JPH06339374A - バチルスコアグランスから得られる新規な制限エンドヌクレアーゼ及びその製造方法 - Google Patents
バチルスコアグランスから得られる新規な制限エンドヌクレアーゼ及びその製造方法Info
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- JPH06339374A JPH06339374A JP3186917A JP18691791A JPH06339374A JP H06339374 A JPH06339374 A JP H06339374A JP 3186917 A JP3186917 A JP 3186917A JP 18691791 A JP18691791 A JP 18691791A JP H06339374 A JPH06339374 A JP H06339374A
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Abstract
(57)【要約】 （修正有）
【目的】Bacillus coagulansから得られる新規なタイプ
IIの制限エンドヌクレアーゼを提供する。 【構成】Bcg Ｉと称するエンドヌクレアーゼは、以下の
ヌクレオチド配列： ５’/（Ｎ）10ＣＧＡ（Ｎ）６ＴＧＣ（Ｎ）12/３’ ３’/（Ｎ）12ＧＣＴ（Ｎ）６ＡＣＧ（Ｎ）10/５’ を認識し、その認識配列の外側両端に切断場所を有し、
34塩基対フラグメントを生成する。Bacillus coagulans
から精製したBcg Ｉを得る方法、染色体ＤＮＡをマッピ
ングする方法及びBcg Ｉなどの酵素での形質転換体に於
けるバックグラウンドを減少させる方法より構成され
る。
IIの制限エンドヌクレアーゼを提供する。 【構成】Bcg Ｉと称するエンドヌクレアーゼは、以下の
ヌクレオチド配列： ５’/（Ｎ）10ＣＧＡ（Ｎ）６ＴＧＣ（Ｎ）12/３’ ３’/（Ｎ）12ＧＣＴ（Ｎ）６ＡＣＧ（Ｎ）10/５’ を認識し、その認識配列の外側両端に切断場所を有し、
34塩基対フラグメントを生成する。Bacillus coagulans
から精製したBcg Ｉを得る方法、染色体ＤＮＡをマッピ
ングする方法及びBcg Ｉなどの酵素での形質転換体に於
けるバックグラウンドを減少させる方法より構成され
る。
Description
【０００１】
【発明の背景】本発明は、バチルスコアグランス（Baci
llus coagulans）から得ることができる新規な制限エン
ドヌクレアーゼ、即ちBcgＩと、その製造方法及びこの
新規な酵素を使用する関連方法に関する。
llus coagulans）から得ることができる新規な制限エン
ドヌクレアーゼ、即ちBcgＩと、その製造方法及びこの
新規な酵素を使用する関連方法に関する。
【０００２】多くの細菌は、外来のＤＮＡの侵入に対す
る保護システムを有する。細菌細胞は、ＤＮＡが通常適
切な対応するＤＮＡメチラーゼによって予め修飾されて
いない限り、侵入ＤＮＡの二重鎖を切断する特定のエン
ドヌクレアーゼを含む。この付随メチラーゼを有するエ
ンドヌクレアーゼは、制限−修飾システム（以後、『R-
Mシステム（a restriction-modification system）』と
称する）と呼ばれる。R-Mシステムの主要な機能は、細
菌細胞を、これらに寄生しようとするプラスミドＤＮＡ
分子及び細菌ファージによって感染しないようにし得る
ことで、防御的である。
る保護システムを有する。細菌細胞は、ＤＮＡが通常適
切な対応するＤＮＡメチラーゼによって予め修飾されて
いない限り、侵入ＤＮＡの二重鎖を切断する特定のエン
ドヌクレアーゼを含む。この付随メチラーゼを有するエ
ンドヌクレアーゼは、制限−修飾システム（以後、『R-
Mシステム（a restriction-modification system）』と
称する）と呼ばれる。R-Mシステムの主要な機能は、細
菌細胞を、これらに寄生しようとするプラスミドＤＮＡ
分子及び細菌ファージによって感染しないようにし得る
ことで、防御的である。
【０００３】細菌は、通常、種（species）当たりほん
の少数の制限エンドヌクレアーゼしか有さない。エンド
ヌクレアーゼは、由来する細菌に従って名付けられる。
そこで、例えばHaemophilus aegyptius種は、HaeＩ、Ha
e II及びHae IIIと名付けられる３つの異なる制限エン
ドヌクレアーゼを合成する。これらの酵素は、各々配列
（ＡＴ）ＧＧＣＣ（ＡＴ）、ＰｕＧＣＧＣＰｙ及びＧＧ
ＣＣを認識し且つ切断する。一方、Escherichia coli R
Y13は、たった１種の制限エンドヌクレアーゼ、即ち配
列ＧＡＡＴＴＣを認識するEcoR Ｉを合成する。
の少数の制限エンドヌクレアーゼしか有さない。エンド
ヌクレアーゼは、由来する細菌に従って名付けられる。
そこで、例えばHaemophilus aegyptius種は、HaeＩ、Ha
e II及びHae IIIと名付けられる３つの異なる制限エン
ドヌクレアーゼを合成する。これらの酵素は、各々配列
（ＡＴ）ＧＧＣＣ（ＡＴ）、ＰｕＧＣＧＣＰｙ及びＧＧ
ＣＣを認識し且つ切断する。一方、Escherichia coli R
Y13は、たった１種の制限エンドヌクレアーゼ、即ち配
列ＧＡＡＴＴＣを認識するEcoR Ｉを合成する。
【０００４】制限エンドヌクレアーゼ、即ちR-Mシステ
ムの第１成分は、ＤＮＡ分子の分解に実際に使用するた
めに、その認識配列及び切断特異性に関して主に特徴付
けられてきた。制限エンドヌクレアーゼの大部分は、4-
6のヌクレオチド長の配列を認識する。より最近では、7
-8のヌクレオチド長の認識配列を有する制限エンドヌク
レアーゼが発見された。全部ではないが、大部分の認識
部位は２回対称軸を含み、多くの場合、部位内部の塩基
は総て独自に特異化されている。制限エンドヌクレアー
ゼの認識配列に於けるこの対称的な関係は、『パリンド
ローム』と呼称されている。幾つかの制限エンドヌクレ
アーゼは、同一位置で複数の塩基を識別し得るという点
で、退化（degenerate）または緩和した（relaxed）特
異性を有する。配列ＧＧＣＣを認識するHae IIIは、対
称関係を有する制限エンドヌクレアーゼの一例であり、
一方、配列ＰｕＧＣＧＣＰｙを認識するHae IIは、退化
または緩和した特異性を有する制限エンドヌクレアーゼ
の代表である。対称認識部位を持つエンドヌクレアーゼ
は、一般に認識部位内部またはそれに隣接する部位を対
称に切断するが、非対称部位を認識するエンドヌクレア
ーゼは、認識部位から距離を於いて切断する傾向があ
り、通常約１〜18塩基対離れて切断する。
ムの第１成分は、ＤＮＡ分子の分解に実際に使用するた
めに、その認識配列及び切断特異性に関して主に特徴付
けられてきた。制限エンドヌクレアーゼの大部分は、4-
6のヌクレオチド長の配列を認識する。より最近では、7
-8のヌクレオチド長の認識配列を有する制限エンドヌク
レアーゼが発見された。全部ではないが、大部分の認識
部位は２回対称軸を含み、多くの場合、部位内部の塩基
は総て独自に特異化されている。制限エンドヌクレアー
ゼの認識配列に於けるこの対称的な関係は、『パリンド
ローム』と呼称されている。幾つかの制限エンドヌクレ
アーゼは、同一位置で複数の塩基を識別し得るという点
で、退化（degenerate）または緩和した（relaxed）特
異性を有する。配列ＧＧＣＣを認識するHae IIIは、対
称関係を有する制限エンドヌクレアーゼの一例であり、
一方、配列ＰｕＧＣＧＣＰｙを認識するHae IIは、退化
または緩和した特異性を有する制限エンドヌクレアーゼ
の代表である。対称認識部位を持つエンドヌクレアーゼ
は、一般に認識部位内部またはそれに隣接する部位を対
称に切断するが、非対称部位を認識するエンドヌクレア
ーゼは、認識部位から距離を於いて切断する傾向があ
り、通常約１〜18塩基対離れて切断する。
【０００５】細菌のR-Mシステムの第２成分は、修飾メ
チラーゼである。これらの酵素は、制限エンドヌクレア
ーゼに対し相補的であり、これによって細菌が自分自身
のＤＮＡを保護でき、且つ自分自身と外来の感染しよう
とするＤＮＡとを区別する手段を備える。修飾メチラー
ゼは、対応する制限エンドヌクレアーゼと同様に、同一
ヌクレオチド認識配列を認識し且つこれと結合し得る
が、ＤＮＡを分解するかわりに、これらは配列内部にメ
チル基を添加することによって１つまたはそれ以上のヌ
クレオチドを化学的に修飾する。メチル化後には、認識
配列は、対応する制限エンドヌクレアーゼによってもは
や結合も切断もされない。細菌細胞のＤＮＡは、その修
飾メチラーゼの活性によって常に十分に修飾されている
ので、内因性の制限エンドヌクレアーゼの存在に対して
完全に感受性である。制限エンドヌクレアーゼの認識及
び攻撃に対して感受性があるのは、修飾されていない、
従って外来のものとして認識し得るＤＮＡだけであ
る。。
チラーゼである。これらの酵素は、制限エンドヌクレア
ーゼに対し相補的であり、これによって細菌が自分自身
のＤＮＡを保護でき、且つ自分自身と外来の感染しよう
とするＤＮＡとを区別する手段を備える。修飾メチラー
ゼは、対応する制限エンドヌクレアーゼと同様に、同一
ヌクレオチド認識配列を認識し且つこれと結合し得る
が、ＤＮＡを分解するかわりに、これらは配列内部にメ
チル基を添加することによって１つまたはそれ以上のヌ
クレオチドを化学的に修飾する。メチル化後には、認識
配列は、対応する制限エンドヌクレアーゼによってもは
や結合も切断もされない。細菌細胞のＤＮＡは、その修
飾メチラーゼの活性によって常に十分に修飾されている
ので、内因性の制限エンドヌクレアーゼの存在に対して
完全に感受性である。制限エンドヌクレアーゼの認識及
び攻撃に対して感受性があるのは、修飾されていない、
従って外来のものとして認識し得るＤＮＡだけであ
る。。
【０００６】1000個以上の種々の制限エンドヌクレアー
ゼが、細菌株から単離されたが、多くは共通の特異性を
共有する。同一配列を認識する制限エンドヌクレアーゼ
は、『アイソシゾマー（isoschizomers）』と呼ばれ
る。アイソシゾマーの認識配列は同一であっても、切断
部位に関しては千差万別であり［例えば、XmaI、SmaIに
関しては、Endowら.,J.Mol .Biol.112:521（1977）；Waa
lwijkら，Nucleic AcidsRes.5:3231（1978）］且つ、種
々の部位に於ける切断速度も様々である［Xhol、v.Pae
R7Iに関しては、Gingerasら.,Proc.Natl.Acad.Sci U.S .
A.80:402（1983）］。
ゼが、細菌株から単離されたが、多くは共通の特異性を
共有する。同一配列を認識する制限エンドヌクレアーゼ
は、『アイソシゾマー（isoschizomers）』と呼ばれ
る。アイソシゾマーの認識配列は同一であっても、切断
部位に関しては千差万別であり［例えば、XmaI、SmaIに
関しては、Endowら.,J.Mol .Biol.112:521（1977）；Waa
lwijkら，Nucleic AcidsRes.5:3231（1978）］且つ、種
々の部位に於ける切断速度も様々である［Xhol、v.Pae
R7Iに関しては、Gingerasら.,Proc.Natl.Acad.Sci U.S .
A.80:402（1983）］。
【０００７】３種の別個のタイプのR-Mシステムは、サ
ブユニット組成、補因子要求性及びＤＮＡ切断タイプを
元にして特徴付けられる。タイプＩのR-Mシステムは最
も複雑である。エンドヌクレアーゼは、通常３種類の異
なるタイプのサブユニットを含み、且つＤＮＡ切断に対
してMg++、ATP及びS-アデノシル-メチオニンを要求す
る。その認識部位は複雑であり、且つＤＮＡ切断は認識
部位から400〜7000塩基対離れた任意の非特異的部位に
て生起する。
ブユニット組成、補因子要求性及びＤＮＡ切断タイプを
元にして特徴付けられる。タイプＩのR-Mシステムは最
も複雑である。エンドヌクレアーゼは、通常３種類の異
なるタイプのサブユニットを含み、且つＤＮＡ切断に対
してMg++、ATP及びS-アデノシル-メチオニンを要求す
る。その認識部位は複雑であり、且つＤＮＡ切断は認識
部位から400〜7000塩基対離れた任意の非特異的部位に
て生起する。
【０００８】タイプIIのR-Mシステムは、タイプＩまた
はIIIよりもずっと単純である。エンドヌクレアーゼ
は、１個のサブユニットのみを含み、且つMg++のみがＤ
ＮＡ切断に要求される。さらにＤＮＡ切断部位は、酵素
の認識部位の内部またはそれに隣接する部位で生じる。
この種の制限エンドヌクレアーゼは、分子生物学者にと
って最も有益であることが解った。
はIIIよりもずっと単純である。エンドヌクレアーゼ
は、１個のサブユニットのみを含み、且つMg++のみがＤ
ＮＡ切断に要求される。さらにＤＮＡ切断部位は、酵素
の認識部位の内部またはそれに隣接する部位で生じる。
この種の制限エンドヌクレアーゼは、分子生物学者にと
って最も有益であることが解った。
【０００９】タイプIIIのR-Mシステムは、タイプＩのシ
ステムよりそれほど複雑ではない。タイプIIIのR-Mシス
テムのエンドヌクレアーゼは２種のサブユニットのみを
含むが、Mg++及びＡＴＰをＤＮＡ切断に於いて要求し、
Ｓ-アデノシル-メチオニンは、絶対的な要件ではない
が、酵素活性を刺激する。ＤＮＡ切断は、認識部位から
約25〜27塩基対だけ離れて起きる。
ステムよりそれほど複雑ではない。タイプIIIのR-Mシス
テムのエンドヌクレアーゼは２種のサブユニットのみを
含むが、Mg++及びＡＴＰをＤＮＡ切断に於いて要求し、
Ｓ-アデノシル-メチオニンは、絶対的な要件ではない
が、酵素活性を刺激する。ＤＮＡ切断は、認識部位から
約25〜27塩基対だけ離れて起きる。
【００１０】近年、２種の制限エンドヌクレアーゼ、即
ちGsu I及びEco57 Iが単離され同定された。両方ともMg
++を要求し、且つＳ-アデノシル-メチオニンで刺激され
る（Petrusyteら.,Dokl．AKad．Ｎauk．SSSR 295.,p.12
50〜1253，1987参照)。これらの酵素は、新規なタイプ
の制限エンドヌクレアーゼのようである。さらに、Kram
arovらは、Bioorg，Khim 14 p.916〜920，1980に於い
て、認識部位領域に於いて30〜32個のヌクレオチドで分
離された２本の二重鎖の切断部分を生成すると報告され
ているBacillus stearothermophilusからの部位特異性
エンドヌクレアーゼBST 4.4Iについて報告している。さ
らに、OrekhovらのDokl．Akad．Nauk．SSSR 263 p.217
〜220，1982では、Sgr II、即ちStreptomyces griseus
からのEcoRIIのアイソシゾマーについて報告しており、
且つこのアイソシゾマーはその認識部位の両端で切断す
ると示唆している。
ちGsu I及びEco57 Iが単離され同定された。両方ともMg
++を要求し、且つＳ-アデノシル-メチオニンで刺激され
る（Petrusyteら.,Dokl．AKad．Ｎauk．SSSR 295.,p.12
50〜1253，1987参照)。これらの酵素は、新規なタイプ
の制限エンドヌクレアーゼのようである。さらに、Kram
arovらは、Bioorg，Khim 14 p.916〜920，1980に於い
て、認識部位領域に於いて30〜32個のヌクレオチドで分
離された２本の二重鎖の切断部分を生成すると報告され
ているBacillus stearothermophilusからの部位特異性
エンドヌクレアーゼBST 4.4Iについて報告している。さ
らに、OrekhovらのDokl．Akad．Nauk．SSSR 263 p.217
〜220，1982では、Sgr II、即ちStreptomyces griseus
からのEcoRIIのアイソシゾマーについて報告しており、
且つこのアイソシゾマーはその認識部位の両端で切断す
ると示唆している。
【００１１】制限エンドヌクレアーゼの数多くが既に多
数のＤＮＡ配列まで知られているにもかからわず、遺伝
子の増殖を成功させるためには、多様な酵素としての特
徴を備えた制限酵素がさらに必要である。
数のＤＮＡ配列まで知られているにもかからわず、遺伝
子の増殖を成功させるためには、多様な酵素としての特
徴を備えた制限酵素がさらに必要である。
【００１２】
【発明の概要】本発明は、細菌バチルスコアグランス
（Bacillus coagulans）から得ることができる新規なタ
イプの制限エンドヌクレアーゼ（以下、『BcgＩ』と呼
称する）を提供し、該エンドヌクレアーゼは： （１）ＤＮＡ配列： ５’ＣＧＡ（Ｎ）６ＴＧＣ３’ ３’ＧＣＴ（Ｎ）６ＡＣＧ５’ （式中、Ａ、Ｔ、Ｃ及びＧは、各々アデニン、チミン、
シトシン及びグアニンを表す）を認識し、（２）その認
識配列の二重鎖ＤＮＡの外側の両端で切断して、BcgＩ
認識配列を含む34塩基対（“bp”）フラグメントを生成
し、（３）Bcg Ｉ二重消化によって、位置950及び5300
にマッピングされた二重鎖phiＸ174をPst Ｉ、Nci Ｉ及
びStu Ｉで２回切断し、且つ位置2200にマッピングされ
たpUC19をSca Ｉ、Pst Ｉ及びAlwN Ｉで一回切断する。
（Bacillus coagulans）から得ることができる新規なタ
イプの制限エンドヌクレアーゼ（以下、『BcgＩ』と呼
称する）を提供し、該エンドヌクレアーゼは： （１）ＤＮＡ配列： ５’ＣＧＡ（Ｎ）６ＴＧＣ３’ ３’ＧＣＴ（Ｎ）６ＡＣＧ５’ （式中、Ａ、Ｔ、Ｃ及びＧは、各々アデニン、チミン、
シトシン及びグアニンを表す）を認識し、（２）その認
識配列の二重鎖ＤＮＡの外側の両端で切断して、BcgＩ
認識配列を含む34塩基対（“bp”）フラグメントを生成
し、（３）Bcg Ｉ二重消化によって、位置950及び5300
にマッピングされた二重鎖phiＸ174をPst Ｉ、Nci Ｉ及
びStu Ｉで２回切断し、且つ位置2200にマッピングされ
たpUC19をSca Ｉ、Pst Ｉ及びAlwN Ｉで一回切断する。
【００１３】本発明はさらに、Bcg Ｉの発現に好適な条
件下に、Ba cillus coagulansを培養し、細胞を収集し、
それから細胞を含まない抽出物を得、そして細胞を含ま
ない抽出物から制限エンドヌクレアーゼBcg Ｉを分離且
つ収集することからなる新規な制限エンドヌクレアーゼ
Bcg Ｉの製造方法に関する。
件下に、Ba cillus coagulansを培養し、細胞を収集し、
それから細胞を含まない抽出物を得、そして細胞を含ま
ない抽出物から制限エンドヌクレアーゼBcg Ｉを分離且
つ収集することからなる新規な制限エンドヌクレアーゼ
Bcg Ｉの製造方法に関する。
【００１４】本発明はさらに、Bcg Ｉなどの酵素を使用
して染色体ＤＮＡをマッピングする新規な方法並びに、
対象ＤＮＡをBcg Ｉなどの制限エンドヌクレアーゼの認
識配列に挿入し、且つ好適な酵素によってそのライブラ
リーを制限して、形質転換細胞に於けるバックグラウン
ドを減少させる方法にも関する。 〔発明の詳細な説明〕
して染色体ＤＮＡをマッピングする新規な方法並びに、
対象ＤＮＡをBcg Ｉなどの制限エンドヌクレアーゼの認
識配列に挿入し、且つ好適な酵素によってそのライブラ
リーを制限して、形質転換細胞に於けるバックグラウン
ドを減少させる方法にも関する。 〔発明の詳細な説明〕
【００１５】本発明に従って、菌株NEB、菌株No.566のB
a cillus coagulansを培養し、次いで細胞から酵素を回
収することによってBcgＩを得る。Bacillus coagulans
のサンプルを、1990年5月31日にAmerican Type Culutur
e Collection（ATCC）に寄託して、ATCC 受託番号No.55
055を得る。
a cillus coagulansを培養し、次いで細胞から酵素を回
収することによってBcgＩを得る。Bacillus coagulans
のサンプルを、1990年5月31日にAmerican Type Culutur
e Collection（ATCC）に寄託して、ATCC 受託番号No.55
055を得る。
【００１６】Bacillus coagulans NEB 566株を、成育地
（soil)から単離してLB寒天上に置いた。選別したコロ
ニーを拾い出してプレートで精製した。精製サンプル
を、Schildkraut，Genetic Engineering Principle s an
d Methods,（1984）Setlow,J.K.ら編著,Plenum Publish
ing，Vol.6，pg.117（本明細書中、参照として含まれ
る）に記載された方法に従ってエンドヌクレアーゼ活性
について分析した。Bacillus coagulans NEB 566として
同定されたサンプルは、新規な制限エンドヌクレアーゼ
Bcg Ｉを含んでいた。
（soil)から単離してLB寒天上に置いた。選別したコロ
ニーを拾い出してプレートで精製した。精製サンプル
を、Schildkraut，Genetic Engineering Principle s an
d Methods,（1984）Setlow,J.K.ら編著,Plenum Publish
ing，Vol.6，pg.117（本明細書中、参照として含まれ
る）に記載された方法に従ってエンドヌクレアーゼ活性
について分析した。Bacillus coagulans NEB 566として
同定されたサンプルは、新規な制限エンドヌクレアーゼ
Bcg Ｉを含んでいた。
【００１７】本発明の酵素を回収するためには、Bacill
us coagulansを任意の好適な方法を使用して増殖させ得
る。例えば、Bacillus coagulansを撹拌及び通気しなが
らLuria Broth（LB）培地（pH7.2）中37℃で増殖させて
もよい。対数関数的増殖期の後期に細胞を遠心分離機を
使用して収集し、-70℃で凍結貯蔵した。
us coagulansを任意の好適な方法を使用して増殖させ得
る。例えば、Bacillus coagulansを撹拌及び通気しなが
らLuria Broth（LB）培地（pH7.2）中37℃で増殖させて
もよい。対数関数的増殖期の後期に細胞を遠心分離機を
使用して収集し、-70℃で凍結貯蔵した。
【００１８】細胞を収穫して、凍結させた後、酵素を慣
用の酵素精製法を利用して単離し、次いで凍結細胞ペー
ストから精製し得る。例えば、得られた細胞ペーストを
緩衝溶液中で溶解、次いで懸濁させ、緩衝溶液によって
酵素を抽出する操作にかける。この操作は、超音波処
理、高圧分散または酵素的な消化を含む。細胞残渣を遠
心分離して除去し、新規酵素を含む上澄みは、例えばホ
スホセルロースまたはDEAE-セルロースを用いてのイオ
ン交換クロマトグラフィー、モレキュラーシーブクロマ
トグラフィー及びアフィニティークロマトグラフィー
（例えば、ヘパリンアガロース若しくはＤＮＡ-セルロ
ースを使用）またはこれらの方法を組み合わせて精製し
得、本発明の酵素を製造し得る。
用の酵素精製法を利用して単離し、次いで凍結細胞ペー
ストから精製し得る。例えば、得られた細胞ペーストを
緩衝溶液中で溶解、次いで懸濁させ、緩衝溶液によって
酵素を抽出する操作にかける。この操作は、超音波処
理、高圧分散または酵素的な消化を含む。細胞残渣を遠
心分離して除去し、新規酵素を含む上澄みは、例えばホ
スホセルロースまたはDEAE-セルロースを用いてのイオ
ン交換クロマトグラフィー、モレキュラーシーブクロマ
トグラフィー及びアフィニティークロマトグラフィー
（例えば、ヘパリンアガロース若しくはＤＮＡ-セルロ
ースを使用）またはこれらの方法を組み合わせて精製し
得、本発明の酵素を製造し得る。
【００１９】以下の実施例１で議論したように、１回の
カラムから得られた蛋白質と粗抽出物は、S-アデノシル
メチオニンの存在を要求しなかったが、Bcg Ｉがより純
粋になるにつれて、Bcg Ｉのエンドヌクレアーゼ活性
は、補因子としてのS-アデノシルメチオニンの存在に完
全に依存することが知見された（図１参照）。Sinefung
in（Cal Biochemより入手）、即ちS-アデノシルメチオ
ニンの構造的類縁体も補因子として作用し、Bcg ＩがS-
アデノシルメチオニンのメチル基の転移を要求せず、従
って切断は認識配列のメチル化に依存しないことを示し
ている。
カラムから得られた蛋白質と粗抽出物は、S-アデノシル
メチオニンの存在を要求しなかったが、Bcg Ｉがより純
粋になるにつれて、Bcg Ｉのエンドヌクレアーゼ活性
は、補因子としてのS-アデノシルメチオニンの存在に完
全に依存することが知見された（図１参照）。Sinefung
in（Cal Biochemより入手）、即ちS-アデノシルメチオ
ニンの構造的類縁体も補因子として作用し、Bcg ＩがS-
アデノシルメチオニンのメチル基の転移を要求せず、従
って切断は認識配列のメチル化に依存しないことを示し
ている。
【００２０】本発明の制限エンドヌクレアーゼ並びに対
応するＤＮＡメチラーゼは、例えば、Wilsonら.,EPO Pu
blication 第019413号（本明細書中に参照として含まれ
る）に開示されたメチラーゼ選択法などの組換体ＤＮＡ
法を利用して得ることができる。メチラーゼ選択法は、
３段階にて実施される。第１に、R-Mシステムをコード
する細菌株からＤＮＡを精製し、部分的にクローニング
エンドヌクレアーゼで消化し、次いで切断した脱リン酸
化プラスミドベクターに連結する。連結したＤＮＡをE.
Coliに形質転換し、形質転換細胞を貯蔵し、プラスミド
の集団を精製してライブラリーを形成した。次に、ライ
ブラリーを選択エンドヌクレアーゼで消化し、これはメ
チラーゼが与える特異的な修飾によってブロックされ得
る。消化物（digests）は、E.Coliに逆に形質転換さ
れ、未消化の分子を回収する。形質転換細胞は、直ちに
スクリーニングされるか、または貯蔵されて、プラスミ
ドは精製及び選択ラウンドをさらに循環する。最後に個
々の形質転換細胞は収集され、そのプラスミドからミニ
調製物を作成する。プラスミドは、問題のエンドヌクレ
アーゼによる耐消化性及び共通の挿入体の保有に関して
分析される。（メチラーゼ遺伝子は、一般的に総ての真
正メチラーゼクローン中に存在する少なくとも１個のフ
ラグメントによってコードされる。）細胞抽出物を正の
候補物（candidate）より調製し、in vitroでメチルト
ランスフェラーゼ及びエンドヌクレアーゼ活性について
分析した。
応するＤＮＡメチラーゼは、例えば、Wilsonら.,EPO Pu
blication 第019413号（本明細書中に参照として含まれ
る）に開示されたメチラーゼ選択法などの組換体ＤＮＡ
法を利用して得ることができる。メチラーゼ選択法は、
３段階にて実施される。第１に、R-Mシステムをコード
する細菌株からＤＮＡを精製し、部分的にクローニング
エンドヌクレアーゼで消化し、次いで切断した脱リン酸
化プラスミドベクターに連結する。連結したＤＮＡをE.
Coliに形質転換し、形質転換細胞を貯蔵し、プラスミド
の集団を精製してライブラリーを形成した。次に、ライ
ブラリーを選択エンドヌクレアーゼで消化し、これはメ
チラーゼが与える特異的な修飾によってブロックされ得
る。消化物（digests）は、E.Coliに逆に形質転換さ
れ、未消化の分子を回収する。形質転換細胞は、直ちに
スクリーニングされるか、または貯蔵されて、プラスミ
ドは精製及び選択ラウンドをさらに循環する。最後に個
々の形質転換細胞は収集され、そのプラスミドからミニ
調製物を作成する。プラスミドは、問題のエンドヌクレ
アーゼによる耐消化性及び共通の挿入体の保有に関して
分析される。（メチラーゼ遺伝子は、一般的に総ての真
正メチラーゼクローン中に存在する少なくとも１個のフ
ラグメントによってコードされる。）細胞抽出物を正の
候補物（candidate）より調製し、in vitroでメチルト
ランスフェラーゼ及びエンドヌクレアーゼ活性について
分析した。
【００２１】しかしながら多くのR-Mシステムは、より
複雑であり、従って上述したメチラーゼ選択アプローチ
などの標準の組換体ＤＮＡ法を利用して得るのがより困
難であり、R-Mシステムを効果的にクローニングするに
は修飾が必要であることが知見された［Lunnenら.,（19
88）Gene 74：25-32,本明細書中に参照として含まれ
る］。例えば、いくつかのシステムに於いては、メチラ
ーゼ及びエンドヌクレアーゼ遺伝子は結合し得ないか、
または細菌性ＤＮＡの分解に使用されるエンドヌクレア
ーゼは、R-M遺伝子のいずれか一方若しくは両方を切断
し得る。他のシステム（例えば、BamHI及びDdeIなど）
に於いては、形質転換宿主中で発現が不十分であるため
か、またはメチラーゼ及びエンドヌクレアーゼ遺伝子の
発現に対する固有な制御機構あるいは未知の理由の故
に、対応するエンドヌクレアーゼによる消化に対しメチ
ラーゼは十分に保護できない。修飾すると、形質転換用
に選択された宿主細胞に対して有害であることも知見さ
れた。R-Mシステムをクローニングすることに於けるも
う１つの困難な点は、クローニングしようとするエンド
ヌクレアーゼは、メチラーゼ選択に十分な純度または量
で得られないことである。最後に、多くのシステムに於
いては、種々の菌種の形質転換用宿主細胞中でエンドヌ
クレアーゼ遺伝子を発現するのが困難である。
複雑であり、従って上述したメチラーゼ選択アプローチ
などの標準の組換体ＤＮＡ法を利用して得るのがより困
難であり、R-Mシステムを効果的にクローニングするに
は修飾が必要であることが知見された［Lunnenら.,（19
88）Gene 74：25-32,本明細書中に参照として含まれ
る］。例えば、いくつかのシステムに於いては、メチラ
ーゼ及びエンドヌクレアーゼ遺伝子は結合し得ないか、
または細菌性ＤＮＡの分解に使用されるエンドヌクレア
ーゼは、R-M遺伝子のいずれか一方若しくは両方を切断
し得る。他のシステム（例えば、BamHI及びDdeIなど）
に於いては、形質転換宿主中で発現が不十分であるため
か、またはメチラーゼ及びエンドヌクレアーゼ遺伝子の
発現に対する固有な制御機構あるいは未知の理由の故
に、対応するエンドヌクレアーゼによる消化に対しメチ
ラーゼは十分に保護できない。修飾すると、形質転換用
に選択された宿主細胞に対して有害であることも知見さ
れた。R-Mシステムをクローニングすることに於けるも
う１つの困難な点は、クローニングしようとするエンド
ヌクレアーゼは、メチラーゼ選択に十分な純度または量
で得られないことである。最後に、多くのシステムに於
いては、種々の菌種の形質転換用宿主細胞中でエンドヌ
クレアーゼ遺伝子を発現するのが困難である。
【００２２】本発明のエンドヌクレアーゼ、即ちBcg Ｉ
の認識配列は、本発明の制限エンドヌクレアーゼ及び既
知の部位にてテストＤＮＡを切断する制限酵素を用い
て、phix174、pUC19及びT7 ＤＮＡの二重消化（double-
digestion）によって決定され得る。得られたＤＮＡ制
限フラグメントの大きさは、アガロースゲル電気泳動を
使用して決定し得る。この方法を利用して、図２に示し
た以下の結果が得られた。
の認識配列は、本発明の制限エンドヌクレアーゼ及び既
知の部位にてテストＤＮＡを切断する制限酵素を用い
て、phix174、pUC19及びT7 ＤＮＡの二重消化（double-
digestion）によって決定され得る。得られたＤＮＡ制
限フラグメントの大きさは、アガロースゲル電気泳動を
使用して決定し得る。この方法を利用して、図２に示し
た以下の結果が得られた。
【００２３】（a）phix174 ＤＮＡ上のBcgＩの２つの認
識配列を、Pst Ｉ、Nci Ｉ及びStuＩで切断したphix174
ＤＮＡに対する分析により、ほぼ950及び5300塩基対に
マッピングした。配列５’ＣＧＡ（Ｎ）６ＴＧＣ３’
が、967及び5362塩基対の位置で２回生じる。
識配列を、Pst Ｉ、Nci Ｉ及びStuＩで切断したphix174
ＤＮＡに対する分析により、ほぼ950及び5300塩基対に
マッピングした。配列５’ＣＧＡ（Ｎ）６ＴＧＣ３’
が、967及び5362塩基対の位置で２回生じる。
【００２４】（b）pUC19上のBcg Ｉの単一の認識配列
を、Sca Ｉ、Pst Ｉ及びAlwN Ｉで切断したpUC19 ＤＮ
Ａに対する分析により、ほぼ2,200塩基対にマッピング
した。配列５’ＣＧＡ（Ｎ）６ＴＧＣ３’は、2,215塩
基対のたった１箇所で生じる。
を、Sca Ｉ、Pst Ｉ及びAlwN Ｉで切断したpUC19 ＤＮ
Ａに対する分析により、ほぼ2,200塩基対にマッピング
した。配列５’ＣＧＡ（Ｎ）６ＴＧＣ３’は、2,215塩
基対のたった１箇所で生じる。
【００２５】（c）これらのＤＮＡ中に存在することが
知られている多くのBcg Ｉ認識部位に基づいて予期され
るλ及びT7 DNAの切断によって生成したフラグメントの
サイズは、これらのＤＮＡのBcg Ｉ消化物から知見され
たフラグメントサイズと一致した（図２、レーン11及び
12参照）。
知られている多くのBcg Ｉ認識部位に基づいて予期され
るλ及びT7 DNAの切断によって生成したフラグメントの
サイズは、これらのＤＮＡのBcg Ｉ消化物から知見され
たフラグメントサイズと一致した（図２、レーン11及び
12参照）。
【００２６】表１に見られるように、６つのＤＮＡ分子
上でBcg Ｉにより消化生成したフラグメントの数は、配
列５’ＣＧＡ（Ｎ）６ＴＧＣ３’で切断生成したフラグ
メントのコンピューターで予見した数と一致し、６つの
マッピングした配列の切断配列の位置は、コンピュータ
ーで予見した位置と一致した。
上でBcg Ｉにより消化生成したフラグメントの数は、配
列５’ＣＧＡ（Ｎ）６ＴＧＣ３’で切断生成したフラグ
メントのコンピューターで予見した数と一致し、６つの
マッピングした配列の切断配列の位置は、コンピュータ
ーで予見した位置と一致した。
【００２７】上述のデータより、Bcg Ｉは配列５’ＣＧ
Ａ（Ｎ）６ＴＧＣ３’を認識すると結論できる。
Ａ（Ｎ）６ＴＧＣ３’を認識すると結論できる。
【００２８】本発明のエンドヌクレアーゼの認識配列上
の切断場所は、Brownら、J．Mol．Biol．140 p.143-14
8，1980に記載された方法を使用することによって決定
し得る。
の切断場所は、Brownら、J．Mol．Biol．140 p.143-14
8，1980に記載された方法を使用することによって決定
し得る。
【００２９】概括すれば、pUC19を鋳型として使用し、2
215Bcg Ｉ部位の上流の好適なプライマー（2138-2155）
を伸長及びジデオキシシーケンシング反応用に使用し
た。Bcg Ｉは、その認識配列の両端で２回切断し、２塩
基３’伸長した34bpフラグメントを生成する（図３）。
pBR322上のシーケンシングデータはこの結果を確認し
た。λ DNA上には、29Bcg Ｉ認識部位もある。λ DNAの
Bcg Ｉ消化物の34塩基対フラグメントは、Bcg Ｉがその
認識配列の両端を切断すれば、29個の34bpフラグメント
を生成すると予測されたように、アガロースゲルの底部
（図４）に現れた。
215Bcg Ｉ部位の上流の好適なプライマー（2138-2155）
を伸長及びジデオキシシーケンシング反応用に使用し
た。Bcg Ｉは、その認識配列の両端で２回切断し、２塩
基３’伸長した34bpフラグメントを生成する（図３）。
pBR322上のシーケンシングデータはこの結果を確認し
た。λ DNA上には、29Bcg Ｉ認識部位もある。λ DNAの
Bcg Ｉ消化物の34塩基対フラグメントは、Bcg Ｉがその
認識配列の両端を切断すれば、29個の34bpフラグメント
を生成すると予測されたように、アガロースゲルの底部
（図４）に現れた。
【００３０】 表 １ ａ）λ、T7及びアデノ２ＤＮＡ上のBcg Ｉ認識部位数 コンピューターによる 知見された 切断部位数 フラグメント数 λ 28 ＞24 T7 19 ＞16 アデノ２ 10 ＞ 9 b）pBR322、pUC19及びPhiX174 DNA中のBcg Ｉ認識配列の位置 コンピューター予測値 二重（鎖）消化により マッピングされた位置 pBR322 707,2064,3883 700,2100,3900 PhiX174 967,5362 950,5300 pUC19 2215 2 200 上述の方法を利用して、Bcg Ｉがその認識配列の各端： ５’/（Ｎ）10ＧＣＡ（Ｎ）６ＴＧＣ（Ｎ）12/３’ ３’/（Ｎ）12ＧＣＴ（Ｎ）６ＡＣＧ（Ｎ）10/５’ でＤＮＡの両方の鎖を切断し、34bpフラグメントを生成
したと結論できる。
したと結論できる。
【００３１】本発明の酵素は、さらに以下の特性を有す
る。
る。
【００３２】（a）S-アデノシルメチオニン及びSinefun
ginのＫｍを、図５に示す。λＤＮＡ及び酵素の濃度を
一定に保持し、S-アデノシルメチオニン及びSinefungin
濃度を、0.01μＭ〜10μＭまで変化させた。S-アデノシ
ルメチオニン-Bcg ＩのＫｍは約0.1μＭであり、Sinefu
ngin-Bcg ＩのＫｍは約0.5μＭであった。
ginのＫｍを、図５に示す。λＤＮＡ及び酵素の濃度を
一定に保持し、S-アデノシルメチオニン及びSinefungin
濃度を、0.01μＭ〜10μＭまで変化させた。S-アデノシ
ルメチオニン-Bcg ＩのＫｍは約0.1μＭであり、Sinefu
ngin-Bcg ＩのＫｍは約0.5μＭであった。
【００３３】（b）最適消化条件は、以下の通りであ
る：100mＭ NaCl、10mＭ Tris-HCl（pH8.4）、10mＭ Mg
Cl2、10mＭ 2-メルカプトエタノール、20μＭ S-アデノ
シルメチオニン、及び37℃。
る：100mＭ NaCl、10mＭ Tris-HCl（pH8.4）、10mＭ Mg
Cl2、10mＭ 2-メルカプトエタノール、20μＭ S-アデノ
シルメチオニン、及び37℃。
【００３４】（c）温度：Bcg Ｉは、約25℃〜37℃の温
度範囲で安定である。
度範囲で安定である。
【００３５】温度安定性については、Bcg Ｉの１単位
（50ul反応容積中30℃60分で、λＤＮＡ１ｕｇを完全に
消化するのに要した酵素量として定義）を、Ｍｇ++、S-
アデノシルメチオニンまたはＤＮＡのいずれか１個の非
存在下の最適条件下に、各々25℃、37℃及び55℃で培養
することによって決定した。30分間培養後、Bcg Ｉの活
性を第３成分（Ｍｇ++、S-アデノシルメチオニンまたは
ＤＮＡ）を添加して30℃で分析した。25℃及び37℃に於
いては酵素は失活しなかったが、55℃ではBcg Ｉは３条
件総てに於いて失活した。
（50ul反応容積中30℃60分で、λＤＮＡ１ｕｇを完全に
消化するのに要した酵素量として定義）を、Ｍｇ++、S-
アデノシルメチオニンまたはＤＮＡのいずれか１個の非
存在下の最適条件下に、各々25℃、37℃及び55℃で培養
することによって決定した。30分間培養後、Bcg Ｉの活
性を第３成分（Ｍｇ++、S-アデノシルメチオニンまたは
ＤＮＡ）を添加して30℃で分析した。25℃及び37℃に於
いては酵素は失活しなかったが、55℃ではBcg Ｉは３条
件総てに於いて失活した。
【００３６】本発明のもう１つの実施態様によると、 ａ）ＤＮＡ（例えば、Bcg Ｉ）からの認識配列を切断す
る酵素でＤＮＡを消化することによって得られる塩基対
ＤＮＡフラグメントから組換体ＤＮＡライブラリーを形
成し、 ｂ）単一の特異な塩基対挿入物を各々含む個々のクロー
ンを分離し、 ｃ）これらのクローンを、対象ＤＮＡのＤＮＡプローブ
として使用する ことからなるＤＮＡのマッピング方法を提供する。この
ようなプローブは、十分に特異なＤＮＡを含んでおり、
発生源であるＤＮＡの大きな領域を識別できる。Bcg Ｉ
によって発生した例えば、32塩基対の挿入ライブラリー
を使用するマッピングへのこのアプローチは、M.Olson
ら.,Science 245:1434（1989）（本開示は、本明細書中
に参照として含まれる）に記載の提案された配列標識化
部位（STS'S）と類似している。Bcg Ｉを使用して、個
々にクローン化した32塩基対フラグメントが、ＤＮＡの
より大きな領域を特異的に同定（タグ）する。ＤＮＡの
大きなストレッチを特異的に標識化するのに加えて、２
個のより大きなＤＮＡフラグメントのオーバーラップが
容易に証明される。このマッピング方法は、例えばヒト
染色体ＤＮＡのマッピングに特に有用である。
る酵素でＤＮＡを消化することによって得られる塩基対
ＤＮＡフラグメントから組換体ＤＮＡライブラリーを形
成し、 ｂ）単一の特異な塩基対挿入物を各々含む個々のクロー
ンを分離し、 ｃ）これらのクローンを、対象ＤＮＡのＤＮＡプローブ
として使用する ことからなるＤＮＡのマッピング方法を提供する。この
ようなプローブは、十分に特異なＤＮＡを含んでおり、
発生源であるＤＮＡの大きな領域を識別できる。Bcg Ｉ
によって発生した例えば、32塩基対の挿入ライブラリー
を使用するマッピングへのこのアプローチは、M.Olson
ら.,Science 245:1434（1989）（本開示は、本明細書中
に参照として含まれる）に記載の提案された配列標識化
部位（STS'S）と類似している。Bcg Ｉを使用して、個
々にクローン化した32塩基対フラグメントが、ＤＮＡの
より大きな領域を特異的に同定（タグ）する。ＤＮＡの
大きなストレッチを特異的に標識化するのに加えて、２
個のより大きなＤＮＡフラグメントのオーバーラップが
容易に証明される。このマッピング方法は、例えばヒト
染色体ＤＮＡのマッピングに特に有用である。
【００３７】もう１つの実施態様に於いては、 ａ）第１の予定認識部位を、第２の予定認識部位を含む
ベクターの該第２の認識部位に挿入し、ここにおいて、
第２の予定認識部位の認識配列は１種以上の非特異性ヌ
クレオチドによって阻害されるものであり、 ｂ）対象ＤＮＡを前記ベクターの第１の認識配列と連結
させて、形質転換反応用ライブラリーを形成し、 ｃ）前記第２の予定認識部位を含むＤＮＡを制限する、
制限エンドヌクレアーゼとステップｂ）のライブラリー
を接触させ、 ｄ）宿主細胞を、ステップｃ）で得られたライブラリー
で形質転換させる ことからなる形質転換細胞中のバックグラウンドＤＮＡ
を減少させる方法を提供する。
ベクターの該第２の認識部位に挿入し、ここにおいて、
第２の予定認識部位の認識配列は１種以上の非特異性ヌ
クレオチドによって阻害されるものであり、 ｂ）対象ＤＮＡを前記ベクターの第１の認識配列と連結
させて、形質転換反応用ライブラリーを形成し、 ｃ）前記第２の予定認識部位を含むＤＮＡを制限する、
制限エンドヌクレアーゼとステップｂ）のライブラリー
を接触させ、 ｄ）宿主細胞を、ステップｃ）で得られたライブラリー
で形質転換させる ことからなる形質転換細胞中のバックグラウンドＤＮＡ
を減少させる方法を提供する。
【００３８】例えばベクターは、内部の６つのヌクレオ
チドが、ＧＡＡＴＴＣ（EcorIの認識配列）またはＣＡ
ＴＡＴＧ（Nde Ｉの認識配列の一部分）であるBcg Ｉ部
位を含んで直ちに構築され得る。これらの内部に生成し
た部位は、慣用の方法、例えば、対象ＤＮＡを挿入及び
連結することに使用し得る。Bcg Ｉに対して連結反応の
生成物を暴露すると、次の形質転換反応用のバックグラ
ウンドを効果的に減少させることができる。何故なら
ば、Bcg Ｉ部位内部に挿入された対象ＤＮＡを含むベク
ターのみが、Bcg Ｉ制限に対して生き残るからである。
挿入されたＤＮＡを持たないベクターはBcg Ｉによって
切断されるので、宿主を形質転換しない。言い換えれ
ば、Bcg Ｉ認識部位内部に挿入されたＤＮＡを含むベク
ターのみが高い効率で形質転換し得るのである。
チドが、ＧＡＡＴＴＣ（EcorIの認識配列）またはＣＡ
ＴＡＴＧ（Nde Ｉの認識配列の一部分）であるBcg Ｉ部
位を含んで直ちに構築され得る。これらの内部に生成し
た部位は、慣用の方法、例えば、対象ＤＮＡを挿入及び
連結することに使用し得る。Bcg Ｉに対して連結反応の
生成物を暴露すると、次の形質転換反応用のバックグラ
ウンドを効果的に減少させることができる。何故なら
ば、Bcg Ｉ部位内部に挿入された対象ＤＮＡを含むベク
ターのみが、Bcg Ｉ制限に対して生き残るからである。
挿入されたＤＮＡを持たないベクターはBcg Ｉによって
切断されるので、宿主を形質転換しない。言い換えれ
ば、Bcg Ｉ認識部位内部に挿入されたＤＮＡを含むベク
ターのみが高い効率で形質転換し得るのである。
【００３９】
【実施例】以下の実施例は、現在のところ実施する上で
好ましいものとして本発明の態様を例示するものであ
る。実施例は、本発明を説明するものであって、請求項
の記載意外には、本発明を一切限定するものではない。
好ましいものとして本発明の態様を例示するものであ
る。実施例は、本発明を説明するものであって、請求項
の記載意外には、本発明を一切限定するものではない。
【００４０】実施例１ Bcg Ｉの精製 総ての段階は、４℃で実施した。
【００４１】ステップ１：粗抽出物の調製 Bcg Ｉを、培地中通気させながら37℃で増殖したBacill
us coagulans NEB 566から単離した（10g/l トリプト
ン、5g/l 酵母エキス、5g/l NaCl、1mM MgCl2，pHは7.2
に調節した）。細胞を遠心分離によって収穫した。細胞
ペースト400gを、Ｐ緩衝溶液900mlに分散させた［50mM
NaCl、10mM リン酸カリウム（pH6.5）、10mM 2-メルカ
プトエタノール、0.1mM EDTA 、10%グリセリン］。細胞
を10分間、超音波にかけて崩壊させた。抽出物を、４
℃、30Ｋにて30分間、Beckmann J2-2P遠心分離機で遠心
分離した。上澄み液をデカンテーションした。
us coagulans NEB 566から単離した（10g/l トリプト
ン、5g/l 酵母エキス、5g/l NaCl、1mM MgCl2，pHは7.2
に調節した）。細胞を遠心分離によって収穫した。細胞
ペースト400gを、Ｐ緩衝溶液900mlに分散させた［50mM
NaCl、10mM リン酸カリウム（pH6.5）、10mM 2-メルカ
プトエタノール、0.1mM EDTA 、10%グリセリン］。細胞
を10分間、超音波にかけて崩壊させた。抽出物を、４
℃、30Ｋにて30分間、Beckmann J2-2P遠心分離機で遠心
分離した。上澄み液をデカンテーションした。
【００４２】ステップ２：ホスホセルロースクロマトグ
ラフィー ステップ１の上澄み液を、Ｐ緩衝液で平衡させた５×16
cmのホスホセルロースカラム（Whatman P11）に適用し
た。カラムを、300mlのＰ緩衝液で洗浄し、次いで酵素
をＰ緩衝液中の直線的濃度勾配液（NaCl；0〜１Ｍ）300
0mlで溶離した。画分のBcg Ｉ活性を分析し、活性画分
をプールした。
ラフィー ステップ１の上澄み液を、Ｐ緩衝液で平衡させた５×16
cmのホスホセルロースカラム（Whatman P11）に適用し
た。カラムを、300mlのＰ緩衝液で洗浄し、次いで酵素
をＰ緩衝液中の直線的濃度勾配液（NaCl；0〜１Ｍ）300
0mlで溶離した。画分のBcg Ｉ活性を分析し、活性画分
をプールした。
【００４３】ステップ３：水酸燐灰石（ヒドロキシルア
パタイト）クロマトグラフィー ステップ２でプールしたものを、2.5×10cmの水酸燐灰
石カラムに直接適用した。酵素を、0.5Ｍ NaCl 、10mM
2-メルカプトエタノール、0.1mM EDTAの直線的濃度勾配
液（10mM〜700mMリン酸カリウム：pH7.0）で溶離した。
画分のBcg Ｉ活性を分析し、活性画分をプールした。
パタイト）クロマトグラフィー ステップ２でプールしたものを、2.5×10cmの水酸燐灰
石カラムに直接適用した。酵素を、0.5Ｍ NaCl 、10mM
2-メルカプトエタノール、0.1mM EDTAの直線的濃度勾配
液（10mM〜700mMリン酸カリウム：pH7.0）で溶離した。
画分のBcg Ｉ活性を分析し、活性画分をプールした。
【００４４】ステップ４：ヘパリンセファロースクロマ
トグラフィー ステップ３でプールしたものをＨ緩衝液［10mM Tri-HCl
（pH7.4）、50mMNaCl、10mM 2-メルカプトエタノール、
0.1mM EDTA］で２回透析し、Ｈ緩衝液で平衡させたヘパ
リンセファロース（Pharmacia製）カラム（１×10cm）
に適用した。酵素をＨ緩衝液中の直線的濃度勾配液（50
mM〜１Ｍ NaCl）100mlで溶離した。画分をBcg Ｉ活性に
ついて分析し、活性画分をプールした。プールしたもの
を、貯蔵緩衝液［50mM KCl、10mM Tris-HCl（pH7.4）、
0.1mM EDTA、10mM 2-メルカプトエタノール及び50%グリ
セリン］で透析した。酵素を好ましくは−20℃で貯蔵し
た。酵素調製物は実質的に純粋であり、他の混入酵素/
蛋白質を含まず且つ、最適反応条件下で16時間100μlで
の反応で酵素１単位を培養することによって決定され
る、検出可能な非特異性ヌクレアーゼ活性を有していな
かった。得られたＤＮＡゲルのバンドパターンは、１時
間培養した同一反応物と一致した。
トグラフィー ステップ３でプールしたものをＨ緩衝液［10mM Tri-HCl
（pH7.4）、50mMNaCl、10mM 2-メルカプトエタノール、
0.1mM EDTA］で２回透析し、Ｈ緩衝液で平衡させたヘパ
リンセファロース（Pharmacia製）カラム（１×10cm）
に適用した。酵素をＨ緩衝液中の直線的濃度勾配液（50
mM〜１Ｍ NaCl）100mlで溶離した。画分をBcg Ｉ活性に
ついて分析し、活性画分をプールした。プールしたもの
を、貯蔵緩衝液［50mM KCl、10mM Tris-HCl（pH7.4）、
0.1mM EDTA、10mM 2-メルカプトエタノール及び50%グリ
セリン］で透析した。酵素を好ましくは−20℃で貯蔵し
た。酵素調製物は実質的に純粋であり、他の混入酵素/
蛋白質を含まず且つ、最適反応条件下で16時間100μlで
の反応で酵素１単位を培養することによって決定され
る、検出可能な非特異性ヌクレアーゼ活性を有していな
かった。得られたＤＮＡゲルのバンドパターンは、１時
間培養した同一反応物と一致した。
【００４５】実施例２ 染色体ＤＮＡのBcg Ｉでのマッピング 染色体ＤＮＡを、Bcg Ｉで完全に消化した。ＤＮＡフラ
グメントを次いでサイズに従って、アガロースゲル電気
泳動などの方法によって分離した。34塩基対ＤＮＡフラ
グメントに対応するゲル上のバンドを集める。34塩基対
ＤＮＡフラグメントを集めて、E.Coli ＤＮＡポリメラ
ーゼクレノウフラグメントのようなＤＮＡポリメラーゼ
及び、全４種のデオキシヌクレオチド三リン酸（dATP、
dTTP、dGTP、dCTP）で処理し、３’２-塩基伸長を除去
した。得られた32塩基対ＤＮＡフラグメントを、pUC19
などのＤＮＡベクターにSma Ｉのような切断した平滑
（blunt）末端制限部位で連結する。連結したＤＮＡ分
子を集めて、E.Coliを形質転換させ、32塩基対挿入ＤＮ
Ａの組換ライブラリーを作成する。このライブラリー
は、特に染色体ＤＮＡの特異な部位にハイブリダイズす
る特定ＤＮＡを含むクローンを有する。個々のクローン
は、λライブラリー、ＹＡＣライブラリー、コスミドラ
イブラリー及び染色体ＤＮＡの制限エンドヌクレアーゼ
消化物に見られるような、かなり大きいＤＮＡフラグメ
ント用の特異なタグを表す。
グメントを次いでサイズに従って、アガロースゲル電気
泳動などの方法によって分離した。34塩基対ＤＮＡフラ
グメントに対応するゲル上のバンドを集める。34塩基対
ＤＮＡフラグメントを集めて、E.Coli ＤＮＡポリメラ
ーゼクレノウフラグメントのようなＤＮＡポリメラーゼ
及び、全４種のデオキシヌクレオチド三リン酸（dATP、
dTTP、dGTP、dCTP）で処理し、３’２-塩基伸長を除去
した。得られた32塩基対ＤＮＡフラグメントを、pUC19
などのＤＮＡベクターにSma Ｉのような切断した平滑
（blunt）末端制限部位で連結する。連結したＤＮＡ分
子を集めて、E.Coliを形質転換させ、32塩基対挿入ＤＮ
Ａの組換ライブラリーを作成する。このライブラリー
は、特に染色体ＤＮＡの特異な部位にハイブリダイズす
る特定ＤＮＡを含むクローンを有する。個々のクローン
は、λライブラリー、ＹＡＣライブラリー、コスミドラ
イブラリー及び染色体ＤＮＡの制限エンドヌクレアーゼ
消化物に見られるような、かなり大きいＤＮＡフラグメ
ント用の特異なタグを表す。
【図１】図１は、BcgＩの補因子要求性を表す分析結果
を示す。 レーン１：ＡＴＰ、AdeMet及びMgを使用したT7 ＤＮＡ
のBcg Ｉ消化物 レーン２：ＡＴＰ非存在下のT7 ＤＮＡのBcg Ｉ消化物 レーン３：AdeMet非存在下のT7 ＤＮＡのBcg Ｉ消化物 レーン４：Mg非存在下のT7 ＤＮＡのBcg Ｉ消化物 レーン５：Hind III−λＤＮＡ及びHae III-phix174サ
イズ標準（AdeMet=Ｓ-アデノシルメチオニン）
を示す。 レーン１：ＡＴＰ、AdeMet及びMgを使用したT7 ＤＮＡ
のBcg Ｉ消化物 レーン２：ＡＴＰ非存在下のT7 ＤＮＡのBcg Ｉ消化物 レーン３：AdeMet非存在下のT7 ＤＮＡのBcg Ｉ消化物 レーン４：Mg非存在下のT7 ＤＮＡのBcg Ｉ消化物 レーン５：Hind III−λＤＮＡ及びHae III-phix174サ
イズ標準（AdeMet=Ｓ-アデノシルメチオニン）
【図２】図２は、BcgＩの認識配列を検出するのに使用
したゲルである。 レーン１：pUC19＋Bcg Ｉ レーン２：１＋ScaＩ レーン３：１＋AlwN Ｉ レーン４：１＋Pst Ｉ レーン６：phix174＋Bcg Ｉ レーン７：６＋Pst Ｉ レーン８：６＋Nci Ｉ レーン９：６＋Stu Ｉ レ−ン11：λ＋Bcg Ｉ レーン12：T7＋Bcg Ｉ レーン５及びレーン10：λ＋Hind III及びphix174＋Hae
III，サイズ標準
したゲルである。 レーン１：pUC19＋Bcg Ｉ レーン２：１＋ScaＩ レーン３：１＋AlwN Ｉ レーン４：１＋Pst Ｉ レーン６：phix174＋Bcg Ｉ レーン７：６＋Pst Ｉ レーン８：６＋Nci Ｉ レーン９：６＋Stu Ｉ レ−ン11：λ＋Bcg Ｉ レーン12：T7＋Bcg Ｉ レーン５及びレーン10：λ＋Hind III及びphix174＋Hae
III，サイズ標準
【図３】図３は、BcgＩがその認識配列の両端で切断し
て、34塩基対フラグメントを生成することを表す配列ゲ
ルである。
て、34塩基対フラグメントを生成することを表す配列ゲ
ルである。
【図４】図４は、BcgＩを使用して消化すると、34塩基
対フラグメントが生成することを確認するアガロースゲ
ルである。 レーン１、レーン５：pBR322＋Msp Ｉ、サイズ標準 レーン２：λ＋Bcg Ｉ レーン３：λ＋Pst Ｉ レーン４：λ＋Bcg Ｉ（Mg非存在下）
対フラグメントが生成することを確認するアガロースゲ
ルである。 レーン１、レーン５：pBR322＋Msp Ｉ、サイズ標準 レーン２：λ＋Bcg Ｉ レーン３：λ＋Pst Ｉ レーン４：λ＋Bcg Ｉ（Mg非存在下）
【図５】図５は、Ｓ-アデノシルメチオニンとSinefungi
nの種々の濃度に於けるBcgＩ切断速度を表す。 Ｋｍ（AdeMet-Bcg Ｉ）＝0.1マイクロモル −●−●−●− Ｋｍ（Sinefungin-Bcg Ｉ）＝0.5マイクロモル −×−×−×− AdeMet＝Ｓ-アデノシルメチオニン
nの種々の濃度に於けるBcgＩ切断速度を表す。 Ｋｍ（AdeMet-Bcg Ｉ）＝0.1マイクロモル −●−●−●− Ｋｍ（Sinefungin-Bcg Ｉ）＝0.5マイクロモル −×−×−×− AdeMet＝Ｓ-アデノシルメチオニン
─────────────────────────────────────────────────────
【手続補正書】
【提出日】平成３年１０月２日
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】図１
【補正方法】変更
【補正内容】
【図１】図１は、ＢｃｇＩの補因子要求性を表す分析結
果を示す電気泳動の写真である。 レーン１：ＡＴＰ、ＡｄｅＭｅｔ及びＭｇを使用したＴ
７ ＤＮＡのＢｃｇ Ｉ消化物 レーン２：ＡＴＰ非存在下のＴ７ ＤＮＡのＢｃｇ Ｉ
消化物 レーン３：ＡｄｅＭｅｔ非存在下のＴ７ ＤＮＡのＢｃ
ｇ Ｉ消化物 レーン４：Ｍｇ非存在下のＴ７ ＤＮＡのＢｃｇ Ｉ消
化物 レーン５：Ｈｉｎｄ ＩＩＩ−λＤＮＡ及びＨａｅ Ｉ
ＩＩ−ｐｈｉｘ１７４サイズ標準（ＡｄｅＭｅｔ＝Ｓ−
アデノシルメチオニン）
果を示す電気泳動の写真である。 レーン１：ＡＴＰ、ＡｄｅＭｅｔ及びＭｇを使用したＴ
７ ＤＮＡのＢｃｇ Ｉ消化物 レーン２：ＡＴＰ非存在下のＴ７ ＤＮＡのＢｃｇ Ｉ
消化物 レーン３：ＡｄｅＭｅｔ非存在下のＴ７ ＤＮＡのＢｃ
ｇ Ｉ消化物 レーン４：Ｍｇ非存在下のＴ７ ＤＮＡのＢｃｇ Ｉ消
化物 レーン５：Ｈｉｎｄ ＩＩＩ−λＤＮＡ及びＨａｅ Ｉ
ＩＩ−ｐｈｉｘ１７４サイズ標準（ＡｄｅＭｅｔ＝Ｓ−
アデノシルメチオニン）
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】図２
【補正方法】変更
【補正内容】
【図２】図２は、ＢｃｇＩの認識配列を検出するのに使
用したゲルを示す電気泳動の写真である。 レーン１：ｐＵＣ１９＋Ｂｃｇ Ｉ レーン２：１＋ＳｃａＩ レーン３：１＋ＡｌｗＮ Ｉ レーン４：１＋Ｐｓｔ Ｉ レーン６：ｐｈｉｘ１７４＋Ｂｃｇ Ｉ レーン７：６＋Ｐｓｔ Ｉ レーン８：６＋Ｎｃｉ Ｉ レーン９：６＋ｓｔｕ Ｉ レーン１１：λ＋Ｂｃｇ Ｉ レーン１２：Ｔ７＋Ｂｃｇ Ｉ レーン５及びレーン１０：λ＋Ｈｉｎｄ ＩＩＩ及び
ｐｈｉｘ１７４＋ＨａｅＩＩＩ，サイズ標準
用したゲルを示す電気泳動の写真である。 レーン１：ｐＵＣ１９＋Ｂｃｇ Ｉ レーン２：１＋ＳｃａＩ レーン３：１＋ＡｌｗＮ Ｉ レーン４：１＋Ｐｓｔ Ｉ レーン６：ｐｈｉｘ１７４＋Ｂｃｇ Ｉ レーン７：６＋Ｐｓｔ Ｉ レーン８：６＋Ｎｃｉ Ｉ レーン９：６＋ｓｔｕ Ｉ レーン１１：λ＋Ｂｃｇ Ｉ レーン１２：Ｔ７＋Ｂｃｇ Ｉ レーン５及びレーン１０：λ＋Ｈｉｎｄ ＩＩＩ及び
ｐｈｉｘ１７４＋ＨａｅＩＩＩ，サイズ標準
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】図３
【補正方法】変更
【補正内容】
【図３】図３は、ＢｃｇＩがその認識配列の両端で切断
して、３４塩基対フラグメントを生成することを表す配
列ゲルを示す電気泳動の写真である。
して、３４塩基対フラグメントを生成することを表す配
列ゲルを示す電気泳動の写真である。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】図４
【補正方法】変更
【補正内容】
【図４】図４は、ＢｃｇＩを使用して消化すると、３４
塩基対フラグメントが生成することを確認するアガロー
スゲルを示す電気泳動の写真である。 レーン１、レーン５：ｐＢＲ３２２＋Ｍｓｐ Ｉ、サイ
ズ標準 レーン２：λ＋Ｂｃｇ Ｉ レーン３：λ＋Ｐｓｔ Ｉ レーン４：λ＋Ｂｃｇ Ｉ（Ｍｇ非存在下）
塩基対フラグメントが生成することを確認するアガロー
スゲルを示す電気泳動の写真である。 レーン１、レーン５：ｐＢＲ３２２＋Ｍｓｐ Ｉ、サイ
ズ標準 レーン２：λ＋Ｂｃｇ Ｉ レーン３：λ＋Ｐｓｔ Ｉ レーン４：λ＋Ｂｃｇ Ｉ（Ｍｇ非存在下）
Claims (9)
- 【請求項１】二重鎖のデオキシリボ核酸分子中で、以下
の塩基配列： ５’ＣＧＡ（Ｎ）６ＴＧＣ３’ ３’ＧＣＴ（Ｎ）６ＡＣＧ５’ を認識し、ＤＮＡをその認識配列の両端で切断して、34
塩基対フラグメントを生成する、バチルスコアグランス
（Bacillus coagulans）（ATCC No.55055）から得られ
る実質的に純粋な制限エンドヌクレアーゼ。 - 【請求項２】 55℃に於ける安定性よりも、25℃〜37℃
に於いてより良い安定性を有することを特徴とする請求
項１に記載の制限エンドヌクレアーゼ。 - 【請求項３】 二重鎖のデオキシリボ核酸phix174を２
箇所で、pUC19を１箇所で切断することを特徴とする請
求項１に記載の制限エンドヌクレアーゼ。 - 【請求項４】 制限エンドヌクレアーゼがバチルスコア
グランス（Bac illus coagulans）（ATCC No.55055）か
ら精製したものであることを特徴とする請求項１に記載
の制限エンドヌクレアーゼ。 - 【請求項５】 制限エンドヌクレアーゼが、制限エンド
ヌクレアーゼをコードしているＤＮＡ配列を含む形質転
換した宿主から精製したものであることを特徴とする請
求項１に記載の制限エンドヌクレアーゼ。 - 【請求項６】 ATCC No.55055から入手可能なバチルス
コアグランス（Bacillus coag ulans）のサンプルを前記
エンドヌクレアーゼの製造に好適な条件下に培養し、次
いでそれから前記エンドヌクレアーゼを分離することか
らなる請求項１に記載の制限エンドヌクレアーゼを取得
する方法。 - 【請求項７】 ａ）対象ＤＮＡから認識配列を切断する
酵素を用いて対象ＤＮＡを消化して得た認識配列を含む
塩基対のＤＮＡフラグメントからなる組換体ＤＮＡライ
ブラリーを形成し、 ｂ）該フラグメントを、認識配列を含むステップａ）の
組換体ライブラリーから分離し、 ｃ）対象ＤＮＡの特定領域を、ステップｂ）のフラグメ
ントで同定することを特徴とする対象ＤＮＡをマッピン
グする方法。 - 【請求項８】 制限エンドヌクレアーゼが、Bcg Ｉから
なることを特徴とする請求項７に記載の方法。 - 【請求項９】 ａ）第１の予定認識部位を、第２の予定
認識部位を含むベクターの該第２の認識部位に挿入し、
この際、最第２の予定認識部位の認識配列は１種以上の
非特異性ヌクレオチドによって阻害されるものであり、 ｂ）対象ＤＮＡを前記ベクターの前記第１の認識配列に
連結して、形質転換反応用のライブラリーを形成し、 ｃ）ステップｂ）のライブラリーを、前記第２の予定認
識部位を含むＤＮＡを制限する制限エンドヌクレアーゼ
と接触させ、 ｄ）宿主細胞をステップｃ）のライブラリーで形質転換
することを特徴とする対象ＤＮＡを含む形質転換細胞に
於けるＤＮＡのバックグラウンドを減少させる方法。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US07/547,787 US5200336A (en) | 1990-07-02 | 1990-07-02 | Restriction endonuclease obtainable foam bacillus coagulans and a process for producing the same |
| US547,787 | 1990-07-02 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH06339374A true JPH06339374A (ja) | 1994-12-13 |
Family
ID=24186127
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP3186917A Pending JPH06339374A (ja) | 1990-07-02 | 1991-07-01 | バチルスコアグランスから得られる新規な制限エンドヌクレアーゼ及びその製造方法 |
Country Status (4)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US5200336A (ja) |
| EP (1) | EP0466332B1 (ja) |
| JP (1) | JPH06339374A (ja) |
| DE (2) | DE466332T1 (ja) |
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5527342A (en) | 1993-12-14 | 1996-06-18 | Pietrzak; William S. | Method and apparatus for securing soft tissues, tendons and ligaments to bone |
| DE19653498C1 (de) | 1996-12-20 | 1998-07-23 | Wolf M Prof Dr Bertling | Klonierungsvektor-System mit Fusionssequenz |
| US6645506B1 (en) * | 1997-04-18 | 2003-11-11 | Ganeden Biotech, Inc. | Topical compositions containing extracellular products of Pseudomonas lindbergii and Emu oil |
| US6716435B1 (en) * | 1997-04-18 | 2004-04-06 | Ganeden Biotech, Inc. | Absorbent product containing absorbent structure and Bacillus coagulans |
| ATE493139T1 (de) * | 1997-04-18 | 2011-01-15 | Ganeden Biotech Inc | Oberflächige verwendung von probiotischen bacillussporen zur verhinderung oder bekämpfung von mikrobiellen infektionen |
| US6811786B1 (en) | 1999-04-01 | 2004-11-02 | Ganeden Biotech, Inc. | Methods for reducing cholesterol using Bacillus coagulans spores, systems and compositions |
| US7767203B2 (en) | 1998-08-07 | 2010-08-03 | Ganeden Biotech, Inc. | Methods for the dietary management of irritable bowel syndrome and carbohydrate malabsorption |
| EP1719518A1 (en) | 1998-08-07 | 2006-11-08 | Ganeden Biotech, Inc. | Compositions comprising bacillus coagulans for increasing the solubility and bioavailability of nutritional minerals |
| US6461607B1 (en) * | 1998-08-24 | 2002-10-08 | Ganeden Biotech, Inc. | Probiotic, lactic acid-producing bacteria and uses thereof |
| EP1212093B1 (en) * | 1999-08-26 | 2004-07-07 | Ganeden Biotech, Inc. | Use of emu oil as a carrier for antifungal, antibacterial and antiviral medications |
| US6849256B1 (en) | 1999-11-08 | 2005-02-01 | Ganeden Biotech Incorporated | Inhibition of pathogens by probiotic bacteria |
| US7704687B2 (en) * | 2002-11-15 | 2010-04-27 | The Johns Hopkins University | Digital karyotyping |
| EP2422804A1 (en) | 2004-06-17 | 2012-02-29 | Amano Enzyme USA., Ltd. | Controlled release formulations of enzymes, microorganisms, and antibodies with mucoadhesive polymers |
| RU2270859C1 (ru) * | 2004-10-18 | 2006-02-27 | Общество с ограниченной ответственностью "СибЭнзайм" | ШТАММ БАКТЕРИЙ BACILLUS SUBTILIS - ПРОДУЦЕНТ ЭНДОНУКЛЕАЗЫ РЕСТРИКЦИИ Bisi |
| WO2009032121A1 (en) * | 2007-08-29 | 2009-03-12 | Ganeden Biotech, Inc. | Compositions and methods for enhancing paper product degradation |
| EP3628164A1 (en) * | 2007-08-29 | 2020-04-01 | Ganeden Biotech, Inc. | Baked goods |
| ES2868135T3 (es) * | 2007-10-16 | 2021-10-21 | Ganeden Biotech Inc | Composiciones de bebidas |
| WO2009099562A2 (en) * | 2008-01-30 | 2009-08-13 | Ganeden Biotech, Inc. | Compositions and methods for cleaning surfaces |
| US7788209B2 (en) * | 2008-05-05 | 2010-08-31 | United Technologies Corporation | Hybrid fault reasoning and guided troubleshooting system that uses case-based reasoning and model-based reasoning |
| CA2740423C (en) | 2008-10-16 | 2020-09-08 | Ganeden Biotech, Inc. | Probiotic grain-based compositions |
| EP2424550B1 (en) | 2009-04-29 | 2017-06-07 | Ganeden Biotech, Inc. | Bacterial cell membrane formulation |
| WO2011130487A1 (en) | 2010-04-14 | 2011-10-20 | Ganeden Biotech, Inc. | Probiotic confection and lipid compositions |
| WO2012135499A1 (en) | 2011-03-31 | 2012-10-04 | Ganeden Biotech, Inc. | Probiotic sports nutrition compositions |
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
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| JPS5315491A (en) * | 1976-07-23 | 1978-02-13 | Rikagaku Kenkyusho | Preparation of novel nucleicacidase |
| JPS5519058A (en) * | 1978-07-28 | 1980-02-09 | Rikagaku Kenkyusho | Preparation of nuclease |
| IN166864B (ja) * | 1985-03-01 | 1990-07-28 | New England Biolabs Inc |
-
1990
- 1990-07-02 US US07/547,787 patent/US5200336A/en not_active Expired - Lifetime
-
1991
- 1991-06-11 DE DE91305262T patent/DE466332T1/de active Pending
- 1991-06-11 DE DE69105377T patent/DE69105377T2/de not_active Expired - Fee Related
- 1991-06-11 EP EP91305262A patent/EP0466332B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1991-07-01 JP JP3186917A patent/JPH06339374A/ja active Pending
Also Published As
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|---|---|
| EP0466332B1 (en) | 1994-11-30 |
| DE466332T1 (de) | 1994-02-03 |
| EP0466332A2 (en) | 1992-01-15 |
| US5200336A (en) | 1993-04-06 |
| EP0466332A3 (en) | 1992-04-01 |
| DE69105377D1 (de) | 1995-01-12 |
| DE69105377T2 (de) | 1995-07-06 |
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