JPH0641909B2 - カラー画像解析装置を用いた細胞の核酸量の顕微測光方法 - Google Patents
カラー画像解析装置を用いた細胞の核酸量の顕微測光方法Info
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- JPH0641909B2 JPH0641909B2 JP63047115A JP4711588A JPH0641909B2 JP H0641909 B2 JPH0641909 B2 JP H0641909B2 JP 63047115 A JP63047115 A JP 63047115A JP 4711588 A JP4711588 A JP 4711588A JP H0641909 B2 JPH0641909 B2 JP H0641909B2
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- cells
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- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N15/00—Investigating characteristics of particles; Investigating permeability, pore-volume or surface-area of porous materials
- G01N15/10—Investigating individual particles
- G01N15/14—Optical investigation techniques, e.g. flow cytometry
- G01N15/1468—Optical investigation techniques, e.g. flow cytometry with spatial resolution of the texture or inner structure of the particle
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- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Biochemistry (AREA)
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- Pathology (AREA)
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- Investigating Or Analysing Materials By Optical Means (AREA)
- Image Processing (AREA)
- Closed-Circuit Television Systems (AREA)
- Image Analysis (AREA)
Description
【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 この発明は、医学または生物学に用いられ、例えばがん
の早期発見などに好適なカラー画像解析装置を用いた細
胞の核酸量の顕微測光方法に関するものである。
の早期発見などに好適なカラー画像解析装置を用いた細
胞の核酸量の顕微測光方法に関するものである。
従来、細胞の核酸量解析を行なう方法として、フローサ
イトメトリー（Flow Cytometry）による方法が知られて
いる。これは核酸に螢光色素を標識した細胞が均一に浮
遊する溶液状の試料を細い管状ないし滴状の流れとして
高速で流し、この流れにレーザ光を照射して、細胞から
発する螢光強度と散乱光の角度を測定し、これらの測定
値に基づいて細胞の核酸量を速やかに解析するものであ
る。この方法は測定精度が高く、細胞周期（cell cvcl
e）の解析にも利用可能であり、最も信頼性のある方法
とされている。しかし、設備が高価なこと、比較的大量
の細胞が均一に浮遊する溶液状の試料でしか計測できな
いこと、螢光の減衰などから再度計測ができないことな
どから、現在のところその利用範囲は研究所等の特殊な
施設に限られ、臨床応用には到っていない。
イトメトリー（Flow Cytometry）による方法が知られて
いる。これは核酸に螢光色素を標識した細胞が均一に浮
遊する溶液状の試料を細い管状ないし滴状の流れとして
高速で流し、この流れにレーザ光を照射して、細胞から
発する螢光強度と散乱光の角度を測定し、これらの測定
値に基づいて細胞の核酸量を速やかに解析するものであ
る。この方法は測定精度が高く、細胞周期（cell cvcl
e）の解析にも利用可能であり、最も信頼性のある方法
とされている。しかし、設備が高価なこと、比較的大量
の細胞が均一に浮遊する溶液状の試料でしか計測できな
いこと、螢光の減衰などから再度計測ができないことな
どから、現在のところその利用範囲は研究所等の特殊な
施設に限られ、臨床応用には到っていない。
細胞の核酸量の解析を行なう別な方法としては顕微鏡を
用いる顕微螢光測光および顕微分光測光法がある。顕微
螢光測光法は核酸螢光染色を施した顕微鏡プレパラート
上の細胞が励起光を受けて発する螢光を顕微鏡を通して
光電子増倍管（フォトマル）で測るものである。理論的
にはフローサイトメトリーと類似するが、計測に時間を
要し、その間に励起光を受けた螢光が減衰すること、計
測する領域に顕微鏡を通過する螢光を絞り込む必要があ
るが、絞りを小さくするには限界があることなどから誤
差が生じ、測定精度に問題がある。
用いる顕微螢光測光および顕微分光測光法がある。顕微
螢光測光法は核酸螢光染色を施した顕微鏡プレパラート
上の細胞が励起光を受けて発する螢光を顕微鏡を通して
光電子増倍管（フォトマル）で測るものである。理論的
にはフローサイトメトリーと類似するが、計測に時間を
要し、その間に励起光を受けた螢光が減衰すること、計
測する領域に顕微鏡を通過する螢光を絞り込む必要があ
るが、絞りを小さくするには限界があることなどから誤
差が生じ、測定精度に問題がある。
一方、顕微分光測光法は、吸光度と溶質の濃度との間に
は比例関係が成立するという吸光光度計の理論（Lamber
t-Beerの法則）に基づいており、単色光を光源とする顕
微鏡を用いて核酸染色したプレパラート上の細胞の吸光
度を計測し、核酸を解析するものである。Lambert-Beer
の法則は対象が透明であり且つその中に吸光物質が均一
に分布していることを前提としている。しかし、顕微鏡
プレパラート上の細胞の核酸量を計測する場合、目的と
する核を取り囲む細胞質が必ずしも透明でないために、
非特異的に光が失われる（非特異的光損失）こと、また
核内の吸光物質（核酸）が不均一に分布することによる
誤差（分布誤差： Distributional Error）が生じるため、やはり精度に問
題が残る。このため現在では核酸染色色素に最も良く吸
収される波長と、ほとんど吸収されない波長の２波長の
光の吸光度を、微小な点で計測（焦点測光）し、それを
走査して集計算出する「２波長走査法」を用いて誤差を
なくす工夫がなされている。
は比例関係が成立するという吸光光度計の理論（Lamber
t-Beerの法則）に基づいており、単色光を光源とする顕
微鏡を用いて核酸染色したプレパラート上の細胞の吸光
度を計測し、核酸を解析するものである。Lambert-Beer
の法則は対象が透明であり且つその中に吸光物質が均一
に分布していることを前提としている。しかし、顕微鏡
プレパラート上の細胞の核酸量を計測する場合、目的と
する核を取り囲む細胞質が必ずしも透明でないために、
非特異的に光が失われる（非特異的光損失）こと、また
核内の吸光物質（核酸）が不均一に分布することによる
誤差（分布誤差： Distributional Error）が生じるため、やはり精度に問
題が残る。このため現在では核酸染色色素に最も良く吸
収される波長と、ほとんど吸収されない波長の２波長の
光の吸光度を、微小な点で計測（焦点測光）し、それを
走査して集計算出する「２波長走査法」を用いて誤差を
なくす工夫がなされている。
このように、顕微分光測光法はその測定誤差を少なくす
るために２波長走査法によって計測する必要があるが、
それでも計測走査スポット（焦点）を小さくするには限
界があり、どうしても多少の分布誤差の問題が残る（Re
sidual Distributional Error）。また、２波長の光の
吸光度を別々に２度しかも同一部位で計測することの技
術的な問題、計測点を走査しなければならないために時
間がかかるなどの解決すべき問題がある。
るために２波長走査法によって計測する必要があるが、
それでも計測走査スポット（焦点）を小さくするには限
界があり、どうしても多少の分布誤差の問題が残る（Re
sidual Distributional Error）。また、２波長の光の
吸光度を別々に２度しかも同一部位で計測することの技
術的な問題、計測点を走査しなければならないために時
間がかかるなどの解決すべき問題がある。
（課題を解決するための手段〕 このような問題を解決するためにこの発明は、カラーテ
レビジョンカメラと画像解析装置の組み合わせによっ
て、「カラー画像」測光の手段を用いるものである。
レビジョンカメラと画像解析装置の組み合わせによっ
て、「カラー画像」測光の手段を用いるものである。
カラーテレビジョンンカメラによって撮影されたデータ
がメモリに記憶され、順次読みだされて解析される。
がメモリに記憶され、順次読みだされて解析される。
第１図はこの発明の一実施例を示すブロック図である。
図において、１はフォイルゲン染色した細胞の顕微鏡標
本であり、チャンバースライドで腫瘍細胞を単層培養後
７０％エチルアルコールで固定し、フォイルゲル（Feul
gen）反応で核酸染色を施したものである。この標本１
は光源２、反射鏡３、コンデンサレンズ４、対物レンズ
５、接眼レンズ６等からなる光学式顕微鏡７に載置され
る。顕微鏡７の光学像はカラーテレビジョンカメラ８で
撮影され、縁（Ｇ）および青（Ｂ）のカラーマルチ画像
としてＡ／Ｄ変換器９および１０にそれぞれ入力され、
デジタル画像データに変換されてＧおよびＢごとに設け
た画像メモリ１１および１２に記憶される。この実施例
においては、画像メモリ１１および１２をそれぞれ５１
２×４８０の画素で２５６階調の濃淡が計測できるよう
に構成した。なお、顕微鏡７とカラーテレビジョンカメ
ラ８は一体に構成された３管式顕微鏡カラーテレビジョ
ンカメラを用いている。顕微鏡の光源、コンデンサレン
ズには顕微測光用に開発されたものを使用し、テレビジ
ョンカメラのＧおよびＢの撮像管にはそれぞれフォイル
ゲン染色の特異吸収光（緑色光565ｎｍ）および非吸収
光（青色光450ｎｍ）に合うように干渉フィルタが挿入
され調整されている。画像メモリ１１および１２のＧお
よびＢのデジタル画像データは読み出されて特異透過率
画像抽出処理部１３に入力され、フォイルゲン染色の特
異吸光域にある色成分のＧ画像と、非特異吸光域のある
色成分のＢ画像とについて、それぞれ次式に基づいてＧ
成分透過率画像TgとＢ成分透過率画像Tbを作成する。
図において、１はフォイルゲン染色した細胞の顕微鏡標
本であり、チャンバースライドで腫瘍細胞を単層培養後
７０％エチルアルコールで固定し、フォイルゲル（Feul
gen）反応で核酸染色を施したものである。この標本１
は光源２、反射鏡３、コンデンサレンズ４、対物レンズ
５、接眼レンズ６等からなる光学式顕微鏡７に載置され
る。顕微鏡７の光学像はカラーテレビジョンカメラ８で
撮影され、縁（Ｇ）および青（Ｂ）のカラーマルチ画像
としてＡ／Ｄ変換器９および１０にそれぞれ入力され、
デジタル画像データに変換されてＧおよびＢごとに設け
た画像メモリ１１および１２に記憶される。この実施例
においては、画像メモリ１１および１２をそれぞれ５１
２×４８０の画素で２５６階調の濃淡が計測できるよう
に構成した。なお、顕微鏡７とカラーテレビジョンカメ
ラ８は一体に構成された３管式顕微鏡カラーテレビジョ
ンカメラを用いている。顕微鏡の光源、コンデンサレン
ズには顕微測光用に開発されたものを使用し、テレビジ
ョンカメラのＧおよびＢの撮像管にはそれぞれフォイル
ゲン染色の特異吸収光（緑色光565ｎｍ）および非吸収
光（青色光450ｎｍ）に合うように干渉フィルタが挿入
され調整されている。画像メモリ１１および１２のＧお
よびＢのデジタル画像データは読み出されて特異透過率
画像抽出処理部１３に入力され、フォイルゲン染色の特
異吸光域にある色成分のＧ画像と、非特異吸光域のある
色成分のＢ画像とについて、それぞれ次式に基づいてＧ
成分透過率画像TgとＢ成分透過率画像Tbを作成する。
Ｔｇ＝Ｉｓ（ｇ）／Ｉｏ（ｇ）・・・・（１） Ｔｂ＝Ｉｓ（ｂ）／Ｉｏ（ｂ）・・・・（２） ここで、Is(g)，Is(b)は標本通過後の光量（特異吸光域
のある画像および吸光域のない画像）Io(g)，Io(b)は標
本への入射光量（背景画像）である。
のある画像および吸光域のない画像）Io(g)，Io(b)は標
本への入射光量（背景画像）である。
ついで、得られたＧ成分透過率画像TgとＢ成分画像Tbを
次式に基づいて除算するとともに、得られた特異透過率
画像を対数濃度変換してフォイルゲン染色の特異吸光画
像Ａとした。
次式に基づいて除算するとともに、得られた特異透過率
画像を対数濃度変換してフォイルゲン染色の特異吸光画
像Ａとした。
Ａ＝Ａｇ−Ａｂ・・・・・・・・・・（３） ＝−logＴｇ＋logＴｂ・・・・・・（４） ＝log（Ｔｂ／Ｔｇ）・・・・・・（５） ここでＡｇはＧ成分の吸光画像、ＡｂはＢ成分の吸光画
像である。
像である。
以上の画像処理で得たフォイルゲン染色特異吸光画像Ａ
には、細胞質と細胞核が共に含まれている。従ってこの
細胞質領域と核領域を区分して目的とする核に計測領域
を限定するために、特異透過率画像を領域区分処理部１
４に入力し、各画素毎にその画素と周囲の画素との濃淡
差の和を求めその差分和を当該画素の重みとして画像全
体の濃度分布を算出して各画素の濃度差に基づく重み付
けをする。即ち、細胞質の領域が広くてもその領域内の
濃度差がなければ重みが小さく、その分布は小さな値と
なり、細胞質と核との境界に対応する濃度には濃度差が
あるため重みが大きく、例えその領域はせまくても大き
な値となる。したがって、この濃度差和分布におけるピ
ークに対応する濃度値を閾値として、フォイルゲン染色
の特異透過率画像を２値化区分して核領域画像を得た。
このようにして得た核領域画像と特異吸光画像は濃淡値
計測処理部１５に入力されて、細胞核領域内の濃淡値が
計測される。計測にあたっては、核領域画像中の任意の
核を自動的に指定して、特異吸光画像中の指定した核領
域に含まれる各画素点（１個の核あたり1000個程度含ま
れる）の濃淡値を計測集計し、第２図に示すヒストグラ
ムを作成した。
には、細胞質と細胞核が共に含まれている。従ってこの
細胞質領域と核領域を区分して目的とする核に計測領域
を限定するために、特異透過率画像を領域区分処理部１
４に入力し、各画素毎にその画素と周囲の画素との濃淡
差の和を求めその差分和を当該画素の重みとして画像全
体の濃度分布を算出して各画素の濃度差に基づく重み付
けをする。即ち、細胞質の領域が広くてもその領域内の
濃度差がなければ重みが小さく、その分布は小さな値と
なり、細胞質と核との境界に対応する濃度には濃度差が
あるため重みが大きく、例えその領域はせまくても大き
な値となる。したがって、この濃度差和分布におけるピ
ークに対応する濃度値を閾値として、フォイルゲン染色
の特異透過率画像を２値化区分して核領域画像を得た。
このようにして得た核領域画像と特異吸光画像は濃淡値
計測処理部１５に入力されて、細胞核領域内の濃淡値が
計測される。計測にあたっては、核領域画像中の任意の
核を自動的に指定して、特異吸光画像中の指定した核領
域に含まれる各画素点（１個の核あたり1000個程度含ま
れる）の濃淡値を計測集計し、第２図に示すヒストグラ
ムを作成した。
第２図は培養した甲状腺未分化がん細胞株ＴＡ−１の各
核酸を前述の方法によって顕微鏡的に計測解析して求め
た核酸ヒストグラムであり、第３図は同じ細胞株につい
てフローサイトメータによって求めた核酸ヒストグラム
である。両図から明らかなように、今回提案する方法に
よって得られたヒストグラムは、細胞周期におけるG1お
よびG2＋Ｍ期において２峰性を示し、フローサイトメー
タによって得られた核酸ヒストグラムと略等しかった。
核酸を前述の方法によって顕微鏡的に計測解析して求め
た核酸ヒストグラムであり、第３図は同じ細胞株につい
てフローサイトメータによって求めた核酸ヒストグラム
である。両図から明らかなように、今回提案する方法に
よって得られたヒストグラムは、細胞周期におけるG1お
よびG2＋Ｍ期において２峰性を示し、フローサイトメー
タによって得られた核酸ヒストグラムと略等しかった。
なお、本実施例においては特異および非特異吸光画像と
して緑および青成分の画像を用いたが、核酸染色に応じ
て特異および非特異的に吸光する色成分の２画像であれ
ば同様に処理することができ、本実施例の色成分の画像
に限定されるものではない。
して緑および青成分の画像を用いたが、核酸染色に応じ
て特異および非特異的に吸光する色成分の２画像であれ
ば同様に処理することができ、本実施例の色成分の画像
に限定されるものではない。
以上説明したようにこの発明は、カラーテレビジョンカ
メラと画像処理装置を用いたので、顕微鏡標本上の細胞
のように、吸光物質が不均一に存在する場合でも、フロ
ーサイトメトリーに匹敵する細胞周期の解析が可能な精
度で核酸量の算出が簡単に行なえるようになり次のよう
な効果を有する。
メラと画像処理装置を用いたので、顕微鏡標本上の細胞
のように、吸光物質が不均一に存在する場合でも、フロ
ーサイトメトリーに匹敵する細胞周期の解析が可能な精
度で核酸量の算出が簡単に行なえるようになり次のよう
な効果を有する。
イ）テレビジョンカメラから画像解析装置に入力される
データはカラー画像データであり、１画像を微細な画素
点に分割して計測、解析処理するため、計測点を走査す
る必要がない。また、一個の核当たりに換算すると多数
の画素点に分割して計測でき、２波長走査法で計測焦点
面積をさらに微小にした場合と同等の精度が得られる。
即ち計測核領域の正確な区分が可能となり、計測焦点内
の分布誤差により生じる分布誤差がほとんど無視でき
る。
データはカラー画像データであり、１画像を微細な画素
点に分割して計測、解析処理するため、計測点を走査す
る必要がない。また、一個の核当たりに換算すると多数
の画素点に分割して計測でき、２波長走査法で計測焦点
面積をさらに微小にした場合と同等の精度が得られる。
即ち計測核領域の正確な区分が可能となり、計測焦点内
の分布誤差により生じる分布誤差がほとんど無視でき
る。
ロ）各計測焦点（画素）毎の計測値をカラーマルチデー
タとして入力処理するため、同一画素における任意の多
波長の吸光度を同時に計算できる。
タとして入力処理するため、同一画素における任意の多
波長の吸光度を同時に計算できる。
ハ）計測データを計測点の集合である画像のまま解析処
理（画像間演算）するため、高速処理が可能である。
理（画像間演算）するため、高速処理が可能である。
また顕微鏡永久標本上で正確な核酸ヒストグラムの解析
が可能となり、検体摂取量、処理法に制約がある一般の
臨床細胞診標本への応用についても十分に考えられる。
が可能となり、検体摂取量、処理法に制約がある一般の
臨床細胞診標本への応用についても十分に考えられる。
第１図はこの発明を適用した装置の一実施例を示すブロ
ック図、第２図はこの発明の方法によって求めた培養が
ん細胞の核酸ヒストグラム（出現頻度を表わすグラ
フ）、第３図はフローサイトメータによって求めた培養
がん細胞の核酸ヒストグラム（出現頻度を表わすグラ
フ）である。 １……顕微鏡標本、７……光学式顕微鏡、８……カラー
テレビジョンカメラ、９，１０……Ａ／Ｄ変換器、１１
……緑画像メモリ、１２……青画像メモリ、１３……特
異透過率画像抽出処理部、１４……領域区分処理部、１
５……濃淡値計測処理部。
ック図、第２図はこの発明の方法によって求めた培養が
ん細胞の核酸ヒストグラム（出現頻度を表わすグラ
フ）、第３図はフローサイトメータによって求めた培養
がん細胞の核酸ヒストグラム（出現頻度を表わすグラ
フ）である。 １……顕微鏡標本、７……光学式顕微鏡、８……カラー
テレビジョンカメラ、９，１０……Ａ／Ｄ変換器、１１
……緑画像メモリ、１２……青画像メモリ、１３……特
異透過率画像抽出処理部、１４……領域区分処理部、１
５……濃淡値計測処理部。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 古市 恒晃 東京都港区西新橋１丁目15番１号 日本ア ビオニクス株式会社内 (56)参考文献 特開 昭58−153144（ＪＰ，Ａ) 特開 昭61−226638（ＪＰ，Ａ)
Claims (1)
- 【請求項１】核酸に染色を施した顕微鏡標本中の核酸量
をカラー画像装置を用いることによって算出するカラー
画像解析装置を用いた細胞の核酸量の顕微測光方法にお
いて、 核酸染色を施した細胞の顕微鏡像をカラーテレビジョン
カメラで撮影して画像解析装置に入力しカラーマルチ画
像を作り出し、 その画像中で核酸染色の吸光域のある色成分と吸光域の
ない色成分とのそれぞれの画像を背景画像で画素毎に画
像間除算することによって輝度の減衰割合である透過率
の画像を作り出し、 この透過率画像間の演算処理を行ない核酸染色の特異透
過率画像を作り出し、 これを対数濃度変換して核酸染色特異吸光度画像を作り
出し、 核領域内の画素と周囲の画素とを２値区分して計測領域
を核に限定し、 核酸染色特異吸光画像の計測する核領域毎に含まれる画
素の濃淡値を計測し、 この計測値を集計して一つ一つの細胞の核酸相当量を算
出することを特徴とするカラー画像解析装置を用いた細
胞の核酸量の顕微測光方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP63047115A JPH0641909B2 (ja) | 1988-02-29 | 1988-02-29 | カラー画像解析装置を用いた細胞の核酸量の顕微測光方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP63047115A JPH0641909B2 (ja) | 1988-02-29 | 1988-02-29 | カラー画像解析装置を用いた細胞の核酸量の顕微測光方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH01219654A JPH01219654A (ja) | 1989-09-01 |
| JPH0641909B2 true JPH0641909B2 (ja) | 1994-06-01 |
Family
ID=12766174
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP63047115A Expired - Lifetime JPH0641909B2 (ja) | 1988-02-29 | 1988-02-29 | カラー画像解析装置を用いた細胞の核酸量の顕微測光方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH0641909B2 (ja) |
Families Citing this family (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US6519355B2 (en) * | 2001-03-28 | 2003-02-11 | Alan C. Nelson | Optical projection imaging system and method for automatically detecting cells having nuclear and cytoplasmic densitometric features associated with disease |
| JP5245424B2 (ja) | 2008-01-25 | 2013-07-24 | 日本電気株式会社 | 病理組織画像撮影システム、病理組織画像撮影方法、および病理組織画像撮影プログラム |
| JP5344073B2 (ja) * | 2012-09-14 | 2013-11-20 | 日本電気株式会社 | 病理組織画像撮影システム、病理組織画像撮影方法、および病理組織画像撮影プログラム |
| CN114869227B (zh) * | 2022-04-02 | 2025-09-05 | 北京信息科技大学 | 一种可穿戴式微型活体流式图像细胞仪 |
Family Cites Families (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS58153144A (ja) * | 1982-03-09 | 1983-09-12 | Nippon Kokan Kk <Nkk> | 反射率が異なる複数の組織を有する塊状物質における組織構成比率測定装置 |
| JPS61226638A (ja) * | 1985-03-30 | 1986-10-08 | Shimadzu Corp | 顕微鏡分光像形成装置 |
-
1988
- 1988-02-29 JP JP63047115A patent/JPH0641909B2/ja not_active Expired - Lifetime
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH01219654A (ja) | 1989-09-01 |
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| S531 | Written request for registration of change of domicile |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R313531 |
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