JPH06343478A - マイクロインジェクション方法及び装置 - Google Patents
マイクロインジェクション方法及び装置Info
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- JPH06343478A JPH06343478A JP5137246A JP13724693A JPH06343478A JP H06343478 A JPH06343478 A JP H06343478A JP 5137246 A JP5137246 A JP 5137246A JP 13724693 A JP13724693 A JP 13724693A JP H06343478 A JPH06343478 A JP H06343478A
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- Japan
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- needle
- substance
- cell
- cells
- injected
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-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
- C12M35/00—Means for application of stress for stimulating the growth of microorganisms or the generation of fermentation or metabolic products; Means for electroporation or cell fusion
- C12M35/02—Electrical or electromagnetic means, e.g. for electroporation or for cell fusion
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- Apparatus Associated With Microorganisms And Enzymes (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
(57)【要約】
【構成】 細胞を規則正しく配列させたプレート１０を
微動ステージに置き、実体顕微鏡１４で観察しながら、
微動な動作が可能な位置決め装置１３に固定した針２０
を細胞１１に近づけゆっくりと挿入する。針の先にはあ
らかじめ細胞に注入したい物質を電着法により塗布して
おく。注入したい物質を塗布した針とは別の針２２を最
初の針の反対側から挿入し、両方の針の間に電源１５か
ら電圧を加えることにより電着固定した注入したい物質
を針から能動的に細胞内に開放する。 【効果】 生体組織や細胞に物質を注入するマイクロイ
ンジェクション装置において、細胞に対するダメージを
軽減し確実に外来物質を注入することができる。
微動ステージに置き、実体顕微鏡１４で観察しながら、
微動な動作が可能な位置決め装置１３に固定した針２０
を細胞１１に近づけゆっくりと挿入する。針の先にはあ
らかじめ細胞に注入したい物質を電着法により塗布して
おく。注入したい物質を塗布した針とは別の針２２を最
初の針の反対側から挿入し、両方の針の間に電源１５か
ら電圧を加えることにより電着固定した注入したい物質
を針から能動的に細胞内に開放する。 【効果】 生体組織や細胞に物質を注入するマイクロイ
ンジェクション装置において、細胞に対するダメージを
軽減し確実に外来物質を注入することができる。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、生体組織及び細胞内に
物質を注入するためのマイクロインジェクション方法お
よびその装置に関するものである。
物質を注入するためのマイクロインジェクション方法お
よびその装置に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】従来、物理的機械的操作によって遺伝子
や蛋白質、生理活性物質を生体組織や細胞に注入した
り、生体組織や細胞から物質を取り出して検出する手法
としてガラス針を細胞及び組織にさして物質を注入する
機械式マイクロインジェクション装置（例えば実験生物
学講座８、細胞生物学、P277ー297「マイクロマニピュ
レーション」丸善（株）、特開平3ー119989「微小イン
ジェクション装置及びそのインジェクションの制御方
法」参照）がある。また物質を注入する手法としては、
電気パルスを印加することによって細胞膜に穴を開ける
エレクトロポーレーション（例えばNeumannらによるマ
ウス細胞へのチミジンキナーゼ遺伝子の導入に関する実
験例（Neumann,E., Schaefer-Ridder,M., Wang, Y., Ho
fschneider,P.H. : EMBO J.,1, 841-845 (1982))参照）
や、レーザによって細胞膜に穴を開けるレーザマイクロ
インジェクション（例えば「レーザ式セルプロセッサに
よる遺伝子導入」植物細胞工学，Vol.3 No.2 (1991)
135-138参照）、さらには、微細な粒子に物質を塗布
して組織あるいは細胞に打ち込むパーティクルガン（例
えば「パーティクルガンによる植物細胞への遺伝子の導
入と発現」植物細胞工学，Vol.2 No.5 (1991) 631-6
37参照）等がある。
や蛋白質、生理活性物質を生体組織や細胞に注入した
り、生体組織や細胞から物質を取り出して検出する手法
としてガラス針を細胞及び組織にさして物質を注入する
機械式マイクロインジェクション装置（例えば実験生物
学講座８、細胞生物学、P277ー297「マイクロマニピュ
レーション」丸善（株）、特開平3ー119989「微小イン
ジェクション装置及びそのインジェクションの制御方
法」参照）がある。また物質を注入する手法としては、
電気パルスを印加することによって細胞膜に穴を開ける
エレクトロポーレーション（例えばNeumannらによるマ
ウス細胞へのチミジンキナーゼ遺伝子の導入に関する実
験例（Neumann,E., Schaefer-Ridder,M., Wang, Y., Ho
fschneider,P.H. : EMBO J.,1, 841-845 (1982))参照）
や、レーザによって細胞膜に穴を開けるレーザマイクロ
インジェクション（例えば「レーザ式セルプロセッサに
よる遺伝子導入」植物細胞工学，Vol.3 No.2 (1991)
135-138参照）、さらには、微細な粒子に物質を塗布
して組織あるいは細胞に打ち込むパーティクルガン（例
えば「パーティクルガンによる植物細胞への遺伝子の導
入と発現」植物細胞工学，Vol.2 No.5 (1991) 631-6
37参照）等がある。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】従来行なわれていた機
械式マイクロインジェクションでは、特定の細胞に物質
を注入することができるが、注入する針として中空状の
ガラスキャピラリを用いていたためその外径を小さくす
ることには限界があった。そのために細胞に針を注入し
た際に細胞が破裂したり致命的なダメージを受けてしま
う、操作が煩雑であるなどの問題点があった。また、エ
レクトロポーレーションやレーザマイクロインジェクシ
ョン、パーティクルガンでは一度に大量の細胞に物質を
注入できるが、特定の細胞だけに物質を注入することは
困難であった。
械式マイクロインジェクションでは、特定の細胞に物質
を注入することができるが、注入する針として中空状の
ガラスキャピラリを用いていたためその外径を小さくす
ることには限界があった。そのために細胞に針を注入し
た際に細胞が破裂したり致命的なダメージを受けてしま
う、操作が煩雑であるなどの問題点があった。また、エ
レクトロポーレーションやレーザマイクロインジェクシ
ョン、パーティクルガンでは一度に大量の細胞に物質を
注入できるが、特定の細胞だけに物質を注入することは
困難であった。
【０００４】
【課題を解決するための手段】本発明の目的は、特定の
細胞あるいは複数の細胞にできるだけダメージが少なく
物質を注入する方法を提供することにある。
細胞あるいは複数の細胞にできるだけダメージが少なく
物質を注入する方法を提供することにある。
【０００５】上記課題を解決するためには、針先に物質
を塗布しその物質を針先に保持したまま細胞内に注入
し、細胞内の目的の位置で物質を針先から開放すること
によって達成される。
を塗布しその物質を針先に保持したまま細胞内に注入
し、細胞内の目的の位置で物質を針先から開放すること
によって達成される。
【０００６】
【作用】本発明では、針表面に注入したい物質を保持す
るため、細胞内に物質を注入する際に用いる針を従来用
いていたものよりも細くすることができる。その結果、
細胞への針注入時における細胞膜での穴は小さくなり細
胞にたいするダメージを軽減し、細胞破壊が少なくな
る。
るため、細胞内に物質を注入する際に用いる針を従来用
いていたものよりも細くすることができる。その結果、
細胞への針注入時における細胞膜での穴は小さくなり細
胞にたいするダメージを軽減し、細胞破壊が少なくな
る。
【０００７】
【実施例】本発明の第１の実施例を図を用いて説明す
る。
る。
【０００８】図１に本実施例を行なうための全体の構成
図を示す。図２は針部分が組織に挿入されたときの拡大
模式図である。図中１はXYステージ、２は針支持台、３
はZ方向ステージ、４は倒立顕微鏡、５はシャーレ、６
は生物組織を収納したシャーレ、７は針、８は生体組織
である。次に本装置の動作を説明する。生体組織はシャ
ーレ５の中に固定する。固定の方法は寒天やゼラチン上
に押しつけることにより可能である。生体組織を固定し
たシャーレ５の下部からは顕微鏡によって生体組織の観
察が可能である。
図を示す。図２は針部分が組織に挿入されたときの拡大
模式図である。図中１はXYステージ、２は針支持台、３
はZ方向ステージ、４は倒立顕微鏡、５はシャーレ、６
は生物組織を収納したシャーレ、７は針、８は生体組織
である。次に本装置の動作を説明する。生体組織はシャ
ーレ５の中に固定する。固定の方法は寒天やゼラチン上
に押しつけることにより可能である。生体組織を固定し
たシャーレ５の下部からは顕微鏡によって生体組織の観
察が可能である。
【０００９】生体組織を固定したシャーレをXYステージ
の定位置に固定する。次に針支持台に固定された針の先
端をシャーレ６の中の溶液、例えばDNAを含む溶液に浸
し、針の先端部分に組織内に注入したい物質を塗布し、
乾燥する。針７の先端部分での物質の固定法は、溶液を
針先端部分で凍結したり電気を流すことによって固定す
る電着法を用いてもよい。続いて針７を倒立顕微鏡で観
察しながら所望の生体組織の上部に配置しZ方向ステー
ジ３によって静かに針７を降ろして、図２で示すように
生体組織に差し込む。差し込む深度は対象となる組織に
よって異なる。注入したい物質が細胞に拡散した後、続
いて針を元の位置まで引き上げ、再び前述の方法で針の
先端部分に溶液を塗布し針７を組織のへ差し込む。
の定位置に固定する。次に針支持台に固定された針の先
端をシャーレ６の中の溶液、例えばDNAを含む溶液に浸
し、針の先端部分に組織内に注入したい物質を塗布し、
乾燥する。針７の先端部分での物質の固定法は、溶液を
針先端部分で凍結したり電気を流すことによって固定す
る電着法を用いてもよい。続いて針７を倒立顕微鏡で観
察しながら所望の生体組織の上部に配置しZ方向ステー
ジ３によって静かに針７を降ろして、図２で示すように
生体組織に差し込む。差し込む深度は対象となる組織に
よって異なる。注入したい物質が細胞に拡散した後、続
いて針を元の位置まで引き上げ、再び前述の方法で針の
先端部分に溶液を塗布し針７を組織のへ差し込む。
【００１０】以上の操作を繰り返し、組織の異なる部分
に順次針を注入することで多数の細胞に外来物質を注入
することが出来る。
に順次針を注入することで多数の細胞に外来物質を注入
することが出来る。
【００１１】本装置で用いる針の作成に関しては、例え
ば線径２５から５０ミクロンのタングステンのワイヤー
を電解研磨法によって作成する。この方法によれば数百
オングストロームの径の細さの針を作成することができ
る。また、針の先端に窪みを設けることで注入したい物
質をより多く針に保持させることができる。
ば線径２５から５０ミクロンのタングステンのワイヤー
を電解研磨法によって作成する。この方法によれば数百
オングストロームの径の細さの針を作成することができ
る。また、針の先端に窪みを設けることで注入したい物
質をより多く針に保持させることができる。
【００１２】第２の実施例を図を用いて説明する。本実
施例では個々の細胞に確実に外来物質の注入を行なう方
法を示す。図３（a）は細胞を固定するためのプレート
の全体図。図３（b）はプレートの一部の正面図、図３
（c）はプレートの一部の断面図である。図４は本実施
例の模式図、図５はプレートを固定するホルダーの模式
図、図６は要部の拡大図である。
施例では個々の細胞に確実に外来物質の注入を行なう方
法を示す。図３（a）は細胞を固定するためのプレート
の全体図。図３（b）はプレートの一部の正面図、図３
（c）はプレートの一部の断面図である。図４は本実施
例の模式図、図５はプレートを固定するホルダーの模式
図、図６は要部の拡大図である。
【００１３】細胞を固定するプレート９は単結晶シリコ
ンウエハを異方性エッチングすることで得られる。本プ
レートでは細胞１１を固定する細胞保持孔１０がすりば
ち状で、底面に一辺約５ミクロンの正方形の穴が開いて
おり裏面まで通じている。まず、プレートへの細胞の固
定の方法を図５を用いて説明する。プレート９をプレー
トホルダー１９に固定する。プレートは緩衝液２１に浸
してあり、プレートの裏面から吸引装置１７によって緩
く吸引されている。吸引された液はシリコンチューブ１
８を通って再びプレートホルダー１９に戻る。プレート
９上に細胞懸濁液をまくと、細胞は１個１個細胞保持孔
１０に固定される。実体顕微鏡１２で細胞が固定された
ことを確認した後、余分な細胞を洗い流す。次にこのプ
レートホルダー１９をＸＹステージ１４に固定する。
ンウエハを異方性エッチングすることで得られる。本プ
レートでは細胞１１を固定する細胞保持孔１０がすりば
ち状で、底面に一辺約５ミクロンの正方形の穴が開いて
おり裏面まで通じている。まず、プレートへの細胞の固
定の方法を図５を用いて説明する。プレート９をプレー
トホルダー１９に固定する。プレートは緩衝液２１に浸
してあり、プレートの裏面から吸引装置１７によって緩
く吸引されている。吸引された液はシリコンチューブ１
８を通って再びプレートホルダー１９に戻る。プレート
９上に細胞懸濁液をまくと、細胞は１個１個細胞保持孔
１０に固定される。実体顕微鏡１２で細胞が固定された
ことを確認した後、余分な細胞を洗い流す。次にこのプ
レートホルダー１９をＸＹステージ１４に固定する。
【００１４】動作について図４を用いて説明する。これ
らの細胞に微動な動作が可能な位置決め装置１３に固定
された針２０を実体顕微鏡１２で観察しながら細胞に近
づけゆっくりと挿入する。ここでは直径２５ミクロンの
タングステンワイヤーを電解研磨法によって作製した直
径が０．５ミクロン以下の針を用いる。針の先にはあら
かじめ細胞に注入したい物質を電着法により塗布してお
く。次に図５に示すように注入したい物質を塗布した針
２０とは別の針２２を最初の針の反対側から挿入し、両
方の針の間に電源１５からリード線１６により電圧を加
えることにより針２０に電着固定されていた注入したい
物質を針２０から能動的に細胞内に開放する。
らの細胞に微動な動作が可能な位置決め装置１３に固定
された針２０を実体顕微鏡１２で観察しながら細胞に近
づけゆっくりと挿入する。ここでは直径２５ミクロンの
タングステンワイヤーを電解研磨法によって作製した直
径が０．５ミクロン以下の針を用いる。針の先にはあら
かじめ細胞に注入したい物質を電着法により塗布してお
く。次に図５に示すように注入したい物質を塗布した針
２０とは別の針２２を最初の針の反対側から挿入し、両
方の針の間に電源１５からリード線１６により電圧を加
えることにより針２０に電着固定されていた注入したい
物質を針２０から能動的に細胞内に開放する。
【００１５】次に細胞から針をゆっくりと抜き、一方の
針に再び導入したい物質を塗布し、次の細胞に同様の操
作を行なう。多数の細胞に同時に確実に外来物質の注入
を行ないたいときは、上記プレート上に細胞を固定し、
固定した細胞に対応したピッチで規則正しく並べた針を
それぞれの細胞に注入することによって実現できる。
針に再び導入したい物質を塗布し、次の細胞に同様の操
作を行なう。多数の細胞に同時に確実に外来物質の注入
を行ないたいときは、上記プレート上に細胞を固定し、
固定した細胞に対応したピッチで規則正しく並べた針を
それぞれの細胞に注入することによって実現できる。
【００１６】
【発明の効果】以上説明したように、本発明によれば細
胞に対するダメージを軽減することができるので、特定
の細胞に物質を注入する際の成功の確立を向上すること
ができる。
胞に対するダメージを軽減することができるので、特定
の細胞に物質を注入する際の成功の確立を向上すること
ができる。
【図１】実施例１の全体を示す模式図。
【図２】実施例１の要部を示す模式図。
【図３】（ａ）、（ｂ）および（ｃ）は実施例２で用い
る細胞固定用プレートの模式図、細胞固定用プレートの
正面図および細胞固定用プレートの断面図。
る細胞固定用プレートの模式図、細胞固定用プレートの
正面図および細胞固定用プレートの断面図。
【図４】実施例２の全体を示す模式図。
【図５】実施例２の要部を示す模式図。
【図６】実施例２の要部の拡大図である。
１…XYステージ、２…針支持台、３…Z方向ステージ、
４…倒立顕微鏡、５…シャーレ、６…生物組織を収納し
たシャーレ、７…針、８…生体組織、９…プレート、１
０…細胞保持孔、１１…細胞、１２…実体顕微鏡、１３
…微動な動作が可能な位置決め装置、１４…ＸＹステー
ジ、１５…電源、１６…ワイヤー、１７…吸引装置、１
８…シリコンチューブ、１９…プレートホルダー、２０
…針、２１…緩衝液、２２…針。
４…倒立顕微鏡、５…シャーレ、６…生物組織を収納し
たシャーレ、７…針、８…生体組織、９…プレート、１
０…細胞保持孔、１１…細胞、１２…実体顕微鏡、１３
…微動な動作が可能な位置決め装置、１４…ＸＹステー
ジ、１５…電源、１６…ワイヤー、１７…吸引装置、１
８…シリコンチューブ、１９…プレートホルダー、２０
…針、２１…緩衝液、２２…針。
フロントページの続き (51)Int.Cl.5 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 8412−4Ｂ Ｃ１２Ｎ 5/00 Ｄ
Claims (6)
- 【請求項１】針の先端に核酸、蛋白質、その他生理活性
物質を塗布し、その針を細胞または微細な組織の目的部
分に差し込むんで目的部分に物質を導入することを特徴
とするマイクロインジェクション方法。 - 【請求項２】先端に核酸、蛋白質、その他生理活性物質
を塗布された針、前記針に対向した位置に配置され核
酸、蛋白質、その他生理活性物質を収納した容器、前記
針を前記容器内の細胞または微細な組織の目的部分に差
し込む為の手段よりなることをを特徴とするマイクロイ
ンジェクション装置。 - 【請求項３】前記針を冷却することで針表面に注入物質
を凍結させて固定することを特徴とする請求項２記載の
マイクロインジェクション装置。 - 【請求項４】上記針に電着によって針表面に注入物質を
固定することを特徴とする請求項２記載のマイクロイン
ジェクション装置。 - 【請求項５】上記針を複数個備えたことを特徴とする請
求項２記載のマイクロインジェクション装置。 - 【請求項６】上記針の先端に微小な窪みを設けたことを
特徴とする請求項２ないし５のいずれかに記載のマイク
ロインジェクション装置。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP5137246A JPH06343478A (ja) | 1993-06-08 | 1993-06-08 | マイクロインジェクション方法及び装置 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP5137246A JPH06343478A (ja) | 1993-06-08 | 1993-06-08 | マイクロインジェクション方法及び装置 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH06343478A true JPH06343478A (ja) | 1994-12-20 |
Family
ID=15194191
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP5137246A Pending JPH06343478A (ja) | 1993-06-08 | 1993-06-08 | マイクロインジェクション方法及び装置 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH06343478A (ja) |
Cited By (14)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
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| US7479388B2 (en) | 2004-04-28 | 2009-01-20 | Fujitsu Limited | Apparatus for injecting solution into cell |
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| CN111693196A (zh) * | 2020-06-16 | 2020-09-22 | 梁诗豪 | 一种活胚胎表面透明带张力检测装置 |
-
1993
- 1993-06-08 JP JP5137246A patent/JPH06343478A/ja active Pending
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