JPH0634522A - 特異親和性物質を用いる分析方法およびそれに用いる反応容器 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【目的】Ｓ／Ｎ比の高い、特異親和性物質を用いる分析
方法を提供する。また、この方法に用いられる反応容器
を提供する。 【構成】反応容器の最も表面積の大きい壁面を底面とし
て、この壁面に測定対象物質に特異親和性を有する特異
親和性物質を固相化し、測定対象物質を添加して結合対
を形成させる。次に測定対象物質に特異親和性を有する
トレ−サ−結合親和性物質を結合対と反応させて複合体
を形成した後、洗浄液により未反応物を除去する。次い
で、反応溶液の姿勢を変えて最も表面積の狭い壁面を底
面とし、トレ−サ−に起因する信号を計測する。この方
法に用いられる反応容器は、実質的に異なる表面積を有
し、かつ上記方法において底面になり得る少なくとも２
つの壁面を有する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】この発明は、高感度の計測が可能
な、特異親和性物質を用いる分析方法に関する。

【０００２】

【従来の技術】生体関連物質の測定は、環境衛生の分野
や医療の分野で日常検査として実施されている。特に、
医療の分野では、疾病の特定や疾病に対する治療効果の
判定等の目的で多くの施設で多数の種類の検査が実施さ
れている。なかでも、最近公衆衛生上の問題となってい
る後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）等の感染症や、従
来特定が困難であった癌関連物質等も、特異親和性物質
による反応の一つである抗原抗体反応を用いることで測
定することが可能となっている。ＡＩＤＳ等に代表され
る感染症の診断は抗原抗体反応を用いて検出することも
できるが、他にも感染性微生物の遺伝子であるＤＮＡあ
るいはＲＮＡを、その核酸の特徴部分と結合する相補核
酸により測定することも可能である。この核酸と相補核
酸との反応も特異親和性物質による反応の一つである
が、ホルモンの一つであるインシュリンとインシュリン
リセプタ−との反応のようなリセプタ−反応もまた特異
親和性物質による反応の一つとして知られている。

【０００３】上述のような特異親和性反応を用いた分析
方法は数多く知られているが、それらの全てに共通する
ことは、分析対象物が極微量であることである。そのた
め、高感度の計測を行なう試みが多くなされている。

【０００４】従来行なわれている計測感度増加の例とし
ては、特開昭63-281053 並びに特開平 2-242159 を挙げ
ることができる。特開昭63-281053 には、固相の表面積
を大きくするために、固相としてラッテクス等の不溶性
微粒子を使用する方法が開示されている。また、特開平
2-242159 には、検液より生じる発光を積分球によって
集光し、より多くの信号が検知管に集まるように構成し
た発光検出器が開示されている。

【０００５】

【発明が解決しようとする課題】しかしながら、特開昭
63-281053 に記載の方法には、表面積が増加した分洗浄
が困難になるという欠点がある。一方、特開平 2-24215
9 に記載の発光検出器には積分球を採用した光学装置な
どが使用されているが、これらの装置は高価であり、加
えて検出器全体が大型化するという欠点を有している。

【０００６】一般的に、計測の感度はＳ／Ｎ（ここで、
Ｓは信号であり、Ｎは雑音である）で表わされる。前記
特開昭63-281053 に記載の不溶性微粒子を用いる方法に
おいては、Ｓ（信号）は増大するが、それに伴い、洗浄
不良によりＮ（雑音）も増大する。したがって、実質的
な感度上昇は期待するほど大きくならないのが現状であ
る。

【０００７】また、特開平 2-242159 に見られるよう
に、蛍光測光や微弱光測光においては集光レンズ、凹面
鏡あるいは積分球を用いてＳ（信号）を増大させる試み
がなされているが、これらの方法では計測のための光学
系が複雑化かつ大型化してしまい実用には不向きであ
る。したがって、この発明は、Ｎ（雑音）を抑制しつつ
Ｓ（信号）を増大させることが可能な、特異親和性物質
を用いる分析方法を提供することを目的とする。

【０００８】また、この発明は、Ｎ（雑音）を抑制しつ
つＳ（信号）を増大させることが可能な、特異親和性物
質を用いる分析を行なうための反応容器を提供すること
を目的とする。

【０００９】

【課題を解決するための手段】この発明の分析方法は、
反応容器内において、測定対象物質と、該測定対象物質
に特異親和性を有しかつ不溶性固相に結合した特異親和
性物質とを反応させて結合対を形成する工程と、測定対
象物質に特異親和性を有しかつ計測可能な信号を生じ得
る物質が結合している親和性物質を結合対と反応させて
複合体を形成する工程と、複合体とこの複合体には関与
しない非形成物質とを分離する工程と、計測可能な信号
を生じ得る物質からの信号を計測する工程とを具備する
分析方法において、結合対を形成する工程および複合体
と非形成物質とを分離する工程の少なくとも１つの工程
を、信号を計測する工程よりも、実質的に表面積の大き
い面を底面として行なうことを特徴とする。

【００１０】また、この発明の反応容器は、測定対象物
質と、該測定対象物質に特異親和性を有しかつ不溶性固
相に結合した特異親和性物質とを反応させて結合対を形
成する工程と、測定対象物質に特異親和性を有しかつ計
測可能な信号を生じ得る物質が結合している親和性物質
を結合対と反応させて複合体を形成する工程と、複合体
とこの複合体には関与しない非形成物質とを分離する工
程と、計測可能な信号を生じ得る物質からの信号を計測
する工程とを具備する分析方法において用いられる反応
容器であって、実質的に異なる表面積を有し、かつ上記
分析方法において底面になり得る少なくとも２つの壁面
を有することを特徴とする。

【００１１】

【作用】より表面積の大きい壁面を底面とすることによ
り結合対形成反応および／または洗浄を効率的に行なう
ことができる。また、より表面積の小さい壁面を底面と
することにより、単位面積当りの被計測物質の量を増加
させ、計測の感度を高めることができる。

【００１２】

【実施例】以下、この発明を具体例を挙げて説明する。

【００１３】図１は、この発明の分析方法を行なうため
の反応容器の一具体例を示す斜視図である。この反応容
器 1は、最も表面積の大きい１対の壁面のうちの一面 2
の一端に開口部 3が形成され、かつ開口部 3の反対側の
端部に突出部 4が形成された筐体である。この突出部 4
の内部には空間が包含されている。各壁面は、通常、合
成樹脂等の材料からなる。この発明の分析方法において
は、不溶性固相として反応容器の内壁を用いる方法と反
応容器の内壁以外の物質を用いる方法とがある。以下、
順に説明する。

【００１４】実施例 １ まず、反応容器 1の最も表面積の大きい壁面である広底
部 5の内壁に、物理吸着あるいは化学的手法によりリガ
ンド（親和性結合物質）を結合させる。ここで、リガン
ドとは、抗原・抗体複合体を形成する抗体、ホルモン・
リセプタ−複合体のリセプタ−、二重らせんを形成する
ＤＮＡ、ＲＮＡのような核酸などの、特異親和性結合対
を形成する物質のうちの一方の物質を指す。

【００１５】次に、容器 1の開口部 3から測定対象物質
を含む検液を注入し、リガンドと測定対象物との結合対
を形成させる。この際、リガンドが結合されている広底
部 5にこの検液がまんべんなく接触するようにして、結
合対形成反応を促進させる。結合対形成反応終了後、容
器 1から検液を除去し、適当な洗浄液を用いて容器内を
洗浄することにより、非結合物質を除去する。

【００１６】次いで、形成された結合対の量を計測する
ために、形成された結合対もしくは測定対象物質に親和
性を有し、かつトレ−サ−（被計測物質）を結合した物
質を容器 1内に添加して、さらに十分反応させる。ここ
で、トレ−サ−とは、計測可能な信号を生じ得る物質で
あって、計測工程においてそれ自身が実際に計測される
物質、またはそれに起因して実際に計測される物質が生
じ得る物質を意味し、例として同位元素、蛍光物質、発
光性物質および酵素を挙げることができる。この反応の
結果、反応容器 1の広底部 5の内表面上には、不溶化さ
れたリガンド、測定対象物質、およびトレ−サ−が結合
した親和性物質の複合体が形成される。この後、この複
合体形成に関与しなかったトレ−サ−結合親和性物質
を、上述の洗浄工程と同様の操作により容器 1内から除
去する。この除去操作を完全に行なうことにより、計測
時のバックグランド（雑音）が軽減する。次に形成され
た結合対の計測を行なうが、この工程はトレ−サ−とし
て用いた物質により操作が異なる。

【００１７】ａ）トレ−サ−自身が計測対象物となり得
る場合 トレ−サ−として、同位元素、蛍光物質等を用いた場合
には、トレ−サ−自身を計測対象物とすることができ
る。この場合には、まず、トレ−サ−が結合している親
和性物質と同一であり、かつトレ−サ−を結合していな
い親和性物質を過剰に含有する溶液を反応容器 1内に加
える。その結果、上記複合体を形成するトレ−サ−結合
親和性物質と後に添加したトレ−サ−非結合親和性物質
との間で競合反応が生じ、複合体を形成するトレ−サ−
結合親和性物質が溶液中に遊離する。

【００１８】その後、反応容器 1の姿勢を変えて、図２
に示すように狭底部 6が底部となるように容器 1を立て
る。このような状態にすることにより、遊離したトレ−
サ−結合親和性物質を含有する溶液は、広底部 5からよ
り表面積の小さい狭底部 6を底部として容器 1に保持さ
れることとなる。すなわち、底面の単位面積当りに保持
される溶液の量が多くなり、その結果、底面の単位面積
当りのトレ−サ−の量が多くなる。したがって、トレ−
サ−の検知器を、底面である狭底部 6に対して垂直方向
に測定可能な位置に配置することにより、広底部 5を底
部とする場合よりも検知器の検知面の単位面積当りの信
号量が大きくなり、計測が容易になってより感度の高い
計測が可能となる。

【００１９】また、図２に示すように、狭底部 6が底部
になるように容器 1を立てた状態で、突出部 4の部分を
広底部 5に対して垂直方向に測定を行なうこともでき
る。この場合には、突出部 4がない場合に比較して光路
長が長くなるので、吸光分析をより高感度に行なうこと
ができる。図２に示す状態で、壁面 8および 9に対して
垂直方向に測定を行なう場合にも同様の利点があり、こ
の場合にはさらに、広底部 5に結合させたリガンドの影
響を回避することが可能になるという利点をも併せも
つ。

【００２０】ｂ）トレ−サ−自身が計測対象物とはなり
得ない場合 トレ−サ−が酵素や発光反応に関与する物質である場合
には、トレ−サ−自身は計測対象物とはならない。この
ような場合には、まず、トレ−サ−と反応して計測可能
となる物質を含有する溶液を反応容器 1に加えて十分反
応させる。次いで、上記ａ）の場合と同様に、狭底部 6
が底部となるように容器 1の姿勢を変える。この場合に
は、トレ−サ−結合親和性物質を遊離させる必要はな
い。これにより、上記ａ）と同様に、底面の単位面積当
りの被計測物質の量が多くなり、計測を容易に、かつ高
感度に行なうことが可能となる。

【００２１】このように、図１および２に示す反応容器
を用いてこの発明の方法を実施することにより、計測時
には底面の単位面積当りの被計測物質の量が多くなるた
め、特に狭底部 6を底面にして垂直方向に測定を行なう
吸光光度法において顕著に効果が現われる。

【００２２】実施例 ２ 実施例１においては反応容器の内壁面に直接親和性結合
物質を結合させた例を示したが、この実施例において
は、不溶性の微粒子を不溶性固相として用いた例を示
す。

【００２３】まず、粒径数μｍないし数ｍｍの微粒子
に、物理吸着もしくは化学的手法を用いてリガンドを結
合させ、この微粒子を懸濁させた微粒子懸濁液を調製す
る。ここで用いられる微粒子の材質としては、例えば、
種々の合成樹脂を適宜用いることができる。

【００２４】次に、図１に示す反応容器 1に上記微粒子
懸濁液および測定対象物質を含有する溶液を加え、広底
部 5を底部として反応させる。この際、反応容器 1を揺
り動かすことにより、検液および不溶性微粒子の撹拌を
行ない反応を促進させることができる。

【００２５】その後、適当な洗浄液を用いて非結合物質
を除去する。その際、不溶性微粒子としてフェライト粒
子等の感磁性粒子を用い、反応容器 1の下方もしくは側
方に磁石を設置して不溶性微粒子を一ヶ所に集めた後洗
浄することにより、不溶性微粒子の損失を抑えることが
可能である。不溶性微粒子を集める方法としては、他
に、遠心力を利用する方法を用いることもできる。ま
た、不溶性微粒子を集めることなく洗浄を行ない、洗浄
液排出時にフィルタ−等により不溶性微粒子の損失を防
ぐこともできる。

【００２６】次いで、実施例１と同様にして、形成され
た結合対とトレ−サ−結合親和性物質とを反応させる。
十分反応させた後、結合しない遊離のトレ−サ−結合親
和性物質を上記洗浄法と同様の方法により反応容器 1か
ら除去する。

【００２７】洗浄の後、トレ−サ−の計測に適した溶液
を反応容器 1に加えて不溶性微粒子の懸濁液を調製し、
実施例１と同様に、図２に示す通りに狭底部 6が底部と
なるように反応容器 1の姿勢を変える。この実施例にお
いては、トレ−サ−としてそれ自身が計測可能である物
質、例えば、同位元素、発光性物質および蛍光物質を用
いることが好ましい。このような物質を用いた場合に
は、容器 1の底面の単位面積当りの不溶性微粒子の数を
増加させることにより、その不溶性微粒子に結合してい
るトレ−サ−の量を増加させることができ、その結果、
信号の強度を高めて計測を容易に行なうことが可能にな
る。

【００２８】上記実施例１においては、不溶性固相は反
応容器の内壁表面上に固定されて形成されている。一
方、実施例２においては、不溶性固相は微粒子の形態で
容器内に懸濁液として保持されている。したがって、実
施例１の方法によると、洗浄時における不溶性固相の損
失の恐れはなく、効率的に洗浄を行なうことができる。
これに対して、実施例２に記載の方法は、洗浄操作は若
干煩雑になるものの、親和性物質を結合させるための表
面積を大きくすることが可能になる。計測後、これらの
反応容器はそのまま廃棄してもよく、あるいは洗浄後再
利用することもできる。

【００２９】上記実施例１および２においては、結合対
形成反応および洗浄の工程をより表面積の大きい壁面を
底面として行ない、トレ−サ−（もしくはトレ−サ−に
より生じた計測対象物質）の計測の工程のみをより表面
積の小さい壁面を底面として行なっている。しかしなが
ら、図１および２に示す反応容器を用いた方法はこれら
に限られるものではなく、洗浄の際にのみより表面積の
大きい壁面を底面とし、結合対形成反応および計測の際
にはより表面積の小さい壁面を底面とすることもでき
る。さらに、結合対形成反応の際にのみより表面積の大
きい壁面を底面とし、洗浄および計測の際にはより表面
積の小さい壁面を底面とすることも可能である。前者の
方法は、特に、測定対象物質またはトレ−サ−結合親和
性物質が微量である場合に有効である。

【００３０】上記実施例１および２においては、図１お
よび２に示す反応容器を用いているが、この発明の分析
方法を実施するにあたって用いることができる反応容器
はこれに限られるものではなく、計測の際に底面となる
壁面の表面積が、結合対形成反応および洗浄のうちの少
なくとも１つの工程の際に底面となる壁面の表面積より
も小さいものであればどのようなものでもよい。

【００３１】この発明の分析方法に用いることができる
他の反応容器の例を図３、図４および図５に示す。図３
に示す反応容器31は、最も表面積が大きい１対の壁面の
うちの一面32の一端に開口部33が形成された筐体であ
る。また、図４に示す反応容器41は、狭底部46を突出部
44の上面47と同じ大きさとし、広底部45と傾斜部49で接
続したものである。さらに、図５に示す反応容器51は、
狭底部56の幅Ｂを広底部55の幅Ａよりも小さくしたもの
である。

【００３２】図１および２に示す反応容器 1の代わりに
これらの反応容器31、41および51を用いて、実施例１お
よび２と同様の測定を行なうことができる。すなわち、
図３に示す反応容器31を例にとると、結合対形成反応お
よび洗浄の際には最も表面積の大きい壁面34を底面と
し、計測の際にはより表面積の小さい壁面35を底面とす
ればよい。この反応容器31を用いた分析においては、蛍
光もしくは発光を用いて計測する場合には最も表面積の
小さい壁面35に対して垂直方向に計測することが好まし
く、吸光度測定を用いて計測を行なう場合には、液量に
もよるが、壁面36に対して垂直方向に計測を行なうこと
が好ましい。これは、通常の液量では、壁面36に対して
垂直の方向のほうが壁面35に対して垂直の方向よりも縦
断距離が長く、単位面積当りの被計測物質の量が多くな
るためである。

【００３３】図４に示す反応容器41では、さらに、狭底
部46とこれに対向する突出部44の上面47とが同一表面積
を有するために、狭底部46および上面47の両面を測光面
とする吸光分析を行なうことが可能となる。また、この
反応容器41は、図１および２に示す反応容器 1よりも突
出部の突出の程度を大きくすることができる。このた
め、発光や蛍光を受光する際においても、狭底部46およ
び上面47の両面を挟んで受光することにより受光面積を
大幅に増加させて感度をより高めることができる。

【００３４】なお、上記反応容器 1および41において
は、突出部 4（もしくは44）の突出の程度は、広底部 5
（もしくは45）を底面として反応させる際の液量に応じ
て、狭底部 6（もしくは46）を底面とした場合に液面が
少なくとも突出部上面 7（もしくは47）に到達する程度
であることが好ましい。この突出部の突出の程度は、図
５に示すように、狭底部56の幅Ｂを広底部55の幅Ａより
も小さくすることでより大きくすることができる。

【００３５】

【発明の効果】以上のように、この発明の分析方法によ
ると、結合対形成反応および洗浄を十分に、かつ効率的
に行なうことができ、さらに計測面の単位面積当りの非
計測物質の量を増加させて感度を高めることができる。
その結果、この発明の分析方法によると、Ｎ（雑音）を
抑制しつつＳ（信号）を増大させて高いＳ／Ｎ比を得る
ことが可能となる。

【００３６】また、この発明による反応容器は、計測の
感度を高めるための特別な部材を必要とすることなく、
簡略な構成で、Ｓ／Ｎ比の高い分析を行なうことが可能
である。

【図面の簡単な説明】

【図１】この発明の分析方法に用いられる反応容器の一
具体例を示す斜視図。

【図２】図１に示す反応容器の姿勢を変えた状態を示す
斜視図。

【図３】この発明の分析方法に用いられる反応容器の他
の具体例を示す斜視図。

【図４】この発明の分析方法に用いられる反応容器の別
の具体例を示す斜視図。

【図５】この発明の分析方法に用いられる反応容器のさ
らに別の具体例を示す斜視図。

【符号の説明】

1、31、41、51…反応容器、 3、33…開口部、 4、44…
突出部、5、45、55…広底部、 6、46、56…狭底部。

Claims (2)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 反応容器内において、測定対象物質と、
   該測定対象物質に特異親和性を有しかつ不溶性固相に結
   合した特異親和性物質とを反応させて結合対を形成する
   工程と、 該測定対象物質に特異親和性を有しかつ計測可能な信号
   を生じ得る物質が結合している親和性物質を該結合対と
   反応させて複合体を形成する工程と、 該複合体と該複合体には関与しない非形成物質とを分離
   する工程と、 該計測可能な信号を生じ得る物質からの信号を計測する
   工程と、を具備する分析方法において、 結合対を形成する工程および複合体と非形成物質とを分
   離する工程の少なくとも１つの工程を、信号を計測する
   工程よりも、実質的に表面積の大きい面を底面として行
   なう分析方法。
2. 【請求項２】 測定対象物質と、該測定対象物質に特異
   親和性を有しかつ不溶性固相に結合した特異親和性物質
   とを反応させて結合対を形成する工程と、 該測定対象物質に特異親和性を有しかつ計測可能な信号
   を生じ得る物質が結合している親和性物質を該結合対と
   反応させて複合体を形成する工程と、 該複合体と該複合体には関与しない非形成物質とを分離
   する工程と、 該計測可能な信号を生じ得る物質からの信号を計測する
   工程と、を具備する分析方法において用いられる反応容
   器であって、 実質的に異なる表面積を有し、かつ上記分析方法におい
   て底面になり得る少なくとも２つの壁面を有する反応容
   器。