JPH06336438A - 表面架橋型タンパク質製剤 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【構成】本発明は、親油性架橋剤を用いた表面架橋型タ
ンパク質製剤及びその製造方法を提供する。 【効果】本発明の表面架橋型タンパク質製剤は、薬物本
来の生理活性を低下させることなく、該薬物を常に安定
して包含させ且つその所望の徐放化をなし得る。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、親油性架橋剤を用いた
表面架橋型タンパク質製剤、より詳しくは水に不溶な架
橋剤を用いて、例えばタンパク質担体を含むエマルジョ
ン粒子の表面近傍のみを架橋してなる製剤に関する。

【０００２】

【従来の技術】近年、高分子材料からなる担体を用い
た、タンパク質乃至生理活性ペプチド薬物等の徐放化技
術が広く研究されている（C.G.Pitt, Int.J.Pharm., 5
9, 173 (11990) ）。かかる薬物徐放用の担体として
は、薬物が徐放化された後にも、体内からの該担体の取
り出しを必要としない材料、即ち生体内で分解されて吸
収される性質をもつ材料が好ましいと考えられ、現在、
このような性質をもつ材料としては、例えばポリ乳酸、
ポリ酸無水物等の合成高分子物質や、核酸、多糖類、蛋
白質等の天然高分子物質が知られている。しかしなが
ら、後者の天然高分子物質の場合は、それら自体が水溶
性であるために、それらの材料から薬物を徐放化させる
ための担体の作製には、該材料の例えば架橋等の手段に
よる水不溶化処理が必要となる。

【０００３】上記天然高分子、特にタンパク質の水不溶
化技術は、これまでも多く報告されており（例えばC.A.
Finch, in "Chemistry and Technology of Water-Solub
le Polymers", C.A.Finch ed. p81, Plenum Press, New
York, 1983 等参照）。それらの代表例としては、例え
ば熱処理によるタンパク質の変性を利用するもの（P.A.
Kramer, J.Pharm.Sci., 63, 1646 (1974) ）や、化学架
橋剤を用いるもの（R.C.Oppenheim,, Int.J.Pharm., 8,
217 (1981) ）等が挙げられる。しかしながら、上記の
如くして得られる架橋されたタンパク質担体によるタン
パク質薬物の担持包含及びその徐放を考えた場合には、
熱や化学架橋剤処理による包含薬物の失活変性が問題と
なる。特にこれまでの架橋に用いられてきた化学架橋剤
は、ホルマリンやグルタルアルデヒド等の水溶性の架橋
剤であるが、之等の架橋剤を利用して担体を架橋反応さ
せようとすると、徐放化を目的として担体内に包含され
ているタンパク質薬物自体も架橋反応を受け、徐放化タ
ンパク質薬物が変性失活したり、担体との架橋反応によ
って薬物の徐放が認められなくなるという重大な欠点が
あった。

【０００４】より詳しくは、例えば特開昭５９−４６２
１５号公報には、ゼラチン、コラーゲン、それらの混合
物からのカプセルの製造法が記載されているが、化学架
橋剤としてグルタルアルデヒドを用いている点で、ま
ず、本発明とは異なっている。尚、この場合の薬物は低
分子量の抗癌剤であるため、水溶性架橋剤により調製さ
れたゼラチンカプセルからの薬物の徐放は認められてい
る。また芯となる粒子を調製後、その芯粒子にカプセル
層を被覆するという、２段階の過程が必要となるため、
カプセルの調製方法が複雑である。

【０００５】タンパク質薬物であるコロニー刺激因子を
含有したゼラチン微粒子の調整法が、特開平２−１１１
７９９号公報に記載されている。この場合には、グルタ
ルアルデヒドのような水溶性の化学架橋剤により微粒子
を調製しているため、ゼラチン微粒子全体が架橋され、
その中に含まれているコロニー刺激因子も架橋に参加し
ていると考えられる。そのため、ゼラチンの架橋体が分
解しない限り、タンパク質薬物の徐放は認められない。
これに対し、本発明においては、ゼラチン粒子の表面し
か架橋されていないため、微粒子内部のゼラチンもタン
パク質薬物も水に溶解することができ、時間をかけれ
ば、微粒子の表面架橋層を通過して、インビトロにおい
て徐放される。実際、グルタルアルデヒド架橋ゼラチン
微粒子とは異なり、本発明の表面架橋型ゼラチン粒子か
らは、タンパク質薬物の徐放がみられた。これは、親油
性の化学架橋剤を用いて、粒子の表面近傍のみを架橋し
たためであり、この点が大きく異なっている。

【０００６】一方、特開昭６０−１００５１６号公報に
は、徐放型マイクロカプセルの製造法が記載されてい
る。その中で、マイクロカプセル材料としてゼラチン等
のタンパク質が挙げられているが、これはマイクロカプ
セルの芯物質としての利用である。また芯となるマイク
ロスフェアをカプセル化する材料としては、水に難溶或
は不溶性の合成高分子物質を使用しているため、本発明
とは基本的に異なるものである。

【０００７】

【発明が解決しようとする課題】従って、本発明の目的
は、従来のこの種タンパク質薬物の徐放化のための架橋
型担体の利用にみられる欠点を悉く解消して、該薬物本
来の生理活性は全く低下乃至失活させることなく、該薬
物を常に安定して包含させ且つその所望の徐放化を見事
になし得る新しい製剤を提供することにある。

【０００８】

【課題を解決するための手段】本発明者は上記目的より
鋭意研究を重ねた結果、親油性の化学架橋剤を利用する
ときには、タンパク質担体の表面近傍のみを架橋して、
該表面のみが架橋された袋状のタンパク質製剤の作製が
可能で、これによれば該袋の中に存在する薬物はなんら
架橋反応を受けず、初期の生理活性をそのまま保持して
安定化され、かくして所望の徐放化製剤が得られるとい
う事実を見出だし、ここに本発明を完成するに至った。

【０００９】即ち、本発明は、親油性架橋剤を用いた表
面架橋型タンパク質製剤、並びにタンパク質薬物を包含
するタンパク質担体を親油性架橋剤により表面架橋させ
ることを特徴とする上記表面架橋型タンパク質製剤の製
造方法に係わる。

【００１０】本発明表面架橋型タンパク質製剤は、その
粒子径に関係なく、本発明方法を用いることにより、タ
ンパク質担体の表面近傍のみ架橋されたカプセルタイプ
のマイクロスフェアの作製が可能である。 例えば本発
明のタンパク質薬物を含有した表面架橋型タンパク質製
剤は、以下の方法で得ることができる。

【００１１】即ち、乳化安定化のための界面活性剤を含
んだ有機溶媒、例えばトルエン、クロロホルム、シクロ
ヘキサン、之等の混合溶媒等或は鉱物油、例えばオリー
ブ油、綿実油等の中に、タンパク質担体及びタンパク質
薬物からなる水溶液を加える。その際のタンパク質担体
濃度としては、通常５〜３０％が好ましく、その量に対
するタンパク質薬物量は、約３０重量％以下の範囲が好
適である。それらの混合物をホモジェナイズして得られ
たエマルジョンを、予め冷却しておいた界面活性剤含有
の有機溶媒或は鉱物油中に素早く注ぎ込み、タンパク質
薬物を含有したタンパク質担体エマルジョンを形成させ
る。この際のタンパク質水溶液の有機溶媒あるいは鉱物
油に対する容量比は、約１／５〜１／２０の範囲が好ま
しい。次いで、このエマルジョンへ、親油性架橋剤を添
加すると、タンパク質担体エマルジョン粒子の表面近傍
のみを架橋させることができる。上記架橋剤の添加量は
タンパク質担体１ｍｇ当り１〜１０×１０-4ミリモル程
度とするのがよい。遠心分離後、上清をすて、沈殿（表
面架橋型タンパク質製剤）を、有機溶媒及びリン酸緩衝
溶液（ｐＨ７．４）で遠心洗浄、凍結乾燥の後、薬物含
有表面架橋型タンパク質製剤を得る。

【００１２】本発明で用いる親油性架橋剤の種類は、特
に限定されるものではないが、架橋時間並びに温度等の
架橋反応の条件をできるだけ緩和する目的から、タンパ
ク分子との反応性が高い２官能性の架橋剤が好ましい。
タンパク質分子中、アミノ基及び水酸基等と瞬時に反応
する官能基として考えられるのは、イソシアネート基及
びカルボキシル基の塩化物等が挙げられ、之等の官能基
を一分子中に２つもつあらゆる親油性架橋剤が使用可能
である。その具体例としては、例えばヘキサメチレンジ
イソシアネート、ヘキサメチレンジアイソシアネートト
リメチロールプロパン付加物、ヘキサメチレンジイソシ
アネートイソシアヌレート、トルエン−２，４−ジイソ
シアネート、オキサリルクロライド、サクシニルクロラ
イド、アジポイルクロライド、テレフタロイルクロライ
ド等を例示することができる。之等以外にも、例えばタ
ンパク質分子中のアミノ基とカルボキシル基との間の反
応を触媒する親油性のジシクロヘキシルカルボジイミド
等を使用することも可能である。

【００１３】上記界面活性剤としては、例えばソルビタ
ンモノオレエート（スパン８０(Span 80) 、和光純薬工
業社製）、ソルビタントリオレエート（スパン８５(Spa
n 85) 、和光純薬工業社製）等のノニオン系界面活性剤
が用いられる。

【００１４】薬剤担体として用いられるタンパク質の種
類は特に限定されるものではなく、ゼラチン、コラーゲ
ン、或はアルブミン等のあらゆる種類のタンパク質に
も、本発明の表面架橋法は適用可能である。

【００１５】本発明においてタンパク質薬物としては、
特に限定されるものではなく、成長因子、インシュリン
等のペプチド薬物、さらには、インターフェロン、腫瘍
壊死因子、リンフォトキシン、インターロイキン類、各
種増殖因子、スーパーオキサイドディスムターゼ、治療
用プロテアーゼ等の高分子量のタンパク質薬物等のあら
ゆる種類の薬物が利用可能である。

【００１６】本発明製剤の粒子径は、ホモジェナイズの
強さ、時間等によってコントロールできる。ホモジェナ
イズ法としては、ホモジェナイザーを用いる方法、超音
波乳化法、マイクロフルイライザー法等があり、之等の
方法を用いることにより本発明製剤粒子のサイズを３０
０ｎｍまで下げることが可能である。

【００１７】かくして上記方法によれば、従来からの水
溶性化学架橋剤の利用では得ることの出来なかった、表
面近傍のみ架橋された袋状のタンパク質製剤の作製が可
能であり、得られる本発明製剤は、その内部のタンパク
質は架橋されておらず水溶液状態である。かかる本発明
製剤の用途は、その形状によりいろいろ考えられるが、
例えばタンパク質薬物の徐放化を考えた場合には、包含
された薬物は架橋による失活を受けず、生理活性をもっ
た状態での薬物の徐放化が可能である。

【００１８】之等のタンパク質製剤は、リン酸緩衝溶液
（ｐＨ７．４）、生理食塩水等の注射用溶媒乃至希釈液
に分散し、用いることができるが、乾燥し、使用時に希
釈液に分散し用いてもよい。

【００１９】かくして得られる本発明の表面架橋型タン
パク質製剤は、表面のみ架橋された袋状のタンパク質製
剤であり、袋の中ではタンパク質或はペプチド薬物は架
橋反応を受けず、元の状態のまま包含され、その結果生
理活性をもった薬物が徐放され、その失活や徐放性悪化
のおそれもない。

【００２０】

【実施例】以下、実施例をあげて本発明について詳細に
説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるもので
はない。

【００２１】

【実施例１】クロロホルム４ｍｌとシクロヘキサン６ｍ
ｌとの混合溶液中に、ソルビタントリオレエート（Span
85 、和光純薬工業社製）１００ｍｇを溶解し、この溶
液中にゼラチン（アルカリタイプ、ｐＩ４．９、新田ゼ
ラチン株式会社製）２０ｍｇ及び牛血清アルブミン（Ｂ
ＳＡ）２ｍｇを含む０．４Ｍ炭酸バァッファー溶液（ｐ
Ｈ９．８）０．２ｍｌを添加し、混合物をホモジェナイ
ザーを用いて乳化した。

【００２２】生成したエマルジョンを予め冷却しておい
た上記Span 85 を含有した上記クロロホルム／シクロヘ
キサン混合有機溶液１０ｍｌにすばやく添加した。次い
で、これに１．９×１０^-4ミリモル／ｍｇゼラチン濃度
のサクシニルクロライドを含む上記クロロホルム／シク
ロヘキサン（４：６）混合溶液２．５ｍｌを加え、０℃
で３分間撹拌した。反応後、エマルジョンを遠心分離
（４０００ｒｐｍ、５分間）し、上清をすてた。沈殿部
分（ＢＳＡ含有表面架橋型ゼラチンマイクロスフェア）
を、上記クロロホルム／シクロヘキサン（４：６）混合
溶液にて３回遠心洗浄し、続いてリン酸緩衝生理食塩水
溶液（ＰＢＳ、ｐＨ７．４）にて遠心洗浄を３回繰返し
て、所望のマイクロスフェアを得た。

【００２３】得られたＢＳＡ含有表面架橋型ゼラチンマ
イクロスフェアのＰＢＳ中での光学顕微鏡写真撮影結果
を図１にＡとして示す。尚、図１中Ｂは、比較のため水
溶性架橋剤としてのグルタルアルデヒドを用いて作製し
たＢＳＡ含有ゼラチンマイクロスフェア（特開平２−１
１１７９９号に従い作製したもの）の写真である。

【００２４】該図より、本実施例によれば、袋状構造を
もつカプセルタイプのマイクロスフェアが調製されるこ
とが判る。

【００２５】

【実施例２】クロロホルム４ｍｌとシクロヘキサン６ｍ
ｌとの混合溶液中に、ソルビタントリオレエート（Span
85 、和光純薬社製）１００ｍｇを溶解し、この溶液中
にゼラチン（アルカリタイプ、ｐＩ４．９、新田ゼラチ
ン株式会社製）及びＢＳＡを含む０．４Ｍ炭酸バァッフ
ァー溶液（ｐＨ９．８）０．２ｍｌを添加し、混合物を
ホモジェナイザーを用いて乳化した。上記ゼラチン添加
量は、２０、４０及び６０ｍｇのそれぞれとし、ＢＳＡ
はゼラチンに対して１０重量％となるように、即ち２、
４及び６ｍｇのそれぞれとした。

【００２６】生成したエマルジョンを予め冷却しておい
た上記Span 85 を含有した上記クロロホルム／シクロヘ
キサン（４：６）混合有機溶液１０ｍｌにすばやく添加
した。次いで、これに各種濃度のサクシニルクロライド
を含む上記クロロホルム／シクロヘキサン混合溶液２．
５ｍｌを加え、０℃で３分間撹拌した。反応後、エマル
ジョンを遠心分離（４０００ｒｐｍ、５分間）し、上清
をすてた。沈殿部分（ＢＳＡ含有表面架橋型ゼラチンマ
イクロスフェア）を、上記クロロホルム／シクロヘキサ
ン（４：６）混合溶液にて３回遠心洗浄後、続いてリン
酸緩衝生理食塩水溶液（ＰＢＳ、ｐＨ７．４）にて遠心
洗浄を３回繰返し、凍結乾燥して所望のマイクロスフェ
アを得た。

【００２７】得られたＢＳＡ含有表面架橋型ゼラチンマ
イクロスフェアの収量及びＢＳＡ含有率を、用いたゼラ
チン及びサクシニルクロライドの濃度と共に、表１に示
す。尚、上記収量及びＢＳＡ含有率は、それぞれマイク
ロスフェア作製前後の重量比、及び ¹²⁵Ｉ標識ＢＳＡを
用いて調べたものである。

【００２８】

【表１】 該表より、マイクロスフェアの収量は、仕込みゼラチン
量の増加と共に増加することが判る。これはゼラチンの
濃度が低い場合には、架橋反応がうまく進行せず、得ら
れる表面架橋型マイクロスフェアが少ないことを示して
いる。またそれらの収量は、対応するマイクロスフェア
のＢＳＡ含有率とほぼ同程度であり、ＢＳＡはマイクロ
スフェア内にほぼ１００％包含されていると考えられ
る。

【００２９】

【実施例３】ＢＳＡの代わりにヒト遺伝子組換え型腫瘍
壊死因子（ＴＮＦ、大日本製薬株式会社製）を用いる以
外は、実施例２と同様にして、ＴＮＦを包含した表面架
橋型ゼラチンマイクロスフェアを調製した。

【００３０】ＴＮＦの仕込み量は、２．５×１０³ ユニ
ット／ｍｇゼラチンとした。

【００３１】得られたＴＮＦ含有ゼラチンマイクロスフ
ェアの収量及びＴＮＦ含有率を実施例１と同様にして求
めた結果を表２に示す。

【００３２】

【表２】 本実施例でも、実施例１と同様にほぼ１００％の含有率
でＴＮＦがマイクロスフェア内に包含されていた。

【００３３】

【実施例４】実施例２で作製したＢＳＡ含有表面架橋型
ゼラチンマイクロスフェアのインビトロ(in vitro)での
分解性を、コラゲナーゼ含有（８×１０^-4 mg/ml）或は
不含ＰＢＳ中、３７℃で振盪した後の残存マイクロスフ
ェアのタンパク質量をニンヒドリン法にて測定すること
で評価した。

【００３４】結果を図２に示す。

【００３５】図２より、時間の経過と共に表面架橋型ゼ
ラチンマイクロスフェアは分解することが判る。またそ
の分解性は、マイクロスフェア調製時でのゼラチン濃度
によりコントロール可能である事が判る。尚、コラゲナ
ーゼ添加により、マイクロスフェアの分解は加速され
た。

【００３６】一方、コラゲナーゼを含まないＰＢＳ中で
のマイクロスフェアの分解性試験において、４日後のマ
イクロスフェアを光学顕微鏡にて観察した所、分解３０
分後とほぼ同じ個数のカプセルタイプのマイクロスフェ
アが残存していた。これはＰＢＳ中ではゼラチンカプセ
ルは分解されず、カプセル膜を通して、カプセル内にあ
るゼラチン分子が拡散により溶出したためであると考え
られる。

【００３７】

【実施例５】¹²⁵Ｉ標識ＴＮＦを用いて実施例３と同様
にして調製したＴＮＦ含有表面架橋型ゼラチンマイクロ
スフェアからのインビトロにおけるＴＮＦの徐放性を、
該マイクロスフェアをＰＢＳ中、３７℃にて所定時間振
盪後の ¹²⁵Ｉ放射活性の測定により調べた。

【００３８】結果を図３に示す。

【００３９】図３より、いずれのマイクロスフェアから
も時間と共にＴＮＦが徐放されていることが判る。ま
た、その徐放パターンはマイクロスフェア作製時でのゼ
ラチン濃度によりコントロールできることも判る。

【００４０】

【実施例６】表面架橋型ゼラチンマイクロスフェア内に
包含されたＴＮＦ、包含されていないＴＮＦ及び空のマ
イクロスフェアのそれぞれを用いて、マウス繊維肉腫
（MethA）を２４時間培養した後の、生存細胞数を調べ
た。コントロールとして、何も培養系に加えずに、通常
の状態で細胞を増殖させた。

【００４１】それぞれの生存細胞数の、コントロール群
の細胞数との比から、細胞増殖抑制率を算出した。この
値が大きいほど増殖抑制活性が大きいことを示してい
る。

【００４２】その結果を図４に示す。

【００４３】図４から、マイクロスフェアへの包含に関
係なく、ＴＮＦ存在下では、細胞の増殖は、ＴＮＦ濃度
依存的に抑制されていた。しかしながらマイクロスフェ
アに包含することにより、遊離ＴＮＦに比較して、より
少ないＴＮＦ量で、同じ増殖抑制活性を示している。こ
のことは、ＴＮＦを徐放化することが、その生理活性発
現に有効に働いていることを示している。

【図面の簡単な説明】

【図１】実施例１で得られたＢＳＡ含有表面架橋型ゼラ
チンマイクロスフェアのＰＢＳ中での粒子構造を示す図
面に代わる光学顕微鏡写真（Ａ）及び水溶性架橋剤であ
るグルタルアルデヒドを用いて作製されたＢＳＡ含有ゼ
ラチンマイクロスフェアの同写真（Ｂ）である。

【図２】実施例２で作製したＢＳＡ含有表面架橋型ゼラ
チンマイクロスフェアのインビトロでの分解性を評価し
たグラフである。

【図３】ＴＮＦ含有表面架橋型ゼラチンマイクロスフェ
アからのインビトロにおけるＴＮＦの徐放性を ¹²⁵Ｉ放
射活性の測定により調べたグラフである。

【図４】表面架橋型ゼラチンマイクロスフェア内に包含
されたＴＮＦによる、マウス繊維肉腫細胞の細胞増殖抑
制効果を評価したグラフである。

Claims (2)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】親油性架橋剤を用いた表面架橋型タンパク
   質製剤。
2. 【請求項２】タンパク質薬物を包含するタンパク質担体
   を親油性架橋剤により表面架橋させることを特徴とする
   請求項１に記載の表面架橋型タンパク質製剤の製造方
   法。