JPH0634719B2 - Ｄｎａフラグメント - Google Patents
ＤｎａフラグメントInfo
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- JPH0634719B2 JPH0634719B2 JP58098732A JP9873283A JPH0634719B2 JP H0634719 B2 JPH0634719 B2 JP H0634719B2 JP 58098732 A JP58098732 A JP 58098732A JP 9873283 A JP9873283 A JP 9873283A JP H0634719 B2 JPH0634719 B2 JP H0634719B2
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- Japan
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- gram
- positive
- dna
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-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/67—General methods for enhancing the expression
- C12N15/68—Stabilisation of the vector
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/74—Vectors or expression systems specially adapted for prokaryotic hosts other than E. coli, e.g. Lactobacillus, Micromonospora
- C12N15/75—Vectors or expression systems specially adapted for prokaryotic hosts other than E. coli, e.g. Lactobacillus, Micromonospora for Bacillus
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- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Saccharide Compounds (AREA)
Description
【発明の詳細な説明】 本発明は一般的に分子生物学の分野、特にグラム陽性菌
中で増殖する遺伝子工学的に組み換えたプラスミドに組
み込むＤＮフラグメントに関する。
中で増殖する遺伝子工学的に組み換えたプラスミドに組
み込むＤＮフラグメントに関する。
本発明の方法は成長するグラム陽性菌の集団中で安定に
増殖する新しい遺伝子工学的に組換えたプラスミドを構
成するのに使用する。本発明の新しい遺伝子工学的に組
換えたプラスミドを構成するのに使用する親プラスミド
はｐＬＳ１１である。プラスミドｐＬＳ１１は大阪（日
本）にある発酵研究所に保管されている枯草菌（Bacil-
lus subtilis）菌株ＩＦＯ３０２２中に発見された。枯
草菌（Bacillus subtilis）菌株ＢＤ２２４中本発明の
方法により構成される新しいプラスミドの例としてアメ
リカン・タイプ・カルチヤー・コレクシヨン（American
Type Culture Collection）（メリーランド州ロツクビ
ル２０８５２）に保管されているものがある。このプラ
スミドはプラスミドｐＯＧ２３８１と同定されたもので
ある。ｐＯＧ２３８１が潜在する枯草菌（Bacillus sub
tilis）菌株ＢＤ２２４はＡＴＣＣ番号３９０３８が付
されている。この菌株およびプラスミドは米国特許が付
与されると一般に自由分譲される。
増殖する新しい遺伝子工学的に組換えたプラスミドを構
成するのに使用する。本発明の新しい遺伝子工学的に組
換えたプラスミドを構成するのに使用する親プラスミド
はｐＬＳ１１である。プラスミドｐＬＳ１１は大阪（日
本）にある発酵研究所に保管されている枯草菌（Bacil-
lus subtilis）菌株ＩＦＯ３０２２中に発見された。枯
草菌（Bacillus subtilis）菌株ＢＤ２２４中本発明の
方法により構成される新しいプラスミドの例としてアメ
リカン・タイプ・カルチヤー・コレクシヨン（American
Type Culture Collection）（メリーランド州ロツクビ
ル２０８５２）に保管されているものがある。このプラ
スミドはプラスミドｐＯＧ２３８１と同定されたもので
ある。ｐＯＧ２３８１が潜在する枯草菌（Bacillus sub
tilis）菌株ＢＤ２２４はＡＴＣＣ番号３９０３８が付
されている。この菌株およびプラスミドは米国特許が付
与されると一般に自由分譲される。
成長している細菌の細胞集団中自律的に複製するプラス
ミドを安定に増殖させるには、いくつかの要求が満足さ
せられねばならない。プラスミド複製の速度をある種の
細胞機能でモニターして、培養の成長速度を調整する。
この事はプラスミドＤＮＡ分子の複製開始の頻度を調節
する細胞質試薬により達成されるらしい事が示唆されて
きた。細胞質試薬と言われるものはプラスミドコピーの
数に比例して合成されるらしい。Pritchard，Ｒ．ら、S
ymp.Soc.Gen.Microbiol.，１９：２６３−２９７（１９
６８）を参照されたい。この方法によりプラスミドは全
体の細胞量中一定の濃度に保持される。
ミドを安定に増殖させるには、いくつかの要求が満足さ
せられねばならない。プラスミド複製の速度をある種の
細胞機能でモニターして、培養の成長速度を調整する。
この事はプラスミドＤＮＡ分子の複製開始の頻度を調節
する細胞質試薬により達成されるらしい事が示唆されて
きた。細胞質試薬と言われるものはプラスミドコピーの
数に比例して合成されるらしい。Pritchard，Ｒ．ら、S
ymp.Soc.Gen.Microbiol.，１９：２６３−２９７（１９
６８）を参照されたい。この方法によりプラスミドは全
体の細胞量中一定の濃度に保持される。
成長する細胞集団中のプラスミドの安定な保持の為には
また細胞分裂の間生じた各々の娘細胞に親細胞から少く
とも一つのプラスミドのコピーを受けとる事が必要であ
る。しかしながら、プラスミドの能働分配の機構なしで
は娘細胞間のプラスミド分子の分布は純粋に不規則に起
こり、限られた比率の細胞しかプラスミドを受け継がな
い。細菌細胞集団の成長の間自然に存在するプラスミド
の消失は一般に観察されないので、ほとんどのそのよう
なプラスミドは細胞分裂の際能動分配されていると現在
信じられている。Meacock，Ｐ．およびCohen，Ｓ．，Ce
ll２０：５２９−５４２（1980）を参照されたい。
また細胞分裂の間生じた各々の娘細胞に親細胞から少く
とも一つのプラスミドのコピーを受けとる事が必要であ
る。しかしながら、プラスミドの能働分配の機構なしで
は娘細胞間のプラスミド分子の分布は純粋に不規則に起
こり、限られた比率の細胞しかプラスミドを受け継がな
い。細菌細胞集団の成長の間自然に存在するプラスミド
の消失は一般に観察されないので、ほとんどのそのよう
なプラスミドは細胞分裂の際能動分配されていると現在
信じられている。Meacock，Ｐ．およびCohen，Ｓ．，Ce
ll２０：５２９−５４２（1980）を参照されたい。
成長細胞集団中で安定にプラスミドを保持するには、さ
らにプラスミドＤＮＡの構造的な安定性が必要である。
構造的安定性とは複製の間プラスミドＤＮＡの正確な増
殖を意味する。
らにプラスミドＤＮＡの構造的な安定性が必要である。
構造的安定性とは複製の間プラスミドＤＮＡの正確な増
殖を意味する。
本発明は能動分配（即ち分配プロフイシエンシー）され
る安定なプラスミド増殖の構成要素に関連する。現代の
ＤＮＡ組換え技術により構成した“遺伝子工学”による
プラスミドは不運な事に宿主細胞分裂の際必ずしも能動
分配されるわけではないので、本発明は重要である。即
ち、多くの遺伝子工学的に組換えたプラスミドはうまく
分配されないか、またはされたとしても非常に少い。あ
る種の微生物に自然に存在するプラスミドから取つた遺
伝子のフラグメントを他の種類の微生物を形質転換でき
る遺伝子工学的に組換えたプラスミドの構成に使用した
場合、能動分配の欠除が特に明白となる。例えば、黄色
ぶどう状球菌（Stap-hylococcus aureus）に本来存在す
るプラスミドからの遺伝子フラグメントは枯草菌（Baci
ll-us subtilis）を形質転換できる合成プラスミドの構
成に用いられてきた。そのようなプラスミドの構成はヨ
ーロツパ特許出願公報第0.036,259号（公報８１／３
８，１９８１年９月２３日公布）に記載されている。そ
の出願は本出願人に譲渡されている。
る安定なプラスミド増殖の構成要素に関連する。現代の
ＤＮＡ組換え技術により構成した“遺伝子工学”による
プラスミドは不運な事に宿主細胞分裂の際必ずしも能動
分配されるわけではないので、本発明は重要である。即
ち、多くの遺伝子工学的に組換えたプラスミドはうまく
分配されないか、またはされたとしても非常に少い。あ
る種の微生物に自然に存在するプラスミドから取つた遺
伝子のフラグメントを他の種類の微生物を形質転換でき
る遺伝子工学的に組換えたプラスミドの構成に使用した
場合、能動分配の欠除が特に明白となる。例えば、黄色
ぶどう状球菌（Stap-hylococcus aureus）に本来存在す
るプラスミドからの遺伝子フラグメントは枯草菌（Baci
ll-us subtilis）を形質転換できる合成プラスミドの構
成に用いられてきた。そのようなプラスミドの構成はヨ
ーロツパ特許出願公報第0.036,259号（公報８１／３
８，１９８１年９月２３日公布）に記載されている。そ
の出願は本出願人に譲渡されている。
そのような遺伝子工学的に組み換えたプラスミドおよび
その子孫は細胞分裂の際能動分配されないので細胞集団
成長の間必ずしも安定に保持されない事を示したヨーロ
ツパ特許出願公報第0.036,259号に記載されたような型
のプラスミドの工業的応用に現在の研究は指向してい
る。もちろん、細胞集団成長間に安定な保持ができない
事は、遺伝子工学的に組換えて有用な遺伝子生成物のた
めの遺伝暗号を構成するようにしたプラスミドの工業上
の利用性を減少させる。構造的に安定であるが能動分配
をしないプラスミドの保持には成長培養液中に抗生物質
（または他の型の選択圧力）を存在させる事が必要であ
り、それに対し、プラスミドは細胞中に潜在している選
択的利点を細胞に与える。この方法でプラスミドを安定
に保持する（即ち成長培養液中に抗生物質を入れる）の
は、高価につき、能率的でない。
その子孫は細胞分裂の際能動分配されないので細胞集団
成長の間必ずしも安定に保持されない事を示したヨーロ
ツパ特許出願公報第0.036,259号に記載されたような型
のプラスミドの工業的応用に現在の研究は指向してい
る。もちろん、細胞集団成長間に安定な保持ができない
事は、遺伝子工学的に組換えて有用な遺伝子生成物のた
めの遺伝暗号を構成するようにしたプラスミドの工業上
の利用性を減少させる。構造的に安定であるが能動分配
をしないプラスミドの保持には成長培養液中に抗生物質
（または他の型の選択圧力）を存在させる事が必要であ
り、それに対し、プラスミドは細胞中に潜在している選
択的利点を細胞に与える。この方法でプラスミドを安定
に保持する（即ち成長培養液中に抗生物質を入れる）の
は、高価につき、能率的でない。
本発明の他の目的は、細胞分裂の際能動的に分配され、
宿主細胞集団成長の間安定に保持され、枯草菌（Bacill
us subtilis）細菌を形質転換できるような遺伝子工学
的に組換えたプラスミドを作り出す方法を提供する事で
ある。
宿主細胞集団成長の間安定に保持され、枯草菌（Bacill
us subtilis）細菌を形質転換できるような遺伝子工学
的に組換えたプラスミドを作り出す方法を提供する事で
ある。
本発明の他の目的は宿主細胞分裂の際能動的に分配さ
れ、宿主細胞集団成長の間安定に伝達され、グラム陽性
菌を形質転換可能な遺伝子工学的に組換えたプラスミド
を提供する事にある。
れ、宿主細胞集団成長の間安定に伝達され、グラム陽性
菌を形質転換可能な遺伝子工学的に組換えたプラスミド
を提供する事にある。
本発明の他の目的は、宿主細胞分裂の際能働的に分配さ
れ、宿主細胞集団成長の間安定に保持され、枯草菌（Ba
cillus subtilis）細菌を形質転換可能な、遺伝子工学
的に組換えたプラスミドを提供する事である。
れ、宿主細胞集団成長の間安定に保持され、枯草菌（Ba
cillus subtilis）細菌を形質転換可能な、遺伝子工学
的に組換えたプラスミドを提供する事である。
本発明の他の目的は、グラム陽性菌を形質転換可能な遺
伝子工学的に組換えたプラスミドに取り込ませた時、宿
主細胞分裂の際“グラム陽性菌”の遺伝子工学的に組換
えたプラスミドを分配プロフイシエントにさせる分配プ
ロフイシエンシー遺伝子からなるＤＮＡフラグメントを
提供する事である。
伝子工学的に組換えたプラスミドに取り込ませた時、宿
主細胞分裂の際“グラム陽性菌”の遺伝子工学的に組換
えたプラスミドを分配プロフイシエントにさせる分配プ
ロフイシエンシー遺伝子からなるＤＮＡフラグメントを
提供する事である。
本発明の他の目的は、枯草菌（Bacillus subtilis）宿
主微生物形質転換可能なプラスミドに取り込ませた時、
宿主細胞分裂の際、枯草菌（Bacillus subtilis）の遺
伝子工学的に組換えたプラスミドを分配プロフイシエン
トにさせる分配プロフイシエント遺伝子からなるＤＮＡ
フラグメントを提供する事である。
主微生物形質転換可能なプラスミドに取り込ませた時、
宿主細胞分裂の際、枯草菌（Bacillus subtilis）の遺
伝子工学的に組換えたプラスミドを分配プロフイシエン
トにさせる分配プロフイシエント遺伝子からなるＤＮＡ
フラグメントを提供する事である。
本発明のフラグメントにより、枯草菌（Bacillus subti
lis）の微生物細胞分裂の際分配がプロフイシエントで
あるような、遺伝子工学的に組換えたプラスミドで形質
転換された枯草菌（Bacillus subtilis）宿主微生物を
提供する事ができる。
lis）の微生物細胞分裂の際分配がプロフイシエントで
あるような、遺伝子工学的に組換えたプラスミドで形質
転換された枯草菌（Bacillus subtilis）宿主微生物を
提供する事ができる。
この分野に精通する者には、添付の図面を関連させると
以下の記述から本発明の他の目的が明白になるであろ
う： 第１図はプラスミドｐＯＧ２３２６の構成を詳述した制
限酵素地図を示す。
以下の記述から本発明の他の目的が明白になるであろ
う： 第１図はプラスミドｐＯＧ２３２６の構成を詳述した制
限酵素地図を示す。
第２図はプラスミドｐＯＧ２３８１（ＡＴＣＣ３９０３
８）の構成を詳述した制限酵素地図を示す。
８）の構成を詳述した制限酵素地図を示す。
第３図は抗生物質のクロラムフエニコール不存在下で成
長する枯草菌（Bacillus subtilis）菌株ＢＤ２２４（t
rpＣ２，thr-５，recＥ４）の集団中、安定に保持され
るプラスミドｐＯＧ２３８１（図中ｏ印）および安定に
保持されないプラスミドｐＯＧ２３２６（図中・印）の
分配プロフイシエンシーのグラフである。ｐＯＧ２３２
６が安定に保持されないのは分配プロフイシエンシーの
欠除による。
長する枯草菌（Bacillus subtilis）菌株ＢＤ２２４（t
rpＣ２，thr-５，recＥ４）の集団中、安定に保持され
るプラスミドｐＯＧ２３８１（図中ｏ印）および安定に
保持されないプラスミドｐＯＧ２３２６（図中・印）の
分配プロフイシエンシーのグラフである。ｐＯＧ２３２
６が安定に保持されないのは分配プロフイシエンシーの
欠除による。
第４図はプラスミドｐＤＨ５０６０の構成を詳述した制
限酵素地図を示す。
限酵素地図を示す。
第５図はプラスミドｐＳＹＣ７０６の制限酵素地図を示
す。
す。
第６図は1.2KbMboＩグラム陽性菌分配フラグメント中に
含まれる約３５０塩基対からなるHaeＩＩＩからHindＩ
ＩＩまでのＤＮＡフラグメントのヌクレオチドの塩基配
列を示す。
含まれる約３５０塩基対からなるHaeＩＩＩからHindＩ
ＩＩまでのＤＮＡフラグメントのヌクレオチドの塩基配
列を示す。
第７図は1.2ＫｂMboＩグラム陽性菌分配フラグメント中
に含まれる約３５０塩基対からなるHaeＩＩＩからHind
ＩＩＩまでのＤＮＡフラグメントの制限酵素地図を示
す。
に含まれる約３５０塩基対からなるHaeＩＩＩからHind
ＩＩＩまでのＤＮＡフラグメントの制限酵素地図を示
す。
非常に一般的には、分配プロフイシエントであり、グラ
ム陽性菌宿主細胞分裂の際安定に伝達され、宿主細胞集
団の成長の間安定に保持できるような遺伝子工学的に組
換えたプラスミドの製造に有益な方法を本発明は明らか
にしている。本発明の方法により製造される遺伝子工学
的に組換えたプラスミドはグラム陽性菌微生物中で複製
でき、宿主細胞分裂の際分配プロフイシエンシーを与
え、成長するグラム陽性菌宿主細胞集団において遺伝子
工学的に組換えたプラスミドの安定な保持に必要な分配
セグメント（par+）を含んでいる。遺伝子工学的に組換
えたプラスミドは目的の蛋白または他の遺伝子生成物の
ためのＤＮＡ暗号を含んでいる。
ム陽性菌宿主細胞分裂の際安定に伝達され、宿主細胞集
団の成長の間安定に保持できるような遺伝子工学的に組
換えたプラスミドの製造に有益な方法を本発明は明らか
にしている。本発明の方法により製造される遺伝子工学
的に組換えたプラスミドはグラム陽性菌微生物中で複製
でき、宿主細胞分裂の際分配プロフイシエンシーを与
え、成長するグラム陽性菌宿主細胞集団において遺伝子
工学的に組換えたプラスミドの安定な保持に必要な分配
セグメント（par+）を含んでいる。遺伝子工学的に組換
えたプラスミドは目的の蛋白または他の遺伝子生成物の
ためのＤＮＡ暗号を含んでいる。
ここで用いる遺伝子工学的に組換えたプラスミドとは遺
伝子工学の技術を用いる事により構成されるプラスミド
を意味している。
伝子工学の技術を用いる事により構成されるプラスミド
を意味している。
遺伝子工学の技術とは、核酸分子（たとえ細胞の外で生
成または誘導されたものでも）を細菌プラスミドまたは
他のベクター系に挿入して新しい遺伝性の物質の結合を
形成し、それを宿主微生物（宿主微生物中には自然には
高頻度では存在しない。しかしそれはその中で複製可能
である）に取り込ませる技術を意味する。
成または誘導されたものでも）を細菌プラスミドまたは
他のベクター系に挿入して新しい遺伝性の物質の結合を
形成し、それを宿主微生物（宿主微生物中には自然には
高頻度では存在しない。しかしそれはその中で複製可能
である）に取り込ませる技術を意味する。
グラム陽性菌とはグラム陽性細菌を意味する。
形質転換可能な宿主とはグラム陽性菌par+組換えプラス
ミドからプラスミドＤＮＡを受けとる事が可能なグラム
陽性宿主菌を意味する。グラム陽性形質転換可能な宿主
菌はこのようにグラム陽性菌Par+組換えプラスミドによ
り形質転換可能になる。
ミドからプラスミドＤＮＡを受けとる事が可能なグラム
陽性宿主菌を意味する。グラム陽性形質転換可能な宿主
菌はこのようにグラム陽性菌Par+組換えプラスミドによ
り形質転換可能になる。
適合性のある宿主菌とは、Par+組換えプラスミドＤＮＡ
の複製が可能な形質転換可能なグラム陽性宿主菌を意味
する。上記適合性ある宿主微生物はまたPar+表現型で表
現され、それに加え少くとも一つの他の遺伝子がグラム
陽性Par+組換えプラスミドを運ぶ。
の複製が可能な形質転換可能なグラム陽性宿主菌を意味
する。上記適合性ある宿主微生物はまたPar+表現型で表
現され、それに加え少くとも一つの他の遺伝子がグラム
陽性Par+組換えプラスミドを運ぶ。
子孫とは細胞分裂により作り出される子または娘細胞を
意味し、それにおいて子または娘細胞は実質的に親細胞
と同一である。
意味し、それにおいて子または娘細胞は実質的に親細胞
と同一である。
分配とは宿主細胞分裂の際娘細胞にプラスミドのコピー
が分布または伝達される過程（不規則または能動的）を
意味する。
が分布または伝達される過程（不規則または能動的）を
意味する。
能動分配とは分配プロフイシエントプラスミドと宿主細
胞との系におけるプラスミドの分配を意味する。
胞との系におけるプラスミドの分配を意味する。
分配プロフイシエンシーは細胞中のプラスミドの表現型
の特徴であり、該プラスミドのコピーは細胞分裂の際純
粋に不規則な過程以外の過程で分配される。プラスミド
−グラム陽性菌宿主系での分配プロフイシエンシーはそ
の系のプラスミド上にグラム陽性菌分配セグメントの存
在を必要とする。
の特徴であり、該プラスミドのコピーは細胞分裂の際純
粋に不規則な過程以外の過程で分配される。プラスミド
−グラム陽性菌宿主系での分配プロフイシエンシーはそ
の系のプラスミド上にグラム陽性菌分配セグメントの存
在を必要とする。
グラム陽性菌分配セグメントは一列のＤＮＡヌクレオチ
ド（ここで分配プロフイシエンシー遺伝子（Par+）と定
義した）からなり、それは分配プロフイシエンシーのた
めにプラスミド上に存在する。
ド（ここで分配プロフイシエンシー遺伝子（Par+）と定
義した）からなり、それは分配プロフイシエンシーのた
めにプラスミド上に存在する。
もしプラスミドに分配プロフイシエンシー遺伝子がなか
つたら、プラスミドは細胞分裂の際不公平に分配され
る。もしプラスミドが細胞に潜在している選択的利点を
与えないと、宿主細胞中のそのひろまりは数代の細胞分
裂後には相当な速度で減少するだろう。このようにプラ
スミド上の遺伝子による有益な遺伝子産物の生産が減少
または完全に停止するだろう。
つたら、プラスミドは細胞分裂の際不公平に分配され
る。もしプラスミドが細胞に潜在している選択的利点を
与えないと、宿主細胞中のそのひろまりは数代の細胞分
裂後には相当な速度で減少するだろう。このようにプラ
スミド上の遺伝子による有益な遺伝子産物の生産が減少
または完全に停止するだろう。
Par+セグメントは自然に存在するグラム陽性菌プラスミ
ドから誘導される。そのようなプラスミドの例はTanak
a，Ｔ．らによるJ.Bacteriol.１２９：１４８７−１４
９４（１９７７）に記載されている。Par+セグメントは
また遺伝子工学的に組換えたプラスミドｐＯＧ２３８１
（ＡＴＣＣ３９０３８）からも得る事ができる。
ドから誘導される。そのようなプラスミドの例はTanak
a，Ｔ．らによるJ.Bacteriol.１２９：１４８７−１４
９４（１９７７）に記載されている。Par+セグメントは
また遺伝子工学的に組換えたプラスミドｐＯＧ２３８１
（ＡＴＣＣ３９０３８）からも得る事ができる。
上記遺伝子工学的に組換えたPar+プラスミドは成長過程
のグラム陽性菌宿主細胞集団中で安定性を持つており、
構造的には同じでも分配セグメントを持たない遺伝子工
学的組換えプラスミドより安定である。グラム陽性菌宿
主細胞成長において少くとも１００世代後に１００％と
同じ高さの安定性を持つている上記Par+遺伝子工学的組
換えプラスミドが得られる。ここで用いる一世代とは宿
主細胞数が倍加する事を意味する。
のグラム陽性菌宿主細胞集団中で安定性を持つており、
構造的には同じでも分配セグメントを持たない遺伝子工
学的組換えプラスミドより安定である。グラム陽性菌宿
主細胞成長において少くとも１００世代後に１００％と
同じ高さの安定性を持つている上記Par+遺伝子工学的組
換えプラスミドが得られる。ここで用いる一世代とは宿
主細胞数が倍加する事を意味する。
方法を実施するにはPar+機能を含む自然に存在するグラ
ム陽性菌プラスミドを制限酵素で切断し、連結可能な末
端を持つ直線状ＤＮＡセグメントを作る。いくつかの直
線状のＤＮＡフラグメントセグメントの上に分配プロフ
イシエンシー遺伝子（グラム陽性菌分配セグメント）が
含まれる。分配プロフイシエンシー遺伝子または遺伝子
工学的に組換えたプラスミドｐＯＧ２３８１（ＡＴＣＣ
３９０３８）からも得る事ができる。プラスミドｐＯＧ
２３８１を制限酵素で切断し、分配プロフイシエンシー
遺伝子を含むフラグメントを得る。制限酵素MboＩまた
はSau３Ａによる切断で分配プロフイシエンシー遺伝子
を含む約１２００ｂｐ（1.2kb）の大きなフラグメント
を得る。制限酵素HaeＩＩＩおよびHindＩＩＩによる切
断ではやはり分配プロフイシエンシー遺伝子を含む約３
５０塩基対のより小さなフラグメントを得る。ｐＯＧ２
３８１をPstＩおよびHaeＩＩＩの制限酵素で切断し、分
配プロフイシエンシー遺伝子を含む約２６０bpのより一
層小さいフラグメントを得る。グラム陽性宿主菌中で複
製できる組換えプラスミドもまた制限酵素で切断し、グ
ラム陽性分配遺伝子セグメントの末端と連結できるよう
な末端を直線ＤＮＡを得る。末端を互いに結合し形質転
換可能で適合性のあるグラム陽性宿主菌を形質転換する
に使用する。形質転換後、細胞を成長させ、分配プロフ
イシエント（Par+-）プラスミドのための選択を行う。P
ar+プラスミドを持つ形質転換細胞を採取し、蛋白質ま
たは他の遺伝子産物の生産の為の長期間の成長または発
酵への応用に使用する事が期待される。
ム陽性菌プラスミドを制限酵素で切断し、連結可能な末
端を持つ直線状ＤＮＡセグメントを作る。いくつかの直
線状のＤＮＡフラグメントセグメントの上に分配プロフ
イシエンシー遺伝子（グラム陽性菌分配セグメント）が
含まれる。分配プロフイシエンシー遺伝子または遺伝子
工学的に組換えたプラスミドｐＯＧ２３８１（ＡＴＣＣ
３９０３８）からも得る事ができる。プラスミドｐＯＧ
２３８１を制限酵素で切断し、分配プロフイシエンシー
遺伝子を含むフラグメントを得る。制限酵素MboＩまた
はSau３Ａによる切断で分配プロフイシエンシー遺伝子
を含む約１２００ｂｐ（1.2kb）の大きなフラグメント
を得る。制限酵素HaeＩＩＩおよびHindＩＩＩによる切
断ではやはり分配プロフイシエンシー遺伝子を含む約３
５０塩基対のより小さなフラグメントを得る。ｐＯＧ２
３８１をPstＩおよびHaeＩＩＩの制限酵素で切断し、分
配プロフイシエンシー遺伝子を含む約２６０bpのより一
層小さいフラグメントを得る。グラム陽性宿主菌中で複
製できる組換えプラスミドもまた制限酵素で切断し、グ
ラム陽性分配遺伝子セグメントの末端と連結できるよう
な末端を直線ＤＮＡを得る。末端を互いに結合し形質転
換可能で適合性のあるグラム陽性宿主菌を形質転換する
に使用する。形質転換後、細胞を成長させ、分配プロフ
イシエント（Par+-）プラスミドのための選択を行う。P
ar+プラスミドを持つ形質転換細胞を採取し、蛋白質ま
たは他の遺伝子産物の生産の為の長期間の成長または発
酵への応用に使用する事が期待される。
本発明の良好な形態として、分配プロフイシエント遺伝
子は自然に存在する枯草菌（Bacillus subtilis）菌株
ＩＦＯ３０２２からのプラスミドｐＬＳ１１（Tanaka
T.らによりJ.Bacteriol.，１２９：１４８７−（１４９
４）（１９７７）に記載されている）から誘導する。菌
株ＩＦＯ３０２２は大阪の発酵研究所に保管されてい
る。それを要求すれば制限なく手に入れる事ができる。
プラスミドｐＬＳ１１は枯草菌（（Bacillus subtili
s）菌株ＩＦＯ３０２２からTanakaらにより記載された
方法（前記の文献）により単離、精製される。単離、精
製に続いて、プラスミドｐＬＳ１１を制限酵素MboＩ（N
ew England Biolabs,Inc.Beverly，Maine０１９１５）
を用い、この分野では周知の技術を用い分離する。酵素
条件は製造業者の推薦する通りである。
子は自然に存在する枯草菌（Bacillus subtilis）菌株
ＩＦＯ３０２２からのプラスミドｐＬＳ１１（Tanaka
T.らによりJ.Bacteriol.，１２９：１４８７−（１４９
４）（１９７７）に記載されている）から誘導する。菌
株ＩＦＯ３０２２は大阪の発酵研究所に保管されてい
る。それを要求すれば制限なく手に入れる事ができる。
プラスミドｐＬＳ１１は枯草菌（（Bacillus subtili
s）菌株ＩＦＯ３０２２からTanakaらにより記載された
方法（前記の文献）により単離、精製される。単離、精
製に続いて、プラスミドｐＬＳ１１を制限酵素MboＩ（N
ew England Biolabs,Inc.Beverly，Maine０１９１５）
を用い、この分野では周知の技術を用い分離する。酵素
条件は製造業者の推薦する通りである。
ｐＬＳ１１を酵素分解すると約１０のＤＮＡフラグメン
トが生じる。分配プロフイシエント遺伝子は約1.2KbのM
boＩフラグメント上に含まれる。分配プロフイシエンシ
ー遺伝子源としてプラスミドｐＯＧ２３８１（ＡＴＣＣ
３９０３８）からの２６０ｂｐHaeＩＩＩ−PstＩフラグ
メント、３５０ｂｐHaeＩＩＩ−HindＩＩＩフラグメン
トまたは1.2KbのMboＩまたはSau３Ａフラグメントもま
た良好である。これらのグラム陽性菌分配セグメント
（ここではグラム陽性Par+-フラグメントとしても記載
されている）はグラム陽性細菌を形質転換できる遺伝子
工学的に組換えたプラスミド上の適合性のある制限酵素
部位に連結する。遺伝子工学的に組換えたプラスミドと
して特に良好なのは、ヨーロツパ特許出願公報第0,036,
259号に記載されている組換えプラスミドである。グラ
ム陽性菌Par+フラグメントを担持する新しい遺伝子工学
的に組換えたプラスミドは形質転換可能で適合性のある
グラム陽性菌宿主細胞を形質転換するのに用いる。特に
良好なのは枯草菌（Bacillus subtilis）菌株ＢＤ２２
４（trpＣ２，thr−５，recＥ４）である。形質転換し
た株を選択した後抗生物質を含まない肉汁に接種し、約
５０世代成長させ不安定な分配欠除の（Par-）クローン
を分離する。Par+プラスミドを持つている形質転換株を
採取し、目的の遺伝子産物の生産に使用する。
トが生じる。分配プロフイシエント遺伝子は約1.2KbのM
boＩフラグメント上に含まれる。分配プロフイシエンシ
ー遺伝子源としてプラスミドｐＯＧ２３８１（ＡＴＣＣ
３９０３８）からの２６０ｂｐHaeＩＩＩ−PstＩフラグ
メント、３５０ｂｐHaeＩＩＩ−HindＩＩＩフラグメン
トまたは1.2KbのMboＩまたはSau３Ａフラグメントもま
た良好である。これらのグラム陽性菌分配セグメント
（ここではグラム陽性Par+-フラグメントとしても記載
されている）はグラム陽性細菌を形質転換できる遺伝子
工学的に組換えたプラスミド上の適合性のある制限酵素
部位に連結する。遺伝子工学的に組換えたプラスミドと
して特に良好なのは、ヨーロツパ特許出願公報第0,036,
259号に記載されている組換えプラスミドである。グラ
ム陽性菌Par+フラグメントを担持する新しい遺伝子工学
的に組換えたプラスミドは形質転換可能で適合性のある
グラム陽性菌宿主細胞を形質転換するのに用いる。特に
良好なのは枯草菌（Bacillus subtilis）菌株ＢＤ２２
４（trpＣ２，thr−５，recＥ４）である。形質転換し
た株を選択した後抗生物質を含まない肉汁に接種し、約
５０世代成長させ不安定な分配欠除の（Par-）クローン
を分離する。Par+プラスミドを持つている形質転換株を
採取し、目的の遺伝子産物の生産に使用する。
以下の実施例は本発明を使用する方法を例示する。これ
らはただ例示のためであり、いづれの方法も本発明の範
囲を限定するわけではない。
らはただ例示のためであり、いづれの方法も本発明の範
囲を限定するわけではない。
実施例１：枯草菌（（Bacillus subtilis）プラスミド
からグラム陽性菌分配フラグメント（Par+）含有の遺伝
子工学的組換えプラスミドの構成。
からグラム陽性菌分配フラグメント（Par+）含有の遺伝
子工学的組換えプラスミドの構成。
プラスミドｐＬＳ１１を枯草菌（Bacillus subtilis）
菌株ＩＦＯ３０２２から単離、精製する。Tanaka，Ｔ．
らによるJ.Bacteriol，１２９：１４８７−１４９４
（１９７７）を参照されたい。２マイクログラムのｐＬ
Ｓ１１ＤＮＡを５０マイクロリツトルの６mM Tris−Ｈ
Ｃｌ（pH7.5、６mM MgCl2、５０mM NaCl）中３７℃で３
０分間２単位の制限酵素MboＩ（New England Biolabs、
前記を参照）で分解する。
菌株ＩＦＯ３０２２から単離、精製する。Tanaka，Ｔ．
らによるJ.Bacteriol，１２９：１４８７−１４９４
（１９７７）を参照されたい。２マイクログラムのｐＬ
Ｓ１１ＤＮＡを５０マイクロリツトルの６mM Tris−Ｈ
Ｃｌ（pH7.5、６mM MgCl2、５０mM NaCl）中３７℃で３
０分間２単位の制限酵素MboＩ（New England Biolabs、
前記を参照）で分解する。
ｐＬＳ１１からのプラスミドＤＮＡをヨーロツパ特許出
願公報第0.036,259号に記載されている遺伝子工学的に
組換えたプラスミドからのＤＮＡと連結する。特に、ｐ
ＬＳ１１からのDNAをプラスミドｐＯＧ２３２６からの
ＤＮＡと連結する。
願公報第0.036,259号に記載されている遺伝子工学的に
組換えたプラスミドからのＤＮＡと連結する。特に、ｐ
ＬＳ１１からのDNAをプラスミドｐＯＧ２３２６からの
ＤＮＡと連結する。
枯草菌（Bacillus subtilis）および大腸菌（Escherich
ia cdi）の両方の中で複製するプラスミドｐＯＧ２３２
６は、枯草菌（Bacillus subtilis）プラスミドｐＯＧ
１１９６（ＡＴＣＣ ３１７７６）および大腸菌（Esch
erichia coli）プラスミドｐＢＲ３２２（ＡＴＣＣ ３
７０１７）から構成する。第１図を参照されたい。ｐＯ
Ｇ２３２６を構成するには、プラスミドｐＯＧ１１９６
からのＤＮＡ３マイクログラムを上に記載したｐＬＳ１
１ＤＮＡの場合と同じ条件下MboＩ酵素で分解する。分
解されたＤＮＡを２０マイクロリツトルの６６mMトリス
（Tris）−ＨＣｌ（pH7.6、6.6mM MgCl2、１０mMＭＤＴ
Ｔ、0.1mMＡＴＰ）中１４℃で１８時間、２単位のＴ４
−ＤＮＡリカーゼで連結する。連結したＤＮＡで枯草菌
（Bacillus subtilis）ＢＤ２２４を形質転換した後、
プラスミド運搬、クロラムフエニコール耐性形質転換株
の特質を更に明らかにする。形質転換株中に発見された
プラスミドはｐＤＨ１０８６と称する；それは小さなMb
oＩフラグメントが失われている事を除いてｐＯＧ１１
９６と同じ構造である。第１図を参照されたい。各々２
マイクログラムのプラスミドｐＨＤ１０８６および大腸
菌（Escherichia coli）プラスミドｐＢＲ３２２を前記
MboＩと同じ条件下PvuＩＩエンドヌクレアーゼで分解す
る。生じるフラグメントをＴ４−ＤＮＡリガーゼを用い
上に記載した方法を用い連結する。連結したＤＮＡは大
腸菌（Escherichia coli）菌株ＣＳ４１２（Ｃ６００菌
株のhsdR-誘導株）を形質転換するのに用いる；クロラ
ムフエニコール耐性の形質転換株を選択する。ｐＯＧ２
３２６と称する一つの形質転換株からのプラスミドの特
質を更に明らかにする。それは第１図に示した構造を持
つ。以下に記載するクロラムフエニコール（Ｃｍ）耐性
を耐性を用いた検定において、抗生物質なしで肉汁中１
０世代継代後、集団中の0.002％以下の細胞がプラスミ
ドを潜在させているという事からｐＯＧ２３２６の不安
定性が示された。これらのデータは第３図に示した。
ia cdi）の両方の中で複製するプラスミドｐＯＧ２３２
６は、枯草菌（Bacillus subtilis）プラスミドｐＯＧ
１１９６（ＡＴＣＣ ３１７７６）および大腸菌（Esch
erichia coli）プラスミドｐＢＲ３２２（ＡＴＣＣ ３
７０１７）から構成する。第１図を参照されたい。ｐＯ
Ｇ２３２６を構成するには、プラスミドｐＯＧ１１９６
からのＤＮＡ３マイクログラムを上に記載したｐＬＳ１
１ＤＮＡの場合と同じ条件下MboＩ酵素で分解する。分
解されたＤＮＡを２０マイクロリツトルの６６mMトリス
（Tris）−ＨＣｌ（pH7.6、6.6mM MgCl2、１０mMＭＤＴ
Ｔ、0.1mMＡＴＰ）中１４℃で１８時間、２単位のＴ４
−ＤＮＡリカーゼで連結する。連結したＤＮＡで枯草菌
（Bacillus subtilis）ＢＤ２２４を形質転換した後、
プラスミド運搬、クロラムフエニコール耐性形質転換株
の特質を更に明らかにする。形質転換株中に発見された
プラスミドはｐＤＨ１０８６と称する；それは小さなMb
oＩフラグメントが失われている事を除いてｐＯＧ１１
９６と同じ構造である。第１図を参照されたい。各々２
マイクログラムのプラスミドｐＨＤ１０８６および大腸
菌（Escherichia coli）プラスミドｐＢＲ３２２を前記
MboＩと同じ条件下PvuＩＩエンドヌクレアーゼで分解す
る。生じるフラグメントをＴ４−ＤＮＡリガーゼを用い
上に記載した方法を用い連結する。連結したＤＮＡは大
腸菌（Escherichia coli）菌株ＣＳ４１２（Ｃ６００菌
株のhsdR-誘導株）を形質転換するのに用いる；クロラ
ムフエニコール耐性の形質転換株を選択する。ｐＯＧ２
３２６と称する一つの形質転換株からのプラスミドの特
質を更に明らかにする。それは第１図に示した構造を持
つ。以下に記載するクロラムフエニコール（Ｃｍ）耐性
を耐性を用いた検定において、抗生物質なしで肉汁中１
０世代継代後、集団中の0.002％以下の細胞がプラスミ
ドを潜在させているという事からｐＯＧ２３２６の不安
定性が示された。これらのデータは第３図に示した。
プラスミドｐＯＧ２３８１の構成には、0.5マイクログ
ラムのプラスミドｐＯＧ２３２６由来ＤＮＡをBamＨ１
酵素で分解する；その後、２マイクログラムのｐＬＳ１
１のMboＩフラグメントを加える。ｐＯＧ２３２６フラ
グメントおよびｐＬＳ１１フラグメントをＴ４−ＤＮＡ
リガーゼを用いて前に記載した方法で連結する。連結し
たＤＮＡは大腸菌（Escherichia coli）菌株ＣＳ４１２
（Ｃ６００菌株のhsdR-誘導株）を形質転換するのに用
いる。この分野に精通する者は他のどのような大腸菌
（Escherichia coli）のhsdR-菌株もこの形質転換に使
用できる事を認めるだろう。
ラムのプラスミドｐＯＧ２３２６由来ＤＮＡをBamＨ１
酵素で分解する；その後、２マイクログラムのｐＬＳ１
１のMboＩフラグメントを加える。ｐＯＧ２３２６フラ
グメントおよびｐＬＳ１１フラグメントをＴ４−ＤＮＡ
リガーゼを用いて前に記載した方法で連結する。連結し
たＤＮＡは大腸菌（Escherichia coli）菌株ＣＳ４１２
（Ｃ６００菌株のhsdR-誘導株）を形質転換するのに用
いる。この分野に精通する者は他のどのような大腸菌
（Escherichia coli）のhsdR-菌株もこの形質転換に使
用できる事を認めるだろう。
BamＨ１部位への挿入はテトラサイクリン耐性（tet）遺
伝子を不活性化するので、クローン化したｐＬＳ１１配
列を含むキメラプラスミドを持つ大腸菌（Escherichia
coli）形質転換株はアンピシリン耐性、テトラサイクリ
ン感受性（Ap RTc s）表現型を示す。１００のAp R形質転
換株を試験した；４７％のAp RクローンがｐＯＧ２３２
６からの組換えプラスミドを持つていた。プラスミドＤ
ＮＡは約１００のアンピシリン耐性テトラサイクリン感
受性（Ap RTc s）形質転換株の混合培養で得た。その後プ
ラスミドＤＮＡで枯草菌（Bacillus subtilis）菌株Ｂ
Ｄ２２４（trpＣ２ thr-５ recＥ４）を形質転換す
る。形質転換株は最初Ｃｍ−含有プレート上で選択す
る。この選択に続き、約１０００の選択クローンを抗生
物質を含まない肉汁に接種し、約５０代成長させる。こ
れにより不安定な分配欠除（par-）クローンを分離でき
る。この培養をＣｍ−含有肉汁中で終夜続けpar+クロー
ンを豊富にする。この型の分離−濃厚化処理をさらに２
サイクルを行つた後、８つの個々のクローンを単離し、
par+表現型の試験を行う。それらはすべて１００％安定
であつた。安定性は抗生物質なしの肉汁中１００代の間
形質転換ＢＤ２２４菌株の成長で試験した。各々の培養
からの１００またはそれ以上のコロニーをプレート上で
成長させ、個々にＣｍ耐性の試験を行つた。これらのク
ローンから得た一つのプラスミド（ｐＯＧ２３８１、Ａ
ＴＣＣ番号３９０３８）の特質をさらに明らかにした。
それはｐＯＧ２３２６のBamＨ１部位に約1.2KbのMboＩ
挿入部を含む。ＢＤ２２４へ形質転換してもpar+表現型
を再び示す事はこの表現型はプラスミドの配列上にある
事を示している。
伝子を不活性化するので、クローン化したｐＬＳ１１配
列を含むキメラプラスミドを持つ大腸菌（Escherichia
coli）形質転換株はアンピシリン耐性、テトラサイクリ
ン感受性（Ap RTc s）表現型を示す。１００のAp R形質転
換株を試験した；４７％のAp RクローンがｐＯＧ２３２
６からの組換えプラスミドを持つていた。プラスミドＤ
ＮＡは約１００のアンピシリン耐性テトラサイクリン感
受性（Ap RTc s）形質転換株の混合培養で得た。その後プ
ラスミドＤＮＡで枯草菌（Bacillus subtilis）菌株Ｂ
Ｄ２２４（trpＣ２ thr-５ recＥ４）を形質転換す
る。形質転換株は最初Ｃｍ−含有プレート上で選択す
る。この選択に続き、約１０００の選択クローンを抗生
物質を含まない肉汁に接種し、約５０代成長させる。こ
れにより不安定な分配欠除（par-）クローンを分離でき
る。この培養をＣｍ−含有肉汁中で終夜続けpar+クロー
ンを豊富にする。この型の分離−濃厚化処理をさらに２
サイクルを行つた後、８つの個々のクローンを単離し、
par+表現型の試験を行う。それらはすべて１００％安定
であつた。安定性は抗生物質なしの肉汁中１００代の間
形質転換ＢＤ２２４菌株の成長で試験した。各々の培養
からの１００またはそれ以上のコロニーをプレート上で
成長させ、個々にＣｍ耐性の試験を行つた。これらのク
ローンから得た一つのプラスミド（ｐＯＧ２３８１、Ａ
ＴＣＣ番号３９０３８）の特質をさらに明らかにした。
それはｐＯＧ２３２６のBamＨ１部位に約1.2KbのMboＩ
挿入部を含む。ＢＤ２２４へ形質転換してもpar+表現型
を再び示す事はこの表現型はプラスミドの配列上にある
事を示している。
ｐＯＧ２３８１からの1.2Kb MboＩフラグメント中にpar
+フラグメントが位置している事をさらに明らかにする
ため、プラスミドをｓａｕ３Ａで分解した。Ｓａｕ３Ａ
およびMboＩの両方が同じＤＮＡ配列を認識した： ５′…ＧＡＴＣ…３′ ３′…ＣＴＡＧ…５′。
+フラグメントが位置している事をさらに明らかにする
ため、プラスミドをｓａｕ３Ａで分解した。Ｓａｕ３Ａ
およびMboＩの両方が同じＤＮＡ配列を認識した： ５′…ＧＡＴＣ…３′ ３′…ＣＴＡＧ…５′。
1.2Kb Sau３Ａフラグメントを精製後、ｐＯＧ２３２６
のBamＨ１部位にクローンした。生じる構成物はPar+で
ありまたｐＯＧ２３８１と同じ構造である事を示した。
この事は分配プロフイシエント遺伝子はMboＩまたはＳ
ａｕ３Ａ中に位置している事を示している。このフラグ
メントがグラム陽性分配セグメントを持つている。
のBamＨ１部位にクローンした。生じる構成物はPar+で
ありまたｐＯＧ２３８１と同じ構造である事を示した。
この事は分配プロフイシエント遺伝子はMboＩまたはＳ
ａｕ３Ａ中に位置している事を示している。このフラグ
メントがグラム陽性分配セグメントを持つている。
実施例２：枯草菌（Bacillus subtilis）Par+が大腸菌
（Escherichia coli）中で機能しない事の証明。
（Escherichia coli）中で機能しない事の証明。
大腸菌（Escherichia coli）中大腸菌（Escherichia co
li）プラスミドの安定な保持には分配機構が必要とされ
る事が実証されている。Meacock，Ｐ．およびCohen，
Ｓ．によるCell，２０；５２９−５４２（１９８０）を
参照されたい。いくつかのクローン化した枯草菌（Ba-c
illus subtilis）遺伝子は大腸菌（Escherichia coli）
中で機能するので、クローン化した枯草菌（Bacillus s
ubtilis）Par+プラスミドを実施例１に記載した方法を
用い、大腸菌（Escherichia coli）菌株ＣＳ４１２で試
験した。分配の試験では、ｐＯＧ２３２６およびｐＯＧ
２３８１の両方のプラスミドが大腸菌（Escherichia co
li）中では表現型としてはPar-であつた。１００世代後
（抗生物質なしで肉汁中成長）、試験した１００のクロ
ーン中、AP Rクローンは検出されなかつた。
li）プラスミドの安定な保持には分配機構が必要とされ
る事が実証されている。Meacock，Ｐ．およびCohen，
Ｓ．によるCell，２０；５２９−５４２（１９８０）を
参照されたい。いくつかのクローン化した枯草菌（Ba-c
illus subtilis）遺伝子は大腸菌（Escherichia coli）
中で機能するので、クローン化した枯草菌（Bacillus s
ubtilis）Par+プラスミドを実施例１に記載した方法を
用い、大腸菌（Escherichia coli）菌株ＣＳ４１２で試
験した。分配の試験では、ｐＯＧ２３２６およびｐＯＧ
２３８１の両方のプラスミドが大腸菌（Escherichia co
li）中では表現型としてはPar-であつた。１００世代後
（抗生物質なしで肉汁中成長）、試験した１００のクロ
ーン中、AP Rクローンは検出されなかつた。
実施例３：枯草菌（Bacillus subtilis）プラスミド由
来のグラム陽性菌分配セグメント（Par+）および分泌さ
れる蛋白質産物のための異種遺伝子コーデイングを含む
遺伝子工学的組換えプラスミドの構成。
来のグラム陽性菌分配セグメント（Par+）および分泌さ
れる蛋白質産物のための異種遺伝子コーデイングを含む
遺伝子工学的組換えプラスミドの構成。
グラム陽性菌細菌中グラム陽性分配フラグメントの存在
が蛋白質産物の発現および分泌を妨害するかどうか確め
るため、グラム陽性菌Par+フラグメントおよび枯草菌
（Bacillus subtilis）において発現：分泌される事が
知られてい蛋白質のための異種遺伝子コーデイングの両
方を持つプラスミドを構成した。このように構成された
プラスミドはｐＯＧ２４２８と称する。ｐＯＧ２４２８
を構成するには、まず大腸菌（Escherichia coli）プラ
スミドｐＢＲ３２２（ＡＴＣＣ ３７０１７）および枯
草菌（Bacillus subtilis）プラスミドｐＯＧ１１９６
（ＡＴＣＣ31776）からの配列を持つハイブリツドプラ
スミドを作る。大腸菌（Escherichia coli）プラスミド
ｐＢＲ３２２はSutcliffe，J,G.によりNucleic Ac-ids
Res.５：２７２１−２７２８（１９７８）およびCold S
pring Harbor Symp，Quant.Biol.４３：７７−９０（１
９７９）に記載されている。枯草菌（Bacillus subtili
s）プラスミドｐＯＧ１１９６はGray，Ｏ．およびChan
g，Ｓ．によりＪ．Bacteriol.145：422−428（１９８
１）に記載されている。。プラスミドｐＢＲ３２２およ
びｐＯＧ１１９６は各々PvuＩＩ制限酵素で分解し、連
結後、大腸菌（Escherichia coli）菌株ＣＳ４１２を形
質転換する；クロラムフエニコール耐性形質転換株を選
択する。一つの形質転換株からのプラスミドｐＤＨ５０
６０をさらに利用したｐＤＨ５０６０の制限酵素地図を
第４図に示した。プラスミドフラグメントの分解および
連結、宿主の形質転換およびその選択は組換えＤＮＡの
分野に精通する者にとつては既知の標準的な方法で行
う。本発明を実施するのに利用するこれらおよび他の分
子クローニング技術はManiatis，Ｔ．らによるMoleular
Clining：A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor
Laboratory（１９８２）に記載されている。
が蛋白質産物の発現および分泌を妨害するかどうか確め
るため、グラム陽性菌Par+フラグメントおよび枯草菌
（Bacillus subtilis）において発現：分泌される事が
知られてい蛋白質のための異種遺伝子コーデイングの両
方を持つプラスミドを構成した。このように構成された
プラスミドはｐＯＧ２４２８と称する。ｐＯＧ２４２８
を構成するには、まず大腸菌（Escherichia coli）プラ
スミドｐＢＲ３２２（ＡＴＣＣ ３７０１７）および枯
草菌（Bacillus subtilis）プラスミドｐＯＧ１１９６
（ＡＴＣＣ31776）からの配列を持つハイブリツドプラ
スミドを作る。大腸菌（Escherichia coli）プラスミド
ｐＢＲ３２２はSutcliffe，J,G.によりNucleic Ac-ids
Res.５：２７２１−２７２８（１９７８）およびCold S
pring Harbor Symp，Quant.Biol.４３：７７−９０（１
９７９）に記載されている。枯草菌（Bacillus subtili
s）プラスミドｐＯＧ１１９６はGray，Ｏ．およびChan
g，Ｓ．によりＪ．Bacteriol.145：422−428（１９８
１）に記載されている。。プラスミドｐＢＲ３２２およ
びｐＯＧ１１９６は各々PvuＩＩ制限酵素で分解し、連
結後、大腸菌（Escherichia coli）菌株ＣＳ４１２を形
質転換する；クロラムフエニコール耐性形質転換株を選
択する。一つの形質転換株からのプラスミドｐＤＨ５０
６０をさらに利用したｐＤＨ５０６０の制限酵素地図を
第４図に示した。プラスミドフラグメントの分解および
連結、宿主の形質転換およびその選択は組換えＤＮＡの
分野に精通する者にとつては既知の標準的な方法で行
う。本発明を実施するのに利用するこれらおよび他の分
子クローニング技術はManiatis，Ｔ．らによるMoleular
Clining：A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor
Laboratory（１９８２）に記載されている。
プラスミドｐＤＨ５０６０を制限酵素EcoＲＩおよびBam
ＨＩで分解する。この酵素分解での“大きい方のプラス
ミドフラグメント”はアガロースゲルからManiatis，
Ｔ．ら（上述の文献）により記載された方法で精製す
る。
ＨＩで分解する。この酵素分解での“大きい方のプラス
ミドフラグメント”はアガロースゲルからManiatis，
Ｔ．ら（上述の文献）により記載された方法で精製す
る。
枯草菌（Bacillus subtilis）中で発現および分泌する
事が知られている異種蛋白質のための遺伝子コーデイン
グを提供するため、バチラスリケニホルミス（Bacillus
Licheniformis）penＰ遺伝子を含むEcoＲＩ−BamＩＩ
Ｉ−酵素発現フラグメントをプラスミドｐＳＹＣ３１０
−２から精製する。このプラスミドはMaLaughlin，Ｊ．
らによりNucleic Acids Res.１０：3905−３９１９（１
９８２）に記載されている。この分野に精通する者は他
の源からバチルスリケニホルミス（Bacillus lichenifo
rmis）penＰを得る事ができるだろう。Gray，Ｏ．およ
びChang，Ｓ．Ｊ Bacteriol.１４５：４２２−４２８
（１９８１）を参照されたい。精製したプラスミドｐＤ
Ｈ５０６０由来の“大きなフラグメント”およびプラス
ミドＰＳＹＣ３１０−２由来のバチルスリケンホルミス
（Bacillus licheniformis）penＰ遺伝子を連結し、大
腸菌（Escherichia coli）菌株ＣＳ４１２を形質転換す
る；アンピシリン耐性形質転換株を選択する。ｐＳＹＣ
１８９と称する一つの形質転換株からのプラスミドをさ
らに利用する。
事が知られている異種蛋白質のための遺伝子コーデイン
グを提供するため、バチラスリケニホルミス（Bacillus
Licheniformis）penＰ遺伝子を含むEcoＲＩ−BamＩＩ
Ｉ−酵素発現フラグメントをプラスミドｐＳＹＣ３１０
−２から精製する。このプラスミドはMaLaughlin，Ｊ．
らによりNucleic Acids Res.１０：3905−３９１９（１
９８２）に記載されている。この分野に精通する者は他
の源からバチルスリケニホルミス（Bacillus lichenifo
rmis）penＰを得る事ができるだろう。Gray，Ｏ．およ
びChang，Ｓ．Ｊ Bacteriol.１４５：４２２−４２８
（１９８１）を参照されたい。精製したプラスミドｐＤ
Ｈ５０６０由来の“大きなフラグメント”およびプラス
ミドＰＳＹＣ３１０−２由来のバチルスリケンホルミス
（Bacillus licheniformis）penＰ遺伝子を連結し、大
腸菌（Escherichia coli）菌株ＣＳ４１２を形質転換す
る；アンピシリン耐性形質転換株を選択する。ｐＳＹＣ
１８９と称する一つの形質転換株からのプラスミドをさ
らに利用する。
プラスミドｐＳＹＣ１８９においては、プラスミドｐＢ
Ｒ３２２の保持部分由来のbla遺伝子に小さな欠失があ
る。Sutcliffe，Ｊ．Ｇ．，Cold Spring Harbor Symp，
Quant.Biol.４３：７７−９０（１９７９）を参照され
たい。bla遺伝子の遺伝子産物はベーターラクラマーゼ
蛋白質である。ベーターラクラマーゼ遺伝子中に小さな
欠失を発生させるため、bla遺伝子のPvuＩ部位でプラス
ミドを分解する。生じたPvuＩ分解プラスミドＤＮＡを
この分野に精通する者にとつてよく知られた条件を用い
エンドヌクレアーゼＢＡＬ−３１で処理する。そのよう
な条件はManiatis，Ｔ．らにより上述の文献に記載され
ている。ＢＡＬ−３１処理フラグメントはリガーゼ処理
により再環化する。この分解により野生型のベーターラ
クタマーゼ遺伝子の配列から約１２０塩基対が欠落し、
ｐＳＹＣ２７４と称するプラスミドを生じる。
Ｒ３２２の保持部分由来のbla遺伝子に小さな欠失があ
る。Sutcliffe，Ｊ．Ｇ．，Cold Spring Harbor Symp，
Quant.Biol.４３：７７−９０（１９７９）を参照され
たい。bla遺伝子の遺伝子産物はベーターラクラマーゼ
蛋白質である。ベーターラクラマーゼ遺伝子中に小さな
欠失を発生させるため、bla遺伝子のPvuＩ部位でプラス
ミドを分解する。生じたPvuＩ分解プラスミドＤＮＡを
この分野に精通する者にとつてよく知られた条件を用い
エンドヌクレアーゼＢＡＬ−３１で処理する。そのよう
な条件はManiatis，Ｔ．らにより上述の文献に記載され
ている。ＢＡＬ−３１処理フラグメントはリガーゼ処理
により再環化する。この分解により野生型のベーターラ
クタマーゼ遺伝子の配列から約１２０塩基対が欠落し、
ｐＳＹＣ２７４と称するプラスミドを生じる。
プラスミドｐＳＹＣ２７４中のペニシリナーゼ遺伝子の
３′−末端には認識配列がＴＧＡＴＣＡであるBclＩの
制限部位が存在する。配列にこの制限酵素部位が存在す
る事が発明されたのはNeugebauer，Ｋ．らの報告である
（Nucleic Acids Research９：２５７７−２５８８（１
９８１））。BclＩ部位はペニシリナーゼ遺伝子の末端
のごく近くにある非翻訳領域である。ペニシリナーゼ遺
伝子の末端のBclＩ部位はプラスミドｐＳＹＣ２７４上
のこの酵素にとつて特徴ある部位である。
３′−末端には認識配列がＴＧＡＴＣＡであるBclＩの
制限部位が存在する。配列にこの制限酵素部位が存在す
る事が発明されたのはNeugebauer，Ｋ．らの報告である
（Nucleic Acids Research９：２５７７−２５８８（１
９８１））。BclＩ部位はペニシリナーゼ遺伝子の末端
のごく近くにある非翻訳領域である。ペニシリナーゼ遺
伝子の末端のBclＩ部位はプラスミドｐＳＹＣ２７４上
のこの酵素にとつて特徴ある部位である。
BclＩによる分解で残つたＧＡＴＣ突出末端と、ＤＮＡ
をMboＩで分解した時生じるＧＡＴＣ突出末端を連結す
る。ｐＯＧ２３８１からの1.2Ｋｂ分配フラグメントを
プラスミドをMboＩで分解する事により削る。このよう
にして得られた1.2ＫｂMboＩ分配フラグメントをｐＳＹ
Ｃ２７４のBclＩ部位の中にクローニングする。これら
の２つのプラスミドフラグメントを連結してｐＯＧ２４
２８と称するハイブリツドプラスミドを作製する。この
プラスミドはバチルスリケニホルミス（Bacijjus liche
niformis）由来のペニシリナーゼ遺伝子（これは枯草菌
（Bacill-us subtilis）形質転換株宿主による生成物分
泌のコードである）を含む；このプラスミドはまたグラ
ム陽性菌分配フラグメントを含んでいる。
をMboＩで分解した時生じるＧＡＴＣ突出末端を連結す
る。ｐＯＧ２３８１からの1.2Ｋｂ分配フラグメントを
プラスミドをMboＩで分解する事により削る。このよう
にして得られた1.2ＫｂMboＩ分配フラグメントをｐＳＹ
Ｃ２７４のBclＩ部位の中にクローニングする。これら
の２つのプラスミドフラグメントを連結してｐＯＧ２４
２８と称するハイブリツドプラスミドを作製する。この
プラスミドはバチルスリケニホルミス（Bacijjus liche
niformis）由来のペニシリナーゼ遺伝子（これは枯草菌
（Bacill-us subtilis）形質転換株宿主による生成物分
泌のコードである）を含む；このプラスミドはまたグラ
ム陽性菌分配フラグメントを含んでいる。
実施例４：グラム陽性菌Par+フラグメントの存在が形質
転換枯草菌（Bacillus subtilis）細菌による異種蛋白
質の産生またはその発現または分泌を妨害しない事の証
明。
転換枯草菌（Bacillus subtilis）細菌による異種蛋白
質の産生またはその発現または分泌を妨害しない事の証
明。
GrayおよびChangはクローン化したバチルスリケニホル
ミス（Bacillus licheniformis）からのベーターラクタ
マーゼ遺伝子（以下ペニシリナーゼまたはpenＰとも記
す）は枯草菌（Ba-cillus subtilis）中でも機能して発
現される事を示した。Gray，Ｏ．およびChang，ｓ．，
Ｊ．Bacteriol.１４５：４２２−４２８（１９８１）を
参照されたい。形質転換枯草菌（Bacillus subtilis）
細胞中産生される異種のペニシリナーゼ分子は境界膜を
超えて移送され続いて蛋白分解的な過程でペニシリナー
ゼ外酵素を形成する。
ミス（Bacillus licheniformis）からのベーターラクタ
マーゼ遺伝子（以下ペニシリナーゼまたはpenＰとも記
す）は枯草菌（Ba-cillus subtilis）中でも機能して発
現される事を示した。Gray，Ｏ．およびChang，ｓ．，
Ｊ．Bacteriol.１４５：４２２−４２８（１９８１）を
参照されたい。形質転換枯草菌（Bacillus subtilis）
細胞中産生される異種のペニシリナーゼ分子は境界膜を
超えて移送され続いて蛋白分解的な過程でペニシリナー
ゼ外酵素を形成する。
グラム陽性Par+の存在が形質転換した枯草菌（Bacillus
subtilis）宿主微生物によるバチルスリケニホルミス
（Bacillus licheniformis）ペニシリナーゼの発現また
は分泌を妨害するかどうかを決定するために、プラスミ
ドｐＯＧ２４２８で枯草菌（Bacillus subtilis）菌株
ＢＤ２４４を形質転換した。Ｏ′Callaghan，Ｃらの方
法によりニトロセフイン（色素生成セフアロスポリ８７
／３１２，Glaxo Research Ｌ−imitedより購入）を用
いる分光光度法により溶液中のペニシリナーゼ活性を測
定、その結果は、ｐＯＧ２４２８上にPar+フラグメント
が存在しても観測可能な酵素活性の減少がない事を示し
ている。Ｏ′Callaghan，Ｃ．らによるAntimicrob，Age
nte Chemother １：２８３−２８８（１９７２）を参
照されたい。
subtilis）宿主微生物によるバチルスリケニホルミス
（Bacillus licheniformis）ペニシリナーゼの発現また
は分泌を妨害するかどうかを決定するために、プラスミ
ドｐＯＧ２４２８で枯草菌（Bacillus subtilis）菌株
ＢＤ２４４を形質転換した。Ｏ′Callaghan，Ｃらの方
法によりニトロセフイン（色素生成セフアロスポリ８７
／３１２，Glaxo Research Ｌ−imitedより購入）を用
いる分光光度法により溶液中のペニシリナーゼ活性を測
定、その結果は、ｐＯＧ２４２８上にPar+フラグメント
が存在しても観測可能な酵素活性の減少がない事を示し
ている。Ｏ′Callaghan，Ｃ．らによるAntimicrob，Age
nte Chemother １：２８３−２８８（１９７２）を参
照されたい。
実施例５：グラム陽性菌分配機能が大きな1.2Kb MboＩ
フラグメントに含まれる約３５０塩基対のフラグメント
に位置している事の証明。
フラグメントに含まれる約３５０塩基対のフラグメント
に位置している事の証明。
1.2Kb MboＩフラグメントはHindＩＩＩ制限部位を含ん
でいる。第２図を参照されたい。制限酵素のマツピング
により1.2Kb MboＩフラグメントにおいてHaeＩＩＩ部位
がHindＩＩＩから約３５０塩基はなれて位置している事
が明らかになつた。プラスミドｐＯＧ２３８１の制限酵
素HaeＩＩＩおよびHindＩＩＩによる二重分解はこの３
５０塩基対フラグメントをアガローズゲルにより精製す
る事を可能にした。精製した３５０塩基対フラグメント
に遺伝子工学的に組換えたプラスミド中でクローン化
し、グラム陽性分配機能がこの小さな３５０bpフラグメ
ントに位置しているかどうか決定した。
でいる。第２図を参照されたい。制限酵素のマツピング
により1.2Kb MboＩフラグメントにおいてHaeＩＩＩ部位
がHindＩＩＩから約３５０塩基はなれて位置している事
が明らかになつた。プラスミドｐＯＧ２３８１の制限酵
素HaeＩＩＩおよびHindＩＩＩによる二重分解はこの３
５０塩基対フラグメントをアガローズゲルにより精製す
る事を可能にした。精製した３５０塩基対フラグメント
に遺伝子工学的に組換えたプラスミド中でクローン化
し、グラム陽性分配機能がこの小さな３５０bpフラグメ
ントに位置しているかどうか決定した。
プラスミドｐＤＨ５０６０をHindＩＩＩ酵素処理し、プ
ラスミド上位置している２つのHindＩＩＩ部位のうち１
つだけを部分的に切断するようにする。プラスミドｐＤ
Ｈ５０６０におけるHindＩＩＩ部位の位置は図４に例示
してある。部分的に分解したｐＤＨ５０６０ＤＮＡ標本
はManiatis，Ｔ．らによる前述の文献に記載されている
大腸菌（Escherichia coli）ＤＮＡポリメラーゼＩ Kl
enowフラグメントで処理する。
ラスミド上位置している２つのHindＩＩＩ部位のうち１
つだけを部分的に切断するようにする。プラスミドｐＤ
Ｈ５０６０におけるHindＩＩＩ部位の位置は図４に例示
してある。部分的に分解したｐＤＨ５０６０ＤＮＡ標本
はManiatis，Ｔ．らによる前述の文献に記載されている
大腸菌（Escherichia coli）ＤＮＡポリメラーゼＩ Kl
enowフラグメントで処理する。
HindＩＩＩにより発生した突出末端が大腸菌（Escheric
hia coli）ＤＮＡポリメラーゼＩ Klenowフラグメント
で満たされた後、標準的な方法でそこを連結する。連結
したＤＮＡで大腸菌（Escherichia coli）菌株ＣＳ４１
２受容細胞を形質転換する。形質転換した大腸菌（Esch
erichia coli）の細胞を検索し、２つのHindＩＩＩ部位
の１つを失つたプラスミドを持つクローンを同定する。
このプラスミドをｐＬＰ１２０１と称する。それはテト
ラサイクリン遺伝子中に位置するHindＩＩＩ部位を保持
するが、桿菌レプリコンにあつたHindＩＩＩ部位を消失
している。
hia coli）ＤＮＡポリメラーゼＩ Klenowフラグメント
で満たされた後、標準的な方法でそこを連結する。連結
したＤＮＡで大腸菌（Escherichia coli）菌株ＣＳ４１
２受容細胞を形質転換する。形質転換した大腸菌（Esch
erichia coli）の細胞を検索し、２つのHindＩＩＩ部位
の１つを失つたプラスミドを持つクローンを同定する。
このプラスミドをｐＬＰ１２０１と称する。それはテト
ラサイクリン遺伝子中に位置するHindＩＩＩ部位を保持
するが、桿菌レプリコンにあつたHindＩＩＩ部位を消失
している。
プラスミドｐＬＰ１２０１をHindＩＩＩおよびBamＨＩ
制限酵素で分解する。BamＨＩを始めて使用した。一度B
amＨＩ突出末端を大腸菌（Escherichia coli）ＤＮＡポ
リメラーゼＩ Klenowフラグメントで満たしてから、プ
ラスミドをHindＩＩＩで分解する。前記の方法で得た約
350塩基対の分配フラグメントをこのＤＮＡ標本に加え
る。ＤＮＡ混合物を連結し、その後大腸菌（Escherichi
a coli）菌株ＣＳ４１２受容細胞を形質転換するのに用
いる。形質転換株は単離して審査し、分配フラグメント
が存在しているかどうか、ＤＮＡ構造の分析を行う。修
復したBamＨＩ部位をHaeＩＩＩ部位と連結すると、Bam
ＨＩ部位は再生する。このように最初単純に形質転換株
から調製したプラスミドＤＮＡを分解し、適当なサイズ
のHindＩＩＩからBamＨＩのフラグメントを持つ目的の
形質転換株を同定できる。ｐＳＹＣ７０６と称するプラ
スミドを持つ形質転換株は適当なサイズのHindＩＩＩか
らBamＨＩのフラグメントを持つていると思われる。ｐ
ＳＹＣ７０６の構造を第５図に示した。プラスミドｐＳ
ＹＣ７０６を持つ枯草菌（Bacillus subtilis）菌株２
２４の分配プロフイシエンシーの試験をしたところ、そ
れはプラスミドｐＯＧ２３８１と同じ表現型を持つ事が
示された。プラスミドｐＳＹＣ７０６が潜在する枯草菌
（Bacillus subtilis）細胞ＢＤ２２４は親プラスミド
を持つ枯草菌（Bacillus subtilis）細胞ＢＤ２２４が
行うような自然にプラスミドを失うという事がない。こ
の実験は明らかに1.2KbのMboＩフラグメント中のHindＩ
ＩＩ部位からHaeＩＩＩ部位の間の約３５０塩基対がグ
ラム陽性菌分配プロフイシエンシー機能を含む事を明ら
かに示している。
制限酵素で分解する。BamＨＩを始めて使用した。一度B
amＨＩ突出末端を大腸菌（Escherichia coli）ＤＮＡポ
リメラーゼＩ Klenowフラグメントで満たしてから、プ
ラスミドをHindＩＩＩで分解する。前記の方法で得た約
350塩基対の分配フラグメントをこのＤＮＡ標本に加え
る。ＤＮＡ混合物を連結し、その後大腸菌（Escherichi
a coli）菌株ＣＳ４１２受容細胞を形質転換するのに用
いる。形質転換株は単離して審査し、分配フラグメント
が存在しているかどうか、ＤＮＡ構造の分析を行う。修
復したBamＨＩ部位をHaeＩＩＩ部位と連結すると、Bam
ＨＩ部位は再生する。このように最初単純に形質転換株
から調製したプラスミドＤＮＡを分解し、適当なサイズ
のHindＩＩＩからBamＨＩのフラグメントを持つ目的の
形質転換株を同定できる。ｐＳＹＣ７０６と称するプラ
スミドを持つ形質転換株は適当なサイズのHindＩＩＩか
らBamＨＩのフラグメントを持つていると思われる。ｐ
ＳＹＣ７０６の構造を第５図に示した。プラスミドｐＳ
ＹＣ７０６を持つ枯草菌（Bacillus subtilis）菌株２
２４の分配プロフイシエンシーの試験をしたところ、そ
れはプラスミドｐＯＧ２３８１と同じ表現型を持つ事が
示された。プラスミドｐＳＹＣ７０６が潜在する枯草菌
（Bacillus subtilis）細胞ＢＤ２２４は親プラスミド
を持つ枯草菌（Bacillus subtilis）細胞ＢＤ２２４が
行うような自然にプラスミドを失うという事がない。こ
の実験は明らかに1.2KbのMboＩフラグメント中のHindＩ
ＩＩ部位からHaeＩＩＩ部位の間の約３５０塩基対がグ
ラム陽性菌分配プロフイシエンシー機能を含む事を明ら
かに示している。
実施例６：３５０bp HindＩＩＩ−HaeＩＩＩフラグメン
ト内の約２６０塩基対のフラグメントにグラム陽性菌分
配機能が位置している事。
ト内の約２６０塩基対のフラグメントにグラム陽性菌分
配機能が位置している事。
1.2Kb MboＩグラム陽性菌分配フラグメント中のHindＩ
ＩＩからHaeＩＩＩの間に位置する約３５０塩基対のフ
ラグメントのヌクレオチド配列を決定した。このフラグ
メントの配列を第６図に示した。
ＩＩからHaeＩＩＩの間に位置する約３５０塩基対のフ
ラグメントのヌクレオチド配列を決定した。このフラグ
メントの配列を第６図に示した。
グラム陽性プロフイエンシー機能が1.2Kb MboＩフラグ
メント内のHaeＩＩＩおよびPstＩ間に位置するかどうか
決定するため、プラスミドｐＯＧ２３８１を制限酵素Ha
eＩＩＩおよびPstＩで分解し、約２６０塩基対のフラグ
メントを単離した。２６０塩基対はアガロースゲル上で
精製する。プラスミドｐＤＨ５０６０を制限酵素EcoＲ
Ｉで分解し；５′突出末端はManiatis，Ｔ．らにより前
述の文献に記載されたようにＤＮＡポリメラーゼＩ Kl
enowフラグメントで満たす。標本は更にPstＩ酵素分解
し、２つのフラグメントを生成する。精製した約２６０
塩基対のHaeＩＩＩ−PatＩフラグメントに当モル比の前
に記載した標本に加える。その後分解したｐＤＨ５０６
０フラグメントを連結する。連結したＤＮＡは大腸菌
（Escherichia coli）菌株ＣＳ４１２を形質転換するの
に使用する。テトラサイクリン耐性、アンピシリン感受
性形質転換株の特質をさらに明らかにする。それはｐＤ
Ｈ５０６０上の小さなEcoＲＩからPatＩのフラグメント
のかわりにクローン化した２６０塩基対のグラム陽性菌
Par+フラグメントを含むｐＳＹＣ７３０と称するプラス
ミドを持つている。プラスミドｐＳＹＣ７３０で枯草菌
（Bcillus subtilis）菌株ＢＤ２２４を形質転換し、分
配プロフイシエンシーを試験する。分配プロフイシエン
シー試験の結果、クロラムフエニコールなしで肉汁中２
０世代の成長の後、枯草菌（Bacillus subtilis）菌株
ＢＤ２２４が担持しているプラスミドｐＤＨ５０６０は
不安定である事が明らかとなつた。Par+プラスミドｐSY
C７３０を担持している同じ菌株ＢＤ２２４は安定であ
つた。このようにグラム陽性菌Par+プロフイエンシーは
第６図に示したようにHaeＩＩＩとPstＩの部位にある約
２６０塩基対領域内に位置すると結論された。
メント内のHaeＩＩＩおよびPstＩ間に位置するかどうか
決定するため、プラスミドｐＯＧ２３８１を制限酵素Ha
eＩＩＩおよびPstＩで分解し、約２６０塩基対のフラグ
メントを単離した。２６０塩基対はアガロースゲル上で
精製する。プラスミドｐＤＨ５０６０を制限酵素EcoＲ
Ｉで分解し；５′突出末端はManiatis，Ｔ．らにより前
述の文献に記載されたようにＤＮＡポリメラーゼＩ Kl
enowフラグメントで満たす。標本は更にPstＩ酵素分解
し、２つのフラグメントを生成する。精製した約２６０
塩基対のHaeＩＩＩ−PatＩフラグメントに当モル比の前
に記載した標本に加える。その後分解したｐＤＨ５０６
０フラグメントを連結する。連結したＤＮＡは大腸菌
（Escherichia coli）菌株ＣＳ４１２を形質転換するの
に使用する。テトラサイクリン耐性、アンピシリン感受
性形質転換株の特質をさらに明らかにする。それはｐＤ
Ｈ５０６０上の小さなEcoＲＩからPatＩのフラグメント
のかわりにクローン化した２６０塩基対のグラム陽性菌
Par+フラグメントを含むｐＳＹＣ７３０と称するプラス
ミドを持つている。プラスミドｐＳＹＣ７３０で枯草菌
（Bcillus subtilis）菌株ＢＤ２２４を形質転換し、分
配プロフイシエンシーを試験する。分配プロフイシエン
シー試験の結果、クロラムフエニコールなしで肉汁中２
０世代の成長の後、枯草菌（Bacillus subtilis）菌株
ＢＤ２２４が担持しているプラスミドｐＤＨ５０６０は
不安定である事が明らかとなつた。Par+プラスミドｐSY
C７３０を担持している同じ菌株ＢＤ２２４は安定であ
つた。このようにグラム陽性菌Par+プロフイエンシーは
第６図に示したようにHaeＩＩＩとPstＩの部位にある約
２６０塩基対領域内に位置すると結論された。
実施例７：グラム陽性菌Par+プロフイシエンシー機能の
ＤＮＡ配列。
ＤＮＡ配列。
分配機能のあるｐＳＹＣ７０６のＤＮＡ配列をGilber
t，Ｗ．およびMaxam，Ａ．らにより発展した方法を用い
て決定した（Methods inEnzymology６５：４９９−５６
０，Grossman，Ｌ．およびMoldave，Ｋ，Ｊ．編集、Aca
demic Press，１９８０年）。第６図はこのＤＮＡのヌ
クレオチド配列を示している。６０から７０の位置のま
わりの領域にある程度のあいまいさがあるがそれはそこ
に隣接したＧＣに富む領域（２０から６５の位置の間に
存在）の存在により多分起こされる圧力のせいであろ
う。しかしながら、配列分析により予想されるこのフラ
グメントの多くの制限酵素部位は、実際の酵素分解でも
また発見される。
t，Ｗ．およびMaxam，Ａ．らにより発展した方法を用い
て決定した（Methods inEnzymology６５：４９９−５６
０，Grossman，Ｌ．およびMoldave，Ｋ，Ｊ．編集、Aca
demic Press，１９８０年）。第６図はこのＤＮＡのヌ
クレオチド配列を示している。６０から７０の位置のま
わりの領域にある程度のあいまいさがあるがそれはそこ
に隣接したＧＣに富む領域（２０から６５の位置の間に
存在）の存在により多分起こされる圧力のせいであろ
う。しかしながら、配列分析により予想されるこのフラ
グメントの多くの制限酵素部位は、実際の酵素分解でも
また発見される。
実施例８：本発明によるグラム陽性菌Par+組換えプラス
ミドはグラム陽性菌recE+形質転換株宿主中改良された
安定性を示す。
ミドはグラム陽性菌recE+形質転換株宿主中改良された
安定性を示す。
前の実施例において本発明によるグラム陽性菌Par+組換
えプラスミドは枯草菌（Bacillus subtilis）のrecE-菌
株（ＢＤ２２４）に導入した時改良された安定性を示し
た。ここで用いた改良された安定性とは、グラム陽性Pa
r+フラグメントと組換えたプラスミドがグラム陽性Par+
フラグメントを含まない同一のプラスミドに比べより安
定であるという意味で用いる。
えプラスミドは枯草菌（Bacillus subtilis）のrecE-菌
株（ＢＤ２２４）に導入した時改良された安定性を示し
た。ここで用いた改良された安定性とは、グラム陽性Pa
r+フラグメントと組換えたプラスミドがグラム陽性Par+
フラグメントを含まない同一のプラスミドに比べより安
定であるという意味で用いる。
Par+プラスミドが枯草菌（Bacillus subtilis）のrecE-
菌株中で改良された安定性を示すかどうかを決定するた
め、グラム陽性Par+組換えプラスミドを枯草菌（Bacill
us subtilis）のrecE+菌株を形質転換するのに用いた。
recE+である事を除いて枯草菌（Bacillus subtilis）菌
株ＢＤ１７０は菌株ＢＤ２２４と同一である。
菌株中で改良された安定性を示すかどうかを決定するた
め、グラム陽性Par+組換えプラスミドを枯草菌（Bacill
us subtilis）のrecE+菌株を形質転換するのに用いた。
recE+である事を除いて枯草菌（Bacillus subtilis）菌
株ＢＤ１７０は菌株ＢＤ２２４と同一である。
枯草菌（Bacillus subtilis）菌株ＢＤ１７０をプラス
ミドｐＯＧ２３８１で形質転換した場合９９％安定であ
つた（即ち１５世代後形質転換株宿主細胞の９９％にｐ
ＯＧ２３８１が存在）。菌株ＢＤ１７０をｐＯＧ２４２
８で形質転換した場合、１５世代後１００％安定であつ
た。形質転換技術は前の実施例に記載したものと同一で
ある。
ミドｐＯＧ２３８１で形質転換した場合９９％安定であ
つた（即ち１５世代後形質転換株宿主細胞の９９％にｐ
ＯＧ２３８１が存在）。菌株ＢＤ１７０をｐＯＧ２４２
８で形質転換した場合、１５世代後１００％安定であつ
た。形質転換技術は前の実施例に記載したものと同一で
ある。
実施例９：本発明によるグラム陽性菌Par+フラグメント
は方向付け依存性を示す。
は方向付け依存性を示す。
本発明による分配フラグメントは組換えプラスミドへ２
つの可能な方向付けで挿入する事ができる。ただ１つの
方向付けが分配表現型を示す。Par+フラグメントの方向
付け依存性の理由は不明確である。
つの可能な方向付けで挿入する事ができる。ただ１つの
方向付けが分配表現型を示す。Par+フラグメントの方向
付け依存性の理由は不明確である。
グラム陽性菌宿主細胞集団中で、特に、成長しているグ
ラム陽性菌宿主細胞集団中でのプラスミドの安定性を促
進させるような分配セグメントを含む遺伝子工学的組換
えプラスミドの生産のために有益な組成物および方法を
本発明は提供しているように思われる。本発明はPar+−
遺伝子工学的組換えプラスミド同様（遺伝子工学的組換
えプラスミドはグラム陽性菌分配セグメントを含む）、
Par+フラグメントを提供する。さらに遺伝子工学的に組
換えたグラム陽性菌Par+プラスミドを提供しそれはその
ようなPar+分配フラグメントを含まない同一のプラスミ
ドより実質的により分配が安定である。さらに、遺伝子
工学的なPar+一組換えプラスミドで形質転換したグラム
陽性菌を提供する。遺伝子工学的なPar+一組換えプラス
ミドおよびそれで形質転換した微生物は蛋白質産物のた
め長期間の成長または発酵（即ち連続発酵過程）の工学
的応用に特に有用である。
ラム陽性菌宿主細胞集団中でのプラスミドの安定性を促
進させるような分配セグメントを含む遺伝子工学的組換
えプラスミドの生産のために有益な組成物および方法を
本発明は提供しているように思われる。本発明はPar+−
遺伝子工学的組換えプラスミド同様（遺伝子工学的組換
えプラスミドはグラム陽性菌分配セグメントを含む）、
Par+フラグメントを提供する。さらに遺伝子工学的に組
換えたグラム陽性菌Par+プラスミドを提供しそれはその
ようなPar+分配フラグメントを含まない同一のプラスミ
ドより実質的により分配が安定である。さらに、遺伝子
工学的なPar+一組換えプラスミドで形質転換したグラム
陽性菌を提供する。遺伝子工学的なPar+一組換えプラス
ミドおよびそれで形質転換した微生物は蛋白質産物のた
め長期間の成長または発酵（即ち連続発酵過程）の工学
的応用に特に有用である。
この分野に精通する者にとつては以上の記述からここに
記載し示した事に加え、本発明の種々の変法が明らかに
なるだろう。そのような変法は付随する特許請求の範囲
内にあるつもりである。
記載し示した事に加え、本発明の種々の変法が明らかに
なるだろう。そのような変法は付随する特許請求の範囲
内にあるつもりである。
第１図はプラスミドｐＯＧ２３２６の構成方法と関連す
るプラスミドの制限酵素地図であり； 第２図はプラスミドｐＯＧ２３８１の制限酵素地図であ
り； 第３図は抗生物質クロラムフエニコール不存在下で成長
する枯草菌（Bacillus subtilis）菌株ＢＤ２２４に導
入したプラスミドｐＯＧ２３８１およびｐＯＧ２３２６
の分配プロフイシエンシーのグラフであつて、グラフ中
ｏ印はｐＯＧ２３８１であり、●印はｐＯＧ２３２６で
あり； 第４図はプラスミドｐＯＧ５０６０の構成方法とその制
限酵素地図であり； 第５図はプラスミドｐＳＹＣ７０６の制限酵素地図であ
り； 第６図は、1.2KbMboＩグラム陽性菌分配フラグメント中
に含まれる約３５０塩基対からなるHaeＩＩＩからHind
ＩＩＩまでのＤＮＡフラグメントのヌクレオチドの塩基
配列であり； 第７図は1.2KbMboＩグラム陽性菌分配フラグメント中に
含まれる約３５０塩基対からなるHaeＩＩＩからHindＩ
ＩＩまでのフラグメントの制限酵素地図である。
るプラスミドの制限酵素地図であり； 第２図はプラスミドｐＯＧ２３８１の制限酵素地図であ
り； 第３図は抗生物質クロラムフエニコール不存在下で成長
する枯草菌（Bacillus subtilis）菌株ＢＤ２２４に導
入したプラスミドｐＯＧ２３８１およびｐＯＧ２３２６
の分配プロフイシエンシーのグラフであつて、グラフ中
ｏ印はｐＯＧ２３８１であり、●印はｐＯＧ２３２６で
あり； 第４図はプラスミドｐＯＧ５０６０の構成方法とその制
限酵素地図であり； 第５図はプラスミドｐＳＹＣ７０６の制限酵素地図であ
り； 第６図は、1.2KbMboＩグラム陽性菌分配フラグメント中
に含まれる約３５０塩基対からなるHaeＩＩＩからHind
ＩＩＩまでのＤＮＡフラグメントのヌクレオチドの塩基
配列であり； 第７図は1.2KbMboＩグラム陽性菌分配フラグメント中に
含まれる約３５０塩基対からなるHaeＩＩＩからHindＩ
ＩＩまでのフラグメントの制限酵素地図である。
Claims (1)
- 【請求項１】下記ＤＮＡ配列： のＨａｅＩＩＩ−ＰｓｔＩフラグメントに含まれている
グラム陽性菌分配セグメントからなるＤＮＡフラグメン
ト。
Applications Claiming Priority (4)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US38425382A | 1982-06-02 | 1982-06-02 | |
| US384253 | 1982-06-02 | ||
| US47057683A | 1983-02-28 | 1983-02-28 | |
| US470576 | 1983-02-28 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS592690A JPS592690A (ja) | 1984-01-09 |
| JPH0634719B2 true JPH0634719B2 (ja) | 1994-05-11 |
Family
ID=27010534
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP58098732A Expired - Lifetime JPH0634719B2 (ja) | 1982-06-02 | 1983-06-02 | Ｄｎａフラグメント |
Country Status (5)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP0095947B1 (ja) |
| JP (1) | JPH0634719B2 (ja) |
| CA (1) | CA1201669A (ja) |
| DE (1) | DE3378588D1 (ja) |
| DK (1) | DK242883A (ja) |
Families Citing this family (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DK410783D0 (da) * | 1982-09-16 | 1983-09-09 | Benzon A Salfred | Fremgangsmade til stabilisering af plasmider |
| ES8705033A1 (es) * | 1984-12-04 | 1987-04-16 | Biotech Australia Pty Ltd | Un metodo para preparar una vacuna para uso en el tratamiento prevencion de diarrea porcina neonatol. |
| DK275685D0 (da) * | 1985-06-18 | 1985-06-18 | Benzon As Alfred | Stabilisering af biologiske systemer |
| JP2707446B2 (ja) * | 1988-01-14 | 1998-01-28 | 出光興産 株式会社 | スチレン系重合体繊維状成形品 |
| JPH0723432B2 (ja) * | 1986-09-30 | 1995-03-15 | 株式会社新素材総合研究所 | 多孔質フイルム |
-
1983
- 1983-05-30 DK DK242883A patent/DK242883A/da not_active Application Discontinuation
- 1983-06-02 CA CA000429548A patent/CA1201669A/en not_active Expired
- 1983-06-02 DE DE8383303195T patent/DE3378588D1/de not_active Expired
- 1983-06-02 JP JP58098732A patent/JPH0634719B2/ja not_active Expired - Lifetime
- 1983-06-02 EP EP83303195A patent/EP0095947B1/en not_active Expired
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| EP0095947A2 (en) | 1983-12-07 |
| DK242883D0 (da) | 1983-05-30 |
| EP0095947B1 (en) | 1988-11-30 |
| DE3378588D1 (en) | 1989-01-05 |
| EP0095947A3 (en) | 1984-05-09 |
| CA1201669A (en) | 1986-03-11 |
| JPS592690A (ja) | 1984-01-09 |
| DK242883A (da) | 1983-12-03 |
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