JPH06336428A

JPH06336428A - 免疫抑制剤

Info

Publication number: JPH06336428A
Application number: JP5165854A
Authority: JP
Inventors: Nobuhiko Katsunuma; 信彦勝沼; Yukio Fujisawa; 幸夫藤沢
Original assignee: Takeda Chemical Industries Ltd
Current assignee: Takeda Pharmaceutical Co Ltd
Priority date: 1993-05-27
Filing date: 1993-05-27
Publication date: 1994-12-06

Abstract

(57)【要約】【目的】エポキシコハク酸誘導体を含有する免疫抑制剤
を提供する。【構成】カテプシンＢが抗原プロセシングに関与してい
ることを見いだし、該酵素阻害活性を有するエポキシコ
ハク酸誘導体を含有する免疫抑制剤を創製した。【効果】本発明の免疫抑制剤は、カテプシンＢの酵素活
性を強く阻害することにより免疫惹起を抑制しうるの
で、各主の自己免疫疾患の治療薬として用いる事ができ
る。

Description

【発明の詳細な説明】

【産業上の利用分野】本発明は免疫抑制剤に関するもの
である。さらに詳しくは、抗原プロセシング酵素である
カテプシンを特異的に阻害する自己免疫疾患治療剤に関
する。

【従来の技術】生体内における抗原の処理すなわち提示
の機構は一般に以下のように考えられている。まず、抗
原はエンドサイトーシスによってマクロファージ、樹状
細胞、Ｂ細胞などの抗原提示細胞に取り込まれ、酸性画
分のエンドゾームの分解酵素によって消化されて１０個
から２０個ほどのアミノ酸からなる抗原ペプチドへと分
解（Ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ）される。次に、当該抗原ペ
プチドは細胞質内でクラスＩＩ主要組織適合遺伝子複合
体（ｍａｊｏｒｈｉｓｔｏｃｏｍｐａｔｉｂｉｌｉｔ
ｙｃｏｍｐｌｅｘ：ＭＨＣ）分子と複合体を形成す
る。最後に、当該複合体が抗原提示細胞膜上に発現され
る。ＣＤ４陽性ヘルパーＴ細胞がクラスＩＩＭＨＣ分子
に結合した抗原を認識し、活性化されて増殖し、それに
よってＢ細胞を刺激して分裂増殖させ、プラズマ細胞に
分化させ抗体を分泌させる〔矢野明彦、臨床免疫、２
２，５１１−５２２（１９９０）；相沢志郎、臨床免
疫、２２，５２３−５３３（１９９０）；Ｈ．Ｍ．グレ
イ、Ａ．セッテ、Ｓ．ブース、Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ
Ａｍｅｒｉｃａｎ日本語版，２０，７−１７（１９９
０）〕。ペプチド−ＭＨＣ複合体を認識するＴ細胞抗原
受容体（ＴＣＲ−α，β鎖）及びこれをコードする遺伝
子が解明され、またＴ細胞が反応するためには、抗原と
自己のＭＨＣ産物の２種類の分子が認識されなければな
らないが、２本鎖ＴＣＲによってその抗原特異性及びＭ
ＨＣ拘束性が決定されることが判明している。多数の抗
原ペプチドがクラスＩＩＭＨＣ分子と結合するために
は、抗原ペプチドは一定の規則構造を取ると考えられて
いるが、それが何によって規定されているかは全く明ら
かでない。また、抗原の免疫学的フラグメントのプロセ
シングに関与するプロテアーゼは今日まで明らかにされ
ていない。

【発明が解決しようとする課題】上述のとおり、抗原は
酸性画分のエンドゾームにおいてプロセシングを受けて
１０個から２０個ほどのアミノ酸に分解され、生じた短
いペプチドがクラスＩＩＭＨＣ分子と結合して細胞表面
に提示される。この抗原のプロセシングに関与する酵素
の実体は今日まで不明であり、この段階を明らかにする
ことによってＭＨＣ分子と抗原との相互作用を解明し、
これを抑制する医薬を開発することが望まれている。こ
れらの解明は、自己の分子に対して免疫系が反応する自
己免疫疾患の治療に道を開くものであり、具体的には慢
性関節リウマチ、多発性硬化症、重症筋無力症、インス
リン依存型糖尿病（Ｉ型糖尿病）、炎症性腸疾患、全身
性エリトマトーデス、糸球体腎炎、自己免疫性溶血性貧
血、橋本病、潰瘍性大腸炎、原発性胆汁性肝硬変、特発
性血小板減少性紫斑病、交換性眼炎、悪性貧血、シェー
グレン症候群、グッドパスチュア症候群などの治療薬の
開発に結びつくものである。

【課題を解決するための手段】このような研究背景のも
とに、本発明者らは特異性の高いプロテアーゼ阻害剤の
投与によって抗原に対する特異的な抗体の産生が抑制さ
れれば、抗原プロセシングに関与するプロテアーゼを同
定することができると考え、鋭意検討を行った結果、シ
ステインプロテアーゼ阻害剤、とりわけカテプシンＢ阻
害剤であるエポキシコハク酸誘導体及び抗カテプシンＢ
抗体が抗原の提示を阻害して特異的抗体の産生を抑制す
ることを見いだした。更に、カテプシンＢの一次構造と
三次元構造、及びクラスＩＩＭＨＣ分子の一次構造を
比較検討し、カテプシンＢの活性中心の一つ、ＶＮ
_{２１７−２２３}（−ＶＡＮＳＷＮＴ−）（配列番号１）
は、クラスＩＩＭＨＣ分子β鎖の結合ドメイン、ＶＮ
_{５７−６３}（−ＶＡＥＳＷＮＳ−）（配列番号２）と高
い相同性を示し、その相同性の高い配列の中で、他のカ
テプシン類ではそれぞれリジン残基とグリシン残基であ
る点が異なっているアラニン残基とアスパラギン残基が
カテプシンＢとクラスＩＩＭＨＣ分子との間で同一の
アミノ酸であることを見い出し、カテプシンＢがプロセ
シングした抗原ペプチドがクラスＩＩＭＨＣ分子に特
異的に結合することにより抗原提示が行われるという予
測を立てた〔図１〕。一方クラスＩＩＭＨＣβ鎖は抗
原ペプチドのＣ末端ドメイン配列と親和性を示すことか
ら、上記の予測に立つとこの親和性はカテプシンＢの基
質特異性によって規定されているといえる。そこで本発
明者は、カテプシンＢの分解によって生成される種々の
ペプチドについて検討を重ね、クラスＩＩＭＨＣ分子
に対して共通の親和性を示すペプチド配列を見いだし、
抗原性提示ドメインは当該配列とそのＮ末端側に付加し
たペプチドから構成されていることを明らかにし本発明
を完成するに至った。すなわち、本発明は、（１）エポ
キシコハク酸誘導体を含有する免疫抑制剤、（２）カテ
プシンＢ阻害作用を有するエポキシコハク酸誘導体を含
有する上記（１）の免疫抑制剤および（３）自己免疫疾
患治療剤である上記（１）の免疫抑制剤である。本発明
におけるエポキシコハク酸誘導体はそのカルボン酸が修
飾されたものまたはその塩であって、分子内のチオール
基が活性中心であると考えられるプロテアーゼ（チオー
ルプロテアーゼ）の活性を阻害しうる作用を有するもの
をいう。該エポキシコハク酸のカルボン酸誘導体として
は、トランス型のエポキシコハク酸のモノまたはジエス
テル、ヒドロキサム酸、モノまたはジアミドが挙げられ
る。トランスエポキシコハク酸エステルとしては、式◎

【化１】〔式中、Ｒ^１およびＲ^２は同一または互いに独立して、
水素原子、置換されていてもよいアルキルまたは環状炭
化水素基を示す。〕で示される化合物またはその塩が挙
げられる。上記における置換されていてもよいアルキル
としては、置換基を有していてもよい環状炭化水素基で
置換されていてもよい炭素原子数１〜５の直鎖状または
分枝鎖状アルキル基が挙げられ、置換されていてもよい
環状炭化水素基で置換された直鎖状アルキル基が好まし
い。また置換されていてもよい環状炭化水素基としては
１〜３の低級（Ｃ_１−３）アルキル基、低級
（Ｃ_１−３）アルコキシまたはハロゲン原子で置換され
ていてもよい１ないし３環性脂環式または芳香族炭化水
素基が好ましく、なかでも１ないし３環性脂環式または
芳香族炭化水素基がシクロアルキル基、シクロアルケニ
ル基もしくはシクロアルカン基または単環式芳香族炭化
水素基であるものが好ましく、とりわけ炭素原子数３〜
８のモノシクロアルキル基，炭素原子数６〜８のビシク
ロアルキル基，炭素数８〜１１のトリシクロアルキル
基，炭素数５〜８のモノシクロアルケニル基，炭素数５
〜８のビシクロアルケニル基，炭素数６〜９のモノシク
ロアルケン基，炭素数６〜９のビシクロアルケン基また
は炭素数５〜７の芳香族炭化水素基であるものが好まし
い。本発明においては、上記におけるＲ^１またはＲ
^２が、同一もしくは互いに独立し、水素、置換されてい
てもよいＣ_８−９アラルキル基、置換されていてもよい
Ｃ_３−６モノシクロアルキル−Ｃ_１−４アルキル基，Ｃ
_１０トリシクロアルキル−Ｃ_１−２アルキル基，Ｃ
_６−９モノシクロアルケンメチル基，Ｃ_６−９ビシクロ
アルケンメチル基，Ｃ_４−８モノシクロアルキル基，置
換されていてもよいＣ_７ビシクロアルキル基，Ｃ_１０ト
リシクロアルキル基，Ｃ_５−８モノシクロアルケニル基
またはＣ_５−８ビシクロアルケニル基であるエポキシコ
ハク酸またはその塩がとりわけ好ましく用いられ、これ
らの具体例としては、例えば、エポキシコハク酸シクロ
ペンチルエステルカリウム塩，エポキシコハク酸シクロ
ヘキシルエステルナトリウム塩，エポキシコハク酸ペン
タメチルエステルカリウム塩，エポキシコハク酸シクロ
ヘキサンメチルエステルカリウム塩，エポキシコハク酸
ノルボルニルエステルカリウム塩，エポキシコハク酸−
２−アダマンチルエステルカリウム塩，エポキシコハク
酸−４−シクロオクテニルエステルカリウム塩，エポキ
シコハク酸−３−シクロヘキサンプロピルエステルカリ
ウム塩，エポキシコハク酸ジ−４−シクロオクテンメチ
ルエステルエポキシジ（トランス−２−クロル）シクロ
ペンタンメチルエステル〔特開昭５４−１４１７３５〕
などが挙げられる。トランスエポキシコハク酸アミドと
しては、式◎

【化２】〔式中、Ｒ^３は水素原子、単環式環状炭化水素または単
環式環状炭化水素基で置換されていてもよい炭素数１〜
１０の炭化水素、水素残基を示し、ＸはＮまたはＯを示
し、Ｙは、置換されていてもよいアミノ基を示す〕で表
わされる化合物である。ここにおける単環式環状炭化水
素基としては、シクロアルキル基，シクロアルケニル
基，シクロアルケン基，シクロアルカン基及び芳香族炭
化水素基が挙げられ、さらにこれらが１〜３のハロゲン
原子、低級（Ｃ_１−３）アルキルまたは低級アルコキシ
基で置換されているものも含まれる。なかでも、炭素数
５〜６のシクロアルキル基、炭素数５〜６のシクロアル
ケニル基、炭素数５〜６のシクロアルカンおよび炭素数
５〜６の芳香族炭化水素基が好ましい。また、鎖状炭化
水素基としては、直鎖状もしくは分枝状アルキル、アル
ケニルまたはアルキニルが挙げられ、好ましくはＣ
_１−５アルキル基，Ｃ_２−４アルケニル基，Ｃ_２−４ア
ルキニル基であり、また単環式炭化水素で置換された鎖
状炭化水素としては、Ｃ_５−６シクロアルキル，Ｃ
_１−３アルキル基，Ｃ_５−６シクロアルケン，Ｃ_１−３
アルキル基，Ｃ_１−３アラルキル基が好ましい。置換さ
れていてもよいアミノ基は、Ｎに結合手を有するアミノ
酸または◎

【化３】〔式中、Ｒ^４及びＲ^５は同一または独立して、水素原
子，Ｃ_１−５アルキル基，低級（Ｃ_１−３）アルキルを
介して結合していてもよく、かつ環構成基として１個の
Ｎ，Ｓ，Ｏを有していてもよい１または２環性環状基、
Ｎ−カルボキシアミノＣ_４−５アルキルを示すか、また
はＲ^４及びＲ^５は結合する窒素原子と共に５〜６員の複
素環基を形成する〕で示される基を示す。ここにおいて
アミノ酸とは、１または２のペプチド結合を有していて
もよいアミノ酸、そのエステル、カルボキサアミドおよ
び塩を示し、アミノ酸残基としてはＬ−α−アミノ酸特
に天然のＬ−α−アミノ酸が好ましく、その具体例とし
てロイシン、イソロイシン，プロリン，トレオニン，チ
ロジンおよびアルギニンなどが挙げられる。また、アミ
ノ酸残基数が２個のものである具体例として、プロリル
プロリン，トレオニルイソロイシン，チロジニルアルギ
ニン，イソロイシルプロリン，イソロイシルアルギニン
などが挙げられる。上記でいうアルキル基は直鎖または
分枝鎖状のいずれでもよい。環構成基としてＮ，Ｓ，Ｏ
を有していてもよい１または２環性環状基とは、具体的
にシクロアルキル基（好ましくはＣ_３−６シクロアルキ
ル），シクロアルケニル基，シクロアルキニル基，Ｃ
_３−６シクロアルカン，Ｃ_１−３アルキル基，アリール
基（好ましくはフェニル），アラルキル基（好ましくは
ベンジル基，フェネチル基など），チエニル基，テニル
基，フリル基，フルフリル基，ピリジニル基，キノリル
基などを示し、さらにこれらの環状基は、１〜３個のメ
チル基，トリフルオロメチル基，メトキシ基，ハロゲン
原子，アセチル基，水酸基，ニトロ基，カルボキシ基，
カルボエトキシ基などの置換基を有していてもよい。Ｒ
^２及びＲ^３がその結合する窒素原子と共に形成する複素
環基は、Ｒ^２及びＲ^３が結合する窒素原子以外にＮ，Ｓ
またはＯのいずれか１個のヘテロ原子を有していてもよ
く、その具体例としてはピロリジン基，ピペラジノ基，
モルホリノ基，チアモルホリノ基などが挙げられ、これ
らの複素環基はメチル基，カルボキシ基，カルボアルカ
リ金属オキシ基，カルボメトキシ基，カルボブトキシ
基，カルボベンゾキシ基などで置換されていてもよい。
エポキシコハク酸アミドの具体例としては、例えば、エ
チルＮ−フェニル−２，３−エポキシスクシナメー
ト，エチルＮ−２′−ピリジニル−２，３−エポキシ
スクシナメート，エチルＮ−８′−キノリニル−２，
３−エポキシスクシナメート，エチルＮ−ベンジル−
２，３−エポキシスクシナメート〔特公昭５５−４７６
６８〕，Ｎ−（ＤＬ−３−トランス−カルボキシオキシ
ラン−２−カルボニル）−Ｌ−ロイシル−Ｌ−プロリン
メチルエステル，Ｎ−〔Ｎ′−（ＤＬ−３−トランス−
カルボキシオキシラン−２−カルボニル）−Ｌ−ロイシ
ル〕フェネチルアミンカリウム塩〔特開昭５５−１１５
８７８〕，Ｎ−（Ｌ−３−トランス−カルボキシオキシ
ラン−２−カルボニル）−Ｌ−ロイシルアグマチン〔ア
グリカルチュアルアンドバイオロジカルケミスト
リー（Ａｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ）第４２巻，第
５２３〜５２８頁（１９７８年）〕，Ｎ−（Ｌ−３−ト
ランス−カルボキシオキシラン−２−カルボニル）−Ｌ
−チロシル−Ｎ−ニトロ−Ｌ−アルギニンベンジルエス
テル〔特開平２−３０４０７４〕，Ｎ−（Ｌ−３−トラ
ンス−エトキシカルボニルオキシラン−２−カルボニ
ル）−Ｌ−プロリル−Ｌ−プロリン〔特開平２−３０４
０８５〕，Ｎ−（Ｌ−３−トランス−エトキシカルボニ
ルオキシラン−２−カルボニル）−Ｌ−イソロイシル−
Ｌ−プロリン，Ｎ−（Ｌ−３−トランスーカルボキシオ
キシラン−２−カルボニル）−Ｌ−イソロイシル−Ｌ−
プロリン，Ｎ−（Ｌ−３−トランス−エトキシカルボニ
ルオキシラン−２−カルボニル）−Ｌ−イソロイシル−
２−プロリンナトリウム塩，Ｎ−（Ｌ−３−トランス−
メトキシカルボニルオキシラン−２−カルボニル）−Ｌ
−イソロイシル−Ｌ−プロリン〔特開平３−４２４７
８〕，Ｎ−（Ｌ−３−トランス−ｎ−プロピルカルバモ
イルオキシラン−２−カルボニル）−Ｌ−イソロイシル
−Ｌ−プロリン（ＣＡ−０７４），Ｎ−（Ｌ−３−トラ
ンス−ｎ−ペプチルカルバモイルオキシラン−２−カル
ボニル）−Ｌ−イソロイシル−Ｌ−プロリン〔特開平４
−１３９１８２〕などが挙げられる。これらのエポキシ
コハク酸誘導体のなかでも、カテプシンＢに対して特異
性の高い阻害効果を示すエポキシコハク酸アミノ酸アミ
ド誘導体、特に２個のアミノ酸残基を有するエポキシコ
ハク酸アミノ酸アミド誘導体またはその塩が好ましく用
いられる。さらに該アミノ酸残基としては、イソロイシ
ン，プロリンを用いることが好ましい。本発明のエポキ
シコハク酸誘導体は公知の化学合成法に準じて製造する
ことができる。例えば、エポキシコハク酸エステル誘導
体については、特開昭５４−１４１７３５号公報，特公
昭６０−３７１０５号公報記載の方法、エポキシコハク
酸アミド誘導体については、特開昭５５−４７６６８号
公報記載の方法、またエポキシコハク酸アミノ酸アミド
誘導体については、特開平２−３０４０７４号公報，特
開平２−３０４０７５号公報，特開平３−７２４７８号
公報，特開平４−１３９１８２号公報記載の方法に準じ
て製造することができる。本発明の免疫抑制剤は、有効
量の上記エポキシコハク酸誘導体を単独または生理学的
に許容される担体と配合し、錠剤、カプセル剤、顆粒
剤、散剤などの固形製剤；またはシロップ剤、注射剤な
どの液状製剤として経口または非経口的に投与すること
ができる。薬学的に許容される担体としては、製剤素材
として慣用の各種有機あるいは無機担体物質が用いら
れ、固形製剤における賦形剤、滑沢剤、結合剤、崩壊
剤；液状製剤における溶剤、溶解補助剤、懸濁化剤、等
張化剤、緩衝剤、無痛化剤などとして配合される。また
必要に応じて、防腐剤、抗酸化剤、着色剤、甘味剤など
の製剤添加物を用いることもできる。賦形剤の好適な例
としては、例えば乳糖、白糖、Ｄ−マンニトール、デン
プン、結晶セルロース、軽質無水ケイ酸などが挙げられ
る。滑沢剤の好適な例としては、例えばステアリン酸マ
グネシウム、ステアリン酸カルシウム、タルク、コロイ
ドシリカなどが挙げられる。結合剤の好適な例として
は、例えば結晶セルロース、白糖、Ｄ−マンニトール、
デキストリン、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロ
キシプロピルメチルセルロース、ポリビニルピロリドン
などが挙げられる。崩壊剤の好適な例としては、例えば
デンプン、カルボキシメチルセルロース、カルボキシメ
チルセルロースカルシウム、クロスカルメロースナトリ
ウム、カルボキシメチルスターチナトリウムなどが挙げ
られる。溶剤の好適な例としては、例えば注射用水、ア
ルコール、プロピレングリコール、マクロゴール、ゴマ
油、トウモロコシ油などが挙げられる。溶解補助剤の好
適な例としては、例えばポリエチレングリコール、プロ
ピレングリコール、Ｄ−マンニトール、安息香酸ベンジ
ル、エタノール、トリスアミノメタン、コレステロー
ル、トリエタノールアミン、炭酸ナトリウム、クエン酸
ナトリウムなどが挙げられる。懸濁化剤の好適な例とし
ては、例えばステアリルトリエタノールアミン、ラウリ
ル硫酸ナトリウム、ラウリルアミノプロピオン酸、レシ
チン、塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム、モ
ノステアリン酸グリセリンなどの界面活性剤；例えばポ
リビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、カルボキ
シメチルセルロースナトリウム、メチルセルロース、ヒ
ドロキシメチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロー
ス、ヒドロキシプロピルセルロースなどの親水性高分子
などが挙げられる。等張化剤の好適な例としては、例え
ば塩化ナトリウム、グリセリン、Ｄ−マンニトールなど
が挙げられる。緩衝剤の好適な例としては、例えばリン
酸塩、酢酸塩、炭酸塩、クエン酸塩などの緩衝液などが
挙げられる。無痛化剤の好適な例としては、例えばベン
ジルアルコールなどが挙げられる。防腐剤の好適な例と
しては、例えばパラオキシ安息香酸エステル類、クロロ
ブタノール、ベンジルアルコール、フェネチルアルコー
ル、デヒドロ酢酸、ソルビン酸などが挙げられる。抗酸
化剤の好適な例としては、例えば亜硫酸塩、アスコルビ
ン酸などが挙げられる。

【作用】本発明で用いられるエポキシコハク酸誘導体
は、強いカテプシンＢ阻害作用と共に毒性が低いことが
既に明らかになっている。したがって、本発明の免疫抑
制剤は、哺乳動物（例、マウス、ラット、ウサギ、犬、
ネコ、牛、豚、ヒト等）の各種自己免疫疾患の治療に安
全に用いることができる。本発明製剤を自己免疫疾患治
療剤として使用する場合、その投与量は、疾病の種類お
よび状態、投与方法、投与対象の年齢、性別等により変
動しうるが通常１日当りエポキシコハク酸誘導体として
１０〜２０００ｍｇを１〜数回に分けて投与することが
できる。なお、本願明細書や図面において、アミノ酸を
略号で表示する場合、ＩＵＰＡＣ−ＩＵＢＣｏｍｍｉ
ｓｉｏｎｏｎＢｉｏｃｈｅｍｉｃａｌＮｏｍｅｎ
ｃｌａｔｕｒｅによる略号あるいは当該分野における慣
用略号に基づくものであり、その例を次に挙げる。また
アミノ酸に関して光学異性体があり得る場合は、特に明
示しなければＬ体を示すものとする。Ｇｌｙ：グリシン（Ｇ）Ａｌａ：アラニン（Ａ）Ｖａｌ：バリン（Ｖ）Ｌ’ｅｕ：ロイシン（Ｌ）Ｉｌｅ：イソロイシン（Ｉ）Ｓｅｒ：セリン（Ｓ）Ｔｈｒ：スレオニン（Ｔ）Ｃｙｓ：システイン（Ｃ）１／２Ｃｙｓ：ハーフシスチンＭｅｔ：メチオニン（Ｍ）Ｇｌｕ：グルタミン酸（Ｅ）Ａｓｐ：アスパラギン酸（Ｄ）Ｌｙｓ：リジン（Ｋ）Ａｒｇ：アルギニン（Ｒ）Ｈｉｓ：ヒスチジン（Ｈ）Ｐｈｅ：フェニールアラニン（Ｆ）Ｔｙｒ：チロシン（Ｙ）Ｔｒｐ：トリプトファン（Ｗ）Ｐｒｏ：プロリン（Ｐ）Ａｓｎ：アスパラギン（Ｎ）Ｇｌｎ：グルタミン（Ｑ）［実施例】以下に参考例および実施例を挙げて更に詳細
に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではな
い。参考例１カテプシンＢ阻害剤によるｉｎｖｉｖｏ抗
体産生の抑制十分量の抗原を実験動物に単回投与すると、免疫後約１
０日目から特異的抗体が誘導され、その抗体価は約２〜
３週目に最高レベルに達する。抗原で動物を免疫する前
にプロテアーゼ阻害剤を投与して、抗体産生が顕著に抑
制され、抗体応答が遅延するならば、プロセシングに関
与する酵素が推定できるはずである。この考えに基づい
て種々のプロテアーゼについて検討した。その結果、抗
原の接種前後にシステインプロテアーゼ阻害剤、とりわ
けカテプシンＢ阻害剤（例えば、ＣＡ−０７４（Ｎ−
（Ｌ−３−トランス−ｎ−プロピルカルバモイルオキシ
ラン−２−カルボニル）−Ｌ−イソロイシル−Ｌ−プロ
リン：特開平４−１３９１８２、Ｅ−６４（Ｎ−（Ｌ−
３−トランス−エトキシカルボニルオキシラン−２−カ
ルボニル）−Ｌ−イソロイシン−メチルブチルアミド；
大正製薬）など）を腹腔内に投与すると、接種した抗原
に対する抗体の産生は阻害されることを見いだした。更
に、カテプシンＢ阻害剤を抗原接種後に連日投与する
と、抗体産生はほとんど完全に抑制された。これらの結
果は抗原のプロセシングにカテプシンＢが関与している
ことを示唆し、またカテプシンＢ阻害剤は特異的な抗体
産生を制御することができることを示している。参考例２抗原の再刺激による感作脾細胞のｉｎｖｉ
ｔｒｏ増殖に対するププテアーゼ阻害剤の影響抗原で免疫した動物の脾細胞（感作脾細胞）をｉｎｖ
ｉｔｒｏで当該抗原で再刺激すると、細胞は著しい増殖
応答を示す。この実験系において、各種のプロテアーゼ
阻害剤の増殖応答に及ぼす影響を調べた。すなわち、あ
らかじめ常法に従って免疫感作したマウスの脾細胞をｉ
ｎｖｉｔｒｏで当該抗原で再刺激する際に、各種プロ
テアーゼを添加し増殖応答を調べた。その結果システイ
ンプロテアーゼ阻害剤、とりわけカテプシンＢ阻害剤を
添加すると、脾細胞の増殖応答は著しく阻害されること
を見いだした。また、脾細胞を免疫する際に、システイ
ンプロテアーゼ阻害剤、とりわけカテプシンＢ阻害剤を
同時に投与すると、感作脾細胞の当該抗原による再刺激
による増殖応答が顕著に阻害された。さらに、カテプシ
ンＢ共存下で免疫した脾細胞の再刺激時に当該阻害剤を
添加すると、増殖はさらに抑制された。これらの結果
は、抗原のプロセシングにカテプシンＢが関与している
ことを示唆している。参考例３抗原ペプチドの再刺激による感作脾細胞のｉ
ｎｖｉｔｒｏ増殖に対するプロテアーゼ阻害剤の影響抗原のプロセシングに関与しているプロテアーゼであれ
ば、そのプロテアーゼで分解された抗原ペプチドは感作
脾細胞の増殖応答を促進させるはずである。この考えに
基づいて種々のプロテアーゼで検討した結果、カテプシ
ンＢ分解物に相当する合成ペプチド（活性型ペプチド）
は感作脾細胞の増殖応答を促すが、他のドメインに相当
する合成ペプチドではこのような脾細胞の増殖応答はみ
られないことを見いだした。また、この活性型ペプチド
による増殖応答はカテプシンＢ阻害剤によって阻害され
なかった。これらの結果は、この活性型ペプチドがカテ
プシンＢの分解によって生成されたものであることを示
している。参考例４抗原によるヒトＴ細胞の増殖応答に及ぼすカ
テプシンＢの阻害効果Ｘ線照射を受けた抹梢血単核細胞（Ｒｘ−ＰＢＭＣ；増
殖はできないが抗原提示はできる細胞）の存在下におい
て、ヒトＴ細胞クローン（例えば、クローン２Ｃ５とＢ
８など）はワクチンによって高い増殖応答を示し、ま
た、ウイルスの糖蛋白質由来のペプチド及び核蛋白質由
来のペプチドによってそれぞれ促進される。この系にお
いて、各種プロテアーゼによるＴ細胞クローンの増殖作
用を検討した。その結果、応答はシステインプロテアー
ゼ阻害剤、とりわけカテプシンＢ阻害剤によって用量依
存的に抑制されたが、当該ワクチンで前処理されたＲｘ
−ＰＢＭＣを抗原提示細胞（ＡＰＣ）として用いると、
この増殖応答はカテプシンＢ阻害剤で抑制されない。ま
た、抗原ペプチドによる増殖応答はＢ阻害剤によって抑
制されなかった。また、ワクチンに対するヒトＴ細胞ク
ローンの増殖応答はカテプシンＢ特異的抗体と共にイン
キュベーションすることによって抑制され、カテプシン
Ｂの特異的基質〔例えば、Ｚ−ＲＲ−ＭＣＡ（ベンジル
オキシカルボニル）−アルギニル−アルギニル−，メチ
ルクマリンアミド）など〕により抗原応答は強力に抑制
された。ＭＣＡにはそのような作用はみられない。以上
の結果は、カテプシンＢが抗原のプロセシングに関与す
るプロテアーゼであることを示唆している。参考例５ｉｎｖｉｖｏでの免疫応答におれるカテプ
シンＢ阻害剤の効果動物カテプシンＢの存在下あるいは非存在下においてア
ジュバントとともにカテプシンＢで処理して得られた活
性型抗原ペプチドで感作した。その結果、抗原ペプチド
による免疫応答はカテプシンＢ阻害剤によって抑制され
ないことが判明した。結果は、カテプシンＢ阻害剤は抗
原のプロセシング以外の免疫応答の過程を阻害しないこ
とを示している。参考例６カテプシンＢによってプロセスされた抗原ペ
プチドとクラスＩＩＭＨＣ分子との結合カテプシンＢとクラスＩＩＭＨＣのアミノ酸配列を比
較した。その結果カテプシンＢの活性部位の一つ、ＶＮ
_{２１７−２２３}（ＶＡＮＳＷＮＴ）はクラスＩＩＭＨ
Ｃβ鎖の結合ドメインの一部、ＶＮ_{５７−６３}（ＶＡＥ
ＳＷＮＳ）と相同性を示すことを見い出した。この相同
性配列内の特にアラニン残基とアスパラギン残基はカテ
プシンＢではクラスＩＩＭＨＣ分子と同一配列である
が、これらのアミノ酸残基は他のカテプシンではそれぞ
れリジン残基とグリシン残基に置換されている。この事
実から、カテプシンＢによって分解された抗原ペプチド
がクラスＩＩＭＨＣ分子とより特異的に結合すること
が分かる。すなわちクラスＩＩＭＨＣ分子と共通の親
和性を示す抗原ペプチドにおけるＣ末端ドメイン配列は
カテプシンＢの基質特異性によって規定される。またク
ラスＩＩＭＨＣ分子から単離された公知の抗原ペプチ
ドの配列の大多数〔Ａ．Ｙ．Ｒｕｄｅｎｓｋｙら、ネ
イチャー（Ｎａｔｕｒｅ），第３５３巻，第６２２頁
（１９９１）；同誌，第３５９巻，第４２９頁（１９９
２）；Ｋ．Ｆａｌｋｒａら、同誌，第３５１巻，第２
９０頁（１９９２）〕は、カテプシンＢとの親和性配列
を含有していることからも、上記の考察を裏付けてい
る。実施例１ｉｎｖｉｖｏにおけるＨＢｓ抗原に対する
抗体産生に及ぼすカテプシンＢ阻害剤の影響ＢＡＬＢ／ｃマウス（８〜１０週齢）にＨＢｓ抗原（か
けつ研製薬）１匹あたり４μｇを腹腔内に単回投与した
対照群と抗原接種の前後２時間目にカテプシンＢ阻害剤
Ｅ−６４（大正製薬）あるいはＣＡ−０７４（２００μ
ｇ／マウス）を腹腔内に投与し、同様に免疫した投与群
の、抗ＨＢｓ抗体価を酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ；ア
ボット社製）で測定した。得られた結果を〔図２〕に示
す。図中データは平均値±標準偏差（ＳＤ）で表わし
た。また●はＥ−６４ａ投与群を□を、△はＣＡ−０７
４投与群を、○は対照群（生理食塩水）を、□は１４日
間のＣＡ−０７４連続投与群をそれぞれ示す。図に示す
とおり対照群では、抗ＨＢｓ抗体価は接種後１０日目に
２００ｍＩＵ／ｍｌになり、２１日目に最高レベル（８
００ｍＩＵ／ｍｌ）に達した。一方、投与群では抗ＨＢ
ｓ抗体の産生は抑制され、抗体応答は遅延した。この抑
制の度合いは接種後１４日目に最大であった。すなわ
ち、阻害剤非投与の対照群は５００ｍＩＵ／ｍｌの抗体
価であったのに対し、ＣＡ−０４７あるいはＥ−６４ａ
の投与群では２５０ｍＩＵ／ｍｌであった。更に、カテ
プシンＢ阻害剤ＣＡ−０７４を抗原接種後１４日間にわ
たって連日投与すると、抗体産生は顕著に抑制されて１
４日目に１２０ｍＩＵ／ｍｌの抗体価に達したにすぎな
かった（阻害剤非投与群ｎの抗体価は５００ｍＩＵ／ｍ
ｌ）。実施例２ＨＢｓ抗原の再刺激によるｉｎｖｉｔｒｏ
感作脾細胞増殖応答のカテプシンＢ阻害剤による抑制実施例１に示したようにＢＡＬＢ／ｃマウスを４μｇの
ＨＢｓ抗原で免疫した後、１４日目に感作脾細胞（１×
１０^５）を調整し、これに１ｇμ／ｍｌのカテプシンＥ
−６４ａあるいはＣＡ−０４７及び４μｇ／ｍｌのＨＢ
ｓ抗原を加え７２時間インキュベーションした（ＨＢｓ
抗原での再刺激）。反応後細胞を１μＣｉの〔^３Ｈ〕−
チミジンで１２時間標識した後、〔^３Ｈ〕−チミジンの
取り込みを測定した。得られた結果を〔表１〕に示す。
表中データは５検体の平均値±ＳＤ（ｃｐｍ）及び増
殖指標（括弧内の数値）で表した。Ｐ＜０．０５；対照グループと有意差（スチューデント
のｔ−テスト）。表１に示すように対照群の感作脾細胞ではＨＢｓ抗原の
再刺激によって増殖応答を示し、〔^３Ｈ〕−チミジンの
取り込みは４０９２ｃｐｍであった。一方、カテプシン
Ｂ阻害剤ＣＡ−０７４及びＥ−６４ａの存在下では、こ
の細胞増殖応答は、それぞれ２１１２ｃｐｍおよび１９
８０ｃｐｍまで著しく抑制され、対照群の増殖応答に比
べて５２％〜４８％まで低下した。ＨＢｓ抗原でマウス
を感作する際に同時にＥ−６４ａあるいはＣＡ−０４７
を投与して得られた脾細胞は抗原の再刺激に対してそれ
ぞ５５０ｃｐｍあるいは４６４ｃｐｍと非常に弱い増殖
応答しか示さなかった。また、この増殖応答は再刺激時
にＥ−６４ａあるいはＣＡ−０７４を添加することによ
ってさらに抑制された。実施例３ＨＢｓ抗原ペプチドの再刺激によるｉｎｖ
ｉｔｒｏ感作脾細胞増殖応答のカテプシンＢ阻害剤によ
る抑制カテプシンＢの基質特異性からＨＢｓ抗原〔図３）（配
列番号３）はカテプシンＢによってアミノ酸残基７９と
８０の間で最も分解されやすいと推定されたが、実際に
カテプシンＢの精製標品によってこの結合はｉｎｖｉ
ｔｒｏで分解された。次にＨＢｓ抗原分子のＮ末端側ア
ミノ酸残基番号第６４〜７９番のアルギニン残基までの
１６アミノ酸残基からなるペプチドＳＲ_{６４−７９}（Ｓ
ＣＰＰＩＣＰＧＹＲＷＭＣＬＲＲ）（配列番号３のアミ
ノ酸残基番号第６４〜７９の配列），第６４〜９４番の
３１アミノ酸残基からなるペプチドＳＬ_{６４−９４}（Ｓ
ＣＰＰＩＣＰＧＹＲＷＭＣＬＲＲＦＩＩＦＩＦＩＬＬＬ
ＣＬＩＦＬ）（配列番号３のアミノ酸残基番号第６４〜
９４の配列）及び第９３〜１１２番の２０アミノ酸残基
からなるペプチドＦＧ_{９３−１１２}（ＦＬＬＶＬＬＤＹ
ＱＧＭＬＰＶＣＰＬＬＰＧ）（配列番号３の配列のアミ
ノ酸残基番号第９３〜１１３の配列）をそれぞれ常法に
従いアプライドバイオシステムモデルＡ４３１１ペプ
チド合成機を用いて自動合成した。得られたペプチド各
１μｇ／ｍｌについて、実施例２に記載の方法に準じ
て、ＨＢｓ抗原感作脾細胞に対する増殖応答を測定した
〔表１〕。〔表１〕に示すように感作脾細胞に対してペ
プチドＳＲ_{６４−７９}は、最も強力な増殖応答（２５６
８ｃｐｍ）を示したが、ＨＢｓ抗原分子における他のド
メインのペプチドＳＬ_{６４−９４}及びＦＧ_{９３−１１２}
は同一の系において極めて弱い増殖応答（それぞれ１６
２６ｃｐｍ及び５５６ｃｐｍ）しか示さなかった。また
ペプチドＳＲ_{６４−７９}による増殖応答はカテプシンＢ
阻害剤ＣＡ−０７４によって全く阻害されなかった。こ
れらの結果より、ＳＲ_{６４−７９}配列はＨＢｓ抗原にお
いて抗原性の強力なペプチドの一つであり、この断片は
ＨＢｓ抗原のカテプシンＢによる分解によって生成され
ると結論した。◎

【表１】実施例４狂犬病ワクチンあるいは抗原ペプチドの再刺
激によるヒトＴ細胞クローンの増殖応答に及ぼすカテプ
シンＢ阻害剤Ｅ−６４ｄ及びＣＡ−０７４の阻害効果（１）Ｘ線照射（３０００ｒａｄ）処理された抹梢血
単核細胞（Ｒｘ−ＰＢＭＣ；１×１０^５／ウエル；増殖
はしないが、抗原提示能はありＴ細胞を刺激することが
できる細胞）の存在下においてヒトＴ細胞クローン２Ｃ
５（３×１０^４／ウエル）完全培地（１０％ヒトＡＢ血
清添加ＲＰＭＩ）に０．０５〜０．４μｇ／ｍｌの各種
濃度の狂犬病ウイルス（Ｍｅｒｉｅｕｘ，Ｌｙｏｎフラ
ンス）及び１．２５，２．５及び５μｇの各濃度のカテ
プシンＢ阻害剤（Ｅ−６４ｄ又はＣＡ−０７４）を添加
し、５％炭酸ガス下、３７℃で７２時間保温し反応させ
た。狂犬病ワクチンで前処理したＲｘ−ＰＢＭＣ（抗原
提示状態）を用いて同様の測定を行った。反応終了前１
６時間１μＣｉ〔^３Ｈ〕−チミジン／ウエルを取り込ま
せ、Ｔ細胞の〔^３Ｈ〕−チミジンを指標として増殖応答
を測った。カテプシンＢ阻害剤としてＥ−６４ｄおよび
ＣＡ−０７４を用いて得られた結果をそれぞれ〔図３〕
および〔図４〕に示す。〔図４〕及び〔図５〕に示すと
おり、カテプシンＢ阻害剤無添加の対照試料では、０．
２μｇ／ｍｌの狂犬病ワクチン（Ｍｅｒｉｅｕｘ，Ｌｙ
ｏｎ，フランス）といずれも高い増殖応答を示し、この
２Ｃ５クローンの増殖応答はＥ−６４ｄあるいはＣＡ−
０４７の添加によって用量依存的に抑制された。また前
処理したＲｘ−ＰＢＭＣを用いたときは、点線で示すよ
うにカテプシンＢ阻害剤で抑制されなかった。（２）上記（１）の狂犬病ワクチンの変わりに、同ワ
クチンの抗原ペプチドである狂犬病ウイルスの糖蛋白質
由来のペプチドＥＲ_{２８１−２９９}（ＥＥＣＬＤＡＬＥ
ＳＴＭＴＴＫＳＶＳＦＲ）（配列番号４）を用いて、
（１）の方法に準じて測定した。その結果、Ｒｘ−ＰＢ
ＭＣの存在下においてヒトＴ細胞クローン２Ｃ５の増殖
は、Ｅ−６４添加〔図６〕およびＣＡ−０７４添加〔図
７〕のいずれによってもそれぞれ促進された。これら抗
原ペプチドによる増殖応答はカテプシンＢ阻害剤Ｅ−６
４ｄ及びＣＡ−０７４によって抑制されなかった。〔図
４〜６〕において各記号は次のとおりである。 △ 前処理されたＲｘ−ＰＢＭＣ＋５μｇ／ｍｌ阻害剤 ○ Ｒｘ−ＰＢＭＣ＋抗原＋１．２５μｇ／ｍｌ阻害剤 × Ｒｘ−ＰＢＭＣ＋抗原＋２．５μｇ／ｍｌ阻害剤 ● Ｒｘ−ＰＢＭＣ＋抗原＋５μｇ／ｍｌ阻害剤 □ Ｒｘ−ＰＢＭＣ＋抗原実施例５カテプシンＢ特異的抗体及びカテプシンＢの
基質によるＴ細胞増殖の阻害ヒトＴ細胞クローン２Ｃ５（３×１０^４）は、各種濃度
の抗カテプシンＢ抗体Ｆ（ａｂ）’（Ｋｏｍｉｎａｍ
ｉ，ＥとＫａｔａｎｕｎａ，Ｎジャーナルオブバ
イオケミストリー第９１巻６７−７１頁記載の方法
に従って調製した）存在下において、Ｘ線照射（３００
０ｒａｄ）処理された抹梢血単核細胞（Ｒｘ−ＰＢＭ
Ｃ；１×１０^５）と０．２μｇ／ｍｌの狂犬病ワクチン
と共に７２時間保温された。反応後細胞に１μＣｉ／ｗ
ｅｌｌの〔^３Ｈ〕−チミジンを１２時間取り込ませた
後、集め増殖応答を〔^３Ｈ〕−チミジンの取り込みを指
標として測定した。その結果クローン２Ｃ５の狂犬病ワ
クチンに対する増殖応答は抗カテプシンＢ抗体Ｆ（ａ
ｂ）’とのコインキュベーションによって抑制された。
また、カテプシンＢの合成基質Ｚ−ＲＲ−ＭＣＡ（ベン
ジルオキシカルボニルアルギニルアルギニルメチルクマ
リルアミド）を添加すると、増殖応答は強く阻害された
〔図８〕。実施例６感作脾細胞の増殖に及ぼす感作時のカテプシ
ンＢ阻害剤の影響カテプシンＢ阻害剤存在下あるいは非存在下でＢＡＬＢ
／ｃマウス脾細胞を狂犬病ワクチンで感作し、得られた
感作細胞について、各種濃度の狂犬病ワクチン及びその
抗原ペプチドＥＲ_{２８１−２９９}による刺激時の増殖応
答を測定した。狂犬病ワクチンで感作されたＢＡＬＢ／
ｃマウス脾細胞は、ｉｎｖｉｔｒｏでのワクチンある
いは合成ペプチドＥＲ_{２８１−２９９}の刺激に対して強
い増殖応答を示した。一方、ＣＡ−０７４あるいはＥ−
６４ｄの存在下において狂犬病ワクチンで感作した細胞
は、ｉｎｖｉｔｒｏでのワクチンあるいは抗原ペプチ
ドＥＲ_{２８１−２９９}に対する脾細胞の増殖応答は強力
に抑制された〔図９〕および〔図１０〕。実施例７カテプシンＢの活性部位とクラスＩＩＭＨ
Ｃ分子の抗原ペプチド結合ドメインの相同性Ｒｘ−ＰＢＭＣの存在下にＴ細胞クローン２Ｃ５を狂犬
病ワクチンで感作する際にＨＢｓ抗原の抗原ペプチドＳ
Ｒ_{６４−７９}のＣ末端ペプチド（ＭＣＬＲＲあるいはＹ
ＲＷＭＣＬＲＲ；１００μｇ／ｍｌ）を添加すると、Ｔ
細胞の増殖（〔^３Ｈ〕−チミジンの取り込み）はこれら
のペプチド非添加の対照のそれの７５％あるいは６０％
にまで抑制された。この結果は、これらのペプチドがカ
テプシンＢによる抗原提示を阻害し、またクラスＩＩ
ＭＨＣ分子への抗原ペプチドの結合を阻害することを示
している。

【配列表】

【図面の簡単な説明】

【図１】抗原提示におけるカテプシンＢの作用の模式図
である。

【図２】カテプシンＢ阻害剤共存あるいは非共存下での
ＨＢｓ抗原による免疫に対する抗体産生量を示す。

【図３】ＨＢｓ抗原のアミノ酸配列を示す。さらに、実
施例３で用いた抗原ペプチドＳＲ_{６４−７９}に相当する
部分をを四角で囲んだ。

【図４】カテプシンＢ阻害剤共存あるいは非共存下での
抗原の再刺激に対するＴ細胞クローンの増殖応答を示
す。

【図５】カテプシンＢ阻害剤共存あるいは非共存下での
抗原の再刺激に対するＴ細胞クローンの増殖応答を示
す。

【図６】カテプシンＢ阻害剤共存あるいは非共存下での
抗原の再刺激に対するＴ細胞クローンの増殖応答を示
す。

【図７】カテプシンＢ阻害剤共存あるいは非共存下での
抗原の再刺激に対するＴ細胞クローンの増殖応答を示
す。

【図８】抗カテプシンＢ抗体あるいはカテプシンＢ合成
基質共存下での抗原の再刺激に対するＴ細胞クローンの
増殖応答を示す。

【図９】カテプシンＢ阻害剤共存あるいは非共存下で抗
原感作した脾臓細胞の抗原再刺激に対する増殖応答を示
す。

【図１０】カテプシンＢ阻害剤共存あるいは非共存下で
抗原感作した脾臓細胞の抗原再刺激に対する増殖応答を
示す。

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】エポキシコハク酸誘導体を含有する免疫抑
制剤。
【請求項２】カテプシンＢ阻害作用を有するエポキシコ
ハク酸誘導体を含有する請求項１記載の免疫抑制剤。
【請求項３】エポキシコハク酸誘導体がエポキシコハク
酸エステル誘導体である請求項１記載の免疫抑制剤。
【請求項４】エポキシコハク酸誘導体がエポキシコハク
酸アミド誘導体である請求項１記載の免疫抑制剤。
【請求項５】エポキシコハク酸アミド誘導体がＮ−（Ｌ
−３−トランス−ｎ−プロピルカルバモイルオキシラン
−２−カルボニル）−Ｌ−イソロイシル−Ｌ−プロリン
である請求項４記載の免疫抑制剤。
【請求項６】エポキシコハク酸アミド誘導体が、Ｎ−
（Ｌ−３−トランス−エトキシカルボニルオキシラン−
２−カルボニル）−Ｌ−ロイシン−３−メチルブチルア
ミドである請求項４記載の免疫抑制剤。
【請求項７】自己免疫疾患治療剤である請求項１記載の
免疫抑制剤。