JPH06340551A - カポジ肉腫の成長阻害剤 - Google Patents
カポジ肉腫の成長阻害剤Info
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- JPH06340551A JPH06340551A JP3132406A JP13240691A JPH06340551A JP H06340551 A JPH06340551 A JP H06340551A JP 3132406 A JP3132406 A JP 3132406A JP 13240691 A JP13240691 A JP 13240691A JP H06340551 A JPH06340551 A JP H06340551A
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Abstract
(57)【要約】
【目的】 エイズに伴うカポジ肉腫に関するオンコスタ
チンＭの成長増強効果を阻害する。 【構成】 オンコスタチンＭに特異的なモノクローナル
抗体を用いる。 【効果】 温血動物のカポジ肉腫細胞の成長を阻害す
る。
チンＭの成長増強効果を阻害する。 【構成】 オンコスタチンＭに特異的なモノクローナル
抗体を用いる。 【効果】 温血動物のカポジ肉腫細胞の成長を阻害す
る。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、エイズに伴う疾患であ
るカポジ肉腫に対するオンコスタチンＭの成長増加効果
を阻害する抗オンコスタチンＭモノクローナル抗体又は
そのフラグメントを有効成分として含有するカポジ肉腫
細胞の成長阻害剤に関する。本発明で用いられる抗体
は、オンコスタチンＭに結合し、オンコスタチンＭ−オ
ンコスタチンＭ受容体結合の阻害及び／又はオンコスタ
チンＭの対生物活性の阻害を行なうことが出来るという
特徴を有する。本発明で用いられるモノクローナル抗体
は、又オンコスタチンＭの存在の検出及び／又は生体内
又は生体外の系におけるオンコスタチンＭの生物学上の
活性の調節に使用することが出来る。
るカポジ肉腫に対するオンコスタチンＭの成長増加効果
を阻害する抗オンコスタチンＭモノクローナル抗体又は
そのフラグメントを有効成分として含有するカポジ肉腫
細胞の成長阻害剤に関する。本発明で用いられる抗体
は、オンコスタチンＭに結合し、オンコスタチンＭ−オ
ンコスタチンＭ受容体結合の阻害及び／又はオンコスタ
チンＭの対生物活性の阻害を行なうことが出来るという
特徴を有する。本発明で用いられるモノクローナル抗体
は、又オンコスタチンＭの存在の検出及び／又は生体内
又は生体外の系におけるオンコスタチンＭの生物学上の
活性の調節に使用することが出来る。
【０００２】
【従来の技術】体細胞ハイブリッドが、短期の一次培養
から得られない特定の細胞性生成物の重要な源であるこ
とは、現在十分に認められている。この最も良い例は、
選ばれた抗原に対するモノクローナル抗体を生成するた
めのハイブリッド骨髄腫の生成に関するＭｉｌｓｔｅｉ
ｎらにより開発された系である（Ｋｏｈｌｅｒ及びＭｉ
ｌｓｔｅｉｎ、１９８５、Ｎａｔｕｒｅ（Ｌｏｎｄｏ
ｎ）２５６：４９５；Ｇａｌｆｒｅら、１９７７、Ｎａ
ｔｕｒｅ（Ｌｏｎｄｏｎ）２６６：５５０）。これらハ
イブリッドは、特定の抗原に対してモノクローナル抗体
を一定に供給する。これらの抗体は、抗体が既に用いら
れた全ての方法の試薬として使用できるし、高度の識
別、低いバックグラウンド及び連続的に利用できる抗体
の供給という追加の利点を有する。
から得られない特定の細胞性生成物の重要な源であるこ
とは、現在十分に認められている。この最も良い例は、
選ばれた抗原に対するモノクローナル抗体を生成するた
めのハイブリッド骨髄腫の生成に関するＭｉｌｓｔｅｉ
ｎらにより開発された系である（Ｋｏｈｌｅｒ及びＭｉ
ｌｓｔｅｉｎ、１９８５、Ｎａｔｕｒｅ（Ｌｏｎｄｏ
ｎ）２５６：４９５；Ｇａｌｆｒｅら、１９７７、Ｎａ
ｔｕｒｅ（Ｌｏｎｄｏｎ）２６６：５５０）。これらハ
イブリッドは、特定の抗原に対してモノクローナル抗体
を一定に供給する。これらの抗体は、抗体が既に用いら
れた全ての方法の試薬として使用できるし、高度の識
別、低いバックグラウンド及び連続的に利用できる抗体
の供給という追加の利点を有する。
【０００３】モノクローナル抗体の生成は、一般に、免
疫化、免疫応答細胞の取出しそして例えばポリエチレン
グリコール中のこれら細胞と、免疫グロブリンを分泌す
るそれらの無能力のために選ばれた常に分割する（「不
滅の」）腫瘍細胞との融合を含む。得られる細胞は、例
えばＨＡＴ（ヒポキサンチン、アミノプテリン、チミジ
ン）培地中の成長によリ区別される。各ハイブリドーマ
は、単一抗体形成細胞及び腫瘍細胞の融合生成物であ
り、それは抗体の単一の種類を分泌させる前者の能力そ
してそれをして連続的に増殖させる後者の不滅性を有
し、細胞の後代をもたらし単一の特異性を有する抗体を
終わることなく供給する。
疫化、免疫応答細胞の取出しそして例えばポリエチレン
グリコール中のこれら細胞と、免疫グロブリンを分泌す
るそれらの無能力のために選ばれた常に分割する（「不
滅の」）腫瘍細胞との融合を含む。得られる細胞は、例
えばＨＡＴ（ヒポキサンチン、アミノプテリン、チミジ
ン）培地中の成長によリ区別される。各ハイブリドーマ
は、単一抗体形成細胞及び腫瘍細胞の融合生成物であ
り、それは抗体の単一の種類を分泌させる前者の能力そ
してそれをして連続的に増殖させる後者の不滅性を有
し、細胞の後代をもたらし単一の特異性を有する抗体を
終わることなく供給する。
【０００４】
【発明の概要】本発明は、エイズに伴うカポジ肉腫に対
するオンコスタチンＭの成長増強作用を阻害するための
オンコスタチンＭに特異的なモノクローナル抗体を有効
成分として含有するカポジ肉腫細胞の成長阻害剤に関す
る。細胞交雑を用いる本発明で使用するモノクローナル
抗体の生成の技術は、本明細書に記載されるが、本発明
の範囲は、この細胞交雑の技術の使用に制限されるもの
ではない。本明細書に記載されたモノクローナル抗体の
特徴を有する全てのモノクローナル抗体又はそのフラグ
メントは、本発明の範囲内に包含される。
するオンコスタチンＭの成長増強作用を阻害するための
オンコスタチンＭに特異的なモノクローナル抗体を有効
成分として含有するカポジ肉腫細胞の成長阻害剤に関す
る。細胞交雑を用いる本発明で使用するモノクローナル
抗体の生成の技術は、本明細書に記載されるが、本発明
の範囲は、この細胞交雑の技術の使用に制限されるもの
ではない。本明細書に記載されたモノクローナル抗体の
特徴を有する全てのモノクローナル抗体又はそのフラグ
メントは、本発明の範囲内に包含される。
【０００５】本発明は、ハイブリドーマ技術が本発明の
抗オンコスタチンＭ抗体を発生させるのに用いる実施例
により記述され、抗体は、それらが本来のオンコスタチ
ンＭ、変性オンコスタチンＭ又はその両者の何れかによ
り免疫沈降物を形成するかどうかにより分類される。各
グループは、オンコスタチンＭ成長阻害の対生物活性及
び／又はその細胞表面受容体へのオンコスタチンＭの結
合をブロックする能力によりさらに特徴付けられる。
抗オンコスタチンＭ抗体を発生させるのに用いる実施例
により記述され、抗体は、それらが本来のオンコスタチ
ンＭ、変性オンコスタチンＭ又はその両者の何れかによ
り免疫沈降物を形成するかどうかにより分類される。各
グループは、オンコスタチンＭ成長阻害の対生物活性及
び／又はその細胞表面受容体へのオンコスタチンＭの結
合をブロックする能力によりさらに特徴付けられる。
【０００６】実施例は、又中和する抗オンコスタチンＭ
抗体が、ＨＴＬＶ−ＩＩ形質転換Ｔ細胞系の調整された
培地に見出だされる因子又はオンコスタチンＭにより増
強されそして維持されるカポジ肉腫由来エイズ−ＫＳ細
胞の成長を阻害することを立証する。
抗体が、ＨＴＬＶ−ＩＩ形質転換Ｔ細胞系の調整された
培地に見出だされる因子又はオンコスタチンＭにより増
強されそして維持されるカポジ肉腫由来エイズ−ＫＳ細
胞の成長を阻害することを立証する。
【０００７】本発明のモノクローナル抗体又はその抗原
決定因子認識フラグメントは、生体内で治療上有効な血
清濃度を達成するために投与でき、この濃度は本明細書
で記載したアッセイシステムを用いて生体外で決定でき
る。
決定因子認識フラグメントは、生体内で治療上有効な血
清濃度を達成するために投与でき、この濃度は本明細書
で記載したアッセイシステムを用いて生体外で決定でき
る。
【０００８】図１は、ｃＤＮＡエンコードオンコスタチ
ンＭにより安定にトランスフェクションされたチャイニ
ーズ・ハムスター・オーバリー（「ＣＨＯ」）細胞系の
上澄み液からの３５Ｓ−メチオニン及び３５Ｓ−システ
インをラベルしたオンコスタチンＭの免疫沈降を示す。
図１Ａは、「本来」の代謝的にラベルされたオンコスタ
チンＭ（代謝的にラベルされたＣＨＯトランスフェクタ
ントから集められた上澄み液）による一連の抗オンコス
タチンＭモノクローナル抗体の反応性を示す。図１Ｂ
は、モノクローナル抗体とのインキュベーション前にＳ
ＤＳ、２−メルカプトエタノール及び煮沸による処理に
より変性された、代謝的にラベルされたＣＨＯ細胞から
集められた上澄み液によるこれら同じ抗体の反応性を示
す。レーン１：ネガティブ・コントロール抗体；レーン
２：１Ｒ１０Ｆ１１；レーン３：３Ｒ９Ｄ９；レーン
４：３Ｒ１３Ｆ４；レーン５：４Ｒ１２Ｃ７；レーン
６：１１Ｒ２Ｆ８；レーン７：１２Ｒ１３Ｂ５；レーン
８：１２Ｒ１３Ｄ７；レーン９：１２Ｒ１９Ｅ３。
ンＭにより安定にトランスフェクションされたチャイニ
ーズ・ハムスター・オーバリー（「ＣＨＯ」）細胞系の
上澄み液からの３５Ｓ−メチオニン及び３５Ｓ−システ
インをラベルしたオンコスタチンＭの免疫沈降を示す。
図１Ａは、「本来」の代謝的にラベルされたオンコスタ
チンＭ（代謝的にラベルされたＣＨＯトランスフェクタ
ントから集められた上澄み液）による一連の抗オンコス
タチンＭモノクローナル抗体の反応性を示す。図１Ｂ
は、モノクローナル抗体とのインキュベーション前にＳ
ＤＳ、２−メルカプトエタノール及び煮沸による処理に
より変性された、代謝的にラベルされたＣＨＯ細胞から
集められた上澄み液によるこれら同じ抗体の反応性を示
す。レーン１：ネガティブ・コントロール抗体；レーン
２：１Ｒ１０Ｆ１１；レーン３：３Ｒ９Ｄ９；レーン
４：３Ｒ１３Ｆ４；レーン５：４Ｒ１２Ｃ７；レーン
６：１１Ｒ２Ｆ８；レーン７：１２Ｒ１３Ｂ５；レーン
８：１２Ｒ１３Ｄ７；レーン９：１２Ｒ１９Ｅ３。
【０００９】図２は、Ａ３７５黒色腫細胞系に関する成
長阻害アッセイ（「ＧＩＡ」）の二つの異なる抗オンコ
スタチンＭモノクローナル抗体の中和する活性の検査か
らのデータを提供する。図２Ａは、種々の濃度の１１Ｒ
２Ｆ８の活性を示し、図２Ｂは、種々の濃度の１Ｒ１０
Ｆ１１の活性を示す。
長阻害アッセイ（「ＧＩＡ」）の二つの異なる抗オンコ
スタチンＭモノクローナル抗体の中和する活性の検査か
らのデータを提供する。図２Ａは、種々の濃度の１１Ｒ
２Ｆ８の活性を示し、図２Ｂは、種々の濃度の１Ｒ１０
Ｆ１１の活性を示す。
【００１０】図３は、放射受容体アッセイにおけるＨ２
９８１肺癌細胞系への１２５Ｉ−オンコスタチンＭの結
合に対する二三の抗オンコスタチンＭモノクローナル抗
体の効果を示す。
９８１肺癌細胞系への１２５Ｉ−オンコスタチンＭの結
合に対する二三の抗オンコスタチンＭモノクローナル抗
体の効果を示す。
【００１１】図４は、アミノ酸の欠失又は変更を含む一
連の突然変異オンコスタチンＭ構造物によってトランス
フェクションされたＣＯＳ細胞により分泌された二つの
異なる抗オンコスタチンＭモノクローナル抗体の結合を
ＥＩＡにより検出して示す。データは、ＯＤ４６０にお
ける全吸収単位として提供される。バックグラウンド結
合は、引かれなかった。この図において、「ｄｅｌ」
は、Ｃ末端から欠失された最後のアミノ酸を示し、一方
アルファベットの字は、なされたアミノ酸の変更を示
す。
連の突然変異オンコスタチンＭ構造物によってトランス
フェクションされたＣＯＳ細胞により分泌された二つの
異なる抗オンコスタチンＭモノクローナル抗体の結合を
ＥＩＡにより検出して示す。データは、ＯＤ４６０にお
ける全吸収単位として提供される。バックグラウンド結
合は、引かれなかった。この図において、「ｄｅｌ」
は、Ｃ末端から欠失された最後のアミノ酸を示し、一方
アルファベットの字は、なされたアミノ酸の変更を示
す。
【００１２】 より分泌された免疫沈降オンコスタチンＭモノクローナ
ル抗体の能力の比較を示す。レーン１：ネガティブ・コ
ントロール抗体；レーン２：１１Ｒ２Ｆ８；レーン３：
１２Ｒ１３Ｄ７。
ル抗体の能力の比較を示す。レーン１：ネガティブ・コ
ントロール抗体；レーン２：１１Ｒ２Ｆ８；レーン３：
１２Ｒ１３Ｄ７。
【００１３】図６は、カポジ肉腫細胞系（白丸）並びに
悪性の縦隔リンパ腫に罹った患者の胸水から由来する平
滑筋細胞（Ｎ１０７２細胞）（黒丸）に対するオンコス
タチンＭの成長増強活性を示す。ＣＨＯ細胞に発現され
た組み換えオンコスタチンＭを示したように濃度を増加
しつつ加えた。
悪性の縦隔リンパ腫に罹った患者の胸水から由来する平
滑筋細胞（Ｎ１０７２細胞）（黒丸）に対するオンコス
タチンＭの成長増強活性を示す。ＣＨＯ細胞に発現され
た組み換えオンコスタチンＭを示したように濃度を増加
しつつ加えた。
【００１４】図７は、生体外で精製したオンコスタチン
Ｍ（黒い記号）又は＃３８ＨＴＬＶ−ＩＩ感染細胞系か
らの調整された培地（「ＣＭ」）（白い記号）の何れか
により処理されたカポジ肉腫細胞系の成長に対する抗オ
ンコスタチンＭモノクローナル抗体の効果を示す。１Ｒ
１０Ｆ１１（Ａａｂ）又は１１Ｒ２Ｆ８（Ｂａｂ）の何
れかを、濃度を上げつつ精製したオンコスタチンＭ又は
＃３８調整培地（「ＣＭ」）の存在下培養した細胞に加
えた。
Ｍ（黒い記号）又は＃３８ＨＴＬＶ−ＩＩ感染細胞系か
らの調整された培地（「ＣＭ」）（白い記号）の何れか
により処理されたカポジ肉腫細胞系の成長に対する抗オ
ンコスタチンＭモノクローナル抗体の効果を示す。１Ｒ
１０Ｆ１１（Ａａｂ）又は１１Ｒ２Ｆ８（Ｂａｂ）の何
れかを、濃度を上げつつ精製したオンコスタチンＭ又は
＃３８調整培地（「ＣＭ」）の存在下培養した細胞に加
えた。
【００１５】本発明は、エイズと結合したカポジ肉腫の
成長を阻害するためにオンコスタチンＭの活性を中和す
る組成物に関する。本発明のモノクローナル抗体、それ
らの特徴及び使用は、以下に記述されそして例示され
る。
成長を阻害するためにオンコスタチンＭの活性を中和す
る組成物に関する。本発明のモノクローナル抗体、それ
らの特徴及び使用は、以下に記述されそして例示され
る。
【００１６】オンコスタチンＭ抗原の認識
【００１７】ヒト腫瘍細胞系に対するその阻害効果を既
に同定されたオンコスタチンＭは、初めホルボール１２
−ミリステート１３−アセテート（ＰＭＡ）誘発ヒト組
織球リンパ腫細胞から（Ｚａｒｌｉｎｇら、１９８６、
Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃ−ａｄ．Ｓｃｉ．（ＵＳＡ）
８３：９７３９−９７４３）そして活性化Ｔリンパ球か
ら（Ｂｒｏｗｎら、１９８７、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１
３９：２９７７−２９８３）単離された。分子は、Ｍｒ
＝２８０００の一本鎖ポリペプチドよりなる熱及び酸に
安定な蛋白である。他の天然に生ずる成長調節剤と同じ
く、オンコスタチンＭは、種々の生物学上の活性を示
す。成長の阻害は、全てではないが或るヒト腫瘍細胞系
について観察される。対照的に、或る正常の繊維芽細胞
例えばヒト包皮繊維芽細胞又はＷＩ−３８細胞の成長
は、オンコスタチンＭへの暴露により刺激される（Ｚａ
ｒｌｉｎｇら、１９８６、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃ−
ａｄ．Ｓｃｉ．（ＵＳＡ）８３：９７３９−９７４
３）。オンコスタチンＭに対する遺伝子は、クローンさ
れそして配列され、組換えオンコスタチンＭの活性形
は、最近哺乳動物の細胞に発現された（公開されたヨー
ロッパ特許出願ＥＰＡ０２９０９４８号（公開日：１９
８８年１１月１７日）に相当する米国出願第１４４５７
４号参照。その全部をここに参考文献として引用す
る）。シグナルペプチドの開裂後、成熟した形は、２２
７個のアミノ酸を含む糖蛋白であり、その内の５個はシ
ステイン残基である。蛋白は、非常に親水性のカルボキ
シ末端ドメインを有する。オンコスタチンＭは構造的に
他の周知のサイトカインに関連していないが、そのｍＲ
ＮＡは、その３’未翻訳末端でＡＵの多い領域を含む。
オンコスタチンＭのメッセージにおけるこの領域は、多
くのサイトカイン、リンホカイン及び他の成長調節分子
のそれとホモローガスであり、遺伝子の発現を調節する
共通の態様を示唆している。オンコスタチンＭに対する
細胞受容体は、種々の哺乳動物の細胞に見出だされる。
主なオンコスタチンＭ受容体分子は、Ｍｒ＝１５０００
０−１６００００の特異蛋白である（Ｌｉｎｓｌｅｙ
ら、１９８９、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６４：６５
２８−６５３２）。
に同定されたオンコスタチンＭは、初めホルボール１２
−ミリステート１３−アセテート（ＰＭＡ）誘発ヒト組
織球リンパ腫細胞から（Ｚａｒｌｉｎｇら、１９８６、
Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃ−ａｄ．Ｓｃｉ．（ＵＳＡ）
８３：９７３９−９７４３）そして活性化Ｔリンパ球か
ら（Ｂｒｏｗｎら、１９８７、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１
３９：２９７７−２９８３）単離された。分子は、Ｍｒ
＝２８０００の一本鎖ポリペプチドよりなる熱及び酸に
安定な蛋白である。他の天然に生ずる成長調節剤と同じ
く、オンコスタチンＭは、種々の生物学上の活性を示
す。成長の阻害は、全てではないが或るヒト腫瘍細胞系
について観察される。対照的に、或る正常の繊維芽細胞
例えばヒト包皮繊維芽細胞又はＷＩ−３８細胞の成長
は、オンコスタチンＭへの暴露により刺激される（Ｚａ
ｒｌｉｎｇら、１９８６、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃ−
ａｄ．Ｓｃｉ．（ＵＳＡ）８３：９７３９−９７４
３）。オンコスタチンＭに対する遺伝子は、クローンさ
れそして配列され、組換えオンコスタチンＭの活性形
は、最近哺乳動物の細胞に発現された（公開されたヨー
ロッパ特許出願ＥＰＡ０２９０９４８号（公開日：１９
８８年１１月１７日）に相当する米国出願第１４４５７
４号参照。その全部をここに参考文献として引用す
る）。シグナルペプチドの開裂後、成熟した形は、２２
７個のアミノ酸を含む糖蛋白であり、その内の５個はシ
ステイン残基である。蛋白は、非常に親水性のカルボキ
シ末端ドメインを有する。オンコスタチンＭは構造的に
他の周知のサイトカインに関連していないが、そのｍＲ
ＮＡは、その３’未翻訳末端でＡＵの多い領域を含む。
オンコスタチンＭのメッセージにおけるこの領域は、多
くのサイトカイン、リンホカイン及び他の成長調節分子
のそれとホモローガスであり、遺伝子の発現を調節する
共通の態様を示唆している。オンコスタチンＭに対する
細胞受容体は、種々の哺乳動物の細胞に見出だされる。
主なオンコスタチンＭ受容体分子は、Ｍｒ＝１５０００
０−１６００００の特異蛋白である（Ｌｉｎｓｌｅｙ
ら、１９８９、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６４：６５
２８−６５３２）。
【００１８】オンコスタチンＭは、例えばオンコスタチ
ンＭの合成及び／又は分泌を支配できる組換えＤＮＡ分
子によりトランスフェクションされた細胞及びオンコス
タチンＭを天然に生成する細胞を含む生体に作用するオ
ンコスタチンＭを合成する種々の細胞の源から当業者に
周知の技術により得ることができる。一方、オンコスタ
チンＭは、固相ペプチド合成を含むがそれに限定されな
い化学的合成法により合成できる。オンコスタチンＭの
生成法は、公開されたヨーロッパ特許出願ＥＰＡ０２９
０９４８号（公開日：１９８８年１１月１７日）に相当
する米国出願第１４４５７４号に記載されている。その
全部をここに参考文献として引用する。
ンＭの合成及び／又は分泌を支配できる組換えＤＮＡ分
子によりトランスフェクションされた細胞及びオンコス
タチンＭを天然に生成する細胞を含む生体に作用するオ
ンコスタチンＭを合成する種々の細胞の源から当業者に
周知の技術により得ることができる。一方、オンコスタ
チンＭは、固相ペプチド合成を含むがそれに限定されな
い化学的合成法により合成できる。オンコスタチンＭの
生成法は、公開されたヨーロッパ特許出願ＥＰＡ０２９
０９４８号（公開日：１９８８年１１月１７日）に相当
する米国出願第１４４５７４号に記載されている。その
全部をここに参考文献として引用する。
【００１９】オンコスタチンＭについて親和性を有する
モノクローナル抗体は、酵素結合免疫吸着アッセイ（Ｅ
ＬＩＳＡ）、免疫沈降、ウエスタン・ブロット分析、放
射線免疫検定法、競合及び非競合免疫アッセイを含むが
これらに限定されない多数の免疫学的アッセイの任意の
ものを用いてオンコスタチンＭを結合するそれらの能力
をアッセイすることにより選択できる。例えば、下記の
固相ミクロ酵素アッセイ（ミクロＥＩＡ）が、容易に使
用できる。簡単には、ハイブリッドの上澄み液に見出だ
される抗体は、穴中の固体表面へコーティングされたオ
ンコスタチンＭへ結合するそれらの能力により評価され
る。上澄み液の添加後、ペルオキシダーゼ複合Ｆ（ａ
ｂ’）ヤギ抗マウスＩｇを穴に加える。全ての未結合物
質を洗い流した後、結合した酵素が色の変化をする基質
の添加により明らかになる。色の変化は、穴に形成され
たモノクローナル抗体／オンコスタチンＭ複合体を間接
的に示す。
モノクローナル抗体は、酵素結合免疫吸着アッセイ（Ｅ
ＬＩＳＡ）、免疫沈降、ウエスタン・ブロット分析、放
射線免疫検定法、競合及び非競合免疫アッセイを含むが
これらに限定されない多数の免疫学的アッセイの任意の
ものを用いてオンコスタチンＭを結合するそれらの能力
をアッセイすることにより選択できる。例えば、下記の
固相ミクロ酵素アッセイ（ミクロＥＩＡ）が、容易に使
用できる。簡単には、ハイブリッドの上澄み液に見出だ
される抗体は、穴中の固体表面へコーティングされたオ
ンコスタチンＭへ結合するそれらの能力により評価され
る。上澄み液の添加後、ペルオキシダーゼ複合Ｆ（ａ
ｂ’）ヤギ抗マウスＩｇを穴に加える。全ての未結合物
質を洗い流した後、結合した酵素が色の変化をする基質
の添加により明らかになる。色の変化は、穴に形成され
たモノクローナル抗体／オンコスタチンＭ複合体を間接
的に示す。
【００２０】オンコスタチンＭ活性の阻害
【００２１】オンコスタチンＭの生物学上の活性を阻害
する抗体は、治療上の応用に特に用いられる。これら抗
体は、下記の成長阻害アッセイ（「ＧＩＡ」）を用いて
同定できる。簡単には、ＧＩＡは、標的細胞の成長及び
増殖に対するオンコスタチンＭの阻害作用を中和する抗
体の能力を評価するテストシステムを提供する。
する抗体は、治療上の応用に特に用いられる。これら抗
体は、下記の成長阻害アッセイ（「ＧＩＡ」）を用いて
同定できる。簡単には、ＧＩＡは、標的細胞の成長及び
増殖に対するオンコスタチンＭの阻害作用を中和する抗
体の能力を評価するテストシステムを提供する。
【００２２】オンコスタチンＭ受容体への結合の阻害
【００２３】細胞の表面受容体は、それらのリガンドに
高い親和性を一般に有する。特定の細胞表面受容体への
リガンドの結合は、種々の細胞の事象のコントロールを
開始する。膜受容体へのオンコスタチンＭの結合は、下
記の放射線受容体アッセイを用いて立証され、前述の米
国特許出願第１４４５７４号に記載されている。テスト
されたヒト腫瘍細胞は、Ａ３７５（黒色腫）；Ａ８７５
（黒色腫）；Ｍｅ１１０９（黒色腫）；Ｔ２４（膀胱
癌）；Ａ５４９（肺腺癌）；Ｈ１４７７（黒色腫）；Ｍ
ｅ１８０（黒色腫）；及びＭＣＦ（乳癌）を含んだ。
１２５Ｉ−オンコスタチンＭの結合は、特異的でしかも
飽和可能であり、他の周知のポリペプチド成長調節剤に
より阻害されなかった。異なる細胞系により得られる結
合データのスカッチャード分析は、１２５Ｉ−オンコス
タチンＭが約１０−９ＭのＫｄで細胞１個当たり１−２
×１０４結合部位に結合したことを明らかにした。本発
明のハイブリッド細胞系により生成されるモノクローナ
ル抗体は、その細胞表面受容体へのオンコスタチンＭの
結合をブロックするそれらの能力について、下記の放射
線受容体アッセイを用いてテストされた。
高い親和性を一般に有する。特定の細胞表面受容体への
リガンドの結合は、種々の細胞の事象のコントロールを
開始する。膜受容体へのオンコスタチンＭの結合は、下
記の放射線受容体アッセイを用いて立証され、前述の米
国特許出願第１４４５７４号に記載されている。テスト
されたヒト腫瘍細胞は、Ａ３７５（黒色腫）；Ａ８７５
（黒色腫）；Ｍｅ１１０９（黒色腫）；Ｔ２４（膀胱
癌）；Ａ５４９（肺腺癌）；Ｈ１４７７（黒色腫）；Ｍ
ｅ１８０（黒色腫）；及びＭＣＦ（乳癌）を含んだ。
１２５Ｉ−オンコスタチンＭの結合は、特異的でしかも
飽和可能であり、他の周知のポリペプチド成長調節剤に
より阻害されなかった。異なる細胞系により得られる結
合データのスカッチャード分析は、１２５Ｉ−オンコス
タチンＭが約１０−９ＭのＫｄで細胞１個当たり１−２
×１０４結合部位に結合したことを明らかにした。本発
明のハイブリッド細胞系により生成されるモノクローナ
ル抗体は、その細胞表面受容体へのオンコスタチンＭの
結合をブロックするそれらの能力について、下記の放射
線受容体アッセイを用いてテストされた。
【００２４】抗オンコスタチンＭモノクローナル抗体に
よる、カポジ肉腫由来エイズＫＳ細胞に対するオンコス
タチンＭの成長増強作用の阻害
よる、カポジ肉腫由来エイズＫＳ細胞に対するオンコス
タチンＭの成長増強作用の阻害
【００２５】カポジ肉腫の形が、ヒト免疫不全ウィルス
タイプ１（ＨＩＶ−１）に感染した患者と関連がある。
ＨＩＶ−１の感染とエイズ関連カポジ肉腫との間に明ら
かな相関関係があるが、ＨＩＶ−１のゲノム配列又は全
ての他のウィルスのそれは、カポジ肉腫の組織に検出さ
れていない（Ｃｉｖａｎｔｏｓら、１９８２、Ｊ．Ｉｎ
ｖｅｓｔ．Ｄｅｒｍａｔｏｌ．７９：７９）。最近、Ｈ
ＴＬＶ−ＩＩ形質転換Ｔ細胞系からの調整培地の存在下
培養されたエイズ−カポジ肉腫細胞が、カポジ肉腫細胞
系の成長を刺激し維持した培地に存在する成長因子を明
らかにした（ナカムラ、Ｓ．ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２４
２、４２６、１９８８年１０月２１日）。下記の実験
は、オンコスタチンＭが又カポジ肉腫細胞の成長を増強
することを立証している（図６）。下記に示されたよう
に、本発明の中和するモノクローナル抗体（例えばＧＩ
Ａ分析により決定されるように）は、オンコスタチンＭ
並びにエイズ−ＫＳ細胞のＨＴＬＶ−ＩＩ形質転換Ｔ細
胞系の調整された培地の両者の成長増強活性を阻害する
（図７）。
タイプ１（ＨＩＶ−１）に感染した患者と関連がある。
ＨＩＶ−１の感染とエイズ関連カポジ肉腫との間に明ら
かな相関関係があるが、ＨＩＶ−１のゲノム配列又は全
ての他のウィルスのそれは、カポジ肉腫の組織に検出さ
れていない（Ｃｉｖａｎｔｏｓら、１９８２、Ｊ．Ｉｎ
ｖｅｓｔ．Ｄｅｒｍａｔｏｌ．７９：７９）。最近、Ｈ
ＴＬＶ−ＩＩ形質転換Ｔ細胞系からの調整培地の存在下
培養されたエイズ−カポジ肉腫細胞が、カポジ肉腫細胞
系の成長を刺激し維持した培地に存在する成長因子を明
らかにした（ナカムラ、Ｓ．ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２４
２、４２６、１９８８年１０月２１日）。下記の実験
は、オンコスタチンＭが又カポジ肉腫細胞の成長を増強
することを立証している（図６）。下記に示されたよう
に、本発明の中和するモノクローナル抗体（例えばＧＩ
Ａ分析により決定されるように）は、オンコスタチンＭ
並びにエイズ−ＫＳ細胞のＨＴＬＶ−ＩＩ形質転換Ｔ細
胞系の調整された培地の両者の成長増強活性を阻害する
（図７）。
【００２６】オンコスタチンＭに対するモノクローナル
抗体の製法
抗体の製法
【００２７】本発明の抗オンコスタチンＭ抗体は、種々
の技術の任意のものを用いて製造でき、その場合オンコ
スタチンＭは、特にアジュバント例えば完全フロインド
アジュバンド、水酸化アルミニウムゲルなどとともに哺
乳動物の宿主例えばマウス、ウシ、ヤギ、ヒツジ、ウサ
ギなどに注射される免疫原として用いられる。宿主は、
次に採血され、血液はポリクローナル抗体の単離に用い
られる。一方、末梢血液リンパ球、脾リンパ球（Ｂ−細
胞）又はリンパ節リンパ球が、適切な黒色腫細胞との融
合に用いられて、オンコスタチンＭに特異的な抗体のモ
ノクローナル発現のための染色体を不滅にできる。
の技術の任意のものを用いて製造でき、その場合オンコ
スタチンＭは、特にアジュバント例えば完全フロインド
アジュバンド、水酸化アルミニウムゲルなどとともに哺
乳動物の宿主例えばマウス、ウシ、ヤギ、ヒツジ、ウサ
ギなどに注射される免疫原として用いられる。宿主は、
次に採血され、血液はポリクローナル抗体の単離に用い
られる。一方、末梢血液リンパ球、脾リンパ球（Ｂ−細
胞）又はリンパ節リンパ球が、適切な黒色腫細胞との融
合に用いられて、オンコスタチンＭに特異的な抗体のモ
ノクローナル発現のための染色体を不滅にできる。
【００２８】本発明は、マウスモノクローナル抗体を用
いる実施例により記述されているが、本発明はそれだけ
に限定されず例えばヒト抗体の使用を含む。これら抗体
は、ヒトハイブリドーマの使用（Ｃｏｔｅら、１９８
３、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（ＵＳ
Ａ）８０：２０２６−２０３０）により、又は生体外の
ＥＢＶウィルスによるヒトＢ細胞の形質転換（Ｃｏｌｅ
ら、１９８５、「Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏ
ｄｉｅｓ ａｎｄ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒａｐｙ」、
Ａｌａｎ Ｒ．ＬＩｓｓ、７７−９６ページ）により得
ることができる。「キメラ抗体」の製造に最近開発され
た技術も使用できる（Ｍｏｒｒｉｓｏｎら、１９８４、
Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（ＵＳＡ）８
１：６８５１−６８５５；Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒら、１９
８４、Ｎａｔｕｒｅ３１２：６０４−６０８；タケダ
ら、１９８５、Ｎａｔｕｒｅ ３１４：４５２−４５
４）。これら後者の技術は、適切な生物学上の活性のヒ
ト抗体分子からの遺伝子により適切な抗原特異性のマウ
ス抗体分子からの遺伝子を切り継ぎすることを含む。
いる実施例により記述されているが、本発明はそれだけ
に限定されず例えばヒト抗体の使用を含む。これら抗体
は、ヒトハイブリドーマの使用（Ｃｏｔｅら、１９８
３、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（ＵＳ
Ａ）８０：２０２６−２０３０）により、又は生体外の
ＥＢＶウィルスによるヒトＢ細胞の形質転換（Ｃｏｌｅ
ら、１９８５、「Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏ
ｄｉｅｓ ａｎｄ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒａｐｙ」、
Ａｌａｎ Ｒ．ＬＩｓｓ、７７−９６ページ）により得
ることができる。「キメラ抗体」の製造に最近開発され
た技術も使用できる（Ｍｏｒｒｉｓｏｎら、１９８４、
Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（ＵＳＡ）８
１：６８５１−６８５５；Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒら、１９
８４、Ｎａｔｕｒｅ３１２：６０４−６０８；タケダ
ら、１９８５、Ｎａｔｕｒｅ ３１４：４５２−４５
４）。これら後者の技術は、適切な生物学上の活性のヒ
ト抗体分子からの遺伝子により適切な抗原特異性のマウ
ス抗体分子からの遺伝子を切り継ぎすることを含む。
【００２９】最近記述された技術は、オンコスタチンＭ
を規定するモノクローナル抗体の全能力を発生するのに
用いることができる（Ｓａｓｔｒｙら、１９８９、Ｐｒ
ｏ−ｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（ＵＳＡ）８
６：５７２８−５７３２；及びＨｕｓｅら、１９８９、
Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４６：１２７５−１２８１参照）。
従って、オンコスタチンＭによりプライムされた動物の
脾ＤＮＡから由来するＦａｂフラグメントのｃＤＮＡラ
イブラリーが、細菌性宿主細胞に発生できる。
を規定するモノクローナル抗体の全能力を発生するのに
用いることができる（Ｓａｓｔｒｙら、１９８９、Ｐｒ
ｏ−ｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（ＵＳＡ）８
６：５７２８−５７３２；及びＨｕｓｅら、１９８９、
Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４６：１２７５−１２８１参照）。
従って、オンコスタチンＭによりプライムされた動物の
脾ＤＮＡから由来するＦａｂフラグメントのｃＤＮＡラ
イブラリーが、細菌性宿主細胞に発生できる。
【００３０】本発明のモノクローナル抗体は、適切なプ
ロテアーゼ例えばペプシン、パパインなどによる処理に
より修飾されて、オンコスタチンＭに免疫特異的に結合
するＦａｂ、Ｆ（ａｂ’）２又はＦｖフラグメントを発
生する。
ロテアーゼ例えばペプシン、パパインなどによる処理に
より修飾されて、オンコスタチンＭに免疫特異的に結合
するＦａｂ、Ｆ（ａｂ’）２又はＦｖフラグメントを発
生する。
【００３１】さらに、全抗体分子又はそのＦａｂ、Ｆ
（ａｂ’）２又はＦｖフラグメントは、シグナル発生化
合物例えばフルオロレサー、放射ラベル、発色団、酵
素、化学発光又は生物発光分子などを含むがこれらに限
定されない種々の化合物の任意のものに複合できる。一
方、全抗体又はそのＦａｂ、Ｆ（ａｂ’）２又はＦｖフ
ラグメントは、オンコスタチンＭの生物学上の活性を増
強又は阻害できる成長因子又はトキシンに複合されて、
それらの表面にオンコスタチンＭプレカーサーを発現す
る細胞が選択的に殺される。抗体及び抗体フラグメント
へのラベル、蛋白、トキシンなどの複合に用いられる方
法は、当業者に周知である。例えば米国特許第４２２０
４５０；４２３５８６９；３９３５０７４；及び３９９
６３４５号参照。
（ａｂ’）２又はＦｖフラグメントは、シグナル発生化
合物例えばフルオロレサー、放射ラベル、発色団、酵
素、化学発光又は生物発光分子などを含むがこれらに限
定されない種々の化合物の任意のものに複合できる。一
方、全抗体又はそのＦａｂ、Ｆ（ａｂ’）２又はＦｖフ
ラグメントは、オンコスタチンＭの生物学上の活性を増
強又は阻害できる成長因子又はトキシンに複合されて、
それらの表面にオンコスタチンＭプレカーサーを発現す
る細胞が選択的に殺される。抗体及び抗体フラグメント
へのラベル、蛋白、トキシンなどの複合に用いられる方
法は、当業者に周知である。例えば米国特許第４２２０
４５０；４２３５８６９；３９３５０７４；及び３９９
６３４５号参照。
【００３２】オンコスタチンＭへのモノクローナル抗体
の使用
の使用
【００３３】本発明の抗体は、本来又は変性の形の天然
又は組換えオンコスタチンＭを検出したり、又はオンコ
スタチンＭが遊離の形か又はその結合蛋白と結合して生
ずる血清サンプル中のオンコスタチンＭの存在を検出す
るのに有利に使用できる。一方、本発明の抗体は、生体
内で用いられて、オンコスタチンＭの生物学上の作用を
阻害する。ポリクローナル抗体又はモノクローナル抗体
の何れかが、サンプル例えば細胞又は生理学上の流体例
えば血液中のオンコスタチンＭの検出に使用できる。体
液中のオンコスタチンＭの検出は、又腫瘍細胞の存在の
指標として使用できる。この点に関し、抗オンコスタチ
ンＭ抗体は、癌及び／又は他の細胞成長関連疾患の診断
及び／又は予後に有用である。抗体は、又天然又は合成
の源からオンコスタチンＭを単離し精製するアフィニー
・クロマトグラフィーに使用できる。抗体は、培養物中
又は生体内で細胞と結合したオンコスタチンＭの量をコ
ントロールし、それにより細胞の成長が、オンコスタチ
ンＭ：オンコスタチンＭ受容体結合の競合的阻害をもた
らす特異的抗体：オンコスタチンＭ複合体の形成により
修飾されるのに用いられる。従って、本発明の抗体は、
オンコスタチンＭの成長刺激活性が因子である細胞成長
障害の治療に治療剤として有用である。
又は組換えオンコスタチンＭを検出したり、又はオンコ
スタチンＭが遊離の形か又はその結合蛋白と結合して生
ずる血清サンプル中のオンコスタチンＭの存在を検出す
るのに有利に使用できる。一方、本発明の抗体は、生体
内で用いられて、オンコスタチンＭの生物学上の作用を
阻害する。ポリクローナル抗体又はモノクローナル抗体
の何れかが、サンプル例えば細胞又は生理学上の流体例
えば血液中のオンコスタチンＭの検出に使用できる。体
液中のオンコスタチンＭの検出は、又腫瘍細胞の存在の
指標として使用できる。この点に関し、抗オンコスタチ
ンＭ抗体は、癌及び／又は他の細胞成長関連疾患の診断
及び／又は予後に有用である。抗体は、又天然又は合成
の源からオンコスタチンＭを単離し精製するアフィニー
・クロマトグラフィーに使用できる。抗体は、培養物中
又は生体内で細胞と結合したオンコスタチンＭの量をコ
ントロールし、それにより細胞の成長が、オンコスタチ
ンＭ：オンコスタチンＭ受容体結合の競合的阻害をもた
らす特異的抗体：オンコスタチンＭ複合体の形成により
修飾されるのに用いられる。従って、本発明の抗体は、
オンコスタチンＭの成長刺激活性が因子である細胞成長
障害の治療に治療剤として有用である。
【００３４】カポジ肉腫の成長を阻害するための抗オン
コスタチンＭの使用
コスタチンＭの使用
【００３５】特に興昧があるのは、オンコスタチンＭに
より刺激された細胞の成長を阻害する本発明の抗オンコ
スタチンＭ抗体の使用である。特に、生体外でアッセイ
されたカポジ肉腫細胞系の成長は、オンコスタチンＭに
より増強されることが下記に示される。中和する抗オン
コスタチンＭ抗体がアッセイに存在するとき、オンコス
タチンＭの増強作用は、モノクローナル抗体により阻害
される。従って、本発明の抗体は、カボジ肉腫を治療す
るのに治療上用いられる。この点に関し、治療上有効な
投与量の中和する抗オンコスタチンＭ抗体又はその抗オ
ンコスタチンＭフラグメントは、生体内に投与できる。
投与量は、抗体又はそのフラグメントの血清濃度を達成
するのに十分なように予定され、生体外で測定してオン
コスタチンＭの作用を阻害するものが、利用できる。
より刺激された細胞の成長を阻害する本発明の抗オンコ
スタチンＭ抗体の使用である。特に、生体外でアッセイ
されたカポジ肉腫細胞系の成長は、オンコスタチンＭに
より増強されることが下記に示される。中和する抗オン
コスタチンＭ抗体がアッセイに存在するとき、オンコス
タチンＭの増強作用は、モノクローナル抗体により阻害
される。従って、本発明の抗体は、カボジ肉腫を治療す
るのに治療上用いられる。この点に関し、治療上有効な
投与量の中和する抗オンコスタチンＭ抗体又はその抗オ
ンコスタチンＭフラグメントは、生体内に投与できる。
投与量は、抗体又はそのフラグメントの血清濃度を達成
するのに十分なように予定され、生体外で測定してオン
コスタチンＭの作用を阻害するものが、利用できる。
【００３６】オンコスタチンＭの作用を真似る抗イディ
オタイプの発生
オタイプの発生
【００３７】本発明のモノクローナル抗体は、又オンコ
スタチンＭの生物学上の作用を真似る抗イディオタイプ
抗体を発生するのに使用できる。抗イディオタイプ抗体
又は抗イディオタイプは、他の抗体分子の抗原結合領域
又は可変領域（イディオタイプと呼ばれる）に対して向
う抗体である。理論では、イディオタイプ的関係のＪｅ
ｒｎｅのネットワークモデルに基づいて（Ｊｅｒｎｅ、
Ｎ．Ｋ．、１９７４、Ａｎｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．（Ｐａ
ｒｉｓ）１２５：３７３；Ｊｅｒｎｅ、Ｎ．Ｋ．ら、１
９８２、ＥＭＢＯ ２３４）、或る抗原についてパラト
ープ（抗原結合部位）を発現する抗体分子による免疫化
は、一群の抗イディオタイプ抗体を生成し、それらの或
るものは抗原とパラトープに補完的な構造をともにす
る。オンコスタチンＭのその受容体への結合を阻害する
モノクローナル抗体による免疫化は、ついでオンコスタ
チンＭを真似し、オンコスタチンＭ受容体に結合する抗
イディオタイプを生成する。従って、これら抗イディオ
タイプが、生体内及び生体外でオンコスタチンＭの作用
を真似するオンコスタチンＭに向けられるモノクローナ
ル抗体により生成されることは、本発明の範囲内にあ
る。同様に、オンコスタチンＭに結合する抗イディオタ
イプ抗体は、本明細書で用いられるオンコスタチンＭを
規定するモノクローナル抗体の規定に含まれることを目
的としている。
スタチンＭの生物学上の作用を真似る抗イディオタイプ
抗体を発生するのに使用できる。抗イディオタイプ抗体
又は抗イディオタイプは、他の抗体分子の抗原結合領域
又は可変領域（イディオタイプと呼ばれる）に対して向
う抗体である。理論では、イディオタイプ的関係のＪｅ
ｒｎｅのネットワークモデルに基づいて（Ｊｅｒｎｅ、
Ｎ．Ｋ．、１９７４、Ａｎｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．（Ｐａ
ｒｉｓ）１２５：３７３；Ｊｅｒｎｅ、Ｎ．Ｋ．ら、１
９８２、ＥＭＢＯ ２３４）、或る抗原についてパラト
ープ（抗原結合部位）を発現する抗体分子による免疫化
は、一群の抗イディオタイプ抗体を生成し、それらの或
るものは抗原とパラトープに補完的な構造をともにす
る。オンコスタチンＭのその受容体への結合を阻害する
モノクローナル抗体による免疫化は、ついでオンコスタ
チンＭを真似し、オンコスタチンＭ受容体に結合する抗
イディオタイプを生成する。従って、これら抗イディオ
タイプが、生体内及び生体外でオンコスタチンＭの作用
を真似するオンコスタチンＭに向けられるモノクローナ
ル抗体により生成されることは、本発明の範囲内にあ
る。同様に、オンコスタチンＭに結合する抗イディオタ
イプ抗体は、本明細書で用いられるオンコスタチンＭを
規定するモノクローナル抗体の規定に含まれることを目
的としている。
【００３８】本発明を制限をすることを目的としない以
下の実施例及びやり方は、本発明をさらに説明するため
に提供される。
下の実施例及びやり方は、本発明をさらに説明するため
に提供される。
【００３９】
【００４０】オンコスタチンＭに対するモノクローナル
抗体の生成
抗体の生成
【００４１】Ａ．免疫化及び融合
【００４２】ハイブリドーマは、前記（Ｚａｒｌｉｎｇ
ら、１９８６、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃ
ｉ．（ＵＳＡ）８３：９７３９−９７）のように精製さ
れた組換えオンコスタチンＭの５μｇ又は１０μｇの何
れかによる４匹のＢａｌｂ／ｃマウスの免疫化により作
成された。簡単に云えば、オンコスタチンＭを、ＰＢＳ
に再懸濁し、等容量の完全フロインドアジュバント中で
乳化し、そして２５μｇのエマルションを皮内で後足肉
趾に注射した。２週間後、同じ後足肉趾に同じ免疫化プ
ロトコールを行い、オンコスタチンＭの濃度は初めの免
疫化のそれと同じであった。第二の免疫化２週間後、マ
ウスに同じ後足肉趾で第三のオンコスタチンＭ製剤を注
射し、このとき製剤は不完全フロインドアジュバントに
乳化した。最後の免疫化後３日目に、膝かリンパ節を取
出し、リンパ節細胞を、融合剤として４０％ポリエチレ
ングリコールを用い、１：１のリンパ節細胞対黒色腫細
胞の比でけっ歯類黒色腫６５３／ＡＧ８細胞と融合し
た。融合生成物を、５×１０４細胞／穴の濃度で、１０
％仔ウシ血清、ピルビン酸ナトリウム及びＬ−グルタミ
ンを補充したダルベッコの変性イーグル培地（ＩＤＭＥ
Ｍ）のイスコブ変性培地で、選択剤としてヒポキサンチ
ン・アミトノプテリン・チミジンを含む９６穴プレート
に入れた。１週間後、初めの培地を選択剤を含む新しい
培地と置換した。ハイブリッドが顕微鏡的に見えるよう
になったとき、ハイブリッドを固相ミクロ酵素結合アッ
セイ（「ＭｉｃｒｏＥＩＡ」）によりスクリーンした。
ら、１９８６、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃ
ｉ．（ＵＳＡ）８３：９７３９−９７）のように精製さ
れた組換えオンコスタチンＭの５μｇ又は１０μｇの何
れかによる４匹のＢａｌｂ／ｃマウスの免疫化により作
成された。簡単に云えば、オンコスタチンＭを、ＰＢＳ
に再懸濁し、等容量の完全フロインドアジュバント中で
乳化し、そして２５μｇのエマルションを皮内で後足肉
趾に注射した。２週間後、同じ後足肉趾に同じ免疫化プ
ロトコールを行い、オンコスタチンＭの濃度は初めの免
疫化のそれと同じであった。第二の免疫化２週間後、マ
ウスに同じ後足肉趾で第三のオンコスタチンＭ製剤を注
射し、このとき製剤は不完全フロインドアジュバントに
乳化した。最後の免疫化後３日目に、膝かリンパ節を取
出し、リンパ節細胞を、融合剤として４０％ポリエチレ
ングリコールを用い、１：１のリンパ節細胞対黒色腫細
胞の比でけっ歯類黒色腫６５３／ＡＧ８細胞と融合し
た。融合生成物を、５×１０４細胞／穴の濃度で、１０
％仔ウシ血清、ピルビン酸ナトリウム及びＬ−グルタミ
ンを補充したダルベッコの変性イーグル培地（ＩＤＭＥ
Ｍ）のイスコブ変性培地で、選択剤としてヒポキサンチ
ン・アミトノプテリン・チミジンを含む９６穴プレート
に入れた。１週間後、初めの培地を選択剤を含む新しい
培地と置換した。ハイブリッドが顕微鏡的に見えるよう
になったとき、ハイブリッドを固相ミクロ酵素結合アッ
セイ（「ＭｉｃｒｏＥＩＡ」）によりスクリーンした。
【００４３】Ｂ．ミクロＥＩＡ
【００４４】ハイブリドーマにより生成したオンコスタ
チンＭに対する抗体の特異性を特徴付けるために、下記
のミクロＥＩＡを用いた。ハイブリドーマの上澄み液
を、ミクロテスト・プレート（Ｒｏｂｂｉｎｓ Ｓｃｉ
ｅｎｔｉｆｉｃ、ＳａｎＦｒａｎｃｉｓｃｏ）に用いる
ように適合された固相ＥＩＡを用いて活性についてスク
リーンした。２−４μｇ／ｍｌに及ぶ濃度の精製したオ
ンコスタチンＭを各穴に５μｌの容量で入れ、一晩風乾
させた。ＰＢＳ中の５％脱脂粉乳及び０．１％ナトリウ
ムアジドによる１時間のブロック後、ハイブリッドの上
澄み液を１μｌの容量で加え、１時間室温でインキュベ
ートした。プレートをＰＢＳ中の浸漬により６回洗っ
た。１：１５００の濃度でＰＢＳ＋２％ＢＳＡ中のペル
オキシダーゼ複合Ｆ（ａｂ’）２ヤギ抗マウスＩｇＧ
（Ｐｅｌ−Ｆｒｅｅｚ、Ｒｏ−ｇｅｒｓＡＫ）を各穴に
５μｌの容量で加えた。１時間のインキュベーション
後、プレートを前記のように６回洗い、１０μｌの基
質、２、２’−アジノ−ビス−（３−エチルベンズチア
ゾリン−６−スルホン酸）（「ＡＢＴＳ」）（Ｓｉｇｍ
ａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、Ｍ
ｏ）を加え、プレートを２０分後ＯＤ＝６６０ｎｍで読
み取った。ポジティブの穴を、オンコスタチンＭに対す
る既に発生したウサギ抗血清のシグナルに比較してバッ
クグラウンドより上のシグナルに基づいて決めた。ポジ
ティブのハイブリッドをソフトアガーにクローンした。
チンＭに対する抗体の特異性を特徴付けるために、下記
のミクロＥＩＡを用いた。ハイブリドーマの上澄み液
を、ミクロテスト・プレート（Ｒｏｂｂｉｎｓ Ｓｃｉ
ｅｎｔｉｆｉｃ、ＳａｎＦｒａｎｃｉｓｃｏ）に用いる
ように適合された固相ＥＩＡを用いて活性についてスク
リーンした。２−４μｇ／ｍｌに及ぶ濃度の精製したオ
ンコスタチンＭを各穴に５μｌの容量で入れ、一晩風乾
させた。ＰＢＳ中の５％脱脂粉乳及び０．１％ナトリウ
ムアジドによる１時間のブロック後、ハイブリッドの上
澄み液を１μｌの容量で加え、１時間室温でインキュベ
ートした。プレートをＰＢＳ中の浸漬により６回洗っ
た。１：１５００の濃度でＰＢＳ＋２％ＢＳＡ中のペル
オキシダーゼ複合Ｆ（ａｂ’）２ヤギ抗マウスＩｇＧ
（Ｐｅｌ−Ｆｒｅｅｚ、Ｒｏ−ｇｅｒｓＡＫ）を各穴に
５μｌの容量で加えた。１時間のインキュベーション
後、プレートを前記のように６回洗い、１０μｌの基
質、２、２’−アジノ−ビス−（３−エチルベンズチア
ゾリン−６−スルホン酸）（「ＡＢＴＳ」）（Ｓｉｇｍ
ａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、Ｍ
ｏ）を加え、プレートを２０分後ＯＤ＝６６０ｎｍで読
み取った。ポジティブの穴を、オンコスタチンＭに対す
る既に発生したウサギ抗血清のシグナルに比較してバッ
クグラウンドより上のシグナルに基づいて決めた。ポジ
ティブのハイブリッドをソフトアガーにクローンした。
【００４５】Ｃ．免疫沈降
【００４６】オンコスタチンＭエンコードｃＤＮＡによ
りトランスフェクションされたＣＨＯ細胞を、６０×１
５ｃｍペトリ皿で４ｍｌの容量でそれぞれ３５Ｓ−メチ
オニン及び３５Ｓ−システインの２００μＣｉにより４
−８時間インキュベートした。上澄み液を集め、濾過
し、１０ｍＭのフェニルメチルスルホニルフルオリド
（「ＰＭＳＦ」）及び１００ｍＭのトシル−リジン−ク
ロロメチルケトン（「ＴＬＣＫ」）を加えてプロテアー
ゼを阻害した。免疫沈降のために、１００−２００μｌ
のラベルした上澄み液を、モノクローナル抗体分泌ハイ
ブリッドからの廃上澄み液２００μｌとともに回転しつ
つ、４℃で一晩インキュベートした。抗原・抗体複合体
を、Ｒｅａｃｔｉｇｅｌビード（Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｈｅ
ｍｉｃａｌｓ）と共有結合でカップリングしたモノクロ
ーナルラット抗マウスκ軽鎖モノクローナル抗体とのイ
ンキュベーションにより単離した。洗浄後、抗体・抗原
複合体を１％ＳＤＳ及び５％２−メルカプトエタノール
を含むサンプル緩衝液中の煮沸により溶離した。溶離し
た物質を、１５％ＳＤＳ−ＰＡＧＥで電気泳動した。ゲ
ルをＡｍｐｌｉｆｙ（商標）（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｃｏ
ｒｐ．、ＡｒｌｉｎｇｔｏｎＨｅｉｇｈｔｓ、ＩＬ）に
よりフルオログラフィーし、乾燥し、コダックＸ−ＡＲ
５ Ｘ線フィルムによりオートラジオグラフィした。
りトランスフェクションされたＣＨＯ細胞を、６０×１
５ｃｍペトリ皿で４ｍｌの容量でそれぞれ３５Ｓ−メチ
オニン及び３５Ｓ−システインの２００μＣｉにより４
−８時間インキュベートした。上澄み液を集め、濾過
し、１０ｍＭのフェニルメチルスルホニルフルオリド
（「ＰＭＳＦ」）及び１００ｍＭのトシル−リジン−ク
ロロメチルケトン（「ＴＬＣＫ」）を加えてプロテアー
ゼを阻害した。免疫沈降のために、１００−２００μｌ
のラベルした上澄み液を、モノクローナル抗体分泌ハイ
ブリッドからの廃上澄み液２００μｌとともに回転しつ
つ、４℃で一晩インキュベートした。抗原・抗体複合体
を、Ｒｅａｃｔｉｇｅｌビード（Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｈｅ
ｍｉｃａｌｓ）と共有結合でカップリングしたモノクロ
ーナルラット抗マウスκ軽鎖モノクローナル抗体とのイ
ンキュベーションにより単離した。洗浄後、抗体・抗原
複合体を１％ＳＤＳ及び５％２−メルカプトエタノール
を含むサンプル緩衝液中の煮沸により溶離した。溶離し
た物質を、１５％ＳＤＳ−ＰＡＧＥで電気泳動した。ゲ
ルをＡｍｐｌｉｆｙ（商標）（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｃｏ
ｒｐ．、ＡｒｌｉｎｇｔｏｎＨｅｉｇｈｔｓ、ＩＬ）に
よりフルオログラフィーし、乾燥し、コダックＸ−ＡＲ
５ Ｘ線フィルムによりオートラジオグラフィした。
【００４７】Ｄ．成長阻害アッセイ
【００４８】抗体をテストして、全てが成長阻害アッセ
イ（「ＧＩＡ」）でオンコスタチンＭの阻害作用を中和
できるかどうかを決めた。ＧＩＡは、指標細胞としてＡ
３７５黒色腫細胞（４×１０３細胞／５０μｌ）を用い
る。Ａ３７５細胞を、１０％熱不活性化仔ウシ血清及び
ペニシリン／ストレプトマイシンを補充したダルベッコ
の変性イーグル培地（「ＤＭＥＭ」）を含む成長培地
で、平底９６穴組織培養プレート（Ｃｏｓｔａｒ３５９
５、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ ＭＡ）で４時間予備培養し
た。オンコスタチンＭを成長培地で希釈し、１穴当たり
５０μｌの希釈したサンプルを加えることにより３検体
で成長の阻害についてアッセイする。細胞を次に３７℃
で７２時間インキュベートする。このインキュベーショ
ン後、各穴を［１２５Ｉ］ヨード−２’−デオキシウリ
ジン（０．０５μＣｉ／穴）（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｃｏ
ｒｐ．、ＡｒｌｉｎｇｔｏｎＨｅｉｇｈｔｓ、ＩＬ）を
含む成長培地１００μｌにより２４時間処理する。単層
をホスフェート緩衝塩水（「ＰＢＳ」）により洗い、９
５％メタノールで固定し、風乾する。細胞により配合さ
れた［１２５Ｉ］ヨードデオキシウリジンを２００μｌ
の１Ｎ水酸化ナトリウムにより可溶化し、細胞成長の量
を、活発に成長している細胞のＤＮＡに配合された［
１２５Ｉ］ヨードデオキシウリジンの量により測定す
る。活性の１単位は、未処理細胞に比べてＡ３７５細胞
の成長を５０％阻害するのに必要なオンコスタチンＭの
量として規定される。
イ（「ＧＩＡ」）でオンコスタチンＭの阻害作用を中和
できるかどうかを決めた。ＧＩＡは、指標細胞としてＡ
３７５黒色腫細胞（４×１０３細胞／５０μｌ）を用い
る。Ａ３７５細胞を、１０％熱不活性化仔ウシ血清及び
ペニシリン／ストレプトマイシンを補充したダルベッコ
の変性イーグル培地（「ＤＭＥＭ」）を含む成長培地
で、平底９６穴組織培養プレート（Ｃｏｓｔａｒ３５９
５、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ ＭＡ）で４時間予備培養し
た。オンコスタチンＭを成長培地で希釈し、１穴当たり
５０μｌの希釈したサンプルを加えることにより３検体
で成長の阻害についてアッセイする。細胞を次に３７℃
で７２時間インキュベートする。このインキュベーショ
ン後、各穴を［１２５Ｉ］ヨード−２’−デオキシウリ
ジン（０．０５μＣｉ／穴）（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｃｏ
ｒｐ．、ＡｒｌｉｎｇｔｏｎＨｅｉｇｈｔｓ、ＩＬ）を
含む成長培地１００μｌにより２４時間処理する。単層
をホスフェート緩衝塩水（「ＰＢＳ」）により洗い、９
５％メタノールで固定し、風乾する。細胞により配合さ
れた［１２５Ｉ］ヨードデオキシウリジンを２００μｌ
の１Ｎ水酸化ナトリウムにより可溶化し、細胞成長の量
を、活発に成長している細胞のＤＮＡに配合された［
１２５Ｉ］ヨードデオキシウリジンの量により測定す
る。活性の１単位は、未処理細胞に比べてＡ３７５細胞
の成長を５０％阻害するのに必要なオンコスタチンＭの
量として規定される。
【００４９】Ｅ．オンコスタチンＭ放射線受容体アッセ
イ
イ
【００５０】抗体を、ヒト癌細胞系Ｈ２９８１のオンコ
スタチンＭのための細胞表面受容体への１２５Ｉラベル
オンコスタチンＭの結合を阻害する能力に関する放射線
受容体アッセイでテストした。Ｈ２９８１細胞を、２×
１０５細胞／穴の密度で４８穴プレートに入れ、アッセ
イの開始前１６−２４時間３７℃に保つ。細胞の単層
を、次に結合緩衝液（Ｌｉｎｓｌｅｙら、１９８６、Ｂ
ｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ２５：２９７８−２９８６）に
より一回洗う。全結合を測定するために、１２５Ｉ−オ
ンコスタチンＭを０．５−１００ｎｇ／ｍｌに及ぶ濃度
で加える。非特異的結合を測定するために、未ラベルオ
ンコスタチンＭを１２５Ｉ−オンコスタチンＭと同時に
加えて、１２５Ｉ−オンコスタチンＭの濃度よりも２０
−１００倍高い濃度でプレートを作成する。結合を２３
℃で２−５時間進めさせ、次に単層を結合緩衝液により
４回洗う。細胞結合放射活性を１Ｎ ＮａＯＨにより可
溶化し、ガンマ・カウンターでカウントする。特異的結
合は、全結合から非特異的結合を差し引くことにより計
算される。解離定数（Ｋｄ）及び結合容量は、スキャチ
ャード分析（Ｓｃａｔｃｈａｒｄ、Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａ
ｃａｄ．Ｓｃｉ．（１９４９）５１：６６０）により求
められた。
スタチンＭのための細胞表面受容体への１２５Ｉラベル
オンコスタチンＭの結合を阻害する能力に関する放射線
受容体アッセイでテストした。Ｈ２９８１細胞を、２×
１０５細胞／穴の密度で４８穴プレートに入れ、アッセ
イの開始前１６−２４時間３７℃に保つ。細胞の単層
を、次に結合緩衝液（Ｌｉｎｓｌｅｙら、１９８６、Ｂ
ｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ２５：２９７８−２９８６）に
より一回洗う。全結合を測定するために、１２５Ｉ−オ
ンコスタチンＭを０．５−１００ｎｇ／ｍｌに及ぶ濃度
で加える。非特異的結合を測定するために、未ラベルオ
ンコスタチンＭを１２５Ｉ−オンコスタチンＭと同時に
加えて、１２５Ｉ−オンコスタチンＭの濃度よりも２０
−１００倍高い濃度でプレートを作成する。結合を２３
℃で２−５時間進めさせ、次に単層を結合緩衝液により
４回洗う。細胞結合放射活性を１Ｎ ＮａＯＨにより可
溶化し、ガンマ・カウンターでカウントする。特異的結
合は、全結合から非特異的結合を差し引くことにより計
算される。解離定数（Ｋｄ）及び結合容量は、スキャチ
ャード分析（Ｓｃａｔｃｈａｒｄ、Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａ
ｃａｄ．Ｓｃｉ．（１９４９）５１：６６０）により求
められた。
【００５１】Ｆ．オンコスタチンＭ突然変異体
【００５２】抗オンコスタチンＭモノクローナル抗体
を、ＤＮＡレベルで生じた、挿入、欠失又は置換を有す
る一連の組換えオンコスタチンＭ突然変異体に対してテ
ストした。抗体を、種々の親及び突然変異の構造物によ
り一時的にトランスフェクションされたＣＯＳ細胞から
培地上のＥＩＡ中の廃上澄み液としてテストした。
を、ＤＮＡレベルで生じた、挿入、欠失又は置換を有す
る一連の組換えオンコスタチンＭ突然変異体に対してテ
ストした。抗体を、種々の親及び突然変異の構造物によ
り一時的にトランスフェクションされたＣＯＳ細胞から
培地上のＥＩＡ中の廃上澄み液としてテストした。
【００５３】Ｇ．モノクローナル抗体による血清中のオ
ンコスタチンＭの検出
ンコスタチンＭの検出
【００５４】血清中のオンコスタチンＭの存在を次のよ
うに検出した。ヒト血清サンプルを先ずＳ−３００サイ
ジング・カラムに加えて分子量により血清蛋白を分離し
た。Ｓ−３００カラムから集めたフラクションを、血清
サンプルの酸性化の前及び後の両方でＧＩＡ活性につい
て調べた。酸性化前、多くの血清サンプルは、ボイドボ
リュウムフラクションでＧＩＡ活性を示さなかった。し
かし、酸性化され次にＧＩＡに加えられる前に再び中和
された血清フラクションは、２００キロダルトンより高
い分子量のフラクションで活性を示し、血清中のオンコ
スタチンＭが一般に２００Ｋｄより大きい結合因子と結
合し、この状態で不活性である。種々の血清フラクショ
ンは、ウエスタン・ブロティングにより調べられた。オ
ンコスタチンＭ特異的モノクローナル抗体と、オンコス
タチンＭの分子量に相当するが高い分子量フラクション
に見出だされる蛋白との反応は、これらのフラクション
におけるオンコスタチンＭの存在を確証した。血清に見
出だされるオンコスタチンＭは精製され、そしてＮ末端
アミノ酸の配列は、それが既に得られた本来及び組換え
オンコスタチンＭと同じであることを示す。
うに検出した。ヒト血清サンプルを先ずＳ−３００サイ
ジング・カラムに加えて分子量により血清蛋白を分離し
た。Ｓ−３００カラムから集めたフラクションを、血清
サンプルの酸性化の前及び後の両方でＧＩＡ活性につい
て調べた。酸性化前、多くの血清サンプルは、ボイドボ
リュウムフラクションでＧＩＡ活性を示さなかった。し
かし、酸性化され次にＧＩＡに加えられる前に再び中和
された血清フラクションは、２００キロダルトンより高
い分子量のフラクションで活性を示し、血清中のオンコ
スタチンＭが一般に２００Ｋｄより大きい結合因子と結
合し、この状態で不活性である。種々の血清フラクショ
ンは、ウエスタン・ブロティングにより調べられた。オ
ンコスタチンＭ特異的モノクローナル抗体と、オンコス
タチンＭの分子量に相当するが高い分子量フラクション
に見出だされる蛋白との反応は、これらのフラクション
におけるオンコスタチンＭの存在を確証した。血清に見
出だされるオンコスタチンＭは精製され、そしてＮ末端
アミノ酸の配列は、それが既に得られた本来及び組換え
オンコスタチンＭと同じであることを示す。
【００５５】結果
【００５６】Ｈ．オンコスタチンＭに特異性を有するモ
ノクローナル抗体の選択
ノクローナル抗体の選択
【００５７】各シリーズで４種の融合よりなる二つのシ
リーズの融合を行い、各融合当たり各マウスからの１個
のリンパ節を用いた。初めのシリーズからは、４種のハ
イブリッドがさらに詳しく調べられた。次のしかもさら
に成功したシリーズの融合（マイクロＥＩＡで同定され
たポジティブ・ハイブリッドの数の条件で）から、少な
くとも２０個の他の抗オンコスタチンＭモノクローナル
抗体が同定された。この数から、下記のハイブリッドが
ＥＩＡにおける相対的シグナル及び免疫沈降への能力に
基づく次の検討に選ばれた。本来の又は変性した代謝的
にラベルしたオンコスタチンＭ：１１Ｒ２Ｆ８：１２Ｒ
１２Ｂ５：１２Ｒ１３Ｄ７及び１２Ｒ１９Ｅ３。下記の
免疫沈降のデータに基づいて、ハイブリッドは、本来の
オンコスタチンＭ、変性オンコスタチンＭ又はその両者
の何れかとのそれらの反応性に基づいて三つのカテゴリ
ーの一つに区分けされた（表Ｉ）。これらのモノクロー
ナル抗体の内の５種は、次にそれらのどれかが成長阻害
アッセイにおけるオンコスタチンＭの阻害効果を中和で
きるかどうかを決めるのにテストされた。これらの結果
を下記に記述する。
リーズの融合を行い、各融合当たり各マウスからの１個
のリンパ節を用いた。初めのシリーズからは、４種のハ
イブリッドがさらに詳しく調べられた。次のしかもさら
に成功したシリーズの融合（マイクロＥＩＡで同定され
たポジティブ・ハイブリッドの数の条件で）から、少な
くとも２０個の他の抗オンコスタチンＭモノクローナル
抗体が同定された。この数から、下記のハイブリッドが
ＥＩＡにおける相対的シグナル及び免疫沈降への能力に
基づく次の検討に選ばれた。本来の又は変性した代謝的
にラベルしたオンコスタチンＭ：１１Ｒ２Ｆ８：１２Ｒ
１２Ｂ５：１２Ｒ１３Ｄ７及び１２Ｒ１９Ｅ３。下記の
免疫沈降のデータに基づいて、ハイブリッドは、本来の
オンコスタチンＭ、変性オンコスタチンＭ又はその両者
の何れかとのそれらの反応性に基づいて三つのカテゴリ
ーの一つに区分けされた（表Ｉ）。これらのモノクロー
ナル抗体の内の５種は、次にそれらのどれかが成長阻害
アッセイにおけるオンコスタチンＭの阻害効果を中和で
きるかどうかを決めるのにテストされた。これらの結果
を下記に記述する。
【００５８】
【表１】
【００５９】Ｉ．オンコスタチンＭによるモノクローナ
ル抗体免疫沈降
ル抗体免疫沈降
【００６０】免疫沈降のデータの結果は、それがＣＨＯ
トランフェクタント（グループ１）から分泌された形で
３５Ｓ−メチオニンをラベルしたオンコスタチンＭとの
み反応する３種のハイブリドーマを同定した（レーン
２、６、７；図１；抗体の同定のための表Ｉ参照）。３
種の他のモノクローナル抗体は、先ずＳＤＳ及び還元剤
による処理により還元されそして変性され次に１００℃
で煮沸された３５Ｓ−メチオニンをラベルしたオンコス
タチンＭとのみ反応するが、本来のオンコスタチンＭと
は反応しなかった（グループ２、レーン３、４、５）。
２種の他のモノクローナル抗体は、それが本来のもので
あっても又は変性したものであっても生合成的にラベル
したオンコスタチンＭと反応した（グループ３、レーン
８、９）。
トランフェクタント（グループ１）から分泌された形で
３５Ｓ−メチオニンをラベルしたオンコスタチンＭとの
み反応する３種のハイブリドーマを同定した（レーン
２、６、７；図１；抗体の同定のための表Ｉ参照）。３
種の他のモノクローナル抗体は、先ずＳＤＳ及び還元剤
による処理により還元されそして変性され次に１００℃
で煮沸された３５Ｓ−メチオニンをラベルしたオンコス
タチンＭとのみ反応するが、本来のオンコスタチンＭと
は反応しなかった（グループ２、レーン３、４、５）。
２種の他のモノクローナル抗体は、それが本来のもので
あっても又は変性したものであっても生合成的にラベル
したオンコスタチンＭと反応した（グループ３、レーン
８、９）。
【００６１】Ｊ．成長阻害アッセイにおいてオンコスタ
チンＭを中和するモノクローナル抗体
チンＭを中和するモノクローナル抗体
【００６２】ハイブリッド１１Ｒ２Ｆ８からの精製した
抗体は、濃度依存の形でオンコスタチンＭの効果を中和
した（図２Ａ）。本来のオンコスタチンＭに対する抗体
１Ｒ１０Ｆ１１は、オンコスタチンＭの成長阻害効果の
ブロッキングを示さなかった（図２Ｂ）。変性した決定
因子を検出する抗体は、ＧＩＡにより測定してオンコス
タチンＭを中和できなかった。中和する抗体１１Ｒ２Ｆ
８は、下記のようにオンコスタチンＭ受容体の結合を阻
害するその能力についてさらにテストされた。
抗体は、濃度依存の形でオンコスタチンＭの効果を中和
した（図２Ａ）。本来のオンコスタチンＭに対する抗体
１Ｒ１０Ｆ１１は、オンコスタチンＭの成長阻害効果の
ブロッキングを示さなかった（図２Ｂ）。変性した決定
因子を検出する抗体は、ＧＩＡにより測定してオンコス
タチンＭを中和できなかった。中和する抗体１１Ｒ２Ｆ
８は、下記のようにオンコスタチンＭ受容体の結合を阻
害するその能力についてさらにテストされた。
【００６３】Ｋ．放射線受容体アッセイにおいてオンコ
スタチンＭの結合を阻害するモノクローナル抗体
スタチンＭの結合を阻害するモノクローナル抗体
【００６４】１１Ｒ２Ｆ８抗体は、本来のしかし非中和
性の部位と反応性の１Ｒ１０Ｆ１１抗体、又は変性した
オンコスタチンＭのエピトープに対する第三の抗体４Ｒ
１２Ｃ７の何れかとは対照的に、濃度依存の形でオンコ
スタチンＭ受容体結合を阻害できた（図３）。
性の部位と反応性の１Ｒ１０Ｆ１１抗体、又は変性した
オンコスタチンＭのエピトープに対する第三の抗体４Ｒ
１２Ｃ７の何れかとは対照的に、濃度依存の形でオンコ
スタチンＭ受容体結合を阻害できた（図３）。
【００６５】Ｌ．組換えオンコスタチンＭ突然変異体に
対してテストされたモノクローナル抗体
対してテストされたモノクローナル抗体
【００６６】オンコスタチンＭ突然変異体は、１９８９
年１２月８日に出願された米国特許出願第４４７７５９
号に記載されており、それはその全部を参考文献として
ここに引用する。５種の異なる抗体が各オンコスタチン
Ｍ突然変異体についてテストされた。変性オンコスタチ
ンＭ決定因子を検出する抗体４Ｒ１２Ｃ７の結合を、中
和するモノクローナル抗体１１Ｒ２Ｆ８のそれと比較す
る（図４）。組換えオンコスタチンＭ分子のＣ末端部分
から欠失するアミノ酸の数が増すにつれ、これらの構造
物上の、本来のエピトープに対する２種の抗体１Ｒ１０
Ｆ１１及び１１Ｒ２Ｆ８の反応性は低下する。アミノ酸
残基数１８３が欠失するとき、両者の抗体の活性は失わ
れ、これらの抗体により認識される三次構造が、分子の
Ｃ末端部分に在るアミノ酸をどうも含むことを暗示して
いる。調べられた一つを除くすべての突然変異構造物に
おいて、本来のオンコスタチンＭに対する２種の抗体が
同 中和する抗体によってではなく１Ｒ１０Ｆ１１により結
合され、この突然変異から生ずる配座上の変化が１Ｒ１
０Ｆ１１により認識される部位ではなく、中和する部位
を破壊することを示唆している。ＥＩＡデータは、ＣＯ
Ｓトランスフェクタントからの生合成的にラベルされた
培地の免疫沈降分析により確証された（図５）。
年１２月８日に出願された米国特許出願第４４７７５９
号に記載されており、それはその全部を参考文献として
ここに引用する。５種の異なる抗体が各オンコスタチン
Ｍ突然変異体についてテストされた。変性オンコスタチ
ンＭ決定因子を検出する抗体４Ｒ１２Ｃ７の結合を、中
和するモノクローナル抗体１１Ｒ２Ｆ８のそれと比較す
る（図４）。組換えオンコスタチンＭ分子のＣ末端部分
から欠失するアミノ酸の数が増すにつれ、これらの構造
物上の、本来のエピトープに対する２種の抗体１Ｒ１０
Ｆ１１及び１１Ｒ２Ｆ８の反応性は低下する。アミノ酸
残基数１８３が欠失するとき、両者の抗体の活性は失わ
れ、これらの抗体により認識される三次構造が、分子の
Ｃ末端部分に在るアミノ酸をどうも含むことを暗示して
いる。調べられた一つを除くすべての突然変異構造物に
おいて、本来のオンコスタチンＭに対する２種の抗体が
同 中和する抗体によってではなく１Ｒ１０Ｆ１１により結
合され、この突然変異から生ずる配座上の変化が１Ｒ１
０Ｆ１１により認識される部位ではなく、中和する部位
を破壊することを示唆している。ＥＩＡデータは、ＣＯ
Ｓトランスフェクタントからの生合成的にラベルされた
培地の免疫沈降分析により確証された（図５）。
【００６７】 ンＭの両者と反応する抗体である１２Ｒ１３Ｄ７の結合
部位のマッピング（図１ ７が配列されたとき、追加の突然変異がアミノ酸１０８
に見出だされ、ロイシンをセリンに変化させ従ってこの
領域に１２Ｒ１３Ｄ７抗体の結合部位を設けた。
部位のマッピング（図１ ７が配列されたとき、追加の突然変異がアミノ酸１０８
に見出だされ、ロイシンをセリンに変化させ従ってこの
領域に１２Ｒ１３Ｄ７抗体の結合部位を設けた。
【００６８】Ｍ．抗オンコスタチンＭによる、カポジ肉
腫由来エイズ−ＫＳ細胞に対するオンコスタチンＭの成
長増強作用の阻害
腫由来エイズ−ＫＳ細胞に対するオンコスタチンＭの成
長増強作用の阻害
【００６９】カポジ肉腫に対するオンコスタチンＭの成
長増強活性を図６で説明する。精製したオンコスタチン
Ｍは、生体外で培養された、カポジ肉腫細胞系並びにＮ
１０７２、悪性縦隔リンパ腫に罹った患者の胸水から由
来する平滑筋細胞の細胞の成長を増大した。本発明の中
和するモノクローナル抗体１１Ｒ２Ｆ８は、カポジ肉腫
培養系に加えて、外因性オンコスタチンＭの成長増強活
性を９５％阻害した（図７）。
長増強活性を図６で説明する。精製したオンコスタチン
Ｍは、生体外で培養された、カポジ肉腫細胞系並びにＮ
１０７２、悪性縦隔リンパ腫に罹った患者の胸水から由
来する平滑筋細胞の細胞の成長を増大した。本発明の中
和するモノクローナル抗体１１Ｒ２Ｆ８は、カポジ肉腫
培養系に加えて、外因性オンコスタチンＭの成長増強活
性を９５％阻害した（図７）。
【００７０】ＨＴＬＶ−ＩＩ感染細胞系（＃３８）から
の調整された培地も又カポジ肉腫細胞の成長を増強する
（ナカムラら、１９８８、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２４２：４
２６−４３０）。モノクローナル抗体１１Ｒ２Ｆ８も又
カポジ肉腫に対するこの調整された培地の成長増強活性
を阻害する。図７に示すように、オンコスタチンＭ活性
の６０％の阻害が得られる。
の調整された培地も又カポジ肉腫細胞の成長を増強する
（ナカムラら、１９８８、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２４２：４
２６−４３０）。モノクローナル抗体１１Ｒ２Ｆ８も又
カポジ肉腫に対するこの調整された培地の成長増強活性
を阻害する。図７に示すように、オンコスタチンＭ活性
の６０％の阻害が得られる。
【００７１】非中和モノクローナル抗体１Ｒ１０Ｆ１１
は、何れのアッセイにおいてオンコスタチンＭの成長刺
激活性になんら作用しなかった（図７）。
は、何れのアッセイにおいてオンコスタチンＭの成長刺
激活性になんら作用しなかった（図７）。
【００７２】Ｎ．生物の寄託
【００７３】本発明を代表する下記の細胞系は、ｔｈｅ
Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏ
ｌｌｅｃｔｉｏｎ、Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、Ｍａｒｙｌａ
ｎｄに寄託され、表示した寄託番号を付された。
Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏ
ｌｌｅｃｔｉｏｎ、Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、Ｍａｒｙｌａ
ｎｄに寄託され、表示した寄託番号を付された。
【００７４】
【００７５】本発明は、寄託された細胞系により範囲を
制限されない。それは、寄託された態様が本発明の個々
の態様の単一の説明として考えられたものであり、機能
的に等しい全ての細胞系又は抗体は、本発明の範囲内で
あるからである。事実、本発明の種々の変法は、示され
記述されたものに加えて、前記の記述及び図から当業者
にとり明らかであろう。この変法は、請求の範囲の範囲
内に入ることを目的としている。
制限されない。それは、寄託された態様が本発明の個々
の態様の単一の説明として考えられたものであり、機能
的に等しい全ての細胞系又は抗体は、本発明の範囲内で
あるからである。事実、本発明の種々の変法は、示され
記述されたものに加えて、前記の記述及び図から当業者
にとり明らかであろう。この変法は、請求の範囲の範囲
内に入ることを目的としている。
【図１】図１は、ｃＤＮＡエンコードオンコスタチンＭ
により安定にトランスフェクションされたチャイニーズ
・ハムスター・オーバリー（「ＣＨＯ」）細胞系の上澄
み液からの３５Ｓ−メチオニン及び３５Ｓ−システイン
をラベルしたオンコスタチンＭの免疫沈降を示す。図１
Ａは、「本来」の代謝的にラベルされたオンコスタチン
Ｍ（代謝的にラベルされたＣＨＯトランスフェクタント
から集められた上澄み液）による一連の抗オンコスタチ
ンＭモノクローナル抗体の反応性を示す。図１Ｂは、モ
ノクローナル抗体とのインキュベーション前にＳＤＳ、
２−メルカプトエタノール及び煮沸による処理により変
性された、代謝的にラベルされたＣＨＯ細胞から集めら
れた上澄み液によるこれら同じ抗体の反応性を示す。レ
ーン１：ネガティブ・コントロール抗体；レーン２：１
Ｒ１０Ｆ１１；レーン３：３Ｒ９Ｄ９；レーン４：３Ｒ
１３Ｆ４；レーン５：４Ｒ１２Ｃ７；レーン６：１１Ｒ
２Ｆ８；レーン７：１２Ｒ１３Ｂ５；レーン８：１２Ｒ
１３Ｄ７；レーン９：１２Ｒ１９Ｅ３。
により安定にトランスフェクションされたチャイニーズ
・ハムスター・オーバリー（「ＣＨＯ」）細胞系の上澄
み液からの３５Ｓ−メチオニン及び３５Ｓ−システイン
をラベルしたオンコスタチンＭの免疫沈降を示す。図１
Ａは、「本来」の代謝的にラベルされたオンコスタチン
Ｍ（代謝的にラベルされたＣＨＯトランスフェクタント
から集められた上澄み液）による一連の抗オンコスタチ
ンＭモノクローナル抗体の反応性を示す。図１Ｂは、モ
ノクローナル抗体とのインキュベーション前にＳＤＳ、
２−メルカプトエタノール及び煮沸による処理により変
性された、代謝的にラベルされたＣＨＯ細胞から集めら
れた上澄み液によるこれら同じ抗体の反応性を示す。レ
ーン１：ネガティブ・コントロール抗体；レーン２：１
Ｒ１０Ｆ１１；レーン３：３Ｒ９Ｄ９；レーン４：３Ｒ
１３Ｆ４；レーン５：４Ｒ１２Ｃ７；レーン６：１１Ｒ
２Ｆ８；レーン７：１２Ｒ１３Ｂ５；レーン８：１２Ｒ
１３Ｄ７；レーン９：１２Ｒ１９Ｅ３。
【図２】図２は、Ａ３７５黒色腫細胞系に関する成長阻
害アッセイ（「ＧＩＡ」）の二つの異なる抗オンコスタ
チンＭモノクローナル抗体の中和する活性の検査からの
データを提供する。図２Ａは、種々の濃度の１１Ｒ２Ｆ
８の活性を示す。図２Ｂは、種々の濃度の１Ｒ１０Ｆ１
１の活性を示す。
害アッセイ（「ＧＩＡ」）の二つの異なる抗オンコスタ
チンＭモノクローナル抗体の中和する活性の検査からの
データを提供する。図２Ａは、種々の濃度の１１Ｒ２Ｆ
８の活性を示す。図２Ｂは、種々の濃度の１Ｒ１０Ｆ１
１の活性を示す。
【図３】図３は、放射受容体アッセイにおけるＨ２９８
１肺癌細胞系への１２５Ｉ−オンコスタチンＭの結合に
対する二三の抗オンコスタチンＭモノクローナル抗体の
効果を示す。
１肺癌細胞系への１２５Ｉ−オンコスタチンＭの結合に
対する二三の抗オンコスタチンＭモノクローナル抗体の
効果を示す。
【図４】図４は、アミノ酸の欠失又は変更を含む一連の
突然変異オンコスタチンＭ構造物によってトランスフェ
クションされたＣＯＳ細胞により分泌された二つの異な
る抗オンコスタチンＭモノクローナル抗体の結合をＥＩ
Ａにより検出して示す。データは、ＯＤ４６０における
全吸収単位として提供される。バックグラウンド結合
は、引かれなかった。この図において、「ｄｅｌ」は、
Ｃ末端から欠失された最後のアミノ酸を示し、一方アル
ファベットの字は、行なわれたアミノ酸の変更を示す。
突然変異オンコスタチンＭ構造物によってトランスフェ
クションされたＣＯＳ細胞により分泌された二つの異な
る抗オンコスタチンＭモノクローナル抗体の結合をＥＩ
Ａにより検出して示す。データは、ＯＤ４６０における
全吸収単位として提供される。バックグラウンド結合
は、引かれなかった。この図において、「ｄｅｌ」は、
Ｃ末端から欠失された最後のアミノ酸を示し、一方アル
ファベットの字は、行なわれたアミノ酸の変更を示す。
【図５】 より分泌された免疫沈降オンコスタチンＭモノクローナ
ル抗体の能力の比較を示す。レーン１：ネガティブ・コ
ントロール抗体；レーン２：１１Ｒ２Ｆ８；レーン３：
１２Ｒ１３Ｄ７。
ル抗体の能力の比較を示す。レーン１：ネガティブ・コ
ントロール抗体；レーン２：１１Ｒ２Ｆ８；レーン３：
１２Ｒ１３Ｄ７。
【図６】図６は、カポジ肉腫細胞系（白丸）並びに悪性
の縦隔リンパ腫に罹った患者の胸水から由来する平滑筋
細胞（Ｎ１０７２細胞）（黒丸）に対するオンコスタチ
ンＭの成長増強活性を示す。ＣＨＯ細胞に発現された組
換えオンコスタチンＭを示したように濃度を増加しつつ
加えた。
の縦隔リンパ腫に罹った患者の胸水から由来する平滑筋
細胞（Ｎ１０７２細胞）（黒丸）に対するオンコスタチ
ンＭの成長増強活性を示す。ＣＨＯ細胞に発現された組
換えオンコスタチンＭを示したように濃度を増加しつつ
加えた。
【図７】図７は、生体外で精製したオンコスタチンＭ
（黒い記号）又は＃３８ＨＴＬＶ−ＩＩ感染細胞系から
の調整された培地（「ＣＭ」）（白い記号）の何れかに
より処理されたカポジ肉腫細胞系の成長に対する抗オン
コスタチンＭモノクローナル抗体の効果を示す。１Ｒ１
０Ｆ１１（Ａａｂ）又は１１Ｒ２Ｆ８（Ｂａｂ）の何れ
かを、濃度を上げつつ精製したオンコスタチンＭ又は＃
３８調整培地（「ＣＭ」）の存在下培養した細胞に加え
た。
（黒い記号）又は＃３８ＨＴＬＶ−ＩＩ感染細胞系から
の調整された培地（「ＣＭ」）（白い記号）の何れかに
より処理されたカポジ肉腫細胞系の成長に対する抗オン
コスタチンＭモノクローナル抗体の効果を示す。１Ｒ１
０Ｆ１１（Ａａｂ）又は１１Ｒ２Ｆ８（Ｂａｂ）の何れ
かを、濃度を上げつつ精製したオンコスタチンＭ又は＃
３８調整培地（「ＣＭ」）の存在下培養した細胞に加え
た。
フロントページの続き (71)出願人 591120273 オンコジェン アメリカ合衆国ワシントン州 98121 シ アトルファースト アベニュー 3005 (72)発明者 シド ゼット サラフディン アメリカ合衆国カリフォルニア州 91030 サウスパサデナ レイモンディール ド ライブ 410 アパートメント 41 (72)発明者 シュージ ナカムラ アメリカ合衆国カリフォルニア州 91030 サウスパサデナ レイモンディール ド ライブ 400 アパートメント 48 (72)発明者 ロバート シー ガロ アメリカ合衆国メリーランド州 20817 ベセスダソーンデン テラス 3513 (72)発明者 スーザン エフ ラドカ アメリカ合衆国ワシントン州 98103 シ アトルナンバー 203 ノース サーティ フイフス ストリート 909 (72)発明者 ピーター エス リンスレイ アメリカ合衆国ワシントン州 98119 シ アトルナインス アベニュー ウエスト 2430 (72)発明者 モハメド ショーヤブ アメリカ合衆国ワシントン州 98119 シ アトルウエストモント ウエー 2405
Claims (6)
- 【請求項１】 オンコスタチンＭと反応性を有する抗原
結合部位を有する、カポジ（Ｋａｐｏｓｉ）細胞成長阻
害活性抗体又はそのフラグメントを有効成分として含有
するカポジ肉腫細胞の成長阻害剤。 - 【請求項２】 抗体又はそのフラグメントがモノクロー
ナル抗体又はそのフラグメントである請求項１の剤。 - 【請求項３】 モノクローナル抗体フラグメントがＦａ
ｂ、Ｆ（ａｂ’）２又はＦｖフラグメントである請求項
２の剤。 - 【請求項４】 抗体又は抗体のフラグメントがラベル、
トキシン又は成長因子に複合している請求項１−３の何
れか一つの項の剤。 - 【請求項５】 該抗体又はそのフラグメントの抗原結合
部位が、モノクローナル抗体１１Ｒ２Ｆ８の免疫特異結
合を競合的に阻害できる請求項１−４の何れか一つの項
の剤。 - 【請求項６】 抗体又はそのフラグメントがキメラ抗体
又はそのフラグメントである請求項１−５の何れか一つ
の項の剤。
Applications Claiming Priority (2)
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|---|---|---|---|
| US50214190A | 1990-03-29 | 1990-03-29 | |
| US502141 | 1990-03-29 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH06340551A true JPH06340551A (ja) | 1994-12-13 |
| JP3076926B2 JP3076926B2 (ja) | 2000-08-14 |
Family
ID=23996528
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP03132406A Expired - Fee Related JP3076926B2 (ja) | 1990-03-29 | 1991-03-27 | カポジ肉腫の成長阻害剤 |
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|---|---|
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| JP (1) | JP3076926B2 (ja) |
| KR (1) | KR910016344A (ja) |
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| CA (1) | CA2039230C (ja) |
| DE (1) | DE69126060T2 (ja) |
| DK (1) | DK0450472T3 (ja) |
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| GR (1) | GR3024336T3 (ja) |
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|---|---|---|---|---|
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| CA2388517A1 (en) * | 1999-11-16 | 2001-05-25 | The General Hospital Corporation | Compositions and methods for regulating tumor-associated antigen expression |
| WO2016046738A1 (en) * | 2014-09-24 | 2016-03-31 | Università Degli Studi Di Padova | Composition to induce bone marrow stem cell mobilization |
| TWI904261B (zh) | 2020-10-19 | 2025-11-11 | 美商碩騰服務公司 | 犬及貓抑瘤素Ｍ受體β之抗體及其用途 |
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
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-
1991
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- 1991-03-26 AT AT91104816T patent/ATE153075T1/de not_active IP Right Cessation
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- 1991-03-28 KR KR1019910005027A patent/KR910016344A/ko not_active Ceased
-
1997
- 1997-07-31 GR GR970401981T patent/GR3024336T3/el unknown
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