JPH0642833B2 - ヒト表皮細胞増殖因子の遺伝子 - Google Patents
ヒト表皮細胞増殖因子の遺伝子Info
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- JPH0642833B2 JPH0642833B2 JP59210502A JP21050284A JPH0642833B2 JP H0642833 B2 JPH0642833 B2 JP H0642833B2 JP 59210502 A JP59210502 A JP 59210502A JP 21050284 A JP21050284 A JP 21050284A JP H0642833 B2 JPH0642833 B2 JP H0642833B2
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- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/475—Growth factors; Growth regulators
- C07K14/485—Epidermal growth factor [EGF], i.e. urogastrone
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- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/70—Vectors or expression systems specially adapted for E. coli
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Description
【発明の詳細な説明】 産業上の利用分野 本発明は、ヒト表皮細胞増殖因子（ｈＥＧＦと略記）製
造のための組換えＤＮＡ技術に関する。より具体的には
ｈＥＧＦに対応する合成遺伝子およびそれを含むＤＮＡ
に関する。
造のための組換えＤＮＡ技術に関する。より具体的には
ｈＥＧＦに対応する合成遺伝子およびそれを含むＤＮＡ
に関する。
従来の技術 ｈＥＧＦは主として十二指腸や顎下線から分泌される５
３個のアミノ酸から成るポリペプチド・ホルモンであ
り、胃酸分泌抑制ならびに表皮細胞増殖促進作用を有す
る。ｈＥＧＦの胃酸抑制作用は十二指腸潰瘍の治療薬と
しての可能性を示すものである。さらにｈＥＧＦは細胞
の膜表面に存在するＥＧＦ受容体に結合して、多方面的
な生体反応を惹起せしめることが知られている〔Ｄ．Ｇ
ｏｓｐｏｄａｒｏｗｉｃｚ，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｐｈｙｓ
ｉｏｌ．４３ ２５１（１９８１）〕。ＥＧＦによつて
誘起される反応は腫瘍ウイルスの発癌遺伝子産物によつ
て誘発される反応と同一で、ＥＧＦの生体内での役割や
細胞増殖調節機構を解明することは発癌機構を探る上か
らも興味あることと考えられている。しかし、天然に存
在するｈＥＧＦは極めて微量であるため、組換えＤＮＡ
技術による生産が注目されるようになった。ｈＥＧＦ遺
伝子をヒトの組織から得る試みは種々の制約によつて極
めて困難なため、未だにｈＥＧＦのＤＮＡ配列は決定さ
れていない。
３個のアミノ酸から成るポリペプチド・ホルモンであ
り、胃酸分泌抑制ならびに表皮細胞増殖促進作用を有す
る。ｈＥＧＦの胃酸抑制作用は十二指腸潰瘍の治療薬と
しての可能性を示すものである。さらにｈＥＧＦは細胞
の膜表面に存在するＥＧＦ受容体に結合して、多方面的
な生体反応を惹起せしめることが知られている〔Ｄ．Ｇ
ｏｓｐｏｄａｒｏｗｉｃｚ，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｐｈｙｓ
ｉｏｌ．４３ ２５１（１９８１）〕。ＥＧＦによつて
誘起される反応は腫瘍ウイルスの発癌遺伝子産物によつ
て誘発される反応と同一で、ＥＧＦの生体内での役割や
細胞増殖調節機構を解明することは発癌機構を探る上か
らも興味あることと考えられている。しかし、天然に存
在するｈＥＧＦは極めて微量であるため、組換えＤＮＡ
技術による生産が注目されるようになった。ｈＥＧＦ遺
伝子をヒトの組織から得る試みは種々の制約によつて極
めて困難なため、未だにｈＥＧＦのＤＮＡ配列は決定さ
れていない。
一方、既に決定されているｈＥＧＦのアミノ酸配列
〔Ｈ．Ｇｒｅｇｏｒｙ，Ｎａｔｕｒｅ ２５７ ３２５
（′７５）〕を基にして、化学的に合成した構造遺伝子
を微生物において発現させる例は知られている。しか
し、ＥＧＦは比較的低分子のペプチドであり、菌体内で
異物として認識され、酵素分解され易い点を考慮して、
融合ペプチドとして発現させている〔Ｊ．Ｓｍｉｔｈ
ら，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ
１０ ４４６７（′８２）〕。また融合ペプチドから不
要部分を除去する方法も提案されているが、極めて不確
実なものにすぎない。（スチーブン・ジェームス・ブル
ウアーら、特開昭５８−２１６６９７）。ｈＥＧＦその
ものを発現させた例は酵母の系において知られているが
〔Ｍ．Ｓ．Ｕｒｄｅａら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａ
ｄ．ｓｃｉ．ＵＳＡ ８０，７４６１（′８３）〕、そ
の発現量は非常に低く、酵母の増殖速度が遅いことと相
まつて大量生産には適していない。
〔Ｈ．Ｇｒｅｇｏｒｙ，Ｎａｔｕｒｅ ２５７ ３２５
（′７５）〕を基にして、化学的に合成した構造遺伝子
を微生物において発現させる例は知られている。しか
し、ＥＧＦは比較的低分子のペプチドであり、菌体内で
異物として認識され、酵素分解され易い点を考慮して、
融合ペプチドとして発現させている〔Ｊ．Ｓｍｉｔｈ
ら，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ
１０ ４４６７（′８２）〕。また融合ペプチドから不
要部分を除去する方法も提案されているが、極めて不確
実なものにすぎない。（スチーブン・ジェームス・ブル
ウアーら、特開昭５８−２１６６９７）。ｈＥＧＦその
ものを発現させた例は酵母の系において知られているが
〔Ｍ．Ｓ．Ｕｒｄｅａら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａ
ｄ．ｓｃｉ．ＵＳＡ ８０，７４６１（′８３）〕、そ
の発現量は非常に低く、酵母の増殖速度が遅いことと相
まつて大量生産には適していない。
発明が解決しようとする問題点 上記のようにｈＥＧＦ遺伝子のＤＮＡ配列は未だ解明さ
れておらず、またｈＥＧＦのアミノ酸配列を基にして合
成した対応遺伝子を種々の系で発現させる試みもある
が、融合ペプチドとして発現させる方法ではその操作上
の煩雑さ、不要部分の除去の困難さ等があるし、また融
合ペプチドとせず直接、上記合成遺伝子を発現させた例
では、その生産量は極めて低く実用的なものではなかっ
た。
れておらず、またｈＥＧＦのアミノ酸配列を基にして合
成した対応遺伝子を種々の系で発現させる試みもある
が、融合ペプチドとして発現させる方法ではその操作上
の煩雑さ、不要部分の除去の困難さ等があるし、また融
合ペプチドとせず直接、上記合成遺伝子を発現させた例
では、その生産量は極めて低く実用的なものではなかっ
た。
問題点を解決するための手段 本発明者らはｈＥＧＦを効率よく生産させる方法を提供
すべく鋭意研究を重ねた結果、この目的に適したｈＥＧ
ＦのＤＮＡ配列を見出し、更に該遺伝子の製法、該遺伝
子を含む組換えＤＮＡ及びその製造法を確立し、本発明
を完成したものである。
すべく鋭意研究を重ねた結果、この目的に適したｈＥＧ
ＦのＤＮＡ配列を見出し、更に該遺伝子の製法、該遺伝
子を含む組換えＤＮＡ及びその製造法を確立し、本発明
を完成したものである。
ｈＥＧＦのＤＮＡ配列として従来採用されていたもの
は、大腸菌、酵母等の発現系に適したコドンからなるも
のであったが、このたび本発明者等はこのような人間と
はかなりかけ離れている発現系に適したコドンとは全く
異なった、人間により近いマウスのＥＧＦ（ｍＥＧＦ）
の遺伝子に注目して本発明を完成したものである。
は、大腸菌、酵母等の発現系に適したコドンからなるも
のであったが、このたび本発明者等はこのような人間と
はかなりかけ離れている発現系に適したコドンとは全く
異なった、人間により近いマウスのＥＧＦ（ｍＥＧＦ）
の遺伝子に注目して本発明を完成したものである。
ｈＥＧＦはマウスのそれ〔Ｊ．Ｓｃｏｔｔら、Ｓｃｉｅ
ｎｃｅ，２２１ ２３６（′８３）〕と比較すると、ア
ミノ酸配列において７０％の相同性があり、アミノ酸の
異なつている部分のその大部分はコドンのｏｎｅ ｐｏ
ｉｎｔ ｍｕｔａｔｉｏｎによつて導かれるものであ
る。すなわち、ｈＥＧＦ遺伝子のＤＮＡ配列はマウスの
それと極めて良く似ているものと推定される。一般にア
ミノ酸配列からＤＮＡ配列を導くと、コドンの縮重によ
つて多数のＤＮＡ配列が可能となる。そこで合成遺伝子
の配列を決定する基準として、発現系の細胞において最
も容認されたコドンを採用するのが通例となつている。
（池原森男ら、生命工学研究レポート ２，７（１９８
３）〕。
ｎｃｅ，２２１ ２３６（′８３）〕と比較すると、ア
ミノ酸配列において７０％の相同性があり、アミノ酸の
異なつている部分のその大部分はコドンのｏｎｅ ｐｏ
ｉｎｔ ｍｕｔａｔｉｏｎによつて導かれるものであ
る。すなわち、ｈＥＧＦ遺伝子のＤＮＡ配列はマウスの
それと極めて良く似ているものと推定される。一般にア
ミノ酸配列からＤＮＡ配列を導くと、コドンの縮重によ
つて多数のＤＮＡ配列が可能となる。そこで合成遺伝子
の配列を決定する基準として、発現系の細胞において最
も容認されたコドンを採用するのが通例となつている。
（池原森男ら、生命工学研究レポート ２，７（１９８
３）〕。
しかし最近の知見によると、原核生物において真核生物
の遺伝子を発現させても何ら支障はなく、ある場合には
発現系に適合させた遺伝子より効率がよい〔Ｍ．Ｈ．Ｃ
ａｒｕｔｈｅｒｓ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅ
ｓｅａｒｃｈ，Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ Ｓｅｒｉｅｓ １
１ １９７（′８２）〕。遺伝子の発現を高めるための
因子としては多くのものが挙げられるが、構造遺伝子に
対応するｍＲＮＡの安定性ならびに翻訳効率も重視され
る。この場合ｍＲＮＡの塩基配列が決定する高次構造が
重要な意味を持つと推定される。これらの点を考慮する
とｈＥＧＦ遺伝子のＤＮＡ配列をアミノ酸配列を変えな
い範囲でマウスのＥＧＦ遺伝子に類似させるべきであろ
う。実際にこの考え方でｈＥＧＦ遺伝子をデザインした
ところ、マウスのそれに対して９０％近い相同性を持た
せることが可能であった。しかし、目的とする遺伝子を
正確に構築するためには、さらにＤＮＡ鎖上における比
較的長い自己相補性のある存在あるいは二重鎖ＤＮＡ間
での正常でない相補性を最小限にすべきである。これら
の条件を満足させるためにコンピューターを利用して若
干の修正を施し、第１図に示すような、ｈＥＧＦの製造
に最も適した新規なＤＮＡ配列を見出した。第１図には
ＤＮＡ配列に加えてアミノ酸配列を示す。
の遺伝子を発現させても何ら支障はなく、ある場合には
発現系に適合させた遺伝子より効率がよい〔Ｍ．Ｈ．Ｃ
ａｒｕｔｈｅｒｓ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅ
ｓｅａｒｃｈ，Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ Ｓｅｒｉｅｓ １
１ １９７（′８２）〕。遺伝子の発現を高めるための
因子としては多くのものが挙げられるが、構造遺伝子に
対応するｍＲＮＡの安定性ならびに翻訳効率も重視され
る。この場合ｍＲＮＡの塩基配列が決定する高次構造が
重要な意味を持つと推定される。これらの点を考慮する
とｈＥＧＦ遺伝子のＤＮＡ配列をアミノ酸配列を変えな
い範囲でマウスのＥＧＦ遺伝子に類似させるべきであろ
う。実際にこの考え方でｈＥＧＦ遺伝子をデザインした
ところ、マウスのそれに対して９０％近い相同性を持た
せることが可能であった。しかし、目的とする遺伝子を
正確に構築するためには、さらにＤＮＡ鎖上における比
較的長い自己相補性のある存在あるいは二重鎖ＤＮＡ間
での正常でない相補性を最小限にすべきである。これら
の条件を満足させるためにコンピューターを利用して若
干の修正を施し、第１図に示すような、ｈＥＧＦの製造
に最も適した新規なＤＮＡ配列を見出した。第１図には
ＤＮＡ配列に加えてアミノ酸配列を示す。
該遺伝子は融合ペプチドとして発現させることもできる
し、融合ペプチドとせず、直接ｈＥＧＦとして発現する
こともできる。
し、融合ペプチドとせず、直接ｈＥＧＦとして発現する
こともできる。
前者の場合は、ｈＥＧＦの合成遺伝子の５′末端側に開
始コドンＡＴＧから始まるｈＥＧＦ以外の蛋白質をコー
ドするＤＮＡを配し、停止コドン（例えばＴＡＧ）で終
るか、または開始コドンＡＴＧから始まるｈＥＧＦ合成
遺伝子の３′末端側にｈＥＧＦ以外の蛋白質をコードす
るＤＮＡを配し、停止コドン（例えばＴＡＧ）で終って
もよい。
始コドンＡＴＧから始まるｈＥＧＦ以外の蛋白質をコー
ドするＤＮＡを配し、停止コドン（例えばＴＡＧ）で終
るか、または開始コドンＡＴＧから始まるｈＥＧＦ合成
遺伝子の３′末端側にｈＥＧＦ以外の蛋白質をコードす
るＤＮＡを配し、停止コドン（例えばＴＡＧ）で終って
もよい。
後者の直接発現に用いるには第２図に示すように、ｈＥ
ＧＦのポリペプチドをコードする配列に加えて開始コド
ンＡＴＧ，停止コドン例えばＴＡＧを各々５′側と３′
側に直接配し、また５′末端側と３′末端側はベクター
への挿入のために各々Ｅｃｏ ＲＩ，Ｂａｍ ＨＩ付着
末端とし、それ以外にも遺伝子操作上の多様性を持たせ
るために構造遺伝子の後半部にＢｇ１IIの認識部位を設
ける。また３′末端の下流にはＰｓｔ Ｉの認識部位を
設けることもできる。以上の修正を施すと、マウスのＥ
ＧＦ（ｍＥＧＦ）遺伝子に対して８０％の相同性とな
る。
ＧＦのポリペプチドをコードする配列に加えて開始コド
ンＡＴＧ，停止コドン例えばＴＡＧを各々５′側と３′
側に直接配し、また５′末端側と３′末端側はベクター
への挿入のために各々Ｅｃｏ ＲＩ，Ｂａｍ ＨＩ付着
末端とし、それ以外にも遺伝子操作上の多様性を持たせ
るために構造遺伝子の後半部にＢｇ１IIの認識部位を設
ける。また３′末端の下流にはＰｓｔ Ｉの認識部位を
設けることもできる。以上の修正を施すと、マウスのＥ
ＧＦ（ｍＥＧＦ）遺伝子に対して８０％の相同性とな
る。
本発明のｈＥＧＦ遺伝子の合成に当っては、例えば第２
図に示すように最終的にはｈＥＧＦ遺伝子を２２個のフ
ラグメントに分割したが、ここでフラグメントの自己会
合を避けるために、５′あるいは３′末端に自己相補的
配列が出現しないよう注意した。第３図に各ＤＮＡフラ
グメントを示す。このフラグメントへの分割の仕方は上
記自己会合を避ける等の注意をすれば、上記のものに限
定される必要はなく、種々の分け方が可能である。
図に示すように最終的にはｈＥＧＦ遺伝子を２２個のフ
ラグメントに分割したが、ここでフラグメントの自己会
合を避けるために、５′あるいは３′末端に自己相補的
配列が出現しないよう注意した。第３図に各ＤＮＡフラ
グメントを示す。このフラグメントへの分割の仕方は上
記自己会合を避ける等の注意をすれば、上記のものに限
定される必要はなく、種々の分け方が可能である。
各ＤＮＡフラグメント（＃１〜＃２２）は既知の合成法
に従って製造し得る。各フラグメントは必要に応じて
５′末端をポリヌクレオチドキナーゼでリン酸化し、２
乃至３群に分けてハイブリダイズさせＤＮＡリガーゼに
よって二重鎖ＤＮＡとする。さらに各群を再びＤＮＡリ
ガーゼで連結させることによって完全なｈＥＧＦ遺伝子
が得られた（第４図参照）。
に従って製造し得る。各フラグメントは必要に応じて
５′末端をポリヌクレオチドキナーゼでリン酸化し、２
乃至３群に分けてハイブリダイズさせＤＮＡリガーゼに
よって二重鎖ＤＮＡとする。さらに各群を再びＤＮＡリ
ガーゼで連結させることによって完全なｈＥＧＦ遺伝子
が得られた（第４図参照）。
これをｐＢＲ３２２のＥｃｏＲＩおよびＢａｍＨＩによ
る消化物と結合させ、新規プラスミドｐＴＢ３６１を
得、大腸菌ＤＨ１を形質転換する。単離したプラスミド
についてＤＮＡフラグメントの一部をプライマーとして
Ｓａｎｇｅｒ法によって塩基配列を決定し、目的とする
ｈＥＧＦ遺伝子の存在を確認する。
る消化物と結合させ、新規プラスミドｐＴＢ３６１を
得、大腸菌ＤＨ１を形質転換する。単離したプラスミド
についてＤＮＡフラグメントの一部をプライマーとして
Ｓａｎｇｅｒ法によって塩基配列を決定し、目的とする
ｈＥＧＦ遺伝子の存在を確認する。
本発明の合成遺伝子を発現するに際しては、プラスミ
ド、バクテリオファージなどのベクターに挿入した組換
えＤＮＡとして用いることが好ましい。
ド、バクテリオファージなどのベクターに挿入した組換
えＤＮＡとして用いることが好ましい。
上記組換えＤＮＡは前記した開始コドンＡＴＧの上流に
プロモーターを有しているのが好ましく、該プロモータ
ーは、形質転換体の製造に用いる宿主に対応して適切な
プロモーターであればいかなるものでもよい。
プロモーターを有しているのが好ましく、該プロモータ
ーは、形質転換体の製造に用いる宿主に対応して適切な
プロモーターであればいかなるものでもよい。
たとえば、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ；
例、２９４，Ｗ３１１０，ＤＨ１，Ｎ４８３０など）で
はｔｒｐプロモーター，ｌａｃプロモーター，ｒｅｃ
Ａプロモーター，λＰＬプロモーター，ｌｐｐプロモー
ター，など、枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌ
ｉｓ；例、ＭＩ １１４など）ではＳＰ０１プロモータ
ー，ＳＰ０２プロモーター，ｐｅｎＰ プロモーターな
ど、酵母（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉ
ｓｉａｅ；例、ＡＨ２２など）ではＰＨ０５プロモータ
ー，ＰＧＫプロモーター，ＧＡＰプロモーター，ＡＤＨ
プロモーターなど、動物細胞（例、サル細胞ＣＯＳ−
７，チャイニーズハムスター細胞ＣＨＯなど）ではＳＶ
４０由来のプロモーターなどが挙げられる。とりわけ宿
主が大腸菌でプロモーターがｔｒｐプロモーターまたは
λＰＬプロモーターであることが好ましい。
例、２９４，Ｗ３１１０，ＤＨ１，Ｎ４８３０など）で
はｔｒｐプロモーター，ｌａｃプロモーター，ｒｅｃ
Ａプロモーター，λＰＬプロモーター，ｌｐｐプロモー
ター，など、枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌ
ｉｓ；例、ＭＩ １１４など）ではＳＰ０１プロモータ
ー，ＳＰ０２プロモーター，ｐｅｎＰ プロモーターな
ど、酵母（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉ
ｓｉａｅ；例、ＡＨ２２など）ではＰＨ０５プロモータ
ー，ＰＧＫプロモーター，ＧＡＰプロモーター，ＡＤＨ
プロモーターなど、動物細胞（例、サル細胞ＣＯＳ−
７，チャイニーズハムスター細胞ＣＨＯなど）ではＳＶ
４０由来のプロモーターなどが挙げられる。とりわけ宿
主が大腸菌でプロモーターがｔｒｐプロモーターまたは
λＰＬプロモーターであることが好ましい。
ｈＥＧＦ合成遺伝子の発現の一例を次に述べる（第５図
参照）。
参照）。
ｐＴＢ３６１からＥｃｏＲＩ−ＰｓｔＩで切り出される
１７２塩基対のＤＮＡを発現用ベクターｐｔｒｐ７８１
のＥｃｏＲＩ，ＰｓｔＩ部位に組込み、Ｐｔｒｐ支配下
の発現用ベクターｐＴＢ３７０を得た。
１７２塩基対のＤＮＡを発現用ベクターｐｔｒｐ７８１
のＥｃｏＲＩ，ＰｓｔＩ部位に組込み、Ｐｔｒｐ支配下
の発現用ベクターｐＴＢ３７０を得た。
一方、ｐＴＢ３６１のＥｃｏＲＩ−ＢａｍＨＩ消化によ
って得られる１７９塩基対のＤＮＡを発現用ベクターｐ
ＴＢ２８１のＥｃｏＲＩ−ＢａｍＨＩ部位に組込みＰＬ
支配下の発現用ベクターｐＴＢ３７２とした。
って得られる１７９塩基対のＤＮＡを発現用ベクターｐ
ＴＢ２８１のＥｃｏＲＩ−ＢａｍＨＩ部位に組込みＰＬ
支配下の発現用ベクターｐＴＢ３７２とした。
ｐＴＢ３７０を用いて大腸菌ＧＨ１を形質転換し、生育
するコロニーをアンピシリン感受性を指標にして選別
し、目的ｈＥＧＦ遺伝子を含む株を得た。
するコロニーをアンピシリン感受性を指標にして選別
し、目的ｈＥＧＦ遺伝子を含む株を得た。
ｐＴＢ３７２の場合には、温度感受性大腸菌Ｎ４８３０
を用いて形質転換し、テトラサイクリン感受性を指標と
して選別し、クローニングしたｐＴＢ３７２で大腸菌Ｄ
Ｈ１を形質転換して合成遺伝子の発現を行った。
を用いて形質転換し、テトラサイクリン感受性を指標と
して選別し、クローニングしたｐＴＢ３７２で大腸菌Ｄ
Ｈ１を形質転換して合成遺伝子の発現を行った。
これら形質転換株を培養し、菌体を７Ｍグアニジン処理
した液中に含まれるｈＥＧＦ〔１２５Ｉ〕で標識された
ｍＥＧＦとの競合反応によるヒト胎児包皮細胞ＥＧＦ受
容体結合アッセイにより定量したところ、大腸菌ＤＨ１
／ｐＴＢ３７０によって約２mg／ｌ以上の産生量を示し
た（第１表参照）。この発現量は大腸菌におけるｈＥＧ
Ｆの直接発現としては注目すべきものである。
した液中に含まれるｈＥＧＦ〔１２５Ｉ〕で標識された
ｍＥＧＦとの競合反応によるヒト胎児包皮細胞ＥＧＦ受
容体結合アッセイにより定量したところ、大腸菌ＤＨ１
／ｐＴＢ３７０によって約２mg／ｌ以上の産生量を示し
た（第１表参照）。この発現量は大腸菌におけるｈＥＧ
Ｆの直接発現としては注目すべきものである。
作用 本発明ではｈＥＧＦ遺伝子のＤＮＡ配列として、発現系
の細胞において最も容認されたコドンを採用するのでな
く、むしろｈＥＧＦとそのアミノ酸配列において類似し
たｍＥＧＦの遺伝子のＤＮＡ配列と高い相同性を有する
ＤＮＡ配列とすることによって、ｍＲＮＡの安定性、翻
訳効率、ｍＲＮＡの塩基配列が決定する高次構造の影響
が良好なものとなって、ｈＥＧＦが効率よく生産され
る。また本発明では構造遺伝子の後半部にＢｇｌII、
３′末端近くにＰｓｔ Ｉの認識部位を有することによ
って、遺伝子挿入の成否、挿入方向の確認を容易にした
り、数種類のベクターに乗せることができる等、遺伝子
操作上の有利さ、多様性を発揮し得るものである。
の細胞において最も容認されたコドンを採用するのでな
く、むしろｈＥＧＦとそのアミノ酸配列において類似し
たｍＥＧＦの遺伝子のＤＮＡ配列と高い相同性を有する
ＤＮＡ配列とすることによって、ｍＲＮＡの安定性、翻
訳効率、ｍＲＮＡの塩基配列が決定する高次構造の影響
が良好なものとなって、ｈＥＧＦが効率よく生産され
る。また本発明では構造遺伝子の後半部にＢｇｌII、
３′末端近くにＰｓｔ Ｉの認識部位を有することによ
って、遺伝子挿入の成否、挿入方向の確認を容易にした
り、数種類のベクターに乗せることができる等、遺伝子
操作上の有利さ、多様性を発揮し得るものである。
そして本発明で提供するｈＥＧＦ遺伝子は新規なＤＮＡ
配列を有し、しかも微生物より大巾に人間に近いマウス
のＥＧＦ遺伝子のＤＮＡ配列と高い相同性を有するもの
で、ｈＥＧＦの高い発現率が期待され、また本発明によ
り始めてｈＥＧＦを大腸菌を宿主とした系で直接発現さ
せることが可能となった。更に本発明のｈＥＧＦに対応
する合成遺伝子を用いた組換えＤＮＡ技術により、ｈＥ
ＧＦをより効率よく製造することができ、治療薬として
のｈＥＧＦの生産や、ｈＥＧＦの生体内での役割や細胞
増殖調節機構の解明、ひいては発癌機構の解明に役立つ
ものである。
配列を有し、しかも微生物より大巾に人間に近いマウス
のＥＧＦ遺伝子のＤＮＡ配列と高い相同性を有するもの
で、ｈＥＧＦの高い発現率が期待され、また本発明によ
り始めてｈＥＧＦを大腸菌を宿主とした系で直接発現さ
せることが可能となった。更に本発明のｈＥＧＦに対応
する合成遺伝子を用いた組換えＤＮＡ技術により、ｈＥ
ＧＦをより効率よく製造することができ、治療薬として
のｈＥＧＦの生産や、ｈＥＧＦの生体内での役割や細胞
増殖調節機構の解明、ひいては発癌機構の解明に役立つ
ものである。
実施例および効果 次に本発明を実施例により説明する。
なお以下に開示する形質転換体 エシェリヒアコリ（Ｅ
ｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）ＤＨ１／ｐＴＢ３７
０およびエシェリヒアコリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ
ｃｏｌｉ）ＤＨ１／ｐＴＢ３７２，ｐＲＫ２４８ｃＩｔ
ｓは、財団法人発酵研究所（ＩＦＯ）にそれぞれＩＦＯ
−１４３７９およびＩＦＯ−１４３８０として、また昭
和５９年１０月５日から通商産業省工業技術院微生物工
業技術研究所（ＦＲＩ）にそれぞれＦＥＲＭ Ｐ−７８
８３およびＦＥＲＭ Ｐ−７８８４として寄託され、該
寄託はブタペスト条約に基づく寄託に切り換えられて、
それぞれ受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−８４３およびＦＥＲ
Ｍ ＢＰ−８４４として同研究所（ＦＲＩ）に保管され
ている。
ｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）ＤＨ１／ｐＴＢ３７
０およびエシェリヒアコリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ
ｃｏｌｉ）ＤＨ１／ｐＴＢ３７２，ｐＲＫ２４８ｃＩｔ
ｓは、財団法人発酵研究所（ＩＦＯ）にそれぞれＩＦＯ
−１４３７９およびＩＦＯ−１４３８０として、また昭
和５９年１０月５日から通商産業省工業技術院微生物工
業技術研究所（ＦＲＩ）にそれぞれＦＥＲＭ Ｐ−７８
８３およびＦＥＲＭ Ｐ−７８８４として寄託され、該
寄託はブタペスト条約に基づく寄託に切り換えられて、
それぞれ受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−８４３およびＦＥＲ
Ｍ ＢＰ−８４４として同研究所（ＦＲＩ）に保管され
ている。
実施例１．ＤＮＡフラグメントの合成 ＤＮＡフラグメントはフォスフォトリエステル法による
固相合成〔Ｉｔｏ，Ｈ．ら Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒ
ｅｓ．，１０，１７５５（１９８２）〕で、各々合成し
た。また、原料となるダイマーブロックは、Ｂｒｏｋａ
らの方法 〔Ｂｒｏｋａ，Ｃ．ら Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅ
ｓ．，８，５４６１（１９８０）〕に従い合成したも
の、あるいは市販品（和光純薬工業）の完全保護ダイマ
ーを、ピリジン（Ｐｙ），トリエチルアミン（ＴＥ
Ａ），水（３：１：１，ｖ／ｖ）の混液に溶解させ、シ
アノエチル基を除去後、ペンタン，エーテル（１：１，
ｖ／ｖ）の混液中で、粉末としたものを用いた。ＤＮＡ
フラグメントの合成手順は次の通りである。
固相合成〔Ｉｔｏ，Ｈ．ら Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒ
ｅｓ．，１０，１７５５（１９８２）〕で、各々合成し
た。また、原料となるダイマーブロックは、Ｂｒｏｋａ
らの方法 〔Ｂｒｏｋａ，Ｃ．ら Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅ
ｓ．，８，５４６１（１９８０）〕に従い合成したも
の、あるいは市販品（和光純薬工業）の完全保護ダイマ
ーを、ピリジン（Ｐｙ），トリエチルアミン（ＴＥ
Ａ），水（３：１：１，ｖ／ｖ）の混液に溶解させ、シ
アノエチル基を除去後、ペンタン，エーテル（１：１，
ｖ／ｖ）の混液中で、粉末としたものを用いた。ＤＮＡ
フラグメントの合成手順は次の通りである。
ジメトキシトリチルヌクレオシドを付着させた２５mgの
１％ポリスチレン（バッケム社）を、次の試薬で順次処
理した。
１％ポリスチレン（バッケム社）を、次の試薬で順次処
理した。
(1)ジクロルメタン中３％（ｗ／ｖ）トリクロロ酢酸
（ＴＣＡ）〔Ｔａｎａｋａ，Ｔ，ら Ｎｕｃｌ．Ａｃｉ
ｄｓ Ｒｅｓ．，１０，３２４９（１９８２）〕で１分
×２（２回同じ操作を行ったことを示す） (2)ジクロルメタン ×４ (3)ピリジン ×３ (4)２０mgのジヌクレオチドブロック又は３０mgのモノ
マーブロックを含む０．３mlの乾燥ピリジン (5)上記溶液を減圧下濃縮（ピリジン共沸） (6)２５mgのメシチレンスルホニルニトロトリアゾリッ
ド（ＭＳＮＴ）および５mgのニトロトリアゾールを含む
０．３mlの乾燥ピリジンで４０℃，２０分間 (7)ピリジン ×２ (8)１０％（ｖ／ｖ）無水酢酸および０．１Ｍジメチル
アミノピリジン（ＤＭＡＰ）を含有するピリジン２mlで
２分間 (9)ピリジン ×２ (10)ジクロルメタン ×３ 適当なジヌクレオチドあるいはモノヌクレオチドブロッ
クを用いて、この約４０分のサイクルを反復し、目的と
するオリゴヌクレオチド鎖を完結させた。合成完了後、
０．５Ｍの１，１，３，３−テトラメチルグアニジウム
−ピリジン−２−アルドキシム〔Ｒｅｅｓｅ，Ｃ．Ｂ．
ら Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ．，２７２７
（１９７８）〕で４０℃、１４時間処理し、重合体担体
より目的物を取り出し、次に濃アンモニア水で６０℃、
４時間処理して、ジメトキシトリチル基以外の保護基を
すべて除いた。この試料を逆相のＣ８シリカゲル（リク
ロプレツプＲＰ−８，メルク社）のカラム（φ３．０×
２．０cm）にかけ、３０％アセトニトリルで溶出した分
画を、８０％酢酸で室温、１５分間処理した。エーテル
洗浄後、さらにイオン交換高速液体クロマトグラフイー
（パーテイジル１０ＳＡＸ，ワットマン社）で精製〔Ｇ
ａｉｔ，Ｍ．Ｊ．ら Ｊ．Ｃ．Ｓ．，Ｃｈｅｍ．Ｃｏｍ
ｍｕｎ．，３７（１９８２）〕を行ない、純粋なＤＮＡ
フラグメントを得た。この様にして合成した２２種のＤ
ＮＡフラグメントは第３図に示した通りである。
（ＴＣＡ）〔Ｔａｎａｋａ，Ｔ，ら Ｎｕｃｌ．Ａｃｉ
ｄｓ Ｒｅｓ．，１０，３２４９（１９８２）〕で１分
×２（２回同じ操作を行ったことを示す） (2)ジクロルメタン ×４ (3)ピリジン ×３ (4)２０mgのジヌクレオチドブロック又は３０mgのモノ
マーブロックを含む０．３mlの乾燥ピリジン (5)上記溶液を減圧下濃縮（ピリジン共沸） (6)２５mgのメシチレンスルホニルニトロトリアゾリッ
ド（ＭＳＮＴ）および５mgのニトロトリアゾールを含む
０．３mlの乾燥ピリジンで４０℃，２０分間 (7)ピリジン ×２ (8)１０％（ｖ／ｖ）無水酢酸および０．１Ｍジメチル
アミノピリジン（ＤＭＡＰ）を含有するピリジン２mlで
２分間 (9)ピリジン ×２ (10)ジクロルメタン ×３ 適当なジヌクレオチドあるいはモノヌクレオチドブロッ
クを用いて、この約４０分のサイクルを反復し、目的と
するオリゴヌクレオチド鎖を完結させた。合成完了後、
０．５Ｍの１，１，３，３−テトラメチルグアニジウム
−ピリジン−２−アルドキシム〔Ｒｅｅｓｅ，Ｃ．Ｂ．
ら Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ．，２７２７
（１９７８）〕で４０℃、１４時間処理し、重合体担体
より目的物を取り出し、次に濃アンモニア水で６０℃、
４時間処理して、ジメトキシトリチル基以外の保護基を
すべて除いた。この試料を逆相のＣ８シリカゲル（リク
ロプレツプＲＰ−８，メルク社）のカラム（φ３．０×
２．０cm）にかけ、３０％アセトニトリルで溶出した分
画を、８０％酢酸で室温、１５分間処理した。エーテル
洗浄後、さらにイオン交換高速液体クロマトグラフイー
（パーテイジル１０ＳＡＸ，ワットマン社）で精製〔Ｇ
ａｉｔ，Ｍ．Ｊ．ら Ｊ．Ｃ．Ｓ．，Ｃｈｅｍ．Ｃｏｍ
ｍｕｎ．，３７（１９８２）〕を行ない、純粋なＤＮＡ
フラグメントを得た。この様にして合成した２２種のＤ
ＮＡフラグメントは第３図に示した通りである。
実施例２ オリゴＤＮＡのリン酸化 各々のＤＮＡフラグメントを２５μｌのリン酸化反応液
〔オリゴＤＮＡ２．５μｇ，５０mM Ｔｒｉｓ−ＨＣ
ｌ，pH７．６，１０mM ＭｇＣｌ２，１０mM ２−メル
カプトエタノール，１mM ＡＴＰ，２．５ユニットＴ４
ポリヌクレオチドキナーゼ（宝酒造）〕中で、３７℃、
１時間反応させ、５′末端をリン酸化した。この反応液
をこのまま凍結し、融解後、次の反応に用いた。
〔オリゴＤＮＡ２．５μｇ，５０mM Ｔｒｉｓ−ＨＣ
ｌ，pH７．６，１０mM ＭｇＣｌ２，１０mM ２−メル
カプトエタノール，１mM ＡＴＰ，２．５ユニットＴ４
ポリヌクレオチドキナーゼ（宝酒造）〕中で、３７℃、
１時間反応させ、５′末端をリン酸化した。この反応液
をこのまま凍結し、融解後、次の反応に用いた。
実施例３ ＤＮＡフラグメントの連結 ｈＥＧＦ遺伝子は２重鎖構成の１連の段階は第４図に示
した通りである（図中−印は５′末端水酸基がリン酸化
されていることを示す）。たとえばブロックＩの連結は
次の様にした。１２種（ＤＮＡフラグメント１から１２
に各々対応する）の実施例２の操作で得たＤＮＡフラグ
メントのリン酸化反応液を５μｌずつ加え、６０μｌと
した。これに１．４ユニットのＴ４ＤＮＡリガーゼ（宝
酒造）を加え、１４℃で２５時間インキュベートした
後、６５℃で１０分間処理し、反応をとめた。ここで主
生成物となったブロックＩの２量体を、制限エンドヌク
レアーゼＥｃｏＲＩ（宝酒造）で消化するために、この
反応液に次の３成分を５０mM ＮａＣｌ，０．０１％牛
血清アルブミン（ＢＳＡ），７mMＭｇＣｌ２になるよう
に加え、１２０ユニットのＥｃｏ ＲＩで３７℃，１．
５時間反応させ、６％含有アクリルアミドゲルを用い
て、緩衝液（pH８．３）〔１００mM Ｔｒｉｓ−ＨＣ
ｌ，１００mMホウ酸，２mM ＥＤＴＡ〕中、２５mAで
１．５時間電気泳動にかけた。泳動後、０．６mg／ｌの
エチジウムブロマイド（ＥｔＢｒ）でゲルを染色し、１
０１bpのＤＮＡ断片を含むゲル片を透析チユーブ内に封
入し、泳動用緩衝液内に沈め、ＤＮＡ断片をゲルから電
気的に溶出した〔Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１１０，１
１９（１９７７）〕。この透析チユーブ内液を０．０１
Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，（pH７．６），０．１ＭＮａＣ
ｌおよび０．００１Ｍ ＥＤＴＡで飽和したフェノール
で３回抽出し、さらにエーテル抽出した後、ＮａＣｌを
０．２Ｍとなるように加えた。続いて２倍量の冷エタノ
ールを加えて、−２０℃でＤＮＡを沈澱させた。以上と
同様の操作によってさらにブロックII（＃１３から＃２
２を含む）を調製した。
した通りである（図中−印は５′末端水酸基がリン酸化
されていることを示す）。たとえばブロックＩの連結は
次の様にした。１２種（ＤＮＡフラグメント１から１２
に各々対応する）の実施例２の操作で得たＤＮＡフラグ
メントのリン酸化反応液を５μｌずつ加え、６０μｌと
した。これに１．４ユニットのＴ４ＤＮＡリガーゼ（宝
酒造）を加え、１４℃で２５時間インキュベートした
後、６５℃で１０分間処理し、反応をとめた。ここで主
生成物となったブロックＩの２量体を、制限エンドヌク
レアーゼＥｃｏＲＩ（宝酒造）で消化するために、この
反応液に次の３成分を５０mM ＮａＣｌ，０．０１％牛
血清アルブミン（ＢＳＡ），７mMＭｇＣｌ２になるよう
に加え、１２０ユニットのＥｃｏ ＲＩで３７℃，１．
５時間反応させ、６％含有アクリルアミドゲルを用い
て、緩衝液（pH８．３）〔１００mM Ｔｒｉｓ−ＨＣ
ｌ，１００mMホウ酸，２mM ＥＤＴＡ〕中、２５mAで
１．５時間電気泳動にかけた。泳動後、０．６mg／ｌの
エチジウムブロマイド（ＥｔＢｒ）でゲルを染色し、１
０１bpのＤＮＡ断片を含むゲル片を透析チユーブ内に封
入し、泳動用緩衝液内に沈め、ＤＮＡ断片をゲルから電
気的に溶出した〔Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１１０，１
１９（１９７７）〕。この透析チユーブ内液を０．０１
Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，（pH７．６），０．１ＭＮａＣ
ｌおよび０．００１Ｍ ＥＤＴＡで飽和したフェノール
で３回抽出し、さらにエーテル抽出した後、ＮａＣｌを
０．２Ｍとなるように加えた。続いて２倍量の冷エタノ
ールを加えて、−２０℃でＤＮＡを沈澱させた。以上と
同様の操作によってさらにブロックII（＃１３から＃２
２を含む）を調製した。
実施例４ ｈＥＧＦ遺伝子のクローニング（第５図） クローニングベクターには大腸菌のプラスミドｐＢＲ３
２２を使用した。ｐＢＲ３２２ＤＮＡを２０μｌの反応
液〔１０mMＴｒｉｓ−ＨＣｌ，pH８．０，７mMＭｇＣｌ
２、１００mMＮａＣｌ，２mM ２−メルカプトエタノー
ル，０．０１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ），１９ユ
ニットのＥｃｏＲＩ（宝酒造），５ユニットのＢａｍＨ
Ｉ（宝酒造）〕中で３７℃、１時間反応させた後、水で
３倍希釈し、６５℃で１０分間処理し、酵素を失活させ
た。この反応液０．５μｌと約２０当量のＤＮＡフラグ
メントブロックＩおよびIIとを混合し、６６mMＴｒｉｓ
−ＨＣｌ（pH７．５）、６．６mMＭｇＣｌ２，１０mMジ
チオスレイトール（ＤＴＴ）および１mMＡＴＰ存在下、
１０μｌの反応液として、１４℃で２時間Ｔ４ＤＮＡリ
ガーゼ（ニューイングランド・バイオラボ社製）を作用
させて、ｈＥＧＦ遺伝子をプラスミドに結合させた。
２２を使用した。ｐＢＲ３２２ＤＮＡを２０μｌの反応
液〔１０mMＴｒｉｓ−ＨＣｌ，pH８．０，７mMＭｇＣｌ
２、１００mMＮａＣｌ，２mM ２−メルカプトエタノー
ル，０．０１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ），１９ユ
ニットのＥｃｏＲＩ（宝酒造），５ユニットのＢａｍＨ
Ｉ（宝酒造）〕中で３７℃、１時間反応させた後、水で
３倍希釈し、６５℃で１０分間処理し、酵素を失活させ
た。この反応液０．５μｌと約２０当量のＤＮＡフラグ
メントブロックＩおよびIIとを混合し、６６mMＴｒｉｓ
−ＨＣｌ（pH７．５）、６．６mMＭｇＣｌ２，１０mMジ
チオスレイトール（ＤＴＴ）および１mMＡＴＰ存在下、
１０μｌの反応液として、１４℃で２時間Ｔ４ＤＮＡリ
ガーゼ（ニューイングランド・バイオラボ社製）を作用
させて、ｈＥＧＦ遺伝子をプラスミドに結合させた。
この反応液を用い、既知の方法に従い、大腸菌ＤＨ１株
〔Ｓｅｌｓｏｎ，Ｍ．Ｅ．ら Ｎａｔｕｒｅ，２１７，
１１１０−１１１４（１９６８）〕を形質転換させた。
すなわち、−７０℃で保存していた５０μｌのコンピテ
ントセル〔Ｈａｎａｈａｎ，Ｄ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏ
ｌ．，１６６，５５７（１９８３）〕を０℃、１５分間
インキュベートした後、４μｌの上記反応液を添加し
た。さらに０℃、３０分間インキュベートした後、４２
℃、１．５分間おき、さらに０℃で５分間おいた。この
反応液に２００μｌのＬＢ培地（１１当りバクトトリプ
トン１０ｇ，バクトイースト抽出物５ｇ，ＮａＣｌ８ｇ
を含む）を加え、３７℃、５０分間インキュベートし
た。この大腸菌を３５μｇ／mlのアンピシリンを含むＬ
Ｂ寒天培地上にまき、３７℃で１晩培養した。生じたア
ンピシリン耐性コロニー中、６０株を選び、さらに７μ
ｇ／mlのテトラサイクリンを含むＬＢ寒天培地に接種し
たが、５９株ははえなかった。次にこの５９株中１６株
を選択し、この転換株のプラスミドＤＮＡをアルカリ法
〔Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｔ．ら Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃ
ｌｏｎｉｎｇ（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｕ
ｒ），３６８−３６９（１９８２）〕により粗精製し、
ＥｃｏＲＩおよびＢａｍＨＩ消化、さらにＥｃｏＲＩお
よびＢｇｌII消化、ＰｓｔＩ消化した。これら消化物の
２％アガロースゲルでの泳動パターンから、１４株が正
しくｈＥＧＦ遺伝子の挿入されている転換株であること
がわかった。この様にして得たクローニングベクターを
ｐＴＢ３６１と名付けた。
〔Ｓｅｌｓｏｎ，Ｍ．Ｅ．ら Ｎａｔｕｒｅ，２１７，
１１１０−１１１４（１９６８）〕を形質転換させた。
すなわち、−７０℃で保存していた５０μｌのコンピテ
ントセル〔Ｈａｎａｈａｎ，Ｄ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏ
ｌ．，１６６，５５７（１９８３）〕を０℃、１５分間
インキュベートした後、４μｌの上記反応液を添加し
た。さらに０℃、３０分間インキュベートした後、４２
℃、１．５分間おき、さらに０℃で５分間おいた。この
反応液に２００μｌのＬＢ培地（１１当りバクトトリプ
トン１０ｇ，バクトイースト抽出物５ｇ，ＮａＣｌ８ｇ
を含む）を加え、３７℃、５０分間インキュベートし
た。この大腸菌を３５μｇ／mlのアンピシリンを含むＬ
Ｂ寒天培地上にまき、３７℃で１晩培養した。生じたア
ンピシリン耐性コロニー中、６０株を選び、さらに７μ
ｇ／mlのテトラサイクリンを含むＬＢ寒天培地に接種し
たが、５９株ははえなかった。次にこの５９株中１６株
を選択し、この転換株のプラスミドＤＮＡをアルカリ法
〔Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｔ．ら Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃ
ｌｏｎｉｎｇ（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｕ
ｒ），３６８−３６９（１９８２）〕により粗精製し、
ＥｃｏＲＩおよびＢａｍＨＩ消化、さらにＥｃｏＲＩお
よびＢｇｌII消化、ＰｓｔＩ消化した。これら消化物の
２％アガロースゲルでの泳動パターンから、１４株が正
しくｈＥＧＦ遺伝子の挿入されている転換株であること
がわかった。この様にして得たクローニングベクターを
ｐＴＢ３６１と名付けた。
このプラスミドｐＴＢ３６１を持つ大腸菌ＤＨ１組み換
え体の１白金耳を、３５μｇ／mlのアンピシリンを含む
ＬＢ培地１．５mlに接種し、３７℃で一夜、振盪培養し
た。この培養液０．３mlを２００mlフラスコに分注した
２５mlの同じ培地に加え、３７℃、６．５時間振盪培養
した後、この培養液を５００mlフラスコに分注した同培
地１２５mlに加え、さらに４５分間振盪培養した。次に
クロラムフェニコールを１７０μｇ／mlになるように添
加し、さらに一夜培養をつづけ、プラスミドＤＮＡの増
幅をはかった。この培養液１５０mlを、６０００rpm，
４℃，９分間遠心分離し、得られた菌体を生理食塩水で
洗浄し、４mlの反応液〔２５mM Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，pH
８．０，５０mMグルコース，１０mMＥＤＴＡ，１mg/ml
リゾチーム〕を加え、懸濁した。氷中で２０分間おいた
後、８mlのアルカリ溶液〔１％（ｗ／ｖ）ＳＤＳ，０．
２Ｎ ＮａＯＨ〕を添加し、氷中で５分間したら、６ml
の５Ｍ酢酸カリウム緩衝液（pH４．８）を加え、１０分
間氷中でおき、１０，０００rpmで４℃、２０分間遠心
分離した。得られた上澄液に２倍量のエタノールを加
え、振盪した後、−２０℃で１０分間おき、１０，００
０rpmで４℃、２０分間遠心分離した。沈殿物を風乾
後、４mlの緩衝液〔１mM Ｎａ２ＥＤＴＡ（pH８．
０），１０mMＴｒｉｓ−ＨＣｌ（pH８．０）〕に溶か
し、塩化セシウム（ＣｓＣｌ）を３．９ｇを、ＥｔＢｒ
を３mgを加え、Ｂｅｃｋｍａｎ５０Ｔｉローターで３
５，０００rpm，１５℃，６４時間ＣｓＣｌ−ＥｔＢｒ
平衡密度勾配遠心分離にかけた。
え体の１白金耳を、３５μｇ／mlのアンピシリンを含む
ＬＢ培地１．５mlに接種し、３７℃で一夜、振盪培養し
た。この培養液０．３mlを２００mlフラスコに分注した
２５mlの同じ培地に加え、３７℃、６．５時間振盪培養
した後、この培養液を５００mlフラスコに分注した同培
地１２５mlに加え、さらに４５分間振盪培養した。次に
クロラムフェニコールを１７０μｇ／mlになるように添
加し、さらに一夜培養をつづけ、プラスミドＤＮＡの増
幅をはかった。この培養液１５０mlを、６０００rpm，
４℃，９分間遠心分離し、得られた菌体を生理食塩水で
洗浄し、４mlの反応液〔２５mM Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，pH
８．０，５０mMグルコース，１０mMＥＤＴＡ，１mg/ml
リゾチーム〕を加え、懸濁した。氷中で２０分間おいた
後、８mlのアルカリ溶液〔１％（ｗ／ｖ）ＳＤＳ，０．
２Ｎ ＮａＯＨ〕を添加し、氷中で５分間したら、６ml
の５Ｍ酢酸カリウム緩衝液（pH４．８）を加え、１０分
間氷中でおき、１０，０００rpmで４℃、２０分間遠心
分離した。得られた上澄液に２倍量のエタノールを加
え、振盪した後、−２０℃で１０分間おき、１０，００
０rpmで４℃、２０分間遠心分離した。沈殿物を風乾
後、４mlの緩衝液〔１mM Ｎａ２ＥＤＴＡ（pH８．
０），１０mMＴｒｉｓ−ＨＣｌ（pH８．０）〕に溶か
し、塩化セシウム（ＣｓＣｌ）を３．９ｇを、ＥｔＢｒ
を３mgを加え、Ｂｅｃｋｍａｎ５０Ｔｉローターで３
５，０００rpm，１５℃，６４時間ＣｓＣｌ−ＥｔＢｒ
平衡密度勾配遠心分離にかけた。
プラスミドＤＮＡのバンドを集め、２倍量の緩衝液〔１
mM Ｎａ２ＥＤＴＡ，pH８．０，１０mM Ｔｒｉｓ−Ｈ
Ｃｌ，pH８．０〕を加え、等量のクロロホルム−フェノ
ール（１：１，ｖ／ｖ）を加えて２回洗浄し、ＥｔＢｒ
を除去後、エタノール沈殿を行なった。さらに沈殿物を
０．６mlの緩衝液〔１mM ＥＤＴＡ，１０mM ＴｒｉＳ
−ＨＣｌ，pH８．０，０．３Ｍ ＮａＣｌ〕に溶かし、
もう一度エタノール沈殿を行なった。
mM Ｎａ２ＥＤＴＡ，pH８．０，１０mM Ｔｒｉｓ−Ｈ
Ｃｌ，pH８．０〕を加え、等量のクロロホルム−フェノ
ール（１：１，ｖ／ｖ）を加えて２回洗浄し、ＥｔＢｒ
を除去後、エタノール沈殿を行なった。さらに沈殿物を
０．６mlの緩衝液〔１mM ＥＤＴＡ，１０mM ＴｒｉＳ
−ＨＣｌ，pH８．０，０．３Ｍ ＮａＣｌ〕に溶かし、
もう一度エタノール沈殿を行なった。
ここで単離したプラスミドｐＴＢ３６１に組み込まれて
いるｈＥＧＦ遺伝子の塩基配列はＷａｌｌａｃｅらの方
法〔Ｗａｌｌａｃｅ，Ｒ．Ｂ．ら Ｇｅｎｅ，１６，２
１−２６（１９８１）〕に従った。すなわち、ｐＴＢ３
６１ＤＮＡを１０μｌの反応液〔７mM Ｔｒｉｓ−ＨＣ
ｌ，pH７．５，７mM ＭｇＣｌ２，５０mM ＮａＣｌ，
４ユニットのＰｖｕII（宝酒造）〕中、３７℃、１時間
反応させた。この反応液にプライマーとしてＤＮＡフラ
グメント＃７の水溶液（１．０Ａ２６０／ml）１μｌを
加え、１００℃で５分加熱後、氷浴で急冷した。以後の
操作はジデオキシ法の一般法どおりで行なった。同様に
して、プライマーにＤＮＡフラグメント＃１４，＃１８
を用いてｈＥＧＦ遺伝子の塩基配列が正しいことを確認
した。
いるｈＥＧＦ遺伝子の塩基配列はＷａｌｌａｃｅらの方
法〔Ｗａｌｌａｃｅ，Ｒ．Ｂ．ら Ｇｅｎｅ，１６，２
１−２６（１９８１）〕に従った。すなわち、ｐＴＢ３
６１ＤＮＡを１０μｌの反応液〔７mM Ｔｒｉｓ−ＨＣ
ｌ，pH７．５，７mM ＭｇＣｌ２，５０mM ＮａＣｌ，
４ユニットのＰｖｕII（宝酒造）〕中、３７℃、１時間
反応させた。この反応液にプライマーとしてＤＮＡフラ
グメント＃７の水溶液（１．０Ａ２６０／ml）１μｌを
加え、１００℃で５分加熱後、氷浴で急冷した。以後の
操作はジデオキシ法の一般法どおりで行なった。同様に
して、プライマーにＤＮＡフラグメント＃１４，＃１８
を用いてｈＥＧＦ遺伝子の塩基配列が正しいことを確認
した。
実施例５ ｈＥＧＦの発現用プラスミドの構築ならびに
形質転換体の製造（第５図） ｉ）上記実施例４で得られた１０μｇのｐＴＢ３６１を
反応液〔５０mM ＮａＣｌ，６mM ＴｒｉＳ−ＨＣｌ
（pH７．６），６mM ＭｇＣｌ２，６mM ２−メルカプ
トエタノール，０．０１％ＢＳＡ，５０ユニットＥｃｏ
ＲＩ，１０ユニットＰｓｔＩ（宝酒造）〕中、３７℃、
１．５時間反応させた後、２％アガロースゲル電気泳動
により１７２bpＤＮＡ断片を常法（前述）に従って精製
した。一方、発現用ベクターにはｐｔｒｐ７８１〔Ｋｕ
ｒｏｋａｗａ，Ｔ．ら Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅ
ｓ．，１１，３０７７−３０８５（１９８３）〕を使用
した。ｐｔｒｐ７８１ＤＮＡを上記と同様にして、Ｅｃ
ｏｒＲＩおよびＰｓｔＩ消化し、この反応液に２倍量の
水を加え、６５度で１０分間おき、酵素を失活させた。
形質転換体の製造（第５図） ｉ）上記実施例４で得られた１０μｇのｐＴＢ３６１を
反応液〔５０mM ＮａＣｌ，６mM ＴｒｉＳ−ＨＣｌ
（pH７．６），６mM ＭｇＣｌ２，６mM ２−メルカプ
トエタノール，０．０１％ＢＳＡ，５０ユニットＥｃｏ
ＲＩ，１０ユニットＰｓｔＩ（宝酒造）〕中、３７℃、
１．５時間反応させた後、２％アガロースゲル電気泳動
により１７２bpＤＮＡ断片を常法（前述）に従って精製
した。一方、発現用ベクターにはｐｔｒｐ７８１〔Ｋｕ
ｒｏｋａｗａ，Ｔ．ら Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅ
ｓ．，１１，３０７７−３０８５（１９８３）〕を使用
した。ｐｔｒｐ７８１ＤＮＡを上記と同様にして、Ｅｃ
ｏｒＲＩおよびＰｓｔＩ消化し、この反応液に２倍量の
水を加え、６５度で１０分間おき、酵素を失活させた。
この様にして得た１７２bpＤＮＡおよびプラスミドＤＮ
Ａは各々、両端にＥｃｏＲＩ消化およびＰｓｔＩ消化に
より生じた単鎖の付着端を有する。
Ａは各々、両端にＥｃｏＲＩ消化およびＰｓｔＩ消化に
より生じた単鎖の付着端を有する。
これら両者を混合し、６６mM ＴｒｉＳ−ＨＣｌ，pH
７．５，６．６mM ＭｇＣｌ２，１０mM ＤＴＴおよび
１mM ＡＴＰ存在下、１４℃，５．５時間Ｔ４ＤＮＡリ
ガーゼ（ＮＥＢ社）を作用させてＤＮＡを結合し、前出
と同様な方法で大腸菌ＤＨ１株を形質転換させた。次に
この大腸菌を７μｇ／mlのテトラサイクリンを含むＬＢ
寒天培地上にまき、３７℃で１日培養した。生じたテト
ラサイクリン耐性コロニーを、次に３５μｇ／mlのアン
ピシリンを含むＬＢ寒天培地に接種し、はえない転換株
を選び出した。さらに前出と同様な方法で、転換株のプ
ラスミドＤＮＡをＥｃｏＲＩおよびＰｓｔＩで消化し、
さらにＢｇ１IIおよびＨｉｎｄIIIで消化して、ｈＥＧ
Ｆ遺伝子でが正しく挿入された転換株を選択した。この
様にして得た発現用プラスミドをｐＴＢ３７０と、また
形質転換体をエシェリヒアコリ ＤＨ１／ｐＴＢ３７０
と名づけた。
７．５，６．６mM ＭｇＣｌ２，１０mM ＤＴＴおよび
１mM ＡＴＰ存在下、１４℃，５．５時間Ｔ４ＤＮＡリ
ガーゼ（ＮＥＢ社）を作用させてＤＮＡを結合し、前出
と同様な方法で大腸菌ＤＨ１株を形質転換させた。次に
この大腸菌を７μｇ／mlのテトラサイクリンを含むＬＢ
寒天培地上にまき、３７℃で１日培養した。生じたテト
ラサイクリン耐性コロニーを、次に３５μｇ／mlのアン
ピシリンを含むＬＢ寒天培地に接種し、はえない転換株
を選び出した。さらに前出と同様な方法で、転換株のプ
ラスミドＤＮＡをＥｃｏＲＩおよびＰｓｔＩで消化し、
さらにＢｇ１IIおよびＨｉｎｄIIIで消化して、ｈＥＧ
Ｆ遺伝子でが正しく挿入された転換株を選択した。この
様にして得た発現用プラスミドをｐＴＢ３７０と、また
形質転換体をエシェリヒアコリ ＤＨ１／ｐＴＢ３７０
と名づけた。
ii)λＰＬプロモーター遺伝子を持つ発現用ベクターは
次の様にして構築した（第６図） プラスミドｐｔｒｐ６０１〔黒川 勉，学位論文 東京
大学（１９８３）〕を制限酵素ＥｃｏＲＩおよびＣｌａ
Ｉで切断した後、生じた単鎖の付着端をＤＮＡポリメラ
ーゼＩ（Ｋｌｅｎｏｗｆｒａｇｍｅｎｔ）でうめ、フェ
ノール処理し、エタノール沈殿を行なった。この直鎖状
ＤＮＡを１４℃でＴ４ＤＮＡリガーゼを作用させて環状
ＤＮＡとし、前出と同様な方法で大腸菌を形質転換さ
せ、これよりｔｒｐプロモーター下流がＥｃｏＲＩとな
ったプラスミドを単離し、ｐＴＢ５６と名付けた。
次の様にして構築した（第６図） プラスミドｐｔｒｐ６０１〔黒川 勉，学位論文 東京
大学（１９８３）〕を制限酵素ＥｃｏＲＩおよびＣｌａ
Ｉで切断した後、生じた単鎖の付着端をＤＮＡポリメラ
ーゼＩ（Ｋｌｅｎｏｗｆｒａｇｍｅｎｔ）でうめ、フェ
ノール処理し、エタノール沈殿を行なった。この直鎖状
ＤＮＡを１４℃でＴ４ＤＮＡリガーゼを作用させて環状
ＤＮＡとし、前出と同様な方法で大腸菌を形質転換さ
せ、これよりｔｒｐプロモーター下流がＥｃｏＲＩとな
ったプラスミドを単離し、ｐＴＢ５６と名付けた。
次にこのプラスミドｐＴＢ５６をＰｖｕIIで消化し直鎖
状ＤＮＡとした後、合成オリゴヌクレオチド（ＥｃｏＲ
Ｉリンカー）と混ぜ、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ反応を行なっ
た。この反応物をＥｃｏＲＩで消化した後、２％アガロ
ースゲル電気泳動によりｔｒｐプロモーター遺伝子を含
む約０．２８kbpＤＮＡ断片を定法に従って精製した。
状ＤＮＡとした後、合成オリゴヌクレオチド（ＥｃｏＲ
Ｉリンカー）と混ぜ、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ反応を行なっ
た。この反応物をＥｃｏＲＩで消化した後、２％アガロ
ースゲル電気泳動によりｔｒｐプロモーター遺伝子を含
む約０．２８kbpＤＮＡ断片を定法に従って精製した。
一方、ｐＢＲ３２２ＤＮＡをＥｃｏＲＩ消化して直鎖状
ＤＮＡとした後、５′末端のリン酸基をアルカリ製フォ
スファターゼ処理により除去し、前記０．２８kbpＤＮ
ＡＥｃｏＲＩ断片と混合し、１４℃でＴ４ＤＮＡリガー
ゼを作用させ、ＤＮＡを結合し、大腸菌を形質転換さ
せ、これよりｔｒｐプロモーターがｐＢＲ３２２のＥｃ
ｏＲＩ部位にクローニングされたプラスミドを単離し、
ｐＴＢ５７と名付けた。
ＤＮＡとした後、５′末端のリン酸基をアルカリ製フォ
スファターゼ処理により除去し、前記０．２８kbpＤＮ
ＡＥｃｏＲＩ断片と混合し、１４℃でＴ４ＤＮＡリガー
ゼを作用させ、ＤＮＡを結合し、大腸菌を形質転換さ
せ、これよりｔｒｐプロモーターがｐＢＲ３２２のＥｃ
ｏＲＩ部位にクローニングされたプラスミドを単離し、
ｐＴＢ５７と名付けた。
次にこのプラスミドｐＴＢ５７をＥｃｏＲＩで部分消化
して得られる直鎖状ＤＮＡを前出と同様の操作で処理
し、片方のＥｃｏＲＩ認識部位をつぶし、環状ＤＮＡと
した後、大腸菌を形質転換させ、得られたコロニーより
プラスミドを得、制限酵素の切断でのパターンよりｔｒ
ｐプロモーターの上流側にあるＥｃｏＲＩ認識部位がな
くなったプラスミドをｐＴＢ９１と名付けた。
して得られる直鎖状ＤＮＡを前出と同様の操作で処理
し、片方のＥｃｏＲＩ認識部位をつぶし、環状ＤＮＡと
した後、大腸菌を形質転換させ、得られたコロニーより
プラスミドを得、制限酵素の切断でのパターンよりｔｒ
ｐプロモーターの上流側にあるＥｃｏＲＩ認識部位がな
くなったプラスミドをｐＴＢ９１と名付けた。
さらにプラスミドｐＴＢ９１をＥｃｏＲＩで消化後、単
鎖の付着端をＤＮＡポリメラーゼＩでうめ、合成オリゴ
ヌクレオチド（ＢｇｌIIリンカー）と混ぜ、Ｔ４ＤＮＡ
リガーゼを用いて結合し、ｔｒｐプロモーター遺伝子の
下流にＢｇｌ II認識部位を導入し、このプラスミドを
ｐＴＢ３３４と名づけた。
鎖の付着端をＤＮＡポリメラーゼＩでうめ、合成オリゴ
ヌクレオチド（ＢｇｌIIリンカー）と混ぜ、Ｔ４ＤＮＡ
リガーゼを用いて結合し、ｔｒｐプロモーター遺伝子の
下流にＢｇｌ II認識部位を導入し、このプラスミドを
ｐＴＢ３３４と名づけた。
この様にして得たｐＴＢ５７とｐＴＢ３３４を用い、ｔ
ｒｐプロモーターの上流にＥｃｏＲＩ認識部位、および
下流にＢｇｌ II認識部位を持つプラスミドを構築し
た。まずｐＴＢ３４４を制限酵素Ｈｐａ ＩおよびＰｓ
ｔ Ｉで切断した後、２％アガロースゲル電気泳動によ
り約０．７８kbpＤＮＡ断片を溶出精製した。
ｒｐプロモーターの上流にＥｃｏＲＩ認識部位、および
下流にＢｇｌ II認識部位を持つプラスミドを構築し
た。まずｐＴＢ３４４を制限酵素Ｈｐａ ＩおよびＰｓ
ｔ Ｉで切断した後、２％アガロースゲル電気泳動によ
り約０．７８kbpＤＮＡ断片を溶出精製した。
またｐＴＢ５７も同様の制限酵素で切断した後、１％ア
ガロースゲル電気泳動により、３．８５kbpＤＮＡ断片
を溶出精製した。これら両者を混合しＴ４ＤＮＡリガー
ゼを用いて結合した後、大腸菌を形質転換させ、得られ
たコロニーよりプラスミドを得、制限酵素の切断でのパ
ターンより目的のプラスミドを持つ転換株を選択した。
これより単離したプラスミドをｐＴＢ３４０と名付け
た。
ガロースゲル電気泳動により、３．８５kbpＤＮＡ断片
を溶出精製した。これら両者を混合しＴ４ＤＮＡリガー
ゼを用いて結合した後、大腸菌を形質転換させ、得られ
たコロニーよりプラスミドを得、制限酵素の切断でのパ
ターンより目的のプラスミドを持つ転換株を選択した。
これより単離したプラスミドをｐＴＢ３４０と名付け
た。
次にλＰＬプロモーターを持つプラスミドｐＡＤ３２９
〔Ａｄｈｙａ，Ｓ．ら Ｃｅｌｌ，２９，９３９−９４
４（１９８２）〕より、λＰＬプロモーター遺伝子を持
つ０．３５kbpのＤＮＡ断片を単離した。まずプラスミ
ドｐＡＤ３２９を制限酵素ＢｇｌIIおよびＨｐａＩで消
化後、２％アガロースゲル電気泳動にかけ、約０．４５
kbpのＤＮＡ断片を溶出精製した。次いでこの０．４５k
bpのＤＮＡ断片をＨｉｎｆ Ｉにより部分消化した後、
２％アガロースゲル電気泳動にかけ、約０．３５kbpの
ＤＮＡ断片を溶出精製した。この様にして得た０．３５
kbpのＤＮＡ断片は両端にＢｇｌII消化およびＨｉｎｆ
Ｉ消化により生じた付着端を有する。
〔Ａｄｈｙａ，Ｓ．ら Ｃｅｌｌ，２９，９３９−９４
４（１９８２）〕より、λＰＬプロモーター遺伝子を持
つ０．３５kbpのＤＮＡ断片を単離した。まずプラスミ
ドｐＡＤ３２９を制限酵素ＢｇｌIIおよびＨｐａＩで消
化後、２％アガロースゲル電気泳動にかけ、約０．４５
kbpのＤＮＡ断片を溶出精製した。次いでこの０．４５k
bpのＤＮＡ断片をＨｉｎｆ Ｉにより部分消化した後、
２％アガロースゲル電気泳動にかけ、約０．３５kbpの
ＤＮＡ断片を溶出精製した。この様にして得た０．３５
kbpのＤＮＡ断片は両端にＢｇｌII消化およびＨｉｎｆ
Ｉ消化により生じた付着端を有する。
一方、プラスミドｐＴＢ３４０を制限酵素ＢｇｌIIおよ
びＥｃｏＲＩで消化した後、１％アガロースゲル電気泳
動にかけ、約４．３５kbpＤＮＡを溶出し、精製した。
ここで得られたＤＮＡは両端にＢｇｌII消化およびＥｃ
ｏＲＩ消化により生じた付着端を有する。この様にして
得られたλＰＬプロモーター遺伝子を含む０．３５kbp
ＤＮＡ断片と約４．３５kbpのＤＮＡとを混ぜ、Ｔ４Ｄ
ＮＡリガーゼで環状ＤＮＡとした後、大腸菌を形質転換
させ、これよりλＰＬプロモーターを持ち、その上流に
Ｂｇｌ II認識部位、下流にＥｃｏＲＩ認識部位を有す
るプラスミドを単離し、これをｐＴＢ２８１と名付け
た。
びＥｃｏＲＩで消化した後、１％アガロースゲル電気泳
動にかけ、約４．３５kbpＤＮＡを溶出し、精製した。
ここで得られたＤＮＡは両端にＢｇｌII消化およびＥｃ
ｏＲＩ消化により生じた付着端を有する。この様にして
得られたλＰＬプロモーター遺伝子を含む０．３５kbp
ＤＮＡ断片と約４．３５kbpのＤＮＡとを混ぜ、Ｔ４Ｄ
ＮＡリガーゼで環状ＤＮＡとした後、大腸菌を形質転換
させ、これよりλＰＬプロモーターを持ち、その上流に
Ｂｇｌ II認識部位、下流にＥｃｏＲＩ認識部位を有す
るプラスミドを単離し、これをｐＴＢ２８１と名付け
た。
これを用いてｈＥＧＦの発現用プラスミドを構築した
（第５図）。まず実施例４で前述したプラスミドｐＴＢ
３６１ １０μｇを反応液〔１００mMＮａＣｌ，１０mM
ＴｒｉＳ−ＨＣｌ，pH８．０，７mM ＭｇＣｌ２，２
mM ２−メルカプトエタノール，０．０１％ＢＳＡ，５
０ユニットＥｃｏＲＩ，２０ユニットＢａｍＨＩ（宝酒
造）〕中、３７℃、１．５時間反応させた後、２％アガ
ロースゲル電気泳動により、ｈＥＧＦ遺伝子を含む１７
９bpのＤＮＡ断片を溶出し、精製した。一方、プラスミ
ドｐＴＢ２８１も上記と同様にしてＥｃｏＲＩおよびＢ
ａｍＨＩ消化し、２倍量の水を加えて６５℃、１０分間
おき、酵素を失活させた。これら両者を混合し、１４℃
でＴ４ＤＮＡリガーゼを作用させ、ＤＮＡを結合した。
（第５図）。まず実施例４で前述したプラスミドｐＴＢ
３６１ １０μｇを反応液〔１００mMＮａＣｌ，１０mM
ＴｒｉＳ−ＨＣｌ，pH８．０，７mM ＭｇＣｌ２，２
mM ２−メルカプトエタノール，０．０１％ＢＳＡ，５
０ユニットＥｃｏＲＩ，２０ユニットＢａｍＨＩ（宝酒
造）〕中、３７℃、１．５時間反応させた後、２％アガ
ロースゲル電気泳動により、ｈＥＧＦ遺伝子を含む１７
９bpのＤＮＡ断片を溶出し、精製した。一方、プラスミ
ドｐＴＢ２８１も上記と同様にしてＥｃｏＲＩおよびＢ
ａｍＨＩ消化し、２倍量の水を加えて６５℃、１０分間
おき、酵素を失活させた。これら両者を混合し、１４℃
でＴ４ＤＮＡリガーゼを作用させ、ＤＮＡを結合した。
大腸菌の形質転換は次の様に行なった。大腸菌Ｎ４８３
０株（ファルマシア・ジャパン社市販）の一晩培養液に
ＬＢ培地を加え、１００倍に稀釈した。３７℃で２時間
振盪培養した後３，３００rpm，４℃，８分間遠心分離
し、得られた菌体を１０mM ＮａＣｌで洗浄した。これ
に５０mM ＣａＣｌ２溶液を添加し、氷中で１５分間お
き、３，３００rpmで４℃、４分間遠心分離し、もう一
度５０mM ＣａＣｌ２に懸濁した。この１００μｌに懸
濁した大腸菌Ｎ４８３０に上記で得た反応液７μｌを添
加し、０℃、４５分間インキュベートした。次いで３７
℃、２分間インキュベートし、９００μｌのＬＢ培地を
加えた後、３０℃で１時間インキュベートした。この大
腸菌を３５μｇ／mlのアンピシリンを含むＬＢ寒天培地
上にまき、３０℃で一晩培養した。生じたアンピシリン
耐性コロニーは、すべて７μｇ／mlのテトラサイクリン
に対する耐性能をなくしていた。次に、この転換株の一
部からプラスミドＤＮＡをとり、ＥｃｏＲＩおよびＢａ
ｍＨＩによる消化、さらにＢｇｌII消化により、ｈＥＧ
Ｆ遺伝子の正しく挿入された転換株を選択した。この様
にして得たプラスミドをｐＴＢ３７２と名づけた。
０株（ファルマシア・ジャパン社市販）の一晩培養液に
ＬＢ培地を加え、１００倍に稀釈した。３７℃で２時間
振盪培養した後３，３００rpm，４℃，８分間遠心分離
し、得られた菌体を１０mM ＮａＣｌで洗浄した。これ
に５０mM ＣａＣｌ２溶液を添加し、氷中で１５分間お
き、３，３００rpmで４℃、４分間遠心分離し、もう一
度５０mM ＣａＣｌ２に懸濁した。この１００μｌに懸
濁した大腸菌Ｎ４８３０に上記で得た反応液７μｌを添
加し、０℃、４５分間インキュベートした。次いで３７
℃、２分間インキュベートし、９００μｌのＬＢ培地を
加えた後、３０℃で１時間インキュベートした。この大
腸菌を３５μｇ／mlのアンピシリンを含むＬＢ寒天培地
上にまき、３０℃で一晩培養した。生じたアンピシリン
耐性コロニーは、すべて７μｇ／mlのテトラサイクリン
に対する耐性能をなくしていた。次に、この転換株の一
部からプラスミドＤＮＡをとり、ＥｃｏＲＩおよびＢａ
ｍＨＩによる消化、さらにＢｇｌII消化により、ｈＥＧ
Ｆ遺伝子の正しく挿入された転換株を選択した。この様
にして得たプラスミドをｐＴＢ３７２と名づけた。
上記で得られたｐＴＢ３７２を次に前述同様の操作によ
りｐＲＫ２４８ｃＩｔｓ（レプレッサー）〔Ｂｅｒｎａ
ｒｄ，Ｈ．ら Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌ
ｏｇｙ，６８，４８２−４９２（１９７９）〕を含有す
る大腸菌ＤＨ１株の形質転換に用い、得られた形質転換
体を３５μｇ／mlのアンピシリンおよび７μｇ／mlのテ
トラサイクリンを含有するＬＢ寒天培地上にまき、３０
℃で一晩培養した。生じたコロニーから前述同様に得た
プラスミドＤＮＡを制限酵素で消化し、そのパターンよ
りｈＥＧＦ遺伝子を含む形質転換株を選び、これをエシ
ェリヒア コリ ＤＨ１／ｐＴＢ３７２，ｐＲＫ２４８
ｃＩｔｓと名づけた。
りｐＲＫ２４８ｃＩｔｓ（レプレッサー）〔Ｂｅｒｎａ
ｒｄ，Ｈ．ら Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌ
ｏｇｙ，６８，４８２−４９２（１９７９）〕を含有す
る大腸菌ＤＨ１株の形質転換に用い、得られた形質転換
体を３５μｇ／mlのアンピシリンおよび７μｇ／mlのテ
トラサイクリンを含有するＬＢ寒天培地上にまき、３０
℃で一晩培養した。生じたコロニーから前述同様に得た
プラスミドＤＮＡを制限酵素で消化し、そのパターンよ
りｈＥＧＦ遺伝子を含む形質転換株を選び、これをエシ
ェリヒア コリ ＤＨ１／ｐＴＢ３７２，ｐＲＫ２４８
ｃＩｔｓと名づけた。
参考例１ ｈＥＧＦの製造法 ｉ）エシェリヒア コリ ＤＨ１／ｐＴＢ３７０を７μ
ｇ／mlのテトラサイクリンを含むＬＢ培地中、３７℃で
一晩振盪培養した。この培養液０．５mlに７μｇ／mlの
テトラサイクリンを含む１０mlのＭ９培地〔０．４％カ
ザミノ酸、１％グルコースを含む〕を加え、３７℃、４
時間振盪培養した後、３β−インドールアクリル酸（Ｉ
ＡＡ）を加えて３０μｇ／mlとなるようにした。このま
ま、さらに４時間培養を続けた後、この培養液１０．５
mlを７，０００rpm、４℃、１０分間遠心分離し、得ら
れた菌体を−７０℃で凍結した。これを溶解後、１mlの
反応液〔７Ｍグアニジン塩酸塩，２mMフェニルメチルス
ルホニルフルオライド（ＰＭＳＦ），０．１Ｍ Ｔｒｉ
Ｓ−ＨＣｌ，pH７．０〕中、０℃、１時間インキュベー
トした。この反応液を２０，０００rpm、４℃、３０分
間遠心分離し、得られた上澄液をＴＥＮ〔２０mM Ｔｒ
ｉＳ−ＨＣｌ，pH８．０，１mM ＥＤＴＡ，０．２Ｍ
ＢａＣｌ〕１ｌに対して４℃で２回透析し、析出した不
溶物を２０，０００rpm、４℃、３０分間の遠心分離で
除去した。この様にして得られた溶液は−２０℃で保存
した。
ｇ／mlのテトラサイクリンを含むＬＢ培地中、３７℃で
一晩振盪培養した。この培養液０．５mlに７μｇ／mlの
テトラサイクリンを含む１０mlのＭ９培地〔０．４％カ
ザミノ酸、１％グルコースを含む〕を加え、３７℃、４
時間振盪培養した後、３β−インドールアクリル酸（Ｉ
ＡＡ）を加えて３０μｇ／mlとなるようにした。このま
ま、さらに４時間培養を続けた後、この培養液１０．５
mlを７，０００rpm、４℃、１０分間遠心分離し、得ら
れた菌体を−７０℃で凍結した。これを溶解後、１mlの
反応液〔７Ｍグアニジン塩酸塩，２mMフェニルメチルス
ルホニルフルオライド（ＰＭＳＦ），０．１Ｍ Ｔｒｉ
Ｓ−ＨＣｌ，pH７．０〕中、０℃、１時間インキュベー
トした。この反応液を２０，０００rpm、４℃、３０分
間遠心分離し、得られた上澄液をＴＥＮ〔２０mM Ｔｒ
ｉＳ−ＨＣｌ，pH８．０，１mM ＥＤＴＡ，０．２Ｍ
ＢａＣｌ〕１ｌに対して４℃で２回透析し、析出した不
溶物を２０，０００rpm、４℃、３０分間の遠心分離で
除去した。この様にして得られた溶液は−２０℃で保存
した。
ii)エシェリヒア コリ ＤＨ１／ｐＴＢ３７２，ｐＲ
Ｋ２４８ｃＩｔｓを３５μｇ／mlのアンピシリンおよび
７μｇ／mlのテトラサイクリンを含むＭ９培地中、２９
℃で一晩振盪培養した。この培養液０．５mlに３５μｇ
／mlのアンピシリンを含む１０mlのＭ９培地を加え、２
９℃で４時間振盪培養し、続いて４２℃で２時間振盪培
養を続けた後、前述と同様な処理を行ない、得られた溶
液は−２０℃で保存した。
Ｋ２４８ｃＩｔｓを３５μｇ／mlのアンピシリンおよび
７μｇ／mlのテトラサイクリンを含むＭ９培地中、２９
℃で一晩振盪培養した。この培養液０．５mlに３５μｇ
／mlのアンピシリンを含む１０mlのＭ９培地を加え、２
９℃で４時間振盪培養し、続いて４２℃で２時間振盪培
養を続けた後、前述と同様な処理を行ない、得られた溶
液は−２０℃で保存した。
上記ｉ）、ii)で得られた各生産物をラジオレセプター
アッセイ法（ＲＲＡ法）〔Ｃｏｈｅｎ，Ｓ．ら Ｐｒｏ
ｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７２，１３
１７−１３２１（１９７５）〕で分析した。
アッセイ法（ＲＲＡ法）〔Ｃｏｈｅｎ，Ｓ．ら Ｐｒｏ
ｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７２，１３
１７−１３２１（１９７５）〕で分析した。
ＥＧＦ活性は、同じ活性を示す精製マウスＥＧＦ標準の
重量で表わした。まずヒト胎児包皮細胞Ｆｌｏｗ７００
０（ｆｌｏｗ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．市
販）を１０％の牛胎児血清を含むダルベッコ・ミニマル
・エセンシャル（ＤＭＥＭ）培地を用いて、直径１．６
cmの細胞培養用ディッシュ（Ｌｉｎｂｒｏ，Ｆｌｏｗ
Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．市販）で培養し
た。この培地を捨て、０．１％ＢＳＡを含むＤＮＡ培地
で細胞を洗浄後、０．２mlの同培地と、クロラミンＴ法
により125ＩでラベルしたマウスＥＧＦ（Ｃｏｌｌａｂ
ｏｒａｔｉｖｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｉｎｃ．市販）５
ng、および上記で得られた各生産物を適量加え、３７℃
で１時間培養した。次に同培地で洗浄後、０．２Ｎ Ｎ
ａＯＨで処理し、チューブへ移し、γ線カウンターで、
とりこまれた Ｉを測定した。同様の操作で重量既知の
マウスＥＧＦとの競合反応により得られた検量曲線よ
り、生産物中のヒトＥＧＦ量を算出した。結果は第１表
に示した。
重量で表わした。まずヒト胎児包皮細胞Ｆｌｏｗ７００
０（ｆｌｏｗ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．市
販）を１０％の牛胎児血清を含むダルベッコ・ミニマル
・エセンシャル（ＤＭＥＭ）培地を用いて、直径１．６
cmの細胞培養用ディッシュ（Ｌｉｎｂｒｏ，Ｆｌｏｗ
Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．市販）で培養し
た。この培地を捨て、０．１％ＢＳＡを含むＤＮＡ培地
で細胞を洗浄後、０．２mlの同培地と、クロラミンＴ法
により125ＩでラベルしたマウスＥＧＦ（Ｃｏｌｌａｂ
ｏｒａｔｉｖｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｉｎｃ．市販）５
ng、および上記で得られた各生産物を適量加え、３７℃
で１時間培養した。次に同培地で洗浄後、０．２Ｎ Ｎ
ａＯＨで処理し、チューブへ移し、γ線カウンターで、
とりこまれた Ｉを測定した。同様の操作で重量既知の
マウスＥＧＦとの競合反応により得られた検量曲線よ
り、生産物中のヒトＥＧＦ量を算出した。結果は第１表
に示した。
またエシェリヒア コリ ＤＨ１／ｐＴＢ３７０株を培
養し、ＩＡＡで誘導後、すでに記載した方法で融解物中
のＥＧＦ活性を発育とあわせて測定した。その結果を第
７図に示した。図中、破線は菌株の発育を、実線はＥＧ
Ｆ活性を示す。
養し、ＩＡＡで誘導後、すでに記載した方法で融解物中
のＥＧＦ活性を発育とあわせて測定した。その結果を第
７図に示した。図中、破線は菌株の発育を、実線はＥＧ
Ｆ活性を示す。
第１図はｈＥＧＦに対応する本発明の合成遺伝子のＤＮ
Ａ配列およびアミノ酸配列を示した図であり、第２図は
本発明のｈＥＧＦ遺伝子合成の際のＤＮＡフラグメント
への分割の一例を示した図であり、第３図は本発明のｈ
ＥＧＦ対応合成遺伝子製造用ＤＮＡフラグメントの一例
を示す図であり、第４図は第３図の各ＤＮＡフラグメン
トを連結してｈＥＧＦ合成遺伝子を製造する模式図であ
る。第５図は本発明のｈＥＧＦ対応遺伝子を組込んだ発
現用プラスミドの構築図であり、第６図はプラスミドｐ
ＴＢ２８１の構築図である。第７図は本発明の合成遺伝
子を用いてＥＧＦを製造した際の菌体の発育とＥＧＦ活
性を示すグラフである。
Ａ配列およびアミノ酸配列を示した図であり、第２図は
本発明のｈＥＧＦ遺伝子合成の際のＤＮＡフラグメント
への分割の一例を示した図であり、第３図は本発明のｈ
ＥＧＦ対応合成遺伝子製造用ＤＮＡフラグメントの一例
を示す図であり、第４図は第３図の各ＤＮＡフラグメン
トを連結してｈＥＧＦ合成遺伝子を製造する模式図であ
る。第５図は本発明のｈＥＧＦ対応遺伝子を組込んだ発
現用プラスミドの構築図であり、第６図はプラスミドｐ
ＴＢ２８１の構築図である。第７図は本発明の合成遺伝
子を用いてＥＧＦを製造した際の菌体の発育とＥＧＦ活
性を示すグラフである。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.5 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｒ 1:19） (56)参考文献 米国特許4395486（ＵＳ，Ａ) Ｐｒｏｃ，Ｎａｔｌ，Ａｃａｄｓ，Ｓｃ ｉ，ＵＳＡ，1983［80］Ｐ．7461−7465 Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅ ａｒｃｈ，1982［10］Ｐ．4467−4482 Ｎａｔｕｒｅ，1983 ［303］Ｐ．722− 725
Claims (2)
- 【請求項１】ＤＮＡ配列 ＡＡＣＡＧＴＧＡＴＴＣＡＧＡＡＴＧＴＣＣＴＣＴＣＴ
ＣＡＣＡＣＧＡＴＧＧＡＴＡＣＴＧＣＣＴＣＣＡＴＧＡ
ＣＧＧＣＧＴＧＴＧＴＡＴＧＴＡＴＡＴＴＧＡＡＧＣＡ
ＣＴＡＧＡＣＡＡＡＴＡＣＧＣＡＴＧＣＡＡＣＴＧＴＧ
ＴＡＧＴＴＧＧＣＴＡＴＡＴＴＧＧＴＧＡＡＣＧＡＴＧ
ＣＣＡＧＴＡＣＣＧＡＧＡＴＣＴＧＡＡＡＴＧＧＴＧＧ
ＧＡＡＣＴＧＣＧＡ で示されるヒト表皮細胞増殖因子発現のための合成遺伝
子を有するＤＮＡ。 - 【請求項２】複数個のオリゴデオキシヌクレオチドを酵
素的に連結し、所望によりベクターに挿入することを特
徴とする、ＤＮＡ配列 ＡＡＣＡＧＴＧＡＴＴＣＡＧＡＡＴＧＴＣＣＴＣＴＣＴ
ＣＡＣＡＣＧＡＴＧＧＡＴＡＣＴＧＣＣＴＣＣＡＴＧＡ
ＣＧＧＣＧＴＧＴＧＴＡＴＧＴＡＴＡＴＴＧＡＡＧＣＡ
ＣＴＡＧＡＣＡＡＡＴＡＣＧＣＡＴＧＣＡＡＣＴＧＴＧ
ＴＡＧＴＴＧＧＣＴＡＴＡＴＴＧＧＴＧＡＡＣＧＡＴＧ
ＣＣＡＧＴＡＣＣＧＡＧＡＴＣＴＧＡＡＡＴＧＧＴＧＧ
ＧＡＡＣＴＧＣＧＡ で示されるヒト表皮細胞増殖因子発現のための合成遺伝
子を有するＤＮＡの製造法。
Priority Applications (6)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP59210502A JPH0642833B2 (ja) | 1984-10-09 | 1984-10-09 | ヒト表皮細胞増殖因子の遺伝子 |
| CA000492430A CA1263619A (en) | 1984-10-09 | 1985-09-08 | Dna, production and use thereof |
| US06/784,844 US4849350A (en) | 1984-10-09 | 1985-10-04 | Novel DNA, production and use thereof |
| EP85112653A EP0177915B1 (en) | 1984-10-09 | 1985-10-05 | Novel dna, production and use thereof |
| DE8585112653T DE3581255D1 (de) | 1984-10-09 | 1985-10-05 | Dns, deren herstellung und verwendung. |
| AT85112653T ATE59861T1 (de) | 1984-10-09 | 1985-10-05 | Dns, deren herstellung und verwendung. |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP59210502A JPH0642833B2 (ja) | 1984-10-09 | 1984-10-09 | ヒト表皮細胞増殖因子の遺伝子 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS6188881A JPS6188881A (ja) | 1986-05-07 |
| JPH0642833B2 true JPH0642833B2 (ja) | 1994-06-08 |
Family
ID=16590425
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP59210502A Expired - Lifetime JPH0642833B2 (ja) | 1984-10-09 | 1984-10-09 | ヒト表皮細胞増殖因子の遺伝子 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH0642833B2 (ja) |
Families Citing this family (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| AU6582594A (en) * | 1993-04-26 | 1994-11-21 | Dae Woong Pharmaceutical Co., Ltd. | A novel gene coding human epidermal growth factor and process for preparing the same |
Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4395486A (en) | 1981-08-19 | 1983-07-26 | Medical College Of Ga. Research Inst., Inc. | Method for the direct analysis of sickle cell anemia |
-
1984
- 1984-10-09 JP JP59210502A patent/JPH0642833B2/ja not_active Expired - Lifetime
Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4395486A (en) | 1981-08-19 | 1983-07-26 | Medical College Of Ga. Research Inst., Inc. | Method for the direct analysis of sickle cell anemia |
Non-Patent Citations (3)
| Title |
|---|
| Ｎａｔｕｒｅ，１９８３［３０３Ｐ．７２２−７２５ |
| ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓｅａｒｃｈ，１９８２［１０Ｐ．４４６７−４４８２ |
| Ｐｒｏｃ，Ｎａｔｌ，Ａｃａｄｓ，Ｓｃｉ，ＵＳＡ，１９８３［８０Ｐ．７４６１−７４６５ |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPS6188881A (ja) | 1986-05-07 |
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Legal Events
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|---|---|---|---|
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