JPH0640839B2 - 試料液中の細菌の属特異的または／および種特異的検出方法 - Google Patents
試料液中の細菌の属特異的または／および種特異的検出方法Info
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- JPH0640839B2 JPH0640839B2 JP3257519A JP25751991A JPH0640839B2 JP H0640839 B2 JPH0640839 B2 JP H0640839B2 JP 3257519 A JP3257519 A JP 3257519A JP 25751991 A JP25751991 A JP 25751991A JP H0640839 B2 JPH0640839 B2 JP H0640839B2
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- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
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Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、試料液中の細菌の属特
異的または／および種特異的検出方法に関する。
異的または／および種特異的検出方法に関する。
【０００２】
【従来の技術および発明が解決しようとする課題】ハイ
ブリダイゼーション技術の開発の後、特定の核酸セグメ
ントの存在または非存在を検出するために使用され得る
特定の核酸の検出に関する多くの方法が開発された。こ
れらの方法は、ヒト遺伝病および実際に影響を及ぼす疾
患に必ずしも至らないゲノムレベルでの他の欠損症の診
断も包含する。しかしながら、最初に開発された方法に
基づく核酸試験は、非常に高い特異的を有しておらず、
２、３の塩基に影響を及ぼしただけである核酸における
突然変異について試験する場合に、特に検出の正確度に
関して困難があった。特に、公知のハイブリダイゼーシ
ョン法は、１または２個の塩基が単に異なるだけである
核酸変異体の分別に関して非常に非特異的であった。こ
れに関する理由は、第１に、比較的短いオリゴヌクレオ
チドの使用のために、ハイブリダイゼーションに関して
非常に厳格な条件が使用されないことであり、これが１
つの塩基のハイブリダイゼーションの非存在(いわゆる
「ミスマッチ」)が通常検出されない理由である。別の
理由は、分別しようとする精製された核酸(単数または
複数種)がしばしば比較的少量しか入手可能でないこと
であった。
ブリダイゼーション技術の開発の後、特定の核酸セグメ
ントの存在または非存在を検出するために使用され得る
特定の核酸の検出に関する多くの方法が開発された。こ
れらの方法は、ヒト遺伝病および実際に影響を及ぼす疾
患に必ずしも至らないゲノムレベルでの他の欠損症の診
断も包含する。しかしながら、最初に開発された方法に
基づく核酸試験は、非常に高い特異的を有しておらず、
２、３の塩基に影響を及ぼしただけである核酸における
突然変異について試験する場合に、特に検出の正確度に
関して困難があった。特に、公知のハイブリダイゼーシ
ョン法は、１または２個の塩基が単に異なるだけである
核酸変異体の分別に関して非常に非特異的であった。こ
れに関する理由は、第１に、比較的短いオリゴヌクレオ
チドの使用のために、ハイブリダイゼーションに関して
非常に厳格な条件が使用されないことであり、これが１
つの塩基のハイブリダイゼーションの非存在(いわゆる
「ミスマッチ」)が通常検出されない理由である。別の
理由は、分別しようとする精製された核酸(単数または
複数種)がしばしば比較的少量しか入手可能でないこと
であった。
【０００３】ＰＣＲ反応は、とりわけ核酸検出方法のさ
らなる開発の一部分として開発され、検出しようとする
核酸を増幅するために使用することができる。しかしな
がら、該ＰＣＲ反応では、ハイブリダイゼーションによ
るその後の検出を妨げる副生成物がしばしば形成され
る。したがって、欧州特許ＥＰ０３３２４３５には、少
なくとも１つのヌクレオチドが異なる核酸間で分別する
ために、ポリメラーゼおよびヌクレオシド三リン酸の補
助によって伸長される診断用プライマーを使用する方法
が既に示唆されているが、しかしながら、それによっ
て、該プライマーの３'末端ヌクレオチドが検出しよう
とする核酸の対応するヌクレオチドと相補的である場合
に伸長が生じるだけである。可能な点突然変異体の存在
は、この方法において伸長生成物の存在または非存在を
介して測定される。これは、この出願において一例とし
てヒトにおける特定の遺伝病を使用して示されている。
らなる開発の一部分として開発され、検出しようとする
核酸を増幅するために使用することができる。しかしな
がら、該ＰＣＲ反応では、ハイブリダイゼーションによ
るその後の検出を妨げる副生成物がしばしば形成され
る。したがって、欧州特許ＥＰ０３３２４３５には、少
なくとも１つのヌクレオチドが異なる核酸間で分別する
ために、ポリメラーゼおよびヌクレオシド三リン酸の補
助によって伸長される診断用プライマーを使用する方法
が既に示唆されているが、しかしながら、それによっ
て、該プライマーの３'末端ヌクレオチドが検出しよう
とする核酸の対応するヌクレオチドと相補的である場合
に伸長が生じるだけである。可能な点突然変異体の存在
は、この方法において伸長生成物の存在または非存在を
介して測定される。これは、この出願において一例とし
てヒトにおける特定の遺伝病を使用して示されている。
【０００４】しかしながら、この技術は、いくつかのポ
リメラーゼがプライマー伸長の間にミスマッチを修正す
るいわゆる「プルーフリーディング活性」を有してお
り、従って特異的検出を不可能にするという困難性も有
する。したがって、まだ、核酸上の唯一の塩基の相違が
確実に検出され得る方法を開発することが必要であっ
た。特に、特定の細菌の属の存在または非存在を検出
し、試料液中のそれらの間で分別するために核酸変異体
に関する非常に特異的な検出方法が必要であった。した
がって、本発明の目的は、このような非常に特異的な方
法を提供するものであった。
リメラーゼがプライマー伸長の間にミスマッチを修正す
るいわゆる「プルーフリーディング活性」を有してお
り、従って特異的検出を不可能にするという困難性も有
する。したがって、まだ、核酸上の唯一の塩基の相違が
確実に検出され得る方法を開発することが必要であっ
た。特に、特定の細菌の属の存在または非存在を検出
し、試料液中のそれらの間で分別するために核酸変異体
に関する非常に特異的な検出方法が必要であった。した
がって、本発明の目的は、このような非常に特異的な方
法を提供するものであった。
【０００５】
【課題を解決するための手段】したがって、本発明は、
特定の細菌のＲＮＡの属特異的もしくは種特異的領域と
相補的であるが、その３'末端において別の属または種
の細菌のＲＮＡと相補的ではないプライマーで細菌ＲＮ
Ａをハイブリダイズし、該プライマーを適切なポリメラ
ーゼおよび４つのデオキシリボヌクレオチドの存在下で
伸長し、所望により該伸長生成物を同時にまたはその後
に標識し、プライマーと鋳型ＲＮＡが相補的である場合
に形成する伸長生成物を変性の後に属特異的または種特
異的オリゴヌクレオチドでさらにハイブリダイズし、該
ハイブリダイゼーションをオリゴヌクレオチド標識によ
って検出することを特徴とする試料液中の細菌の属特異
的または／および種特異的検出方法に関する。
特定の細菌のＲＮＡの属特異的もしくは種特異的領域と
相補的であるが、その３'末端において別の属または種
の細菌のＲＮＡと相補的ではないプライマーで細菌ＲＮ
Ａをハイブリダイズし、該プライマーを適切なポリメラ
ーゼおよび４つのデオキシリボヌクレオチドの存在下で
伸長し、所望により該伸長生成物を同時にまたはその後
に標識し、プライマーと鋳型ＲＮＡが相補的である場合
に形成する伸長生成物を変性の後に属特異的または種特
異的オリゴヌクレオチドでさらにハイブリダイズし、該
ハイブリダイゼーションをオリゴヌクレオチド標識によ
って検出することを特徴とする試料液中の細菌の属特異
的または／および種特異的検出方法に関する。
【０００６】本発明の範囲内で、プライマーは、他の属
または種のＲＮＡと塩基対をなす場合に該プライマーの
３'末端においてミスマッチが生じるならば、一般に高
度に保存されている細菌のＲＮＡの領域と相補的でもあ
り得る。
または種のＲＮＡと塩基対をなす場合に該プライマーの
３'末端においてミスマッチが生じるならば、一般に高
度に保存されている細菌のＲＮＡの領域と相補的でもあ
り得る。
【０００７】本発明の範囲内で、用語「細菌ＲＮＡ」
は、細菌によって直接形成されるＲＮＡの増幅生成物も
含む。細菌ＲＮＡの増幅は、例えば、ポリメラーゼ鎖反
応(米国特許ＵＳＰ ４,６８３,１９５)、核酸配列に基
づく増幅(欧州特許出願公開ＥＰ−Ａ ０３２９８２２)
または高速酵素結合強度鎖複製効果(ドイツ特許出願Ｐ3
929030.１)のような公知の方法を用いて行うことができ
る。
は、細菌によって直接形成されるＲＮＡの増幅生成物も
含む。細菌ＲＮＡの増幅は、例えば、ポリメラーゼ鎖反
応(米国特許ＵＳＰ ４,６８３,１９５)、核酸配列に基
づく増幅(欧州特許出願公開ＥＰ−Ａ ０３２９８２２)
または高速酵素結合強度鎖複製効果(ドイツ特許出願Ｐ3
929030.１)のような公知の方法を用いて行うことができ
る。
【０００８】本発明の方法において２つの選択工程が使
用されるので、ただ１つの分別反応だけによって生じた
間違った結果の危険性をかなり減少することが可能であ
り、したがって、該方法は、２、３の塩基が異なるだけ
である細菌ＲＮＡの間で分別するために使用し得、次に
特定の細菌の属または種の存在について示すことができ
る非常に特異的な試験を提供する。実際に、それは、特
に、しばしば２、３のヌクレオチドが異なるだけである
細菌種の１６Ｓ−rＲＮＡおよび２３Ｓ−rＲＮＡであ
る。このような相違が、しばしば、「有害の」および
「無害の」細菌間で分別することの唯一の可能性であ
る。原理的には、本発明にしたがって、個々の細菌科の
分別も行うことができる。
用されるので、ただ１つの分別反応だけによって生じた
間違った結果の危険性をかなり減少することが可能であ
り、したがって、該方法は、２、３の塩基が異なるだけ
である細菌ＲＮＡの間で分別するために使用し得、次に
特定の細菌の属または種の存在について示すことができ
る非常に特異的な試験を提供する。実際に、それは、特
に、しばしば２、３のヌクレオチドが異なるだけである
細菌種の１６Ｓ−rＲＮＡおよび２３Ｓ−rＲＮＡであ
る。このような相違が、しばしば、「有害の」および
「無害の」細菌間で分別することの唯一の可能性であ
る。原理的には、本発明にしたがって、個々の細菌科の
分別も行うことができる。
【０００９】本発明の特に好ましい具体例において、細
菌の属のメンバーの存在に関する試験の後、実質的に１
工程において実際の種を決定することが可能である。こ
れに関し、細菌の特定の属のＲＮＡと相補的であるが、
その３'末端の少なくとも１つの、好ましくは２または
３つの塩基によって他の属の細菌のＲＮＡとは異なるプ
ライマーが使用される。調べている属の細菌が試料液中
に存在する場合、プライマーの伸長の後に伸長生成物が
形成され、次いで、この伸長生成物は、細菌ＲＮＡの別
の領域に対応するオリゴヌクレオチドでハイブリダイズ
される。この場合、ハイブリダイゼーションのための必
要条件は、この細菌の属の特定の種に適合するだけであ
る。
菌の属のメンバーの存在に関する試験の後、実質的に１
工程において実際の種を決定することが可能である。こ
れに関し、細菌の特定の属のＲＮＡと相補的であるが、
その３'末端の少なくとも１つの、好ましくは２または
３つの塩基によって他の属の細菌のＲＮＡとは異なるプ
ライマーが使用される。調べている属の細菌が試料液中
に存在する場合、プライマーの伸長の後に伸長生成物が
形成され、次いで、この伸長生成物は、細菌ＲＮＡの別
の領域に対応するオリゴヌクレオチドでハイブリダイズ
される。この場合、ハイブリダイゼーションのための必
要条件は、この細菌の属の特定の種に適合するだけであ
る。
【００１０】本発明の方法において、プライマーとＲＮ
Ａとのハイブリダイゼーションのために非常に長いプラ
イマーを使用することが可能であり、次いで、これによ
って、このハイブリダイゼーションにおける非常に厳格
な条件が使用される。結果として、プライマー伸長工程
によって、すでに、非常に特異的な結果が得られ、これ
は、付加的ハイブリダイゼーション工程によって実質的
に増大する。本発明において、多くの細菌の属および種
に関して同一のものであるＲＮＡ上の領域と相補的であ
るかまたは一致するプライマーまたはオリゴヌクレオチ
ドが使用される付加的対照試験を行うこともできる。対
照試験に関して、全ての真正細菌について特異的である
プライマーまたはオリゴヌクレオチドがある。このよう
な対照試験によって標的ＲＮＡの存在およびアクセシビ
リティを示すことができ、したがって、「誤った否定
的」結果を防止する。さらに、標的ＲＮＡを用いないブ
ラインド試験を行うことができる。これによって、プラ
イマーの伸長における、ならびに実際の特異的反応に関
するハイブリダイゼーションにおける人為結果を誤認す
ることを避けることが可能である。同時に、細菌の合計
料と比較して特定の属または種の細菌の量を評価するこ
とができる。
Ａとのハイブリダイゼーションのために非常に長いプラ
イマーを使用することが可能であり、次いで、これによ
って、このハイブリダイゼーションにおける非常に厳格
な条件が使用される。結果として、プライマー伸長工程
によって、すでに、非常に特異的な結果が得られ、これ
は、付加的ハイブリダイゼーション工程によって実質的
に増大する。本発明において、多くの細菌の属および種
に関して同一のものであるＲＮＡ上の領域と相補的であ
るかまたは一致するプライマーまたはオリゴヌクレオチ
ドが使用される付加的対照試験を行うこともできる。対
照試験に関して、全ての真正細菌について特異的である
プライマーまたはオリゴヌクレオチドがある。このよう
な対照試験によって標的ＲＮＡの存在およびアクセシビ
リティを示すことができ、したがって、「誤った否定
的」結果を防止する。さらに、標的ＲＮＡを用いないブ
ラインド試験を行うことができる。これによって、プラ
イマーの伸長における、ならびに実際の特異的反応に関
するハイブリダイゼーションにおける人為結果を誤認す
ることを避けることが可能である。同時に、細菌の合計
料と比較して特定の属または種の細菌の量を評価するこ
とができる。
【００１１】本発明において、種々の属または種におい
て異なることが示され得るＲＮＡは、細菌起源のＲＮＡ
として使用され得る。rＲＮＡ、mＲＮＡまたはt−ＲＮ
Ａは、好ましくはそれらと相補的である本発明の方法に
関するプライマーおよびオリゴヌクレオチドを選択する
ことによって使用される。公知方法に従って、本発明の
方法に関する細菌ＲＮＡを調製する。
て異なることが示され得るＲＮＡは、細菌起源のＲＮＡ
として使用され得る。rＲＮＡ、mＲＮＡまたはt−ＲＮ
Ａは、好ましくはそれらと相補的である本発明の方法に
関するプライマーおよびオリゴヌクレオチドを選択する
ことによって使用される。公知方法に従って、本発明の
方法に関する細菌ＲＮＡを調製する。
【００１２】形成された伸長生成物のハイブリダイゼー
ションの実際の検出は、オリゴヌクレオチド標識を介し
て行われる。この場合、核酸に関する如何なるタイプの
標識も使用され得る。本発明において、この反応を観察
するためにも該伸長生成物をさらに標識し得る；標識化
は、その形成の間もしくはその直後に行われ得るかまた
はプライマーを介して標識され得る。伸長生成物の標識
化は、好ましくは、すでに標識されているプライマーを
使用することによって行われる。
ションの実際の検出は、オリゴヌクレオチド標識を介し
て行われる。この場合、核酸に関する如何なるタイプの
標識も使用され得る。本発明において、この反応を観察
するためにも該伸長生成物をさらに標識し得る；標識化
は、その形成の間もしくはその直後に行われ得るかまた
はプライマーを介して標識され得る。伸長生成物の標識
化は、好ましくは、すでに標識されているプライマーを
使用することによって行われる。
【００１３】本発明において、プライマーおよびオリゴ
ヌクレオチドの標識化が異なっており、従って、該方法
における両工程が別々に制御およびモニターされ得るの
が特に好ましい。
ヌクレオチドの標識化が異なっており、従って、該方法
における両工程が別々に制御およびモニターされ得るの
が特に好ましい。
【００１４】よく知られている方法で、好ましくは非伸
長プライマーと非反応核酸成分を分離することによっ
て、ハイブリダイゼーションのための伸長生成物を調製
する。サイズによって核酸フラグメントの分離を行う全
ての方法がこれに適している。これは、ゲル電気泳動ま
たは上昇薄層クロマトグラフィーを使用して行われるの
が好ましい。ＨＰＬＣによる分離も適していると思われ
る。
長プライマーと非反応核酸成分を分離することによっ
て、ハイブリダイゼーションのための伸長生成物を調製
する。サイズによって核酸フラグメントの分離を行う全
ての方法がこれに適している。これは、ゲル電気泳動ま
たは上昇薄層クロマトグラフィーを使用して行われるの
が好ましい。ＨＰＬＣによる分離も適していると思われ
る。
【００１５】次いで、オリゴヌクレオチドとのハイブリ
ダイゼーションも、例えばニトロセルロース紙上へのＤ
ＮＡのサザーントランスファーまたは他の公知の方法に
よるような、よく知られている方法で行われる。次い
で、オリゴヌクレオチドとのハイブリダイゼーションの
後のシグナルの位置およびシグナルの強度から必要な結
果を引き出すことができる。
ダイゼーションも、例えばニトロセルロース紙上へのＤ
ＮＡのサザーントランスファーまたは他の公知の方法に
よるような、よく知られている方法で行われる。次い
で、オリゴヌクレオチドとのハイブリダイゼーションの
後のシグナルの位置およびシグナルの強度から必要な結
果を引き出すことができる。
【００１６】しかしながら、本発明の範囲内で、形成さ
れた伸長生成物がその標識を介して固相に結合され、次
いで、非伸長プライマーと相補的ではない標識形態のオ
リゴヌクレオチドによって検出を行い、従って間違った
シグルは生じ得ないような方法で伸長生成物およびオリ
ゴヌクレオチドの２重標識を行うことが可能であり、か
つ好ましい。このような標識に関しては、例えば、ビオ
チン／ストレプタビジン、またはジゴキシゲニン／抗ジ
ゴキシゲニン抗体のようなハプテン／抗ハプテン抗体の
ような結合対が適しており、これらにおいて、１つの結
合パートナーは、固相(例えば、ストレプタビジン)に結
合しており、第２のパートナーはプライマーまたは核酸
結合ブロックの１つに結合している。
れた伸長生成物がその標識を介して固相に結合され、次
いで、非伸長プライマーと相補的ではない標識形態のオ
リゴヌクレオチドによって検出を行い、従って間違った
シグルは生じ得ないような方法で伸長生成物およびオリ
ゴヌクレオチドの２重標識を行うことが可能であり、か
つ好ましい。このような標識に関しては、例えば、ビオ
チン／ストレプタビジン、またはジゴキシゲニン／抗ジ
ゴキシゲニン抗体のようなハプテン／抗ハプテン抗体の
ような結合対が適しており、これらにおいて、１つの結
合パートナーは、固相(例えば、ストレプタビジン)に結
合しており、第２のパートナーはプライマーまたは核酸
結合ブロックの１つに結合している。
【００１７】本発明における方法の特異性を増大するた
めに、プライマー配列とは異なる配列上でオリゴヌクレ
オチドとのハイブリダイゼーションが起こる。この配列
は、プライマー伸長方法によって通常生産される対応す
る核酸鎖長さのようなプライマー配列から少し離れるこ
とができる。該ハイブリダイゼーションは、プライマー
と相補的であるＲＮＡ上の配列の近くにあり、かつ５'
方向に２０〜４００塩基離れている配列で行われるのが
好ましい。
めに、プライマー配列とは異なる配列上でオリゴヌクレ
オチドとのハイブリダイゼーションが起こる。この配列
は、プライマー伸長方法によって通常生産される対応す
る核酸鎖長さのようなプライマー配列から少し離れるこ
とができる。該ハイブリダイゼーションは、プライマー
と相補的であるＲＮＡ上の配列の近くにあり、かつ５'
方向に２０〜４００塩基離れている配列で行われるのが
好ましい。
【００１８】本発明の方法の範囲内で、１５〜５０ヌク
レオチド長さであるプライマーを使用するのが好まし
い。しかしながら、プライマーの長さは主としてハイブ
リダイゼーション条件に依存し、したがって該方法のス
トリンジェンシーに依存し、次に使用したポリメラー
ゼ、好ましくはＡＭＶまたはＭＭｕＬＶリバーストラン
スクリプターゼの温度感受性に依存する。ハイブリダイ
ゼーション温度は、ポリメラーゼによって耐えられる温
度よりも高くないが、高いストリンジェンシーを可能に
させるのに充分であるべきである。プライマーが長いほ
ど、プライマーと検出しようとするＲＮＡ配列とのハイ
ブリッド生成物の融点は高い。
レオチド長さであるプライマーを使用するのが好まし
い。しかしながら、プライマーの長さは主としてハイブ
リダイゼーション条件に依存し、したがって該方法のス
トリンジェンシーに依存し、次に使用したポリメラー
ゼ、好ましくはＡＭＶまたはＭＭｕＬＶリバーストラン
スクリプターゼの温度感受性に依存する。ハイブリダイ
ゼーション温度は、ポリメラーゼによって耐えられる温
度よりも高くないが、高いストリンジェンシーを可能に
させるのに充分であるべきである。プライマーが長いほ
ど、プライマーと検出しようとするＲＮＡ配列とのハイ
ブリッド生成物の融点は高い。
【００１９】伸長生成物とのハイブリダイゼーションの
ために使用されるオリゴヌクレオチドは本発明の範囲内
で１２〜２０ヌクレオチド長さであるのが好ましく、そ
れは高い特異的を達成するにもかかわらずオリゴヌクレ
オチド合成における要求を比較的低く維持する。
ために使用されるオリゴヌクレオチドは本発明の範囲内
で１２〜２０ヌクレオチド長さであるのが好ましく、そ
れは高い特異的を達成するにもかかわらずオリゴヌクレ
オチド合成における要求を比較的低く維持する。
【００２０】本発明の方法によって、試料液中におい
て、非常に特異的な方法で、特定の細菌の存在が検出さ
れる。特に、この方法では、特定の細菌の属が存在する
場合に同時に実際の亜種を決定することも可能である。
臨床診断に関する高い特異的要求も満たされる。
て、非常に特異的な方法で、特定の細菌の存在が検出さ
れる。特に、この方法では、特定の細菌の属が存在する
場合に同時に実際の亜種を決定することも可能である。
臨床診断に関する高い特異的要求も満たされる。
【００２１】以下の実施例によって、本発明をさらに説
明する。
明する。
【００２２】
【実施例】実施例１ ラクトコッカス・ラクティス・サブスピーシズ・ラクテ
ィス(Ｌactococcus lactis subspecies lactis)とラク
トコッカス・ラクティス・サブスピーシズ・クレモリス
(Ｌ. lactis subspec. cremoris)との分別
ィス(Ｌactococcus lactis subspecies lactis)とラク
トコッカス・ラクティス・サブスピーシズ・クレモリス
(Ｌ. lactis subspec. cremoris)との分別
【００２３】１ ｘ ＳＳＣ(１５０ミリモル／リットル
ＮaＣl、１５ミリモル／リットルクエン酸三ナトリウ
ム、０℃でｐＨ７.０)３ミリリットル中で個々の細菌亜
種の細胞(１〜３g)を懸濁した。４×３０秒間、細胞ホ
モジナイザー中でガラスビーズ(５０g；φ０.１７mm)を
用いて細胞を溶解した後、毎回、１ ｘ ＳＳＣ ３ミリ
リットルおよびフェノール６ミリリットル(１ ｘ ＳＳ
Ｃ飽和)と一緒に３回振盪してフェノール抽出を行っ
た。この後に、２倍量のジエチルエーテルによる抽出を
４回行った。最後に、−２０℃で、５モル／リットル酢
酸カリウム０.１容量、無水エタノール２.５容量を添加
することによって核酸を沈殿させ、遠心分離(２０分、
１００００g)の後、沈殿物を真空乾燥させた。残存した
ＤＮＡを、ウルトラ・タラックス(Ｕltra Ｔurrax)(１
０秒)中、０℃で、３モル／リットル酢酸ナトリウム(ｐ
Ｈ６.０)１０ミリリットル中に懸濁させることによって
再懸濁させ、遠心分離し、この方法を３〜４回繰り返し
た後、主としてrＲＮＡをペレット状態で得た。
ＮaＣl、１５ミリモル／リットルクエン酸三ナトリウ
ム、０℃でｐＨ７.０)３ミリリットル中で個々の細菌亜
種の細胞(１〜３g)を懸濁した。４×３０秒間、細胞ホ
モジナイザー中でガラスビーズ(５０g；φ０.１７mm)を
用いて細胞を溶解した後、毎回、１ ｘ ＳＳＣ ３ミリ
リットルおよびフェノール６ミリリットル(１ ｘ ＳＳ
Ｃ飽和)と一緒に３回振盪してフェノール抽出を行っ
た。この後に、２倍量のジエチルエーテルによる抽出を
４回行った。最後に、−２０℃で、５モル／リットル酢
酸カリウム０.１容量、無水エタノール２.５容量を添加
することによって核酸を沈殿させ、遠心分離(２０分、
１００００g)の後、沈殿物を真空乾燥させた。残存した
ＤＮＡを、ウルトラ・タラックス(Ｕltra Ｔurrax)(１
０秒)中、０℃で、３モル／リットル酢酸ナトリウム(ｐ
Ｈ６.０)１０ミリリットル中に懸濁させることによって
再懸濁させ、遠心分離し、この方法を３〜４回繰り返し
た後、主としてrＲＮＡをペレット状態で得た。
【００２４】この方法で調製したrＲＮＡ ２μgおよび
以下の配列(ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ １):５' ＣＧＧＴＴＡＡ
ＧＡＡＣＧＣＴＣＴＣＣＴＡＣＣＡＴＴＴ ３'を有する
プライマー１０ピコモルを、９０℃で４０分間、緩衝液
(０.１モル／リットルＫＣl；０.０５モル／リットル
トリス(Ｔris)−ＨＣl、ｐＨ８.３)５ミリリットル中で
変性させ、その後、混合物を７０℃で１０分間インキュ
ベートした。この混合物１マイクロリットルを緩衝液
(０.０５モル／リットル トリス／ＨＣl、ｐＨ８.３；
０.１２モル／リットルＮaＣl、０.０７モル／リットル
ＭgＣl2；各々、０.０６ミリモル／リットルdＧＴＰ、d
ＣＴＰ、dＴＴＰ；０.０６ミリモル／リットル［32Ｐ］
α−dＡＴＰ(約１μＣi；ＡＭＶまたはＭＭｕＬＶリバ
ーストランスクリプターゼ(ベーリンガー・マンハイム
(Ｂoehringer Ｍannheim))５ユニット))４マイクロリッ
トルと一緒に４５℃で２０分間インキュベートした。移
動溶媒として９モル／リットル尿素に入れた０.４モル
／リットル ギ酸アンモニウムを用いて、８０℃で４５
分間、上昇薄層クロマトグラフィー(ＤＥＡＥセルロー
ス、ポリグラム・セル(Ｐolygram cell)３００、シュラ
イヒャー・アンド・シュール(Ｓchleicher and Ｓchuel
l))によって反応生成物(２マイクロリットル)を分離し
た。オートラジオグラフィー後、形成された伸長生成物
を検出した。
以下の配列(ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ １):５' ＣＧＧＴＴＡＡ
ＧＡＡＣＧＣＴＣＴＣＣＴＡＣＣＡＴＴＴ ３'を有する
プライマー１０ピコモルを、９０℃で４０分間、緩衝液
(０.１モル／リットルＫＣl；０.０５モル／リットル
トリス(Ｔris)−ＨＣl、ｐＨ８.３)５ミリリットル中で
変性させ、その後、混合物を７０℃で１０分間インキュ
ベートした。この混合物１マイクロリットルを緩衝液
(０.０５モル／リットル トリス／ＨＣl、ｐＨ８.３；
０.１２モル／リットルＮaＣl、０.０７モル／リットル
ＭgＣl2；各々、０.０６ミリモル／リットルdＧＴＰ、d
ＣＴＰ、dＴＴＰ；０.０６ミリモル／リットル［32Ｐ］
α−dＡＴＰ(約１μＣi；ＡＭＶまたはＭＭｕＬＶリバ
ーストランスクリプターゼ(ベーリンガー・マンハイム
(Ｂoehringer Ｍannheim))５ユニット))４マイクロリッ
トルと一緒に４５℃で２０分間インキュベートした。移
動溶媒として９モル／リットル尿素に入れた０.４モル
／リットル ギ酸アンモニウムを用いて、８０℃で４５
分間、上昇薄層クロマトグラフィー(ＤＥＡＥセルロー
ス、ポリグラム・セル(Ｐolygram cell)３００、シュラ
イヒャー・アンド・シュール(Ｓchleicher and Ｓchuel
l))によって反応生成物(２マイクロリットル)を分離し
た。オートラジオグラフィー後、形成された伸長生成物
を検出した。
【００２５】検出システムの対照として、配列(ＳＥＱ
ＩＤ ＮＯ ２)：５' ＡＧＡＡＣＧＣＴＣＣＣＣＴＡＣ
Ｃ ３’を有するほとんど全ての細菌のｒＲＮＡ分子と
相補的である合成オリゴヌクレオチドを用いて、ポジテ
ィブ標準として対照反応を行った。条件は、特異的プラ
イマーに関して既に記載したものと同一であった。
ＩＤ ＮＯ ２)：５' ＡＧＡＡＣＧＣＴＣＣＣＣＴＡＣ
Ｃ ３’を有するほとんど全ての細菌のｒＲＮＡ分子と
相補的である合成オリゴヌクレオチドを用いて、ポジテ
ィブ標準として対照反応を行った。条件は、特異的プラ
イマーに関して既に記載したものと同一であった。
【００２６】特異的プライマーを用いて得られた伸長生
成物の試料を０.４Ｎ ＮaＯＨ ２００マイクロリットル
中で変性させ(２０分、２５℃)、次いで、膜(ゼータプ
ローブ(Ｚetaprobe)、バイオラド(Ｂiorad)；ドットブ
ロット、ミニフォールド(Ｍinifold)、シュライヒャー
・アンド・シュール(Ｓchleicher and Ｓchuell))に結
合させた。配列(ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ ３)：５' ＴＧＣＧ
ＴＡＡＴＡＧＣＴＣＡＣＴ ３'を有する検出プローブ
(５ピコモル)は、ＲＮＡ上のその相補的配列が該相補的
配列から５'側上の特異的プライマーまでの約６５塩基
であり、それを緩衝液(０.０２７モル／リットル トリ
ス／ＨＣl、ｐＨ８；０.０１１モル／リットル ＤＴ
Ｔ；０.９ミリモル／リットル スペルミン；０.０１１
モル／リットル ＭgＣl2；０.２５ミリモル／リットル
[γ−32Ｐ]ＡＴＰ、約３０μＣi)２０マイクロリットル
中、３７℃で３０分間インキュベートすることによって
標識した。非反応ヌクレオチドを除去し、標識検出プロ
ーブをジーン・クリーン(Ｇene ＣleanTM)またはマー・
メイド(Ｍer Ｍaid)(バイオ １０１ インコーポレイテ
ッド(Ｂio１０１ Ｉnc.)、ラ・ジョーラ、アメリカ合衆
国)のシステムを使用して精製した。伸長生成物を結合
する上記に従って調製した膜を０.５ｘ ＳＳＣ、０.５
％ＳＤＳ中、５０℃で１時間洗浄し、次いで、６ ｘ Ｓ
ＳＣ、５ ｘ デンハーツ(Ｄenhardt)、０.５％ サルコ
シル、０.１％ ＳＤＳ中、５０℃で２時間プレインキュ
ベートした。６ ｘ ＳＳＣ、５ ｘ デンハーツ(Ｄenhar
dt)、０.５％ サルコシル、０.１％ ＳＤＳ中、３８℃
で４時間、検出プローブ３ピコモルでハイブリダイゼー
ションを行った後、２ ｘ ＳＳＣ、０.１％ ＳＤＳで洗
浄した(２５℃で２×５分間、３７℃で１×５分間)。オ
ートラジオグラフィーの後、オートラジオグラムの比重
分析を行った。その結果、ドットブロットにおいて伸長
生成物を適用した後に、形成された伸長生成物および対
照反応に関して匹敵するシグナルが得られた；しかしな
がら、検出プローブが使用される場合にはこれはラクト
コッカス・ラクティス・サブスピーシズ・ラクティス
(Ｌ. lactis subspec. lactis)が存在する場合だけであ
ることが分かった。
成物の試料を０.４Ｎ ＮaＯＨ ２００マイクロリットル
中で変性させ(２０分、２５℃)、次いで、膜(ゼータプ
ローブ(Ｚetaprobe)、バイオラド(Ｂiorad)；ドットブ
ロット、ミニフォールド(Ｍinifold)、シュライヒャー
・アンド・シュール(Ｓchleicher and Ｓchuell))に結
合させた。配列(ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ ３)：５' ＴＧＣＧ
ＴＡＡＴＡＧＣＴＣＡＣＴ ３'を有する検出プローブ
(５ピコモル)は、ＲＮＡ上のその相補的配列が該相補的
配列から５'側上の特異的プライマーまでの約６５塩基
であり、それを緩衝液(０.０２７モル／リットル トリ
ス／ＨＣl、ｐＨ８；０.０１１モル／リットル ＤＴ
Ｔ；０.９ミリモル／リットル スペルミン；０.０１１
モル／リットル ＭgＣl2；０.２５ミリモル／リットル
[γ−32Ｐ]ＡＴＰ、約３０μＣi)２０マイクロリットル
中、３７℃で３０分間インキュベートすることによって
標識した。非反応ヌクレオチドを除去し、標識検出プロ
ーブをジーン・クリーン(Ｇene ＣleanTM)またはマー・
メイド(Ｍer Ｍaid)(バイオ １０１ インコーポレイテ
ッド(Ｂio１０１ Ｉnc.)、ラ・ジョーラ、アメリカ合衆
国)のシステムを使用して精製した。伸長生成物を結合
する上記に従って調製した膜を０.５ｘ ＳＳＣ、０.５
％ＳＤＳ中、５０℃で１時間洗浄し、次いで、６ ｘ Ｓ
ＳＣ、５ ｘ デンハーツ(Ｄenhardt)、０.５％ サルコ
シル、０.１％ ＳＤＳ中、５０℃で２時間プレインキュ
ベートした。６ ｘ ＳＳＣ、５ ｘ デンハーツ(Ｄenhar
dt)、０.５％ サルコシル、０.１％ ＳＤＳ中、３８℃
で４時間、検出プローブ３ピコモルでハイブリダイゼー
ションを行った後、２ ｘ ＳＳＣ、０.１％ ＳＤＳで洗
浄した(２５℃で２×５分間、３７℃で１×５分間)。オ
ートラジオグラフィーの後、オートラジオグラムの比重
分析を行った。その結果、ドットブロットにおいて伸長
生成物を適用した後に、形成された伸長生成物および対
照反応に関して匹敵するシグナルが得られた；しかしな
がら、検出プローブが使用される場合にはこれはラクト
コッカス・ラクティス・サブスピーシズ・ラクティス
(Ｌ. lactis subspec. lactis)が存在する場合だけであ
ることが分かった。
【００２７】実施例２ ラクトコッカス・ラクティス(Ｌactococcus lactis)と
ストレプトコッカス・オラリス(Ｓtreptococcus orali
s)との分別、ラクトコッカス・ラクティス(Ｌ.lactis)
特異的検出プローブによるcＤＮＡに関する試験
ストレプトコッカス・オラリス(Ｓtreptococcus orali
s)との分別、ラクトコッカス・ラクティス(Ｌ.lactis)
特異的検出プローブによるcＤＮＡに関する試験
【００２８】ラクトコッカス・ラクティス(Ｌ. lactis)
のＲＮＡと相補的であるが、３'末端の最後の塩基がス
トレプトコッカス・オラリス(Ｓtreptococcus oralis)
ＲＮＡと異なるプライマーとして、配列(ＳＥＱ ＩＤ
ＮＯ ４)：５' ＴＴＣＧＣＴＣＧＣＣＧＣＴＡＣＴＴ
３'を有する長さ１７塩基のオリゴヌクレオチドを用い
た。実施例１と同様に、ＲＮＡ調製ならびにハイブリダ
イゼーションおよびプライマー伸長を行った。ストレプ
トコッカス・オラリス(Ｓ. oralis)のＲＮＡ配列とは実
質的に異なり、ラクトコッカス・ラクティス(Ｌ. lacti
s)ＲＮＡにハイブリダイズするだけである特異的なオリ
ゴヌクレオチドとして、配列(ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ ５)：
５' ＣＴＡＧＣＡＧＴＴＡＴＴＣＡＴＧＡＧＴＧ ３'を
用いた。膜に移動した伸長生成物のハイブリダイゼーシ
ョンは、４８℃の温度で行う以外は、実施例１に記載と
同様に行った。検出は、オートラジオグラフィーおよび
比重分析によって実施例１に従って行った。
のＲＮＡと相補的であるが、３'末端の最後の塩基がス
トレプトコッカス・オラリス(Ｓtreptococcus oralis)
ＲＮＡと異なるプライマーとして、配列(ＳＥＱ ＩＤ
ＮＯ ４)：５' ＴＴＣＧＣＴＣＧＣＣＧＣＴＡＣＴＴ
３'を有する長さ１７塩基のオリゴヌクレオチドを用い
た。実施例１と同様に、ＲＮＡ調製ならびにハイブリダ
イゼーションおよびプライマー伸長を行った。ストレプ
トコッカス・オラリス(Ｓ. oralis)のＲＮＡ配列とは実
質的に異なり、ラクトコッカス・ラクティス(Ｌ. lacti
s)ＲＮＡにハイブリダイズするだけである特異的なオリ
ゴヌクレオチドとして、配列(ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ ５)：
５' ＣＴＡＧＣＡＧＴＴＡＴＴＣＡＴＧＡＧＴＧ ３'を
用いた。膜に移動した伸長生成物のハイブリダイゼーシ
ョンは、４８℃の温度で行う以外は、実施例１に記載と
同様に行った。検出は、オートラジオグラフィーおよび
比重分析によって実施例１に従って行った。
【００２９】実施例３ 腸球菌類またはグラム陽性菌とラクトコッカス属との分
別およびラクトコッカス・ラクティス・サブスピーシー
ズ・ラクティス(Ｌactococcuslactis subspecies lacti
s)とラクトコッカス・ラクティス・サブスピーシーズ・
クレモリス(Ｌactococcus lactis subspecies cremori
s)との亜種特異的分別
別およびラクトコッカス・ラクティス・サブスピーシー
ズ・ラクティス(Ｌactococcuslactis subspecies lacti
s)とラクトコッカス・ラクティス・サブスピーシーズ・
クレモリス(Ｌactococcus lactis subspecies cremori
s)との亜種特異的分別
【００３０】プライマーとして、配列(ＳＥＱ ＩＤ Ｎ
Ｏ ６)：５' ＣＴＣＡＣＴＴＣＴＴＡＡＣＧＣＴＣＣＡ
Ｇ ３'を使用した。この配列は、乳酸球菌類に関して属
特異的であり、該配列によって、この属と腸球菌類およ
び他のグラム陽性菌とが分別される。ＲＮＡ調製ならび
にハイブリダイゼーションおよびプライマー伸長は、実
施例１と同様に行った。亜種ラクトコッカス・ラクティ
ス・サブスピーシズ・ラクティス(Ｌactococcuslactis
subspecies lactis)に関して特異的なオリゴヌクレオチ
ドとして、配列(ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ ７)：５' ＡＧＣＧ
ＴＴＧＧＡＴＴＣＡＡＴＴＴＡＡＴ３'を使用した。膜
に移動した伸長生成物のハイブリダイセーションを、再
度、３８℃で行い、後処理は実施例１の記載同様であっ
た。この場合は、オートラジオグラフィーおよび比重分
析の後、ラクトコッカス・ラクティス・サブスピーシー
ズ・ラクティス(Ｌactococcus lactis subspecies lact
is)が存在する場合だけハイブリダイゼーションが生
じ、ラクトコッカス・ラクティス・サブスピーシーズ・
クレモリス(Ｌactococcus lactis subspecies cremori
s)の伸長生成物が存在するだけである場合は生じないこ
とが明らかであった。
Ｏ ６)：５' ＣＴＣＡＣＴＴＣＴＴＡＡＣＧＣＴＣＣＡ
Ｇ ３'を使用した。この配列は、乳酸球菌類に関して属
特異的であり、該配列によって、この属と腸球菌類およ
び他のグラム陽性菌とが分別される。ＲＮＡ調製ならび
にハイブリダイゼーションおよびプライマー伸長は、実
施例１と同様に行った。亜種ラクトコッカス・ラクティ
ス・サブスピーシズ・ラクティス(Ｌactococcuslactis
subspecies lactis)に関して特異的なオリゴヌクレオチ
ドとして、配列(ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ ７)：５' ＡＧＣＧ
ＴＴＧＧＡＴＴＣＡＡＴＴＴＡＡＴ３'を使用した。膜
に移動した伸長生成物のハイブリダイセーションを、再
度、３８℃で行い、後処理は実施例１の記載同様であっ
た。この場合は、オートラジオグラフィーおよび比重分
析の後、ラクトコッカス・ラクティス・サブスピーシー
ズ・ラクティス(Ｌactococcus lactis subspecies lact
is)が存在する場合だけハイブリダイゼーションが生
じ、ラクトコッカス・ラクティス・サブスピーシーズ・
クレモリス(Ｌactococcus lactis subspecies cremori
s)の伸長生成物が存在するだけである場合は生じないこ
とが明らかであった。
【００３１】配列プロトコール
【００３２】ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ １ 配列の長さ： ２６塩基 配列のタイプ： ヌクレオチド配列(ＤＮ
Ａ) 鎖のタイプ： 一本鎖 トポロジー： 線形 ５' ＣＧＧＴＴＡＡＧＡＡ ＣＧＣＴＣＴＣＣＴＡ ＣＣ
ＡＴＴＴ−３'
Ａ) 鎖のタイプ： 一本鎖 トポロジー： 線形 ５' ＣＧＧＴＴＡＡＧＡＡ ＣＧＣＴＣＴＣＣＴＡ ＣＣ
ＡＴＴＴ−３'
【００３３】ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ ２ 配列の長さ： １６塩基 配列のタイプ： ヌクレオチド配列(ＤＮ
Ａ) 鎖のタイプ： 一本鎖 トポロジー： 線形 ５'−ＡＧＡＡＣＧＣＴＣＣ ＣＣＴＡＣＣ−３'
Ａ) 鎖のタイプ： 一本鎖 トポロジー： 線形 ５'−ＡＧＡＡＣＧＣＴＣＣ ＣＣＴＡＣＣ−３'
【００３４】ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ ３ 配列の長さ： １６塩基 配列のタイプ： ヌクレオチド配列(ＤＮ
Ａ) 鎖のタイプ： 一本鎖 トポロジー： 線形 ５'−ＴＧＣＧＴＡＡＴＡＧ ＣＴＣＡＣＴ−３'
Ａ) 鎖のタイプ： 一本鎖 トポロジー： 線形 ５'−ＴＧＣＧＴＡＡＴＡＧ ＣＴＣＡＣＴ−３'
【００３５】ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ ４ 配列の長さ： １７塩基 配列のタイプ： ヌクレオチド配列(ＤＮ
Ａ) 鎖のタイプ： 一本鎖 トポロジー： 線形 ５'−ＴＴＣＧＣＴＣＧＣＣ ＧＣＴＡＣＴＴ−３'
Ａ) 鎖のタイプ： 一本鎖 トポロジー： 線形 ５'−ＴＴＣＧＣＴＣＧＣＣ ＧＣＴＡＣＴＴ−３'
【００３６】ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ ５ 配列の長さ： ２０塩基 配列のタイプ： ヌクレオチド配列(ＤＮ
Ａ) 鎖のタイプ： 一本鎖 トポロジー： 線形 ５'−ＣＴＡＧＣＡＧＴＴＡ ＴＴＣＡＴＧＡＧＴＧ−
３'
Ａ) 鎖のタイプ： 一本鎖 トポロジー： 線形 ５'−ＣＴＡＧＣＡＧＴＴＡ ＴＴＣＡＴＧＡＧＴＧ−
３'
【００３７】ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ ６ 配列の長さ： ２０塩基 配列のタイプ： ヌクレオチド配列(ＤＮ
Ａ) 鎖のタイプ： 一本鎖 トポロジー： 線形 ５'−ＣＴＣＡＣＴＴＣＴＴ ＡＡＣＧＣＴＣＣＡＧ−
３'
Ａ) 鎖のタイプ： 一本鎖 トポロジー： 線形 ５'−ＣＴＣＡＣＴＴＣＴＴ ＡＡＣＧＣＴＣＣＡＧ−
３'
【００３８】ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ ７ 配列の長さ： ２０塩基 配列のタイプ： ヌクレオチド配列(ＤＮ
Ａ) 鎖のタイプ： 一本鎖 トポロジー： 線形 ５'−ＡＧＣＧＴＴＧＧＡＴ ＴＣＡＡＴＴＴＡＡＴ−
３’
Ａ) 鎖のタイプ： 一本鎖 トポロジー： 線形 ５'−ＡＧＣＧＴＴＧＧＡＴ ＴＣＡＡＴＴＴＡＡＴ−
３’
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 カール・ハインツ・シュライファー ドイツ連邦共和国デー−8044ウンターシュ ライスハイム、シュヴァルベンシュトラー セ３アー番 (72)発明者 クリストフ・ケスラー ドイツ連邦共和国デー−8021ドルフェン、 シュロスベルクヴェーク11番 (72)発明者 リューディガー・リューガー ドイツ連邦共和国デー−8124ゼースハウプ ト、トゥーツィンガー・シュトラーセ２番 (72)発明者 アンネ・シュテルン ドイツ連邦共和国デー−8122ペンツベル ク、カルヴェンデルシュトラーセ10番
Claims (6)
- 【請求項１】 特定の細菌のＲＮＡの属特異的もしくは
種特異的領域または一般的な細菌のＲＮＡの高度に保存
された領域と相補的であるが、その３'末端において別
の属または種の細菌のＲＮＡと相補的ではないプライマ
ーで細菌ＲＮＡをハイブリダイズし、該プライマーを適
切なポリメラーゼおよび４つのデオキシリボヌクレオチ
ドの存在下で伸長し、所望により該伸長生成物を同時に
またはその後に標識し、形成された伸長生成物を変性さ
せた後、属特異的または種特異的オリゴヌクレオチドで
ハイブリダイズし、該ハイブリダイゼーションをオリゴ
ヌクレオチド標識によって検出することを特徴とする試
料液中の細菌の属特異的または／および種特異的検出方
法。 - 【請求項２】 特定の属の細菌のＲＮＡと相補的である
プライマーが用いられ、伸長生成物が細菌のこの属内の
特定の種のＲＮＡとだけ一致するオリゴヌクレオチドで
ハイブリダイズされる請求項１記載の方法。 - 【請求項３】 rＲＮＡ、mＲＮＡまたはt−ＲＮＡの属
特異的もしくは種特異的領域と相補的であるかまたは一
致するプライマーおよびオリゴヌクレオチドが用いられ
る請求項１または２記載の方法。 - 【請求項４】 プライマーおよびオリゴヌクレオチドに
ついて別々の標識を使用する請求項１〜３のいずれか１
項記載の方法。 - 【請求項５】 特異的結合対の一方が伸長生成物に関す
る標識として使用され、他方が固相に結合され、この固
相上でオリゴヌクレオチドとのハイブリダイゼーション
が行われる請求項１〜４のいずれか１項記載の方法。 - 【請求項６】 プライマーが１５〜５０ヌクレオチド長
さである請求項１〜５のいずれか１項記載の方法。
Applications Claiming Priority (4)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DE4032024.3 | 1990-10-09 | ||
| DE4032024 | 1990-10-09 | ||
| DE4038804.2 | 1990-12-05 | ||
| DE4038804A DE4038804A1 (de) | 1990-10-09 | 1990-12-05 | Verfahren zur genus- oder/und spezies-spezifischen detektion von bakterien in einer probenfluessigkeit |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH04258299A JPH04258299A (ja) | 1992-09-14 |
| JPH0640839B2 true JPH0640839B2 (ja) | 1994-06-01 |
Family
ID=25897574
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP3257519A Expired - Lifetime JPH0640839B2 (ja) | 1990-10-09 | 1991-10-04 | 試料液中の細菌の属特異的または／および種特異的検出方法 |
Country Status (7)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US6225094B1 (ja) |
| EP (1) | EP0480289B1 (ja) |
| JP (1) | JPH0640839B2 (ja) |
| AT (1) | ATE150092T1 (ja) |
| CA (1) | CA2052668C (ja) |
| DE (2) | DE4038804A1 (ja) |
| ES (1) | ES2101706T3 (ja) |
Families Citing this family (10)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US6001564A (en) * | 1994-09-12 | 1999-12-14 | Infectio Diagnostic, Inc. | Species specific and universal DNA probes and amplification primers to rapidly detect and identify common bacterial pathogens and associated antibiotic resistance genes from clinical specimens for routine diagnosis in microbiology laboratories |
| FR2730234B1 (fr) * | 1995-02-08 | 1997-03-28 | Bio Merieux | Detection de bacteries du genre listeria selon des techniques d'hybridation de sondes nucleiques |
| US5994079A (en) | 1998-02-06 | 1999-11-30 | Digene Corporation | Direct detection of RNA mediated by reverse transcriptase lacking RNAse H function |
| US7399589B2 (en) | 1998-02-06 | 2008-07-15 | Digene Corporation | Immunological detection of RNA:DNA hybrids on microarrays |
| US6468743B1 (en) * | 1998-05-18 | 2002-10-22 | Conagra Grocery Products Company | PCR techniques for detecting microbial contaminants in foodstuffs |
| AU4427100A (en) * | 1999-05-14 | 2000-12-05 | Enterprise Ireland Trading As Bioresearch Ireland | Nucleic acid probe-based diagnostic assays for prokaryotic and eukaryotic organisms |
| AU5371099A (en) * | 1999-07-22 | 2001-02-13 | Artus Gesellschaft Fur Molekularbiologische Diagnostik Und Entwicklung Mbh | Method for the species-specific detection of organisms |
| US20050050101A1 (en) * | 2003-01-23 | 2005-03-03 | Vockley Joseph G. | Identification and use of informative sequences |
| WO2007044091A2 (en) * | 2005-06-02 | 2007-04-19 | Fluidigm Corporation | Analysis using microfluidic partitioning devices |
| WO2013177206A2 (en) | 2012-05-21 | 2013-11-28 | Fluidigm Corporation | Single-particle analysis of particle populations |
Family Cites Families (8)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4683195A (en) * | 1986-01-30 | 1987-07-28 | Cetus Corporation | Process for amplifying, detecting, and/or-cloning nucleic acid sequences |
| WO1988003957A1 (en) * | 1986-11-24 | 1988-06-02 | Gen-Probe Incorporated | Nucleic acid probes for detection and/or quantitation of non-viral organisms |
| AU622104B2 (en) * | 1987-03-11 | 1992-04-02 | Sangtec Molecular Diagnostics Ab | Method of assaying of nucleic acids, a reagent combination and kit therefore |
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