JPH0640926A - Ｃ型肝炎ウイルスの除去方法 - Google Patents
Ｃ型肝炎ウイルスの除去方法Info
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- JPH0640926A JPH0640926A JP4218496A JP21849692A JPH0640926A JP H0640926 A JPH0640926 A JP H0640926A JP 4218496 A JP4218496 A JP 4218496A JP 21849692 A JP21849692 A JP 21849692A JP H0640926 A JPH0640926 A JP H0640926A
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Abstract
(57)【要約】
【目的】 血漿または血清からＣ型肝炎ウイルス（ＨＣ
Ｖ）を除去する方法を提供する。 【構成】 血漿または血清に二価の金属イオンを添加
し、ポリアニオン化合物を添加、攪拌し、得られる沈澱
を除去することにより、簡便にＨＣＶを除去することが
できる。
Ｖ）を除去する方法を提供する。 【構成】 血漿または血清に二価の金属イオンを添加
し、ポリアニオン化合物を添加、攪拌し、得られる沈澱
を除去することにより、簡便にＨＣＶを除去することが
できる。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、血漿または血清からの
Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）の除去方法に関するもので
ある。
Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）の除去方法に関するもので
ある。
【０００２】
【発明の背景と従来技術】ウイルス性肝炎には、飲料水
など経口的に感染するもの（Ａ型肝炎及びＥ型肝炎）
と、輸血や性交渉などを通じて感染するもの（Ｂ型肝炎
及びＣ型肝炎）のタイプがある。後者の輸血で感染する
タイプは特に輸血後肝炎と呼ばれ、慢性化しやすく肝細
胞ガンの危険因子となりやすいことから注目を集めてき
た。この原因ウイルスと見られるのがＢ型肝炎ウイルス
（ＨＢＶ）とＣ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）である。Ｂ型
肝炎は、その原因ウイルスであるＨＢＶについて、早く
からウイルス粒子が確認され、ワクチンも実用化してい
る。また、献血時の検査体制もいち早く完成をみてい
る。一方、Ｃ型肝炎についてはつい最近まで、病原体が
不明であったため、その抗原及び抗体の検出法として
は、非Ａ非Ｂ型肝炎として除外診断に頼らざるを得なか
った。しかしながら、米国Ｃｈｉｒｏｎ社のＣｈｏｏら
（Science, 244, p359, (1989)）によりＨＣＶのｃＤＮ
Ａが分離されて以来、ＨＣ及びＨＣＶに関する研究が急
速に進み、多くの知見が集積されつつある。
など経口的に感染するもの（Ａ型肝炎及びＥ型肝炎）
と、輸血や性交渉などを通じて感染するもの（Ｂ型肝炎
及びＣ型肝炎）のタイプがある。後者の輸血で感染する
タイプは特に輸血後肝炎と呼ばれ、慢性化しやすく肝細
胞ガンの危険因子となりやすいことから注目を集めてき
た。この原因ウイルスと見られるのがＢ型肝炎ウイルス
（ＨＢＶ）とＣ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）である。Ｂ型
肝炎は、その原因ウイルスであるＨＢＶについて、早く
からウイルス粒子が確認され、ワクチンも実用化してい
る。また、献血時の検査体制もいち早く完成をみてい
る。一方、Ｃ型肝炎についてはつい最近まで、病原体が
不明であったため、その抗原及び抗体の検出法として
は、非Ａ非Ｂ型肝炎として除外診断に頼らざるを得なか
った。しかしながら、米国Ｃｈｉｒｏｎ社のＣｈｏｏら
（Science, 244, p359, (1989)）によりＨＣＶのｃＤＮ
Ａが分離されて以来、ＨＣ及びＨＣＶに関する研究が急
速に進み、多くの知見が集積されつつある。
【０００３】ＨＣＶ−ＲＮＡからイムノスクリーニング
法で得られた種々のエピトープから遺伝子組換えまたは
化学合成により得られたペプチドを用いたＨＣＶ抗体検
出系が開発され、その一部は実用に供されている。日本
赤十字社では１９８９年１１月よりＣ１００−３抗原を
用いたＯｒｔｈｏ社のＨＣ抗体検出用キットによる輸血
用血液のスクリーニングを世界に先駆けて開始した。１
９９０年１１月までの供血者約８００万人の検体を対象
に測定した結果、ＨＣＶ抗体陽性者の比率は1.15％であ
り、高齢者ほど陽性率は高かった。この成績から年齢構
成による修正を行なうと、国内のＨＣＶ陽性者数は約１
７０万人、国民の1.41％と推定されている。
法で得られた種々のエピトープから遺伝子組換えまたは
化学合成により得られたペプチドを用いたＨＣＶ抗体検
出系が開発され、その一部は実用に供されている。日本
赤十字社では１９８９年１１月よりＣ１００−３抗原を
用いたＯｒｔｈｏ社のＨＣ抗体検出用キットによる輸血
用血液のスクリーニングを世界に先駆けて開始した。１
９９０年１１月までの供血者約８００万人の検体を対象
に測定した結果、ＨＣＶ抗体陽性者の比率は1.15％であ
り、高齢者ほど陽性率は高かった。この成績から年齢構
成による修正を行なうと、国内のＨＣＶ陽性者数は約１
７０万人、国民の1.41％と推定されている。
【０００４】当該スクリーニングによりＨＣＶ抗体陽性
と判定された血液は、輸血用としてはもとより、血液製
剤の原料としても使用することが禁じられている。しか
しながら、日本と米国で流行している株間に抗原性の差
異があるため、当該ＨＣ抗体検出用キットでは、日本の
ＨＣ患者血清の全てを検出できないことが明らかになっ
ている（日本肝臓学会1990年）。
と判定された血液は、輸血用としてはもとより、血液製
剤の原料としても使用することが禁じられている。しか
しながら、日本と米国で流行している株間に抗原性の差
異があるため、当該ＨＣ抗体検出用キットでは、日本の
ＨＣ患者血清の全てを検出できないことが明らかになっ
ている（日本肝臓学会1990年）。
【０００５】従って、Ｃ型肝炎の感染を未然に防ぐた
め、輸血用血液及び各種血液製剤はもちろんのこと、安
全性の面から精度管理用血清等からもＨＣＶを完全に除
去することが強く望まれている。
め、輸血用血液及び各種血液製剤はもちろんのこと、安
全性の面から精度管理用血清等からもＨＣＶを完全に除
去することが強く望まれている。
【０００６】ＨＣＶの除去法としては、高分子多層構造
膜（ＢＭＭ、旭化成工業）を利用した限外濾過法が知ら
れている。ＢＭＭは血漿分画製剤とりわけ凝固因子製剤
からのＨＣＶ除去法として実用化されているが、これは
凝固因子精製の最終段階で使用されており、高濃度の蛋
白を含む大量の血漿または血清からＨＣＶを除去するの
には適していない。
膜（ＢＭＭ、旭化成工業）を利用した限外濾過法が知ら
れている。ＢＭＭは血漿分画製剤とりわけ凝固因子製剤
からのＨＣＶ除去法として実用化されているが、これは
凝固因子精製の最終段階で使用されており、高濃度の蛋
白を含む大量の血漿または血清からＨＣＶを除去するの
には適していない。
【０００７】
【発明の目的】本発明はＨＣＶを含有する血漿または血
清から効率的に、かつ簡便にＨＣＶを除去することを目
的とする。また組織培養法または遺伝子組換え体から得
られたＨＣＶまたはその構成成分とりわけエンベロープ
蛋白の分画にも応用が可能であろう。本発明は、特別の
機器を必要とせず極めて安価に、かつ多量の血漿または
血清からＨＣＶを除去できるところに特徴を有するもの
である。
清から効率的に、かつ簡便にＨＣＶを除去することを目
的とする。また組織培養法または遺伝子組換え体から得
られたＨＣＶまたはその構成成分とりわけエンベロープ
蛋白の分画にも応用が可能であろう。本発明は、特別の
機器を必要とせず極めて安価に、かつ多量の血漿または
血清からＨＣＶを除去できるところに特徴を有するもの
である。
【０００８】
【発明の構成】本発明のＨＣＶの除去方法は、下記のよ
うにして極めて簡便に行うことができる。まず、血漿又
は血清に二価金属イオンを溶解し、ついでポリアニオン
化合物を添加、攪拌し、一夜冷房に静置後、冷却遠心
し、沈澱を除去することにより、達成できる。ここで、
本発明に用いられるポリアニオン化合物の代表例として
は、ヘパリン、デキストラン硫酸、コンドロイチン硫
酸、コンドロイチンポリ硫酸、ヘパラン酸、アミロペク
チン硫酸、ケラタン硫酸、ヘパリチン硫酸、キシラン硫
酸、カロニン硫酸、セルロース硫酸、キチン硫酸、キト
サン硫酸、ペクチン硫酸、イヌリン硫酸、アルギン酸硫
酸、グリコーゲン硫酸、ポリラクトース硫酸、カラゲニ
ン硫酸、デンプン硫酸、ポリグルコース硫酸、ラミナリ
ン硫酸、ガラクタン硫酸、レバン硫酸、メペサルフェー
トなどの硫酸多糖体、リンタングステン酸、ポリ硫酸化
アネトール、ポリビニルアルコール硫酸、ポリリン酸等
があげられる。また共存させる二価金属イオンとして
は、カルシウム、マグネシウム、マンガン、コバルト等
のイオンが使用可能である。
うにして極めて簡便に行うことができる。まず、血漿又
は血清に二価金属イオンを溶解し、ついでポリアニオン
化合物を添加、攪拌し、一夜冷房に静置後、冷却遠心
し、沈澱を除去することにより、達成できる。ここで、
本発明に用いられるポリアニオン化合物の代表例として
は、ヘパリン、デキストラン硫酸、コンドロイチン硫
酸、コンドロイチンポリ硫酸、ヘパラン酸、アミロペク
チン硫酸、ケラタン硫酸、ヘパリチン硫酸、キシラン硫
酸、カロニン硫酸、セルロース硫酸、キチン硫酸、キト
サン硫酸、ペクチン硫酸、イヌリン硫酸、アルギン酸硫
酸、グリコーゲン硫酸、ポリラクトース硫酸、カラゲニ
ン硫酸、デンプン硫酸、ポリグルコース硫酸、ラミナリ
ン硫酸、ガラクタン硫酸、レバン硫酸、メペサルフェー
トなどの硫酸多糖体、リンタングステン酸、ポリ硫酸化
アネトール、ポリビニルアルコール硫酸、ポリリン酸等
があげられる。また共存させる二価金属イオンとして
は、カルシウム、マグネシウム、マンガン、コバルト等
のイオンが使用可能である。
【０００９】硫酸多糖体を始めとするポリアニオン化合
物は二価金属イオンの存在下、リポ蛋白特に低密度リポ
蛋白（ＬＤＬ）及び超低密度リポ蛋白（ＶＬＤＬ）と結
合し、沈澱を形成することが知られている。沈澱を生ず
るメカニズムについては、ポリアニオンの負電荷と蛋白
の正電荷によって、可溶性のリポ蛋白−ポリアニオン複
合体を生じ、リポ蛋白中の脂質成分に二価の金属イオン
が結合して不溶性のリポ蛋白−ポリアニオン−金属イオ
ン複合体を形成するとされている。この現象を応用して
血漿または血清中のＬＤＬ及びＶＬＤＬを沈澱させ、上
清に残った高密度リポ蛋白（ＨＤＬ）を測定する方法は
臨床検査に広く利用されている。本発明者らはＨＣＶの
分離、除去を目的として、上述の分離法を基に鋭意研究
を重ねた結果、ＨＣＶを含む血漿または血清から効率的
にＨＣＶを分離しうる技術を提供する本発明を完成する
に至った。
物は二価金属イオンの存在下、リポ蛋白特に低密度リポ
蛋白（ＬＤＬ）及び超低密度リポ蛋白（ＶＬＤＬ）と結
合し、沈澱を形成することが知られている。沈澱を生ず
るメカニズムについては、ポリアニオンの負電荷と蛋白
の正電荷によって、可溶性のリポ蛋白−ポリアニオン複
合体を生じ、リポ蛋白中の脂質成分に二価の金属イオン
が結合して不溶性のリポ蛋白−ポリアニオン−金属イオ
ン複合体を形成するとされている。この現象を応用して
血漿または血清中のＬＤＬ及びＶＬＤＬを沈澱させ、上
清に残った高密度リポ蛋白（ＨＤＬ）を測定する方法は
臨床検査に広く利用されている。本発明者らはＨＣＶの
分離、除去を目的として、上述の分離法を基に鋭意研究
を重ねた結果、ＨＣＶを含む血漿または血清から効率的
にＨＣＶを分離しうる技術を提供する本発明を完成する
に至った。
【００１０】上記の処理によりＨＣＶが除去されたこと
を確認する方法として、上清、及びシュウ酸ナトリウム
液で溶解した沈澱について、ＰＣＲ法並びに電気泳動法
を適用することによってＨＣＶの有無の判定ができる。
を確認する方法として、上清、及びシュウ酸ナトリウム
液で溶解した沈澱について、ＰＣＲ法並びに電気泳動法
を適用することによってＨＣＶの有無の判定ができる。
【００１１】ＨＣＶ−ｃＤＮＡの増幅にはＡｍｐｌｉ−
ｔａｑポリメラーゼ及びＮＣＲ１〜４のプライマーを用
いダブルＰＣＲを行なう。すなわち、ＮＣＲ１及び４の
外側のプライマーセットを用い１ｓｔＰＣＲを行い、つ
いでその一部を試料としてＮＣＲ２及び３の内側プライ
マーセットを用い２ｎｄＰＣＲを行なう。
ｔａｑポリメラーゼ及びＮＣＲ１〜４のプライマーを用
いダブルＰＣＲを行なう。すなわち、ＮＣＲ１及び４の
外側のプライマーセットを用い１ｓｔＰＣＲを行い、つ
いでその一部を試料としてＮＣＲ２及び３の内側プライ
マーセットを用い２ｎｄＰＣＲを行なう。
【００１２】この様にして増幅された各ＨＣＶ遺伝子断
片を電気泳動にかけ、１ｓｔＰＣＲ242bp，２ｎｄＰＣ
Ｒ145bpのバンドの有無で、サンプル中のＨＣＶ−ＲＮ
Ａの存在を判定する。その結果、本発明のＨＣＶ除去処
理後の上清はＨＣＶ−ＲＮＡ陰性であったが、沈澱画分
はＨＣＶ−ＲＮＡ陽性であった。この事は当該除去処理
を施すことにより、血漿又は血清中からＨＣＶが完全に
除去されたことを示している。
片を電気泳動にかけ、１ｓｔＰＣＲ242bp，２ｎｄＰＣ
Ｒ145bpのバンドの有無で、サンプル中のＨＣＶ−ＲＮ
Ａの存在を判定する。その結果、本発明のＨＣＶ除去処
理後の上清はＨＣＶ−ＲＮＡ陰性であったが、沈澱画分
はＨＣＶ−ＲＮＡ陽性であった。この事は当該除去処理
を施すことにより、血漿又は血清中からＨＣＶが完全に
除去されたことを示している。
【００１３】このように、本発明のＨＣＶの除去方法に
よって、血漿または血清中に存在するＨＣＶを極めて簡
便にかつ確実に除去することが可能となったのである。
本発明のＨＣＶ除去方法を、例えば、臨床検査において
利用度の高い精度管理用血清の製造工程に適用すると、
ＨＣＶ感染性粒子を含まない安全な精度管理用血清を簡
便にかつ安価に得ることができる。
よって、血漿または血清中に存在するＨＣＶを極めて簡
便にかつ確実に除去することが可能となったのである。
本発明のＨＣＶ除去方法を、例えば、臨床検査において
利用度の高い精度管理用血清の製造工程に適用すると、
ＨＣＶ感染性粒子を含まない安全な精度管理用血清を簡
便にかつ安価に得ることができる。
【００１４】
実施例１： デキストラン硫酸−塩化カルシウム処理 ＨＴＬＶ−Ｉ抗体、ＨＩＶ抗体及びＨＢｓ抗原いずれも
陰性で、ＨＣＶ抗体及びＨＣＶ−ＲＮＡ陽性の血清200m
lに塩化カルシウム1.11ｇを溶解し、攪拌しながらデキ
ストラン硫酸（ファルマシア）１０％溶液2.02mlを添加
した。一夜冷室に静置後、冷却遠心機（日立６ＰＲ−５
２）で4,000rpm、３０分遠心し、上清及び沈澱を得た。
陰性で、ＨＣＶ抗体及びＨＣＶ−ＲＮＡ陽性の血清200m
lに塩化カルシウム1.11ｇを溶解し、攪拌しながらデキ
ストラン硫酸（ファルマシア）１０％溶液2.02mlを添加
した。一夜冷室に静置後、冷却遠心機（日立６ＰＲ−５
２）で4,000rpm、３０分遠心し、上清及び沈澱を得た。
【００１５】実施例２： ヘパリンナトリウム−塩化マ
ンガン処理 ＨＴＬＶ−Ｉ抗体、ＨＩＶ抗体及びＨＢｓ抗原いずれも
陰性で、ＨＣＶ抗体及びＨＣＶ−ＲＮＡ陽性の血清200m
lに塩化マンガン1.98ｇを溶解し、攪拌しながらヘパリ
ンナトリウム（和光純薬）１０％溶液4.04mlを添加し
た。以下、実施例１と同様に処理し、上清及び沈澱を得
た。
ンガン処理 ＨＴＬＶ−Ｉ抗体、ＨＩＶ抗体及びＨＢｓ抗原いずれも
陰性で、ＨＣＶ抗体及びＨＣＶ−ＲＮＡ陽性の血清200m
lに塩化マンガン1.98ｇを溶解し、攪拌しながらヘパリ
ンナトリウム（和光純薬）１０％溶液4.04mlを添加し
た。以下、実施例１と同様に処理し、上清及び沈澱を得
た。
【００１６】実施例３： リンタングステン酸−塩化マ
グネシウム処理 ＨＴＬＶ−Ｉ抗体、ＨＩＶ抗体及びＨＢｓ抗原いずれも
陰性で、ＨＣＶ抗体及びＨＣＶ−ＲＮＡ陽性の血清200m
lに塩化マグネシウム６水和物2.03ｇを溶解し、攪拌し
ながらリンタグステン酸（和光純薬）１０％溶液8.08ml
を添加した。以下、実施例１と同様に処理し、上清及び
沈澱を得た。
グネシウム処理 ＨＴＬＶ−Ｉ抗体、ＨＩＶ抗体及びＨＢｓ抗原いずれも
陰性で、ＨＣＶ抗体及びＨＣＶ−ＲＮＡ陽性の血清200m
lに塩化マグネシウム６水和物2.03ｇを溶解し、攪拌し
ながらリンタグステン酸（和光純薬）１０％溶液8.08ml
を添加した。以下、実施例１と同様に処理し、上清及び
沈澱を得た。
【００１７】実施例４： ＨＣＶ除去確認試験 (１)シュウ酸ナトリウム溶解 実施例１，２及び３で得られた沈澱画分に0.1Ｍシュウ
酸ナトリウム１０mlを加え、沈澱が溶解するまで強く振
とうした。ＤＥＡＥデキストラン（ファルマシア）１０
％溶液を２５％v/v添加し、攪拌後一夜冷室に静置し
た。冷却遠心機で4,000rpm、２０分遠心後、上清を静か
に吸引し採取した。生理食塩水に透析し、脂質画分とし
た。
酸ナトリウム１０mlを加え、沈澱が溶解するまで強く振
とうした。ＤＥＡＥデキストラン（ファルマシア）１０
％溶液を２５％v/v添加し、攪拌後一夜冷室に静置し
た。冷却遠心機で4,000rpm、２０分遠心後、上清を静か
に吸引し採取した。生理食塩水に透析し、脂質画分とし
た。
【００１８】(２)検体溶液調製 実施例１、２、３及び４(１)で得られた上清及び沈澱処
理溶液各々５０μｌに５０％グアニヂンチオシアネイト
及び0.5Ｍ ２−メルカプトエタノールを含む0.75Ｍクエ
ン酸緩衝液（ｐＨ7.0）500μｌを加え、攪拌した後、２
Ｍ酢酸ナトリウム５０μｌ及びクロロホルム／イソアミ
ルアルコール（４９：１）100μｌを加え、攪拌した。
氷中で１５分間冷却した後、超遠心機（Ｔｏｍｙ ＭＣ
−１５０）を用いて15,000rpm、３０分超遠心を行な
い、水層を採取した。これにグリコーゲン２μｌを加え
攪拌した後、２−プロパノール600μｌを添加し、攪拌
した。零下２０℃に１時間静置後、同様に15,000rpm、
３０分超遠心し、ＲＮＡペレットを得た。ペレットを減
圧下、５５℃で乾燥後、脱イオン水１０μｌを加えて溶
解し、検体溶液とした。
理溶液各々５０μｌに５０％グアニヂンチオシアネイト
及び0.5Ｍ ２−メルカプトエタノールを含む0.75Ｍクエ
ン酸緩衝液（ｐＨ7.0）500μｌを加え、攪拌した後、２
Ｍ酢酸ナトリウム５０μｌ及びクロロホルム／イソアミ
ルアルコール（４９：１）100μｌを加え、攪拌した。
氷中で１５分間冷却した後、超遠心機（Ｔｏｍｙ ＭＣ
−１５０）を用いて15,000rpm、３０分超遠心を行な
い、水層を採取した。これにグリコーゲン２μｌを加え
攪拌した後、２−プロパノール600μｌを添加し、攪拌
した。零下２０℃に１時間静置後、同様に15,000rpm、
３０分超遠心し、ＲＮＡペレットを得た。ペレットを減
圧下、５５℃で乾燥後、脱イオン水１０μｌを加えて溶
解し、検体溶液とした。
【００１９】(３)ｃＤＮＡ合成 375mMＫＣｌ及び１５mMＭｇＣｌ2を含む250mMトリス塩
酸緩衝液（pH8.3）４μｌにｄＡＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＣ
ＴＰ、ｄＧＴＰ（いずれも宝酒造）の等量混合液（以下
ｄＮＴＰｓ）0.4μｌ、ランダムプライマー（宝酒造）
１μｌ、、ＲＮａｓｅインヒビター（宝酒造）0.2μ
ｌ、Ｍ−ＭＬＶリバーストランスクリプターゼ（ＢＲ
Ｌ）１μｌ及び脱イオン水3.4μｌを加え、ｃＤＮＡ合
成用混合液を調製した。実施例４(２)で得られた各検体
溶液１０μｌを６５℃で５分間加温した後、ｃＤＮＡ合
成用混合液１０μｌ加え、３７℃で９０分間加温し、ｃ
ＤＮＡを合成した。
酸緩衝液（pH8.3）４μｌにｄＡＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＣ
ＴＰ、ｄＧＴＰ（いずれも宝酒造）の等量混合液（以下
ｄＮＴＰｓ）0.4μｌ、ランダムプライマー（宝酒造）
１μｌ、、ＲＮａｓｅインヒビター（宝酒造）0.2μ
ｌ、Ｍ−ＭＬＶリバーストランスクリプターゼ（ＢＲ
Ｌ）１μｌ及び脱イオン水3.4μｌを加え、ｃＤＮＡ合
成用混合液を調製した。実施例４(２)で得られた各検体
溶液１０μｌを６５℃で５分間加温した後、ｃＤＮＡ合
成用混合液１０μｌ加え、３７℃で９０分間加温し、ｃ
ＤＮＡを合成した。
【００２０】(４)ＰＣＲ法 500mMＫＣｌ、15mMＭｇＣｌ2、0.2％ＢＳＡを含む100mM
トリス塩酸緩衝液（ｐＨ8.3）５μｌにｄＮＴＰｓ0.2μ
ｌ、Ｔａｑポリメラーゼ （宝酒造）、プライマー Ｎ
ＣＲ−１（ＨＣＶ−ＲＮＡの７〜２６bpに相補的な合成
ＤＮＡ、自家製、以下同）及びＮＣＲ−４（同229〜248
bpに相補的）の等量混合液0.2μｌ及び脱イオン水39.1
μｌを加えて１ｓｔＰＣＲ用混合液とした。実施例４
(３)で得られた各ｃＤＮＡ溶液５μｌを小エッペンドル
フチューブにとり、１ｓｔＰＣＲ用混合液４５μｌを加
え混合した。蒸発を防ぐためにミネラルオイル２滴を滴
下した後、プログラムコントロールシステムＰＣ−７０
０（アステック）を用い、３５サイクルのＤＮＡ増幅を
行なった（１ｓｔＰＣＲ）。
トリス塩酸緩衝液（ｐＨ8.3）５μｌにｄＮＴＰｓ0.2μ
ｌ、Ｔａｑポリメラーゼ （宝酒造）、プライマー Ｎ
ＣＲ−１（ＨＣＶ−ＲＮＡの７〜２６bpに相補的な合成
ＤＮＡ、自家製、以下同）及びＮＣＲ−４（同229〜248
bpに相補的）の等量混合液0.2μｌ及び脱イオン水39.1
μｌを加えて１ｓｔＰＣＲ用混合液とした。実施例４
(３)で得られた各ｃＤＮＡ溶液５μｌを小エッペンドル
フチューブにとり、１ｓｔＰＣＲ用混合液４５μｌを加
え混合した。蒸発を防ぐためにミネラルオイル２滴を滴
下した後、プログラムコントロールシステムＰＣ−７０
０（アステック）を用い、３５サイクルのＤＮＡ増幅を
行なった（１ｓｔＰＣＲ）。
【００２１】ついで、上記の緩衝液５μｌにｄＮＴＰｓ
0.2μｌ、Ｔａｑポリメラーゼ0.2μｌ、プライマーＮＣ
Ｒ−２（同４６〜６５bpに相補的）及びＮＣＲ−３（同
171〜190bpに相補的）の等量混合液0.5μｌを加え、２
ｎｄＰＣＲ用混合液とした。１ｓｔＰＣＲ反応液から１
μｌを小エッペンドルフチューブにとり、２ｎｄＰＣＲ
用混合液４９μｌを加え混合した。以下、１ｓｔＰＣＲ
と同様に操作し、２ｎｄＰＣＲを行なった。
0.2μｌ、Ｔａｑポリメラーゼ0.2μｌ、プライマーＮＣ
Ｒ−２（同４６〜６５bpに相補的）及びＮＣＲ−３（同
171〜190bpに相補的）の等量混合液0.5μｌを加え、２
ｎｄＰＣＲ用混合液とした。１ｓｔＰＣＲ反応液から１
μｌを小エッペンドルフチューブにとり、２ｎｄＰＣＲ
用混合液４９μｌを加え混合した。以下、１ｓｔＰＣＲ
と同様に操作し、２ｎｄＰＣＲを行なった。
【００２２】(５)電気泳動 ミニゲル電気泳動システムＭｕｐｉｄ−２（アドバン
ス）に２％アガロースゲル（0.089Ｍトリス−ホウ酸緩
衝液（pH7.3）２０mMＥＤＴＡ）を調製し、固化した
後、泳動槽に同緩衝液を満たした。実施例４(４)で得ら
れた検体（１ｓｔＰＣＲ反応液及び２ｎｄＰＣＲ反応
液）１０μｌに色素液ＭａｒｋｅｒＶ（半井）２μｌを
添加したものをアプライし、120Ｖで泳動した。マーカ
ーが中央から約１cmのところで泳動を止め、取り出した
ゲルを0.025％エチヂウムブロマイド蛍光染色液中で２
０分間振とうし、染色した。染色したゲルにＵＶランプ
を照射し、陽性コントロールと同じ位置にバンドが観察
されるか否かにより、検体中のＨＣＶ−ＲＮＡの存在を
判定した。その結果、図１及び図２、並びに表１に示し
たように、実施例１，２及び３で得られた沈澱について
はいずれも陽性コントロールと同じ位置にバンドが観察
されたのに対して、上清ではいずれの検体もバンドが観
察されなかった。これは、沈澱画分はＨＣＶ陽性、上清
はＨＣＶ陰性であることを意味し、本発明のポリアニオ
ン−金属塩処理を行うことにより、血清中のＨＣＶを沈
澱させ、容易にＨＣＶの除去が可能なことを示すもので
ある。
ス）に２％アガロースゲル（0.089Ｍトリス−ホウ酸緩
衝液（pH7.3）２０mMＥＤＴＡ）を調製し、固化した
後、泳動槽に同緩衝液を満たした。実施例４(４)で得ら
れた検体（１ｓｔＰＣＲ反応液及び２ｎｄＰＣＲ反応
液）１０μｌに色素液ＭａｒｋｅｒＶ（半井）２μｌを
添加したものをアプライし、120Ｖで泳動した。マーカ
ーが中央から約１cmのところで泳動を止め、取り出した
ゲルを0.025％エチヂウムブロマイド蛍光染色液中で２
０分間振とうし、染色した。染色したゲルにＵＶランプ
を照射し、陽性コントロールと同じ位置にバンドが観察
されるか否かにより、検体中のＨＣＶ−ＲＮＡの存在を
判定した。その結果、図１及び図２、並びに表１に示し
たように、実施例１，２及び３で得られた沈澱について
はいずれも陽性コントロールと同じ位置にバンドが観察
されたのに対して、上清ではいずれの検体もバンドが観
察されなかった。これは、沈澱画分はＨＣＶ陽性、上清
はＨＣＶ陰性であることを意味し、本発明のポリアニオ
ン−金属塩処理を行うことにより、血清中のＨＣＶを沈
澱させ、容易にＨＣＶの除去が可能なことを示すもので
ある。
【００２３】
【表１】
【図１】１ｓｔＰＣＲ反応により得られた各検体の電気
泳動結果を示す図である。
泳動結果を示す図である。
【図２】２ｎｄＰＣＲ反応により得られた各検体の電気
泳動結果を示す図である。
泳動結果を示す図である。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.5 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 // Ｃ１２Ｎ 15/51
Claims (3)
- 【請求項１】 血漿または血清に二価の金属イオン、並
びにポリアニオン化合物を添加し、攪拌後、得られる沈
澱を除去することからなるＣ型肝炎ウイルスの除去方
法。 - 【請求項２】 ポリアニオン化合物が、ヘパリン、デキ
ストラン硫酸、コンドロイチン硫酸、コンドロイチンポ
リ硫酸、ヘパラン酸、アミロペクチン硫酸などの硫酸多
糖体、リンタングステン酸、ポリリン酸より選択される
少なくとも１種の化合物である請求項１記載の除去方
法。 - 【請求項３】 二価の金属イオンが、カルシウム、マグ
ネシウム、マンガン、コバルトのイオンより選択される
少なくとも１種の金属イオンである請求項１記載の除去
方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP4218496A JPH0640926A (ja) | 1992-07-24 | 1992-07-24 | Ｃ型肝炎ウイルスの除去方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP4218496A JPH0640926A (ja) | 1992-07-24 | 1992-07-24 | Ｃ型肝炎ウイルスの除去方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH0640926A true JPH0640926A (ja) | 1994-02-15 |
Family
ID=16720847
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP4218496A Withdrawn JPH0640926A (ja) | 1992-07-24 | 1992-07-24 | Ｃ型肝炎ウイルスの除去方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH0640926A (ja) |
Cited By (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1998042392A1 (en) * | 1997-03-25 | 1998-10-01 | Kaneka Corporation | Adsorbent for eliminating hepatitis c virus, adsorber, and adsorption method |
| JP2009521413A (ja) * | 2005-12-13 | 2009-06-04 | エクステラ・アーベー | 血液からの病原性微生物、炎症性細胞または炎症性タンパク質の体外除去法 |
| US9408962B2 (en) | 2009-12-01 | 2016-08-09 | Exthera Medical Corporation | Methods for removing cytokines from blood with surface immobilized polysaccharides |
| US9669150B2 (en) | 2007-06-18 | 2017-06-06 | Exthera Medical Corporation | Device and method for restoration of the condition of blood |
| US11911551B2 (en) | 2016-03-02 | 2024-02-27 | Exthera Medical Corporation | Method for treating drug intoxication |
-
1992
- 1992-07-24 JP JP4218496A patent/JPH0640926A/ja not_active Withdrawn
Cited By (9)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1998042392A1 (en) * | 1997-03-25 | 1998-10-01 | Kaneka Corporation | Adsorbent for eliminating hepatitis c virus, adsorber, and adsorption method |
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| US9173989B2 (en) | 2005-12-13 | 2015-11-03 | Exthera Medical Corporation | Method for extracorporeal removal of a pathogenic microbe, an inflammatory cell or an inflammatory protein from blood |
| US9764077B2 (en) | 2005-12-13 | 2017-09-19 | Exthera Medical Corporation | Method for extracorporeal removal of pathogenic microbe, an inflammatory cell or an inflammatory protein from blood |
| US10188783B2 (en) | 2005-12-13 | 2019-01-29 | Exthera Medical Corporation | Method for extracorporeal removal of pathogenic microbe, an inflammatory cell or an inflammatory protein from blood |
| US9669150B2 (en) | 2007-06-18 | 2017-06-06 | Exthera Medical Corporation | Device and method for restoration of the condition of blood |
| US9408962B2 (en) | 2009-12-01 | 2016-08-09 | Exthera Medical Corporation | Methods for removing cytokines from blood with surface immobilized polysaccharides |
| US10086126B2 (en) | 2009-12-01 | 2018-10-02 | Exthera Medical Corporation | Methods for removing cytokines from blood with surface immobilized polysaccharides |
| US11911551B2 (en) | 2016-03-02 | 2024-02-27 | Exthera Medical Corporation | Method for treating drug intoxication |
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Legal Events
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|---|---|---|---|
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