JPH063358A - 免疫分析用試薬 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【構成】 同一又は相異なるリポソーム表面にポリクロ
ーナル抗体及びモノクローナル抗体を固定化した免疫分
析用試薬。 【効果】 抗原との親和力の強いモノクローナル抗体及
び凝集力の高いポリクローナル抗体を組み合わせて用い
ることにより、抗原性物質との反応性及びリポソームの
凝集性を共に高めることが出来るため、測定対象抗原が
非常に低濃度であっても感度良く測定することができ
る。また、担体として抗原性のないリポソームを用いる
ため非特異的な凝集反応が起こりにくい。また、自動分
析機による測定が可能であるため、大量の検体を一度に
短時間で測定することができる。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、免疫分析用試薬に関
し、更に詳細には被検試料中に存在する広い濃度範囲の
成分を簡単な操作で、又は自動分析機を用いて、感度良
く測定することのできる免疫分析用試薬及びこれを用い
た免疫分析法に関する。

【０００２】

【従来の技術】抗原抗体反応を利用する免疫測定法は、
各種内分泌疾患の臨床診断等において極めて重要であ
り、従来種々の測定方法が知られている。

【０００３】その中でも、抗原性物質又は抗体を結合さ
せた担体に被検物質中の抗体又は抗原性物質を反応させ
て生じた凝集量を目視又は分光光度計を使用して測定
し、その結果を予め作成しておいた標準検量線と照合さ
せて、抗体又は抗原性物質を定量する方法が知られてい
る。この担体に結合させる抗体としては、凝集力価の高
い抗体を使用することが望ましく、ヤギ、ウサギ、モル
モット等に免疫して得られたポリクローナル抗体が使用
されてきた。

【０００４】

【発明が解決しようとする課題】しかし、一般にポリク
ローナル抗体はモノクローナル抗体よりも親和力が低い
こと、免疫する動物の個体差によって均一な抗体を得る
ことが困難なこと、及び動物種によっては非特異的に凝
集してしまうなどの問題が存在する。従って、均一な抗
体を大量に得るためには、モノクローナル抗体を使用す
ることが望ましい。しかし、１種類のモノクローナル抗
体が認識する抗原部位は限られており、凝集反応に利用
した場合には、凝集力が非常に弱いか、凝集しない場合
もある。これを解決するために、反応性の異なる２種類
以上のモノクローナル抗体を組み合わせることが考え出
されたが、凝集力の強いモノクローナル抗体の組み合わ
せを得るためには、何種類ものモノクローナル抗体を作
製し、組み合わせを検討しなければならなかった。

【０００５】

【課題を解決するための手段】かかる実情において、本
発明者らは、鋭意研究した結果、同一の又は異なるリポ
ソーム表面にポリクローナル抗体及びモノクローナル抗
体をそれぞれ固定化した免疫分析用試薬を凝集反応に利
用することによって、ポリクローナル抗体の低親和力を
補い、しかもモノクローナル抗体の組み合わせの選択の
煩雑を回避し、被検試料中に存在する抗原を高感度で測
定することができることを見出し本発明を完成した。

【０００６】すなわち本発明は、同一リポソーム表面に
ポリクローナル抗体及びモノクローナル抗体を固定化し
てなる免疫分析用試薬に係る第一の発明、並びにポリク
ローナル抗体を表面に固定化したリポソーム及びモノク
ローナル抗体を表面に固定化したリポソームを混合して
なる免疫分析用試薬に係る第２の発明を提供するもので
ある。

【０００７】また、本発明は、被検体に上記第１発明又
は第２発明の免疫分析用試薬を作用せしめ、抗原抗体反
応により生じたリポソームの凝集量を測定する免疫分析
法に係る第３の発明を提供するものである。

【０００８】本発明において、リポソームとしてはリン
脂質及びコレステロールを主要構成成分とするものであ
れば、従来使用されている何れのものを用いてもよい
が、粒径が50nm〜５μm、特に100〜600nmのものが好ま
しい。また、リン脂質とコレステロールの比が１：１前
後であり、リン脂質中の脂肪酸残基は、炭素原子数が12
〜18、特に偶数であることが好ましい。また、重合性リ
ン脂質を用いたリポソームも使用できる。

【０００９】抗体としては、被測定抗原性物質を認識す
るポリクローナル抗体とモノクローナル抗体が使用され
る。これらポリクローナル抗体とモノクローナル抗体
は、１つのリポソーム表面にその双方が固定化されても
よいし、別個のリポソーム表面にそれぞれ固定化されて
もよい。また、抗体はIgG分画のまま用いてもよいしF(a
b′)₂化されたものを用いてもよい。

【００１０】本発明の免疫分析用試薬は、例えば下に示
す方法で製造されるが、これに限定されるものではな
く、下記以外にも、抗体とリポソームの結合は過ヨウ素
酸法（特開平3-73855号公報）、Passive法（特開平3-73
856号公報）等が応用できる。

【００１１】まず、リン脂質、コレステロール、架橋剤
導入リン脂質からVortexing法又はガラスビーズを使用
する方法によってリポソームを調製する。架橋剤として
は、例えばN-ハイドロオキシスクシンイミジル3-(2-ピ
リジルジチオ)プロピオネート（SPDP）、N-スクシンイ
ミジル4-(p-マレイミドフェニル)ブチレート（SMPB）、
N-スクシンイミジル4-(p-マレイミドフェニル)アセテー
ト（SMPA）、N-スクシンイミジル4-(p-マレイミドフェ
ニル)プロピオネート（SMPP）、N-(γ-マレイミドブチ
リルオキシ)スクシンイミド（GMBS）及びN-(ε-マレイ
ミドカプロイルオキシ)スクシンイミド（EMCS）等が挙
げられる。具体的には、上記混合物の溶媒を留去し、吸
引乾燥する。しかる後に、壁面に薄膜が形成されたフラ
スコ内に緩衝液を加え、必要があれば更にガラスビーズ
を加え密栓して振とうし、リポソーム懸濁液を得る。そ
の後一定のポアサイズを持ったポリカーボネートの膜を
通すことによって、均一な粒径のリポソームを得る。

【００１２】一方、ポリクローナル抗体とモノクローナ
ル抗体の分子中に上記架橋剤と反応する反応基を導入す
る。反応性の異なるモノクローナル抗体を用いて上記の
操作を繰り返せば、それぞれ反応性の異なる修飾抗体が
得られる。

【００１３】次いで、このようにして調製したリポソー
ムと修飾抗体を各々単独で又は混合して緩衝液中で反応
せしめれば、表面にポリクローナル抗体とモノクローナ
ル抗体が固定化された抗体感作リポソームが得られる。
ここで、一のリポソーム表面にポリクローナル抗体とモ
ノクローナル抗体を固定化せしめるには、当該二種以上
の修飾抗体を混合して一のリポソームと反応させればよ
い。また、二以上のリポソーム表面にポリクローナル抗
体とモノクローナル抗体をそれぞれ別個に固定化せしめ
るには、それぞれの修飾抗体を別々のリポソームと反応
させればよい。ポリクローナル抗体とモノクローナル抗
体の混合比は、モノクローナル抗体が全抗体量の20％以
上になることが好ましい。

【００１４】なお、本発明免疫分析用試薬のうち、二以
上のリポソームにポリクローナル抗体とモノクローナル
抗体が別個に固定化されているものを使用する場合は、
これらのリポソームを使用直前に混合するのが好まし
い。

【００１５】本発明における被測定抗原性物質として
は、ホルモン（インシュリン、HCG-β、成長ホルモン、
TSH、LH、FSH、プロラクチン、サイロキシン、トリヨー
ドサイロニン、ガストリン、グルカゴン、ソマトスタチ
ン等）、酵素（エラスターゼ、アミラーゼ、プロテアー
ゼ、リパーゼ、リボヌクレアーゼ、エノラーゼ、アルカ
リフォスファターゼ等）、血清タンパク質（IgG、IgA、
IgM、IgE、IgD、RF、SLO、マクログロブリン、TBG、糖
タンパク質、糖脂質、アポAI、AII、B、CI、CII、CII
I、D、E、Fタンパク質等）、腫瘍関連抗原（CEA、α-フ
ェトプロテイン、フェリチン、POA、CA19-9、CA125
等）、DNA結合性タンパク質因子、サイトカイン（イン
ターフェロン、インターロイキン１、インターロイキン
２等）、種々の細菌、ウイルス、原虫（真菌、連鎖球
菌、肝炎ウイルス、ヘルペスウイルス、エイズウイル
ス、トキソプラズマ原虫、マラリア原虫、赤痢アメーバ
ー等）などが挙げられる。これらのうち、特に大量の被
検体を短時間で測定する必要のある血清タンパク質、腫
瘍関連抗原、ウイルス等が好ましい。

【００１６】本発明の免疫分析用試薬を用いた免疫分析
法による被検試料中の成分の定量は、例えば次のように
して行われる。まず、本発明試薬及び測定対象物を含む
試料を適当な緩衝液（例えば、TES緩衝液）中で混合
し、抗原−抗体結合反応を引き起こさせ、それに伴うリ
ポソームの凝集を形成させる。その凝集量に依存した光
の透過光の減少を分光光度計又は自動分析機（日立70
5，7050，7150，736，7070など）により測定し、例え
ば、予め作成した検量線との照合により、試料中の測定
対象物の量を測定することができる。

【００１７】

【発明の効果】叙上の如く本発明の免疫分析用試薬を用
いて測定を行えば、抗体として抗原との親和力の強いモ
ノクローナル抗体を用いることにより抗原性物質との反
応性を高め、かつこれにポリクローナル抗体を組み合わ
せることによりリポソームの凝集性を高めることが出来
るため、被測定抗原性物質が非常に低濃度であっても感
度良く測定することができる。また、担体として抗原性
のないリポソームを用いるため非特異的な凝集反応が起
こりにくい。

【００１８】更に、本発明の免疫分析用試薬を使用すれ
ば、自動分析機による測定が可能であるため、大量の検
体を一度に短時間で測定することができる。

【００１９】

【実施例】以下、本発明を実施例に基づいて詳細に説明
するが、これらの実施例は本発明の範囲を何ら制限する
ものではない。

【００２０】実施例１ １)リポソームの調製 100mlナシ型フラスコに、ジパルミトイルホスファチジ
ルコリン（DPPC：10mM,10ml）、コレステロール（Cho
l：10mM, 10ml）及びジチオピリジル化ジパルミトイル
ホスファチジルエタノールアミン（DTP-DPPE：１mM, 10
ml）より成る脂質（クロロホルム又はクロロホルム／メ
タノールに溶解したもの）をとり、溶媒をエバポレータ
ーで留去し、フラスコ内壁にフィルム状に脂質薄膜を形
成させた。この脂質薄膜を１〜２時間真空乾燥した後、
0.01M TES緩衝液（0.05M NaCl含有，pH7.5）４mlと800
μｍの粒径のガラスビーズ４ｇを添加し、フラスコを30
分間転倒撹拌した。その後ガラスビーズを濾紙で濾過
し、エクストルーダーを用いてリポソームをサイジング
した。サイジングはポアサイズ１μm、0.6μm、0.2μm
のポリカーボネート膜を各５回ずつ窒素ガスで加圧する
ことにより行い、粒径0.2μmのリポソームを得た。

【００２１】２)リポソームの抗体感作（抗CRP抗体） ヤギ抗CRP抗体溶液及びマウス抗CRPモノクローナル抗体
溶液（それぞれ10mg/ml,１ml）に30mM SPDPエタノール
溶液を10μｌずつ添加し、室温で30分間反応させた。次
いで、セファデックスG-25カラムを用いて未反応のSPDP
を除去した。この際に0.1M酢酸緩衝液（0.15M NaCl, pH
4.5）に緩衝液を交換すると共に、分光光度計によりA28
0nmで抗体の溶出を確認した。得られた抗体溶液（各２m
l）にジチオスレイトール（DTT）を終濃度50mMとなるよ
うに添加し室温で30分間反応させた。次いでセファデッ
クスG-25カラムを用いてDTTを除去した。この際、0.01M
TES緩衝液（0.05M NaCl含有，pH7.5）に緩衝液を交換
すると共に、分光光度計によりA280nmで抗体の溶出を確
認した。こうして得られた各抗体溶液（４ml）を、予め
１)で調製しておいたリポソームに別々に、又は両者を
適当な混合比で混合して加え、15〜20時間４℃で緩やか
に撹拌し、抗体感作リポソームを調製した。その後、未
反応の抗体を除去するために0.01M TES緩衝液（0.15M N
aCl含有, pH7.5）で平衡化したセファロースCL-4Bカラ
ムでゲル濾過し、リポソーム分画を分取した。分取後、
リン定量を行い、リン濃度１mMの抗体感作リポソームと
なるように希釈した。同時に粒度分布測定器BI-90（日
機装）により抗体感作リポソームの粒径を測定し、平均
粒径200nm付近であることを確認した。

【００２２】実施例２ CRP検量線の作成 CRP抗原の測定は日立7150を用いて行った。パラメータ
ーは10-300-100、測定波長は主波長340nm、副波長700nm
を用い、測定ポイントは24-50の２ポイント分析により
５分間の吸光度変化量を求めた。CRP抗原は、既知濃度
の血清を希釈し10〜０mg/dlの検体を調製した。リポソ
ーム試薬は実施例１で調製したヤギ抗CRP抗体感作リポ
ソーム、マウス抗CRPモノクローナル抗体感作リポソー
ム、これら２種の抗体感作リポソームを混合したもの、
及びヤギ抗CRP抗体とマウス抗CRPモノクローナル抗体を
同一のリポソームに感作したものを用いた。測定結果を
図１及び図２に示した。図１は、ヤギ抗CRP抗体感作リ
ポソーム、マウス抗CRPモノクローナル抗体感作リポソ
ーム及びその２つのリポソームを測定の際に１：１に混
合したものを用いて測定した結果である。また、図２
は、ヤギ抗CRP抗体感作リポソーム、マウス抗CRPモノク
ローナル抗体感作リポソーム及びそれら２つの抗体を
１：１の比で同一のリポソーム表面に感作したものを用
いて測定した結果である。図１及び図２より、以下のこ
とが示される。すなわち、ヤギ抗CRP抗体感作リポソー
ム単独では抗体の低親和力のため反応に伴う吸光度変化
量が少ない。また、マウス抗CRPモノクローナル抗体感
作リポソーム単独では抗原の認識部位が限られてしまう
ため凝集反応が起こりにくい。しかし、両者を混ぜ合わ
せることによって欠点が補われ、反応に伴う吸光度変化
量が増大した（図１）。この現象は、双方の抗体が同一
のリポソームに感作されている場合にも確認された（図
２）。

【図面の簡単な説明】

【図１】ポリクローナル抗体感作リポソームとモノクロ
ーナル抗体感作リポソームの混合物を使用した場合、及
びそれぞれを単独で使用した場合の測定結果を示す図で
ある。

【図２】ポリクローナル抗体とモノクローナル抗体が同
一リポソーム表面に感作したものを使用した場合、及び
ポリクローナル抗体感作リポソーム又はモノクローナル
抗体感作リポソームをそれぞれ単独で使用した場合の測
定結果を示す図である。

Claims (3)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 同一リポソーム表面にポリクローナル抗
   体及びモノクローナル抗体を固定化してなる免疫分析用
   試薬。
2. 【請求項２】 ポリクローナル抗体を表面に固定化した
   リポソーム及びモノクローナル抗体を表面に固定化した
   リポソームを混合してなる免疫分析用試薬。
3. 【請求項３】 被検体に請求項１又は２記載の免疫分析
   用試薬を作用せしめ、抗原抗体反応により生じたリポソ
   ームの凝集量を測定することを特徴とする免疫分析法。