JPH0638767A - 糖転移酵素遺伝子 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【目的】 β−Ｄ−マンノシドβ１−４−Ｎ−アセチル
グルコサミニルトランスフェラーゼIII の遺伝子を特定
し、その遺伝子工学的製造方法を提供する。 【構成】 図面の図１で表される制限酵素地図を有し、
その長さが約１．８kbである糖転移酵素遺伝子。この遺
伝子を含有させた組換体プラスミドを導入させた形質転
換体を培養し、培養物から該酵素を採取する糖転移酵素
の製造方法。 【効果】 該遺伝子及び酵素は、生化学、診断等の分野
で有用である。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、糖転移酵素遺伝子及び
糖質工学の分野において有用な該酵素の製造方法に関す
る。

【０００２】

【従来の技術】糖転移酵素の一種として、ラット由来の
ＵＤＰ−Ｎ−アセチルグルコサミン：β−Ｄ−マンノシ
ドβ１−４Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラ
ーゼIII （ＥＣ 2. 4. 1. １４４：以下ＧｎＴ−III と
略す）が知られている。ＧｎＴ−III は、アスパラギン
結合型糖鎖のβ１−４結合したマンノース残基（Ｍａ
ｎ）に、ＵＤＰ−Ｎ−アセチルグルコサミン（GlcNAc）
中のGlcNAcを転移する酵素としてナラシムハンによって
報告された〔ナラシムハン，Ｓ．( Narasimhan,
Ｓ．）、ジャーナル オブ バイオロジカル ケミスト
リー（Ｊ．Biol.Chem.)、第２５７巻、第１０２３５〜
１０２４２頁（１９８２）〕。ＧｎＴ−III によって転
移されたGlcNAcはバイセクティングGlcNAcと称され、各
種の糖タンパク質の糖鎖に見出されている。また、ラッ
ト肝のガン化に伴ってＧｎＴ−IIIの活性が上昇するこ
ともナラシムハンら〔ナラシムハン，Ｓ．ら ジャーナ
ルオブ バイオロジカル ケミストリー、第２６３巻、
第１２７３〜１２８２頁（１９８８）〕、パスカルら
〔 Pascale, Ｒ．ら カルシノゲネシス( Carcinogenes
is )、第１０巻、第９６１〜９６４頁（１９８９）〕に
よって報告されている。他にノビコフ( Novikoff )腹水
ガンや肝ガンの患者血清中でＧｎＴ−III の活性の上昇
が知られている。

【０００３】

【発明が解決しようとする課題】上述の様に、ＧｎＴ−
III は生体内で重要な役割を持ち、また、ガン化と関連
して活性が上昇するといったガン診断においても有用な
酵素であるにもかかわらず、ＧｎＴ−III に関する報告
はその活性の測定にとどまり、ＧｎＴ−III が生体より
単離されたという報告は無い。本発明の目的は、ＧｎＴ
−III の性質を明らかにし、その遺伝子を特定し、Ｇｎ
Ｔ−III の遺伝子工学的製造方法を提供することにあ
る。

【０００４】

【課題を解決するための手段】本発明を概説すれば、本
発明の第１の発明は糖転移酵素遺伝子に関し、図面の図
１で表される制限酵素地図を有し、その長さが約１．８
kbであることを特徴とする。また、本発明の第２の発明
は糖転移酵素の製造方法に関し、第１の発明の糖転移酵
素遺伝子を含有させた組換体プラスミドを導入させた形
質転換体を培養し、該培養物から糖転移酵素を採取する
ことを特徴とする。

【０００５】本発明者らは、ラット腎臓ホモジネート中
より、種々の精製方法を用い、ＧｎＴ−III を単離する
ことに成功し、次いで、該ＧｎＴ−III のアミノ酸分析
を行い、その部分アミノ酸配列を決定した。次にそのア
ミノ酸配列より、ＰＣＲ用のプライマーを調製し、ラッ
ト腎臓ｃＤＮＡを鋳型としＰＣＲを行い、ＧｎＴ−III
をコードする遺伝子を増幅し、プローブを作成した。続
いて、該プローブを用いて、ラット腎臓のｃＤＮＡライ
ブラリー中より、ＧｎＴ−III をコードする遺伝子を含
有するクローン体を検索し、ＧｎＴ−III をコードする
遺伝子の単離及び該遺伝子を用いたＧｎＴ−III の発現
に成功し、本発明を完成させた。

【０００６】以下、本発明を詳細に説明する。ＧｎＴ−
III は例えばラット腎臓より、表１に示す工程により精
製することができる。

【０００７】

【表１】 表 １ ──────────────────────────────────── 工 程 比活性 n mol／mg／ｈ ──────────────────────────────────── １．ホモジネート ２．１６ ２．トリトン抽出 ８．９４ ３．ＱＡＥ−セファロース ４２．１ ４．ヒドロキシアパタイト ７４．６ ５．Ｃｕ²⁺−キレーティングセファロース ２４８ ６．ＣｏｎＡセファロース ５７８ ７．Ｃｕ²⁺−キレーティングセファロース ８２０ ８．ＵＤＰ−ヘキサノールアミンアガロース ７，２３０ ９．Ｇｎ，Ｇｎ−ｂｉ−Ａｓｎセファロース ３３１，０００ ────────────────────────────────────

【０００８】〔表中Ｇｎ，Ｇｎ−ｂｉ−ＡｓｎはGlcNAc
β1-２Man α1-６( GlcNAcβ1-２Manα1-３)Manβ1-４G
lcNAcβ1-４GlcNAc-Asnの略である。ＧｎＴ−III 活性
はビオキミカ エ ビオフィジカ アクタ( Biochimica
et Biophysica Acta ) 第１０３５巻、第３１３〜３１
８頁（１９９０）に記載の方法に準じ、８０μＭの蛍光
基質を用いて測定し、酵素の比活性は、転移された Glc
NAc(mol)／タンパク量(mg)／時間（ｈ）で表し、２−ピ
リジルアミノ化GlcNAcを標準物質として使用した。タン
パク質は血清アルブミンを標準物質として、ＢＣＡキッ
ト（ピアス社製）を用いて測定した〕

【０００９】精製ＧｎＴ−III はポリアクリルアミドゲ
ル電気泳動で単一バンドを示し、この精製ＧｎＴ−III
を用い、アミノ酸配列の解析を行う。精製ＧｎＴ−III
をプロテアーゼ、例えばトリプシンを用い限定分解を行
い、次に分解物のアミノ酸配列を解析することにより、
配列表の配列番号１〜４で表されるＧｎＴ−III の部分
アミノ酸配列が決定される。配列番号１で表されるポリ
ペプチドはＴ−７、配列番号２で表されるポリペプチド
はＴ−８、配列番号３で表される配列をＣ末端に有する
ポリペプチドはＴ−１３、配列番号４で表されるポリペ
プチドはＴ−２０と命名され、次に各配列より、ＰＣＲ
用のミックスプライマーを作成することができる。例え
ばＴ−７より、配列表の配列番号５で表されるミックス
プライマーＳ１、及び配列番号６で表されるミックスプ
ライマーＡ１、Ｔ−８より、配列番号７で表されるミッ
クスプライマーＳ２、及び配列番号８で表されるミック
スプライマーＡ２、Ｔ−２０より、配列番号９で表され
るミックスプライマーＳ３、及び配列番号１０で表され
るミックスプライマーＡ３がそれぞれＤＮＡ合成機で合
成され、精製後ＧｎＴ−III 遺伝子の検索に使用するこ
とができる。例えば、ラット腎臓よりＲＮＡを調製し、
次にオリゴ（ｄＴ）−セルロース（ファルマシア社製）
カラムを用いてポリ（Ａ）⁺ ＲＮＡの精製を行い、次に
例えば該ポリ（Ａ）⁺ ＲＮＡ５μｇとオリゴ（ｄＴ）プ
ライマーを用い、ｃＤＮＡシステムプラス（アマーシャ
ム社製）を使用し作成したｃＤＮＡを鋳型とし、前述の
ミックスプライマーを組合せ、ＰＣＲを行うことによ
り、ＧｎＴ−III をコードするｃＤＮＡを増幅すること
ができる。例えばＳ２とＡ１を使用し、９４℃（１
分）、５０℃（２分）、７２℃（３分間）を１サイクル
として４０サイクル行うことにより、約１６０bpのＤＮ
Ａ断片が増幅され、同様にＳ３とＡ１を使用し、約６３
０bpのＤＮＡ断片、Ｓ３とＡ２を使用し、約４９０bpの
ＤＮＡ断片が増幅される。各増幅断片にはミックスプラ
イマー由来のHind III、EcoRＩ認識配列が付加されてお
り、増幅ＤＮＡ断片はHind III、EcoRＩで処理後、プラ
スミド、例えばプラスミドｐＵＣ１９にサブクローニン
グすることができる。

【００１０】次に、例えばこれらの増幅ＤＮＡをプロー
ブとし、ラット腎臓より調製したｃＤＮＡライブラリー
より、ＧｎＴ−III をコードする遺伝子を組込んだクロ
ーン体を検索することができる。ｃＤＮＡライブラリー
は、例えば前述のラット腎臓ｃＤＮＡよりｃＤＮＡクロ
ーニングシステムλｇｔ１０（アマーシャム社製）を用
いて調製できる。前述のＳ３とＡ２で増幅されたＤＮＡ
をプローブとし、プラークハイブリダイゼーションを行
うことにより、例えば２．５×１０⁶ のプラークより、
４個の陽性クローンが得られ、これらのクローンはEcoR
Ｉ分解後、例えばブルースクリプト( Bluescript )II
ＫＳ（ストラタジーン社製）にサブクローニングされ
る。

【００１１】サブクローニングされた４種のＤＮＡ（Ｃ
１、Ｃ２、Ｃ３、Ｃ４）の制限酵素分析による関係を図
２に示す。次に、これらのＤＮＡを発現用プラスミドに
組込み、発現用細胞を形質転換し、ＧｎＴ−III の発現
性の有無を検討することにより、ＧｎＴ−III 産生細胞
を得ることができる。発現用細胞としては例えばＣＯＳ
−１細胞、HeLa細胞を使用することができ、例えば、真
核細胞での発現用ベクターpSVK３（ファルマシア社製）
にＣ１〜Ｃ４をそれぞれ組込み調製したプラスミドで、
これらの細胞を形質転換すれば良い。形質転換体を培養
し、転換体中に発現されたＧｎＴ−III 活性を測定する
ことによりＧｎＴ−III をコードする遺伝子が特定され
る。該遺伝子はＣ４であり、その制限酵素地図を図１に
示す。

【００１２】Ｃ４を組込んだpSVK３はＳＶ３と命名さ
れ、ＳＶ３で形質転換された大腸菌ＸＬ１−Blue（スト
ラタジーン社製）は Escherichia coli ＸＬ１− Blue
SV３と命名、表示され工業技術院微生物工業技術研究所
に微工研菌寄第１２７１８号（ＦＥＲＭ Ｐ−１２７１
８）として寄託されており、該微生物よりＳＶ３を調製
し、ＧｎＴ−III の発現に使用することができる。

【００１３】以上、詳細に説明した様に、本発明により
糖転移酵素・ＧｎＴ−III の遺伝子が単離され、該遺伝
子を用いたＧｎＴ−III の製法が提供される。該遺伝子
及びその分解物は、ＧｎＴ−III の生体中での発現過程
の測定に使用することもでき、ガン診断等の遺伝子診断
においても有用である。また、本発明遺伝子のコードす
るポリペプチドを用いて、種々の抗体を免疫学的に作製
することもでき、これらの抗体も、診断の分野や、Ｇｎ
Ｔ−III の精製等に有用である。

【００１４】

【実施例】以下に本発明の実施例を挙げるが、本発明
は、これら実施例に限定されるものではない。

【００１５】実施例１ （ＧｎＴ−III の精製） 工程１：ラット（ドンリューラット、雄）の腎臓２．２
kgを４倍容積の０．２５Ｍショ糖、１mMベンザミジン塩
酸塩、２０μＭ ４−（アミジノフェニル）メタンスル
ホニルフルオライド（ＡＰＭＳＦ）を含む１０mMトリス
−塩酸バッファー( ｐＨ７．４）の中でポリトロン ホ
モジナイザー（ブリンクマン インスツルーメンツ社
製）を用いたホモジナイズした。なお各工程の操作は０
〜４℃の低温下で行った。

【００１６】工程２：工程１で得たホモジナイズ溶液を
９００×ｇで１０分間遠心し、その上澄を１０５，００
０×ｇで６０分間遠心した。沈殿を４倍容積の０．２５
Ｍショ糖、１mMベンザミジン塩酸塩、２０μＭ ＡＰＭ
ＳＦ、１％トリトンＸ１００（ｗ／ｖ）を含む１０mMト
リス−塩酸バッファー( ｐＨ７．４）に懸濁させ、再度
ホモジナイズした。懸濁液を１時間ゆるやかにかくはん
し、１０５，０００×ｇにて１時間遠心分離を行い、ト
リトン抽出液を得た。沈殿に上記と同様の操作を３回繰
返し、計４回分のトリトン抽出液を得た。

【００１７】工程３：工程２で得たトリトン抽出液をＱ
ＡＥ−セファロースカラム（５×４６cm）に供した。カ
ラムは、あらかじめ１mMベンザミジン塩酸塩、２０μＭ
ＡＰＭＳＦ、０．１％トリトンＸ１００を含む２０mM
リン酸バッファー( ｐＨ７．４）で平衡化を行ってお
き、トリトン抽出液を供した。次に同一のバッファーを
流し、カラムからタンパク質の流出が見られなくなるま
で洗った。ＧｎＴ−III の溶出は、塩化ナトリウムの濃
度グラジエント（０〜０．５Ｍ）を用いて行い、ＧｎＴ
−III の活性画分を分画した。なおＧｎＴ−III 活性測
定は、前出の文献記載の様に、８０μＭのピリジルアミ
ノ（ＰＡ）化Ｇｎ，Ｇｎ−ｂｉ〔GlcNAcβ1-２Man α1-
６( GlcNAcβ1-２Man α1-３)Manβ1-４GlcNAcβ1-４Gl
cNAc-PA 〕を受容体とし、１０mM ＭｎＣｌ₂ 、２００
mM GlcNAc、０．５％（ｖ／ｖ）トリトンＸ１００を含
む１２５mM ２−（Ｎ−モルホリノ）エタンスルホン酸
バッファー（ＭＥＳバッファー，ｐＨ６．２５）溶液
に、最終濃度８０μＭになるように糖供与体であるＵＤ
Ｐ−GlcNAcを加え、３７℃１時間反応を行った後、ＨＰ
ＬＣにて分析し、ＧｎＴ−III の活性を測定した。

【００１８】工程４：工程３で集めたＧｎＴ−III を含
むフラクションを、０．１％トリトンＸ１００を含む２
００mMリン酸バッファーを用いて、イオン強度とｐＨを
調製した後、０．１％トリトンＸ１００を含む５０mMリ
ン酸バッファー( ｐＨ６．８）で平衡化したヒドロキシ
アパタイトカラム（１４×１３cm）に供し、ＧｎＴ−II
I はこのカラムに吸着しないため、素通り画分をＧｎＴ
−III 画分として集めた。

【００１９】工程５：工程４で得た画分を０．５Ｍ塩化
ナトリウム、０．０５％トリトンＸ１００を含む２０mM
トリス−塩酸バッファー( ｐＨ８．０）で平衡化したＣ
ｕ²⁺−キレーティング セファロースカラム（５×１５
cm）に供し、同一のバッファーでタンパク質の溶出が見
られなくなるまで洗った。次に０〜０．１Ｍのグリシン
の濃度グラジエントを用いてＧｎＴ−III を溶出し、活
性画分をＹＭ３０膜を装着したアミコン ダイアフロー
ウルトラフィルトレーターを用いて３０mlに濃縮し
た。

【００２０】工程６：工程５で得た濃縮液に０．３Ｍ塩
化ナトリウムを含む５０mMトリス−塩酸バッファー( ｐ
Ｈ７．４）を２７０ml加え、トリトンＸ１００の濃度を
下げた後、０．３Ｍ塩化ナトリウムを含む５０mMトリス
−塩酸バッファー( ｐＨ７．４）で平衡化した ConＡセ
ファロースカラム（５×５cm）に供した。平衡化に用い
たと同じバッファーで、タンパク質の溶出が検出されな
くなるまでカラムを洗い、次にメチル−α−Ｄ−マンノ
シドを０．５Ｍ含む同一のバッファーで溶出し、ＧｎＴ
−III 活性の画分を集めた。

【００２１】工程７：工程６で得たＧｎＴ−III 画分を
工程５と同様の条件にてＣｕ²⁺−キレーティング セフ
ァロースカラム（２．５×１６cm）に供し、グリシンを
含むバッファーで溶出し、ＧｎＴ−III の活性画分を集
めた。

【００２２】工程８：工程７で得た画分を１５mlに濃縮
した。方法は工程５に準じて行った。そのうち３mlを、
１０mM ＭｎＣｌ₂ 、２０％グリセロール、０．０５％
トリトンＸ１００を含む２０mM ＭＥＳバッファー( ｐ
Ｈ６．３）で平衡化したＵＤＰ−ヘキサノールアミン
アガロースカラム（１．５×５．５cm）に供した。Ｇｎ
Ｔ−III は吸着しないため、素通り画分を集めた。更
に、この操作を４回繰返し、全素通り画分を濃縮し、４
mlにした。

【００２３】工程９：工程８で集めた画分に８０μｌの
５０mM ＵＤＰ−Ｇｌｃを添加後、そのうち１mlを、１
０mM ＭｎＣｌ₂ 、０．０５％トリトンＸ１００、２０
％クリセロール１mM、ＵＤＰ−Ｇｌｃを含む２０mM Ｍ
ＥＳバッファー( ｐＨ６．３）で平衡化したＧｎ，Ｇｎ
−ｂｉ−Ａｓｎセファロースカラム（１×１０cm）に供
した。

【００２４】なお、Ｇｎ，Ｇｎ−ｂｉ−Ａｓｎセファロ
ースは、ヒト・トランスフェリンをプロナーゼ（ベーリ
ンガーマンハイム社製）消化し、ゲルろ過を用いてＡｓ
ｎ結合糖鎖を調製した後、該糖鎖をシアリダーゼ（アル
スロバクター ウレアファシーンス由来：ナカライテス
ク社製）、β−ガラクトシダーゼ（ジャックビーン由
来：生化学工業社製）で分解し、Ｇｎ，Ｇｎ−ｂｉ−Ａ
ｓｎを調製し、次に該調製物を活性化したＣＨ−セファ
ロース（ファルマシア社製）に結合し、作成した。

【００２５】ＧｎＴ−III の全活性のうちの１／５量は
カラムに吸着せず素通りした。平衡化に用いたバッファ
ーからＭｎＣｌ₂ とＵＤＰ−Ｇｌｃを含まない溶出用バ
ッファーを調製し、カラムに吸着された４／５量のＧｎ
Ｔ−III を溶出させた。また、前述の１／５量の素通り
画分も、再クロマト後、活性画分を得た。以上の操作に
より、ＧｎＴ−III は表１に示すように約１５０，００
０倍に純化され、８−２５％濃度勾配ポリアクリルアミ
ドゲル電気泳動で単一なバンドを示した。

【００２６】実施例２ （ＧｎＴ−III 遺伝子のクローニング） （１）部分アミノ酸配列の決定 約３μｇの精製したＧｎＴ−III を５０mMトリス−塩酸
バッファー( ｐＨ８．０）に５日間透析した後トリプシ
ン（シグマ社製）で消化し、逆相ＨＰＬＣにてペプチド
断片を精製した。次にアプライド バイオシステムズ社
製の４７０Ａプロテインシークエンサーを用い、配列表
の配列番号１〜４でそれぞれ表されるＧｎＴ−III の部
分アミノ酸配列を決定した。

【００２７】（２）ｃＤＮＡの合成 ドンリューラット（雄）の腎臓より全ＲＮＡを調製し、
次にポリ（Ａ）⁺ ＲＮＡをオリゴ（ｄＴ）−セルロース
カラムを用いて精製した。続いてポリ（Ａ）⁺ＲＮＡ５
μｇを鋳型とし、オリゴ（ｄＴ）プライマーを使用し、
前出ｃＤＮＡシステムプラスを用い、二本鎖ｃＤＮＡを
合成した。

【００２８】（３）ＰＣＲ 前述のＧｎＴ−III の部分アミノ酸配列より、配列表の
配列番号５〜１０でそれぞれ表されるＰＣＲ用プライマ
ーをＤＮＡ合成機で合成し、精製した。すなわち配列番
号１で表されるＴ−７のアミノ酸配列より、配列番号
５、６でそれぞれ表される、センスプライマーの５′末
端にはサブクローニング用のHind III認識配列、アンチ
センスプライマーの５′末端にはサブクローニング用の
EcoRＩ認識配列を付加した、ミックスプライマーＳ１、
Ａ１をそれぞれ合成した。また、配列番号２で表される
Ｔ−８のアミノ酸番号２〜７の配列より、配列番号７、
８でそれぞれ表される、センスプライマーの５′末端に
Hind III認識配列、アンチセンスプライマーの５′末端
にEcoRＩ認識配列を付加したミックスプライマーＳ２、
Ａ２をそれぞれ合成した。更にまた、配列番号３で表さ
れるＴ−２０のアミノ酸番号４〜９の配列より、配列番
号９、１０でそれぞれ表される、センスプライマーの
５′末端にHind III認識配列、アンチセンスプライマー
の５′末端にEcoRＩ認識配列を付加したミックスプライ
マーＳ３、Ａ３をそれぞれ合成した。

【００２９】次にＰＣＲは５０mM ＫＣｌ、１０mMトリ
ス−塩酸、ｐＨ８．３、１．５mMＭｇＣｌ₂ 、０．０１
％ゼラチン、各０．２mMの４種のｄＮＴＰｓ、各１μＭ
の一対のプライマー、４０ngのラット腎臓の鋳型のｃＤ
ＮＡ、２．５単位のタックポリメラーゼを含む総液量
０．１mlで行い、反応液は０．１mlのミネラルオイルを
添加した。反応は９４℃（１分）、５０℃（２分）、７
２℃（３分）のサイクルを４０サイクル行い、最終サイ
クル後７２℃で７分温度を維持した。Ｓ２とＡ１、Ｓ３
とＡ１、Ｓ３とＡ２の組合せで約１６０、６３０、４９
０bpのＤＮＡがそれぞれ増幅され、これらのＤＮＡはEc
oRＩとHind IIIで切断後、ベクターｐＵＣ１９にそれぞ
れサブクローニングした。

【００３０】（４）ｃＤＮＡライブラリーの作成及び陽
性クローンの検索 ラット腎臓ｃＤＮＡと、前出のｃＤＮＡクローニングシ
ステムλｇｔ１０を用いｃＤＮＡライブラリーを作成し
た。次に前述のＳ３とＡ２の組合せで増幅したＤＮＡを
プローブとして用いるため、該ＤＮＡをマルチプライム
ＤＮＡラベリングシステム（アマーシャム社製）を用
い、（α³²−Ｐ）ｄＣＴＰ（３０００Ci／mmol：アマー
シャム社製）で標識した。次にこの標識ＤＮＡを用い、
ｃＤＮＡライブラリーより、プラークハイブリダイゼー
ション法を用い、目的のクローンを検索した。２．５×
１０⁶ のプラークより、４個の陽性プラークが得られ、
ファージを単離後、そのEcoRＩ分解物をブルースクリプ
トII ＫＳにサブクローニングし、サブクローニングさ
れた４種のそれぞれ１．５kbp 、１．３kbp 、１．３kb
p 、１．８kbp のＤＮＡをそれぞれＣ１、Ｃ２、Ｃ３、
Ｃ４と命名した。各ＤＮＡの制限酵素地図、及びその関
係を図２に示す。

【００３１】実施例３ （ＧｎＴ−III の発現）ＧｎＴ−III 発現用のＣＯＳ−
１細胞、HeLa細胞は５％ＣＯ₂ 下、湿条件で３７℃で、
１０％ＦＣＳをそれぞれ含むイーグル培地のダルベッコ
改変培地、イーグルの最少培地でそれぞれ培養した。実
施例２で調製したブルースクリプトII ＫＳに組込まれ
たＣ１〜Ｃ４は、EcoRＩで切出した後、真核細胞での発
現用ベクターpVSK３のEcoRＩサイトに組込み、次にジー
ンパルサー（バイオラッド社製）を用い、エレクトロポ
レーションにより、上記真核細胞に導入した。約５×１
０⁶ の細胞と組換えプラスミド、又は対照のベクターは
１３７mM塩化ナトリウム、５mM ＫＣｌ、０．７mM Ｎ
ａ₂ ＨＰＯ₄ 、６mMデキストロースを含む０．８mlの２
０mMヘペスバッファー、ｐＨ７．０５中に懸濁され、電
圧２５０Ｖ／０．４cm、キャパシタンス９６０μFDで処
理を行った。

【００３２】形質転換後、２日間培養を行い、細胞を集
め、ＰＢＳ中で超音波破砕を行い、破砕液中のＧｎＴ−
III 活性を測定した。結果を表２に示す。プラスミド無
処理の細胞、対照のプラスミドpSVK３処理の細胞にはＧ
ｎＴ−III 活性は認められないのに対し、ＳＶ３と命名
されたＣ４を組込んだプラスミドpSVK３で形質転換した
細胞中にはＧｎＴ−III が発現した。また、その発現量
は形質転換に使用したプラスミド量に依存し、ＣＯＳ−
１細胞が高発現であった。なおＧｎＴ−III の発現プラ
スミドＳＶ３は Escherichia coli ＸＬ１− Blue ＳＶ
３（ＦＥＲＭＰ−１２７１８）より調製することがで
き、プラスミド中に組込まれたＧｎＴ−III 遺伝子の制
限酵素地図は図１で表される。

【００３３】

【表２】 表 ２ ────────────────────────────────── ＧｎＴ−III 活性 ( p mol／mg タンパク／ｈ） プ ラ ス ミ ド ────────────────── ＣＯＳ−１細胞 HeLa細胞 ────────────────────────────────── 無処理 ＜５ ０ ｐＳＶＫ３（２０μｇ） ＜５ ０ ＳＶ３ （２０μｇ） ２，８００ １８ ＳＶ３ （４０μｇ） ３，６００ ５６ ──────────────────────────────────

【００３４】

【発明の効果】本発明によって、生体内で重要な役割を
有するＧｎＴ−III の遺伝子及び該酵素の工業的製造方
法が提供された。該遺伝子及び酵素は生化学、診断等の
分野で有用である。

【配列表】

配列番号：１ 配列の長さ：６ 配列の型：アミノ酸 鎖の数：１本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列番号：２ 配列の長さ：７ 配列の型：アミノ酸 鎖の数：１本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列の特徴：1 E 不明のアミノ酸 配列番号：３ 配列の長さ：10 配列の型：アミノ酸 鎖の数：１本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列番号：４ 配列の長さ：11 配列の型：アミノ酸 鎖の数：１本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列番号：５ 配列の長さ：24 配列の型：核酸 鎖の数：１本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ） アンチセンス：NO 配列： CAAGCTTAAY TAYGAYCART TYMG 24 配列番号：６ 配列の長さ：25 配列の型：核酸 鎖の数：１本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ） アンチセンス：YES 配列： GGAATTCNCK RAAYTGRTCR TARTT 25 配列番号：７ 配列の長さ：24 配列の型：核酸 鎖の数：１本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ） アンチセンス：NO 配列： CAAGCTTGGN GAYTAYGARG AYAA 24 配列番号：８ 配列の長さ：25 配列の型：核酸 鎖の数：１本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ） アンチセンス：YES 配列： GGAATTCYTT RTCYTCRTAR TCNCC 25 配列番号：９ 配列の長さ：24 配列の型：核酸 鎖の数：１本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ） アンチセンス：NO 配列： CAAGCTTTGG ATHGCNGAYG AYTA 24 配列番号：10 配列の長さ：28 配列の型：核酸 鎖の数：１本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ） アンチセンス：YES 配列： GGAATTCRTC NGCDATCCAN CCRTCYTG 28

【図面の簡単な説明】

【図１】ＧｎＴ−III をコードする遺伝子の制限酵素地
図を示す図である。

【図２】４種のＤＮＡＣ１〜Ｃ４の関係を示す図であ
る。

Claims (2)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 図面の図１で表される制限酵素地図を有
   し、その長さが約１．８kbであることを特徴とする糖転
   移酵素遺伝子。
2. 【請求項２】 請求項１記載の糖転移酵素遺伝子を含有
   させた組換体プラスミドを導入させた形質転換体を培養
   し、該培養物から糖転移酵素を採取することを特徴とす
   る糖転移酵素の製造方法。