JPH06327480A - プラスミドの自律複製を司る機能に関与する遺伝子を含むｄｎａ断片 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【構成】 ブレビバクテリウム・スタチオニスが保持す
るプラスミドｐＢＹ５０３から得られ、コリネ型細菌内
でプラスミドの自律複製を司る機能に関与する遺伝子を
含むＤＮＡ領域であって、プラスミドの複製数を増加さ
せ得る変異点が少なくとも１カ所に存在するＤＮＡ断
片。 【効果】 該ＤＮＡ断片を用いて造成されるベクターに
工業的に有用な遺伝子、例えばアスパルターゼ遺伝子等
を連結し、これにより形質転換されたコリネ型細菌を用
いることで、従来よりも高効率に有用微生物産物を生産
することが可能である。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、プラスミドの自律複製
を司る機能に関与する遺伝子を含むＤＮＡ断片に関し、
さらに詳しくは、コリネ型細菌内でプラスミドの自律複
製を司る機能に関与する遺伝子を含むＤＮＡ断片であっ
て、プラスミドの複製数を増加し得る変異点が該領域内
の少なくとも１カ所に存在するＤＮＡ断片および該ＤＮ
Ａ断片を有する多コピー数プラスミドベクターに関す
る。

【０００２】

【従来の技術】ブレビバクテリウム属細菌を含むコリネ
型細菌は、アミノ酸、有機酸、プリンヌクレオチド等を
生産する工業的に極めて有用な微生物群である。従っ
て、これらコリネ型細菌の発酵生産物の生産性を高める
目的で、組換えＤＮＡ技術によりコリネ型細菌を宿主と
するプラスミドベクターが幾つか開発されている。コリ
ネ型細菌の工業的に有用なプラスミドベクターとして
は、例えば、ブレビバクテリウム・スタチオニス（Brev
ibacterium stationis）IFO 12144（FERM BP-2515）が
保持するプラスミドｐＢＹ５０３（特開平1-95785号公
報参照）に由来するコリネ型細菌内でプラスミドの自律
複製を司る機能に関与するＤＮＡ領域、プラスミドマー
カーとなり得る薬剤耐性遺伝子を含むＤＮＡ領域および
エシエリヒア・コリ（Escherichia coli）内での複製に
必要な遺伝子を含むＤＮＡ領域からなるプラスミドｐＣ
ＲＹ３（特開平1-191686号公報参照）が挙げられる。し
かしながら、このプラスミドｐＣＲＹ３のコリネ型細菌
細胞内におけるコピー数は４〜６であり、目的遺伝子の
発現効率は必ずしも満足できるものではない。

【０００３】

【発明が解決しようとする課題】コリネ型細菌を宿主と
するプラスミドベクターに有用遺伝子を挿入して有用物
質の生産に利用する場合、その有用遺伝子の発現量はプ
ラスミドベクターのコピー数にほぼ比例することが知ら
れている。従って、多コピー数プラスミドベクターに有
用遺伝子を挿入することにより、高い遺伝子増幅効果、
即ち有用遺伝子の強い発現が期待される。すなわち、本
発明の目的は、コリネ型細菌内で自律複製し得るプラス
ミドであって、多コピー数で細胞内に存在可能なプラス
ミドの造成に利用可能な、プラスミドの自律複製機能に
関与する遺伝子を含むＤＮＡ断片を得ることである。

【０００４】

【課題を解決するための手段】本発明者らは上記目的を
達成すべく鋭意研究を行った結果、プラスミドｐＢＹ５
０３に由来するプラスミドの自律複製を司る機能に関与
するＤＮＡ領域を改変することにより、コリネ型細菌内
でプラスミドコピー数の増加をもたらし得るＤＮＡ断片
を取得することができ、さらに該ＤＮＡ断片を用いるこ
とにより多コピー数のプラスミドベクターが創製できる
ことをも見い出し、本発明を完成するに至った。即ち本
発明は、（１） ブレビバクテリウム・スタチオニス I
FO12144（FERM BP-2515）が保持するプラスミドｐＢＹ
５０３に由来するコリネ型細菌内でプラスミドの自律複
製を司る機能に関与する遺伝子を含むＤＮＡ断片であっ
て、プラスミドのコピー数を増加し得る変異点が該遺伝
子内の少なくとも１カ所に存在するＤＮＡ断片、（２）
該ＤＮＡ断片を保有するコリネ型細菌内で複製増殖可
能なプラスミドベクター、を提供するものである。本発
明の上記ＤＮＡ断片を用いることにより、コリネ型細菌
内に多コピー数で存在し得るプラスミドベクターを造成
することが可能である。さらに、このプラスミドベクタ
ーに有用構造遺伝子を導入してコリネ型細菌を形質転換
することにより、工業的に有用なコリネ型細菌の育種改
良が可能となる。以下に、本発明のＤＮＡ断片およびプ
ラスミドベクターについてさらに詳細に説明する。

【０００５】

【本発明の具体的説明】本発明の、コリネ型細菌内でプ
ラスミドの自律複製を司る機能に関与する遺伝子（以下
これを「自律複製遺伝子」ということがある。）を含む
ＤＮＡ断片であって、プラスミドのコピー数を増加し得
る変異点が該遺伝子内の少なくとも１カ所に存在するＤ
ＮＡ断片（以下これを「多コピー数自律複製ＤＮＡ断
片」ということがある。）とは、該ＤＮＡ断片を用いて
造成されたプラスミドベクターのコピー数を、変異点を
有しない自律複製遺伝子を含むＤＮＡ断片を用いて造成
されたプラスミドベクターのコピー数と比較して、増加
し得る作用を有するＤＮＡ断片を意味するものである。
ここで、本明細書においては、コピー数という術語は１
細胞当たりのプラスミド分子数（プラスミドの存在数）
を意味し、多コピー数という術語はプラスミドｐＢＹ５
０３またはｐＣＲＹ３のコピー数よりも多いコピー数を
意味する。

【０００６】本発明の多コピー数自律複製ＤＮＡ断片
は、その塩基配列が決定された後においては合成するこ
とも可能であるが、通常は、ブレビバクテリウム・スタ
チオニス（Brebibacterium stationis） IFO 12144（FE
RM BP-2515）が保持する大きさ約１５ｋｂのプラスミド
ｐＢＹ５０３（特開平1-95785号公報参照）上に存在す
るコリネ型細菌内で自律複製を司る機能に関与する遺伝
子を変異誘起処理して改変した後、コピー数の増加がも
たらされたプラスミドを適当な制限酵素で切断して得ら
れる切断断片の中から、分離および取得することができ
る。即ち、自律複製遺伝子を含むプラスミドｐＢＹ５０
３を適当な制限酵素で切断して得られるＤＮＡ断片を、
マーカーとなり得る薬剤耐性遺伝子を保持するベクター
プラスミド、例えば、クロラムフェニコール耐性遺伝子
を有するｐＨＳＧ３９８（宝酒造製）、カナマイシン耐
性遺伝子を有するｐＨＳＧ２９８（宝酒造製）またはテ
トラサイクリン耐性遺伝子を有するｐＢＲ３２２（宝酒
造製）に、それ自体既知の常法により挿入し、このベク
タープラスミドを電気パルス法による形質転換により宿
主コリネ型細菌に導入し（なお、宿主コリネ型細菌およ
び形質転換法等は後述のものと同様である。）、得られ
る形質転換株よりプラスミドＤＮＡを、それ自体既知の
常法、例えばアルカリ−ＳＤＳ法等により抽出し、適当
な制限酵素で切断して解析することにより、挿入された
ｐＢＹ５０３由来の自律複製遺伝子を含むＤＮＡ断片を
確認することができる。

【０００７】このプラスミド保持株を、Ｘ線、γ線、ま
たは紫外線等で照射するか、あるいはＮ−メチル−Ｎ'
−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン等の変異誘起剤に曝
した後に、各種濃度のマーカー薬剤による選択圧下で培
養して薬剤耐性濃度の上昇した菌株をプラスミド複製数
の増加による遺伝子増幅効果が現れたものと見なして選
抜し、選抜株が保持するプラスミドのコピー数を解析す
る。かくして得られる薬剤耐性およびプラスミドコピー
数が親株より上昇した菌株から組換えプラスミドを抽出
し、該プラスミドを適当な制限酵素で切断することによ
り、多コピー数自律複製ＤＮＡ断片を得ることができ
る。ここで、コピー数の解析は、Journal of Bacteriol
ogy, 152, p722（1982）に記載の方法に従い、細胞より
染色体ＤＮＡおよびプラスミドＤＮＡを抽出し、双方の
分子数の比を求めることにより行うことができる。上記
手法で得られる多コピー数自律複製ＤＮＡ断片として
は、前記プラスミドｐＣＲＹ３を保持するブレビバクテ
リウム・フラバムＭＪ２３３ ＧＥ１０２（FERM BP-251
3）をＮ−メチル−Ｎ'−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジ
ンで処理することにより得られる、クロラムフェニコー
ル耐性濃度が上昇し、かつプラスミドコピー数が約２倍
に増加した菌株であるブレビバクテリウム・フラバムＭ
Ｊ２３３ ｃｏｐ１（FERM P-13619）および同ＭＪ２３
３ ｃｏｐ２（FERM P-13620）からそれぞれ得られるプ
ラスミドｐＣＯＰ１およびｐＣＯＰ２を制限酵素Ｋｐｎ
Iで切断して得られる、大きさ約６.０ｋｂのＤＮＡ断片
が挙げられる。

【０００８】なお、本明細書において、制限酵素による
「認識部位数」という術語は、ＤＮＡ断片またはプラス
ミドを過剰の制限酵素の存在下に完全分解して得られる
分解物を、それ自体既知の方法に従い１％アガロースゲ
ル電気泳動および４％ポリアクリルアミドゲル電気泳動
に供したときに分離可能な断片の数から決定した値を意
味する。また、「切断断片の大きさ」という術語は、１
％アガロースゲル電気泳動を用いる場合にはエシエリヒ
ア・コリのλファージのＤＮＡを制限酵素ＨｉｎｄIII
で切断して得られる分子量既知のＤＮＡ断片を試料と同
時に泳動して得られる標準線に基づき、また、４％ポリ
アクリルアミドゲル電気泳動を用いる場合にはエシエリ
ヒア・コリのφｘ１７４ファージのＤＮＡを制限酵素Ｈ
ａｅIIIで切断して得られる分子量既知のＤＮＡ断片を
試料と同時に泳動して得られる標準線に基づき、切断Ｄ
ＮＡ断片の大きさをそれぞれ算出して決定することがで
きる。また、「プラスミドの大きさ」は、前記「切断断
片の大きさ」を決定する手法によりプラスミドの各ＤＮ
Ａ断片の大きさ決定し、それを加算することで求めるこ
とができる。なお、各ＤＮＡ断片の大きさの決定におい
ては、１ｋｂ以上の断片の大きさついては１％アガロー
スゲル電気泳動の結果を採用し、１ｋｂ未満の断片の大
きさについては４％ポリアクリルアミドゲル電気泳動の
結果を採用した。このようにして大きさが決定されたＤ
ＮＡ断片を上記泳動ゲルより抽出することにより、特定
の大きさを有するＤＮＡ断片を取得することができる。

【０００９】上記プラスミドｐＣＯＰ１およびｐＣＯＰ
２を制限酵素ＫｐｎIで切断して得られる大きさ約６.０
ｋｂの多コピー数自律複製ＤＮＡ断片を各種の制限酵素
で切断して得られる認識部位数および切断断片の大きさ
は、両プラスミドにおいて同一であり、その値を下記表
１に示す。

【００１０】

【表１】

【００１１】上記表１に示した、前記大きさ約６.０ｋ
ｂのＫｐｎI切断断片をＸｈｏIで切断して得られる大き
さ約４.０ｋｂのＤＮＡ断片、およびＨｈａIで切断して
得られる大きさ約１.８ｋｂのＤＮＡ断片は、双方共に
多コピー数自律複製機能を有していることが確認されて
おり、従って、これらのＤＮＡ断片も本発明の多コピー
数自律複製ＤＮＡ断片に包含されるものである。以上の
如く、自律複製遺伝子または多コピー数自律複製遺伝子
は、プラスミドｐＢＹ５０３、ｐＣＲＹ３、ｐＣＯＰ１
またはｐＣＯＰ２を制限酵素ＸｈｏIで切断することに
より得られる大きさ約４.０ｋｂのＤＮＡ断片、および
同プラスミドを制限酵素ＨｈａIで切断して得られる大
きさ約１.８ｋｂのＤＮＡ断片中に含まれているものと
考えられる。上記プラスミドｐＣＯＰ１およびｐＣＯＰ
２を制限酵素ＸｈｏIで切断して得られる大きさ約４.０
ｋｂのＤＮＡ断片をさらに各種制限酵素で切断したとき
の認識部位数および切断断片の大きさは、両プラスミド
において同一であり、その値を下記表２に示す。

【００１２】

【表２】

【００１３】また、上記ｐＣＯＰ１およびｐＣＯＰ２を
制限酵素ＨｈａIで切断して得られる大きさ約１.８ｋｂ
のＤＮＡ断片をさらに各種制限酵素で切断したときの認
識部位数および切断断片の大きさも、両プラスミドにお
いて同一であり、その値を下記表３に示す。

【００１４】

【表３】

【００１５】一方、プラスミドｐＣＯＰ１およびｐＣＯ
Ｐ２を制限酵素ＨｈａIで切断して得られる大きさ約１.
８ｋｂの多コピー数自律複製遺伝子を含むＤＮＡ断片、
ならびにプラスミドｐＢＹ５０３およびｐＣＲＹ３を制
限酵素ＨｈａIで切断して得られる大きさ約１.８ｋｂの
自律複製遺伝子を含むＤＮＡ断片については、その塩基
配列をプラスミドｐＵＣ１８またはｐＵＣ１９を用いる
ジデオキシヌクレオチド酵素法（dideoxy chain termin
ation method, Sanger,F.ら, Proc. Natl.Acad. Sci. U
SA, 74, 5463, 1977）により決定することができる。こ
のようにして得られた、上記ｐＣＯＰ１から得られた大
きさ約１.８ｋｂのＤＮＡ断片の配列を後記配列表の配
列番号１に、ｐＣＯＰ２から得られた大きさ約１.８ｋ
ｂのＤＮＡ断片の配列を後記配列表の配列番号２にそれ
ぞれ示す。また、ｐＢＹ５０３およびｐＣＲＹ３からそ
れぞれ得られた大きさ約１.８ｋｂのＤＮＡ断片は同一
の配列を有しており、その配列を後記配列表の配列番号
３に示す。

【００１６】後記配列表の配列番号１〜３に示した塩基
配列から明らかなとおり、上記大きさ約１.８ｋｂの自
律複製遺伝子または多コピー数自律複製遺伝子を含むＤ
ＮＡ断片は、１８９７塩基対の大きさを有しており、そ
の中に２６１個のアミノ酸をコードする７８３の塩基対
よりなるオープン・リーディング・フレーム（ＯＲＦ）
の配列中に、配列番号３に示したｐＢＹ５０３およびｐ
ＣＲＹ３から得られたＤＮＡ断片の配列（以下これを
「野生型の配列」ということがある。）と比較して、配
列番号１に示したｐＣＯＰ１から得られたＤＮＡ断片の
配列では１３０７番目のグアニン（Ｇ）がアラニン
（Ａ）に変異することによりコードするアミノ酸がアル
ギニン（Ａｒｇ）からヒスチジン（Ｈｉｓ）に変換さ
れ、また、配列番号２に示したｐＣＯＰ２から得られた
ＤＮＡ断片では１５７７番目のＧがＡに変異することに
よりコードするアミノ酸がグリシン（Ｇｌｙ）からアス
パラギン酸（Ａｓｐ）に変換されていることが明らかと
なった。即ち、オープン・リーディング・フレーム（Ｏ
ＲＦ）中の上記した塩基配列の変異によりコピー数の増
加がもたらされるものと考えられる。従って、後記配列
表の配列番号１〜３に示した配列から得られる次の配列
を含むＤＮＡ断片もまた、本発明の多コピー数自律複製
ＤＮＡ断片に包含されるものである：

【００１７】 GCGCAGCCTG ACCATGGACA TGCTTCTACG TTCTTCCACA CTGGTATCTT TTGGTTGCAA 60 TATATATTGC AACCATGCTG GTAAAACAAC TTTTTAGCGT GTCTTGCCCA AAATTACAGT 120 CATGTGATTT ACAGTTGAAA GATACTGAAA ATCAAAGAAG GCCACTCGGC GGCAACCGAA 180 TGACCTTCGC TTATCACCCA GTCCTACCTG GGAGAAAGCA TGTACATGAT TATACCCAAT 240 AGTACGCCCG CGTACCCCAT TTCCGGTTCG CGTGTTAACA CGCCATCACG TTTGCGCCCT 300 GACTGCGCAG GCCTTGATGA CACCCCAGCG AGCACCGTTG ACCGGGACAA GCTGCTCGCA 360 CATCTTGGCC GTACAGCACT GCACGGGTCT ATAAGTCGAA ACTTCAAAGG CGCTTATCGC 420 CTCGTTGTGG ATAAGGAAAC GGGGGAAAAG CGAAGCGTTC CGAACCTTTA CCGCATTGAT 480 TCCGAAAAAC TCGGTCGCTG CGAATACGTC ATGCTGACTA GTAAGCAATA TGCTTCGGTC 540 ATGGTCATAG ACGTTGACCA GATAGGAGAG GCTGGAGGAC ATCCAGAAAA CCTCAACTCC 600 TATGTCAAAG GCGTTATCTG GGTACTTGTG CAGCACGGAA TTGGACCAGC ATGGGCAGGC 660 ATTAATCCGA TTAGTGGTAA AGCGCAGTTT ATTTGGCTTA TTGACCCAGT TTATGCAGGA 720 AAGAATCGTG CGTCCCGGAA TATGGAGCTA CTCAAAGCCA CAAGTCACGA GTTGGGTGAG 780 TTACTGGATC ATGATCCACA TTTTGCGCAT CGGTTTAGCC GGAGTCCTTT TTATACTGGA 840 AAGTCACCGG AGGCTTATCG CTGGTATTGC CAGCATGACC GGGTTATACG CCTCCAAGAC 900 TTTCTAAGGC AGGTGCGCGA G ATG GCG GGA CAA TCC CAG CAC ATT AAA AAC 951 Met Ala Gly Gln Ser Gln His Ile Lys Asn 1 5 10 AAG CGC CAG CAA TTT AAC AGT GGC CGT GAG CTT ATT AAT GCG GTC AAA 999 Lys Arg Gln Gln Phe Asn Ser Gly Arg Glu Leu Ile Asn Ala Val Lys 15 20 25 ACT CGC CGT GAA GAA GCC CAA GCC TTT AAA GCA CTT GCT GAG GAT GTC 1047 Thr Arg Arg Glu Glu Ala Gln Ala Phe Lys Ala Leu Ala Glu Asp Val 30 35 40 GAA AAC GAG ATA AGT GAA GAA ATC GAT CAA TAC GAC CCG GAA CTA ATC 1095 Glu Asn Glu Ile Ser Glu Glu Ile Asp Gln Tyr Asp Pro Glu Leu Ile 45 50 55 GAC GGG GTG CGC GTG CGC TGG ATT AGC CAA GGG GTC GCA GCA CGC GAC 1143 Asp Gly Val Arg Val Arg Trp Ile Ser Gln Gly Val Ala Ala Arg Asp 60 65 70 GAA ACA GCG TTT AGC CAC GCA CTA AAA ATT GGT CAC CGC CTA CGC AAA 1191 Glu Thr Ala Phe Ser His Ala Leu Lys Ile Gly His Arg Leu Arg Lys 75 80 85 90 GCA GGA CAA CGA CTC ACA GAC GCC GCC GTT ATC GAT GCC TAC GAG CAT 1239 Ala Gly Gln Arg Leu Thr Asp Ala Ala Val Ile Asp Ala Tyr Glu His 95 100 105 GCC TAT AAC GTT GCA CAA CAA CAA GGC TCA GCA GGC CGA GAC AGC GAA 1287 Ala Tyr Asn Val Ala Gln Gln Gln Gly Ser Ala Gly Arg Asp Ser Glu 110 115 120 ATG CCA CCC ATG CGT GAC CRC CAG ACC ATG GCA CGA CGC GTA CGC GGC 1335 Met Pro Pro Met Arg Asp Xxx Gln Thr Met Ala Arg Arg Val Arg Gly 125 130 135 TAT GTC ACC CAA TCC AAA ACC AAC ACA AGT CTA GGA GCT AGC GCT CCC 1383 Tyr Val Thr Gln Ser Lys Thr Asn Thr Ser Leu Gly Ala Ser Ala Pro 140 145 150 GGA CGC GTT ACC AGC AGC GAA CGC AAA GCA CTG GCC ACC ATG GGG CGA 1431 Gly Arg Val Thr Ser Ser Glu Arg Lys Ala Leu Ala Thr Met Gly Arg 155 160 165 170 AAA GGC GGA CAG AAA GCA GCA CAA CGC TGG AAA ACC GAT CCA GAA GGT 1479 Lys Gly Gly Gln Lys Ala Ala Gln Arg Trp Lys Thr Asp Pro Glu Gly 175 180 185 CAA TAC GCA CAA AAT CAG CTG CAG AAA CTA AAG AAA ACG CAC CGG AAG 1527 Gln Tyr Ala Gln Asn Gln Leu Gln Lys Leu Lys Lys Thr His Arg Lys 190 195 200 AAG CGG GTG GAA GGA CAG ACC ACG CGT GCG AAG ATT CAA GCC TTA ATT 1575 Lys Arg Val Glu Gly Gln Thr Thr Arg Ala Lys Ile Gln Ala Leu Ile 205 210 215 GRT GAA GCT TAC GTG CAA ACA GGC GAG GTA CTT ACC CGC AAA CAG ATT 1623 Zzz Glu Ala Tyr Val Gln Thr Gly Glu Val Leu Thr Arg Lys Gln Ile 220 225 230 GTG GAT GAG ACA GGA CTA TCT AGA GCT ACA GTG ACA CGG CAT TTG GCG 1671 Val Asp Glu Thr Gly Leu Ser Arg Ala Thr Val Thr Arg His Leu Ala 235 240 245 250 GCA CTT CGA GAA CAG GGA GCA CTT CCG GAA ACG TAGGGGCTCATACCGTAAGCA 1725 Ala Leu Arg Glu Gln Gly Ala Leu Pro Glu Thr 255 260 ATATACGGTT CCCCTGCCGG TAGGAATGTA GTAATAACCT CTCTTGAAGA AAACCTTGTA 1785 GGGCAAGGCT ACTTATGCTT CCGGGGTTAG TCGTTCTTCT ATTGCGGTGA TGAGTTCTAG 1845 ACCTTTATCT AAGTCCTGGG GGCTGCTGTT GCCGTGCGAG GCTTTGCTGC GC 1897 （上記塩基配列中１３０７番目および１５７７番目のＲ
はＧまたはＡを示すが、双方が同時にＧであることはな
く、ならびに上記アミノ酸配列中１２９番目のＸｘｘは
ＡｒｇまたはＨｉｓを、２１９番目のＺｚｚはＧｌｙま
たはＡｓｐをそれぞれ示し、かつ１２９番目のＸｘｘが
ＡｒｇであるときにはＺｚｚがＧｌｙであることはな
い。）。

【００１８】上記配列を有する本発明の多コピー数自律
複製ＤＮＡ断片は、プラスミドｐＣＯＰ１およびｐＣＯ
Ｐ２から単離されたもののみならず、通常用いられるＤ
ＮＡ合成装置、例えばベックマン社製システム−１プラ
ス（System-1 Plus）を用いて合成されたものであって
もよい。また、上記の配列を有する本発明の多コピー数
自律複製ＤＮＡ断片は、多コピー数自律複製機能を実質
的に損なうことがない限り、塩基配列の一部の塩基が他
の塩基で置換されていてもよく、あるいは新たに塩基が
挿入されていてもよく、また一部の塩基が欠損していて
もよく、これら誘導体のいずれもが、本発明の多コピー
数自律複製ＤＮＡ断片に包含されるものである。以上に
詳述した多コピー数自律複製ＤＮＡ断片の制限酵素によ
る切断点地図を図１に示す。

【００１９】本発明の多コピー数自律複製ＤＮＡ断片を
コリネ型細菌内で発現するマーカーとなり得る薬剤耐性
遺伝子を含むＤＮＡ断片またはプラスミドに導入するこ
とにより、コリネ型細菌内で多コピー数で自律複製し、
かつ有用遺伝子を高発現する優れたプラスミドベクター
を得ることができる。本発明の多コピー数自律複製遺伝
子を組み込むことができ、コリネ型細菌内でマーカーと
なり得る薬剤耐性遺伝子を含むプラスミドとしては、例
えば、前記したクロラムフェニコール耐性遺伝子を有す
るｐＨＳＧ３９８（宝酒造製）、カナマイシン耐性遺伝
子を有するｐＨＳＧ２９８（宝酒造製）、テトラサイク
リン耐性遺伝子を有するｐＢＲ３２２（宝酒造製）等を
挙げることができる。上記の如きプラスミドベクターに
本発明の多コピー数自律複製ＤＮＡ断片を挿入する方法
としては、例えば、プラスミドｐＨＳＧ３９８を適当な
制限酵素により完全分解または部分分解して開裂させ、
それに前述した（大きさ約６.０ｋｂ、約４.０ｋｂまた
は約１.８ｋｂの）多コピー数自律複製ＤＮＡ断片を連
結酵素で処理して結合させる方法等が挙げられる。

【００２０】かくして造成される本発明のプラスミドベ
クターの好適な具体例として、前記したプラスミドｐＣ
ＯＰ１から制限酵素ＨｈａIで切り出すことにより得ら
れる大きさ約１.８ｋｂのＤＮＡ断片とプラスミドｐＨ
ＳＧ３９８よりなる大きさ約１.８ｋｂのプラスミドｐ
ＣＯＰ１−１.８、およびプラスミドｐＣＯＰ２から制
限酵素ＨｈａIで切り出すことにより得られる大きさ約
１.８ｋｂのＤＮＡ断片とプラスミドｐＨＳＧ３９８よ
りなる大きさ約４.０ｋｂのプラスミドｐＣＯＰ２−１.
８を挙げることができる。プラスミドｐＣＯＰ１−１.
８およびｐＣＯＰ２−１.８を各種の制限酵素で切断し
たときの認識部位数および切断断片の大きさは、両プラ
スミドにおいて同一であり、その値を表４に示す。

【００２１】

【表４】

【００２２】このようにして創製される多コピー数自律
複製ＤＮＡ断片を含み、かつコリネ型細菌内で多コピー
数で自律複製可能なプラスミドベクターには、種々の産
業上有用な物質をコードする構造遺伝子等を含むＤＮＡ
断片を組み込むことができる。従って、本発明の多コピ
ー数自律複製ＤＮＡ断片を含む上記ベクターを有用遺伝
子等で組換えたプラスミドベクターを宿主微生物に導入
して培養することにより、該有用遺伝子でコードされた
有用物質を効率よく工業的に生産することが可能とな
る。本発明によるプラスミドベクターに組み込みうる有
用な構造遺伝子等を含むＤＮＡとしては、例えば、アス
パルターゼ（E.C.4.3.1.1）をコードする遺伝子を含む
ＤＮＡ断片；少なくともトリプトファンシンターゼ（E.
C.4.2.1.20）遺伝子をコードする遺伝子（trp Ａとtrp
Ｂ）と該遺伝子の発現を制御するプロモーターおよびオ
ペレーターとを含むＤＮＡ断片；スレオニン生合成遺伝
子またはイソロイシン生合成遺伝子等のアミノ酸生合成
遺伝子を含むＤＮＡ断片等が挙げられる。

【００２３】本発明の前記プラスミドベクターおよび該
ベクターに上記有用遺伝子を組み込んだプラスミドベク
ターで形質転換し得る宿主微生物としては、コリネ型細
菌、例えば、ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ−２３
３（FERM BP-1497）、ブレビバクテリウム・フラバムＭ
Ｊ−２３３−ＡＢ−４１（FERM BP-1498）、ブレビバク
テリウム・フラバムＭＪ−２３３−ＡＢＴ−１１（FERM
BP-1500）、ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ−２３
３−ＡＢＤ−２１（FERM BP-1499）等が挙げられる。な
お、上記 FERM BP-1498 の菌株は FERM BP-1497 の菌株
を親株としてＤＬ−α−アミノ酪酸耐性を積極的に付与
されたエタノール資化性微生物である（特公昭59-28398
号公報参照）。また、FERM BP-1500 の菌株は FERM BP-
1497 の菌株を親株としたＬ−α−アミノ酪酸トランス
アミナーゼ高活性変異株である（特開昭62-51998号公報
参照）。さらに、FERM BP-1499 の菌株は FERM BP-1497
の菌株を親株としたＤ−α−アミノ酪酸デアミナーゼ
高活性変異株である（特開昭61-177993号公報参照）。

【００２４】上記微生物の他に、ブレビバクテリウム・
アンモニアゲネス（Brevibacterium ammoniagenes）ATCC
6871、同 ATCC 13745、同 ATCC 13746、ブレビバクテ
リウム・デバリカム（Brevibacterium divaricatum）AT
CC 4020、ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム
（Brevibacterium lactofermentum）ATCC 13869、コリ
ネバクテリウム・グルタミカム（Corynebacterium glut
amicum）ATCC 31830等を宿主微生物として用いることも
できる。なお、宿主としてブレビバクテリウム・フラバ
ムＭＪ−２３３由来の菌株を用いる場合、本菌株が保持
するプラスミドｐＢＹ５０２のために形質転換が困難と
なる場合があるので、そのような場合には、本菌株より
プラスミドｐＢＹ５０２を除去することが望ましい。プ
ラスミドｐＢＹ５０２を除去する方法としては、例え
ば、継代培養を繰り返すことにより自然に欠落させるこ
とも可能であるし、人為的に除去することも可能である
［Bact. Rev. 36, p.361-405 (1972）参照］。

【００２５】上記宿主微生物の前記組換えプラスミドベ
クターによる形質転換は、それ自体既知の方法、例え
ば、Satoh,Y.ら、Journal of Industrial Microbiolog
y, 5,p159（1990)（宿主微生物にパルス波を通電する方
法）；Calvin,N.M.およびHanawalt,P.C., Journal of B
acteriology, 170, 2796 (1988）；Ioo,K.,Nishida,T.
および Izaki,K., Agricultural and biological Chemi
stry, 52,293 (1988) 等の文献に記載の方法により行う
ことができる。次に実施例により本発明をさらに具体的
に説明する。当然ながら、下記実施例は本発明について
具体的な認識を得る一助としてのみ挙げたものであり、
本発明の範囲を何ら限定するものではない。

【００２６】

【実施例】

参考例１プラスミドｐＢＹ５０３とプラスミドｐＨＳＧ３９８と
からなる複合プラスミドｐＣＲＹ３の造成 （Ａ） プラスミドｐＢＹ５０３の調製 プラスミドｐＢＹ５０３は、ブレビバクテリウム・スタ
チオニス（Brevi-bacterium stationis）IFO12144 (FER
M BP-2515) から分離された分子量約１０メガダルトン
（約１５ｋｂ）のプラスミドであり、その詳細は特開平
1-95785号公報に記載されている。プラスミドｐＢＹ５
０３は以下の方法にて調製した。半合成培地Ａ培地［組
成：尿素 ２ｇ、硫酸アンモニウム ７ｇ、リン酸一カリ
ウム ０.５ｇ、リン酸二カリウム ０.５ｇ、ＭｇＳＯ₄
０.５ｇ、ＭｎＳＯ₄・４〜６Ｈ₂Ｏ ６ｍｇ、ＦｅＳＯ₄
・７Ｈ₂Ｏ ６ｍｇ、酵母エキス ２.５ｇ、カザミノ酸
５ｇ、ビオチン ２００μｇ、塩酸チアミン ２００μ
ｇ、グルコース ２０ｇを純水に溶解して１ｌとする
（ｐＨ７.４)］１ｌにてブレビバクテリウム・スタチオ
ニスを対数増殖期後期まで培養して菌体を集めた。得ら
れた菌体をリゾチームを１０ mg/mｌ 濃度で含有する緩
衝液［組成：２５ｍＭ トリス（ヒドロキシメチル）ア
ミノメタン、１０ｍＭ ＥＤＴＡ、５０ｍＭ グルコー
ス］２０ｍｌに懸濁し、３７℃で１時間反応させた。反
応液にアルカリ−ＳＤＳ液［組成：０.２Ｎ ＮａＯＨ、
１％（Ｗ/Ｖ）ＳＤＳ］４０ｍｌを添加し、穏やかに混
和して室温にて１５分間静置した。次に、この反応液に
酢酸カリウム水溶液［組成：５Ｍ 酢酸カリウム溶液 ６
０ｍｌ、酢酸 １１.５ｍｌ、純水 ２８.５ｍｌの混合
液］３０ｍｌを添加し、充分混和してから、氷水中に１
５分間静置した。

【００２７】溶菌物全量を遠心管に移し、４℃で１０分
間、１５,０００×ｇの遠心分離にかけ、上澄液を得
た。これに等量のフェノール/クロロホルム（１：１、
ｖ/ｖ）混和液を添加して懸濁した後、全量を遠心管に
移し、室温下で５分間、１５,０００×ｇの遠心分離に
かけ、水層を得た。該水層に２倍量のエタノールを添加
し、−２０℃で１時間静置した後、４℃で１０分間、１
５,０００×ｇの遠心分離にかけ、その沈殿を回収し
た。

【００２８】得られた沈殿を減圧乾燥した後、ＴＥ緩衝
液［１０ｍＭ トリス、１ｍＭＥＤＴＡ；塩酸にてｐＨ
８.０に調整］２ｍｌに溶解した。この溶解液に塩化セ
シウム溶液［組成：５倍濃度のＴＥ緩衝液 １００ｍｌ
に塩化セシウム １７０ｇを溶解させた液］１５ｍｌと
１０ mg/ml エチジウム・ブロマイド溶液 １ｍｌを添加
して該液の密度を１.３９２ ｇ/ml に調節した。この溶
液を１２℃で４２時間、１１６,０００×ｇの遠心分離
にかけた。遠心後、プラスミドｐＢＹ５０３は、紫外線
照射により遠心管内の下方に存在するバンドとして見い
だされる。このバンドを、滅菌済みプラスチック製注射
器で遠心管の側面から抜き出すことにより、プラスミド
ＤＮＡを含む分画液を得た。次いでこの分画液を等量の
イソアミルアルコールで４回処理してエチジウム・ブロ
マイドを抽出除去し、その後ＴＥ緩衝液に対して透析を
行った。このようにして得られたプラスミドｐＢＹ５０
３を含む透析液に、最終濃度が３０ｍＭとなるように３
Ｍ 酢酸ナトリウム溶液を添加した後、２倍量のエタノ
ールを添加して−２０℃で１時間静置した。この溶液を
１５,０００×ｇの遠心分離にかけてＤＮＡを沈降さ
せ、プラスミドｐＢＹ５０３のＤＮＡ約５０μｇを回収
した。

【００２９】（Ｂ） プラスミドｐＨＳＧ３９８の準備 プラスミドｐＨＳＧ３９８（宝酒造製）はコリネ型細菌
内で複製せず、エシエリヒア・コリ内で複製してクロラ
ムフェニコール耐性を発現する、大きさ約２.２ｋｂの
プラスミドであり、市販品として宝酒造より購入可能で
ある。 （Ｃ） 複合プラスミドｐＨＳＧ３９８の造成 前記プラスミドｐＨＳＧ３９８（宝酒造製）０.５μｇ
を、制限酵素ＫｐｎI５ units と３７℃で１時間反応さ
せて該プラスミドＤＮＡを完全分解した。前記（Ａ）で
調製したプラスミドｐＢＹ５０３ ＤＮＡ ２μｇを制限
酵素ＫｐｎI １ unit と３７℃で３０分間反応させて該
プラスミドＤＮＡを部分分解した。両者のプラスミドＤ
ＮＡ分解物を混合し、６５℃で１０分間加熱処理して制
限酵素を不活性化させた後、該混合液にそれぞれの最終
濃度が ５０ｍＭ トリス緩衝液（ｐＨ７.６）、１０ｍ
Ｍ ＭｇＣｌ₂、１０ｍＭ ジチオスレイトール、１ｍＭ
ＡＴＰ、およびＴ４ＤＮＡリガーゼ １ unit となるよ
うに各成分を添加して強化し、１６℃で約１５時間イン
キュベートした。この溶液を用いて、エシエリヒア・コ
リＪＭ１０９コンピテント細胞（宝酒造製）を製造者の
マニュアルに従い形質転換した。

【００３０】得られた形質転換株は、３０ μg/ml（最
終濃度）クロラムフェニコール、１００ μg/ml（最終
濃度）イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド
（ＩＰＴＧ)、１００ μg/ml（最終濃度）５−ブロモ−
４−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−ガラクトピラノ
シド（Ｘ−ｇａｌ）を含むＬ培地［組成：トリプトン１
０ｇ、酵母エキス ５ｇ、塩化ナトリウム ５ｇを純水に
溶解して１ｌとした液（ｐＨ７.２)］で３７℃にて２４
時間培養し、培地上に白いコロニーとして生育した株を
それぞれ独立に選抜し、各々のプラスミドをアルカリ−
ＳＤＳ法［T.Maniatis, E.F.Fritsch, J.Sambrook,“Mo
lecular cloning", p90-91 (1982）参照］により抽出し
た。

【００３１】（Ｄ） 複合プラスミドのコリネ型細菌へ
の形質転換 形質転換には電気パルス法を用いた。ブレビバクテリウ
ム・フラバムＭＪ−２３３（FERM BP-1497）プラスミド
除去株を１００ｍｌの前記Ａ培地で対数増殖期初期まで
培養した後、ペニシリンＧを１ unit/ml となるように
添加してさらに２時間振盪培養した。培養菌体を遠心分
離にて集め、２０ｍｌのパルス用溶液［組成：２７２ｍ
Ｍ シュークロース、７ｍＭ ＫＨ₂ＰＯ₄、１ｍＭ Ｍｇ
Ｃｌ₂；ｐＨ７.４］にて洗浄した。再度、遠心分離にて
菌体を集め、５ｍｌのパルス用溶液に懸濁し、０.７５
ｍｌの細胞と前記（Ｃ）で得られたＤＮＡ溶液５０ｍｌ
とを混合し、氷中にて２０分間静置した。ジーンパルサ
ー（バイオラド社製）を用いて、２５００ボルト、２５
μＦＤに設定し、パルスを印加後氷中に２０分間静置し
た。全量を３ｍｌの前記Ａ培地に移し、３０℃にて１時
間培養後、クロラムフェニコール３ μg/ml（最終濃
度）を含む前記Ａ寒天培地に植菌して３０℃で２〜３日
間培養し、出現したクロラムフェニコール耐性株である
ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ２３３ ＧＥ１０２
より、上記（Ａ）に記載の方法を用いてプラスミドを得
た。このプラスミドを各種制限酵素で切断し、得られた
切断断片の大きさを測定した。その結果を下記表５に示
す。

【００３２】

【表５】

【００３３】上記制限酵素の切断断片により特徴付けら
れるプラスミドを“ｐＣＲＹ３”と命名した。上記表５
から明らかな如く、前記プラスミドｐＣＲＹ３を制限酵
素ＫｐｎIで切断することにより、プラスミドｐＨＳＧ
３９８に由来する大きさ２.２ｋｂのＤＮＡ断片に加え
て、プラスミドｐＢＹ５０３に由来する大きさ６.０ｋ
ｂの自律複製遺伝子を含むＤＮＡ断片が確認された。な
お、複合プラスミドｐＣＲＹ３により形質転換されたブ
レビバクテリウム・フラバムＭＪ２３３ ＧＥ１０２
は、茨城県つくば市東１丁目１番３号の工業技術院生命
工学工業技術研究所に、受託番号：FERM BP-2513 とし
てブタペスト条約に基いて国際寄託されている。

【００３４】実施例１プラスミドｐＣＲＹ３からの変異型多コピー数プラスミ
ドの取得 （Ａ） クロラムフェニコール高濃度耐性株の取得 プラスミドｐＣＲＹ３で形質転換されたブレビバクテリ
ウム・フラバムＭＪ２３３ ＧＥ１０２（FERM BP-251
3）株を３００ μg/ml のＮ−メチル−Ｎ'−ニトロ−Ｎ
−ニトロソグアニジンに３０℃で３０分間曝す変異誘発
処理を行った。次に半合成Ａ培地［組成：尿素 ２ｇ、
硫酸アンモニウム ７ｇ、リン酸一カリウム０.５ｇ、リ
ン酸二カリウム ０.５ｇ、ＭｇＳＯ₄ ０.５ｇ、ＭｎＳ
Ｏ₄・４〜６Ｈ₂Ｏ ６ｍｇ、ＦｅＳＯ₄・７Ｈ₂Ｏ ６ｍ
ｇ、酵母エキス ２.５ｇ、カザミノ酸５ｇ、ビオチン
２００μｇ、塩酸チアミン ２００μｇ、グルコース ２
０ｇを蒸留水に溶解して１ｌとする（ｐＨ７.４)］にク
ロラムフェニコールを６ μg/ml添加した培地を用い、
３３℃で５時間培養した。得られた培養菌体を、クロラ
ムフェニコールを３６ μg/ml、寒天を１５ｇ/ｌ含有す
る半分合成Ａ培地に塗抹して培養し、クロラムフェニコ
ール高濃度耐性株を選抜して２株のクロラムフェニコー
ル高濃度耐性株を得た。前記クロラムフェニコール高濃
度含有培地上で生育可能な変異株を、それぞれ“ブレビ
バクテリウム・フラバムＭＪ２３３ ｃｏｐ１”、“ブ
レビバクテリウム・フラバムＭＪ２３３ ｃｏｐ２”と
命名した。

【００３５】（Ｂ） プラスミドコピー数の確認 上記（Ａ）にて得たブレビバクテリウム・フラバムＭＪ
２３３ ｃｏｐ１および同ＭＪ２３３ ｃｏｐ２、ならび
にプラスミドｐＣＲＹ３を保有する同ＭＪ２３３ ＧＥ
１０２（FERM BP-2513）を、前記半合成培地Ａ培地で対
数増殖期後期まで培養し、菌体を集めた。得られた菌体
を１０ mg/ml の濃度にリゾチームを含む緩衝液［組
成：２５ｍＭ トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタ
ン、１０ｍＭ ＥＤＴＡ、５０ｍＭ グルコース］２０ｍ
ｌに懸濁し、３７℃で１時間反応させた。反応液にアル
カリ−ＳＤＳ液［組成：０.２Ｎ ＮａＯＨ、１％（Ｗ/
Ｖ）ＳＤＳ］を４０ｍｌ添加し、穏やかに混和して室温
にて１５分間静置した。次に、この反応液に酢酸カリウ
ム水溶液［組成：５Ｍ 酢酸カリウム溶液 ６０ｍｌ、酢
酸 １１.５ｍｌ、純水 ２８.５ｍｌの混合液］３０ｍｌ
を添加し、充分混和してから、氷水中に１５分間静置し
た。

【００３６】溶菌物全量を遠心管に移し、４℃で１０分
間、１５,０００×ｇの遠心分離にかけ、上澄液を得
た。これに等量のフェノール/クロロホルム（１：１、
ｖ/ｖ）混和液を添加して懸濁した後、全量を遠心管に
移し、室温下で５分間、１５,０００×ｇの遠心分離に
かけ、水層を得た。該水層に２倍量のエタノールを添加
し、−２０℃で１時間静置した後、４℃で１０分間、１
５,０００×ｇの遠心分離にかけ、ＤＮＡの沈殿を回収
した。得られた沈殿を減圧乾燥した後、ＴＥ緩衝液［組
成：１０ｍＭ トリス、１ｍＭ ＥＤＴＡ；塩酸にてｐＨ
８.０に調整］２ｍｌに溶解した。以上のようにして抽
出したプラスミドおよび染色体ＤＮＡをそれぞれ０.８
％アガロースゲル電気泳動により分離した。次に、泳動
ネガフィルムをデンシトメーターにかけ、染色体ＤＮＡ
とプラスミドＤＮＡの割合を測定し、染色体ＤＮＡの分
子量を３.０×１０⁹ダルトン、プラスミドの分子量を
５.４×１０³ダルトン（８.２ｋｂ）として、プラスミ
ドコピー数を算出した。その結果、ブレビバクテリウム
・フラバムＭＪ２３３ ｃｏｐ１および同ＭＪ２３３ ｃ
ｏｐ２には１０〜１２コピーのプラスミドが存在し、同
ＭＪ２３３ＧＥ１０２には５〜６コピーのプラスミド
（ｐＣＲＹ３）が存在することが判明した。

【００３７】（Ｃ） 大きさ約６.０ｋｂの多コピー数
自律複製ＤＮＡ断片の取得 参考例１（Ａ）と同様の方法により、前記（Ａ）で得た
ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ２３３ ｃｏｐ１お
よび同ＭＪ２３３ ｃｏｐ２からプラスミドを抽出し、
これを各種制限酵素で切断してその切断断片の大きさを
測定した。その結果、両株から得られたプラスミドの制
限酵素による認識部位数および切断断片の大きさは同一
であり、前記表５に示したプラスミドｐＣＲＹ３の値と
一致した。上記の如く、菌体当たり１０〜１２のコピー
数で存在し、かつ表５に示した制限酵素による認識部位
数および切断断片の大きさを有することで特徴付けら
れ、ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ２３３ ｃｏｐ
１より得られるプラスミドを“ｐＣＯＰ−１”、また同
ＭＪ２３３ ｃｏｐ２より得られるプラスミドを“ｐＣ
ＯＰ−２”と、それぞれ命名した。

【００３８】次に、プラスミドｐＣＯＰ−１およびｐＣ
ＯＰ−２から制限酵素ＫｐｎIで大きさが約６.０ｋｂの
多コピー数自律複製ＤＮＡ断片を切り出し、このＤＮＡ
断片を各種の制限酵素で切断し、切断断片の大きさを求
めた。その結果、両プラスミドから得られたＤＮＡ断片
の制限酵素認識部位数および切断断片の大きさは同一で
あり、前記表１に示したとおりであった。なお、プラス
ミドｐＣＯＰ−１を保有するブレビバクテリウム・フラ
バムＭＪ２３３ ｃｏｐ１、およびプラスミドｐＣＯＰ
−２を保有する同ＭＪ２３３ｃｏｐ２は、茨城県つくば
市東１丁目１番３号の工業技術院生命工学技術研究所
に、平成５年４月２７日付けで、それぞれ受託番号：FE
RM P-13619 および受託番号：FERM P-13620 として寄託
されている。

【００３９】実施例２大きさ約４.０ｋｂの多コピー数自律複製ＤＮＡ断片の
クローニング 実施例１で調製したプラスミドｐＣＯＰ−１およびｐＣ
ＯＰ−２のコリネ型細菌内で多コピー数で自律複製し得
る機能を担う遺伝子領域を特定化するために、両プラス
ミドが有する約６.０ｋｂの自律複製ＤＮＡ断片を更に
縮小化した。以下の操作は全て、両プラスミドについて
各々独立に行った。プラスミド １μｇを制限酵素Ｘｈ
ｏI １ unit と３７℃で１時間反応させてプラスミドＤ
ＮＡを完全分解した。得られた分解物を０.８％アガロ
ースゲル電気泳動で分離して大きさ約４.０ｋｂのＤＮ
Ａ断片画分をゲルから切り出した。この画分よりＤＮＡ
を抽出精製して約０.５μｇのＤＮＡを得た。次に、参
考例１に既述の大腸菌プラスミドｐＨＳＧ３９８ １μ
ｇを制限酵素ＳａｌI １unitと３７℃で１時間反応させ
た後、該反応液を７０℃で１０分間加熱して酵素を失活
させた。この失活溶液と上記で得た大きさ約４.０ｋｂ
のＤＮＡとを混合し、この混合液にそれぞれの最終濃度
が ５０ｍＭ トリス緩衝液（ｐＨ７.６)、１０ｍＭ Ｍ
ｇＣｌ₂、１０ｍＭ ジチオスレイトール、１ ｍＭ ＡＴ
Ｐ、およびＴ４ＤＮＡリガーゼ １ unit となるように
各成分を添加し、これを１２℃で１５時間反応させてＤ
ＮＡ断片を結合させた。

【００４０】結合させたＤＮＡを参考例（１）Ｄと同様
にしてブレビバクテリウム・フラバムＭＪ−２３３に導
入して該細菌を形質転換した。形質転換株は、クロラム
フェニコール ３６ μg/ml を含む半合成Ａ培地に寒天
を１５ｇ/ｌ添加した固体培地上で２〜３日間培養し、
クロラムフェニコール高濃度耐性株を取得した。上記操
作により得られた、プラスミドｐＣＯＰ−１に由来する
大きさ約４.０ｋｂのＤＮＡ断片が導入されたプラスミ
ドを保有する菌株を“ブレビバクテリウム・フラバムＭ
Ｊ２３３ ｃｏｐ１−４.０"、およびプラスミドｐＣＯ
Ｐ−２に由来する大きさ約４.０ｋｂのＤＮＡ断片が導
入されたプラスミドを保有する菌株を“ブレビバクテリ
ウム・フラバムＭＪ２３３ ｃｏｐ２−４.０”と、それ
ぞれ命名した。上記菌株のプラスミドコピー数を、実施
例１（Ｂ）と同様の方法を用い、プラスミドの分子量を
４.０×１０³ダルトン（６.２ｋｂ）として、算出し
た。その結果、それぞれの形質転換株の保持するプラス
ミドコピー数は１０〜１２であることが判明した。

【００４１】得られた２種の形質転換株から、参考例１
（Ａ）と同様の方法でプラスミドを抽出し、そのプラス
ミドをそれぞれ各種制限酵素で切断して切断断片の大き
さを求めた。その結果、両プラスミドから得られたＤＮ
Ａ断片の制限酵素認識部位数および切断断片の大きさは
同一であった。その値を表６に示す。

【００４２】

【表６】

【００４３】上記の如く、菌体当たり１０〜１２のコピ
ー数で存在し、かつ表６に示した制限酵素による認識部
位数および切断断片の大きさを有することで特徴付けら
れ、ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ２３３ ｃｏｐ
１−４.０が保持するプラスミドを“ｐＣＯＰ１−４.
０"、また同ＭＪ２３３ ｃｏｐ２−４.０が保持するプ
ラスミドを“ｐＣＯＰ２−４.０”と、それぞれ命名し
た。次に、プラスミドｐＣＯＰ−１およびｐＣＯＰ−２
から得られた上記大きさ約４.０ｋｂの多コピー数自律
複製ＤＮＡ断片を各種の制限酵素で切断して切断断片の
大きさを求めた。その結果、両プラスミドから得られた
ＤＮＡ断片の制限酵素認識部位数および切断断片の大き
さは同一であり、前記表２に示したとおりであった。

【００４４】実施例３大きさ約１.８ｋｂの多コピー数自律複製ＤＮＡ断片の
クローニング 参考例１で得たプラスミドｐＣＲＹ３、ならびに実施例
１で得たプラスミドｐＣＯＰ−１およびｐＣＯＰ−２を
各々１μｇとり、それぞれを制限酵素ＫｐｎI １ unit
と１時間反応させて完全分解した。次いで、該分解物を
０.８％アガロースゲル電気泳動により分離したが、そ
の際に、大腸菌λファージの制限酵素ＨｉｎｄIIIによ
る分解物（λＨｉｎｄIII分解物）をサイズマーカーと
して試料と同時に泳動した。泳動に用いたゲルからプラ
スミドの自律複製を司る機能に関与する大きさ約６.０
ｋｂのＤＮＡ断片を含むアガロース画分を切り出し、該
画分より大きさ約６.０ｋｂのＤＮＡ断片を抽出した。
得られた大きさ約６.０ｋｂのＤＮＡ断片０.８μｇを制
限酵素ＨｈａI ０.１unit と３７℃で３０分間反応させ
て不完全に分解し、種々の大きさの分解物を得た後、反
応液を７０℃で１０分間加熱処理して酵素を失活させ
た。次に、前述の大腸菌プラスミドｐＨＳＧ３９８ ０.
５μｇを制限酵素ＡｃｃI０.５ units と３７℃で１時
間反応させて完全分解した後、この反応液も７０℃で１
０分間加熱処理して酵素を失活した。得られた双方の分
解物を混合し、この混合液にそれぞれの最終濃度が５０
ｍＭトリス緩衝液（ｐＨ７.６)、１０ｍＭ ジチオスレ
イトール、１ｍＭ ＡＴＰ、１０ｍＭ ＭｇＣｌ₂ および
Ｔ４リガーゼ１ unit となるように各成分を添加し、こ
れを１２℃で１５時間反応させてＤＮＡ断片を結合させ
た。結合して得られたプラスミドＤＮＡを参考例１
（Ｄ）と同様にして電気パルス法によりコリネ型細菌に
導入して該細菌を形質転換し、前記半合成Ａ培地にて培
養した。さらに、プラスミドｐＣＯＰ−１およびｐＣＯ
Ｐ−２由来のＤＮＡで形質転換させた菌体は３０ μg/m
l（最終濃度)、ｐＣＲＹ３由来のＤＮＡで形質転換させ
た菌体は５ μg/ml（最終濃度）のクロラムフェニコー
ルをそれぞれ含有する前記Ａ培地の寒天培地上に植菌
し、３０℃で２〜３日間培養して、それぞれのクロラム
フェニコール耐性株を得た。

【００４５】出現したクロラムフェニコール耐性株をそ
れぞれ独立に上記半合成Ａ培地１ｌを用いて対数増殖期
後期まで培養した後、菌体を回収した。得られた菌体を
リゾチームを１０ mg/ml の濃度で含有する緩衝液［組
成：２５ｍＭ トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタ
ン、１０ｍＭ ＥＤＴＡ、５０ｍＭ グルコース］２０ｍ
ｌに懸濁し、３７℃で１時間反応させた。この反応液に
アルカリ−ＳＤＳ液［組成：０.２Ｎ ＮａＯＨ、１％
（Ｗ/Ｖ）ＳＤＳ］４０ｍｌを添加し、穏やかに混和し
て室温にて１５分間静置した。次に、該反応液に酢酸カ
リウム溶液［組成：５Ｍ 酢酸カリウム溶液 ６０ｍｌ、
酢酸 １１.５ｍｌ、蒸留水 ２８.５ｍｌの混合液］３０
ｍｌを添加し、これを充分に混和してから氷水中に１５
分間静置した。

【００４６】リゾチームによる溶菌物を全量遠心管に移
し、４℃で１０分間、１５,０００×ｇの遠心分離にか
けて上澄液を得た。該上澄液に等量のフェノール/クロ
ロホルム液（１：１、ｖ/ｖ）を添加し、これを懸濁し
てから遠心管に移し、室温下で５分間、１５,０００×
ｇの遠心分離にかけてその水層を回収した。該水層に２
倍量のエタノールを添加して−２０℃で１時間静置した
後、４℃で１０分間、１５,０００×ｇの遠心分離にか
け、沈殿を回収した。得られた沈殿には染色体ＤＮＡお
よびプラスミドＤＮＡが含まれている。この沈殿を減圧
乾燥した後、ＴＥ緩衝液［組成：１０ｍＭ トリス、１
ｍＭ ＥＤＴＡ；塩酸にてｐＨを８.０に調整］２ｍｌに
溶解して試料とした。

【００４７】上記手順により得た、抽出プラスミドＤＮ
Ａを含む試料をそれぞれ０.８％アガロースゲルを用い
た電気泳動にかけてその分子量を測定したところ、３.
０×１０⁹ダルトンの染色体ＤＮＡと２.６×１０³ダル
トン（４.０ｋｂ）のプラスミドＤＮＡのバンドが確認
された。従って、得られたプラスミドにおいては、プラ
スミドｐＨＳＧ３９８の大きさ２.２ｋｂのＤＮＡ断片
に、プラスミドｐＣＲＹ３、ｐＣＯＰ−１およびｐＣＯ
Ｐ−２を制限酵素ＨｈａIでそれぞれ切断して得られる
大きさ約１.８ｋｂのＤＮＡ断片（多コピー数自律複製
ＤＮＡ断片）が挿入されていることが確認された。上記
で得られた、３種の大きさ約１.８ｋｂの制限酵素Ｈｈ
ａI切断ＤＮＡ断片がそれぞれ導入されたプラスミドを
各種の制限酵素で切断して切断断片の大きさを求めた。
その結果、３種のプラスミドの制限酵素認識部位数およ
び切断断片の大きさは同一であり、前記表４に示したと
おりであった。上記の如くして取得された、プラスミド
ｐＣＯＰ−１に由来する大きさ約１.８ｋｂの制限酵素
ＨｈａI切断ＤＮＡ断片を有し、かつ前記表４に示す切
断断片により特徴付けられるプラスミドを“ｐＣＯＰ１
−１.８"、プラスミドｐＣＯＰ−２に由来する大きさ約
１.８ｋｂの制限酵素ＨｈａI切断ＤＮＡ断片を有し、か
つ前記表４に示す切断断片により特徴付けられるプラス
ミドを“ｐＣＯＰ２−１.８"、プラスミドｐＣＲＹ３に
由来する大きさ約１.８ｋｂの制限酵素ＨｈａI切断ＤＮ
Ａ断片を有し、かつ前記表４に示す切断断片により特徴
付けられるプラスミドを“ｐＳ−１"と、それぞれ命名
した。

【００４８】また、実施例１（Ｂ）と同様の手順により
取得した上記プラスミドおよび染色体ＤＮＡをアガロー
スゲル電気泳動にかけ、染色体ＤＮＡの分子量を３.０
×１０⁹ダルトン、プラスミドの分子量を２.６×１０³
ダルトン（４.０ｋｂ）としてプラスミドのコピー数を
算出した。その結果、プラスミドコピー数はｐＳ−１で
５〜６、ｐＣＯＰ１−１.８およびｐＣＯＰ２−１.８で
は１０〜１２であることが判明した。さらに、プラスミ
ドｐＣＯＰ−１およびｐＣＯＰ−２を制限酵素ＨｈａI
で切断して得られる大きさ約１.８ｋｂの多コピー数自
律複製ＤＮＡ断片を各種の制限酵素で切断し、切断断片
の大きさを求めた。その結果、両プラスミドから得られ
たＤＮＡ断片の制限酵素認識部位数および切断断片の大
きさは同一であり、前記表３に示したとおりであった。
なお、プラスミドｐＣＯＰ１−１.８を保持するブレビ
バクテリウム・フラバム ＣＯＰ１−１.８およびｐＣＯ
Ｐ２−１.８を保持するブレビバクテリウム・フラバム
ＣＯＰ２−１.８は、茨城県つくば市東１丁目１番３号
の工業技術院生命工学工業技術研究所に、平成５年３月
４日付けで受託番号：FERM P-13506 および FERM P-135
07 として寄託されている。

【００４９】実施例４多コピー数変異プラスミドにおける変異位置の決定 実施例３で得た、制限酵素ＨｈａIで切断して得られる
大きさ約１.８ｋｂのＤＮＡ断片の塩基配列をプラスミ
ドｐＵＣ１８またはプラスミドｐＵＣ１９を用いるジデ
オキシヌクレオチド酵素法［dideoxy chain terminatio
n method, Sanger,F.ら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA,
74, 5463 (1977) 参照］により決定した。配列番号１
にプラスミドｐＣＯＰ−１、配列番号２にｐＣＯＰ−
２、および配列番号３にｐＳ−１から得られる、大きさ
約１.８ｋｂのＤＮＡ断片の塩基配列をそれぞれ示す。

【００５０】各配列は１８９７塩基からなるが、その中
に２６１個のアミノ酸をコードするオープン・リーディ
ング・フレームが存在し、これがプラスミドの複製に不
可欠な複製蛋白質をコードしているものと推察される。
プラスミドｐＣＯＰ−１およびｐＣＯＰ−２から得られ
る配列をｐＳ−１から得られる配列と比較したところ、
配列中のオープン・リーディング領域において、ｐＣＯ
Ｐ−１から得られる配列では１３０７番目の塩基ＧがＡ
に変異することにより該部位がコードするアミノ酸がＡ
ｒｇからＨｉｓに変換し、ｐＣＯＰ−２から得られる配
列では１５７７番目のＧがＡに変異することにより該部
位がコードするアミノ酸がＧｌｙからＡｓｐに変換して
いることが判明した。

【００５１】実施例５ アスパルターゼをコードするブレビバクテリウム・フラ
バムＭＪ−２３３由来遺伝子を含むＤＮＡ断片のクロー
ン化、ならびに該遺伝子を含有するプラスミドｐＣＯＰ
１−１.８−ＡｓｐおよびｐＣＯＰ２−１.８−Ａｓｐの
作製 （Ａ）ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ−２３３の全
ＤＮＡの抽出 前記半合成培地Ａ培地１ｌを用いてブレビバクテリウム
・フラバムＭＪ−２３３（FERM BP-1497）を対数増殖期
後期まで培養し、培養菌体を回収した。得られた菌体
を、リゾチームを１０ mg/ml の濃度で含有する溶液
［組成：１０ｍＭＮａＣｌ、２０ｍＭ トリス緩衝液(ｐ
Ｈ８.０)、１ｍＭ ＥＤＴＡ・２Ｎａ]１５ｍｌに懸濁し
た。続いて最終濃度１００ μg/ml 量のプロテナーゼＫ
を添加し、３７℃で１時間インキュベートした。さらに
最終濃度０.５％量のドデシル硫酸ナトリウムを添加
し、５０℃で６時間インキュベートして溶菌した。この
溶菌液に、等量のフェノール/クロロホルム溶液（１：
１、ｖ/ｖ）を添加し、室温で１０分間穏やかに振盪し
た後、全量を１０〜１２℃で１０分間、５,０００×ｇ
の遠心分離にかけ、その上清画分を分取した。酢酸ナト
リウムをその最終濃度が０.３Ｍとなるように該画分に
添加し、次いで２倍量のエタノールを穏やかに添加し
た。水層とエタノール層との間に存在するＤＮＡをガラ
ス棒で搦め取り、これを７０％エタノールで洗浄した後
に風乾した。得られたＤＮＡは、溶液［組成；１０ｍＭ
トリス緩衝液（ｐＨ７.５)、１ｍＭ ＥＤＴＡ・２Ｎ
ａ］５ｍｌを添加して４℃で一晩静置した後、実験に供
した。

【００５２】（Ｂ）アスパルターゼ遺伝子を含む組換え
コスミドの創製および選抜 前記（Ａ）項で得られたブレビバクテリウム・フラバム
ＭＪ−２３３の全ＤＮＡ溶液 ９０μｌを、１ unit の
制限酵素Ｓａｕ３ＡIと３７℃で２０分間反応させて部
分分解した。部分分解したＤＮＡに、制限酵素ＢａｍＨ
Iで切断後脱リン酸化処理したコスミドｐＷＥ１５（ス
トラダジーン社製）を混合した後、該液に、それぞれの
最終濃度が５０ｍＭ トリス緩衝液（ｐＨ７.６)、１０
ｍＭジチオスレイトール、１ｍＭ ＡＴＰ、１０ｍＭ Ｍ
ｇＣｌ₂、およびＴ４ＤＮＡリガーゼ１ unit となるよ
うに各成分を添加し、４℃で１５時間反応させて、ＤＮ
Ａを結合させた。

【００５３】上記手順により得られたコスミド混液、お
よびλＤＮＡ in vitro Packagingkit（宝酒造製）を用
い、常法によりエシエリヒア・コリに形質導入した。使
用したエシエリヒア・コリは、アスパルターゼ欠損変異
株、エシエリヒア・コリ（Escherichia coli)Ｋ−１２
ＪＲＧ１１１４(ａｓｐＡ２３)であった［(）内はアス
パルターゼ遺伝子型を示す。該菌株については、Journa
l of General Micro-biology, 130, 1271-1278（1984)
を参照されたい］。形質導入した前記エシエリヒア・コ
リＪＲＧ１１７４株を、アンピシリン５０ｍｇを含有す
る選択培地［組成；Ｋ₂ＨＰＯ₄ ７ｇ、ＫＨ₂ＰＯ₄ ２
ｇ、(ＮＨ₄)₂ＳＯ₄ １ｇ、ＭｇＳＯ₄・７Ｈ₂Ｏ ０.１
ｇ、３０ｍＭ Ｌ−グルタミン酸ナトリウム塩、および
寒天 １６ｇを蒸留水 １ｌに溶解する］に塗抹した。こ
の培地上に生育したアスパルターゼをコードする遺伝子
を含むコスミドを有する菌株を、常法により液体培養し
て培養液よりコスミドＤＮＡを抽出した。抽出したコス
ミドを制限酵素により分解し、得られた分解物をアガロ
ースゲル電気泳動に供した結果、該コスミドはコスミド
ｐＷＥ１５の大きさ８.８ｋｂのＤＮＡ断片および大き
さ約３０ｋｂのＤＮＡ断片からなることが判明し、本発
明者らは、このコスミドをｐＷＥ１５−Ａｓｐと命名し
た。

【００５４】（Ｃ）アスパルターゼ遺伝子を含むＤＮＡ
断片のプラスミドｐＳ−１、ｐＣＯＰ１−１.８，およ
びｐＣＯＰ２−１.８へのサブク−ロニング 前記（Ｂ）で得られたコスミドｐＷＥ１５−Ａｓｐの制
限酵素ＥｃｏＲI分解物と、実施例３で得られたプラス
ミドｐＳ−１、ｐＣＯＰ１−１.８およびｐＣＯＰ２−
１.８それぞれの制限酵素ＥｃｏＲI分解物を混合した。
この混合液に、それぞれの最終濃度が ５０ｍＭ トリス
緩衝液（ｐＨ７.６）、１０ｍＭ ジチオスレイトール、
１ｍＭ ＡＴＰ、１０ｍＭ ＭｇＣｌ₂、およびＴ４ＤＮ
Ａリガーゼ １ unit となるように各成分を添加し、４
℃で１５時間反応させて、ＤＮＡ分解物を結合させた。
得られたプラスミド混液を用いて、塩化カルシウム法
（Journal of MolecularBiology, 53, 159, 1970）によ
りエシエリヒア・コリＫ−１２ＪＲＧ１１１４（ａｓｐ
Ａ２３）株を形質転換し、クロラムフェニコールを５０
ｍｇ含有する選択培地［組成：Ｋ₂ＨＰＯ₄ ７ｇ、ＫＨ₂
ＰＯ₄ ２ｇ、(ＮＨ₄)₂ＳＯ₄ １ｇ、ＭｇＳＯ₄・７Ｈ₂Ｏ
０.１ｇ、３０ｍＭ Ｌ−グルタミン酸ナトリウム塩、
および寒天 １６ｇを蒸留水に溶解して１ｌとする］に
塗抹した。この培地上に生育した菌株を常法により液体
培養し、実施例１に記載した方法により該培養液からプ
ラスミドＤＮＡを抽出した。抽出したプラスミドを制限
酵素により分解し、得られた分解物をアガロースゲル電
気泳動に供した結果、プラスミドｐＳ−１、ｐＣＯＰ１
−１.８，ｐＣＯＰ２−１.８それぞれに長さ約２.４ｋ
ｂの挿入ＤＮＡ断片、即ちアスパルターゼ遺伝子断片が
認められた。これらのプラスミドを各種の制限酵素で切
断したときの切断断片の大きさを下記表７に示す。

【００５５】

【表７】

【００５６】上記制限酵素の切断断片により特徴付けら
れるプラスミドをそれぞれ“ｐＳ−１−Ａｓｐ”、“ｐ
ＣＯＰ１−１.８−Ａｓｐ”、および“ｐＣＯＰ２−１.
８−Ａｓｐ”と命名した。

【００５７】実施例６ ｐＣＯＰ１−１.８−ＡｓｐおよびｐＣＯＰ２−１.８−
Ａｓｐを含有するブレビバクテリウム・フラバムによる
Ｌ−Ａｓｐの生産 実施例５で得たプラスミドｐＳ−１−Ａｓｐ、ｐＣＯＰ
１−１.８−Ａｓｐ、およびｐＣＯＰ２−１.８−Ａｓｐ
を、参考例１（Ｄ）に記載した手法を用いて、ブレビバ
クテリウム・フラバムＭＪ２３３（FERM BP-1497）のｐ
ＢＹ５０２除去株に導入して、該菌株を形質転換した。
得られた形質転換株をそれぞれ、ブレビバクテリウム・
フラバムＭＪ２３３−Ｓ−Ａｓｐ、同ＭＪ２３３−ＣＯ
Ｐ１−Ａｓｐ、および同ＭＪ２３３−ＣＯＰ２−Ａｓｐ
と命名した。次に、５００ｍｌ容三角フラスコに分注し
て滅菌し、クロラムフェニコールを最終濃度が６ μg/m
l となるように添加した前出のＡ培地１００ｍｌに、前
記３株を植菌し、これにグルコースを最終濃度が５ g/m
l となるように無菌的に添加した後、３３℃で２日間振
盪培養を行った。

【００５８】本培養培地［組成：５％ グルコース、２.
３％ 硫酸アンモニウム、０.０５％ＫＨ₂ＰＯ₄、０.０
５％ Ｋ₂ＨＰＯ₄、０.０５％ ＭｇＳＯ₄・７Ｈ₂Ｏ、２
０ppmＦｅＳＯ₄・７Ｈ₂Ｏ、２０ppm ＭｎＳＯ₄・ｎＨ₂
Ｏ、２００ μg/ｌ ビオチン、１００ μg/ｌ 塩酸チア
ミン、０.３％ カザミノ酸、および０.３％ 酵母エキス
を純水に溶解して１ｌとした液］１ｌを２ｌ容通気撹拌
槽に仕込み、１２０℃で２０分間のオートクレーブ処理
により滅菌した後、前記培養物 ２０ｍｌを添加し、回
転数１０００rpm、通気量１vvm、温度３３℃、ｐＨ７.
６の条件下で２４時間培養を行った。培養終了後、これ
らの培養液を４０００rpm で１５分間の遠心分離にかけ
て菌体を収集し、これを蒸留水に懸濁してＯ.Ｄ.値（光
学密度、波長６１０ｎｍでの吸光度）が５０の菌体懸濁
液を調製し、該菌体懸濁液を供試液とした。

【００５９】下記表８に示す反応液５０ｍｌを、４５℃
で５時間反応させてＬ−アスパラギン酸を生成させた。
その後、該反応液を４０００rpm で１５分間の遠心分離
にかけ、その上清液中のアスパラギン酸生成量をロイコ
ノストック・メセンテロイデス(Leuconostoc mesentero
ides）ATCC 8042 を使用した微生物定量法により求め
た。その結果を、ＭＪ２３３−Ｓ−Ａｓｐ株による生成
量を１とする相対値として表９に示す。

【００６０】

【表８】

【００６１】

【表９】

【００６２】上記表９の結果にみられる如く、本発明の
多コピー数プラスミドｐＣＯＰ１−１.８およびｐＣＯ
Ｐ２−１.８にアスパラターゼ遺伝子が導入されたプラ
スミドで形質転換された菌株を用いることで、従来より
も高効率にＬ−アスパラギン酸を生産することが可能で
ある。

【００６３】実施例７ ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ２３３由来のトリプ
トファンシンターゼ遺伝子を含むＤＮＡ断片のクローン
化、ならびに該遺伝子を含有するプラスミドｐＣＯＰ１
−１.８−ｔｒｐおよびｐＣＯＰ２−１.８−ｔｒｐの作
製 （Ａ）トリプトファン生合成遺伝子群を含むＤＮＡ断片
の調製 上記実施例５（Ａ）項で調製した、ブレビバクテリウム
・フラバムの染色体ＤＮＡ２５μｇを、制限酵素Ｂａｍ
ＨI ５０ units と３０℃で１時間反応させ、染色体Ｄ
ＮＡのＢａｍＨI分解物溶液を調製した。この分解物溶
液に、プラスミドｐＢＲ３２２（宝酒造製）１μｇを制
限酵素ＢａｍＨIと３７℃で１時間反応させて得た分解
物溶液を混合し、これにそれぞれ最終濃度が ５０ｍＭ
トリス緩衝液（ｐＨ７.６)、１０ｍＭ ジチオスレイト
ール、１ｍＭ ＡＴＰ、１０ｍＭＭｇＣｌ₂、およびＴ４
ＤＮＡリガーゼ １ unit となるように各成分を添加
し、１６℃で１５時間反応させて、ＤＮＡ分解物を結合
させた。

【００６４】得られた溶液を用いて常法［ M.Mandel、
A.Higa ; J. Mol. Biol., 53, 159 (1970)参照］により
大腸菌変異株、エシエリヒア・コリ ATCC23718（トリプ
トファンシンターゼ欠損変異株、即ちトリプトファン要
求性株）を形質転換し、得られた形質転換菌をアンピシ
リンを５０ μg/ml 含む選択培地［組成；Ｋ₂ＨＰＯ₄７
ｇ、ＫＨ₂ＰＯ₄ ２ｇ、(ＮＨ₄)₂ＳＯ₄ １ｇ、ＭｇＳＯ₄
・７Ｈ₂Ｏ ０.１ｇ、３０ｍＭ Ｌ−グルタミン酸ナトリ
ウム塩、および寒天 １６ｇを蒸留水に溶解して１ｌと
する］に塗抹した。選択培地上に生育した菌株を、アン
ピシリンを最終濃度で５０ μg/ml 含有するＬ培地に植
菌し、これを３７℃で７時間培養した。菌体は、培養液
を４℃で１０分間、８,０００×ｇの遠心分離にかけて
収集した。収集した菌株からアルカリ-ＳＤＳ法[T.Mani
atis, E.F. Fritsch, J.Sambrook:“モルキュラー・ク
ローニング(Molecular cloning)" p.90〜91 (1982）参
照]によりプラスミドを抽出した。該プラスミドを制限
酵素ＢａｍＨIにより分解し、その切断断片をアガロー
スゲル電気泳動に供したところ、プラスミドｐＢＲ３２
２のＢａｍＨI部位に約１２.３ｋｂの挿入が認められ
た。

【００６５】（Ｂ）トリプトファン要求性大腸菌変異株
への相補試験 上記（Ａ）項で調製したプラスミド溶液を用いて、トリ
プトファン生合成系の各ステップを欠くトリプトファン
要求性大腸菌変異株であるエシエリヒア・コリATCC2372
0（trpD)、同 ATCC23719（trpC)、同 ATCC23718（trp
B)、同 ATCC23717（trpA)を形質転換し、それぞれの変
異株において約１０⁵ 細胞/μｇＤＮＡの頻度で前記選
択培地上に生育する形質転換株を得た。これにより、上
記（Ｂ）項で調製したプラスミドの大きさ約１２.３ｋ
ｂのＢａｍＨI−ＢａｍＨI ＤＮＡ断片上に trpE、trp
D、trpC、trpB および trpAよりなるトリプトファン生
合成遺伝子群（トリプトファンオペロン）が含まれるこ
とが確認された。以上の如く調製したプラスミドをプラ
スミド“ｐＢＲ３２２−ｔｒｐＯ”と命名した。

【００６６】（Ｃ）トリプトファンシンターゼの構造遺
伝子を含むＤＮＡ断片のｐＫＫ２２３−３へのサブクロ
ーニング 上記（Ｂ）項で得られたｐＢＲ３２２−ｔｒｐＯに含ま
れるトリプトファンシンターゼの構造遺伝子を含むＤＮ
Ａ断片を、ｔａｃ発現ベクターｐＫＫ２２３−３（ファ
ルマシア製）に下記の如くサブクローニングし、該ＤＮ
Ａ断片を特定化した。上記（Ｃ）項で得たプラスミドｐ
ＢＲ３２２−ｔｒｐＯを制限酵素ＥｃｏＲVおよびＢａ
ｍＨIで分解した分解物と、ｔａｃ発現ベクターｐＫＫ
２２３−３を制限酵素ＳｍａIで分解した分解物とを混
合し、これをＳ１ヌクレアーゼで処理して分解物の末端
を平滑末端とした後、該混合液にそれぞれ最終濃度が５
０ｍＭトリス緩衝液（ｐＨ７.６）、１０ｍＭ ジチオス
レイトール、１ｍＭ ＡＴＰ、１０ｍＭ ＭｇＣｌ₂、お
よびＴ４ＤＮＡリガーゼ １ unit となるように各成分
を添加し、１６℃で１５時間反応させてＤＮＡ分解物を
結合させた。

【００６７】得られた溶液を用い、常法［ M.Mandel、
A.Higa ; J. Mol. Bio., 53, 159(1970) 参照］に従い
エシエリヒア・コリＫ−１２系株（トリプトファンシン
ターゼ欠損変異株、即ちトリプトファンシンターゼ要求
性株）を形質転換し、得られた形質転換菌をアンピシリ
ンを５０ μg/ml 含む選択培地［組成；Ｋ₂ＨＰＯ₄７
ｇ、ＫＨ₂ＰＯ₄ ２ｇ、(ＮＨ₄)₂ＳＯ₄ １ｇ、ＭｇＳＯ₄
・７Ｈ₂Ｏ ０.１ｇ、グルコース ２ｇ、および寒天 １
６ｇを蒸留水に溶解して１ｌとする］に塗抹した。前記
選択培地上に生育した菌株を、アンピシリンを最終濃度
で５０ μg/ml 含有するＬ培地に植菌し、これを３７℃
で７時間培養した。菌体は、培養液を４℃で１０分間、
８,０００×ｇの遠心分離にかけて収集した。収集した
菌株から前記アルカリ-ＳＤＳ法によりプラスミドを抽
出した。該プラスミドを制限酵素により切断し、その切
断断片をアガロースゲル電気泳動に供したところ、プラ
スミドｐＫＫ２２３−３の大きさ４.６ｋｂのＤＮＡ断
片に加え、大きさ約３.７ｋｂの挿入ＤＮＡ断片が認め
られた。以上の如く調製したプラスミドをプラスミドｐ
ＢＲ３２２−ｔｒｐＡＢと命名した。

【００６８】次に、このプラスミドｐＢＲ３２２−ｔｒ
ｐＡＢの制限酵素ＢａｍＨI分解物と、実施例３で得た
プラスミドｐＳ−１、ｐＣＯＰ１−１.８およびｐＣＯ
Ｐ２−１.８それぞれの制限酵素ＢａｍＨI分解物とを混
合し、上記条件下でこれらを結合させた。この混合液を
用い、常法に従いエシエリヒア・コリＫ−１２系株（ト
リプトファンシンターゼ欠損変異株、即ちトリプトファ
ン要求性株）を形質転換し、得られた形質転換菌をクロ
ラムフェニコールを５ μg/ml 含む選択培地［組成；Ｋ
₂ＨＰＯ₄ ７ｇ、ＫＨ₂ＰＯ₄ ２ｇ、(ＮＨ₄)₂ＳＯ₄ １
ｇ、ＭｇＳＯ₄・７Ｈ₂Ｏ０.１ｇ、グルコース ２ｇ、お
よび寒天 １６ｇを蒸留水に溶解して１ｌとする］で３
７℃にて２４時間培養した。前記選択培地上に生育した
菌株を常法により液体培養し、該培養液からプラスミド
ＤＮＡを抽出した。該プラスミドを制限酵素ＢａｍＨI
により切断し、その切断断片をアガロースゲル電気泳動
に供したところ、プラスミドｐＳ−１、ｐＣＯＰ１−
１.８およびｐＣＯＰ２−１.８の大きさ約４.０ｋｂの
ＤＮＡ断片に加え、大きさ約３.９ｋｂの挿入ＤＮＡ断
片（ｐＫＫ２２３−３由来ｔａｃプロモーター断片とト
リプトファンシンターゼの構造遺伝子を含むＤＮＡ断
片）が認められた。これらのプラスミドを各種制限酵素
で切断したときの切断断片の大きさを表１０に示す。

【００６９】

【表１０】

【００７０】上記の如く特徴付けられるプラスミドをそ
れぞれｐＳ−１−trp、ｐＣＯＰ１−−１.８trp および
ｐＣＯＰ２−１.８−trp と命名した。

【００７１】実施例８ ｐＣＯＰ１−１.８−trpおよびｐＣＯＰ２−１.８−trp
を含有するブレビバクテリウム・フラバムによるＬ−
トリプトファンの生産 実施例７で調製したｐＳ−１−trp、ｐＣＯＰ１−１.８
−trp およびｐＣＯＰ２−１.８−trpを、参考例１
（Ｄ）に示した方法により、ブレビバクテリウム・フラ
バムＭＪ−２３３（FERM BP-1497）のｐＢＹ５０２除去
株へ導入した。得られた形質転換株をそれぞれ、“ブレ
ビバクテリウム・フラバムＭＪ２３３−Ｓ−trp"、“ブ
レビバクテリウム・フラバムＭＪ２３３−ＣＯＰ１−tr
p”および“ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ２３３
−ｐＣＯＰ２−trp”と命名した。上記３株によりＬ−
トリプトファンを生産させたが、その際Ｌ−トリプトフ
ァンの定性はペーパークロマトグラフのＲｆ値、および
微生物定量法による生物活性値により確認した。また、
Ｌ−トリプトファンの定量は高速液体クロマトグラフィ
ー（島津ＬＣ−５Ａ）を用い、反応液中のグルコースの
定量はグルコースアナライザー（東亜電波工業製 ＧＬ
Ｕ−１）を用いて、それぞれ行った。

【００７２】次に、５００ｍｌ容三角フラスコに分注し
て滅菌し、クロラムフェニコールを６ μg/mlとなるよ
うに添加した前出のＡ培地１００ｍｌに前記３株を植菌
し、これにグルコースを５ ｇ/ml の濃度となるように
無菌的に添加した後、３３℃で２日間振盪培養を行っ
た。本培養培地［組成：５％ グルコース、２.３％ 硫
酸アンモニウム、０.０５％ＫＨ₂ＰＯ₄、０.０５％ Ｋ₂
ＨＰＯ₄、０.０５％ ＭｇＳＯ₄・７Ｈ₂Ｏ、２０ppmＦｅ
ＳＯ₄・７Ｈ₂Ｏ、２０ppm ＭｎＳＯ₄・ｎＨ₂Ｏ、２００
μg/ｌビオチン、１００ μg/ｌ塩酸チアミン、０.３
％ カザミノ酸、０.３％ 酵母エキス］１０００ｍｌを
２ｌ容通気撹拌槽に仕込み、１２０℃で２０分間のオー
トクレーブ処理により滅菌した後、前記培養物 ２０ｍ
ｌを添加し、回転数１０００rpm、通気量１vvm、温度３
３℃、ｐＨ７.６の条件下で２４時間培養を行った。培
養終了後、これらの培養液５００ｍｌを遠心分離にかけ
て菌体を収集し、これを脱塩蒸留水にて２度洗浄した。
得られた清浄な菌体を反応液［組成:２ｇ/l(ＮＨ₄)₂Ｓ
Ｏ₄、０.５ｇ/l ＫＨ₂ＰＯ₄、０.５ｇ/l Ｋ₂ＨＰＯ₄、
０.５ｇ/lＭｇＳＯ₄・７Ｈ₂Ｏ、２０ppm ＦｅＳＯ₄・７
Ｈ₂Ｏ、２０ppm ＭｎＳＯ₄・４〜６Ｈ₂Ｏ；１００ μg/
l 塩酸チアミン；ｐＨ７.６］１０００ｍｌに懸濁後、
該懸濁液を２ｌ容通気撹拌槽に仕込み、グルコール２０
ｇおよびインドール２ｇを添加して、回転数３００rp
m、通気量０.１vvm、温度３３℃、ｐＨ７.６にて２４時
間反応させた。反応終了後、反応液を４℃で１５分間、
４０００ｒｐｍの遠心分離にかけて除菌した上清液中の
Ｌ−トリプトファンを定量した。定量したＬ−トリプト
ファン生成量を、ＭＪ２３３−Ｓ−trp による値を１と
した相対値として、下記表１１に示す。

【００７３】

【表１１】

【００７４】上記表１１の結果にみられる如く、本発明
の多コピー数プラスミドｐＣＯＰ１−１.８およびｐＣ
ＯＰ２−１.８にトリプトファンシンターゼ遺伝子を導
入したプラスミドで形質転換した菌株を用いることで、
従来よりも高効率にＬ−トリプトファンを生産すること
が可能である。

【００７５】

【配列表】

配列番号：1 配列の長さ：1897 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：プラスミド DNA 起源 生物名：ブレビバクテリウム フラバム 株名：MJ233 COP1-1.8 配列の特徴 特徴を表す記号：peptide 存在位置：922-1704 特徴を決定した方法：E 配列 GCGCAGCCTG ACCATGGACA TGCTTCTACG TTCTTCCACA CTGGTATCTT TTGGTTGCAA 60 TATATATTGC AACCATGCTG GTAAAACAAC TTTTTAGCGT GTCTTGCCCA AAATTACAGT 120 CATGTGATTT ACAGTTGAAA GATACTGAAA ATCAAAGAAG GCCACTCGGC GGCAACCGAA 180 TGACCTTCGC TTATCACCCA GTCCTACCTG GGAGAAAGCA TGTACATGAT TATACCCAAT 240 AGTACGCCCG CGTACCCCAT TTCCGGTTCG CGTGTTAACA CGCCATCACG TTTGCGCCCT 300 GACTGCGCAG GCCTTGATGA CACCCCAGCG AGCACCGTTG ACCGGGACAA GCTGCTCGCA 360 CATCTTGGCC GTACAGCACT GCACGGGTCT ATAAGTCGAA ACTTCAAAGG CGCTTATCGC 420 CTCGTTGTGG ATAAGGAAAC GGGGGAAAAG CGAAGCGTTC CGAACCTTTA CCGCATTGAT 480 TCCGAAAAAC TCGGTCGCTG CGAATACGTC ATGCTGACTA GTAAGCAATA TGCTTCGGTC 540 ATGGTCATAG ACGTTGACCA GATAGGAGAG GCTGGAGGAC ATCCAGAAAA CCTCAACTCC 600 TATGTCAAAG GCGTTATCTG GGTACTTGTG CAGCACGGAA TTGGACCAGC ATGGGCAGGC 660 ATTAATCCGA TTAGTGGTAA AGCGCAGTTT ATTTGGCTTA TTGACCCAGT TTATGCAGGA 720 AAGAATCGTG CGTCCCGGAA TATGGAGCTA CTCAAAGCCA CAAGTCACGA GTTGGGTGAG 780 TTACTGGATC ATGATCCACA TTTTGCGCAT CGGTTTAGCC GGAGTCCTTT TTATACTGGA 840 AAGTCACCGG AGGCTTATCG CTGGTATTGC CAGCATGACC GGGTTATACG CCTCCAAGAC 900 TTTCTAAGGC AGGTGCGCGA G ATG GCG GGA CAA TCC CAG CAC ATT AAA AAC 951 Met Ala Gly Gln Ser Gln His Ile Lys Asn 1 5 10 AAG CGC CAG CAA TTT AAC AGT GGC CGT GAG CTT ATT AAT GCG GTC AAA 999 Lys Arg Gln Gln Phe Asn Ser Gly Arg Glu Leu Ile Asn Ala Val Lys 15 20 25 ACT CGC CGT GAA GAA GCC CAA GCC TTT AAA GCA CTT GCT GAG GAT GTC 1047 Thr Arg Arg Glu Glu Ala Gln Ala Phe Lys Ala Leu Ala Glu Asp Val 30 35 40 GAA AAC GAG ATA AGT GAA GAA ATC GAT CAA TAC GAC CCG GAA CTA ATC 1095 Glu Asn Glu Ile Ser Glu Glu Ile Asp Gln Tyr Asp Pro Glu Leu Ile 45 50 55 GAC GGG GTG CGC GTG CGC TGG ATT AGC CAA GGG GTC GCA GCA CGC GAC 1143 Asp Gly Val Arg Val Arg Trp Ile Ser Gln Gly Val Ala Ala Arg Asp 60 65 70 GAA ACA GCG TTT AGC CAC GCA CTA AAA ATT GGT CAC CGC CTA CGC AAA 1191 Glu Thr Ala Phe Ser His Ala Leu Lys Ile Gly His Arg Leu Arg Lys 75 80 85 90 GCA GGA CAA CGA CTC ACA GAC GCC GCC GTT ATC GAT GCC TAC GAG CAT 1239 Ala Gly Gln Arg Leu Thr Asp Ala Ala Val Ile Asp Ala Tyr Glu His 95 100 105 GCC TAT AAC GTT GCA CAA CAA CAA GGC TCA GCA GGC CGA GAC AGC GAA 1287 Ala Tyr Asn Val Ala Gln Gln Gln Gly Ser Ala Gly Arg Asp Ser Glu 110 115 120 ATG CCA CCC ATG CGT GAC CAC CAG ACC ATG GCA CGA CGC GTA CGC GGC 1335 Met Pro Pro Met Arg Asp His Gln Thr Met Ala Arg Arg Val Arg Gly 125 130 135 TAT GTC ACC CAA TCC AAA ACC AAC ACA AGT CTA GGA GCT AGC GCT CCC 1383 Tyr Val Thr Gln Ser Lys Thr Asn Thr Ser Leu Gly Ala Ser Ala Pro 140 145 150 GGA CGC GTT ACC AGC AGC GAA CGC AAA GCA CTG GCC ACC ATG GGG CGA 1431 Gly Arg Val Thr Ser Ser Glu Arg Lys Ala Leu Ala Thr Met Gly Arg 155 160 165 170 AAA GGC GGA CAG AAA GCA GCA CAA CGC TGG AAA ACC GAT CCA GAA GGT 1479 Lys Gly Gly Gln Lys Ala Ala Gln Arg Trp Lys Thr Asp Pro Glu Gly 175 180 185 CAA TAC GCA CAA AAT CAG CTG CAG AAA CTA AAG AAA ACG CAC CGG AAG 1527 Gln Tyr Ala Gln Asn Gln Leu Gln Lys Leu Lys Lys Thr His Arg Lys 190 195 200 AAG CGG GTG GAA GGA CAG ACC ACG CGT GCG AAG ATT CAA GCC TTA ATT 1575 Lys Arg Val Glu Gly Gln Thr Thr Arg Ala Lys Ile Gln Ala Leu Ile 205 210 215 GGT GAA GCT TAC GTG CAA ACA GGC GAG GTA CTT ACC CGC AAA CAG ATT 1623 Gly Glu Ala Tyr Val Gln Thr Gly Glu Val Leu Thr Arg Lys Gln Ile 220 225 230 GTG GAT GAG ACA GGA CTA TCT AGA GCT ACA GTG ACA CGG CAT TTG GCG 1671 Val Asp Glu Thr Gly Leu Ser Arg Ala Thr Val Thr Arg His Leu Ala 235 240 245 250 GCA CTT CGA GAA CAG GGA GCA CTT CCG GAA ACG TAGGGGCTCATACCGTAAGCA 1725 Ala Leu Arg Glu Gln Gly Ala Leu Pro Glu Thr 255 260 ATATACGGTT CCCCTGCCGG TAGGAATGTA GTAATAACCT CTCTTGAAGA AAACCTTGTA 1785 GGGCAAGGCT ACTTATGCTT CCGGGGTTAG TCGTTCTTCT ATTGCGGTGA TGAGTTCTAG 1845 ACCTTTATCT AAGTCCTGGG GGCTGCTGTT GCCGTGCGAG GCTTTGCTGC GC 1897

【００７６】配列番号：2 配列の長さ：1897 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：プラスミド DNA 起源 生物名：ブレビバクテリウム フラバム 株名：MJ233 COP2-1.8 配列の特徴 特徴を表す記号：peptide 存在位置：922-1704 特徴を決定した方法：E 配列 GCGCAGCCTG ACCATGGACA TGCTTCTACG TTCTTCCACA CTGGTATCTT TTGGTTGCAA 60 TATATATTGC AACCATGCTG GTAAAACAAC TTTTTAGCGT GTCTTGCCCA AAATTACAGT 120 CATGTGATTT ACAGTTGAAA GATACTGAAA ATCAAAGAAG GCCACTCGGC GGCAACCGAA 180 TGACCTTCGC TTATCACCCA GTCCTACCTG GGAGAAAGCA TGTACATGAT TATACCCAAT 240 AGTACGCCCG CGTACCCCAT TTCCGGTTCG CGTGTTAACA CGCCATCACG TTTGCGCCCT 300 GACTGCGCAG GCCTTGATGA CACCCCAGCG AGCACCGTTG ACCGGGACAA GCTGCTCGCA 360 CATCTTGGCC GTACAGCACT GCACGGGTCT ATAAGTCGAA ACTTCAAAGG CGCTTATCGC 420 CTCGTTGTGG ATAAGGAAAC GGGGGAAAAG CGAAGCGTTC CGAACCTTTA CCGCATTGAT 480 TCCGAAAAAC TCGGTCGCTG CGAATACGTC ATGCTGACTA GTAAGCAATA TGCTTCGGTC 540 ATGGTCATAG ACGTTGACCA GATAGGAGAG GCTGGAGGAC ATCCAGAAAA CCTCAACTCC 600 TATGTCAAAG GCGTTATCTG GGTACTTGTG CAGCACGGAA TTGGACCAGC ATGGGCAGGC 660 ATTAATCCGA TTAGTGGTAA AGCGCAGTTT ATTTGGCTTA TTGACCCAGT TTATGCAGGA 720 AAGAATCGTG CGTCCCGGAA TATGGAGCTA CTCAAAGCCA CAAGTCACGA GTTGGGTGAG 780 TTACTGGATC ATGATCCACA TTTTGCGCAT CGGTTTAGCC GGAGTCCTTT TTATACTGGA 840 AAGTCACCGG AGGCTTATCG CTGGTATTGC CAGCATGACC GGGTTATACG CCTCCAAGAC 900 TTTCTAAGGC AGGTGCGCGA G ATG GCG GGA CAA TCC CAG CAC ATT AAA AAC 951 Met Ala Gly Gln Ser Gln His Ile Lys Asn 1 5 10 AAG CGC CAG CAA TTT AAC AGT GGC CGT GAG CTT ATT AAT GCG GTC AAA 999 Lys Arg Gln Gln Phe Asn Ser Gly Arg Glu Leu Ile Asn Ala Val Lys 15 20 25 ACT CGC CGT GAA GAA GCC CAA GCC TTT AAA GCA CTT GCT GAG GAT GTC 1047 Thr Arg Arg Glu Glu Ala Gln Ala Phe Lys Ala Leu Ala Glu Asp Val 30 35 40 GAA AAC GAG ATA AGT GAA GAA ATC GAT CAA TAC GAC CCG GAA CTA ATC 1095 Glu Asn Glu Ile Ser Glu Glu Ile Asp Gln Tyr Asp Pro Glu Leu Ile 45 50 55 GAC GGG GTG CGC GTG CGC TGG ATT AGC CAA GGG GTC GCA GCA CGC GAC 1143 Asp Gly Val Arg Val Arg Trp Ile Ser Gln Gly Val Ala Ala Arg Asp 60 65 70 GAA ACA GCG TTT AGC CAC GCA CTA AAA ATT GGT CAC CGC CTA CGC AAA 1191 Glu Thr Ala Phe Ser His Ala Leu Lys Ile Gly His Arg Leu Arg Lys 75 80 85 90 GCA GGA CAA CGA CTC ACA GAC GCC GCC GTT ATC GAT GCC TAC GAG CAT 1239 Ala Gly Gln Arg Leu Thr Asp Ala Ala Val Ile Asp Ala Tyr Glu His 95 100 105 GCC TAT AAC GTT GCA CAA CAA CAA GGC TCA GCA GGC CGA GAC AGC GAA 1287 Ala Tyr Asn Val Ala Gln Gln Gln Gly Ser Ala Gly Arg Asp Ser Glu 110 115 120 ATG CCA CCC ATG CGT GAC CGC CAG ACC ATG GCA CGA CGC GTA CGC GGC 1335 Met Pro Pro Met Arg Asp Arg Gln Thr Met Ala Arg Arg Val Arg Gly 125 130 135 TAT GTC ACC CAA TCC AAA ACC AAC ACA AGT CTA GGA GCT AGC GCT CCC 1383 Tyr Val Thr Gln Ser Lys Thr Asn Thr Ser Leu Gly Ala Ser Ala Pro 140 145 150 GGA CGC GTT ACC AGC AGC GAA CGC AAA GCA CTG GCC ACC ATG GGG CGA 1431 Gly Arg Val Thr Ser Ser Glu Arg Lys Ala Leu Ala Thr Met Gly Arg 155 160 165 170 AAA GGC GGA CAG AAA GCA GCA CAA CGC TGG AAA ACC GAT CCA GAA GGT 1479 Lys Gly Gly Gln Lys Ala Ala Gln Arg Trp Lys Thr Asp Pro Glu Gly 175 180 185 CAA TAC GCA CAA AAT CAG CTG CAG AAA CTA AAG AAA ACG CAC CGG AAG 1527 Gln Tyr Ala Gln Asn Gln Leu Gln Lys Leu Lys Lys Thr His Arg Lys 190 195 200 AAG CGG GTG GAA GGA CAG ACC ACG CGT GCG AAG ATT CAA GCC TTA ATT 1575 Lys Arg Val Glu Gly Gln Thr Thr Arg Ala Lys Ile Gln Ala Leu Ile 205 210 215 GAT GAA GCT TAC GTG CAA ACA GGC GAG GTA CTT ACC CGC AAA CAG ATT 1623 Asp Glu Ala Tyr Val Gln Thr Gly Glu Val Leu Thr Arg Lys Gln Ile 220 225 230 GTG GAT GAG ACA GGA CTA TCT AGA GCT ACA GTG ACA CGG CAT TTG GCG 1671 Val Asp Glu Thr Gly Leu Ser Arg Ala Thr Val Thr Arg His Leu Ala 235 240 245 250 GCA CTT CGA GAA CAG GGA GCA CTT CCG GAA ACG TAGGGGCTCATACCGTAAGCA 1725 Ala Leu Arg Glu Gln Gly Ala Leu Pro Glu Thr 255 260 ATATACGGTT CCCCTGCCGG TAGGAATGTA GTAATAACCT CTCTTGAAGA AAACCTTGTA 1785 GGGCAAGGCT ACTTATGCTT CCGGGGTTAG TCGTTCTTCT ATTGCGGTGA TGAGTTCTAG 1845 ACCTTTATCT AAGTCCTGGG GGCTGCTGTT GCCGTGCGAG GCTTTGCTGC GC 1897

【００７７】配列番号：3配列の長さ：1897 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：プラスミド DNA 起源 生物名：ブレビバクテリウム フラバム 株名：MJ233 GE102 配列の特徴 特徴を表す記号：peptide 存在位置：922-1704 特徴を決定した方法：E 配列 GCGCAGCCTG ACCATGGACA TGCTTCTACG TTCTTCCACA CTGGTATCTT TTGGTTGCAA 60 TATATATTGC AACCATGCTG GTAAAACAAC TTTTTAGCGT GTCTTGCCCA AAATTACAGT 120 CATGTGATTT ACAGTTGAAA GATACTGAAA ATCAAAGAAG GCCACTCGGC GGCAACCGAA 180 TGACCTTCGC TTATCACCCA GTCCTACCTG GGAGAAAGCA TGTACATGAT TATACCCAAT 240 AGTACGCCCG CGTACCCCAT TTCCGGTTCG CGTGTTAACA CGCCATCACG TTTGCGCCCT 300 GACTGCGCAG GCCTTGATGA CACCCCAGCG AGCACCGTTG ACCGGGACAA GCTGCTCGCA 360 CATCTTGGCC GTACAGCACT GCACGGGTCT ATAAGTCGAA ACTTCAAAGG CGCTTATCGC 420 CTCGTTGTGG ATAAGGAAAC GGGGGAAAAG CGAAGCGTTC CGAACCTTTA CCGCATTGAT 480 TCCGAAAAAC TCGGTCGCTG CGAATACGTC ATGCTGACTA GTAAGCAATA TGCTTCGGTC 540 ATGGTCATAG ACGTTGACCA GATAGGAGAG GCTGGAGGAC ATCCAGAAAA CCTCAACTCC 600 TATGTCAAAG GCGTTATCTG GGTACTTGTG CAGCACGGAA TTGGACCAGC ATGGGCAGGC 660 ATTAATCCGA TTAGTGGTAA AGCGCAGTTT ATTTGGCTTA TTGACCCAGT TTATGCAGGA 720 AAGAATCGTG CGTCCCGGAA TATGGAGCTA CTCAAAGCCA CAAGTCACGA GTTGGGTGAG 780 TTACTGGATC ATGATCCACA TTTTGCGCAT CGGTTTAGCC GGAGTCCTTT TTATACTGGA 840 AAGTCACCGG AGGCTTATCG CTGGTATTGC CAGCATGACC GGGTTATACG CCTCCAAGAC 900 TTTCTAAGGC AGGTGCGCGA G ATG GCG GGA CAA TCC CAG CAC ATT AAA AAC 951 Met Ala Gly Gln Ser Gln His Ile Lys Asn 1 5 10 AAG CGC CAG CAA TTT AAC AGT GGC CGT GAG CTT ATT AAT GCG GTC AAA 999 Lys Arg Gln Gln Phe Asn Ser Gly Arg Glu Leu Ile Asn Ala Val Lys 15 20 25 ACT CGC CGT GAA GAA GCC CAA GCC TTT AAA GCA CTT GCT GAG GAT GTC 1047 Thr Arg Arg Glu Glu Ala Gln Ala Phe Lys Ala Leu Ala Glu Asp Val 30 35 40 GAA AAC GAG ATA AGT GAA GAA ATC GAT CAA TAC GAC CCG GAA CTA ATC 1095 Glu Asn Glu Ile Ser Glu Glu Ile Asp Gln Tyr Asp Pro Glu Leu Ile 45 50 55 GAC GGG GTG CGC GTG CGC TGG ATT AGC CAA GGG GTC GCA GCA CGC GAC 1143 Asp Gly Val Arg Val Arg Trp Ile Ser Gln Gly Val Ala Ala Arg Asp 60 65 70 GAA ACA GCG TTT AGC CAC GCA CTA AAA ATT GGT CAC CGC CTA CGC AAA 1191 Glu Thr Ala Phe Ser His Ala Leu Lys Ile Gly His Arg Leu Arg Lys 75 80 85 90 GCA GGA CAA CGA CTC ACA GAC GCC GCC GTT ATC GAT GCC TAC GAG CAT 1239 Ala Gly Gln Arg Leu Thr Asp Ala Ala Val Ile Asp Ala Tyr Glu His 95 100 105 GCC TAT AAC GTT GCA CAA CAA CAA GGC TCA GCA GGC CGA GAC AGC GAA 1287 Ala Tyr Asn Val Ala Gln Gln Gln Gly Ser Ala Gly Arg Asp Ser Glu 110 115 120 ATG CCA CCC ATG CGT GAC CGC CAG ACC ATG GCA CGA CGC GTA CGC GGC 1335 Met Pro Pro Met Arg Asp Arg Gln Thr Met Ala Arg Arg Val Arg Gly 125 130 135 TAT GTC ACC CAA TCC AAA ACC AAC ACA AGT CTA GGA GCT AGC GCT CCC 1383 Tyr Val Thr Gln Ser Lys Thr Asn Thr Ser Leu Gly Ala Ser Ala Pro 140 145 150 GGA CGC GTT ACC AGC AGC GAA CGC AAA GCA CTG GCC ACC ATG GGG CGA 1431 Gly Arg Val Thr Ser Ser Glu Arg Lys Ala Leu Ala Thr Met Gly Arg 155 160 165 170 AAA GGC GGA CAG AAA GCA GCA CAA CGC TGG AAA ACC GAT CCA GAA GGT 1479 Lys Gly Gly Gln Lys Ala Ala Gln Arg Trp Lys Thr Asp Pro Glu Gly 175 180 185 CAA TAC GCA CAA AAT CAG CTG CAG AAA CTA AAG AAA ACG CAC CGG AAG 1527 Gln Tyr Ala Gln Asn Gln Leu Gln Lys Leu Lys Lys Thr His Arg Lys 190 195 200 AAG CGG GTG GAA GGA CAG ACC ACG CGT GCG AAG ATT CAA GCC TTA ATT 1575 Lys Arg Val Glu Gly Gln Thr Thr Arg Ala Lys Ile Gln Ala Leu Ile 205 210 215 GGT GAA GCT TAC GTG CAA ACA GGC GAG GTA CTT ACC CGC AAA CAG ATT 1623 Gly Glu Ala Tyr Val Gln Thr Gly Glu Val Leu Thr Arg Lys Gln Ile 220 225 230 GTG GAT GAG ACA GGA CTA TCT AGA GCT ACA GTG ACA CGG CAT TTG GCG 1671 Val Asp Glu Thr Gly Leu Ser Arg Ala Thr Val Thr Arg His Leu Ala 235 240 245 250 GCA CTT CGA GAA CAG GGA GCA CTT CCG GAA ACG TAGGGGCTCATACCGTAAGCA 1725 Ala Leu Arg Glu Gln Gly Ala Leu Pro Glu Thr 255 260 ATATACGGTT CCCCTGCCGG TAGGAATGTA GTAATAACCT CTCTTGAAGA AAACCTTGTA 1785 GGGCAAGGCT ACTTATGCTT CCGGGGTTAG TCGTTCTTCT ATTGCGGTGA TGAGTTCTAG 1845 ACCTTTATCT AAGTCCTGGG GGCTGCTGTT GCCGTGCGAG GCTTTGCTGC GC 1897

【図面の簡単な説明】

【図１】本発明の多コピー数自律複製ＤＮＡ断片の各種
制限酵素による切断点地図である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁵ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｒ 1:13） (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:15） (72)発明者 湯川 英明 茨城県稲敷郡阿見町中央８丁目３番１号 三菱油化株式会社筑波総合研究所内

Claims (9)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 ブレビバクテリウム・スタチオニス（Br
   evibacterium stationis）IFO12144 が保持するプラスミ
   ドｐＢＹ５０３に由来するコリネ型細菌内でプラスミド
   の自律複製を司る機能に関与する遺伝子を含むＤＮＡ断
   片であって、プラスミドのコピー数を増加し得る変異点
   が該遺伝子内の少なくとも１カ所に存在するＤＮＡ断
   片。
2. 【請求項２】 大きさが６.０ｋｂであり、かつ両末端
   に制限酵素ＫｐｎI切断点を有する、請求項１に記載の
   ＤＮＡ断片。
3. 【請求項３】 下記の制限酵素で切断した場合、下記の
   認識部位数および切断断片の大きさを示す、請求項２に
   記載のＤＮＡ断片。制限酵素 認識部位数 切断断片の大きさ（ｋｂ） Ｓｍａ I １ １.３，４.７Ｘｈｏ I ２ １.６，４.０，０.４Ｓｐｈ I ２ ３.６，１.７，０.７
4. 【請求項４】 大きさが４.０ｋｂであり、かつ両末端
   に制限酵素ＸｈｏI切断点を有する、請求項１に記載の
   ＤＮＡ断片。
5. 【請求項５】 下記の制限酵素で切断した場合、下記の
   認識部位数および切断断片の大きさを示す、請求項４に
   記載のＤＮＡ断片。制限酵素 認識部位数 切断断片の大きさ（ｋｂ） Ｐｓｔ I ２ ０.９，０.８，２.３Ｓｐｈ I ２ ２.０，１.７，０.３
6. 【請求項６】 大きさが１.８ｋｂであり、かつ両末端
   に制限酵素ＨｈａI切断点を有する、請求項１に記載の
   ＤＮＡ断片。
7. 【請求項７】 下記の制限酵素で切断した場合、下記の
   認識部位数および切断断片の大きさを示す、請求項６に
   記載のＤＮＡ断片。制限酵素 認識部位数 切断断片の大きさ（ｋｂ） Ｐｓｔ I １ ０.４，１.４Ｓｐｈ I １ ０.７，１.１Ｓｐｅ I １ １.３，０.５
8. 【請求項８】 コリネ型細菌内でプラスミドの自律複製
   を司る機能に関与する下記の配列： GCGCAGCCTG ACCATGGACA TGCTTCTACG TTCTTCCACA CTGGTATCTT TTGGTTGCAA 60 TATATATTGC AACCATGCTG GTAAAACAAC TTTTTAGCGT GTCTTGCCCA AAATTACAGT 120 CATGTGATTT ACAGTTGAAA GATACTGAAA ATCAAAGAAG GCCACTCGGC GGCAACCGAA 180 TGACCTTCGC TTATCACCCA GTCCTACCTG GGAGAAAGCA TGTACATGAT TATACCCAAT 240 AGTACGCCCG CGTACCCCAT TTCCGGTTCG CGTGTTAACA CGCCATCACG TTTGCGCCCT 300 GACTGCGCAG GCCTTGATGA CACCCCAGCG AGCACCGTTG ACCGGGACAA GCTGCTCGCA 360 CATCTTGGCC GTACAGCACT GCACGGGTCT ATAAGTCGAA ACTTCAAAGG CGCTTATCGC 420 CTCGTTGTGG ATAAGGAAAC GGGGGAAAAG CGAAGCGTTC CGAACCTTTA CCGCATTGAT 480 TCCGAAAAAC TCGGTCGCTG CGAATACGTC ATGCTGACTA GTAAGCAATA TGCTTCGGTC 540 ATGGTCATAG ACGTTGACCA GATAGGAGAG GCTGGAGGAC ATCCAGAAAA CCTCAACTCC 600 TATGTCAAAG GCGTTATCTG GGTACTTGTG CAGCACGGAA TTGGACCAGC ATGGGCAGGC 660 ATTAATCCGA TTAGTGGTAA AGCGCAGTTT ATTTGGCTTA TTGACCCAGT TTATGCAGGA 720 AAGAATCGTG CGTCCCGGAA TATGGAGCTA CTCAAAGCCA CAAGTCACGA GTTGGGTGAG 780 TTACTGGATC ATGATCCACA TTTTGCGCAT CGGTTTAGCC GGAGTCCTTT TTATACTGGA 840 AAGTCACCGG AGGCTTATCG CTGGTATTGC CAGCATGACC GGGTTATACG CCTCCAAGAC 900 TTTCTAAGGC AGGTGCGCGA G ATG GCG GGA CAA TCC CAG CAC ATT AAA AAC 951 Met Ala Gly Gln Ser Gln His Ile Lys Asn 1 5 10 AAG CGC CAG CAA TTT AAC AGT GGC CGT GAG CTT ATT AAT GCG GTC AAA 999 Lys Arg Gln Gln Phe Asn Ser Gly Arg Glu Leu Ile Asn Ala Val Lys 15 20 25 ACT CGC CGT GAA GAA GCC CAA GCC TTT AAA GCA CTT GCT GAG GAT GTC 1047 Thr Arg Arg Glu Glu Ala Gln Ala Phe Lys Ala Leu Ala Glu Asp Val 30 35 40 GAA AAC GAG ATA AGT GAA GAA ATC GAT CAA TAC GAC CCG GAA CTA ATC 1095 Glu Asn Glu Ile Ser Glu Glu Ile Asp Gln Tyr Asp Pro Glu Leu Ile 45 50 55 GAC GGG GTG CGC GTG CGC TGG ATT AGC CAA GGG GTC GCA GCA CGC GAC 1143 Asp Gly Val Arg Val Arg Trp Ile Ser Gln Gly Val Ala Ala Arg Asp 60 65 70 GAA ACA GCG TTT AGC CAC GCA CTA AAA ATT GGT CAC CGC CTA CGC AAA 1191 Glu Thr Ala Phe Ser His Ala Leu Lys Ile Gly His Arg Leu Arg Lys 75 80 85 90 GCA GGA CAA CGA CTC ACA GAC GCC GCC GTT ATC GAT GCC TAC GAG CAT 1239 Ala Gly Gln Arg Leu Thr Asp Ala Ala Val Ile Asp Ala Tyr Glu His 95 100 105 GCC TAT AAC GTT GCA CAA CAA CAA GGC TCA GCA GGC CGA GAC AGC GAA 1287 Ala Tyr Asn Val Ala Gln Gln Gln Gly Ser Ala Gly Arg Asp Ser Glu 110 115 120 ATG CCA CCC ATG CGT GAC CRC CAG ACC ATG GCA CGA CGC GTA CGC GGC 1335 Met Pro Pro Met Arg Asp Xxx Gln Thr Met Ala Arg Arg Val Arg Gly 125 130 135 TAT GTC ACC CAA TCC AAA ACC AAC ACA AGT CTA GGA GCT AGC GCT CCC 1383 Tyr Val Thr Gln Ser Lys Thr Asn Thr Ser Leu Gly Ala Ser Ala Pro 140 145 150 GGA CGC GTT ACC AGC AGC GAA CGC AAA GCA CTG GCC ACC ATG GGG CGA 1431 Gly Arg Val Thr Ser Ser Glu Arg Lys Ala Leu Ala Thr Met Gly Arg 155 160 165 170 AAA GGC GGA CAG AAA GCA GCA CAA CGC TGG AAA ACC GAT CCA GAA GGT 1479 Lys Gly Gly Gln Lys Ala Ala Gln Arg Trp Lys Thr Asp Pro Glu Gly 175 180 185 CAA TAC GCA CAA AAT CAG CTG CAG AAA CTA AAG AAA ACG CAC CGG AAG 1527 Gln Tyr Ala Gln Asn Gln Leu Gln Lys Leu Lys Lys Thr His Arg Lys 190 195 200 AAG CGG GTG GAA GGA CAG ACC ACG CGT GCG AAG ATT CAA GCC TTA ATT 1575 Lys Arg Val Glu Gly Gln Thr Thr Arg Ala Lys Ile Gln Ala Leu Ile 205 210 215 GRT GAA GCT TAC GTG CAA ACA GGC GAG GTA CTT ACC CGC AAA CAG ATT 1623 Zzz Glu Ala Tyr Val Gln Thr Gly Glu Val Leu Thr Arg Lys Gln Ile 220 225 230 GTG GAT GAG ACA GGA CTA TCT AGA GCT ACA GTG ACA CGG CAT TTG GCG 1671 Val Asp Glu Thr Gly Leu Ser Arg Ala Thr Val Thr Arg His Leu Ala 235 240 245 250 GCA CTT CGA GAA CAG GGA GCA CTT CCG GAA ACG TAGGGGCTCATACCGTAAGCA 1725 Ala Leu Arg Glu Gln Gly Ala Leu Pro Glu Thr 255 260 ATATACGGTT CCCCTGCCGG TAGGAATGTA GTAATAACCT CTCTTGAAGA AAACCTTGTA 1785 GGGCAAGGCT ACTTATGCTT CCGGGGTTAG TCGTTCTTCT ATTGCGGTGA TGAGTTCTAG 1845 ACCTTTATCT AAGTCCTGGG GGCTGCTGTT GCCGTGCGAG GCTTTGCTGC GC 1897 （上記塩基配列中１３０７番目および１５７７番目のＲ
   はＧまたはＡを示すが、双方が同時にＧであることはな
   く、ならびに上記アミノ酸配列中１２９番目のＸｘｘは
   ＡｒｇまたはＨｉｓを、２１９番目のＺｚｚはＧｌｙま
   たはＡｓｐをそれぞれ示し、かつ１２９番目のＸｘｘが
   ＡｒｇであるときにはＺｚｚがＧｌｙであることはな
   い。）を含む、ＤＮＡ断片。
9. 【請求項９】 請求項１〜８のいずれか一つに記載の
   ＤＮＡ断片を保有する、コリネ型細菌内で複製可能なプ
   ラスミドベクター。