JPH06331620A - アミノ酸のフェニルチオヒダントイン誘導体の分析方法 - Google Patents

アミノ酸のフェニルチオヒダントイン誘導体の分析方法

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JPH06331620A
JPH06331620A JP14273793A JP14273793A JPH06331620A JP H06331620 A JPH06331620 A JP H06331620A JP 14273793 A JP14273793 A JP 14273793A JP 14273793 A JP14273793 A JP 14273793A JP H06331620 A JPH06331620 A JP H06331620A
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JP
Japan
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pth
amino acid
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eluent
acetonitrile
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JP14273793A
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English (en)
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Hitoshi Uemori
仁志 上森
Kunio Takiuchi
邦雄 瀧内
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Fujifilm Wako Pure Chemical Corp
Original Assignee
Wako Pure Chemical Industries Ltd
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Abstract

(57)【要約】 【目的】 高速液体クロマトグラフィ（以下、HPLCと
略記する。）により高感度に且つ高精度にアミノ酸のフ
ェニルチオヒダントイン誘導体（以下、PTHアミノ酸と
略記する。）を分析し得る方法を提供することをその目
的とする。 【構成】 本発明は、（ｉ）比表面積（m2/g）：450
〜520、（ii）細孔容量（ml/g）：0.9〜1.1、（iii）細
孔直径（オンク゛ストローム）：60〜90、（iｖ）炭素含量（w/w
％）：17〜22、なる物性を有するオクタデシルシリカゲ
ルを充填した逆相カラムを使用し、(Ａ)メタノール、ア
セトニトリル及び緩衝液を含んで成る溶離液、及び(Ｂ)
第２級アルコール、メタノール及びアセトニトリルを含
んで成る溶離液を用いてグラジエント溶出を行うことを
特徴とする、HPLCによるPTHアミノ酸の分析方法。

Description

【発明の詳細な説明】
【産業上の利用分野】本発明は逆相カラムを用いた高速
液体クロマトグラフィ（以下、HPLCと略記する。）によ
るアミノ酸のフェニルチオヒダントイン誘導体（以下、
PTHアミノ酸と略記する。）の分析方法に関する。
【０００２】
【発明の背景】アミノ酸配列分析は蛋白質の１次構造の
決定に欠くことのできない重要な分析の一つで、蛋白
質、ペプチド等の研究や利用に関与する、医学、薬学、
生化学等の分野で広く行われている。
【０００３】アミノ酸配列分析を行う方法としては、現
在逆相カラムを用いたHPLCを利用する方法が主流であ
る。中でもエドマン分解反応により、蛋白質、ペプチド
等のアミノ末端（以下、Ｎ末端と略記する。）側から、
逐次アミノ酸残基をアニリノチアゾリノン誘導体として
遊離させ、次にアニリノチアゾリノン誘導体をより安定
なPTHアミノ酸に変換した後、逆相カラムを用いて分
離、同定する方法は、例えば、（ｉ）蛋白質を構成する
20種のアミノ酸のPTHアミノ酸を１本のカラムで分析で
きる、（ii）すべてのPTHアミノ酸は分析中に安定で同
程度のＵＶ吸収をもっているので定量分析が可能である
（システインはあらかじめ誘導体化反応処理を行ってお
くことにより安定に分析可能）、（iii）検出感度が高
い（検出限界：p molレベル）、（iｖ）分析が迅速であ
る（分析所要時間：45分以下）、（ｖ）特定のPTHアミ
ノ酸が分取できる、等の利点を有していることから一般
に広く利用されている。
【０００４】逆相カラムを装着したHPLCを利用し、PTH
アミノ酸を分析する方法としては、溶離液としてテトラ
ヒドロフラン（以下、THFと略記する。）を添加した緩
衝液及びアセトニトリルを用い、充填剤としてオクタデ
シルシリカゲル（以下、ODSシリカゲルと略記する。）
を充填した逆相カラムを用いて分析する方法がその代表
的なものとして挙げられる。
【０００５】しかしながら、この方法は、溶離液に含有
されたTHFが不安定であるため、分析時のベースライン
が経時的に上昇することや、PTH-リジンのピークが小さ
くなる等の問題点を有しているため、測定精度の面で、
必ずしも満足できるものではなかった。
【０００６】また、上記した如き問題点を解決するため
に、アセトニトリル、緩衝液、ドデシル硫酸ナトリウム
からなる単一溶離液を用いてPTHアミノ酸を分析する方
法も実施されている。しかしがら、この方法も、遅れて
溶出されるPTHアミノ酸ほどピークが広がるために検出
感度が低下することや、濃度勾配を利用する方法に比べ
分離能が良くないこと等の問題点を有しており、更なる
改良が求められている現状にある。
【０００７】
【発明の目的】本発明は上記した如き状況に鑑みなされ
たもので、HPLCにより高感度に且つ高精度にPTHアミノ
酸を分析し得る方法を提供することをその目的とする。
【０００８】
【発明の構成】本発明は、（ｉ）比表面積（m2/g）：45
0〜520、（ii）細孔容量（ml/g）：0.9〜1.1、（iii）
細孔直径（オンク゛ストローム）：60〜90、（iｖ）炭素含量（w/
w％）：17〜22、なる物性を有するオクタデシルシリカ
ゲルを充填した逆相カラムを使用し、(Ａ)メタノール、
アセトニトリル及び緩衝液を含んで成る溶離液、及び
(Ｂ)第２級アルコール、メタノール及びアセトニトリル
を含んで成る溶離液を用いてグラジエント溶出を行うこ
とを特徴とする、HPLCによるPTHアミノ酸の分析方法の
発明である。
【０００９】即ち、本発明者らは逆相カラムを装着した
HPLCによりPTHアミノ酸を分析するに当たり、不安定なT
HFを添加した溶離液を使用することなく、PTHアミノ酸
を高感度に、且つ高精度に分析し得る方法を求めて鋭意
研究を重ねた結果、逆相カラムの充填剤として特定の物
性を有するODSシリカゲルを用い、溶離液として(Ａ)メ
タノール、アセトニトリル及び緩衝液を含んで成る溶離
液（以下、溶離液Ａと略記する。）、及び(Ｂ)第２級ア
ルコール、メタノール及びアセトニトリルを含んで成る
溶離液（以下、溶離液Ｂと略記する。）の２液の組合せ
を用いた場合には上記の目的を達成し得ることを見出
し、本発明を完成するに至った。
【００１０】本発明に於て用いられるODSシリカゲルと
しては、（ｉ）比表面積（m2/g）：450〜520、（ii）細
孔容量（ml/g）：0.9〜1.1、（iii）細孔直径（オンク゛ストロ
ーム）：60〜90、（iｖ）炭素含量（w/w％）：17〜22、な
る物性を有しているものであれば特に限定することなく
挙げられる。尚、上記の物性のうち（ｉ）比表面積、
（ii）細孔容量、（iii）細孔直径はＢＥＴ法により、
また、（iｖ）炭素含量は通常の元素分析により夫々測
定を行って得られたものである。
【００１１】本発明に係る溶離液Ａに於けるメタノール
の濃度としては、通常１〜８％、好ましくは２〜４％の
範囲が挙げられ、アセトニトリルの濃度としては、通常
３〜10％、好ましくは５〜７％の範囲が挙げられる。ま
た、本発明に係る溶離液Ａに例えばイソプロピルアルコ
ール、secーブチルアルコール等の第２級アルコールを添
加した場合には分析時間が短くなるという効果が生じる
ので、好ましい。また、溶離液Ａ中の第２級アルコール
の濃度としては分析に支障がない範囲であれば特に限定
されないが、通常３％以下、好ましくは１〜２％の範囲
で添加するのが効果的である。
【００１２】本発明に係る溶離液Ａ中にはｐＨを一定に
保つために緩衝剤が含まれている必要があり、この目的
で用いることのできる緩衝剤としてはＵＶ領域に殆ど吸
収を持たないものであれば特に限定されることなく挙げ
られるが、例えば、酢酸塩、リン酸塩、ホウ酸塩等の緩
衝剤が好ましく挙げられる。また、これらの使用量とし
ては溶離液中の濃度として通常10〜200mM、好ましくは5
0〜100mMの範囲が挙げられる。
【００１３】また、溶離液ＡのｐＨとしては、PTHアミ
ノ酸の同定に影響を与えない範囲であれば特に限定され
ないが、通常ｐＨ3.5〜ｐＨ4.5の範囲から適宜選択され
る。
【００１４】本発明に係る溶離液Ｂに使用される第２級
アルコールとしては必要な濃度範囲で水中に均一に溶解
する第２級アルコールであれば特に限定することなく挙
げられるが、例えばイソプロピルアルコール、sec-ブチ
ルアルコール等が好ましく挙げられ、中でもイソプロピ
ルアルコールはＵＶの領域での吸収が少なく且つ悪臭も
少なく更にPTHアミノ酸の分離も良好であるので特に好
ましく用いられる。
【００１５】溶離液Ｂに於ける第２級アルコールの濃度
としては、第２級アルコールの種類により若干異なる
が、通常65〜85％、好ましくは70〜80％の範囲が挙げら
れ、メタノールの濃度としては、通常10〜25%、好まし
くは15〜20％の範囲が挙げられ、アセトニトリルの濃度
としては、通常５〜20％、好ましくは10〜15％の範囲が
挙げられる。
【００１６】尚、PTHアミノ酸の分離能という観点から
判断すれば、第２級アルコールの代りに例えば1,4-ジオ
キサン等も使用可能であるが、これらの溶媒はＵＶ領域
に比較的強い吸収を有しているのでPTHアミノ酸の分析
に用いるにはあまり好ましいものではない。
【００１７】尚、溶離液調製のために用いられる試薬類
は、これら溶離液中にPTHアミノ酸の分析を阻害する不
純物が含まれないように、しかるべき純度のものを使用
しなければならないことは言うまでもない。
【００１８】また、本発明の方法によりPTHアミノ酸の
同定を行う際に、エドマン分解反応で生成する反応副生
成物であるジメチルフェニルチオ尿素、ジフェニルチオ
尿素、ジフェニル尿素が検出されることがあり、PTHア
ミノ酸同定の妨げとなるので、これらのピークがPTHア
ミノ酸のピークと重ならないように、有機溶媒濃度、緩
衝液の濃度及びｐＨを適宜選択し、溶離液を調製しなけ
ればならないということは言うまでもない。
【００１９】本発明に於て用いられるHPLC装置として
は、通常用いられている汎用のHPLC装置であって、リニ
ア型グラジエントを実施し得るものであれば特に限定さ
れることなく挙げられ、その他特別な機能を備えている
必要はない。
【００２０】本発明の分析方法を実施するには、例えば
以下の如く行えば良い。即ち、本発明に係るODSシリカ
ゲルを充填し、前記した如き組成の溶離液Ａで平衡化し
た逆相カラム（カラム自体としては、内径(φ)が通常2.
0〜4.6mm、好ましくは2.1〜3.2mmで、長さが通常75〜25
0mm、好ましくは100〜225mmのステンレス製のものが好
ましく挙げられる。）を装着したHPLC装置に、例えばPT
Hアミノ酸を含む20％アセトニトリル水溶液等の試料を
通常５〜50μｌ注入した後、通常室温〜50℃、好ましく
は36〜45℃で通常0.1〜1.0ml/minの流速で、前記した如
き溶離液Ａ及び溶離液Ｂを用いて０〜４％Ｂから25〜75
％Ｂへ、好ましくは０〜２％Ｂから30〜60％Ｂの範囲で
リニア型グラジエント溶出を行うことによりPTHアミノ
酸を高感度且つ高精度に分析し得る。
【００２１】以下に、実施例を挙げて本発明を更に具体
的に説明するが、本発明はこれら実施例により何ら限定
されるものではない。
【００２２】
【実施例】
実施例１ 溶離液の経時的変化の検討 （溶離液） Ａ：85mM酢酸緩衝液（ｐＨ4.18、メタノール３％及びア
セトニトリル６％含有） Ｂ：イソプロピルアルコール70％、メタノール15％、ア
セトニトリル15％含有
【００２３】（充填剤） (１)比表面積（m2/g）：487、(２)細孔容量（ml/g）：
0.96、(３)細孔直径（オンク゛ストローム）：78、(４)炭素含有
量（W/W％）：19.8、の物性を有するODSシリカゲルを使
用した。
【００２４】（PTHアミノ酸溶液）PTHアミノ酸混合標準
品（和光純薬工業(株)製）適当量を20％アセトニトリル
水溶液に溶解したものに、PTH-ピリジルエチルシステイ
ン、エドマン分解反応副生成物であるジメチルフェニル
チオ尿素（以下、DMPTUと略記する。）、ジフェニルチ
オ尿素（以下、DPTUと略記する。）、ジフェニル尿素
（以下、DPUと略記する。）を添加した後、PTHアミノ酸
濃度が夫々１n mol/mlとなるよう20％アセトニトリル溶
液で希釈したものを、PTHアミノ酸溶液とした。
【００２５】（操作法）上記のODSシリカゲルを充填し
たカラム（2.1φ×225mm）を装着したLC-10A型HPLC装置
（島津製作所(株)製）を上記溶離液Ａにて平衡化した
後、PTHアミノ酸溶液50μlを注入し、流速0.25ml/min、
温度40℃で、下記に示す条件でリニアグラジエント溶出
を行った。尚、PTHアミノ酸及びエドマン分解反応副生
成物の検出は波長269nmの吸光度の変化を測定すること
により行った。また、別に溶離液Ａとして調製後６週間
室温で保存したものを用い、それ以外は上記で用いたも
のと同じ溶離液Ｂ及びPTHアミノ酸溶液を用い、上記と
同様の操作を行った。 グラジエント条件 ０ー２０min ：０ー３３％Ｂ ２０ー２５min ： ３３％Ｂ ２５ー３０min ： ５５％Ｂ
【００２６】（結果）得られた結果を図１に示す。尚、
図１の(１)は調製直後の溶離液Ａを使用して得られた結
果を、(２)は調製後６週間室温で保存した溶離液Ａを使
用して得られた分析の結果を夫々示す。また、図１の各
図に於ける各ピーク番号は夫々以下のPTHアミノ酸又は
エドマン分解反応副生成物のピークを示す。１：PTH-ヒ
スチジン、２：PTH-アスパラギン酸、３：PTHーアスパラ
ギン、４：PTH-アルギニン、５：PTH-セリン、６：PTHー
スレオニン、７：PTH-グルタミン、８：PTH-グリシン、
９：PTH-グルタミン酸、10：DMPTU、11：PTH-アラニ
ン、12：PTH-チロシン、13:PTH-ピリジルエチルシステ
イン、14：PTH-デルタスレオニン、15：PTH-プロリン、
16：PTH-メチオニン、17：PTH-バリン、18：DPTU、19：
PTH-トリプトファン、20：PTH-リジン、21：PTH-フェニ
ルアラニン、22：PTH-イソロイシン、23：PTH-ロイシ
ン、24：ＤＰＵ。図１の(１)及び(２)の結果から明らか
な如く、本発明のPTHアミノ酸分析に於いては、THF無添
加の溶離液を用いているため、経時的なベースラインの
上昇は認められず且つ各ピークの分離が良好であるこ
と、即ち溶離液が安定であることが判る。
【００２７】実施例２ （溶離液）実施例１と同じものを使用した。
【００２８】（充填剤） (１)比表面積（m2/g）：482、(２)細孔容量（ml/g）：
0.95、(３)細孔直径（オンク゛ストローム）：78、(４)炭素含量
（w/w％）：20.5、の物性を有するODSシリカゲルを使用
した。
【００２９】（試料）PTHアミノ酸混合標準品（和光純
薬工業(株)製）を20％アセトニトリル水溶液で溶解した
ものに、PTH-ピリジルエチルシステイン、エドマン分解
反応副生成物であるDMPTU、DPTU、DPUを添加した後、PT
Hアミノ酸濃度が夫々10p mol/mlとなるように20％アセ
トニトリル水溶液で希釈したものを、試料とした。
【００３０】（操作法）上記のODSシリカゲルを充填し
たカラム（2.1φ×225mm）を装着したLC-10A型HPLC装置
（島津製作所(株)製）を上記溶離液Ａにて平衡化した
後、試料50μlを注入し、流速0.25ml/min、温度40℃の
条件下で実施例１と同様の条件でリニアグラジエント溶
出を行った。尚、PTHアミノ酸及びエドマン分解反応副
組成物の検出は波長の269nmの吸光度の変化を測定する
ことにより行った。
【００３１】（結果）得られた結果を図２に示す。尚、
図２中に於ける各ピーク番号は夫々図１のそれと同じも
のを示す。図２から明らかな如く、本発明によれば、10
p mol/mlのPTHアミノ酸（注入量：0.5p mol）でも十分
に検出可能であることが判る。。
【００３２】実施例３ 溶離液中に於ける有機溶媒濃度のPTHアミノ酸分析への
影響について検討を行った。 （溶離液）表１に示す如き組成の溶離液Ａ及びＢを組合
せて使用した。
【表１】
【００３３】（充填剤）実施例２と同じものを使用し
た。
【００３４】（試料）実施例１で調製したPTHアミノ酸
溶液を試料として使用した。
【００３５】（操作法）実施例２と同じカラム及び装置
を用いて、実施例２と同様の操作を行った。
【００３６】（結果）得られた結果を図３〜図１２に示
す。図３〜図１２は、表１の１〜10に示した溶離液Ａ及
びＢの組合せを順次使用して得られた結果を夫々示す。
尚、図３〜図１２に於ける各ピークの番号は夫々図１の
それと同じものを示す。図１の(２)及び図３〜図６の結
果から明らかな如く、溶離液Ａに於て、メタノールは２
〜４％の濃度範囲で、また、アセトニトリルは、５〜７
％の濃度範囲で、PTHアミノ酸の分析が可能であること
が判る。また、図７〜図１２の結果から明らかな如く、
溶離液Ｂに於て、イソプロピルアルコールは68〜74％の
濃度範囲で、メタノールは10〜16％の濃度範囲で、ま
た、アセトニトリルは、13〜19％の濃度範囲で、PTHア
ミノ酸分析が可能であることが判る。
【００３７】実施例４ 溶離液ＡのｐＨが分析へ与える影響について検討を行っ
た。 （溶離液） Ａ：メタノール３v/v％、アセトニトリル７v/v％を含
む、所定ｐＨの85mM酢酸緩衝液を使用した。 Ｂ：イソプロピルアルコール71％、メタノール13％、ア
セトニトリル16％を含む溶液を使用した。
【００３８】（充填剤）実施例２と同じものを使用し
た。
【００３９】（試料）実施例１で調製したPTHアミノ酸
溶液を試料として使用した。
【００４０】（操作法）実施例２と同じカラム及び装置
を用いて、実施例２と同様の操作を行った。
【００４１】（結果）得られた結果を図１３〜図１５に
示す。尚、図１３はｐＨ4.08の溶離液Ａを使用して得ら
れた結果を、図１４はｐＨ4.18の溶離液Ａを使用して得
られた結果を、また、図１５はｐＨ4.28の溶離液Ａを使
用して得られた結果を夫々示す。尚、図１３〜図１５に
於ける各ピーク番号は夫々図１のそれと同じものを示
す。これらの結果から明らかな如く、上記の条件下でPT
Hアミノ酸を効率的に分析するためには、ｐＨ4.18付近
の溶離液Ａを用いるのが好ましいことが判る。即ち、ｐ
Ｈ4.08の緩衝液を溶離液Ａとして使用した場合には９番
目（PTH-グルタミン酸）及び10番目（DMPTU）のピーク
が重なり、また、ｐＨ4.28の緩衝液を溶離液Ａとして使
用した場合には１番目（PTH-ヒスチジン）及び２番目
（PTH-アスパラギン酸）のピーク並びに８番目（PTH-グ
リシン）及び９番目（PTH-グルタミン酸）のピークが重
なって、PTHアミノ酸分析を精度良く実施し得ないこと
が判る。尚、溶離液の組成を変えることにより、ｐＨ4.
08及びｐＨ4.28の溶離液を使用した場合でも、PTHアミ
ノ酸分析を精度良く実施することは可能である。
【００４２】実施例５ 種々の物性を有するODSシリカ
ゲルによるPTHアミノ酸の分析 （溶離液） Ａ：85mM酢酸緩衝液（pH4.18、メタノール３％、アセト
ニトリル６％含有） Ｂ：イソプロピルアルコール70％、メタノール15％、ア
セトニトリル15％含有
【００４３】（充填剤）表２に示す如き物性を有するOD
Sシリカゲルを充填剤として使用した。
【表２】
【００４４】（試料）実施例１で調製したPTHアミノ酸
溶液を試料として使用した。
【００４５】（操作法）実施例２と同じカラム及び装置
を用いて、実施例２と同様の操作を行った。
【００４６】（結果）図１６〜図１９に夫々充填剤１〜
４を使用して得られた結果を示す。尚、図１６〜図１９
に於ける各ピークの番号は夫々図１のそれと同じものを
示す。これらの結果から明らかな如く、PTHアミノ酸を
効率的に分析するためには、充填剤２或は３の如き物性
を有するODSシリカゲルを充填剤として用いるのが好ま
しいことが判る。即ち、充填剤１を使用した場合には、
１番目（PTH-ヒスチジン）と２番目（PTH-アスパラギン
酸）のピーク、４番目（PTH-アルギニン）と５番目（PT
H-セリン）のピーク、７番目（PTH-グルタミン）と８番
目（PTH-グリシン）のピーク及び９番目（グルタミン
酸）と10番目（DMPTU）のピークが重なり、充填剤４を
使用した場合には１番目（PTH-ヒスチジン）と２番目
（PTH-アスパラギン酸）のピーク、８番目（PTH-グリシ
ン）と９番目（PTH-グルタミン酸）のピーク及び15番目
（PTH-プロリン）と16番目（PTH-メチオニン）のピーク
が重なり、PTHアミノを精度よく分析し得ないことが判
る。
【００４７】実施例６ 逆相カラムのカラムサイズによる分析への影響について
検討を行った。 （カラム）実施例１と同じ充填剤を表３に示す如きサイ
ズのカラムに充填したものを使用した。
【表３】
【００４８】（溶離液） Ａ：85mM酢酸緩衝液（pＨ4.15、イソプロピルアルコー
ル２％、メタノール４％、アセトニトリルを６％含
有）。 Ｂ：イソプロピルアルコール７５％、メタノール２０
％、アセトニトリル５％含有。
【００４９】（試料）実施例１で調製したPTHアミノ酸
溶液を試料として使用した。
【００５０】（操作法）上記の何れかのカラムを装着し
たＬＣ−１０Ａ型ＨＰＬＣ装置（島津製作所（株）製）
を上記溶離液Ａにて平衡化した後、試料５０μｌを注入
し、流速０．２５ml/min、温度４０℃で以下に示す条件
でリニアグラジエント溶出を行った。尚、PTHアミノ酸
及びエドマン分解反応副生成物の検出は波長269nmの吸
光度の変化を測定することによって行った。 グラジエント条件 ０−１４min ： ０−２４％Ｂ １４−２５min ：２４−３３％Ｂ ２５−３０min ： ５５％Ｂ
【００５１】（結果）得られた分析結果を、図２０に示
す。尚、図２０に於いて、(１)は2.1φ×225mmのカラム
を使用して得られた結果を、(２)は3.2φ×100mmのカラ
ムを使用して得られた結果を、(３)は4.0φ×75mmのカ
ラムを使用して得られた結果を夫々示す。また図２０に
於ける各ピークの番号は夫々図１のそれと同じものを示
す。これらの結果から明らかな如く、PTHアミノ酸を効
率的に分析するためには、１或は２の如きサイズのカラ
ムを使用するのが好ましいことが判る。即ち、図２０の
(３)から明らかな如く、4.0φ×75mmのカラムを使用し
た場合には６番目（PTH−スレオニン）と７番目（PTH−
グルタミン）のピーク、及び８番目（PTH−グリシン）
と９番目（PTH−グルタミン酸）のピークが重なり、PTH
アミノ酸を精度よく分析し得ないことが判る。
【００５２】実施例７ 再現性の検討 （溶離液）実施例１と同じものを使用した。
【００５３】（充填剤）実施例２と同じものを使用し
た。
【００５４】（試料）実施例１で調製したPTHアミノ酸
溶液を試料として使用した。
【００５５】（操作法）実施例２と同じカラム及び装置
を用い、実施例２と同様の操作で分析を行った。
【００５６】（結果）10回繰り返し分析を行って得られ
た結果を表４に示す。
【表４】 表４の結果から明らかな如く、本発明によればPTHアミ
ノ酸を再現性良く分析し得ることが判る。
【００５７】実施例８ ミオグロビンのアミノ酸配列の
分析 （溶離液）実施例１と同じものを使用した。
【００５８】（充填剤）実施例２と同じものを使用し
た。
【００５９】（試料）ミオグロビン（和光純薬工業(株)
製）100pmolをプロテインシークエンサーPSQ-1（島津製
作所(株)製）に供し、常法により順次得られるPTHアミ
ノ酸を夫々含む溶液を試料とした。 （操作法）上記ODSシリカゲルを充填したカラム（2.1φ
×225mm）を装着したLC-10A型HPLC装置（島津製作所
(株)製）を上記溶離液Ａにて平衡化した後、試料50μl
を注入し、流速0.25ml/min、温度40℃で以下に示す条件
下にリニアグラジエント溶出を行った。尚PTHアミノ酸
及びエドマン分解反応副生成物の検出は波長269nmの吸
光度の変化を測定することにより行った。 グラジエント条件 ０ー２０min ：０ー３３％Ｂ ２０ー２５min ： ３３％Ｂ ２５ー３０min ： ５５％Ｂ
【００６０】（結果）各試料についてのHPLCによる分析
の結果を図２１〜図４０に示す。尚、図２１.は実施例
１で調製したPTHアミノ酸溶液を試料として分析を行っ
た結果を、図２２〜図３０は、ミオグロビンのＮ末端か
ら１番目〜９番目のアミノ酸残基を順次遊離させた後誘
導体化して得られたPTHアミノ酸夫々を含む試料につい
て分析を行って得られた結果を夫々示す。また、図３１
〜図４０はＮ末端から10番目〜19番目のアミノ酸残基を
順次遊離させた後誘導体化して得られたPTHアミノ酸を
夫々含む試料について分析を行って得られた結果を夫々
示す。尚、図２１〜図４０に於ける各ピークの番号は夫
々図１のそれと同じものを示す。また、表５に既知のミ
オグロビンのＮ末端側の１番目〜19番目のアミノ酸配列
と、図２２〜図４０で検出されたPTHアミノ酸の中で最
も大きなピークを図２１により得られる標準PTHアミノ
酸のピークと保持時間との関係にあてはめることにより
同定された、ミオグロビンのＮ末端側の１番目〜１９番
目のアミノ酸配列とを併せて示す。
【表５】 表５の結果から明らかな如く、本発明の方法により得ら
れたミオグロビンのアミノ酸配列が既知のアミノ酸配列
と一致すること、言い換えれば本発明の方法により精度
よくアミノ酸配列の分析を行うことができることが判
る。
【００６１】
【発明の効果】以上に述べた如く、本発明は従来の方法
に於ける種々の問題点、例えば、THFを含有する溶離液
を使用する方法に於けるTHFが不安定であるため分析時
のベースラインが経時的に上昇すること、PTH-リジンの
ピークが小さくなること等、或は単一溶離液を使用する
方法に於ける遅れて溶出されるPTHアミノ酸ほどピーク
が広がり検出感度が低くなることや、濃度勾配を利用す
る方法に比べ分離能が良くないこと等の問題点を全て解
決したPTHアミノ酸の分析方法を提供するものであり、
斯業に貢献するところ大なる発明である。
【００６２】
【図面の簡単な説明】
【図１】図１は実施例１で得られた高速液体クロマトグ
ラフィ（HPLC）の結果を示す。
【図２】図２は実施例２で得られたHPLCの結果を示す。
【図３】図３は実施例３で得られたHPLCの結果を示す。
【図４】図３は実施例３で得られたHPLCの結果を示す。
【図５】図３は実施例３で得られたHPLCの結果を示す。
【図６】図３は実施例３で得られたHPLCの結果を示す。
【図７】図３は実施例３で得られたHPLCの結果を示す。
【図８】図３は実施例３で得られたHPLCの結果を示す。
【図９】図３は実施例３で得られたHPLCの結果を示す。
【図１０】図３は実施例３で得られたHPLCの結果を示
す。
【図１１】図３は実施例３で得られたHPLCの結果を示
す。
【図１２】図３は実施例３で得られたHPLCの結果を示
す。
【図１３】図４は実施例４で得られたHPLCの結果を示
す。
【図１４】図４は実施例４で得られたHPLCの結果を示
す。
【図１５】図４は実施例４で得られたHPLCの結果を示
す。
【図１６】図１６は実施例５で得られたHPLCの結果を示
す。
【図１７】図１７は実施例５で得られたHPLCの結果を示
す。
【図１８】図１８は実施例５で得られたHPLCの結果を示
す。
【図１９】図１９は実施例５で得られたHPLCの結果を示
す。
【図２０】図２０は実施例６で得られたHPLCの結果を示
す。
【図２１】図２１は実施例８で得られたHPLCの結果を示
す。
【図２２】図２２は実施例８で得られたHPLCの結果を示
す。
【図２３】図２３は実施例８で得られたHPLCの結果を示
す。
【図２４】図２４は実施例８で得られたHPLCの結果を示
す。
【図２５】図２５は実施例８で得られたHPLCの結果を示
す。
【図２６】図２６は実施例８で得られたHPLCの結果を示
す。
【図２７】図２７は実施例８で得られたHPLCの結果を示
す。
【図２８】図２８は実施例８で得られたHPLCの結果を示
す。
【図２９】図２９は実施例８で得られたHPLCの結果を示
す。
【図３０】図３０は実施例８で得られたHPLCの結果を示
す。
【図３１】図３１は実施例８で得られたHPLCの結果を示
す。
【図３２】図３２は実施例８で得られたHPLCの結果を示
す。
【図３３】図３３は実施例８で得られたHPLCの結果を示
す。
【図３４】図３４は実施例８で得られたHPLCの結果を示
す。
【図３５】図３５は実施例８で得られたHPLCの結果を示
す。
【図３６】図３６は実施例８で得られたHPLCの結果を示
す。
【図３７】図３７は実施例８で得られたHPLCの結果を示
す。
【図３８】図３８は実施例８で得られたHPLCの結果を示
す。
【図３９】図３９は実施例８で得られたHPLCの結果を示
す。
【図４０】図４０は実施例８で得られたHPLCの結果を示
す。
【００６３】
【符号の説明】
図１〜図４０中の各ピーク番号は夫々以下のものを示
す。１：ヒスチジンのフェニルチオヒダントイン誘導
体、２：アスパラギン酸のフェニルチオヒダントイン誘
導体、３：アスパラギンのフェニルチオヒダントイン誘
導体、４：アルギニンのフェニルチオヒダントイン誘導
体、５：セリンのフェニルチオヒダントイン誘導体、
６：スレオニンのフェニルチオヒダントイン誘導体、
７：グルタミンのフェニルチオヒダントイン誘導体、
８：グリシンのフェニルチオヒダントイン誘導体、９：
グルタミン酸のフェニルチオヒダントイン誘導体、10：
ジメチルフェニルチオ尿素、11：アラニンのフェニルチ
オヒダントイン誘導体、12：チロシンのフェニルチオヒ
ダントイン誘導体、13:ピリジルエチルシステインのフ
ェニルチオヒダントイン誘導体、14：デルタスレオニン
のフェニルチオヒダントイン誘導体、15：プロリンのフ
ェニルチオヒダントイン誘導体、16：メチオニンのフェ
ニルチオヒダントイン誘導体、17：バリンのフェニルチ
オヒダントイン誘導体、18：ジフェニルチオ尿素、19：
トリプトファンのフェニルチオヒダントイン誘導体、2
0：リジンのフェニルチオヒダントイン誘導体、21：フ
ェニルアラニンのフェニルチオヒダントイン誘導体、2
2：イソロイシンのフェニルチオヒダントイン誘導体、2
3：ロイシンのフェニルチオヒダントイン誘導体、24：
ジフェニル尿素。

Claims (5)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 （ｉ）比表面積（m2/g）：450〜520、
    （ii）細孔容量（ml/g）：0.9〜1.1、（iii）細孔直径
    （オンク゛ストローム）：60〜90、（iｖ）炭素含量（w/w％）：1
    7〜22、なる物性を有するオクタデシルシリカゲルを充
    填した逆相カラムを使用し、(Ａ)メタノール、アセトニ
    トリル及び緩衝液を含んで成る溶離液、及び(Ｂ)第２級
    アルコール、メタノール及びアセトニトリルを含んで成
    る溶離液を用いてグラジエント溶出を行うことを特徴と
    する、高速液体クロマトグラフィによるアミノ酸のフェ
    ニルチオヒダントイン誘導体の分析方法。
  2. 【請求項２】 メタノール、アセトニトリル及び緩衝液
    を含んで成る溶離液に第２級アルコールが含有されてい
    る請求項１に記載の分析方法。
  3. 【請求項３】 第２級アルコールがイソプロピルアルコ
    ールである請求項２に記載の分析方法。
  4. 【請求項４】 第２級アルコール、メタノール及びアセ
    トニトリルを含んで成る溶離液に於ける第２級アルコー
    ルがイソプロピルアルコールである請求項１〜３に記載
    の分析方法。
  5. 【請求項５】 緩衝液のｐＨが4.0±0.5である請求項１
    〜４の何れかに記載の分析方法。 【０００１】
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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1998033064A1 (en) * 1997-01-24 1998-07-30 Amersham Pharmacia Biotech K.K. Method for separating pth amino acids

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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1998033064A1 (en) * 1997-01-24 1998-07-30 Amersham Pharmacia Biotech K.K. Method for separating pth amino acids
US6372141B1 (en) 1997-01-24 2002-04-16 Amersham Pharmacia Biotech K.K. Method for separating PTH amino acids

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