JPH0634702B2 - 細胞の破壊方法 - Google Patents

細胞の破壊方法

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JPH0634702B2
JPH0634702B2 JP57190921A JP19092182A JPH0634702B2 JP H0634702 B2 JPH0634702 B2 JP H0634702B2 JP 57190921 A JP57190921 A JP 57190921A JP 19092182 A JP19092182 A JP 19092182A JP H0634702 B2 JPH0634702 B2 JP H0634702B2
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Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、細胞を破壊するための改良された方法および
特に、多糖類を産出する微生物で栄養基質を発酵させる
ことによって得られたブイヨン中で細胞を破壊させる方
法に関する。
微生物的なプロセスにおいては後の段階において細菌の
細胞を破壊することが屡々必要になる。この要求は、例
えば、細胞内酵素の製造において、酵素を放出させるた
めに細胞を壊して開かなければならないときに生ずる。
石油の回収率増進法における粘性化剤(viscosifier)
として使用するための多糖類を微生物によって製造する
場合のような、全く異った技術関係において別の例が生
ずる。この応用においては、水性系の粘度を増大させ、
それによって一層効率よく、ピストンの形で石油を油層
岩から排除させるために、水攻法に対して親水性の多糖
類またはキサンタンガム(xanthangum)が低濃度において
添加される。これらの微生物による多糖類は、水性系中
低濃度において、油層中に圧入する点で遭遇する高い剪
断速度に対して安定であると共に油層中の水の中にみら
れる高い塩濃度に対しては非感応性である高い粘度を示
すので、このポリマー・フラッディングの適用にとって
は、特によく適しているものと思われる。
原油の回収率増進法においては微生物による多糖類を使
用する見通しは将来有望であると思われるけれども、実
際にはこれらの工業的な等級の多糖類の中に存在する不
溶性の不純物を包含する、ある一定の問題に遭遇してき
ている。キサントモナス(xanthomonas)の発酵による多
糖類の典型的な工業的生産において、細胞くずおよび生
長不能の細菌のような不溶性物質を多糖類含有ブイヨン
から完全に分離することは発酵ブイヨンの高い粘度によ
って妨げられている。その結果、これらの微生物による
工業的な等級の多糖類は、石油の回収率増進法における
ポリマー・フラッディングに必要であるような、うすい
水溶液に溶解しない固体を含んでいる。多糖類の溶液中
にこれらの粒状の固体が存在すると、岩石の表面と圧入
水のフィルターの閉塞を引起こすので、ポリマー・フラ
ッドの野外の適用においてはかなりの困難が生ずる。こ
の閉塞の問題を克服する従来のこころみは、多糖類溶液
の苛性処理とそれにつづく固体の凝集、並びに使用に先
立つ多糖類溶液中の細菌性固形物の破壊を引起こす酵素
処理とその結果生ずる可溶性を含んでいた。多くの場
合、酵素処理に伴う物理的/化学的条件は所望の多糖類
において不利な変化を最小にするような条件なので、酵
素処理が好ましい。しかしながら、若干の微生物は酵素
による破壊に対して抵抗性があり、そして本発明はこの
ような微生物がある種の表面活性剤による前処理によっ
て酵素的に破壊できるという発見に基いている。細胞の
破壊のために表面活性剤を使用することは公知である
が、本出願人は、正面活性剤または酵素単独による攻撃
に対して抵抗性である微生物が陰イオン系または非イオ
ン系表面活性剤とポロテアーゼ酵素との連続的な処理に
よって破壊できることを意外にも発見した。
したがって本発明は、細胞を含む水性基質をプロテアー
ゼ酵素と接触させることによって細胞を破壊する方法に
おいて、細胞を含む基質が、多糖類を産出する微生物に
よる栄養基質の発酵によって得られたブイヨンであるこ
と、かつ酵素との接触の前に陰イオン系または非イオン
系表面活性剤との接触を先行させることを特徴とする、
上記方法を提供する。上に説明したように、また当該技
術に熟達した者には明らかなように、この細胞破壊方法
は、細胞組織を破壊するのに、例えば細胞内酵素を放出
させるのに必要な種々の実用的な状態に適用することが
できるけれども、本方法は多糖類産出性の微生物で栄養
基質を発酵させて得たブイヨン中で細胞成分を分解/可
溶化する場合特に価値がある。酵素処理のみを使用して
このような微生物を適当に分解することができる場合も
あるが、その他の多くの有機体、特にグラム陰性の細菌
は攻撃に対してより抵抗性の細胞膜を有するので、この
ような場合には本発明方法は特に有利である。このよう
に、シュードモナスのうち粘液を形成する種、そして殊
にシュードモナス種NCIB11592が石油の回収率増進
法において使用するのに適した性質を具えた多糖類を産
出することは公知であるが、これらの有機体は酵素処理
のみでは容易に分解されない。しかしながら、本発明に
よる表面活性剤とそれにつづくプロテアーゼによる連続
的な処理はこのようなシュードモナスの細胞を破壊し、
それによって細胞を可溶化させることができる。これ
は、(a)栄養基質中で適当なシュードモナスを培養し;
(b)得られた発酵ブイヨンを最初に陰イオン系または非
イオン系表面活性剤と接触させ、つづいてプロテアーゼ
と接触させて細胞膜を破壊し;そして(c)溶液を過し
て油層岩を閉塞する残りの固形物を除去することによっ
て、石油の回収率増進法において使用するのに適した多
糖類溶液を製造することを可能とする。文献から周知の
ように、プロテアーゼ酵素の性質はアルカリ性、中性ま
たは酸性であり得る。所望ならば、得られた細胞を含ま
ない多糖類溶液を次いで輸送に便利なように、例えば限
外過によって濃縮することができる。
表面活性剤は非イオン系または陰イオン系のどちらでも
よいが、好ましくは陰イオン系表面活性剤である。多く
の種類の陰イオン系表面活性剤が商業的に入手でき、そ
してアルカリ金属アルキルサルフェート、アルキルベン
ゼンスルホネート、硫酸化アルカノールエトキシレート
および硫酸化アルカノール、殊にアルキル連鎖が少なく
とも8個の炭素原子を含む上記のもの、および特にドデ
シルサルフェートまたは硫酸化アルカノールエトキシレ
ートのアルカリ金属塩、適当にはナトリウム塩、例えば
「ドバノール(Dobanol)」洗浄剤アルキレートの名称で
市販されている製品によって良好な結果が得られた。最
も効果的な結果を得るためには、細胞含有基質を6.0以
下、好ましくは4.5以下のpHで表面活性剤と接触させる
と共に、つづく酵素との接触を酵素が最も活性が高いpH
で行うべきであって、アルカリ性プロテアーゼについて
はこのpHは6.0以上であり、適当にはpH7.0ないしpH9.0
である。表面活性剤および酵素のいずれの処理について
も温度は、適当には、室温以上であるが、酵素または多
糖類を分解するほど高くなく、例えば50−60℃であ
る。
前に説明したように、石油の回収率増進法で使用するこ
とになっている多糖類のブイヨンに細胞破壊方法を適用
する主な目的は細胞のくずが油層岩の閉塞を引起こすこ
とを防止することにある。処理されたブイヨンの特定の
バッチに関するこの危険の潜在的な度合を評価するため
に、それ自体公知の適当な過試験を遂行することがで
き、そして本発明の破壊処理は閉塞の傾向の意義のある
減少の表示となる、微孔性薄膜を通る過速度の実質的
な改良を達成することがわかった。
つぎに以下の実施例によって本発明を説明する。
シュードモナスNCIB11592菌株は、1980年4月
7日にナショナル・コレクション・オブ・インダストリ
アル・バクテリア(National Collection of Industria
l Bacteria)に寄託された(NCIB11592)。
実施例I A)下の第1表に示した鉱物性の塩の生育基質4を含む
ケマップ(Chemap)LF.7発酵装置(fermenter)中でバッチ
条件下にシュードモナスNCIB11592を培養した。培
養温度を28℃に維持し、そして2Mアルカリ溶液(1
MNaOH+1MKOH)を自動的に添加してpHを7.0に制御し
た。発酵装置中に空気を毎分0.5の量で散布させ、そ
して1000rpmで回転する3×4枚羽根を有するラス
トン(Rushton)タービン羽根車で培養液を攪拌した。
接種後およそ120時間経過した後、発酵ブイヨン中に
残ったグルコースを微生物による代謝によって消耗さ
せ、そして培養液を採取し、酵素処理のために必要とな
るまで5℃において貯蔵した。ブイヨン中の細胞および
多糖類の最終濃度は、乾燥重量の測定値に調整してそれ
ぞれ1.34g-1および9.1g-1であった。蒸留水によっ
て9倍に希釈した後のブイヨンの粘度は、ブルックフィ
ールドLVT粘度計で測定して23sec-1の剪断速度におい
て27センチポアズであることがわかった。
B)発酵ブイヨンの試料(100m)を2M硫酸で滴定
してpH4.0とし、そして洗浄剤のドデシル硫酸ナトリウ
ムを最終濃度が1g-1となるように添加した。軌道振
混ぜ機上の250g-1円錐フラスコ中で試料を60℃
において1時間温置した。次いで2M水酸化ナトリウム
で培養液を再滴定してpHを9.0とし、そして濃厚液の形
の細菌に由来するアルカリ性プロテアーゼである、アル
カラーゼ(Alcalase)0.6L(NOVO Enzyme Products Ltd.
製品,Windsor、英国)をプロテアーゼ活性1アンソン
(Anson)単位/g細菌細胞蛋白質に相当する最終濃度と
なるように添加した。次に試料を軌道振混ぜ機上で60
℃において更に20時間温置し、その間に細胞の蛋白質
分解は発酵ブイヨンを肉眼でわかるほど澄ませた。セシ
ル(Cecil)CS595型分光光度計において600nmで測定し
た培養液の光学密度は酵素を4時間以内添加している間
に3.30から0.60の最小値まで低下した。これは、培養細
胞の乾燥重量濃度が1.34g-1から0.56g-1に低下した
ことと関連していた。澄明になったブイヨンを顕微鏡で
検査すると、細菌の細胞体の完全な分解が起こり、直径
0.1μよりも小さい細胞膜の破片の残渣が残っているこ
とがわかった。
C)蒸留水で9倍に希釈して62ppmの不溶性固形物を含
む1000ppmの多糖類溶液とした清浄化したブイヨン
について、分解していない細胞膜物質または不溶性の塩
沈澱物の形で過試験を実施した。15psiの過圧(オ
ーバープレッシャー)を使用して、この希釈した溶液
を、0.65μおよび0.45μの孔径を有する直径47mmのミ
リポア(Millipore)フィルターパッドを通して過し
た。第2表および第3表はそれぞれ0.65μおよび0.45μ
の孔のフィルターを通る典型的な過速度を示してい
る。いずれの場合も、清浄化されたブイヨンの過速度
は、清浄化されていないブイヨンを同様に希釈して得た
試料を使用して得た過速度よりもかなり速かった。
実施例II 処理のpHおよび洗浄剤と酵素の濃度によってプロセスの
有効性が影響される程度を測定するために更に実験を実
施した。これらの実験は、実施例IAに記載したのと同
様な手順によって製造されたシュードモナス種NCIB11
592の発酵ブイヨンを使用したが、下記の培養基を使
用して実施した。
2Mアルカリ溶液によってpHを7に調整した。接種して
から約90時間後にブイヨンを採収し、次いで軌道振混
ぜ機上の250mフラスコ中、ドデシル硫酸ナトリウ
ム(SDS)および/またはアルカラーゼと共に、50℃に
おいて温置したブイヨンの試料30mで個々の処理を
遂行した。SDS処理温置時間は40分であったが、酵素
処理の温置時間は第4表に示すように変化させた。次い
で、処理されたブイヨンを19倍容量の蒸留水で希釈
し、そしてパイユニカム(Pye Unicam)SP6-500におい
て、ブランクとして蒸留水について測定すると共に、6
25nm,10mmの通路長さで光学密度を測定することに
よって、清浄化の度合を測定した。同じ希釈率における
未処理のブイヨンの光学密度は0.140であって、これは
希釈してないブイヨン中の細胞の乾燥重量約1.3g/に
相当していた。これらの試験の結果を下の第4表に示
す。
実施例III 以下の手順は実施例IIに記載したのと同様であり、発酵
ブイヨンはシュードモナス種NCIB11592から製造
し、そして異った洗浄剤と、それにつづくアルカラーゼ
酵素によって処理した。使用した洗浄剤は次のとおりで
あった。
陰イオン系:デドシル硫酸ナトリウム(SDS)。
「ドバノール(Dobanol)」25-3S、硫酸化アルカノールエ
トキシレートのナトリウム塩。
「ドバノール」23-2S、硫酸化アルカノールエトキシレ
ートのナトリウム塩。
「ティーポール(Teepol)」HB6、C9-13第一級アルコール
サルフェートのナトリウム塩。
「ドバニン(Dobanic)」酸83、アルキルベンゼンスル
ホネート。
「ドバニン」酸JN、アルキルベンゼンスルホネート。
非イオン系:「トリトン(Triton)」X-100、オクチルフ
ェノールエチレンオキシド縮合物。
陽イオン系:セチルトリメチルアンモニウムブロマイ
ド,ドデシルベンジルジメチルアンモニウムクロライド 洗浄剤と酵素の両者の温置を50℃において、前者は4
0分、後者は120分遂行した。「ドバニン」酸洗浄剤
は別として、洗浄剤の温置後のpHは洗浄剤を添加する前
のpHと少ししか相違しない。
2種の陽イオン系表面活性剤は重合体および細胞の迅速
かつ完全な沈殿を生じ、陰イオン系および非イオン系洗
浄剤によって得られた結果を下の第5表に示す。
比較例A 酵素のみの使用 上記の実施例IAに記載したように、シュードモナスNC
IB11592の発酵によってブイヨンを製造した。
温度制御をした軌道振混ぜ機の上で攪拌されている25
0mの円錐フラスコ中で100mのブイヨン試料を使
用して、発酵ブイヨンのベンチスケールの表面活性剤/
酵素処理を遂行した。種々の標準的なプロテアーゼ処
理、リゾチーム処理および表面活性剤処理を、使用条件
の簡単な項目と共に第6表に示す。600nmにおける光
学密度の測定、乾燥重量の測定および顕微鏡による検査
によるブイヨン中に残った不溶性の細胞物質の測定によ
って、各処理の有効性を評価した。評価した酵素の詳
細、適用した条件および細胞の溶解を成しとげる各酵素
の(非)有効性を第5表に示す。この表から、発酵ブイ
ヨン全体または燐酸塩緩衝剤中に懸濁したシュードモナ
スNCIB11592の細胞のいずれに対してもプロテアー
ゼ単独の処理は有効でないことがわかる。同様に、EDTA
およびトリス(Tris)緩衝剤を使用または使用しないリゾ
チーム処理も浸透圧的破壊を受けたシュードモナスNCIB
11592を溶解するには十分でなかった。
比較例B 洗浄剤のみの使用 酵素を省いたこと、すなわちSDSの処理の後ブイヨンのp
Hを(必要ならば)pH7に調整し、50℃において酵素
の不存在下ブイヨンを16時間温置したことを除いて、
実施例IIと同じ様に発酵ブイヨンを製造して処理した。
光学密度の測定(蒸留水で20倍に希釈した試料を62
5nm、10mmの通路長さにおいて、蒸留水のブランクに
対して測定)によって各処理の効果を評価する。その結
果は下の第7表に示されており、第4表と比較すると、
光学密度の減少(すなわち清浄化)はSDSと酵素の両者
を使用した時に得られたものよりもかなり小さいことが
明らかである。
比較例C 酵素処理の後の洗浄剤の使用 (「順序を逆にした」処理) SDS処理を酵素処理の前に先行させる代りに、SDS処理を
酵素処理の後につづけることを除いて、実施例IIと同様
にして発酵ブイヨンを製造して処理した。本発明の結果
とできるだけ密接に比較させるために、pH7または4お
よび50℃において40分間(すなわちSDS処理のため
に使用した条件)温置することによって酵素処理を先行
させ、次いでSDSの存在下50℃においてブイヨンを5
0分間温置した。清浄化の程度を光学密度によって評価
し、その得られた結果を下の第8表に示す。この表か
ら、洗浄剤と酵素の処理を逆の順序で適用すると、ブイ
ヨンを清浄化する能力が全体として実質的に失われるこ
とが明らかである。

Claims (9)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項1】細胞を含む水性基質をプロテアーゼ酵素と
    接触させることによって細胞を破壊する方法において、
    細胞を含む基質が、多糖類を産出する微生物による栄養
    基質の発酵によって得られたブイヨンであること、かつ
    酵素との接触の前に陰イオン系または非イオン系表面活
    性剤との接触を先行させることを特徴とする、上記方
    法。
  2. 【請求項2】微生物がシュードモナスの粘液形成性の種
    である、特許請求の範囲第1項記載の方法。
  3. 【請求項3】微生物がシュードモナスNCIB1159
    2である、特許請求の範囲第2項記載の方法。
  4. 【請求項4】表面活性剤が陰イオン系表面活性剤であ
    る、特許請求の範囲第1〜3項のいずれか一つの項記載
    の方法。
  5. 【請求項5】表面活性剤が、アルキル連鎖が少なくとも
    8個の炭素原子を含むアルカリ金属アルキルサルフェー
    ト、アルキルベンゼンスルホネート、硫酸化アルカノー
    ルエトキシレートまたは硫酸化アルカノールである、特
    許請求の範囲第4項記載の方法。
  6. 【請求項6】6.0よりも低いpHにおいて基質を表面活
    性剤と接触させる、特許請求の範囲第1〜5項のいずれ
    か一つの項記載の方法。
  7. 【請求項7】酵素がアルカリ性プロテアーゼである、特
    許請求の範囲第1〜6項のいずれか一つの項記載の方
    法。
  8. 【請求項8】(a)多糖類を産出する微生物を栄養基質中
    で培養し;(b)得られた発酵ブイヨンを最初に陰イオン
    系又は非イオン系表面活性剤と接触させ、次にプロテア
    ーゼ酵素と接触させ;そして(c)得られた溶液を濾過す
    ることによって、石油の回収率増進法において使用する
    のに適した、実質的に細胞を含まない多糖類溶液を得
    る、特許請求の範囲第1〜7項のいずれか一つの項記載
    の方法。
  9. 【請求項9】実質的に細胞を含まない溶液を限外濾過に
    よって濃縮する、特許請求の範囲第8項記載の方法。
JP57190921A 1981-11-03 1982-11-01 細胞の破壊方法 Expired - Lifetime JPH0634702B2 (ja)

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Application Number Priority Date Filing Date Title
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GB8133059 1981-11-03

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