JPH06343473A - ブリーチング除草剤耐性植物の製造 - Google Patents
ブリーチング除草剤耐性植物の製造Info
- Publication number
- JPH06343473A JPH06343473A JP5163926A JP16392693A JPH06343473A JP H06343473 A JPH06343473 A JP H06343473A JP 5163926 A JP5163926 A JP 5163926A JP 16392693 A JP16392693 A JP 16392693A JP H06343473 A JPH06343473 A JP H06343473A
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- Japan
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- phytoene
- plant
- gene
- desaturase
- carotene
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- Breeding Of Plants And Reproduction By Means Of Culturing (AREA)
- Agricultural Chemicals And Associated Chemicals (AREA)
Abstract
(57)【要約】
【目的】 ブリーチング除草剤に対して耐性を有する植
物の製造に関する技術を提供する。 【構成】 フィトエンをζ‐カロチンを経てリコピンに
変換する酵素活性を有するポリペプチド（フィトエンデ
サチュラーゼ）をコードするＤＮＡ配列を、その遺伝情
報が発現可能な状態で植物に導入することを特徴とす
る、ζ‐カロチンデサチュラーゼ阻害除草剤に対する耐
性植物の作出法。フィトエンをリコピンに変換する酵素
活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ配列から
なる、ζ‐カロチンデサチュラーゼ阻害除草剤に対する
形質転換確認用マーカー。 【効果】 植物のフィトエンデサチュラーゼを阻害する
除草剤だけでなく植物のζ‐カロチンデサチュラーゼを
阻害する除草剤に対する耐性を植物に与えることができ
るとともに、これらの除草剤を形質転換時のマーカーと
して使用することができる。
物の製造に関する技術を提供する。 【構成】 フィトエンをζ‐カロチンを経てリコピンに
変換する酵素活性を有するポリペプチド（フィトエンデ
サチュラーゼ）をコードするＤＮＡ配列を、その遺伝情
報が発現可能な状態で植物に導入することを特徴とす
る、ζ‐カロチンデサチュラーゼ阻害除草剤に対する耐
性植物の作出法。フィトエンをリコピンに変換する酵素
活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ配列から
なる、ζ‐カロチンデサチュラーゼ阻害除草剤に対する
形質転換確認用マーカー。 【効果】 植物のフィトエンデサチュラーゼを阻害する
除草剤だけでなく植物のζ‐カロチンデサチュラーゼを
阻害する除草剤に対する耐性を植物に与えることができ
るとともに、これらの除草剤を形質転換時のマーカーと
して使用することができる。
Description
【０００１】〔発明の背景〕
【産業上の利用分野】本発明は、非光合成細菌であるエ
ルウィニア（Ｅｒｗｉｎｉａ）由来のフィトエンデサチ
ュラーゼ（ｃｒｔＩ）遺伝子を利用したブリーチング除
草剤耐性植物の製造技術に関するものである。更に詳細
には、本発明は、ノルフルラゾンやフルリドンのような
植物のフィトエンデサチュラーゼを阻害する除草剤だけ
でなく、ＳＡＮ３８０ＨやＪ８５２等の植物のζ‐カロ
チンデサチュラーゼを阻害する除草剤に対して耐性を有
する植物の作出方法、ならびにＥｒｗｉｎｉａ由来のフ
ィトエンデサチュラーゼ（ｃｒｔＩ）遺伝子の、植物の
形質転換におけるマーカー遺伝子としての使用に関する
ものである。
ルウィニア（Ｅｒｗｉｎｉａ）由来のフィトエンデサチ
ュラーゼ（ｃｒｔＩ）遺伝子を利用したブリーチング除
草剤耐性植物の製造技術に関するものである。更に詳細
には、本発明は、ノルフルラゾンやフルリドンのような
植物のフィトエンデサチュラーゼを阻害する除草剤だけ
でなく、ＳＡＮ３８０ＨやＪ８５２等の植物のζ‐カロ
チンデサチュラーゼを阻害する除草剤に対して耐性を有
する植物の作出方法、ならびにＥｒｗｉｎｉａ由来のフ
ィトエンデサチュラーゼ（ｃｒｔＩ）遺伝子の、植物の
形質転換におけるマーカー遺伝子としての使用に関する
ものである。
【０００２】
【従来の技術】カロチノイド（ｃａｒｏｔｅｎｏｉｄ）
は、黄〜橙〜赤色色素であり、自然界に最も広く存在す
る色素である。たとえば、魚類、鳥類、昆虫類およびそ
の他の水産動物の中には、美しい色彩を呈するものが多
いが、これらの多くはカロチノイド色素に起因している
（松野隆男，幹渉．動物におけるカロチノイドの生理機
能と生物活性、化学と生物，Ｖｏｌ．２８，No. ４，
ｐ．２１９−２２７（１９９０）参照）。カロチノイド
は、また、多くの生物で重要な生理的役割を果たしてい
る。植物や光合成微生物では、カロチノイドは光合成の
補助色素である他、光酸化的障害から組織や細胞を保護
する機能を担っている（Rau, W. "Functionof caroteno
oids other than in photosynthesis". Plant Pigment
s. London, Academic Press, 1988, p.231-255. (Goodw
in, T. W. ed. ）参照）。動物では、ビタミンＡの前駆
体である他、種々の癌に対する予防効果や増殖抑制作用
があることが知られてきており、健康食品としても注目
されつつある（末木一夫、β‐カロテン−解明すすむ生
理活性、食品と開発，Ｖｏｌ．２４，No. １１，ｐ．６
１−６５（１９９０）参照）。光合成を行なわない微生
物においても、カロチノイド色素を持つものがあるが、
これは、光酸化反応から細胞を保護する役割を持つので
はないかと推定されている。カロチノイドは、メバロン
酸を出発物質として、ステロイドやテルペノイドと途中
まで共通なイソプレノイド生合成経路によって合成され
る。イソプレン基本生合成系によって生じたＣ15のファ
ルネシルピロリン酸（ＥＰＰ）は、Ｃ５のイソペンテニ
ルピロリン酸（ＩＰＰ）と縮合することにより、Ｃ20の
ゲラニルゲラニルピロリン酸（ＧＧＰＰ）が作られる。
次に、２分子のＧＧＰＰが縮合して、最初のカロチノイ
ドである無色のフィトエン（phytoene）が合成される。
フィトエンは、一連の不飽和反応により、フィトフルエ
ン（phytofluene ）、ζ‐カロチン（ζ‐carotene）、
ノイロスポレン（neurosporene）、リコピン（lycopen
e）に変換される。このリコピンは環化反応によりβ‐
カロチン（β‐carotene）に変換され、さらに、水酸基
やケト基などが導入され、種々のキサントフィルと総称
されるカロチノイドが合成されると考えられている（Br
itton, G. "Biosynthesis of carotenooids". Plant Pi
gments. London, Academic Press, 1988, p.133-182.
(Goodwin, T. W. ed.) 参照）。上記したように、カロ
チノイドは生物的に重要な働きをするにもかかわらず、
カロチノイドの生合成を担う遺伝子や酵素の知見は最近
までごく限られたものであった。これは、カロチノイド
の生合成に関与する酵素が精製するには不安定な膜酵素
であったため、酵素の機能や構造の解析が不可能であ
り、その結果として、これをコードする遺伝子のクロー
ニングができなかったためである。最近になって本発明
者らは、植物常在細菌Ｅｒｗｉｎｉａ ｕｒｅｄｏｖｏ
ｒａのカロチノイド生合成遺伝子群を、その色調を指標
に大腸菌にクローニングし、これらの遺伝子のいろいろ
な組み合わせを大腸菌で発現させ、大腸菌に蓄積したカ
ロチノイド色素を解析するという独自の手法により、Ｅ
ｒ． ｕｒｅｄｏｖｏｒａのカロチノイドの生合成経路
を遺伝子および酵素のレベルで世界で始めて解明した。
その結果、Ｅｒ． ｕｒｅｄｏｖｏｒａのカロチノイド
生合成経路は、フィトエン、β‐カロチン、リコピン、
ゼアキサンチンなどの基本的カロチノイドの生合成経路
であることを明らかにした（Misawa, N.; Nakagawa,
M.; Kobayashi, K.;Yamano, S.;Izawa, Y.;Nakamura.
K.;Harashima k. Elucidation of the Erwiniauredovor
a carotenoid biosynthetic pathway by functional an
alysis of gene products expressed in Escherichia c
oli. Journal of Bacteriology, Vol.172, No.12, p.67
04-6712 (1992)、および、本発明者らによる特許出願特
願平３−５８７８６号公報（特願平２−５３２５５号明
細書）：「カロチノイドの合成に有用なＤＮＡ鎖」）。
その後、Ａｕｓｉｃｈらは、同じＥｒｗｉｎｉａ属のＥ
ｒｗｉｎｉａ ｈｅｒｂｉｃｏｌａのカロチノイド生合
成経路がＥｒ． ｕｒｅｄｏｖｏｒａのものと同じであ
ることを明らかにした（ＷＯ９１／１３０７８号公報参
照）。本発明者らは、また、Ｅｒ． ｕｒｅｄｏｖｏｒ
ａのカロチノイド生合成遺伝子群を利用することによ
り、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）、エ
タノール生産細菌Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ ｍｏｂｉｌｉ
ｓ、植物病原細菌Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍ
ｅｆａｃｉｅｎｓなどの微生物に、フィトエン、β‐カ
ロチン、リコピン、ゼアキサンチンなどの基本カロチノ
イドを作らせることを可能にした（Misawa, N.; Yaman
o, S.; Ikenaga, H. Production of β‐carotene in Z
ymomonas mobilis and Agrobacterium tumefaciens by
introduction of the biosynthesis genes from Erwini
a uredovora. Applied andEnvironmental Microbiolog
y, Vol.57, No.6, p.1847-1849 (1991)、および上記のJ
ournal of Bacteriology 、および本発明者らによる前
記の特許出願明細書）。Ｅｒ． ｕｒｅｄｏｖｏｒａの
カロチノイド生合成遺伝子群を利用して、これらのカロ
チノイドを大腸菌に合成させ、解析するという上記の技
術は、また、最もよく進んだ大腸菌の遺伝子操作実験の
系を、カロチノイドの生合成研究に適用できることを意
味した。このことは、生合成酵素の不安定性のために、
植物などの生物において今まで遅々として進まなかった
遺伝子および酵素のレベルでのカロチノイドの生合成研
究を一気に進めることが可能なことを意味した。たとえ
ば、次に示すようなこともその例である。Ｅｒ． ｕｒ
ｅｄｏｖｏｒａのｃｒｔＥとｃｒｔＢ遺伝子を保持する
大腸菌は、フィトエンを合成することが知られており、
光合成細菌Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ ｃａｐｓｕｌａｔ
ｕｓおよびシアノバクテリアＳｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕ
ｓ ＰＣＣ７９４２においては、突然変異株の利用によ
り、フィトエンデサチュラーゼ（ｐｈｙｔｏｅｎｅ ｄ
ｅｓａｔｕｒａｓｅ）をコードすると考えられる遺伝子
が取得されていた。前者の微生物の遺伝子産物の基質は
フィトエンであるが、反応産物は明かにされていなかっ
た。後者の微生物においては、基質も反応産物も明らか
にされていなかった。Ｌｉｎｄｅｎらは、これらの遺伝
子をｃｒｔＥとｃｒｔＢを保持する大腸菌に導入し、合
成されたカロチノイドをＨＰＬＣで解析することによ
り、光合成細菌のフィトエンデサチュラーゼ（ｃｒｔＩ
遺伝子産物、ＣｒｔＩ）がノイロスポレンを、またシア
ノバクテリアのフィトエンデサチュラーゼ（Ｐｄｓ）が
ζ‐カロチンを、共にフィトエンを基質として合成する
ことを見出した（Linden, H.; Misawa, N. ;Chamovitz,
D.; Pecker, I; Hirschberg, J.;Sandmann, G. Functi
onal complementation in Escherichia coli of differ
ent Phytoene desaturase genes andanalysis of accum
ulated carotenes. Z. Naturforsch., Vol. 46c, p.104
5-1051 (1991) 参照）。また、Ｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃ
ｕｓ ＰＣＣ７９４２のフィトエンデサチュラーゼ遺伝
子を手掛りとして得られたトマト果実のフィトエンデサ
チュラーゼ遺伝子（ｐｄｓ）も、また、フィトエンを基
質としてζ‐カロチンを合成することが、上記の系を用
いて明かにされた（Pecker, I.; Chamovitz, D.; Linde
n, H.; Sandmann, G.; Hirschberg. J. A Single polyp
eptide catalyzing the conversion of phytoene to ζ
‐carotene is transcriptinally regulated during to
mato fruit ripning. Proc. Natl. Sci. USA, Vol.89,
p.4962-4966 (1992)参照）。植物のフィトエンデサチュ
ラーゼが、フィトエンを基質としてζ‐カロチンまでし
か合成できないので、植物内には、ζ‐カロチンからリ
コピンを合成する別の酵素（ζ‐カロチンデサチュラー
ゼ）が存在するはずである。Ｌｉｎｄｅｎらは、この酵
素をコードする遺伝子（ｚｄｓ）を、Ｅｒ． ｕｒｅｄ
ｏｖｏｒａのカロチノイド生合成遺伝子等を利用してシ
アノバクテリア Ａｎａｂａｅｎａ ＰＣＣ７１２０よ
りクローニングし、この遺伝子産物がζ‐カロチンから
リコピンを合成する反応を触媒することを明かにした
（Linden, H.;Vioque, A.; Sandmann, G. Isolation of
a carotenoid biosynthesis gene coding for ζ‐car
otene desaturase from Anabaena PCC7120 by heterolo
gous complementation. FEMS Microbiol. Lett., Vol.
106, p.99-103 (1993) 参照）。しかし、この遺伝子の
塩基配列は未報告である。
は、黄〜橙〜赤色色素であり、自然界に最も広く存在す
る色素である。たとえば、魚類、鳥類、昆虫類およびそ
の他の水産動物の中には、美しい色彩を呈するものが多
いが、これらの多くはカロチノイド色素に起因している
（松野隆男，幹渉．動物におけるカロチノイドの生理機
能と生物活性、化学と生物，Ｖｏｌ．２８，No. ４，
ｐ．２１９−２２７（１９９０）参照）。カロチノイド
は、また、多くの生物で重要な生理的役割を果たしてい
る。植物や光合成微生物では、カロチノイドは光合成の
補助色素である他、光酸化的障害から組織や細胞を保護
する機能を担っている（Rau, W. "Functionof caroteno
oids other than in photosynthesis". Plant Pigment
s. London, Academic Press, 1988, p.231-255. (Goodw
in, T. W. ed. ）参照）。動物では、ビタミンＡの前駆
体である他、種々の癌に対する予防効果や増殖抑制作用
があることが知られてきており、健康食品としても注目
されつつある（末木一夫、β‐カロテン−解明すすむ生
理活性、食品と開発，Ｖｏｌ．２４，No. １１，ｐ．６
１−６５（１９９０）参照）。光合成を行なわない微生
物においても、カロチノイド色素を持つものがあるが、
これは、光酸化反応から細胞を保護する役割を持つので
はないかと推定されている。カロチノイドは、メバロン
酸を出発物質として、ステロイドやテルペノイドと途中
まで共通なイソプレノイド生合成経路によって合成され
る。イソプレン基本生合成系によって生じたＣ15のファ
ルネシルピロリン酸（ＥＰＰ）は、Ｃ５のイソペンテニ
ルピロリン酸（ＩＰＰ）と縮合することにより、Ｃ20の
ゲラニルゲラニルピロリン酸（ＧＧＰＰ）が作られる。
次に、２分子のＧＧＰＰが縮合して、最初のカロチノイ
ドである無色のフィトエン（phytoene）が合成される。
フィトエンは、一連の不飽和反応により、フィトフルエ
ン（phytofluene ）、ζ‐カロチン（ζ‐carotene）、
ノイロスポレン（neurosporene）、リコピン（lycopen
e）に変換される。このリコピンは環化反応によりβ‐
カロチン（β‐carotene）に変換され、さらに、水酸基
やケト基などが導入され、種々のキサントフィルと総称
されるカロチノイドが合成されると考えられている（Br
itton, G. "Biosynthesis of carotenooids". Plant Pi
gments. London, Academic Press, 1988, p.133-182.
(Goodwin, T. W. ed.) 参照）。上記したように、カロ
チノイドは生物的に重要な働きをするにもかかわらず、
カロチノイドの生合成を担う遺伝子や酵素の知見は最近
までごく限られたものであった。これは、カロチノイド
の生合成に関与する酵素が精製するには不安定な膜酵素
であったため、酵素の機能や構造の解析が不可能であ
り、その結果として、これをコードする遺伝子のクロー
ニングができなかったためである。最近になって本発明
者らは、植物常在細菌Ｅｒｗｉｎｉａ ｕｒｅｄｏｖｏ
ｒａのカロチノイド生合成遺伝子群を、その色調を指標
に大腸菌にクローニングし、これらの遺伝子のいろいろ
な組み合わせを大腸菌で発現させ、大腸菌に蓄積したカ
ロチノイド色素を解析するという独自の手法により、Ｅ
ｒ． ｕｒｅｄｏｖｏｒａのカロチノイドの生合成経路
を遺伝子および酵素のレベルで世界で始めて解明した。
その結果、Ｅｒ． ｕｒｅｄｏｖｏｒａのカロチノイド
生合成経路は、フィトエン、β‐カロチン、リコピン、
ゼアキサンチンなどの基本的カロチノイドの生合成経路
であることを明らかにした（Misawa, N.; Nakagawa,
M.; Kobayashi, K.;Yamano, S.;Izawa, Y.;Nakamura.
K.;Harashima k. Elucidation of the Erwiniauredovor
a carotenoid biosynthetic pathway by functional an
alysis of gene products expressed in Escherichia c
oli. Journal of Bacteriology, Vol.172, No.12, p.67
04-6712 (1992)、および、本発明者らによる特許出願特
願平３−５８７８６号公報（特願平２−５３２５５号明
細書）：「カロチノイドの合成に有用なＤＮＡ鎖」）。
その後、Ａｕｓｉｃｈらは、同じＥｒｗｉｎｉａ属のＥ
ｒｗｉｎｉａ ｈｅｒｂｉｃｏｌａのカロチノイド生合
成経路がＥｒ． ｕｒｅｄｏｖｏｒａのものと同じであ
ることを明らかにした（ＷＯ９１／１３０７８号公報参
照）。本発明者らは、また、Ｅｒ． ｕｒｅｄｏｖｏｒ
ａのカロチノイド生合成遺伝子群を利用することによ
り、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）、エ
タノール生産細菌Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ ｍｏｂｉｌｉ
ｓ、植物病原細菌Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍ
ｅｆａｃｉｅｎｓなどの微生物に、フィトエン、β‐カ
ロチン、リコピン、ゼアキサンチンなどの基本カロチノ
イドを作らせることを可能にした（Misawa, N.; Yaman
o, S.; Ikenaga, H. Production of β‐carotene in Z
ymomonas mobilis and Agrobacterium tumefaciens by
introduction of the biosynthesis genes from Erwini
a uredovora. Applied andEnvironmental Microbiolog
y, Vol.57, No.6, p.1847-1849 (1991)、および上記のJ
ournal of Bacteriology 、および本発明者らによる前
記の特許出願明細書）。Ｅｒ． ｕｒｅｄｏｖｏｒａの
カロチノイド生合成遺伝子群を利用して、これらのカロ
チノイドを大腸菌に合成させ、解析するという上記の技
術は、また、最もよく進んだ大腸菌の遺伝子操作実験の
系を、カロチノイドの生合成研究に適用できることを意
味した。このことは、生合成酵素の不安定性のために、
植物などの生物において今まで遅々として進まなかった
遺伝子および酵素のレベルでのカロチノイドの生合成研
究を一気に進めることが可能なことを意味した。たとえ
ば、次に示すようなこともその例である。Ｅｒ． ｕｒ
ｅｄｏｖｏｒａのｃｒｔＥとｃｒｔＢ遺伝子を保持する
大腸菌は、フィトエンを合成することが知られており、
光合成細菌Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ ｃａｐｓｕｌａｔ
ｕｓおよびシアノバクテリアＳｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕ
ｓ ＰＣＣ７９４２においては、突然変異株の利用によ
り、フィトエンデサチュラーゼ（ｐｈｙｔｏｅｎｅ ｄ
ｅｓａｔｕｒａｓｅ）をコードすると考えられる遺伝子
が取得されていた。前者の微生物の遺伝子産物の基質は
フィトエンであるが、反応産物は明かにされていなかっ
た。後者の微生物においては、基質も反応産物も明らか
にされていなかった。Ｌｉｎｄｅｎらは、これらの遺伝
子をｃｒｔＥとｃｒｔＢを保持する大腸菌に導入し、合
成されたカロチノイドをＨＰＬＣで解析することによ
り、光合成細菌のフィトエンデサチュラーゼ（ｃｒｔＩ
遺伝子産物、ＣｒｔＩ）がノイロスポレンを、またシア
ノバクテリアのフィトエンデサチュラーゼ（Ｐｄｓ）が
ζ‐カロチンを、共にフィトエンを基質として合成する
ことを見出した（Linden, H.; Misawa, N. ;Chamovitz,
D.; Pecker, I; Hirschberg, J.;Sandmann, G. Functi
onal complementation in Escherichia coli of differ
ent Phytoene desaturase genes andanalysis of accum
ulated carotenes. Z. Naturforsch., Vol. 46c, p.104
5-1051 (1991) 参照）。また、Ｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃ
ｕｓ ＰＣＣ７９４２のフィトエンデサチュラーゼ遺伝
子を手掛りとして得られたトマト果実のフィトエンデサ
チュラーゼ遺伝子（ｐｄｓ）も、また、フィトエンを基
質としてζ‐カロチンを合成することが、上記の系を用
いて明かにされた（Pecker, I.; Chamovitz, D.; Linde
n, H.; Sandmann, G.; Hirschberg. J. A Single polyp
eptide catalyzing the conversion of phytoene to ζ
‐carotene is transcriptinally regulated during to
mato fruit ripning. Proc. Natl. Sci. USA, Vol.89,
p.4962-4966 (1992)参照）。植物のフィトエンデサチュ
ラーゼが、フィトエンを基質としてζ‐カロチンまでし
か合成できないので、植物内には、ζ‐カロチンからリ
コピンを合成する別の酵素（ζ‐カロチンデサチュラー
ゼ）が存在するはずである。Ｌｉｎｄｅｎらは、この酵
素をコードする遺伝子（ｚｄｓ）を、Ｅｒ． ｕｒｅｄ
ｏｖｏｒａのカロチノイド生合成遺伝子等を利用してシ
アノバクテリア Ａｎａｂａｅｎａ ＰＣＣ７１２０よ
りクローニングし、この遺伝子産物がζ‐カロチンから
リコピンを合成する反応を触媒することを明かにした
（Linden, H.;Vioque, A.; Sandmann, G. Isolation of
a carotenoid biosynthesis gene coding for ζ‐car
otene desaturase from Anabaena PCC7120 by heterolo
gous complementation. FEMS Microbiol. Lett., Vol.
106, p.99-103 (1993) 参照）。しかし、この遺伝子の
塩基配列は未報告である。
【０００３】〔発明の概要〕
【発明が解決しようとする課題】図１は、植物およびシ
アノバクテリアとＥｒｗｉｎｉａにおけるβ‐カロチン
までの生合成経路を遺伝子および酵素（遺伝子産物）の
レベルで、以上述べてきたことを含めて、現在までに明
かにされた知見をまとめたものである。ＧＧＰＰシンタ
ーゼとフィトエンシンターゼは、植物（あるいはシアノ
バクテリア）とＥｒｗｉｎｉａ間で、全く同じ機能を示
し（Sandmann, G.; Misawa, N. New functional assign
ment of the carotenogenic genes crtB and crtE with
constructs of these genes from Erwinia species. F
EMS Microbiology Letters, Vol.90, p.253-258 (1992)
参照）、アミノ酸配列レベルでも、３０％前後のアイデ
ンティーという意義深いホモロジィーを示した。したが
って、ＧＧＰＰシンターゼとフィトエンシンターゼは、
種を超えて良く保存されているようである。一方、フィ
トエンデサチュラーゼにおいては、植物（あるいはシア
ノバクテリア）とＥｒｗｉｎｉａ間で、その機能は異な
っている、すなわち、前者のフィトエンデサチュラーゼ
が、フィトエンを基質としてζ‐カロチンまでしか合成
できないのに対して、後者のフィトエンデサチュラーゼ
ＣｒｔＩはフィトエンを基質としてリコピンまで合成す
ることができる。アミノ酸配列レベルでも、両者のフィ
トエンデサチュラーゼにホモロジーは一部のＮ‐末領域
を除いて見出されない。また、前述したように、両者の
フィトエンデサチュラーゼの機能は、光合成細菌のもの
とも異なっていることから、本酵素は多様性を獲得して
いると考えられる。植物（あるいはシアノバクテリア）
のフィトエンデサチュラーゼは、ノルフルラゾン（norf
lurazon ）やフルリドン（fluridon）等のブリーチング
除草剤と呼ばれる除草剤の作用部位である（Sandmann,
G; Boger, P."Inhibition of carotenoid biosynthesis
by herbicides". Target Sites of Herbicide Action.
Boca Raton, FL: CRC Press, 1989, p.25-44. (Boger,
P.; Sandmann, G. eds ）参照）。ノルフルラゾンやフ
ルリドンは酵素を直接に攻撃する非競合阻害剤（non-co
mpetitive inhibitor ）であることが知られている。Ｅ
ｒｗｉｎｉａのフィトエンデサチュラーゼＣｒｔＩは、
植物（あるいはシアノバクテリア）のものと、前述した
ように、機能や構造において異なっているので、これら
のブリーチング除草剤に抵抗性であると予想することが
できる。事実、Ａｕｓｉｃｈらは、Ｅｒｗｉｎｉａ ｈ
ｅｒｂｉｃｏｌａのフィトエンデサチュラーゼ遺伝子ｃ
ｒｔＩを、葉緑体の移行に必要なトランジットペプチド
配列を付加してタバコに導入することにより、０．８μ
ｇ／ｍｌ（２．６μＭ）のノルフルラゾンを含む培地で
正常に生育するタバコ形形質転換体を得たと記述してい
る（前記ＷＯ９１／１３０７８号公報参照）。ただ、こ
の公報では、ノルフルラゾンを含む培地で正常に生育す
るタバコ形質転換体において、Ｅｒ． ｈｅｒｂｉｃｏ
ｌａのフィトエンデサチュラーゼ遺伝子ｃｒｔＩがタバ
コ染色体に組み込まれ、その転写、翻訳が行われている
ということや、合成されたｃｒｔＩ遺伝子産物がタバコ
葉の葉緑体に輸送され、トランジットペプチドがプロセ
スされていることが実験的に確認されていないので、形
質転換体だと考えられたタバコが、実際は、順化または
順養によるノルフルラゾン自然抵抗性株であった可能性
がある。事実、本発明者らは、３μＭ濃度のノルフルラ
ゾンを含む培地では、タバコｉｎ ｖｉｔｒｏ植物が正
常に生育できるようになる場合があることを実験的に確
認している。一方、ＳＡＮ３８０ＨやＪ８５２等のブリ
ーチング除草剤は、ζ‐カロチンからリコピンまでのデ
サチュレーション（脱水素）反応を阻害する除草剤であ
ることが知られている（Boger, P.; Sandmann, G. "Mod
ern herbicides affecting typical plant processes".
Chemistry of Plant Protection. Vol. 6. SpringerPu
bl., 1990, p.173-216. (Bowers, W.S.; Ebing, W., Ma
rtin, D., Wegler, R. eds ）参照）。ｉｎ ｖｉｖ
ｏ、ｉｎ ｖｉｔｒｏ共に、ＳＡＮ３８０ＨまたはＪ８
５２で処理した植物体はζ‐カロチンを蓄積するように
なるので、これらはζ‐カロチンデサチュラーゼ酵素を
直接に攻撃する除草剤であると考えられている。ζ‐カ
ロチンデサチュラーゼを阻害する除草剤に対するＥｒｗ
ｉｎｉａのフィトエンデサチュラーゼｃｒｔＩを導入し
た植物体の抵抗性に関しては、前述したように、最近、
ようやく、シアノバクテリアからζ‐カロチンデサチュ
ラーゼをコードする遺伝子がクローニングされたばかり
であり、そのアミノ酸配列がまだ明かにされていないこ
とや、この抵抗性に関する研究例が現在までに全く無い
ことから、ＥｒｗｉｎｉａのｃｒｔＩ遺伝子を利用し
て、ζ‐カロチンデサチュラーゼ阻害剤に対する抵抗性
を植物に与えられるかどうかは全くわからないのが現状
であった。本発明は、上述のような点に鑑み、ブリーチ
ング除草剤に対して耐性を有する植物の製造に関する技
術を提供することを目的とするものである。
アノバクテリアとＥｒｗｉｎｉａにおけるβ‐カロチン
までの生合成経路を遺伝子および酵素（遺伝子産物）の
レベルで、以上述べてきたことを含めて、現在までに明
かにされた知見をまとめたものである。ＧＧＰＰシンタ
ーゼとフィトエンシンターゼは、植物（あるいはシアノ
バクテリア）とＥｒｗｉｎｉａ間で、全く同じ機能を示
し（Sandmann, G.; Misawa, N. New functional assign
ment of the carotenogenic genes crtB and crtE with
constructs of these genes from Erwinia species. F
EMS Microbiology Letters, Vol.90, p.253-258 (1992)
参照）、アミノ酸配列レベルでも、３０％前後のアイデ
ンティーという意義深いホモロジィーを示した。したが
って、ＧＧＰＰシンターゼとフィトエンシンターゼは、
種を超えて良く保存されているようである。一方、フィ
トエンデサチュラーゼにおいては、植物（あるいはシア
ノバクテリア）とＥｒｗｉｎｉａ間で、その機能は異な
っている、すなわち、前者のフィトエンデサチュラーゼ
が、フィトエンを基質としてζ‐カロチンまでしか合成
できないのに対して、後者のフィトエンデサチュラーゼ
ＣｒｔＩはフィトエンを基質としてリコピンまで合成す
ることができる。アミノ酸配列レベルでも、両者のフィ
トエンデサチュラーゼにホモロジーは一部のＮ‐末領域
を除いて見出されない。また、前述したように、両者の
フィトエンデサチュラーゼの機能は、光合成細菌のもの
とも異なっていることから、本酵素は多様性を獲得して
いると考えられる。植物（あるいはシアノバクテリア）
のフィトエンデサチュラーゼは、ノルフルラゾン（norf
lurazon ）やフルリドン（fluridon）等のブリーチング
除草剤と呼ばれる除草剤の作用部位である（Sandmann,
G; Boger, P."Inhibition of carotenoid biosynthesis
by herbicides". Target Sites of Herbicide Action.
Boca Raton, FL: CRC Press, 1989, p.25-44. (Boger,
P.; Sandmann, G. eds ）参照）。ノルフルラゾンやフ
ルリドンは酵素を直接に攻撃する非競合阻害剤（non-co
mpetitive inhibitor ）であることが知られている。Ｅ
ｒｗｉｎｉａのフィトエンデサチュラーゼＣｒｔＩは、
植物（あるいはシアノバクテリア）のものと、前述した
ように、機能や構造において異なっているので、これら
のブリーチング除草剤に抵抗性であると予想することが
できる。事実、Ａｕｓｉｃｈらは、Ｅｒｗｉｎｉａ ｈ
ｅｒｂｉｃｏｌａのフィトエンデサチュラーゼ遺伝子ｃ
ｒｔＩを、葉緑体の移行に必要なトランジットペプチド
配列を付加してタバコに導入することにより、０．８μ
ｇ／ｍｌ（２．６μＭ）のノルフルラゾンを含む培地で
正常に生育するタバコ形形質転換体を得たと記述してい
る（前記ＷＯ９１／１３０７８号公報参照）。ただ、こ
の公報では、ノルフルラゾンを含む培地で正常に生育す
るタバコ形質転換体において、Ｅｒ． ｈｅｒｂｉｃｏ
ｌａのフィトエンデサチュラーゼ遺伝子ｃｒｔＩがタバ
コ染色体に組み込まれ、その転写、翻訳が行われている
ということや、合成されたｃｒｔＩ遺伝子産物がタバコ
葉の葉緑体に輸送され、トランジットペプチドがプロセ
スされていることが実験的に確認されていないので、形
質転換体だと考えられたタバコが、実際は、順化または
順養によるノルフルラゾン自然抵抗性株であった可能性
がある。事実、本発明者らは、３μＭ濃度のノルフルラ
ゾンを含む培地では、タバコｉｎ ｖｉｔｒｏ植物が正
常に生育できるようになる場合があることを実験的に確
認している。一方、ＳＡＮ３８０ＨやＪ８５２等のブリ
ーチング除草剤は、ζ‐カロチンからリコピンまでのデ
サチュレーション（脱水素）反応を阻害する除草剤であ
ることが知られている（Boger, P.; Sandmann, G. "Mod
ern herbicides affecting typical plant processes".
Chemistry of Plant Protection. Vol. 6. SpringerPu
bl., 1990, p.173-216. (Bowers, W.S.; Ebing, W., Ma
rtin, D., Wegler, R. eds ）参照）。ｉｎ ｖｉｖ
ｏ、ｉｎ ｖｉｔｒｏ共に、ＳＡＮ３８０ＨまたはＪ８
５２で処理した植物体はζ‐カロチンを蓄積するように
なるので、これらはζ‐カロチンデサチュラーゼ酵素を
直接に攻撃する除草剤であると考えられている。ζ‐カ
ロチンデサチュラーゼを阻害する除草剤に対するＥｒｗ
ｉｎｉａのフィトエンデサチュラーゼｃｒｔＩを導入し
た植物体の抵抗性に関しては、前述したように、最近、
ようやく、シアノバクテリアからζ‐カロチンデサチュ
ラーゼをコードする遺伝子がクローニングされたばかり
であり、そのアミノ酸配列がまだ明かにされていないこ
とや、この抵抗性に関する研究例が現在までに全く無い
ことから、ＥｒｗｉｎｉａのｃｒｔＩ遺伝子を利用し
て、ζ‐カロチンデサチュラーゼ阻害剤に対する抵抗性
を植物に与えられるかどうかは全くわからないのが現状
であった。本発明は、上述のような点に鑑み、ブリーチ
ング除草剤に対して耐性を有する植物の製造に関する技
術を提供することを目的とするものである。
【０００４】
【課題を解決するための手段】本発明者らは、非光合成
細菌エルウィニア（Ｅｒｗｉｎｉａ）のフィトエンデサ
チュラーゼ（ｃｒｔＩ）遺伝子を利用することにより、
ノルフルラゾンやフルリドンのような植物のフィトエン
デサチュラーゼを阻害する除草剤だけでなく、ＳＡＮ３
８０ＨやＪ８５２等の植物のζ‐カロチンデサチュラー
ゼを阻害する除草剤に対する耐性を植物に与えることが
できることを見出し、この知見をもとに本発明を完成さ
せるに至った。すなわち、本発明によるζ‐カロチンデ
サチュラーゼ阻害除草剤に対する耐性植物の作出法は、
フィトエンをリコピンに変換する酵素活性を有するポリ
ペプチドをコードするＤＮＡ配列を、その遺伝情報が発
現可能な状態で植物に導入すること、を特徴とするもの
である。上記作出法によって得られるζ‐カロチンデサ
チュラーゼ阻害除草剤に対する耐性植物は、フィトエン
をリコピンに変換する酵素活性を有するポリペプチドを
コードするＤＮＡ配列が導入され、上記酵素活性を有す
るポリペプチドを産生する能力を有すること、を特徴と
するものである。さらに、本発明は、上記ＤＮＡ配列
の、植物の形質転換におけるマーカー遺伝子としての使
用、すなわち、フィトエンをリコピンに変換する酵素活
性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ配列からな
る、ζ−カロチンデサチュラーゼ阻害除草剤に対する形
質転換確認用マーカー、にも関する。
細菌エルウィニア（Ｅｒｗｉｎｉａ）のフィトエンデサ
チュラーゼ（ｃｒｔＩ）遺伝子を利用することにより、
ノルフルラゾンやフルリドンのような植物のフィトエン
デサチュラーゼを阻害する除草剤だけでなく、ＳＡＮ３
８０ＨやＪ８５２等の植物のζ‐カロチンデサチュラー
ゼを阻害する除草剤に対する耐性を植物に与えることが
できることを見出し、この知見をもとに本発明を完成さ
せるに至った。すなわち、本発明によるζ‐カロチンデ
サチュラーゼ阻害除草剤に対する耐性植物の作出法は、
フィトエンをリコピンに変換する酵素活性を有するポリ
ペプチドをコードするＤＮＡ配列を、その遺伝情報が発
現可能な状態で植物に導入すること、を特徴とするもの
である。上記作出法によって得られるζ‐カロチンデサ
チュラーゼ阻害除草剤に対する耐性植物は、フィトエン
をリコピンに変換する酵素活性を有するポリペプチドを
コードするＤＮＡ配列が導入され、上記酵素活性を有す
るポリペプチドを産生する能力を有すること、を特徴と
するものである。さらに、本発明は、上記ＤＮＡ配列
の、植物の形質転換におけるマーカー遺伝子としての使
用、すなわち、フィトエンをリコピンに変換する酵素活
性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ配列からな
る、ζ−カロチンデサチュラーゼ阻害除草剤に対する形
質転換確認用マーカー、にも関する。
【０００５】〔発明の具体的説明〕本発明は、フィトエ
ンをリコピンに変換する酵素活性を有するポリペプチ
ド、すなわちフィトエンデサチュラーゼ（以下、ｃｒｔ
Ｉともいう）をコードするＤＮＡ配列（以下、フィトエ
ンデサチュラーゼ遺伝子もしくはｃｒｔＩ遺伝子ともい
う）を利用することにより、植物のフィトエンデサチュ
ラーゼを阻害する除草剤のみならず、植物のζ‐カロチ
ンデサチュラーゼを阻害する除草剤に対して耐性を有す
る植物の製造に関する技術を提供するものである。
ンをリコピンに変換する酵素活性を有するポリペプチ
ド、すなわちフィトエンデサチュラーゼ（以下、ｃｒｔ
Ｉともいう）をコードするＤＮＡ配列（以下、フィトエ
ンデサチュラーゼ遺伝子もしくはｃｒｔＩ遺伝子ともい
う）を利用することにより、植物のフィトエンデサチュ
ラーゼを阻害する除草剤のみならず、植物のζ‐カロチ
ンデサチュラーゼを阻害する除草剤に対して耐性を有す
る植物の製造に関する技術を提供するものである。
【０００６】ζ‐カロチンデサチュラーゼ阻害除草剤に
対する耐性植物の製造 本発明におけるζ‐カロチンデサチュラーゼ阻害除草剤
に対する耐性植物は、フィトエンをリコピンに変換する
酵素活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ配列
（フィトエンデサチュラーゼ遺伝子）が導入され、上記
酵素活性を有するポリペプチド（フィトエンデサチュラ
ーゼ）を産生する能力を有することを特徴とするもので
あり、このような植物は、本発明作出法により、すなわ
ち、フィトエンをリコピンに変換する酵素活性を有する
ポリペプチドをコードするＤＮＡ配列（フィトエンデサ
チュラーゼ遺伝子）を、その遺伝情報が発現可能な状態
で植物に導入することを特徴とする方法により作出する
ことができる。フィトエンデサチュラーゼ遺伝子導入の
対象となる植物としては、光合成を行なう任意の高等植
物が使用可能であり、特に限定されないが、具体的には
穀類あるいはタバコ、ペチュニア、ジャガイモなど、好
ましくはイネ、トウモロコシ、コムギ、オオムギなどが
あげられる。上記ＤＮＡ配列（フィトエンデサチュラー
ゼ遺伝子）は、コードするポリペプチドが、フィトエン
をリコピンに変換する酵素活性を有するものであれば任
意のアミノ酸配列に対応するものでありうるが、その代
表例としては非光合成細菌であるエルウィニア（Ｅｒｗ
ｉｎｉａ）属由来のフィトエンデサチュラーゼ遺伝子
（ｃｒｔＩ遺伝子）のＤＮＡ配列をあげることができ
る。このエルウィニア属由来のｃｒｔＩ遺伝子は、フィ
トエンをζ‐カロチンを経てリコピンに変換するフィト
エンデサチュラーゼのアミノ酸配列をコードするもので
ある。エルウィニア属細菌由来の遺伝子としては、具体
的にはたとえば、Ｅｒ． ｕｒｅｄｏｖａｒａのｃｒｔ
Ｉ遺伝子を使用することができる。このｃｒｔＩ遺伝子
の塩基配列の詳細については、前記の論文Journal of B
acteriology, vol.172, p.6704-6712 (1992)に、コード
されるポリペプチド（フィトエンデサチュラーゼ（Ｃｒ
ｔＩ））のアミノ酸配列と共に示されている。使用する
ＤＮＡ配列は、この論文に示されたものの他に、同一の
ポリペプチドをコードし縮重コドンにおいてのみ塩基配
列が異なる縮重異性体でもよいことはいうまでもなく、
さらには、アミノ酸配列中の一部のアミノ酸の置換、欠
失、挿入あるいは付加などのアミノ酸変異もしくは変更
があっても、フィトエンデサチュラーゼ活性を維持して
いるポリペプチドに対応する塩基配列を有するものであ
れば使用可能である。また、エルウィニア属細菌由来の
遺伝子としては、Ｅｒ．ｈｅｒｂｉｃｏｌａのｃｒｔＩ
遺伝子（前記ＷＯ ９１／１３０７８号公開公報参照）
も例示され、この塩基配列に関しても、上記Ｅｒ． ｕ
ｒｅｄｏｖｏｒａの場合と同様に、縮重異性体あるいは
アミノ酸変異に対応する塩基配列のものが使用できる。
これらのＤＮＡ配列は、一部または全部を化学合成する
ことができるが、好ましくは細菌等の取得源から常法に
よりフィトエンデサチュラーゼをコードするゲノム遺伝
子あるいはｃＤＮＡを単離して得ることができる（上記
公開公報等参照）。上記のようなＤＮＡ配列（フィトエ
ンデサチュラーゼ遺伝子）は、プラスミド等のベクター
に含有された形で、その遺伝情報が発現可能な状態で植
物に導入して形質転換することにより、ブリーチング除
草剤に対する耐性植物を作出することができる。上記ベ
クターとしては、たとえばバイナリーベクターであれば
任意のものが使用可能であるが、好ましくはｐＢＩ １
２１などをあげることができる。ＤＮＡ配列を発現させ
てそれがコードするポリペプチド（フィトエンデサチュ
ラーゼ）を産生させるためには、そのコーディング領域
の他に、発現調節配列が必要であり、そのような発現調
節配列としてはたとえばカリフラワーモザイクウィルス
由来の３５Ｓプロモーターなどを用いることができる。
さらに、産生されたポリペプチド（フィトエンデサチュ
ラーゼ）を細胞の特定の場所（たとえば葉緑体）に輸送
したい場合には、コーディング領域の上流に輸送に必要
なトランジットペプチドをコードする塩基配列をさらに
付加することによりその輸送が可能となる。トランジッ
トペプチドをコードする配列としては、たとえば、図２
に示されるように、エンドウのＲｕｂｉｓｃｏ小サブユ
ニットのトランジットペプチドをコードするＤＮＡ配列
を利用することができる。したがって、本発明における
「ポリペプチドをコードするＤＮＡ配列」は、このポリ
ペプチドのコーディング領域のみを限定して指すのでは
なく、コーディング領域と共に発現調節配列やトランジ
ットペプチドをコードする配列などを含むようなＤＮＡ
配列をも包含するものとする。発現調節配列やトランジ
ットペプチドをコードする配列などの連結あるいはこれ
らを含む発現ベクター等の作製に関する基本的な事項に
ついては、一般的な公知の方法（たとえば長田敏行著：
「植物細胞の遺伝子操作」、蛋白質・核酸・酵素（臨時
増刊）1983:12,Vol.28,No.14, 共立出版株式会社、p155
1-1568の記載による方法など）を用いることができる。
また、このＤＮＡ配列（フィトエンデサチュラーゼ遺伝
子）による植物の形質転換、すなわち植物に外来遺伝子
を導入する方法としては、すでに報告され確立されてい
る種々の方法、たとえばアグロバクラリウムのＴｉプラ
スミドをベクターとして用いる方法や、植物プロトプラ
ストにエレクトロポレーションで遺伝子を導入する方法
などを、遺伝子を導入しようとする植物の種類等に応じ
て適宜用いることができる（たとえば岡田吉美，飯田
滋：「遺伝子工学的分子育種技術の現状と将来」植物バ
イオテクノロジーII，山田康之・岡田吉美編、現代化学
・増刊２０，東京化学同人，p233-264参照）。外来遺伝
子、すなわちフィトエンデサチュラーゼ遺伝子を導入す
る対象となる植物は前記した通りであるが、遺伝子導入
のための植物材料としては、導入法等に応じて、葉、
茎、根など任意の材料の中から適宜選択して用いること
ができる。ＤＮＡ配列（フィトエンデサチュラーゼ遺伝
子）が導入された形質転換体は、通常の方法（たとえば
本吉総男，宇垣正志：「コートタンパク質遺伝子による
ウィルス抵抗性のトマト」植物バイオテクノロジーII，
山田康之・岡田吉美編、現代化学・増刊２０，東京化学
同人，p153-161参照）により再生させ、幼植物体から馴
化植物体にまで生育した形質転換植物を得ることができ
る。この形質転換植物は、フィトエンをζ‐カロチンを
経てリコピンに変換するフィトエンデサチュラーゼを産
生する能力を有し、ノルフルラゾンやフルリドンのよう
な植物のフィトエンデサチュラーゼを阻害する除草剤だ
けでなく、ＳＡＮ３８０ＨやＪ８５２等の植物のζ‐カ
ロチンデサチュラーゼを阻害する除草剤に対して耐性を
獲得したものである。なお、上記した種々の薬剤に対す
る耐性試験は、一般的な公知の方法（たとえば、「微生
物学実験法」：微生物研究法懇談会編，1975，講談社,I
V.生理的性状観察法，p199-254に記載の方法）により実
施することができる。
対する耐性植物の製造 本発明におけるζ‐カロチンデサチュラーゼ阻害除草剤
に対する耐性植物は、フィトエンをリコピンに変換する
酵素活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ配列
（フィトエンデサチュラーゼ遺伝子）が導入され、上記
酵素活性を有するポリペプチド（フィトエンデサチュラ
ーゼ）を産生する能力を有することを特徴とするもので
あり、このような植物は、本発明作出法により、すなわ
ち、フィトエンをリコピンに変換する酵素活性を有する
ポリペプチドをコードするＤＮＡ配列（フィトエンデサ
チュラーゼ遺伝子）を、その遺伝情報が発現可能な状態
で植物に導入することを特徴とする方法により作出する
ことができる。フィトエンデサチュラーゼ遺伝子導入の
対象となる植物としては、光合成を行なう任意の高等植
物が使用可能であり、特に限定されないが、具体的には
穀類あるいはタバコ、ペチュニア、ジャガイモなど、好
ましくはイネ、トウモロコシ、コムギ、オオムギなどが
あげられる。上記ＤＮＡ配列（フィトエンデサチュラー
ゼ遺伝子）は、コードするポリペプチドが、フィトエン
をリコピンに変換する酵素活性を有するものであれば任
意のアミノ酸配列に対応するものでありうるが、その代
表例としては非光合成細菌であるエルウィニア（Ｅｒｗ
ｉｎｉａ）属由来のフィトエンデサチュラーゼ遺伝子
（ｃｒｔＩ遺伝子）のＤＮＡ配列をあげることができ
る。このエルウィニア属由来のｃｒｔＩ遺伝子は、フィ
トエンをζ‐カロチンを経てリコピンに変換するフィト
エンデサチュラーゼのアミノ酸配列をコードするもので
ある。エルウィニア属細菌由来の遺伝子としては、具体
的にはたとえば、Ｅｒ． ｕｒｅｄｏｖａｒａのｃｒｔ
Ｉ遺伝子を使用することができる。このｃｒｔＩ遺伝子
の塩基配列の詳細については、前記の論文Journal of B
acteriology, vol.172, p.6704-6712 (1992)に、コード
されるポリペプチド（フィトエンデサチュラーゼ（Ｃｒ
ｔＩ））のアミノ酸配列と共に示されている。使用する
ＤＮＡ配列は、この論文に示されたものの他に、同一の
ポリペプチドをコードし縮重コドンにおいてのみ塩基配
列が異なる縮重異性体でもよいことはいうまでもなく、
さらには、アミノ酸配列中の一部のアミノ酸の置換、欠
失、挿入あるいは付加などのアミノ酸変異もしくは変更
があっても、フィトエンデサチュラーゼ活性を維持して
いるポリペプチドに対応する塩基配列を有するものであ
れば使用可能である。また、エルウィニア属細菌由来の
遺伝子としては、Ｅｒ．ｈｅｒｂｉｃｏｌａのｃｒｔＩ
遺伝子（前記ＷＯ ９１／１３０７８号公開公報参照）
も例示され、この塩基配列に関しても、上記Ｅｒ． ｕ
ｒｅｄｏｖｏｒａの場合と同様に、縮重異性体あるいは
アミノ酸変異に対応する塩基配列のものが使用できる。
これらのＤＮＡ配列は、一部または全部を化学合成する
ことができるが、好ましくは細菌等の取得源から常法に
よりフィトエンデサチュラーゼをコードするゲノム遺伝
子あるいはｃＤＮＡを単離して得ることができる（上記
公開公報等参照）。上記のようなＤＮＡ配列（フィトエ
ンデサチュラーゼ遺伝子）は、プラスミド等のベクター
に含有された形で、その遺伝情報が発現可能な状態で植
物に導入して形質転換することにより、ブリーチング除
草剤に対する耐性植物を作出することができる。上記ベ
クターとしては、たとえばバイナリーベクターであれば
任意のものが使用可能であるが、好ましくはｐＢＩ １
２１などをあげることができる。ＤＮＡ配列を発現させ
てそれがコードするポリペプチド（フィトエンデサチュ
ラーゼ）を産生させるためには、そのコーディング領域
の他に、発現調節配列が必要であり、そのような発現調
節配列としてはたとえばカリフラワーモザイクウィルス
由来の３５Ｓプロモーターなどを用いることができる。
さらに、産生されたポリペプチド（フィトエンデサチュ
ラーゼ）を細胞の特定の場所（たとえば葉緑体）に輸送
したい場合には、コーディング領域の上流に輸送に必要
なトランジットペプチドをコードする塩基配列をさらに
付加することによりその輸送が可能となる。トランジッ
トペプチドをコードする配列としては、たとえば、図２
に示されるように、エンドウのＲｕｂｉｓｃｏ小サブユ
ニットのトランジットペプチドをコードするＤＮＡ配列
を利用することができる。したがって、本発明における
「ポリペプチドをコードするＤＮＡ配列」は、このポリ
ペプチドのコーディング領域のみを限定して指すのでは
なく、コーディング領域と共に発現調節配列やトランジ
ットペプチドをコードする配列などを含むようなＤＮＡ
配列をも包含するものとする。発現調節配列やトランジ
ットペプチドをコードする配列などの連結あるいはこれ
らを含む発現ベクター等の作製に関する基本的な事項に
ついては、一般的な公知の方法（たとえば長田敏行著：
「植物細胞の遺伝子操作」、蛋白質・核酸・酵素（臨時
増刊）1983:12,Vol.28,No.14, 共立出版株式会社、p155
1-1568の記載による方法など）を用いることができる。
また、このＤＮＡ配列（フィトエンデサチュラーゼ遺伝
子）による植物の形質転換、すなわち植物に外来遺伝子
を導入する方法としては、すでに報告され確立されてい
る種々の方法、たとえばアグロバクラリウムのＴｉプラ
スミドをベクターとして用いる方法や、植物プロトプラ
ストにエレクトロポレーションで遺伝子を導入する方法
などを、遺伝子を導入しようとする植物の種類等に応じ
て適宜用いることができる（たとえば岡田吉美，飯田
滋：「遺伝子工学的分子育種技術の現状と将来」植物バ
イオテクノロジーII，山田康之・岡田吉美編、現代化学
・増刊２０，東京化学同人，p233-264参照）。外来遺伝
子、すなわちフィトエンデサチュラーゼ遺伝子を導入す
る対象となる植物は前記した通りであるが、遺伝子導入
のための植物材料としては、導入法等に応じて、葉、
茎、根など任意の材料の中から適宜選択して用いること
ができる。ＤＮＡ配列（フィトエンデサチュラーゼ遺伝
子）が導入された形質転換体は、通常の方法（たとえば
本吉総男，宇垣正志：「コートタンパク質遺伝子による
ウィルス抵抗性のトマト」植物バイオテクノロジーII，
山田康之・岡田吉美編、現代化学・増刊２０，東京化学
同人，p153-161参照）により再生させ、幼植物体から馴
化植物体にまで生育した形質転換植物を得ることができ
る。この形質転換植物は、フィトエンをζ‐カロチンを
経てリコピンに変換するフィトエンデサチュラーゼを産
生する能力を有し、ノルフルラゾンやフルリドンのよう
な植物のフィトエンデサチュラーゼを阻害する除草剤だ
けでなく、ＳＡＮ３８０ＨやＪ８５２等の植物のζ‐カ
ロチンデサチュラーゼを阻害する除草剤に対して耐性を
獲得したものである。なお、上記した種々の薬剤に対す
る耐性試験は、一般的な公知の方法（たとえば、「微生
物学実験法」：微生物研究法懇談会編，1975，講談社,I
V.生理的性状観察法，p199-254に記載の方法）により実
施することができる。
【０００７】ζ‐カロチンデサチュラーゼ遺伝子および
コードされるポリペプチド 上記ＳＡＮ３８０ＨあるいはＪ８５２等のブリーチング
除草剤の作用部位となるζ‐カロチンデサチュラーゼを
コードする遺伝子に関しては、最近シアノバクテリアＡ
ｎａｂａｅｎａ（ＰＣＣ７１２０）からこの遺伝子がク
ローニングされたばかりであり（前記FEMS Microbiol.
Lett., Vol.106, p.99-103 (1993) 参照）、そのアミノ
酸配列がまだ明かにされていないことや、この抵抗性に
関する研究例が現在までに全く無いことから、Ｅｒｗｉ
ｎｉａのフィトエンデサチュラーゼ遺伝子を利用して、
ζ‐カロチンデサチュラーゼ阻害剤に対する抵抗性を植
物に与えられるかどうかは全くわからない現状であっ
た。さらに、本発明者らは後記の実験例９に示されてい
るように、最近シアノバクテリアからクローニングされ
たこのζ‐カロチンデサチュラーゼ遺伝子ｚｄｓの塩基
配列をダイデオキシ法により決定し、そこから推定した
アミノ酸配列をすでに報告されているいろいろな生物種
のフィトエンデサチュラーゼと比較した。その結果、驚
くべきことに、このζ‐カロチンデサチュラーゼｚｄｓ
遺伝子産物は、シアノバクテリアや植物のフィトエンデ
サチュラーゼと、一部のＮ‐末領域を除いてホモロジー
はほとんど見出されず、むしろ、ＥｒｗｉｎｉａやＲｈ
ｏｄｏｂａｃｔｅｒ ｃａｐｓｕｌａｔｕｓのフィトエ
ンデサチュラーゼＣｒｔＩと約３５％という意義深いホ
モロジーを示した。このことから、Ｅｒｗｉｎｉａのフ
ィトエンデサチュラーゼと植物のζ‐カロチンデサチュ
ラーゼとは構造がよく似ていると考えられるので、当業
者であれば、Ｅｒｗｉｎｉａのフィトエンデサチュラー
ゼ遺伝子は、植物のζ‐カロチンデサチュラーゼを阻害
する除草剤に対する抵抗性を与えることはできないと予
測するであろう。図３〜５に、シアノバクテリア（Anab
aena）由来のζ‐カロチンデサチュラーゼ遺伝子の塩基
配列およびそこから推定したアミノ酸配列を示してある
が（後記配列表参照）、このζ‐カロチンデサチュラー
ゼ遺伝子の塩基配列およびコードされるポリペプチドの
アミノ酸配列は、これまで知られていなかったものであ
り、本発明において初めて明らかにされたものである。
コードされるポリペプチド 上記ＳＡＮ３８０ＨあるいはＪ８５２等のブリーチング
除草剤の作用部位となるζ‐カロチンデサチュラーゼを
コードする遺伝子に関しては、最近シアノバクテリアＡ
ｎａｂａｅｎａ（ＰＣＣ７１２０）からこの遺伝子がク
ローニングされたばかりであり（前記FEMS Microbiol.
Lett., Vol.106, p.99-103 (1993) 参照）、そのアミノ
酸配列がまだ明かにされていないことや、この抵抗性に
関する研究例が現在までに全く無いことから、Ｅｒｗｉ
ｎｉａのフィトエンデサチュラーゼ遺伝子を利用して、
ζ‐カロチンデサチュラーゼ阻害剤に対する抵抗性を植
物に与えられるかどうかは全くわからない現状であっ
た。さらに、本発明者らは後記の実験例９に示されてい
るように、最近シアノバクテリアからクローニングされ
たこのζ‐カロチンデサチュラーゼ遺伝子ｚｄｓの塩基
配列をダイデオキシ法により決定し、そこから推定した
アミノ酸配列をすでに報告されているいろいろな生物種
のフィトエンデサチュラーゼと比較した。その結果、驚
くべきことに、このζ‐カロチンデサチュラーゼｚｄｓ
遺伝子産物は、シアノバクテリアや植物のフィトエンデ
サチュラーゼと、一部のＮ‐末領域を除いてホモロジー
はほとんど見出されず、むしろ、ＥｒｗｉｎｉａやＲｈ
ｏｄｏｂａｃｔｅｒ ｃａｐｓｕｌａｔｕｓのフィトエ
ンデサチュラーゼＣｒｔＩと約３５％という意義深いホ
モロジーを示した。このことから、Ｅｒｗｉｎｉａのフ
ィトエンデサチュラーゼと植物のζ‐カロチンデサチュ
ラーゼとは構造がよく似ていると考えられるので、当業
者であれば、Ｅｒｗｉｎｉａのフィトエンデサチュラー
ゼ遺伝子は、植物のζ‐カロチンデサチュラーゼを阻害
する除草剤に対する抵抗性を与えることはできないと予
測するであろう。図３〜５に、シアノバクテリア（Anab
aena）由来のζ‐カロチンデサチュラーゼ遺伝子の塩基
配列およびそこから推定したアミノ酸配列を示してある
が（後記配列表参照）、このζ‐カロチンデサチュラー
ゼ遺伝子の塩基配列およびコードされるポリペプチドの
アミノ酸配列は、これまで知られていなかったものであ
り、本発明において初めて明らかにされたものである。
【０００８】フィトエンデサチュラーゼ遺伝子の用途 本発明において、上記の、フィトエンをリコピンに変換
する酵素活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ
配列、すなわちフィトエンデサチュラーゼ（ｃｒｔＩ）
遺伝子（代表的には、エルウィニア属由来のもの）は、
種々の外来遺伝子（たとえば薬剤耐性遺伝子など）によ
る植物の形質転換実験等において、ＳＡＮ３８０Ｈある
いはＪ８５２等の植物ζ‐カロチンデサチュラーゼを阻
害するブリーチング除草剤に対する形質転換確認用の遺
伝子マーカーとして使用することができる。これまでの
ところ、植物の形質転換実験は、植物病原菌Ａｇｒｏｂ
ａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓのＴｉプラ
スミド系を用いて行なわれるのが一般的であるが、外来
遺伝子が植物に導入されたことを示すマーカー遺伝子
は、抗生物質耐性遺伝子であるカナマイシンやハイグロ
マイシン耐性遺伝子ぐらいしか実際に使用できるものは
なく、従ってこれらの薬剤に抵抗性を示す種々の植物種
の形質転換あるいは一つの植物体への複数の遺伝子の導
入実験等が、形質転換有無の確認の点から困難なものと
なっていた。後述の実験例８において、フィトエンデサ
チュラーゼ（ｃｒｔＩ）遺伝子およびカナマイシン耐性
遺伝子を含むプラスミドを有するアクロバクテリウム
（Ａ．ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｃｅ）の感染によって葉片
（タバコ植物）を形質転換し、これをζ‐カロチンデサ
チュラーゼ阻害剤（ＳＡＮ３８０Ｈ）およびカナマイシ
ンの有無の培地上で培養したところ、ＳＡＮ３８０Ｈを
含む培地上で、異常な生育、すなわち両薬剤を含まない
コントロール培地上の場合と比べて生育の悪い多数の白
色の不定芽形成、の中に一部正常に生育しカナマイシン
を含む培地の場合より生育のよい緑色の不定芽形成が観
察され、緑色の不定芽は、カナマイシンを含む培地上で
も正常に生育した。この緑色の不定芽の部分を再生培地
上で培養して幼植物体を形成させ、葉の染色体ＤＮＡを
分析したところ、フィトエンデサチュラーゼ遺伝子とカ
ナマイシン耐性遺伝子との両方が組み込まれていること
が確認され、このことから、選択マーカーとしてのＳＡ
Ｎ３８０Ｈにより、外来遺伝子としてのカナマイシン耐
性遺伝子が導入された植物体、すなわち形質転換体を選
抜できたということがわかった。したがって、Ｅｒｗｉ
ｎｉａのフィトエンデサチュラーゼ遺伝子は、種々の外
来遺伝子（たとえば薬剤耐性遺伝子など）による植物の
形質転換実験等において、ＳＡＮ３８０Ｈ等のζ‐カロ
チンデサチュラーゼ阻害剤に対するマーカー遺伝子とし
て使用できることが確認できた。
する酵素活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ
配列、すなわちフィトエンデサチュラーゼ（ｃｒｔＩ）
遺伝子（代表的には、エルウィニア属由来のもの）は、
種々の外来遺伝子（たとえば薬剤耐性遺伝子など）によ
る植物の形質転換実験等において、ＳＡＮ３８０Ｈある
いはＪ８５２等の植物ζ‐カロチンデサチュラーゼを阻
害するブリーチング除草剤に対する形質転換確認用の遺
伝子マーカーとして使用することができる。これまでの
ところ、植物の形質転換実験は、植物病原菌Ａｇｒｏｂ
ａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓのＴｉプラ
スミド系を用いて行なわれるのが一般的であるが、外来
遺伝子が植物に導入されたことを示すマーカー遺伝子
は、抗生物質耐性遺伝子であるカナマイシンやハイグロ
マイシン耐性遺伝子ぐらいしか実際に使用できるものは
なく、従ってこれらの薬剤に抵抗性を示す種々の植物種
の形質転換あるいは一つの植物体への複数の遺伝子の導
入実験等が、形質転換有無の確認の点から困難なものと
なっていた。後述の実験例８において、フィトエンデサ
チュラーゼ（ｃｒｔＩ）遺伝子およびカナマイシン耐性
遺伝子を含むプラスミドを有するアクロバクテリウム
（Ａ．ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｃｅ）の感染によって葉片
（タバコ植物）を形質転換し、これをζ‐カロチンデサ
チュラーゼ阻害剤（ＳＡＮ３８０Ｈ）およびカナマイシ
ンの有無の培地上で培養したところ、ＳＡＮ３８０Ｈを
含む培地上で、異常な生育、すなわち両薬剤を含まない
コントロール培地上の場合と比べて生育の悪い多数の白
色の不定芽形成、の中に一部正常に生育しカナマイシン
を含む培地の場合より生育のよい緑色の不定芽形成が観
察され、緑色の不定芽は、カナマイシンを含む培地上で
も正常に生育した。この緑色の不定芽の部分を再生培地
上で培養して幼植物体を形成させ、葉の染色体ＤＮＡを
分析したところ、フィトエンデサチュラーゼ遺伝子とカ
ナマイシン耐性遺伝子との両方が組み込まれていること
が確認され、このことから、選択マーカーとしてのＳＡ
Ｎ３８０Ｈにより、外来遺伝子としてのカナマイシン耐
性遺伝子が導入された植物体、すなわち形質転換体を選
抜できたということがわかった。したがって、Ｅｒｗｉ
ｎｉａのフィトエンデサチュラーゼ遺伝子は、種々の外
来遺伝子（たとえば薬剤耐性遺伝子など）による植物の
形質転換実験等において、ＳＡＮ３８０Ｈ等のζ‐カロ
チンデサチュラーゼ阻害剤に対するマーカー遺伝子とし
て使用できることが確認できた。
【０００９】
【実施例】以下の実施例は、本発明をさらに具体的に説
明するためのものであり、本発明を限定するものではな
い。 実験例１：プラスミドｐＹＰＩＥＴ４の作製 ここで用いられた通常の遺伝子組換え実験は、特に言及
されていない場合は、標準的な方法（Sambrook, J.; Fr
itsch, E.F.; Maniatis, T. Molecular Clonig: A Labo
ratory Manual. Cold Spring Harbor Laboratory Pres
s, 1989）に基づいている。エンドウのリブロース‐
１，５‐２リン酸（Ｒｕｂｉｓｃｏ）前駆体のトランジ
ットペプチドをコードする配列（ｔｐ）は、プラスミド
ｐＳＮＩＦ８３（Schreier, P.H.; Seftor, E.A.; Sche
ll, J.; Bohnet, H.J. The use of nuclear-encoded se
quences to direct the light-regulated synthesis an
d transport ofa foreign protein into plant chlorop
lasts. The EMBO Journal, Vol. 4, p.25-32 (1985)参
照）から２０４ｂｐのＨｉｎｄIII −ＳｐｈＩ断片とし
て単離した。次に、Ｅｒ． ｕｒｅｄｏｖｏｒａのフィ
トエンデサチュラーゼ遺伝子ｃｒｔＩを有するプラスミ
ドであるｐＣＲＴ−Ｉ（Fraser, P.D.; Misawa, N.; Li
nden, H.; Yamano, S.; Kobayashi, k.; Sandmann, G.
Expression in E. coli, purification and reactivati
on of the recombinant Erwinia uredovora phytoen
e desturase. J. Biol. Chem., Vol. 267, p.19819-198
95 (1992) 参照）をＢａｍＨＩとＨｉｎｄIII で二重消
化した後、Ｎ末の一部を欠失したｃｒｔＩを含む１．５
７ｋｂのＢａｍＨＩ−ＨｉｎｄIII 断片を単離した。次
に、ｃｒｔＩの開始コドンからＢａｍＨＩ部位までの７
６ｂｐの配列を合成した。このｃｒｔＩの開始コドンに
は、ＳｐｈＩの粘着末端を生じるようにデザインした。
そして、上記で得た３種類の断片を、ｔｐを含む２０４
ｂｐ ＨｉｎｄIII −ＳｐｈＩ断片、合成した７６ｂｐ
ＳｐｈＩ−ＢａｍＨＩ断片、Ｎ末の一部を欠失したｃ
ｒｔＩを含む１．５７ｋｂ ＢａｍＨＩ−ＨｉｎｄIII
断片の順で結合した。こうして得た１．８４ｋｂのＨｉ
ｎｄIII 断片を、Ｋｌｅｎｏｗ酵素で処理した後、東洋
紡（株）から購入したバイナリーベクターｐＢI １２１
からＳｍａＩとＳａｃＩによる二重消化によりβ‐グル
クロニダーゼ遺伝子を除いたものに、カリフラワーモザ
イクウィルス（ＣａＭＶ）の３５Ｓプロモーターの転写
のリードスルーを受けるように挿入した。こうして得た
プラスミドをｐＹＰＩＥＴ４と名づけた。ｐＹＰＩＥＴ
４における、ｔｐ−ｃｒｔＩ遺伝子を含む１．８４ｋｂ
のＨｉｎｄIII 断片部分を図２に示した。
明するためのものであり、本発明を限定するものではな
い。 実験例１：プラスミドｐＹＰＩＥＴ４の作製 ここで用いられた通常の遺伝子組換え実験は、特に言及
されていない場合は、標準的な方法（Sambrook, J.; Fr
itsch, E.F.; Maniatis, T. Molecular Clonig: A Labo
ratory Manual. Cold Spring Harbor Laboratory Pres
s, 1989）に基づいている。エンドウのリブロース‐
１，５‐２リン酸（Ｒｕｂｉｓｃｏ）前駆体のトランジ
ットペプチドをコードする配列（ｔｐ）は、プラスミド
ｐＳＮＩＦ８３（Schreier, P.H.; Seftor, E.A.; Sche
ll, J.; Bohnet, H.J. The use of nuclear-encoded se
quences to direct the light-regulated synthesis an
d transport ofa foreign protein into plant chlorop
lasts. The EMBO Journal, Vol. 4, p.25-32 (1985)参
照）から２０４ｂｐのＨｉｎｄIII −ＳｐｈＩ断片とし
て単離した。次に、Ｅｒ． ｕｒｅｄｏｖｏｒａのフィ
トエンデサチュラーゼ遺伝子ｃｒｔＩを有するプラスミ
ドであるｐＣＲＴ−Ｉ（Fraser, P.D.; Misawa, N.; Li
nden, H.; Yamano, S.; Kobayashi, k.; Sandmann, G.
Expression in E. coli, purification and reactivati
on of the recombinant Erwinia uredovora phytoen
e desturase. J. Biol. Chem., Vol. 267, p.19819-198
95 (1992) 参照）をＢａｍＨＩとＨｉｎｄIII で二重消
化した後、Ｎ末の一部を欠失したｃｒｔＩを含む１．５
７ｋｂのＢａｍＨＩ−ＨｉｎｄIII 断片を単離した。次
に、ｃｒｔＩの開始コドンからＢａｍＨＩ部位までの７
６ｂｐの配列を合成した。このｃｒｔＩの開始コドンに
は、ＳｐｈＩの粘着末端を生じるようにデザインした。
そして、上記で得た３種類の断片を、ｔｐを含む２０４
ｂｐ ＨｉｎｄIII −ＳｐｈＩ断片、合成した７６ｂｐ
ＳｐｈＩ−ＢａｍＨＩ断片、Ｎ末の一部を欠失したｃ
ｒｔＩを含む１．５７ｋｂ ＢａｍＨＩ−ＨｉｎｄIII
断片の順で結合した。こうして得た１．８４ｋｂのＨｉ
ｎｄIII 断片を、Ｋｌｅｎｏｗ酵素で処理した後、東洋
紡（株）から購入したバイナリーベクターｐＢI １２１
からＳｍａＩとＳａｃＩによる二重消化によりβ‐グル
クロニダーゼ遺伝子を除いたものに、カリフラワーモザ
イクウィルス（ＣａＭＶ）の３５Ｓプロモーターの転写
のリードスルーを受けるように挿入した。こうして得た
プラスミドをｐＹＰＩＥＴ４と名づけた。ｐＹＰＩＥＴ
４における、ｔｐ−ｃｒｔＩ遺伝子を含む１．８４ｋｂ
のＨｉｎｄIII 断片部分を図２に示した。
【００１０】実験例２：アグロバクテリウムを介した植
物体の形質転換 プラスミドｐＹＰＩＥＴ４は、ヘルパープラスミドｐＲ
Ｋ２０１３を用いた接合伝達法（Stuy, J.H. Plasmid t
ransfer in Haemophilus influenzae. Journal of B
acteriology, Vol. 139, p.520-529 (1979) 参照）によ
り、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅ
ｎｓ ＬＢＡ ４４０４に導入された。プラスミドｐＹ
ＰＩＥＴ４を有するＡ． ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ接合
体は、リーフディスク法（Horsch, R.B.; Fry, J.E.; H
offmann, N.L.; Eichholtz, D.;Rogers, S.G.; Fraley,
R.T. A simple and general method for transferring
genes into plants. Science, Vol. 227, p.1229-1231
(1985)参照）によりタバコ植物（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ
ｔａｂａｃｕｍ ｖａｒｉｅｔｉｅｓ Ｓａｍｓｕｎ）
を形質転換するのに用いられた。タバコ形質転換体の選
択は、１００μｇ／ｍｌのカナマイシン、５００μｇ／
ｍｌのカルベニシリン、１ｍｇ／ｌのベンジルアデニ
ン、０．１ｍｇ／ｌのＮＡＡを含むＭＳ培地上で、２６
℃、１６時間光照射下、８時間暗黒下の条件で行われ
た。ここで得られた不定芽を、植物ホルモンを含まない
ＭＳ培地上に移し培養することにより根を形成させた。
根を形成した幼植物は、土壌に移し、温室で栽培した。
また、増殖、維持を行う場合は、根を形成した幼植物の
頂芽または葉柄付きの茎を切り取り、植物ホルモンを含
まない別のＭＳ培地に置床し、培養を行った。
物体の形質転換 プラスミドｐＹＰＩＥＴ４は、ヘルパープラスミドｐＲ
Ｋ２０１３を用いた接合伝達法（Stuy, J.H. Plasmid t
ransfer in Haemophilus influenzae. Journal of B
acteriology, Vol. 139, p.520-529 (1979) 参照）によ
り、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅ
ｎｓ ＬＢＡ ４４０４に導入された。プラスミドｐＹ
ＰＩＥＴ４を有するＡ． ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ接合
体は、リーフディスク法（Horsch, R.B.; Fry, J.E.; H
offmann, N.L.; Eichholtz, D.;Rogers, S.G.; Fraley,
R.T. A simple and general method for transferring
genes into plants. Science, Vol. 227, p.1229-1231
(1985)参照）によりタバコ植物（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ
ｔａｂａｃｕｍ ｖａｒｉｅｔｉｅｓ Ｓａｍｓｕｎ）
を形質転換するのに用いられた。タバコ形質転換体の選
択は、１００μｇ／ｍｌのカナマイシン、５００μｇ／
ｍｌのカルベニシリン、１ｍｇ／ｌのベンジルアデニ
ン、０．１ｍｇ／ｌのＮＡＡを含むＭＳ培地上で、２６
℃、１６時間光照射下、８時間暗黒下の条件で行われ
た。ここで得られた不定芽を、植物ホルモンを含まない
ＭＳ培地上に移し培養することにより根を形成させた。
根を形成した幼植物は、土壌に移し、温室で栽培した。
また、増殖、維持を行う場合は、根を形成した幼植物の
頂芽または葉柄付きの茎を切り取り、植物ホルモンを含
まない別のＭＳ培地に置床し、培養を行った。
【００１１】実験例３：フィトエンデサチュラーゼ遺伝
子ｃｒｔＩの植物体での発現 上記の方法により、計２８株のカナマイシン耐性形質転
換タバコを単離した。ｃｒｔＩ遺伝子産物（ＣｒｔＩ）
に対する抗体を用いたウエスタンブロット法により、こ
れらの形質転換体の葉中でのｃｒｔＩ遺伝子の発現を調
べたところ、形質転換植物の半数においてｃｒｔＩ遺伝
子の発現が認められ、トランジットペプチドが切断され
たＣｒｔＩ蛋白質自身の大きさのバンドを現した。した
がって、これら半数の形質転換植物において、葉中で合
成されたｔｐ−ｃｒｔＩ遺伝子産物は、トランジットペ
プチドの情報に基づいて葉緑体に移行後、トランジット
ペプチドが切断されたと考えられた。このことは、ま
た、ＣｒｔＩに対する抗体を用いた免疫金粒子検出実験
により確かめられた。すなわち、発現が確認されたタバ
コ形質転換体の１つ（ＥＴ４−１）からの葉を用いて、
ＣｒｔＩの抗体に吸着する金粒子で反応を行った後、そ
の葉の超薄切片を電子顕微鏡で観察した。この実験方法
は、Vivo, A; Andreu, J.M.; Vina, S.de.la.; Felipe,
M.R.de. Leghemoglobin in lupin plants (Lupinus al
bus cv Multolupa). Plant Physiol., Vol. 90, p.452-
457 (1989)に基づいて行った。その結果、ＥＴ４−１に
おいて、ｃｒｔＩの大部分が葉緑体内に取り込まれ、そ
の内の８９％がチラコイド膜に移行していることがわか
った。なお、コントロールとして行った非形質転換タバ
コにおける免疫金粒子の反応は、ＥＴ４−１の１０％以
下であった。
子ｃｒｔＩの植物体での発現 上記の方法により、計２８株のカナマイシン耐性形質転
換タバコを単離した。ｃｒｔＩ遺伝子産物（ＣｒｔＩ）
に対する抗体を用いたウエスタンブロット法により、こ
れらの形質転換体の葉中でのｃｒｔＩ遺伝子の発現を調
べたところ、形質転換植物の半数においてｃｒｔＩ遺伝
子の発現が認められ、トランジットペプチドが切断され
たＣｒｔＩ蛋白質自身の大きさのバンドを現した。した
がって、これら半数の形質転換植物において、葉中で合
成されたｔｐ−ｃｒｔＩ遺伝子産物は、トランジットペ
プチドの情報に基づいて葉緑体に移行後、トランジット
ペプチドが切断されたと考えられた。このことは、ま
た、ＣｒｔＩに対する抗体を用いた免疫金粒子検出実験
により確かめられた。すなわち、発現が確認されたタバ
コ形質転換体の１つ（ＥＴ４−１）からの葉を用いて、
ＣｒｔＩの抗体に吸着する金粒子で反応を行った後、そ
の葉の超薄切片を電子顕微鏡で観察した。この実験方法
は、Vivo, A; Andreu, J.M.; Vina, S.de.la.; Felipe,
M.R.de. Leghemoglobin in lupin plants (Lupinus al
bus cv Multolupa). Plant Physiol., Vol. 90, p.452-
457 (1989)に基づいて行った。その結果、ＥＴ４−１に
おいて、ｃｒｔＩの大部分が葉緑体内に取り込まれ、そ
の内の８９％がチラコイド膜に移行していることがわか
った。なお、コントロールとして行った非形質転換タバ
コにおける免疫金粒子の反応は、ＥＴ４−１の１０％以
下であった。
【００１２】実験例４：フィトエンデサチュラーゼ遺伝
子ｃｒｔＩ発現植物体のノルフルラゾン耐性 植物ホルモンを含まないＭＳ培地で維持中のトランスジ
ェニックタバコ（ウエスタンブロット実験によりｃｒｔ
Ｉ遺伝子の発現が確認されたもの）１４株から、葉柄付
きの茎（脇芽増殖可能なもの）を切り取り、３μＭのノ
ルフルラゾン（ＳＡＮ９７８９、４‐ｃｈｌｏｒｏ‐５
‐ｍｅｔｙｌａｍｉｎｏ‐２‐（３‐ｔｒｉｆｌｕｏｒ
ｏｍｅｔｈｙｌｐｈｅｎｙｌ）‐ｐｙｒｉｄａｚｉｎ‐
３（２Ｈ）ｏｎｅ）を含み植物ホルモンを含まないＭＳ
培地に置床し、２６℃、１６時間光照射下、８時間暗黒
下の条件で培養を行った。コントロールとして、形質転
換しないタバコも同様に行った。その結果、ＥＴ４−１
を含む１１株には、部分的なブリーチング（葉が白くな
ること）が見られたが、コントロールと比べて、ブリー
チングの程度は小さかった。残りの３株には、全くブリ
ーチングは見られなかった。したがって、前者を中耐性
株、後者を強耐性株とした。なお、コントロールとし
て、同一のｉｎ ｖｉｔｒｏタバコ植物体（形質転換し
ないもの）から取得した複数の葉柄付きの茎を３μＭの
ノルフルラゾンを含み植物ホルモンを含まないＭＳ培地
に置床し上記と同様の条件で培養を行うと、コントロー
ルの中には、外見上、中耐性株とほぼ同等の耐性を有す
るものも現われた。したがって、中耐性株の場合、この
データだけでは、トランスジェニックタバコの除草剤耐
性の証明としては弱いので、さらに、次に示すように、
種々の実験を行った。
子ｃｒｔＩ発現植物体のノルフルラゾン耐性 植物ホルモンを含まないＭＳ培地で維持中のトランスジ
ェニックタバコ（ウエスタンブロット実験によりｃｒｔ
Ｉ遺伝子の発現が確認されたもの）１４株から、葉柄付
きの茎（脇芽増殖可能なもの）を切り取り、３μＭのノ
ルフルラゾン（ＳＡＮ９７８９、４‐ｃｈｌｏｒｏ‐５
‐ｍｅｔｙｌａｍｉｎｏ‐２‐（３‐ｔｒｉｆｌｕｏｒ
ｏｍｅｔｈｙｌｐｈｅｎｙｌ）‐ｐｙｒｉｄａｚｉｎ‐
３（２Ｈ）ｏｎｅ）を含み植物ホルモンを含まないＭＳ
培地に置床し、２６℃、１６時間光照射下、８時間暗黒
下の条件で培養を行った。コントロールとして、形質転
換しないタバコも同様に行った。その結果、ＥＴ４−１
を含む１１株には、部分的なブリーチング（葉が白くな
ること）が見られたが、コントロールと比べて、ブリー
チングの程度は小さかった。残りの３株には、全くブリ
ーチングは見られなかった。したがって、前者を中耐性
株、後者を強耐性株とした。なお、コントロールとし
て、同一のｉｎ ｖｉｔｒｏタバコ植物体（形質転換し
ないもの）から取得した複数の葉柄付きの茎を３μＭの
ノルフルラゾンを含み植物ホルモンを含まないＭＳ培地
に置床し上記と同様の条件で培養を行うと、コントロー
ルの中には、外見上、中耐性株とほぼ同等の耐性を有す
るものも現われた。したがって、中耐性株の場合、この
データだけでは、トランスジェニックタバコの除草剤耐
性の証明としては弱いので、さらに、次に示すように、
種々の実験を行った。
【００１３】実験例５：ブリーチング除草剤中耐性トラ
ンスジェニック植物の分析 免疫金粒子検出実験によりｃｒｔＩ遺伝子産物の葉緑体
への取り込みが確かめられたトランスジェニックタバコ
ＥＴ４−１を用いて、種々のブリーチング除草剤抵抗性
試験を行った。ｉｎ ｖｉｔｒｏで培養されているＥＴ
４−１と非形質転換タバコから、それぞれ、葉柄付きの
茎（脇芽増殖可能なもの）を切り取り、３μＭのノルフ
ルラゾンを含み植物ホルモンを含まないＭＳ培地に置床
し、２６℃、１６時間光照射下、８時間暗黒下の条件
で、１７日間、培養を行った。両者にブリーチングが認
められたが、ブリーチングの程度は、ＥＴ４−１よりコ
ントロールの非形質転換タバコの方が強かった。これら
の葉を用いてカロチノイド含有量とクロロフィル含量の
定量を行った結果を表１に示す。 表１ タバコ葉のカロチノイド色素、フィトエン、クロロフィル含量 色 素 コントロール植物 コントロール植物 ＥＴ４−１形質転換体 ３μＭノルフルラゾン存在下 カロチノイド色素 １．３ ０．２ ０．９ フィトエン ＜０．１ ０．６ ０．１ クロロフィル ８．９ １．５ ６．１ ３μＭノルフルラゾン存在下、ＥＴ４−１では、カロチ
ノイド色素とクロロフィル含量は、ノルフルラゾンを加
えないコントロールと比べて、３０％程の減少に過ぎな
いが、非形質転換体では、カロチノイド色素、クロロフ
ィル含量ともに８０％以上の減少を示し、フィトエンデ
サチュラーゼの基質であるフィトエンの蓄積が認められ
た。次に、ＥＴ４−１と非形質転換タバコを土壌に移植
し、１週間、通常の水で栽培した後、３μＭノルフルラ
ゾンを含む水を与え続けた。非形質転換タバコでは、ノ
ルフルラゾン添加後、６日目にブリーチングが認められ
始めたのに対し、ＥＴ４−１では、ノルフルラゾン添加
後、１１日目にブリーチングが認められ始めた。以上の
結果より、ＥＴ４−１は、ノルフルラゾンに対して、あ
る程度の抵抗性を獲得していると結論した。同様にし
て、ノルフルラゾンだけでなく、他のフィトエンデサチ
ュラーゼ阻害剤であるフルリドン（ＥＬ１７１、１‐ｍ
ｅｔｈｙｌ‐３‐ｐｈｅｎｙｌ‐５‐（３‐ｔｒｉｆｌ
ｕｏｒｏｍｅｔｈｙｌｐｈｅｎｙｌ）‐４（１Ｈ）‐ｐ
ｙｒｉｄｏｎｅ）、ζ‐カロチンデサチュラーゼ阻害剤
であるＳＡＮ３８０Ｈ（下記構造式参照）およびＪ８５
２（下記構造式参照）に対しても、抵抗性が上昇してい
ることがわかった。さらに、これらの植物体から種子を
取り、種子から発芽した幼植物を用いて、このブリーチ
ング除草剤抵抗性が次世代に受け継がれることを確認し
た。
ンスジェニック植物の分析 免疫金粒子検出実験によりｃｒｔＩ遺伝子産物の葉緑体
への取り込みが確かめられたトランスジェニックタバコ
ＥＴ４−１を用いて、種々のブリーチング除草剤抵抗性
試験を行った。ｉｎ ｖｉｔｒｏで培養されているＥＴ
４−１と非形質転換タバコから、それぞれ、葉柄付きの
茎（脇芽増殖可能なもの）を切り取り、３μＭのノルフ
ルラゾンを含み植物ホルモンを含まないＭＳ培地に置床
し、２６℃、１６時間光照射下、８時間暗黒下の条件
で、１７日間、培養を行った。両者にブリーチングが認
められたが、ブリーチングの程度は、ＥＴ４−１よりコ
ントロールの非形質転換タバコの方が強かった。これら
の葉を用いてカロチノイド含有量とクロロフィル含量の
定量を行った結果を表１に示す。 表１ タバコ葉のカロチノイド色素、フィトエン、クロロフィル含量 色 素 コントロール植物 コントロール植物 ＥＴ４−１形質転換体 ３μＭノルフルラゾン存在下 カロチノイド色素 １．３ ０．２ ０．９ フィトエン ＜０．１ ０．６ ０．１ クロロフィル ８．９ １．５ ６．１ ３μＭノルフルラゾン存在下、ＥＴ４−１では、カロチ
ノイド色素とクロロフィル含量は、ノルフルラゾンを加
えないコントロールと比べて、３０％程の減少に過ぎな
いが、非形質転換体では、カロチノイド色素、クロロフ
ィル含量ともに８０％以上の減少を示し、フィトエンデ
サチュラーゼの基質であるフィトエンの蓄積が認められ
た。次に、ＥＴ４−１と非形質転換タバコを土壌に移植
し、１週間、通常の水で栽培した後、３μＭノルフルラ
ゾンを含む水を与え続けた。非形質転換タバコでは、ノ
ルフルラゾン添加後、６日目にブリーチングが認められ
始めたのに対し、ＥＴ４−１では、ノルフルラゾン添加
後、１１日目にブリーチングが認められ始めた。以上の
結果より、ＥＴ４−１は、ノルフルラゾンに対して、あ
る程度の抵抗性を獲得していると結論した。同様にし
て、ノルフルラゾンだけでなく、他のフィトエンデサチ
ュラーゼ阻害剤であるフルリドン（ＥＬ１７１、１‐ｍ
ｅｔｈｙｌ‐３‐ｐｈｅｎｙｌ‐５‐（３‐ｔｒｉｆｌ
ｕｏｒｏｍｅｔｈｙｌｐｈｅｎｙｌ）‐４（１Ｈ）‐ｐ
ｙｒｉｄｏｎｅ）、ζ‐カロチンデサチュラーゼ阻害剤
であるＳＡＮ３８０Ｈ（下記構造式参照）およびＪ８５
２（下記構造式参照）に対しても、抵抗性が上昇してい
ることがわかった。さらに、これらの植物体から種子を
取り、種子から発芽した幼植物を用いて、このブリーチ
ング除草剤抵抗性が次世代に受け継がれることを確認し
た。
【化１】
【化２】
【００１４】実験例６：ブリーチング除草剤強耐性トラ
ンスジェニック植物の分析 ３μＭのノルフルラゾンを含むＭＳ培地で全くブリーチ
ングを生じなかった３株のトランスジェニックタバコの
うち１株ＥＴ４−２０８を用いて、さらなるブリーチン
グ除草剤抵抗性試験を行った。ｉｎ ｖｉｔｒｏで培養
されているＥＴ４−２０８と非形質転換タバコから、そ
れぞれ葉柄付きの茎（脇芽増殖可能なもの）を切り取
り、１０μＭのノルフルラゾンを含み植物ホルモンを含
まないＭＳ培地、および、３μＭのフルリドンを含み植
物ホルモンを含まないＭＳ培地に置床し、２６℃、１６
時間光照射下、８時間暗黒下の条件で、２８日間、培養
を行った。その結果、１０μＭのノルフルラゾン、３μ
Ｍのフルリドンともに、非形質転換タバコにおいては、
強いブリーチングが生じ、茎葉は白色を呈した。一方、
ＥＴ４−２０８には、１０μＭのノルフルラゾン、３μ
Ｍのフルリドンともに全くブリーチングは認められな
く、このｉｎ ｖｉｔｒｏ植物体は、除草剤を含まない
培地でのコントロールタバコと同程度に正常に生育し
た。さらに、１０μＭのノルフルラゾン存在下のＥＴ４
−２０８の茎葉を用いて、カロチノイド含量とクロロフ
ィル含量の定量を行い、クロロフィル、カロチノイド含
量ともに、ノルフルラゾンを加えないコントロールと同
じであることを確認した。次に、植物ホルモンを含まな
いＭＳ培地で発根しているＥＴ４−２０８と非形質転換
タバコを土壌に移植し、１週間、通常の水で栽培した
後、３μＭノルフルラゾンを含む水を与え続けた。非形
質転換タバコでは、ノルフルラゾン添加後、６日目にブ
リーチングが認められ始め、２５日以内に枯死したが、
ＥＴ４−２０８は、全くブリーチングを呈すること無く
正常に生育し、ノルフルラゾン添加後２ケ月以内に種子
を形成した。以上の結果より、ＥＴ４−２０８は、ノル
フルラゾンやフルリドン等の植物型のフィトエンデサチ
ュラーゼを阻害するブリーチング除草剤に対して強力な
耐性能を獲得していることがわかった。
ンスジェニック植物の分析 ３μＭのノルフルラゾンを含むＭＳ培地で全くブリーチ
ングを生じなかった３株のトランスジェニックタバコの
うち１株ＥＴ４−２０８を用いて、さらなるブリーチン
グ除草剤抵抗性試験を行った。ｉｎ ｖｉｔｒｏで培養
されているＥＴ４−２０８と非形質転換タバコから、そ
れぞれ葉柄付きの茎（脇芽増殖可能なもの）を切り取
り、１０μＭのノルフルラゾンを含み植物ホルモンを含
まないＭＳ培地、および、３μＭのフルリドンを含み植
物ホルモンを含まないＭＳ培地に置床し、２６℃、１６
時間光照射下、８時間暗黒下の条件で、２８日間、培養
を行った。その結果、１０μＭのノルフルラゾン、３μ
Ｍのフルリドンともに、非形質転換タバコにおいては、
強いブリーチングが生じ、茎葉は白色を呈した。一方、
ＥＴ４−２０８には、１０μＭのノルフルラゾン、３μ
Ｍのフルリドンともに全くブリーチングは認められな
く、このｉｎ ｖｉｔｒｏ植物体は、除草剤を含まない
培地でのコントロールタバコと同程度に正常に生育し
た。さらに、１０μＭのノルフルラゾン存在下のＥＴ４
−２０８の茎葉を用いて、カロチノイド含量とクロロフ
ィル含量の定量を行い、クロロフィル、カロチノイド含
量ともに、ノルフルラゾンを加えないコントロールと同
じであることを確認した。次に、植物ホルモンを含まな
いＭＳ培地で発根しているＥＴ４−２０８と非形質転換
タバコを土壌に移植し、１週間、通常の水で栽培した
後、３μＭノルフルラゾンを含む水を与え続けた。非形
質転換タバコでは、ノルフルラゾン添加後、６日目にブ
リーチングが認められ始め、２５日以内に枯死したが、
ＥＴ４−２０８は、全くブリーチングを呈すること無く
正常に生育し、ノルフルラゾン添加後２ケ月以内に種子
を形成した。以上の結果より、ＥＴ４−２０８は、ノル
フルラゾンやフルリドン等の植物型のフィトエンデサチ
ュラーゼを阻害するブリーチング除草剤に対して強力な
耐性能を獲得していることがわかった。
【００１５】実験例７：トランスジェニック植物のζ‐
カロチンデサチュラーゼ阻害剤に対する耐性試験 植物型のフィトエンデサチュラーゼを阻害するブリーチ
ング除草剤に対して耐性であることがわかったトランス
ジェニックタバコＥＴ４−２０８を用いて、ζ‐カロチ
ンデサチュラーゼを阻害するブリーチング除草剤に対す
る抵抗性試験を行った。ｉｎ ｖｉｔｒｏで培養されて
いるＥＴ４−２０８と非形質転換タバコから、それぞ
れ、葉柄付きの茎（脇芽増殖可能なもの）を切り取り、
１０μＭのＳＡＮ３８０Ｈを含み植物ホルモンを含まな
いＭＳ培地、および、２０μＭのＪ８５２を含み植物ホ
ルモンを含まないＭＳ培地に置床し、２６℃、１６時間
光照射下、８時間暗黒下の条件で、１４日間、培養を行
った。その結果、１０μＭのＳＡＮ３８０Ｈ、２０μＭ
のＪ８５２ともに、非形質転換タバコにおいては、強い
ブリーチングが生じ、茎葉は白色を呈した。一方、ＥＴ
４−２０８には、１０μＭのＳＡＮ３８０Ｈ、２０μＭ
のＪ８５２ともに全くブリーチングは認められなく、こ
のｉｎ ｖｉｔｒｏ植物体は、除草剤を含まない培地で
のコントロールタバコと同程度に正常に生育した。さら
に、１０μＭ ＳＡＮ３８０Ｈ存在下のＥＴ４−２０８
の茎葉を用いて、カロチノイド含量とクロロフィル含量
の定量を行い、クロロフィル、カロチノイド含量とも
に、ＳＡＮ３８０Ｈを加えないコントロールと同じであ
ることを確認した。次に、植物ホルモンを含まないＭＳ
培地で発根しているＥＴ４−２０８と非形質転換タバコ
を土壌に移植し、５日間、通常の水で栽培した後、１０
μＭのＪ８５２を含む水を与え続けた。非形質転換タバ
コでは、Ｊ８５２添加後、１０日目にブリーチングが認
められ始め、４０日以内に枯死したが、ＥＴ４−２０８
は、全くブリーチングを呈すること無く正常に生育し、
Ｊ８５２添加後２ケ月以内に種子を形成した。以上の結
果より、ＥＴ４−２０８は、ノルフルラゾンやフルリド
ン等の植物型のフィトエンデサチュラーゼを阻害するブ
リーチング除草剤に対してだけでなく、ＳＡＮ３８０Ｈ
やＪ８５２等のζ‐カロチンデサチュラーゼを阻害する
ブリーチング除草剤に対しても強力な耐性能を獲得して
いることがわかった。
カロチンデサチュラーゼ阻害剤に対する耐性試験 植物型のフィトエンデサチュラーゼを阻害するブリーチ
ング除草剤に対して耐性であることがわかったトランス
ジェニックタバコＥＴ４−２０８を用いて、ζ‐カロチ
ンデサチュラーゼを阻害するブリーチング除草剤に対す
る抵抗性試験を行った。ｉｎ ｖｉｔｒｏで培養されて
いるＥＴ４−２０８と非形質転換タバコから、それぞ
れ、葉柄付きの茎（脇芽増殖可能なもの）を切り取り、
１０μＭのＳＡＮ３８０Ｈを含み植物ホルモンを含まな
いＭＳ培地、および、２０μＭのＪ８５２を含み植物ホ
ルモンを含まないＭＳ培地に置床し、２６℃、１６時間
光照射下、８時間暗黒下の条件で、１４日間、培養を行
った。その結果、１０μＭのＳＡＮ３８０Ｈ、２０μＭ
のＪ８５２ともに、非形質転換タバコにおいては、強い
ブリーチングが生じ、茎葉は白色を呈した。一方、ＥＴ
４−２０８には、１０μＭのＳＡＮ３８０Ｈ、２０μＭ
のＪ８５２ともに全くブリーチングは認められなく、こ
のｉｎ ｖｉｔｒｏ植物体は、除草剤を含まない培地で
のコントロールタバコと同程度に正常に生育した。さら
に、１０μＭ ＳＡＮ３８０Ｈ存在下のＥＴ４−２０８
の茎葉を用いて、カロチノイド含量とクロロフィル含量
の定量を行い、クロロフィル、カロチノイド含量とも
に、ＳＡＮ３８０Ｈを加えないコントロールと同じであ
ることを確認した。次に、植物ホルモンを含まないＭＳ
培地で発根しているＥＴ４−２０８と非形質転換タバコ
を土壌に移植し、５日間、通常の水で栽培した後、１０
μＭのＪ８５２を含む水を与え続けた。非形質転換タバ
コでは、Ｊ８５２添加後、１０日目にブリーチングが認
められ始め、４０日以内に枯死したが、ＥＴ４−２０８
は、全くブリーチングを呈すること無く正常に生育し、
Ｊ８５２添加後２ケ月以内に種子を形成した。以上の結
果より、ＥＴ４−２０８は、ノルフルラゾンやフルリド
ン等の植物型のフィトエンデサチュラーゼを阻害するブ
リーチング除草剤に対してだけでなく、ＳＡＮ３８０Ｈ
やＪ８５２等のζ‐カロチンデサチュラーゼを阻害する
ブリーチング除草剤に対しても強力な耐性能を獲得して
いることがわかった。
【００１６】実験例８：ζ‐カロチンデサチュラーゼ阻
害剤に対するマーカー遺伝子Ｅｒｗｉｎｉａ のフィトエンデサチュラーゼ遺伝子ｃｒ
ｔＩがζ‐カロチンデサチュラーゼ阻害剤に対するマー
カー遺伝子として使えることを示すため、以下の実験を
行った。プラスミドｐＹＰＩＥＴ４を有するＡ． ｔｕ
ｍｅｆａｃｉｅｎｓ接合体を用いて、リーフディスク法
（Horsch, R.B.; Fry, J.E.; Hoffmann, N.L.; Eichhol
tz, D.; Rogers, S.G.; Fraley, R.T. A simple and ge
neral method for transferring genes into plants. S
cience, Vol. 227, p.1229-1231 (1985)参照）により、
タバコ植物（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｔａｂａｃｕｍ ｖ
ａｒｉｅｔｉｅｓＳａｍｓｕｎ）への感染処理を行っ
た。２日間、フィーダープレート上で培養した後、感染
処理したタバコの葉を、カナマイシンの変わりに２０μ
ＭのＳＡＮ３８０Ｈを含み、３００μｇ／ｍｌのクラフ
ォラン、１ｍｇ／ｌのベンジルアデニン、０．１ｍｇ／
ｌのＮＡＡを含むＭＳプレート上に移し、２６℃、１６
時間光照射下、８時間暗黒下の条件で培養を行った。コ
ントロールとして、３００μｇ／ｍｌのクラフォラン、
１ｍｇ／ｌのベンジルアデニン、０．１ｍｇ／ｌのＮＡ
Ａのみを含むＭＳプレート、および、１００μｇ／ｍｌ
のカナマイシンを含み、３００μｇ／ｍｌのクラフォラ
ン、１ｍｇ／ｌのベンジルアデニン、０．１ｍｇ／ｌの
ＮＡＡを含むＭＳプレート上にも置床し、同様にして培
養を行った。そして、これら各々のタバコ葉のディスク
を、２週間おきに、同じプレート上に置床した。ＳＡＮ
３８０Ｈもカナマイシンも含まないコントロールのプレ
ート上では、培養２週間目から多くの不定芽が形成され
始め、培養４週間目には、葉ディスク一面にカルスと不
定芽が形成された。培養４週間目では、１プレートあた
り（６個のディスクを置床したプレート１つあたり）、
緑色カルスから３０個程度の緑色の不定芽が形成されて
いた。一方、カナマイシンを含む通常の形質転換選抜用
のプレート上では、培養４週間目には、１プレートあた
り、１−２個の不定芽しか形成されていなかったので、
カナマイシンを含まないプレート上で形成された不定芽
の大部分は形質転換体ではないと考えられた。一方、カ
ナマシインの変わりにＳＡＮ３８０Ｈを含むプレート上
では、培養４週間目には、１プレートあたり、２０個程
度の白い不定芽が観察されたが、ＳＡＮ３８０Ｈもカナ
マイシンも含まないコントロールのものと比べて、不定
芽の生育は悪かった。そして、この多くの白い不定芽に
混って、１プレートあたり、３個の正常に生育する緑色
の不定芽が形成されていた。この緑色の不定芽の生育
は、１００μｇ／ｍｌのカナマシインを含むプレートで
生えてきたものより優れていた。また、この緑色の不定
芽を単離し、カナマイシンを含むＭＳプレート上に置床
しても正常に生育することができた。次に、ＳＡＮ３８
０Ｈを含むプレート上で形成した緑色の不定芽を単離
し、植物ホルモンを含まないＭＳ培地上に移し培養する
ことにより幼植物体を形成させた。これらの幼植物体の
葉から染色体ＤＮＡを取得し、サザン分析を行うことに
より、ｃｒｔＩ遺伝子とカナマイシン耐性遺伝子ＮＰＴ
IIとの両方が組み込まれていることを確認した。このこ
とは、選択マーカーとしてのＳＡＮ３８０Ｈにより、外
来遺伝子としてのカナマイシン耐性遺伝子が導入された
植物体を選抜できたということを意味している。したが
って、Ｅｒｗｉｎｉａのフィトエンデサチュラーゼ遺伝
子ｃｒｔＩはＳＡＮ３８０Ｈ等のζ‐カロチンデサチュ
ラーゼ阻害剤に対するマーカー遺伝子として使えること
が明かとなった。
害剤に対するマーカー遺伝子Ｅｒｗｉｎｉａ のフィトエンデサチュラーゼ遺伝子ｃｒ
ｔＩがζ‐カロチンデサチュラーゼ阻害剤に対するマー
カー遺伝子として使えることを示すため、以下の実験を
行った。プラスミドｐＹＰＩＥＴ４を有するＡ． ｔｕ
ｍｅｆａｃｉｅｎｓ接合体を用いて、リーフディスク法
（Horsch, R.B.; Fry, J.E.; Hoffmann, N.L.; Eichhol
tz, D.; Rogers, S.G.; Fraley, R.T. A simple and ge
neral method for transferring genes into plants. S
cience, Vol. 227, p.1229-1231 (1985)参照）により、
タバコ植物（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｔａｂａｃｕｍ ｖ
ａｒｉｅｔｉｅｓＳａｍｓｕｎ）への感染処理を行っ
た。２日間、フィーダープレート上で培養した後、感染
処理したタバコの葉を、カナマイシンの変わりに２０μ
ＭのＳＡＮ３８０Ｈを含み、３００μｇ／ｍｌのクラフ
ォラン、１ｍｇ／ｌのベンジルアデニン、０．１ｍｇ／
ｌのＮＡＡを含むＭＳプレート上に移し、２６℃、１６
時間光照射下、８時間暗黒下の条件で培養を行った。コ
ントロールとして、３００μｇ／ｍｌのクラフォラン、
１ｍｇ／ｌのベンジルアデニン、０．１ｍｇ／ｌのＮＡ
Ａのみを含むＭＳプレート、および、１００μｇ／ｍｌ
のカナマイシンを含み、３００μｇ／ｍｌのクラフォラ
ン、１ｍｇ／ｌのベンジルアデニン、０．１ｍｇ／ｌの
ＮＡＡを含むＭＳプレート上にも置床し、同様にして培
養を行った。そして、これら各々のタバコ葉のディスク
を、２週間おきに、同じプレート上に置床した。ＳＡＮ
３８０Ｈもカナマイシンも含まないコントロールのプレ
ート上では、培養２週間目から多くの不定芽が形成され
始め、培養４週間目には、葉ディスク一面にカルスと不
定芽が形成された。培養４週間目では、１プレートあた
り（６個のディスクを置床したプレート１つあたり）、
緑色カルスから３０個程度の緑色の不定芽が形成されて
いた。一方、カナマイシンを含む通常の形質転換選抜用
のプレート上では、培養４週間目には、１プレートあた
り、１−２個の不定芽しか形成されていなかったので、
カナマイシンを含まないプレート上で形成された不定芽
の大部分は形質転換体ではないと考えられた。一方、カ
ナマシインの変わりにＳＡＮ３８０Ｈを含むプレート上
では、培養４週間目には、１プレートあたり、２０個程
度の白い不定芽が観察されたが、ＳＡＮ３８０Ｈもカナ
マイシンも含まないコントロールのものと比べて、不定
芽の生育は悪かった。そして、この多くの白い不定芽に
混って、１プレートあたり、３個の正常に生育する緑色
の不定芽が形成されていた。この緑色の不定芽の生育
は、１００μｇ／ｍｌのカナマシインを含むプレートで
生えてきたものより優れていた。また、この緑色の不定
芽を単離し、カナマイシンを含むＭＳプレート上に置床
しても正常に生育することができた。次に、ＳＡＮ３８
０Ｈを含むプレート上で形成した緑色の不定芽を単離
し、植物ホルモンを含まないＭＳ培地上に移し培養する
ことにより幼植物体を形成させた。これらの幼植物体の
葉から染色体ＤＮＡを取得し、サザン分析を行うことに
より、ｃｒｔＩ遺伝子とカナマイシン耐性遺伝子ＮＰＴ
IIとの両方が組み込まれていることを確認した。このこ
とは、選択マーカーとしてのＳＡＮ３８０Ｈにより、外
来遺伝子としてのカナマイシン耐性遺伝子が導入された
植物体を選抜できたということを意味している。したが
って、Ｅｒｗｉｎｉａのフィトエンデサチュラーゼ遺伝
子ｃｒｔＩはＳＡＮ３８０Ｈ等のζ‐カロチンデサチュ
ラーゼ阻害剤に対するマーカー遺伝子として使えること
が明かとなった。
【００１７】実験例９：シアノバクテリアのζ‐カロチ
ンデサチュラーゼ遺伝子ｚｄｓの塩基配列の決定 Ｌｉｎｄｅｎらによってクローニングされたシアノバク
テリアＡｎａｂａｅｎａ ＰＣＣ７１２０のζ‐カロチ
ンデサチュラーゼ遺伝子ｚｄｓ（Linden, H.;Vioque,
A.; Sandmann, G. Isolation of a carotenoid biosynt
hesis gene coding for ζ-carotene desaturase from
Anabaena PCC7120 by heterologous complementation.
FEMS Microbiol. Lett., Vol. 106, p.99-103 (1993)参
照）の塩基配列の決定を、エキソヌクレアーゼIII とマ
ングビーンヌクレアーゼを組み合わせたデレーション反
応の後、ダイデオキシ法により行った。４９９アミノ酸
からなるペプチドをコード可能な１４９７ｂｐのオープ
ンリーディングフレームが観察された。図３〜５（配列
表：配列番号１）にその塩基配列とそこから推定したア
ミノ酸配列を示した。ζ‐カロチンデサチュラーゼ遺伝
子の塩基配列やアミノ酸配列はこの報告が最初である。
さらに、Ｇｅｎｂａｎｋ、ＥＭＢＬのデーターベースを
用いて、ｚｄｓ遺伝子産物（Ｚｄｓ）のホモロジー検索
を行ったところ、ホモロジーが認められたものは、すべ
て、カロチノドデサチュラーゼであった。このカロチノ
イドデサチュラーゼは、Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ ｃａ
ｐｓｕｌａｔｕｓのｃｒｔＤ以外は、すべて、フィトエ
ンデサチュラーゼであった。その中で特に高いホモロジ
ーが認められたのは、ＥｒｗｉｎｉａとＲ． ｃａｐｓ
ｕｌａｔｕｓのＣｒｔＩであった。図６〜７に、Ｚｄｓ
とＥｒ． ｕｒｅｄｏｖｏｒａのＣｒｔＩ、および、
Ｒ．ｃａｐｓｕｌａｔｕｓのＣｒｔＩのアミノ酸配列の
比較を行った結果を示した。ギャップを考慮したホモロ
ジー分析の結果、Ｚｄｓは、Ｅｒ． ｕｒｅｄｏｖ ｏｒ
ａのＣｒｔＩ、および、Ｒ． ｃａｐｓｕｌａｔｕｓの
ＣｒｔＩと、それぞれ、３６％、３４％のアイデンティ
ティーを示した。一方、植物やシアノバクテリアのフィ
トエンデサチュラーゼとは、一部のＮ‐末領域を除い
て、ほとんどホモロジーは認められなかった。この領域
は、ＮＡＤやＦＡＤ等の補酵素の結合領域であると推定
されている。この領域のみ、シアノバクテリアＳｙｎｅ
ｃｈｏｃｏｃｃｕｓ ＰＣＣ７９４２のフィトエンデサ
チュラーゼ遺伝子ｐｄｓ（Chamovitz, D; Pecker, I.;
Hirschberg, J. The molecular basis of resistance t
othe herbicide norflurazon. J. Plant Mol. Biol., V
ol. 16, p.967-974 (1991) 参照）、および、ダイズの
フィトエンデサチュラーゼｐｄｓ１（Bartley, G.E.; V
itanen, P.V.; Pecker, I.; Chamovitz, D.; Hirschber
g. J.; Scolnik, P.A. Molecular cloning and express
ion in photosynthetic bacteria of a soybean cDNA c
oding for phytoene desaturase, an enzyme of the ca
rotenoid biosynthesis pathway. Proc. Natl. Acad. S
ci.USA, Vol. 88, p.6532-6536 (1991) 参照）を合わせ
て図６〜７に示した。
ンデサチュラーゼ遺伝子ｚｄｓの塩基配列の決定 Ｌｉｎｄｅｎらによってクローニングされたシアノバク
テリアＡｎａｂａｅｎａ ＰＣＣ７１２０のζ‐カロチ
ンデサチュラーゼ遺伝子ｚｄｓ（Linden, H.;Vioque,
A.; Sandmann, G. Isolation of a carotenoid biosynt
hesis gene coding for ζ-carotene desaturase from
Anabaena PCC7120 by heterologous complementation.
FEMS Microbiol. Lett., Vol. 106, p.99-103 (1993)参
照）の塩基配列の決定を、エキソヌクレアーゼIII とマ
ングビーンヌクレアーゼを組み合わせたデレーション反
応の後、ダイデオキシ法により行った。４９９アミノ酸
からなるペプチドをコード可能な１４９７ｂｐのオープ
ンリーディングフレームが観察された。図３〜５（配列
表：配列番号１）にその塩基配列とそこから推定したア
ミノ酸配列を示した。ζ‐カロチンデサチュラーゼ遺伝
子の塩基配列やアミノ酸配列はこの報告が最初である。
さらに、Ｇｅｎｂａｎｋ、ＥＭＢＬのデーターベースを
用いて、ｚｄｓ遺伝子産物（Ｚｄｓ）のホモロジー検索
を行ったところ、ホモロジーが認められたものは、すべ
て、カロチノドデサチュラーゼであった。このカロチノ
イドデサチュラーゼは、Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ ｃａ
ｐｓｕｌａｔｕｓのｃｒｔＤ以外は、すべて、フィトエ
ンデサチュラーゼであった。その中で特に高いホモロジ
ーが認められたのは、ＥｒｗｉｎｉａとＲ． ｃａｐｓ
ｕｌａｔｕｓのＣｒｔＩであった。図６〜７に、Ｚｄｓ
とＥｒ． ｕｒｅｄｏｖｏｒａのＣｒｔＩ、および、
Ｒ．ｃａｐｓｕｌａｔｕｓのＣｒｔＩのアミノ酸配列の
比較を行った結果を示した。ギャップを考慮したホモロ
ジー分析の結果、Ｚｄｓは、Ｅｒ． ｕｒｅｄｏｖ ｏｒ
ａのＣｒｔＩ、および、Ｒ． ｃａｐｓｕｌａｔｕｓの
ＣｒｔＩと、それぞれ、３６％、３４％のアイデンティ
ティーを示した。一方、植物やシアノバクテリアのフィ
トエンデサチュラーゼとは、一部のＮ‐末領域を除い
て、ほとんどホモロジーは認められなかった。この領域
は、ＮＡＤやＦＡＤ等の補酵素の結合領域であると推定
されている。この領域のみ、シアノバクテリアＳｙｎｅ
ｃｈｏｃｏｃｃｕｓ ＰＣＣ７９４２のフィトエンデサ
チュラーゼ遺伝子ｐｄｓ（Chamovitz, D; Pecker, I.;
Hirschberg, J. The molecular basis of resistance t
othe herbicide norflurazon. J. Plant Mol. Biol., V
ol. 16, p.967-974 (1991) 参照）、および、ダイズの
フィトエンデサチュラーゼｐｄｓ１（Bartley, G.E.; V
itanen, P.V.; Pecker, I.; Chamovitz, D.; Hirschber
g. J.; Scolnik, P.A. Molecular cloning and express
ion in photosynthetic bacteria of a soybean cDNA c
oding for phytoene desaturase, an enzyme of the ca
rotenoid biosynthesis pathway. Proc. Natl. Acad. S
ci.USA, Vol. 88, p.6532-6536 (1991) 参照）を合わせ
て図６〜７に示した。
【００１８】
【発明の効果】背 景 前述したように、フィトエンデサチュラーゼは、遺伝子
レベルで今までに明かにされたカロチノイド合成酵素の
中で、唯一、生物間で多様性を有している酵素である。
また、前述したように、植物において、フェトエンから
ζ‐カロチンを経てリコピンに至るデサチュレーション
反応は、ブリーチング除草剤と呼ばれる多くの除草剤の
作用部位である。Ｅｒｗｉｎｉａのフィトエンデサチュ
ラーゼは、フィトエンからζ‐カロチンを経てリコピン
に至るデサチュレーション反応を一つの酵素で触媒でき
る酵素であり（前記Journal of Bacteriology, Vol. 17
2,No.12, p.6704-6712 (1992)、および本発明者らによ
る前記特許出願明細書）、Ｅｒｗｉｎｉａのフィトエン
デサチュラーゼのような強力な脱水素機能を示す酵素
は、現在までにその機能が明かにされているいくつかの
生物のフィトエンデサチュラーゼの中では唯一のもので
ある。また、前述したように、Ｅｒｗｉｎｉａのフィト
エンデサチュラーゼと植物のフィトエンデサチュラーゼ
は、アミノ酸配列レベルで、ホモロジーは一部のＮ‐末
領域を除いて見出されないことから、Ｅｒｗｉｎｉａの
フィトエンデサチュラーゼ遺伝子を、葉緑体への移行に
必要なトランジットペプチド配列を付加して植物に導入
することにより、植物のフィトエンデサチュラーゼを阻
害する除草剤に抵抗性を与えることが可能であることが
予想される。一方、植物のζ‐カロチンデサチュラーゼ
を阻害する除草剤に対する抵抗性に関しては、最近、よ
うやく、シアノバクテリアＡｎａｂａｅｎａ ＰＣＣ７
１２０からこの酵素をコードする遺伝子がクローニング
されたばかりであり（前記FEMS Microbiol. Lett., Vo
l. 106, p.99-103 (1993)参照）、そのアミノ酸配列が
まだ明かにされていないことや、この抵抗性に関する研
究例が現在までに全く無いことから、Ｅｒｗｉｎｉａの
フィトエンデサチュラーゼ遺伝子を利用して、ζ‐カロ
チンデサチュラーゼ阻害剤に対する抵抗性を植物に与え
られるかどうかは全くわからないのが現状であった。さ
らに、本発明者らは、最近シアノバクテリアからクロー
ニングされたこのζ‐カロチンデサチュラーゼ遺伝子の
塩基配列を決定し、そこから推定したアミノ酸配列をす
でに報告されているいろいろな生物種のフィトエンデサ
チュラーゼと比較をした。その結果、驚くべきことに、
このζ‐カロチンデサチュラーゼ遺伝子産物は、シアノ
バクテリアや植物のフィトエンデサチュラーゼと、一部
のＮ‐末領域を除いてホモロジーはほとんど見出され
ず、むしろ、ＥｒｗｉｎｉａやＲｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ
ｃａｐｓｕｌａｔｕｓのフィトエンデサチュラーゼと
約３５％という意義深いホモロジーを示した。このこと
から、Ｅｒｗｉｎｉａのフィトエンデサチュラーゼと植
物のζ‐カロチンデサチュラーゼとは構造がよく似てい
ると考えられるので、当業者であれば、Ｅｒｗｉｎｉａ
のフィトエンデサチュラーゼ遺伝子は、植物のζ‐カロ
チンデサチュラーゼを阻害する除草剤に対する抵抗性を
与えることはできないと予測するであろう。一方、植物
の形質転換実験は、植物病原菌Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉ
ｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓのＴｉプラスミドの系を
用いて、現在では普通に行われているが、外来遺伝子が
植物に導入されたことを示すマーカー遺伝子は、抗生物
質耐性遺伝子であるカナマイシンやハイグロマイシン耐
性遺伝子位しか実際に使えるものは無く、このことが、
これらの薬剤に抵抗性を示す種々の植物種の形質転換
や、一つの植物体への複数の遺伝子の導入実験等を困難
なものにしていた。本発明の効果 本発明により、フィトエンをリコピンに変換する酵素活
性を有するフィトエンデサチュラーゼ遺伝子を利用し
て、ノルフルラゾンやフルリドンのような植物のフィト
エンデサチュラーゼを阻害する除草剤だけでなく、ＳＡ
Ｎ３８０ＨやＪ８５２等の植物のζ‐カロチンデサチュ
ラーゼを阻害する除草剤に対する耐性を植物に与えるこ
とが可能になったとともに、これらの除草剤を形質転換
時のマーカーとして使用することが可能になった。
レベルで今までに明かにされたカロチノイド合成酵素の
中で、唯一、生物間で多様性を有している酵素である。
また、前述したように、植物において、フェトエンから
ζ‐カロチンを経てリコピンに至るデサチュレーション
反応は、ブリーチング除草剤と呼ばれる多くの除草剤の
作用部位である。Ｅｒｗｉｎｉａのフィトエンデサチュ
ラーゼは、フィトエンからζ‐カロチンを経てリコピン
に至るデサチュレーション反応を一つの酵素で触媒でき
る酵素であり（前記Journal of Bacteriology, Vol. 17
2,No.12, p.6704-6712 (1992)、および本発明者らによ
る前記特許出願明細書）、Ｅｒｗｉｎｉａのフィトエン
デサチュラーゼのような強力な脱水素機能を示す酵素
は、現在までにその機能が明かにされているいくつかの
生物のフィトエンデサチュラーゼの中では唯一のもので
ある。また、前述したように、Ｅｒｗｉｎｉａのフィト
エンデサチュラーゼと植物のフィトエンデサチュラーゼ
は、アミノ酸配列レベルで、ホモロジーは一部のＮ‐末
領域を除いて見出されないことから、Ｅｒｗｉｎｉａの
フィトエンデサチュラーゼ遺伝子を、葉緑体への移行に
必要なトランジットペプチド配列を付加して植物に導入
することにより、植物のフィトエンデサチュラーゼを阻
害する除草剤に抵抗性を与えることが可能であることが
予想される。一方、植物のζ‐カロチンデサチュラーゼ
を阻害する除草剤に対する抵抗性に関しては、最近、よ
うやく、シアノバクテリアＡｎａｂａｅｎａ ＰＣＣ７
１２０からこの酵素をコードする遺伝子がクローニング
されたばかりであり（前記FEMS Microbiol. Lett., Vo
l. 106, p.99-103 (1993)参照）、そのアミノ酸配列が
まだ明かにされていないことや、この抵抗性に関する研
究例が現在までに全く無いことから、Ｅｒｗｉｎｉａの
フィトエンデサチュラーゼ遺伝子を利用して、ζ‐カロ
チンデサチュラーゼ阻害剤に対する抵抗性を植物に与え
られるかどうかは全くわからないのが現状であった。さ
らに、本発明者らは、最近シアノバクテリアからクロー
ニングされたこのζ‐カロチンデサチュラーゼ遺伝子の
塩基配列を決定し、そこから推定したアミノ酸配列をす
でに報告されているいろいろな生物種のフィトエンデサ
チュラーゼと比較をした。その結果、驚くべきことに、
このζ‐カロチンデサチュラーゼ遺伝子産物は、シアノ
バクテリアや植物のフィトエンデサチュラーゼと、一部
のＮ‐末領域を除いてホモロジーはほとんど見出され
ず、むしろ、ＥｒｗｉｎｉａやＲｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ
ｃａｐｓｕｌａｔｕｓのフィトエンデサチュラーゼと
約３５％という意義深いホモロジーを示した。このこと
から、Ｅｒｗｉｎｉａのフィトエンデサチュラーゼと植
物のζ‐カロチンデサチュラーゼとは構造がよく似てい
ると考えられるので、当業者であれば、Ｅｒｗｉｎｉａ
のフィトエンデサチュラーゼ遺伝子は、植物のζ‐カロ
チンデサチュラーゼを阻害する除草剤に対する抵抗性を
与えることはできないと予測するであろう。一方、植物
の形質転換実験は、植物病原菌Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉ
ｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓのＴｉプラスミドの系を
用いて、現在では普通に行われているが、外来遺伝子が
植物に導入されたことを示すマーカー遺伝子は、抗生物
質耐性遺伝子であるカナマイシンやハイグロマイシン耐
性遺伝子位しか実際に使えるものは無く、このことが、
これらの薬剤に抵抗性を示す種々の植物種の形質転換
や、一つの植物体への複数の遺伝子の導入実験等を困難
なものにしていた。本発明の効果 本発明により、フィトエンをリコピンに変換する酵素活
性を有するフィトエンデサチュラーゼ遺伝子を利用し
て、ノルフルラゾンやフルリドンのような植物のフィト
エンデサチュラーゼを阻害する除草剤だけでなく、ＳＡ
Ｎ３８０ＨやＪ８５２等の植物のζ‐カロチンデサチュ
ラーゼを阻害する除草剤に対する耐性を植物に与えるこ
とが可能になったとともに、これらの除草剤を形質転換
時のマーカーとして使用することが可能になった。
【００１９】
配列番号：１ 配列の長さ：２０７６ 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：Genomic DNA 起源 生物名：シアノバクテリア Anabaena 株名：PCC7120 配列 GATCGCTCTA CAATTTAGTC TTTTGCGAAT TAAAAGAGCA AAATTTTTCT TGGTGAAAAT 60 CAACCGAAAA ATGAAAAGAT GAGAATTTAT GACGCAAATT TATCACCCAA ACTAAACAAA 120 TTTCCTTGAT TGTCTTCAGC AAGTGTTTAA AAAATATAGG CTGCCTAAGT AAACGAGGAG 180 TTCATCT ATG TCT AAA AAA GTT GCG ATT GTC GGC GCA GGC CCT GGA GGT 229 Met Ser Lys Lys Val Ala Ile Val Gly Ala Gly Pro Gly Gly 1 5 10 TTA GCT ACA GCT ATC CGT CTT GCT GGA CTT GGG TAT CAA GTA GAA ATC 277 Leu Ala Thr Ala Ile Arg Leu Ala Gly Leu Gly Tyr Gln Val Glu Ile 15 20 25 30 TTT GAG GCG GCT GAA CGT GTT GGT GGA AGA ATG CGC GGT TTT GAA GTT 325 Phe Glu Ala Ala Glu Arg Val Gly Gly Arg Met Arg Gly Phe Glu Val 35 40 45 GAT TCC TAC GCC TTT GAT ACT GGC CCC ACT ATT CTC CAA CTA CCA CAC 373 Asp Ser Tyr Ala Phe Asp Thr Gly Pro Thr Ile Leu Gln Leu Pro His 50 55 60 TTA TAT AAA GAG CTT TTT GAG GAG GCT GGT TTA AAT TTT GCC GAC TAT 421 Leu Tyr Lys Glu Leu Phe Glu Glu Ala Gly Leu Asn Phe Ala Asp Tyr 65 70 75 GTT CAA CTC AAA CGT TTA GAA CCA TAT ACA CGT TTG AAA TTT TGG GAT 469 Val Gln Leu Lys Arg Leu Glu Pro Tyr Thr Arg Leu Lys Phe Trp Asp 80 85 90 GGT ACT CAA CTG GAT ATC ACT TCG GAT CTA CAG TCA TTT AAA ACC CAA 517 Gly Thr Gln Leu Asp Ile Thr Ser Asp Leu Gln Ser Phe Lys Thr Gln 95 100 105 110 CTG GCA ACC TTA CGC TCC GAT TTA CCA TTA GCA TTT GAT CGC TGG TAT 565 Leu Ala Thr Leu Arg Ser Asp Leu Pro Leu Ala Phe Asp Arg Trp Tyr 115 120 125 AGT GAG CAT ATC CGT AAA TAT GAG TTA GGT TAC AAA CCC TAT TTA GCC 613 Ser Glu His Ile Arg Lys Tyr Glu Leu Gly Tyr Lys Pro Tyr Leu Ala 130 135 140 GGC CCT GCA CGC TCT ATT TTT GGT TAC TTG CGC CCA GAT GAC CTG ATG 661 Gly Pro Ala Arg Ser Ile Phe Gly Tyr Leu Arg Pro Asp Asp Leu Met 145 150 155 AAG TTT TTG TCT TTT CGT CCT TGG GAA AAT TTA TAT CAA CAC TTT TGG 709 Lys Phe Leu Ser Phe Arg Pro Trp Glu Asn Leu Tyr Gln His Phe Trp 160 165 170 CGA TTT TTT CAA GAT GAG CGT TTA GTC TAT GAT CTG AGA TAT CCG TCA 757 Arg Phe Phe Gln Asp Glu Arg Leu Val Tyr Asp Leu Arg Tyr Pro Ser 175 180 185 190 AAA TAT TTG GGA ATG CAC CCA ACT GTG GCA TCA AGT GTC TTT AGC CTG 805 Lys Tyr Leu Gly Met His Pro Thr Val Ala Ser Ser Val Phe Ser Leu 195 200 205 ATT CCA TTC TTA GAA TTT TCC CAA GGA GTA TGG CAT CCA GTC GGT GGA 853 Ile Pro Phe Leu Glu Phe Ser Gln Gly Val Trp His Pro Val Gly Gly 210 215 220 TTT CGT GCA TTA GCT CAG GGC TTG GCT AAT GCC GCT CAA GAC TTA GGA 901 Phe Arg Ala Leu Ala Gln Gly Leu Ala Asn Ala Ala Gln Asp Leu Gly 225 230 235 GTG AAA ATT CAT CTG CAT TCG CCT GTT CAC CAA ATC TGG ATT GAC CAA 949 Val Lys Ile His Leu His Ser Pro Val His Gln Ile Trp Ile Asp Gln 240 245 250 GGG CAA GTT CGT GGT TTG GAA CTG GCT GAT GCT TCT CGC CAT CAG TTT 997 Gly Gln Val Arg Gly Leu Glu Leu Ala Asp Ala Ser Arg His Gln Phe 255 260 265 270 GAT ACA GTA GTG ATT AAT GCT GAC TTT GCC TAT GCT GTT CGT CAT CTG 1045 Asp Thr Val Val Ile Asn Ala Asp Phe Ala Tyr Ala Val Arg His Leu 275 280 285 TTA CCA ACT TCA GCA CGC GGT CGT TAC ACT GAT AAC AAG CTT GGG CAA 1093 Leu Pro Thr Ser Ala Arg Gly Arg Tyr Thr Asp Asn Lys Leu Gly Gln 290 295 300 ATG CAA TTC TCA TGC TCT ACC TTC ATG ATC TAT TTA TCA GAC AAT CTT 1141 Met Gln Phe Ser Cys Ser Thr Phe Met Leu Tyr Leu Gly Ile Asn Arg 305 310 315 TAT TTG GGT ATC AAT CGC CGC TAC GAA GAT TTA CCT CAT CAT CAA ATT 1189 Arg Tyr Glu Asp Leu Pro His His Gln Ile Tyr Leu Ser Asp Asn Ile 320 325 330 CGC CGA CTT GAA CGT CCT TGG GTT GAT GAT TCA GCA CTA GAT GAA ACT 1237 Arg Arg Leu Glu Arg Pro Trp Val Asp Asp Ser Ala Leu Asp Glu Thr 335 340 345 350 GAT CCA CCA TTT TAT GTC TGT AAT CCT ACA ATT ATC GAC CCC AGT AAT 1285 Asp Pro Pro Phe Tyr Val Cys Asn Pro Thr Ile Ile Asp Pro Ser Asn 355 360 365 GCA CCT GCC GGC CAC AGC ACT TTA TTT GTT TTA GTA CCA ATT CCC AAC 1333 Ala Pro Ala Gly His Ser Thr Leu Phe Val Leu Val Pro Ile Pro Asn 370 375 380 ACT TCT TAT GCT GTT GAC TGG GAT ATT AAA CAA AAA AGC TAT ACA GAT 1381 Thr Ser Tyr Ala Val Asp Trp Asp Ile Lys Gln Lys Ser Tyr Thr Asp 385 390 395 TTT ATT CTT AAA CGT TTA CAT TTG CTG GGA TAT CAC AAT ATT GAA CAG 1429 Phe Ile Leu Lys Arg Leu His Leu Leu Gly Tyr His Asn Ile Glu Gln 400 405 410 CAC ATT GTT ACC CAA AGT TGT TAC ACA GCA CAA TCT TGG CTT GAT GAT 1477 His Ile Val Thr Gln Ser Cys Tyr Thr Ala Gln Ser Trp Leu Asp Asp 415 420 425 430 TAT CGC GTT CAT TTG GGT GCT GTG TTT AAT CTC AGC CAC AAT TTG ACT 1525 Tyr Arg Val His Leu Gly Ala Val Phe Asn Leu Ser His Asn Leu Thr 335 340 445 CAG CTT GGG CCC TTT CGT CCA CCC ATC CGT TCG GAA AAT ATT GCC GGA 1573 Gln Leu Gly Pro Phe Arg Pro Pro Ile Arg Ser Glu Asn Ile Ala Gly 450 455 460 CTG TAC TGG ATT GGT GGC GCT GTT CAT CCC GGC AGT GGT TTA CTC ACT 1621 Leu Tyr Trp Ile Gly Gly Ala Val His Pro Gly Ser Gly Leu Leu Thr 465 470 475 ATT TTG GAA GCA TCT CGT AGT GCT GCT GGA TTT ATT CAT CAA GAT TTT 1669 Ile Leu Glu Ala Ser Arg Ser Ala Ala Gly Phe Ile His Gln Asp Phe 480 485 490 GCT TCA ACT GGG TCT TAGCAATCCT GTTCTTTACC TAGCTATTTT TTTTACCCAG 1724 Ala Ser Thr Gly Ser*** 495 AGTCATGTTT AGCTGTCGCA TTCGGATTTT TTAAAATTAA AAATACGAGC TAGTTTAGCA 1784 TTAACAATCA AAAGCTGTTC TGGATTTTTA CTAGGGCAGC TTTGCTCCTG TGGAATTAAG 1844 ATAAACCAGA AACCAATCAC ATACACCCGC TCTGGACACT TGCCACATAT TCAAACAATG 1904 GCAATTGAAT CACTTGACCT TGTTTTCGGT AACGTCAAGA TATGCCTCAT CCAAGGCTAC 1964 CCCTTCTACT ACGTCAGTGT AGCGTTTGAA TATTTCGTGG ATTTGGGCAG ACACTTCTCG 2024 GTAGACATCA AATCTCGGTC TGACAAATAT TAATCGGGGG CAAAGAGCGA TC 2076
【図１】Ｅｒｗｉｎｉａと植物およびシアノバクテリア
における、ファルネシルピロリン酸からβ‐カロチンま
での生合成経路を示す説明図。
における、ファルネシルピロリン酸からβ‐カロチンま
での生合成経路を示す説明図。
【図２】作製した、Ｅｒｗｉｎｉａ ｕｒｅｄｏｖｏｒ
ａのフィトエンデサチュラーゼ遺伝子ｃｒｔＩの植物へ
の導入用プラスミドのｃｒｔＩ部分を示す説明図。この
ｃｒｔＩには、葉緑体へのターゲティングに必要なエン
ドウのＲｕｂｉｓｃｏ小サブユニットのトランジットペ
プチド配列が付加されている。
ａのフィトエンデサチュラーゼ遺伝子ｃｒｔＩの植物へ
の導入用プラスミドのｃｒｔＩ部分を示す説明図。この
ｃｒｔＩには、葉緑体へのターゲティングに必要なエン
ドウのＲｕｂｉｓｃｏ小サブユニットのトランジットペ
プチド配列が付加されている。
【図３】シアノバクテリアＡｎａｂａｅｎａ ＰＣＣ７
１２０のζ‐カロチンデサチュラーゼ遺伝子ｚｄｓの塩
基配列およびそこから推定したアミノ酸配列を示す説明
図。下線は、リボソーム結合部位と推定される配列であ
る。
１２０のζ‐カロチンデサチュラーゼ遺伝子ｚｄｓの塩
基配列およびそこから推定したアミノ酸配列を示す説明
図。下線は、リボソーム結合部位と推定される配列であ
る。
【図４】図３に続く塩基配列およびアミノ酸配列を示す
説明図。
説明図。
【図５】図４に続く塩基配列およびアミノ酸配列を示す
説明図。
説明図。
【図６】Ａｎａｂａｅｎａ ＰＣＣ７１２０のζ‐カロ
チンデサチュラーゼ遺伝子産物Ｚｄｓと種々の生物から
取得されたフィトエンデサチュラーゼのアミノ酸配列の
比較を示す説明図。Ｅｕ−ＣｒｔＩ、Ｒｃ−ＣｒｔＩ、
Ｐｄｓ、Ｐｄｓ１は、それぞれ、Ｅｒｗｉｎｉａ ｕｒ
ｅｄｏｖｏｒａのＣｒｔＩ、Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ
ｃａｐｓｕｌａｔｕｓのＣｒｔＩ、Ｓｙｎｅｃｈｏｃｏ
ｃｃｕｓ ＰＣＣ７９４２のＰｄｓ、ダイズのＰｄｓ１
を示している。下線は、このすべてに共通なアミノ酸を
示し、＊はＥｒ． ｕｒｅｄｏｖｏｒａのＣｒｔＩおよ
びＲ． ｃａｐｓｕｌａｔｕｓのＣｒｔＩと共通なアミ
ノ酸を示している。
チンデサチュラーゼ遺伝子産物Ｚｄｓと種々の生物から
取得されたフィトエンデサチュラーゼのアミノ酸配列の
比較を示す説明図。Ｅｕ−ＣｒｔＩ、Ｒｃ−ＣｒｔＩ、
Ｐｄｓ、Ｐｄｓ１は、それぞれ、Ｅｒｗｉｎｉａ ｕｒ
ｅｄｏｖｏｒａのＣｒｔＩ、Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ
ｃａｐｓｕｌａｔｕｓのＣｒｔＩ、Ｓｙｎｅｃｈｏｃｏ
ｃｃｕｓ ＰＣＣ７９４２のＰｄｓ、ダイズのＰｄｓ１
を示している。下線は、このすべてに共通なアミノ酸を
示し、＊はＥｒ． ｕｒｅｄｏｖｏｒａのＣｒｔＩおよ
びＲ． ｃａｐｓｕｌａｔｕｓのＣｒｔＩと共通なアミ
ノ酸を示している。
【図７】図６に続くアミノ酸配列の比較を示す説明図。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.5 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｒ 1:18）
Claims (4)
- 【請求項１】フィトエンをリコピンに変換する酵素活性
を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ配列を、その
遺伝情報が発現可能な状態で植物に導入することを特徴
とする、ζ‐カロチンデサチュラーゼ阻害除草剤に対す
る耐性植物の作出法。 - 【請求項２】ポリペプチドが、エルウィニア属由来のフ
ィトエンデサチュラーゼまたはその変異体である、請求
項１記載の作出法。 - 【請求項３】ＤＮＡ配列が、トランジットペプチドをコ
ードする塩基配列を有する、請求項１または２記載の作
出法。 - 【請求項４】フィトエンをリコピンに変換する酵素活性
を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ配列からな
る、ζ−カロチンデサチュラーゼ阻害除草剤に対する形
質転換確認用マーカー。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP16392693A JP3759628B2 (ja) | 1993-06-08 | 1993-06-08 | ブリーチング除草剤耐性植物の製造 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP16392693A JP3759628B2 (ja) | 1993-06-08 | 1993-06-08 | ブリーチング除草剤耐性植物の製造 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH06343473A true JPH06343473A (ja) | 1994-12-20 |
| JP3759628B2 JP3759628B2 (ja) | 2006-03-29 |
Family
ID=15783453
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP16392693A Expired - Lifetime JP3759628B2 (ja) | 1993-06-08 | 1993-06-08 | ブリーチング除草剤耐性植物の製造 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP3759628B2 (ja) |
Cited By (9)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US7083967B1 (en) | 2000-06-27 | 2006-08-01 | Basf Corporation | Cyanobacterial nucleic acid fragments encoding proteins useful for controlling plant traits via nuclear or plastome transformation |
| WO2007030432A2 (en) | 2005-09-06 | 2007-03-15 | Monsanto Technology Llc | Vectors and methods for improved plant transformation efficiency |
| EP2108694A1 (en) | 2000-06-27 | 2009-10-14 | Basf Se | Cyanobacterial nucleic acid fragments encoding proteins useful for controlling plant traits via nuclear or plastome transformation |
| WO2011112570A1 (en) | 2010-03-08 | 2011-09-15 | Monsanto Technology Llc | Polynucleotide molecules for gene regulation in plants |
| EP2425709A1 (en) | 2007-03-09 | 2012-03-07 | Monsanto Technology, LLC | Preparation and use of plant embryo explants for transformation |
| EP2454940A2 (en) | 2006-10-25 | 2012-05-23 | Monsanto Technology LLC | Cropping systems for managing weeds |
| WO2015200223A1 (en) | 2014-06-23 | 2015-12-30 | Monsanto Technology Llc | Compositions and methods for regulating gene expression via rna interference |
| EP3339441A1 (en) | 2005-10-13 | 2018-06-27 | Monsanto Technology LLC | Methods for producing hybrid seed |
| EP3748003A1 (en) | 2016-01-26 | 2020-12-09 | Monsanto Technology LLC | Compositions and methods for controlling insect pests |
-
1993
- 1993-06-08 JP JP16392693A patent/JP3759628B2/ja not_active Expired - Lifetime
Cited By (14)
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| EP2108694A1 (en) | 2000-06-27 | 2009-10-14 | Basf Se | Cyanobacterial nucleic acid fragments encoding proteins useful for controlling plant traits via nuclear or plastome transformation |
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| WO2007030432A2 (en) | 2005-09-06 | 2007-03-15 | Monsanto Technology Llc | Vectors and methods for improved plant transformation efficiency |
| EP3536793A1 (en) | 2005-09-06 | 2019-09-11 | Monsanto Technology LLC | Vectors and methods for improved plant transformation efficiency |
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| EP3290520A1 (en) | 2007-03-09 | 2018-03-07 | Monsanto Technology LLC | Preparation and use of plant embryo explants for transformation |
| EP2425709A1 (en) | 2007-03-09 | 2012-03-07 | Monsanto Technology, LLC | Preparation and use of plant embryo explants for transformation |
| EP3916097A1 (en) | 2007-03-09 | 2021-12-01 | Monsanto Technology LLC | Preparation and use of plant embryo explants for transformation |
| WO2011112570A1 (en) | 2010-03-08 | 2011-09-15 | Monsanto Technology Llc | Polynucleotide molecules for gene regulation in plants |
| EP3231872A1 (en) | 2010-03-08 | 2017-10-18 | Monsanto Technology LLC | Polynucleotide molecules for gene regulation in plants |
| US9121022B2 (en) | 2010-03-08 | 2015-09-01 | Monsanto Technology Llc | Method for controlling herbicide-resistant plants |
| WO2015200223A1 (en) | 2014-06-23 | 2015-12-30 | Monsanto Technology Llc | Compositions and methods for regulating gene expression via rna interference |
| EP3748003A1 (en) | 2016-01-26 | 2020-12-09 | Monsanto Technology LLC | Compositions and methods for controlling insect pests |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JP3759628B2 (ja) | 2006-03-29 |
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