JPH0642840B2 - 発癌遺伝子の解明およびそれに基づく検定法 - Google Patents
発癌遺伝子の解明およびそれに基づく検定法Info
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Description
【発明の詳細な説明】 技術分野 本発明は分子生物学の分野であり、特に突然変異体対立
遺伝子およびその対応する野性型の対立遺伝子特に発癌
遺伝子および始原発癌遺伝子間の相違を明らかにし、そ
の相違を利用して検定する事に関する。
遺伝子およびその対応する野性型の対立遺伝子特に発癌
遺伝子および始原発癌遺伝子間の相違を明らかにし、そ
の相違を利用して検定する事に関する。
背景技術 化学発癌に関連した従来の研究結果は化合物の発癌力が
しばしばその変異誘発素としての能力と相関する事を示
してきた。McCann,J.Choi,E.,Yamaski,Ｅ．およびAmes,
B.N.Proc.Natl,Acad.Sci.USA７２：５１３５−５１３９
（１９７５）；McCann,Ｊ．およびAmes,B.N.Proc.Natl,
Acad.Sci.USA７３：９５０−９５４（１９７６）；Brid
ges,B.A.Nature２６１：１９５−２００（１９７６）；
およびBouck,Ｎ．およびdiMayorca,G.Nature２６４：７
２２−７２７（１９７６）を参照されたい。この事はＤ
ＮＡが発癌活性化の終局の標的である事を示唆してい
る。このため、研究者はしばしば“発癌遺伝子”と称さ
れ、その変化が発癌への変化に決定的に重要である癌細
胞中のＤＮＡセグメントの同定および研究を試みてき
た。
しばしばその変異誘発素としての能力と相関する事を示
してきた。McCann,J.Choi,E.,Yamaski,Ｅ．およびAmes,
B.N.Proc.Natl,Acad.Sci.USA７２：５１３５−５１３９
（１９７５）；McCann,Ｊ．およびAmes,B.N.Proc.Natl,
Acad.Sci.USA７３：９５０−９５４（１９７６）；Brid
ges,B.A.Nature２６１：１９５−２００（１９７６）；
およびBouck,Ｎ．およびdiMayorca,G.Nature２６４：７
２２−７２７（１９７６）を参照されたい。この事はＤ
ＮＡが発癌活性化の終局の標的である事を示唆してい
る。このため、研究者はしばしば“発癌遺伝子”と称さ
れ、その変化が発癌への変化に決定的に重要である癌細
胞中のＤＮＡセグメントの同定および研究を試みてき
た。
最近の発癌遺伝子の単離の１つの試みにおいて、非トラ
ンスフオームＮＩＨ３Ｔ３マウス線維芽細胞内へＥＪ膀
胱癌細胞株からの腫瘍細胞ＤＮＡが導入された。この方
法により細胞から細胞へ細胞トランスフオーメーシヨン
の表現型が移せる事が発見された。腫瘍ＤＮＡは受容Ｎ
ＩＨ単層培養においてトランスフオームした細胞のフオ
ーカスを誘導できるが、正常の非トランスフオーム供与
細胞からのＤＮＡはフオーカスを生成しない。Shih,C.,
Shilo,B.,Goldfard,M.P.,Dannenberg,A.およびWeinber
g,R.A.Proc.Natl.Acad.Sci.ＵＳＡ７６：５７１４−５
７１８（１９７９）；Cooper,G.M.,Okenqist,SおよびSi
lverman,L.Nature２８４：４１８−４２１（１９８
０）；Shih,C.,Padhy,L.C.,Murray,Ｍ．Ｊ．およびWein
berg,R.A.Nature２９０：２６１−２６４（１９８
１）；Krontiris,Ｔ．Ｇ．およびCooper,G.M.Proc.Nat
l.Acad.Sci.ＵＳＡ７８：１１８１−１１８４（１９８
１）；およびPerucho,Ｍ．らＣｅｌｌ２７：４６７−４
７６（１９８１）を参照されたい。
ンスフオームＮＩＨ３Ｔ３マウス線維芽細胞内へＥＪ膀
胱癌細胞株からの腫瘍細胞ＤＮＡが導入された。この方
法により細胞から細胞へ細胞トランスフオーメーシヨン
の表現型が移せる事が発見された。腫瘍ＤＮＡは受容Ｎ
ＩＨ単層培養においてトランスフオームした細胞のフオ
ーカスを誘導できるが、正常の非トランスフオーム供与
細胞からのＤＮＡはフオーカスを生成しない。Shih,C.,
Shilo,B.,Goldfard,M.P.,Dannenberg,A.およびWeinber
g,R.A.Proc.Natl.Acad.Sci.ＵＳＡ７６：５７１４−５
７１８（１９７９）；Cooper,G.M.,Okenqist,SおよびSi
lverman,L.Nature２８４：４１８−４２１（１９８
０）；Shih,C.,Padhy,L.C.,Murray,Ｍ．Ｊ．およびWein
berg,R.A.Nature２９０：２６１−２６４（１９８
１）；Krontiris,Ｔ．Ｇ．およびCooper,G.M.Proc.Nat
l.Acad.Sci.ＵＳＡ７８：１１８１−１１８４（１９８
１）；およびPerucho,Ｍ．らＣｅｌｌ２７：４６７−４
７６（１９８１）を参照されたい。
これらの結果はＥＪ腫瘍細胞株ＤＮＡ中に存在する発癌
遺伝子因子は明らかに正常細胞のＤＮＡには存在しない
事を示している。
遺伝子因子は明らかに正常細胞のＤＮＡには存在しない
事を示している。
種々の部位−特異性エンドヌクレアーゼの処理による、
ＥＪ膀胱癌細胞株からの発癌遺伝子の感受性または抵抗
性を検討した研究は、その細胞トランスフオーメーシヨ
ンにはある種の特別な供与ＤＮＡ配列が関係している事
を示した。Lane,M.A.,Sainten,A.およびCooper,G.M.Pro
c.Natl.Acad.Sci.ＵＳＡ７８：５１８５−５１８９（１
９８１）；およびShilo，Ｂ．およびWeinberg,R.A.Natu
re.２８９：６０７−６０９（１９８１）を参照された
い。分離および特定可能な発癌遺伝子のこの概念は、後
にRobert A.Weinbergの名前で１９８２年５月１９日付
で出願中の出願番号３７９，７２１号に記載されている
方法により、ＥＪヒト膀胱癌細胞株から独立したトラン
スフオーミング遺伝子の分子単離により直接示された。
ＥＪ膀胱癌細胞株からの発癌遺伝子の感受性または抵抗
性を検討した研究は、その細胞トランスフオーメーシヨ
ンにはある種の特別な供与ＤＮＡ配列が関係している事
を示した。Lane,M.A.,Sainten,A.およびCooper,G.M.Pro
c.Natl.Acad.Sci.ＵＳＡ７８：５１８５−５１８９（１
９８１）；およびShilo，Ｂ．およびWeinberg,R.A.Natu
re.２８９：６０７−６０９（１９８１）を参照された
い。分離および特定可能な発癌遺伝子のこの概念は、後
にRobert A.Weinbergの名前で１９８２年５月１９日付
で出願中の出願番号３７９，７２１号に記載されている
方法により、ＥＪヒト膀胱癌細胞株から独立したトラン
スフオーミング遺伝子の分子単離により直接示された。
この出願中の出願に記載されている如く、ＥＪ細胞株か
ら単離されたＤＮＡを、ヒト膀胱癌発癌遺伝子およびマ
ーカーのみを実質的に含有するマウス線維芽細胞が選別
されるまでＮＩＨ３Ｔ３マウス線維芽細胞にトランスフ
エクシヨンして連続的に取り込ませる。この作業で用い
られたマーカーはＡｌｕ ＤＮＡ配列であり、ヒトＤＮ
Ａにおいては約３００，０００回繰り返しているがマウ
ス線維芽細胞ＤＮＡには存在しない。このような種間ト
ランスフエクシヨンにより最終的にマーカーを伴つた目
的とする発癌遺伝子を含有する細胞が選別される。この
トランスフエクトされた細胞からの全てのＤＮＡを用い
ラムダフアージ内にゲノムライブラリーをつくり、適当
なキメララムダフアージをヒトＡｌｕマーカーに特異的
なプローブを用いて選択する。
ら単離されたＤＮＡを、ヒト膀胱癌発癌遺伝子およびマ
ーカーのみを実質的に含有するマウス線維芽細胞が選別
されるまでＮＩＨ３Ｔ３マウス線維芽細胞にトランスフ
エクシヨンして連続的に取り込ませる。この作業で用い
られたマーカーはＡｌｕ ＤＮＡ配列であり、ヒトＤＮ
Ａにおいては約３００，０００回繰り返しているがマウ
ス線維芽細胞ＤＮＡには存在しない。このような種間ト
ランスフエクシヨンにより最終的にマーカーを伴つた目
的とする発癌遺伝子を含有する細胞が選別される。この
トランスフエクトされた細胞からの全てのＤＮＡを用い
ラムダフアージ内にゲノムライブラリーをつくり、適当
なキメララムダフアージをヒトＡｌｕマーカーに特異的
なプローブを用いて選択する。
この研究により、エンドヌクレアーゼＢａｍ ＨＩによ
り生じる6.6Ｋｂの長さのＤＮＡセグメントにＥＪ膀胱
癌ＤＮＡの発癌遺伝子の活性が位置している事が解明さ
れた。6.6ＫｂセグメントをプラスミドベクターｐＢＲ
３２２にクローン化し、サザーン・ブロツト分析におけ
る配列プローブに使用する。これにより正常ヒトゲノム
に存在する類似の構造の配列から該発癌遺伝子が誘導さ
れた事が示された。Goldfarb,M.,Shimizu,Perucho,Ｍ．
およびWigler,M.Nature２９６：４０４−４０９（１９
８２）；およびShih,Ｃ．およびWeinberg,R.,Cell２
９：１６１−１６９（１９８２）を参照されたい。この
ように、発癌過程の間に正常細胞遺伝子の突然変異によ
りヒト膀胱発癌遺伝子が生じると思われる。
り生じる6.6Ｋｂの長さのＤＮＡセグメントにＥＪ膀胱
癌ＤＮＡの発癌遺伝子の活性が位置している事が解明さ
れた。6.6ＫｂセグメントをプラスミドベクターｐＢＲ
３２２にクローン化し、サザーン・ブロツト分析におけ
る配列プローブに使用する。これにより正常ヒトゲノム
に存在する類似の構造の配列から該発癌遺伝子が誘導さ
れた事が示された。Goldfarb,M.,Shimizu,Perucho,Ｍ．
およびWigler,M.Nature２９６：４０４−４０９（１９
８２）；およびShih,Ｃ．およびWeinberg,R.,Cell２
９：１６１−１６９（１９８２）を参照されたい。この
ように、発癌過程の間に正常細胞遺伝子の突然変異によ
りヒト膀胱発癌遺伝子が生じると思われる。
ＥＪ膀胱発癌遺伝子とその対応する正常細胞配列（“始
原発癌遺伝子”）の比較は、この発癌遺伝子がラツト由
来のHarveyラツト肉腫ウイルスのトランスフオーメーシ
ヨン遺伝子と類似しているという続いての発見により促
進された。Der,C.,Krontiris,T.G.およびCooper,G.M.Pr
oc.Natl.Acad.Sci.ＵＳＡ７９：３６３７−３６４０
（１９８２）；Parada,L.F.,Tabin,C.J.,Shih,Ｃ．およ
びWeinberg,R.A.Natur２９７：４７４−４７９（１９８
２）；およびSantos,Ｅ．らNature２９８：３４３−３
４７（１９８２）を参照されたい。このラツト肉腫ウイ
ルス遺伝子（ｖ−Ｈａ−ｒａｓと名付けられている）は
キメラウイルスゲノムの形成の過程においてラツトゲノ
ムから得られたものである。Scolnick,Ｅ．Ｍ．およびP
arks,Ｗ．Ｐ．Ｊ．Virol.１３：１２１１−１２１９
（１９７４）；およびShih,T.Y.,Williams,Ｄ．Ｒ．，W
eeks,Ｍ．Ｏ．，Maryak,Ｊ．Ｍ．，Vass,Ｗ．Ｃ．およ
びScolnick,Ｅ．Ｍ．Ｊ．Virol.２７：４５−５５（１
９７８）を参照されたい。この遺伝子の研究の過程にお
いて、ｖ−Ｈａ−ｒａｓのラツトおよびヒト細胞相同体
が単離された。DeFeo,D.,Gonda,M.A..Young,H.A.,Chang
e,E.H.,Lowy,D.R.,Scolnick,E.M.およびEllis,R.W.Pro
c.Natl.Acad,Sci,ＵＳＡ７８：３３２８−３３３２（１
９８１）；および、Chang,E.H.,Gonda,M.A.Ellis,R.W.,
Scolnick,E.M.およびLowy,D.R.Proc.Natl.Acad.Sci.Ｕ
ＳＡ７９，４８４８−４８５２（１９８２）を参照され
たい。ヒト細胞ｖ−Ｈａ−ｒａｓ相同体はＥＪ膀胱発癌
遺伝子の正常前駆体と正確に対応する事が見い出され
た。
原発癌遺伝子”）の比較は、この発癌遺伝子がラツト由
来のHarveyラツト肉腫ウイルスのトランスフオーメーシ
ヨン遺伝子と類似しているという続いての発見により促
進された。Der,C.,Krontiris,T.G.およびCooper,G.M.Pr
oc.Natl.Acad.Sci.ＵＳＡ７９：３６３７−３６４０
（１９８２）；Parada,L.F.,Tabin,C.J.,Shih,Ｃ．およ
びWeinberg,R.A.Natur２９７：４７４−４７９（１９８
２）；およびSantos,Ｅ．らNature２９８：３４３−３
４７（１９８２）を参照されたい。このラツト肉腫ウイ
ルス遺伝子（ｖ−Ｈａ−ｒａｓと名付けられている）は
キメラウイルスゲノムの形成の過程においてラツトゲノ
ムから得られたものである。Scolnick,Ｅ．Ｍ．およびP
arks,Ｗ．Ｐ．Ｊ．Virol.１３：１２１１−１２１９
（１９７４）；およびShih,T.Y.,Williams,Ｄ．Ｒ．，W
eeks,Ｍ．Ｏ．，Maryak,Ｊ．Ｍ．，Vass,Ｗ．Ｃ．およ
びScolnick,Ｅ．Ｍ．Ｊ．Virol.２７：４５−５５（１
９７８）を参照されたい。この遺伝子の研究の過程にお
いて、ｖ−Ｈａ−ｒａｓのラツトおよびヒト細胞相同体
が単離された。DeFeo,D.,Gonda,M.A..Young,H.A.,Chang
e,E.H.,Lowy,D.R.,Scolnick,E.M.およびEllis,R.W.Pro
c.Natl.Acad,Sci,ＵＳＡ７８：３３２８−３３３２（１
９８１）；および、Chang,E.H.,Gonda,M.A.Ellis,R.W.,
Scolnick,E.M.およびLowy,D.R.Proc.Natl.Acad.Sci.Ｕ
ＳＡ７９，４８４８−４８５２（１９８２）を参照され
たい。ヒト細胞ｖ−Ｈａ−ｒａｓ相同体はＥＪ膀胱発癌
遺伝子の正常前駆体と正確に対応する事が見い出され
た。
Parada,L.F.,Tabin,C.J.,Shih,C.およびWeinbevg,R.A.N
ature２９７：４７４−４７９（１９８２）を参照され
たい。
ature２９７：４７４−４７９（１９８２）を参照され
たい。
ＥＪ発癌遺伝子およびその正常細胞対応物（ｃ−Ｈａ−
ｒａｓと名付けられている）の予備的な比較がなされ
た。Ellis,R.W.,DeFeo,D.,Maryak,J.M.,Young,H.A.,Shi
h,T.Y.,Chang,E.H.,Lowy,D.R.およびScolnick,E.M..J.V
ivol.３６：４０８−４２０（１９８０）。この研究に
おいて、ＮＩＨ３Ｔ３単層に加えた場合正常細胞遺伝子
からの分子クローンはフオーカスを誘導しないのに対
し、膀胱発癌遺伝子はトランスフエクトしたＤＮＡマイ
クログラム当り約５×１０４のフオーカスを形成させる
生物活性を持つ事が示されている。Shih,C.およびWeinb
erg,R.A.Cell２９：１６１−１６９（１９８２）；およ
びChang,E.H.,Gonda,M.A.,Ellis,R.W.,Scolnick,E.M.お
よびLowy,D.R.Proc.Natl.Acad.Sci.USA７９：４８４８
−５２（１９８２）を参照されたい。
ｒａｓと名付けられている）の予備的な比較がなされ
た。Ellis,R.W.,DeFeo,D.,Maryak,J.M.,Young,H.A.,Shi
h,T.Y.,Chang,E.H.,Lowy,D.R.およびScolnick,E.M..J.V
ivol.３６：４０８−４２０（１９８０）。この研究に
おいて、ＮＩＨ３Ｔ３単層に加えた場合正常細胞遺伝子
からの分子クローンはフオーカスを誘導しないのに対
し、膀胱発癌遺伝子はトランスフエクトしたＤＮＡマイ
クログラム当り約５×１０４のフオーカスを形成させる
生物活性を持つ事が示されている。Shih,C.およびWeinb
erg,R.A.Cell２９：１６１−１６９（１９８２）；およ
びChang,E.H.,Gonda,M.A.,Ellis,R.W.,Scolnick,E.M.お
よびLowy,D.R.Proc.Natl.Acad.Sci.USA７９：４８４８
−５２（１９８２）を参照されたい。
この純然たる機能上の相違は２つのクローン間の明らか
な構造的相違としては相関しない。ＥＪ発癌遺伝子クロ
ーンおよび非クローン化関連ヒト始原発癌遺伝子の大ま
かな制限エンドヌクレアーゼ部位地図作成では、ＥＪ発
癌遺伝子のトランスフオーミング活性を含有する6.6Ｋ
ｂ配列のすべてにわたつて、この２つは基本的に区別で
いない事が示された。Shih,Ｃ．およびWeinberg,R.A.Ce
ll２９：１６１−１６９（１９８２）を参照されたい。
後になされた精密な地図作成は２つの遺伝子の分子クロ
ーンの直接の比較を可能にしたが、やはり遺伝子の暗号
付け領域の３′（下流）の１つの相違を除いては一連の
異つたエンドヌクレアーゼを用いても相違は観察されな
かつた。この相違は他の研究者により以前に証明された
タイプの、遺伝子プール中に存在する遺伝子の機能とは
無関係な多形性を現わすものとして説明された。Goldfa
rb,M.,Shimizu,Perucho,M.およびWigler,M.Nature２９
６：４０４−４０９（１９８２）を参照されたい。
な構造的相違としては相関しない。ＥＪ発癌遺伝子クロ
ーンおよび非クローン化関連ヒト始原発癌遺伝子の大ま
かな制限エンドヌクレアーゼ部位地図作成では、ＥＪ発
癌遺伝子のトランスフオーミング活性を含有する6.6Ｋ
ｂ配列のすべてにわたつて、この２つは基本的に区別で
いない事が示された。Shih,Ｃ．およびWeinberg,R.A.Ce
ll２９：１６１−１６９（１９８２）を参照されたい。
後になされた精密な地図作成は２つの遺伝子の分子クロ
ーンの直接の比較を可能にしたが、やはり遺伝子の暗号
付け領域の３′（下流）の１つの相違を除いては一連の
異つたエンドヌクレアーゼを用いても相違は観察されな
かつた。この相違は他の研究者により以前に証明された
タイプの、遺伝子プール中に存在する遺伝子の機能とは
無関係な多形性を現わすものとして説明された。Goldfa
rb,M.,Shimizu,Perucho,M.およびWigler,M.Nature２９
６：４０４−４０９（１９８２）を参照されたい。
このように、ヒト膀胱癌発癌遺伝子およびその正常始原
発癌遺伝子の２つの構造的に同様の遺伝子の劇的な機能
上の相違が示されてきた。２つの遺伝子の構造上の相違
は従来未知であるが、機能的相違を産み出す相違は次の
２つのうちの何れかの仕組によるものと推測された。即
ち、機能上の変化は、遺伝子の発現を調節している配列
の変化によるか、もしくはトランスフオームした発現型
の変化は遺伝子の蛋白質をコードする部分の変化による
かである。第１の仮説は遺伝子の転写または翻訳を上昇
させ、高水準の普通ならば正常の蛋白質を産生するに違
いないし、一方第２の仮説は変つた蛋白質の合成を示唆
している。両方の型の変化もまた観察される機能上の相
違を創造する事に関係するように働くかも知れない。
発癌遺伝子の２つの構造的に同様の遺伝子の劇的な機能
上の相違が示されてきた。２つの遺伝子の構造上の相違
は従来未知であるが、機能的相違を産み出す相違は次の
２つのうちの何れかの仕組によるものと推測された。即
ち、機能上の変化は、遺伝子の発現を調節している配列
の変化によるか、もしくはトランスフオームした発現型
の変化は遺伝子の蛋白質をコードする部分の変化による
かである。第１の仮説は遺伝子の転写または翻訳を上昇
させ、高水準の普通ならば正常の蛋白質を産生するに違
いないし、一方第２の仮説は変つた蛋白質の合成を示唆
している。両方の型の変化もまた観察される機能上の相
違を創造する事に関係するように働くかも知れない。
発明の開示 本発明は、従来ヒト膀胱癌を起こすことが示されている
ＥＪ発癌遺伝子およびその始原発癌遺伝子間の相違を調
べる事に関係する。示される方法はどんな変異体対立遺
伝子およびその対応する野性型対立遺伝子間の相違を決
定するのに応用できる；この方法は発癌遺伝子および始
原発癌遺伝子間の相違を決定するのに特に有効である。
ＥＪ発癌遺伝子およびその始原発癌遺伝子間の相違を調
べる事に関係する。示される方法はどんな変異体対立遺
伝子およびその対応する野性型対立遺伝子間の相違を決
定するのに応用できる；この方法は発癌遺伝子および始
原発癌遺伝子間の相違を決定するのに特に有効である。
最初に、ＥＪ発癌遺伝子およびその始原発癌遺伝子間の
劇的な機能の相違が調節機能によるものか、または配列
の相違によるものかを決定する実験を実施した。これら
の実験により、前記遺伝子の調節の促進が細胞トランス
フオーメーシヨンの原因ではない事を示すデータが提供
された。それ故、劇的な機能変化は前記遺伝子のＤＮＡ
配列の変化によるに違いないと決定された。
劇的な機能の相違が調節機能によるものか、または配列
の相違によるものかを決定する実験を実施した。これら
の実験により、前記遺伝子の調節の促進が細胞トランス
フオーメーシヨンの原因ではない事を示すデータが提供
された。それ故、劇的な機能変化は前記遺伝子のＤＮＡ
配列の変化によるに違いないと決定された。
ＮＩＨ３Ｔ３線維芽細胞の細胞トランスフオーメーシヨ
ンの原因となる6.6Ｋｂ ｐＥＪの範囲を一連のイン
ビトロでの遺伝子組換えにより３５０塩基対のセグメン
トにしぼつた。この３５０塩基対セグメントについて、
発癌遺伝子および始原発癌遺伝子の配列が求められ、Ｘ
ｍａＩ制限部位から６０番目のヌクレオチドの相違で説
明される単一の塩基の置換が観察された。この通常ＧＧ
Ｃとして存在するグリシン（Ｇｌｙ１２）のためのコド
ンが置換され、バリンを発現するコドンのＧＴＣ配列に
変化していた。それ故、ＥＪおよびその始原発癌遺伝子
からの細胞ＤＮＡ中の特定の相違の場所がつきとめら
れ、対応するｐ２１蛋白質のアミノ酸配列の相違もまた
決定された。
ンの原因となる6.6Ｋｂ ｐＥＪの範囲を一連のイン
ビトロでの遺伝子組換えにより３５０塩基対のセグメン
トにしぼつた。この３５０塩基対セグメントについて、
発癌遺伝子および始原発癌遺伝子の配列が求められ、Ｘ
ｍａＩ制限部位から６０番目のヌクレオチドの相違で説
明される単一の塩基の置換が観察された。この通常ＧＧ
Ｃとして存在するグリシン（Ｇｌｙ１２）のためのコド
ンが置換され、バリンを発現するコドンのＧＴＣ配列に
変化していた。それ故、ＥＪおよびその始原発癌遺伝子
からの細胞ＤＮＡ中の特定の相違の場所がつきとめら
れ、対応するｐ２１蛋白質のアミノ酸配列の相違もまた
決定された。
次に、ＤＮＡ配列内のそのような変化を検出する検定法
を開発した。一つの型の検定法では発癌遺伝子または始
原発癌遺伝子の一方の部位に特有の制限酵素（しかし、
他のものにはそうではない）を用い、そのＤＮＡ配列中
の相違を検出する。
を開発した。一つの型の検定法では発癌遺伝子または始
原発癌遺伝子の一方の部位に特有の制限酵素（しかし、
他のものにはそうではない）を用い、そのＤＮＡ配列中
の相違を検出する。
これらの遺伝子により暗号化されたｐ２１蛋白質もまた
異つているので、ｐ２１蛋白質中の変化した、または正
常配列領域に、または発癌の間に生じる変化には含まれ
ないアミノ酸配列に特異的なポリクローナルまたはモノ
クローナル抗体の如き血清学の試薬もまた発展できた。
そのような血清学試薬はヒト膀胱発癌のための非常に感
度の良い試験を提供する種々のプロトコールに用いる事
ができる。同様に、これらの検定は他の変異体対立遺伝
子により起こされる野性株の対立遺伝子の変化を検出す
るのに用いる事ができる。
異つているので、ｐ２１蛋白質中の変化した、または正
常配列領域に、または発癌の間に生じる変化には含まれ
ないアミノ酸配列に特異的なポリクローナルまたはモノ
クローナル抗体の如き血清学の試薬もまた発展できた。
そのような血清学試薬はヒト膀胱発癌のための非常に感
度の良い試験を提供する種々のプロトコールに用いる事
ができる。同様に、これらの検定は他の変異体対立遺伝
子により起こされる野性株の対立遺伝子の変化を検出す
るのに用いる事ができる。
図面の簡単な説明 第１Ａは正常およびトランスフオーム膀胱細胞の両方か
ら得られた総細胞ＲＮＡの電気泳動ゲルパターンを示
し、そのパターンはオートラジオグラフイーにより視覚
化した； 図１Ｂは、ｖ−Ｈａ−ｒａｓｐ２１蛋白質に対するモノ
クローナル抗血清を用い、ＥＪおよび正常膀胱細胞両方
からの代謝的標識蛋白質溶解物の沈降により得られた電
気泳動ゲルパターンを示す； 図２Ａは、ｐＥＪまたはｐＥＣでトランスフエクトした
４つの細胞株からの細胞ＤＮＡの電気泳動ゲルパターン
を示す。
ら得られた総細胞ＲＮＡの電気泳動ゲルパターンを示
し、そのパターンはオートラジオグラフイーにより視覚
化した； 図１Ｂは、ｖ−Ｈａ−ｒａｓｐ２１蛋白質に対するモノ
クローナル抗血清を用い、ＥＪおよび正常膀胱細胞両方
からの代謝的標識蛋白質溶解物の沈降により得られた電
気泳動ゲルパターンを示す； 図２Ａは、ｐＥＪまたはｐＥＣでトランスフエクトした
４つの細胞株からの細胞ＤＮＡの電気泳動ゲルパターン
を示す。
図２Ｂは、同一の４つのトランスフエクトした細胞株か
らの総ポリアデニル化ＲＮＡの電気泳動ゲルパターンを
示す； 図２Ｃは同一の４つのトランスフエクトした細胞株の細
胞溶解物からｐ２１蛋白質を免疫沈降した電気泳動ゲル
パターンを示す； 図３Ａ−３ＤはｐＥＪまたはｐＥＣでトランスフエクト
した４つの細胞株を５００倍の倍率の位相差顕微鏡を通
して得た写真である； 図４はｐＥＪまたはｐＥＣでトランスフエクトした細胞
からの免疫沈降ｐ２１蛋白質の電気泳動ゲルパターンを
示す； 図５はＥＪトランスフオーミング遺伝子およびその正常
細胞相同体から構成されたイン ビトロ遺伝子組み換え
体を図式的に示したものであり、その遺伝子組み換え体
で実施した実験のトランスフエクシヨンおよびトランス
フオーメーシヨンのデータの概要もまた含んでいる； 図６はイン ビトロでＥＪ発癌遺伝子クローン（ｐＥ
Ｊ）およびその相同始原発癌遺伝子クローン（ｐＥＣ）
の組み換え体でトランスフエクトした細胞から免疫沈降
したｐ２１蛋白質の移動の電気泳動ゲルパターンを示
す； 図７はＥＪトランスフオーミング遺伝子およびその非−
トランスフオーミング細胞相同体の分子クローンのＤＮ
Ａ配列の比較を示しており、また各々の発現するアミノ
酸配列も示す； 図８はＮａｅＩ制限酵素で切断されるＥＪおよびＥＣ遺
伝子のクローンのフラグメントの相違を示した電気泳動
ゲルパターンを示し；および 図９および１０はエンドヌクレアーゼまたは正常遺伝子
またはトランスフオーミング遺伝子で暗号化された蛋白
質に対する抗血清を用いる検定プロトコールを示したブ
ロツクダイアグラムである。
らの総ポリアデニル化ＲＮＡの電気泳動ゲルパターンを
示す； 図２Ｃは同一の４つのトランスフエクトした細胞株の細
胞溶解物からｐ２１蛋白質を免疫沈降した電気泳動ゲル
パターンを示す； 図３Ａ−３ＤはｐＥＪまたはｐＥＣでトランスフエクト
した４つの細胞株を５００倍の倍率の位相差顕微鏡を通
して得た写真である； 図４はｐＥＪまたはｐＥＣでトランスフエクトした細胞
からの免疫沈降ｐ２１蛋白質の電気泳動ゲルパターンを
示す； 図５はＥＪトランスフオーミング遺伝子およびその正常
細胞相同体から構成されたイン ビトロ遺伝子組み換え
体を図式的に示したものであり、その遺伝子組み換え体
で実施した実験のトランスフエクシヨンおよびトランス
フオーメーシヨンのデータの概要もまた含んでいる； 図６はイン ビトロでＥＪ発癌遺伝子クローン（ｐＥ
Ｊ）およびその相同始原発癌遺伝子クローン（ｐＥＣ）
の組み換え体でトランスフエクトした細胞から免疫沈降
したｐ２１蛋白質の移動の電気泳動ゲルパターンを示
す； 図７はＥＪトランスフオーミング遺伝子およびその非−
トランスフオーミング細胞相同体の分子クローンのＤＮ
Ａ配列の比較を示しており、また各々の発現するアミノ
酸配列も示す； 図８はＮａｅＩ制限酵素で切断されるＥＪおよびＥＣ遺
伝子のクローンのフラグメントの相違を示した電気泳動
ゲルパターンを示し；および 図９および１０はエンドヌクレアーゼまたは正常遺伝子
またはトランスフオーミング遺伝子で暗号化された蛋白
質に対する抗血清を用いる検定プロトコールを示したブ
ロツクダイアグラムである。
発明の詳細な説明 前に指摘した如く、出願中の米国特許出願第３７９，７
２１号に記載されている方法により、ＥＪ膀胱癌細胞株
から発癌遺伝子が単離された。発癌遺伝子は6.6Ｋｂを
含みＮＩＨ３Ｔ３マウス線維芽細胞に対しトランスフオ
ームさせる活性を持つ事が示された。ここに記載した研
究はこの従来の研究の続きであるから、この先行する出
願中の出願番号第３７９，７２１号はそのため説明的に
本明細書に含まれる。
２１号に記載されている方法により、ＥＪ膀胱癌細胞株
から発癌遺伝子が単離された。発癌遺伝子は6.6Ｋｂを
含みＮＩＨ３Ｔ３マウス線維芽細胞に対しトランスフオ
ームさせる活性を持つ事が示された。ここに記載した研
究はこの従来の研究の続きであるから、この先行する出
願中の出願番号第３７９，７２１号はそのため説明的に
本明細書に含まれる。
ここにおいて“発癌遺伝子”の用語は細胞中での発現型
が細胞を正常細胞から癌細胞へ変換する事を誘導する遺
伝子配列を意味するものとして用いる。同様に、用語
“始原発癌遺伝子”は正常、非癌細胞の正常ゲノム中に
存在しており、適当な方法で変化させた場合発癌遺伝子
になる能力を持つ遺伝子配列を意味する。
が細胞を正常細胞から癌細胞へ変換する事を誘導する遺
伝子配列を意味するものとして用いる。同様に、用語
“始原発癌遺伝子”は正常、非癌細胞の正常ゲノム中に
存在しており、適当な方法で変化させた場合発癌遺伝子
になる能力を持つ遺伝子配列を意味する。
米国特許出願第３７９，７２１号に記載されている方法
で単離した完全な発癌遺伝子クローン（ｐＥＪ）および
その正常ヒト相同体クローン（ｐＥＣ）の配列決定は、
これら２つの遺伝子の配列の単純な比較には用いられな
い。発癌遺伝子およびその正常始原発癌遺伝子相対物配
列は別々の固体から得られたＤＮＡｓであるので、これ
らの間の多くの配列の相違はこの座位における自然に依
存する単なる多形性を反映しているかもしれない。他の
配列の相違は発癌の間に受ける突然変異傷害の結果かも
しれず、それは機能的に不活性であり、活性化過程には
重要性を持たない。
で単離した完全な発癌遺伝子クローン（ｐＥＪ）および
その正常ヒト相同体クローン（ｐＥＣ）の配列決定は、
これら２つの遺伝子の配列の単純な比較には用いられな
い。発癌遺伝子およびその正常始原発癌遺伝子相対物配
列は別々の固体から得られたＤＮＡｓであるので、これ
らの間の多くの配列の相違はこの座位における自然に依
存する単なる多形性を反映しているかもしれない。他の
配列の相違は発癌の間に受ける突然変異傷害の結果かも
しれず、それは機能的に不活性であり、活性化過程には
重要性を持たない。
発癌遺伝子および始原発癌遺伝子間の有意な相違が調節
の相違によるかどうかを決定する為、正常ヒト膀胱上皮
細胞株からのｃ−Ｈａ−ｒａｓ始原発癌遺伝子（ＥＣ）
の発現と、ＥＪでトランスフオームされた膀胱細胞中の
発癌遺伝子の発現の比較を行つた。用いたＨｂ１−５膀
胱上皮細胞は、５ケ月のヒト膀胱から得られた不活性化
ＮＩＨ３Ｔ３フイーダーレヤー上で増殖させた初代組織
培養のものである。この培養細胞を新鮮ヒト膀胱組織か
ら成長させると、遷移的な膀胱上皮に期待されるいくつ
かの性質を示した。それは基礎にある間質物質がなく、
その結果、膀胱癌の由来した細胞に厳密に相当するもの
である。
の相違によるかどうかを決定する為、正常ヒト膀胱上皮
細胞株からのｃ−Ｈａ−ｒａｓ始原発癌遺伝子（ＥＣ）
の発現と、ＥＪでトランスフオームされた膀胱細胞中の
発癌遺伝子の発現の比較を行つた。用いたＨｂ１−５膀
胱上皮細胞は、５ケ月のヒト膀胱から得られた不活性化
ＮＩＨ３Ｔ３フイーダーレヤー上で増殖させた初代組織
培養のものである。この培養細胞を新鮮ヒト膀胱組織か
ら成長させると、遷移的な膀胱上皮に期待されるいくつ
かの性質を示した。それは基礎にある間質物質がなく、
その結果、膀胱癌の由来した細胞に厳密に相当するもの
である。
総細胞ＲＮＡが正常およびトランスフオームした膀胱細
胞から調製された。ホルムアルデヒドゲル上でＲＮＡを
展開し、ニトロセルロースフイルターに移行し、ニツク
−トランスレートしたＥＪ発癌遺伝子クローンでフイル
ターをプローブし、転写ＲＮＡを分析した。用いた具体
的方法は以下の如くである。
胞から調製された。ホルムアルデヒドゲル上でＲＮＡを
展開し、ニトロセルロースフイルターに移行し、ニツク
−トランスレートしたＥＪ発癌遺伝子クローンでフイル
ターをプローブし、転写ＲＮＡを分析した。用いた具体
的方法は以下の如くである。
総ポリアデニル化ＲＮＡはＶａｒｍｕｓらの技術により
調製した。Varmus,H.E.,Quintrell,N.およびOrtiz,S.Ce
ll２５：２３−３６（１９８１）を参照されたい。次
に、４マイクログラムのＲＮＡをホルムアルデヒド含有
２パーセントアガロースゲルを通した電気泳動により分
画し、ニトロセルロースへ移行させる。ｒａｓ−特異プ
ローブは、ｐＥＪをＢａｍＨＩで切断し、生じる断片を
１パーセントアガロースを通して分画し、6.6Ｋｂ断片
をＮａＩおよびガラスビーズで抽出することにより調製
した。ニツク−トランスレートしたフラグメント（6.6
×１０７ｃｐｍ／マイクログラム）を固定化したＲＮＡ
にアニールした。Rigby,Ｐ．ＷらＪ．Mol.Biol.１３：
２３７−２５１（１９７７）；およびWahl,G.M.,Stern,
Ｍ．およびStark,G.R.Proc.Natl.Acad.Sci.ＵＳＡ７
６：３６８３−３６８７（１９７９）を参照されたい。
プローブと相同のバンドはオートラジオグラフイーによ
り視覚化する。分子量は、アデノウイルスレイトプロモ
ーターのイン ビトロ ラン−オフ転写により得られた
マーカーとの比較により決定した。Manley,Ｊ．Ｌ．らP
roc.Natl.Acad.Sci.ＵＳＡ７７：３８５５−３８５９
（１９８０）を参照されたい。
調製した。Varmus,H.E.,Quintrell,N.およびOrtiz,S.Ce
ll２５：２３−３６（１９８１）を参照されたい。次
に、４マイクログラムのＲＮＡをホルムアルデヒド含有
２パーセントアガロースゲルを通した電気泳動により分
画し、ニトロセルロースへ移行させる。ｒａｓ−特異プ
ローブは、ｐＥＪをＢａｍＨＩで切断し、生じる断片を
１パーセントアガロースを通して分画し、6.6Ｋｂ断片
をＮａＩおよびガラスビーズで抽出することにより調製
した。ニツク−トランスレートしたフラグメント（6.6
×１０７ｃｐｍ／マイクログラム）を固定化したＲＮＡ
にアニールした。Rigby,Ｐ．ＷらＪ．Mol.Biol.１３：
２３７−２５１（１９７７）；およびWahl,G.M.,Stern,
Ｍ．およびStark,G.R.Proc.Natl.Acad.Sci.ＵＳＡ７
６：３６８３−３６８７（１９７９）を参照されたい。
プローブと相同のバンドはオートラジオグラフイーによ
り視覚化する。分子量は、アデノウイルスレイトプロモ
ーターのイン ビトロ ラン−オフ転写により得られた
マーカーとの比較により決定した。Manley,Ｊ．Ｌ．らP
roc.Natl.Acad.Sci.ＵＳＡ７７：３８５５−３８５９
（１９８０）を参照されたい。
図１Ａは２つの細胞型中のｃ−Ｈａ−ｒａｓ特異ＲＮＡ
の相対レベルを示す：レーン１、ＥＪ細胞からのＲＮ
Ａ；レーン２、Ｈｂ１−５細胞からのＲＮＡ。観察され
る如く、同じレベルのＲＮＡが２つの培養細胞で検出さ
れ、転写されたサイズは1.2Ｋｂであつた。ｒａｓ 遺伝子のただ１つ知られている生成物は約２１，
０００ダクトンの質量の蛋白質（ｐ２１と名付けられて
いる）である。ＥＪおよび正常膀胱細胞の両方からのｐ
２１蛋白質溶解物の泳動速度を分析する実験を行つた。
ｖ−Ｈａ−ｒａｓｐ２１蛋白質に対するモノクローナル
抗血清を用いた。Furth,M.E.,Davis,L.J.,Fleurdelys,
Ｂ．およびScolnick,E.M.J.Virol.４３：２９４−３０
４（１９８２）を参照されたい。存在する抗原の免疫沈
降が必要とするより過剰の抗体量を使用した事は対照実
験により確認した。結果を図１Ｂに示す。
の相対レベルを示す：レーン１、ＥＪ細胞からのＲＮ
Ａ；レーン２、Ｈｂ１−５細胞からのＲＮＡ。観察され
る如く、同じレベルのＲＮＡが２つの培養細胞で検出さ
れ、転写されたサイズは1.2Ｋｂであつた。ｒａｓ 遺伝子のただ１つ知られている生成物は約２１，
０００ダクトンの質量の蛋白質（ｐ２１と名付けられて
いる）である。ＥＪおよび正常膀胱細胞の両方からのｐ
２１蛋白質溶解物の泳動速度を分析する実験を行つた。
ｖ−Ｈａ−ｒａｓｐ２１蛋白質に対するモノクローナル
抗血清を用いた。Furth,M.E.,Davis,L.J.,Fleurdelys,
Ｂ．およびScolnick,E.M.J.Virol.４３：２９４−３０
４（１９８２）を参照されたい。存在する抗原の免疫沈
降が必要とするより過剰の抗体量を使用した事は対照実
験により確認した。結果を図１Ｂに示す。
具体的には、培養細胞を１２時間３５Ｓ−メチオニンで
標識した。その後溶解物を調製し、非免疫血清（レーン
１ａおよび２ａ）、Ｈａ−ＭｕＳＶでコードされたｐ２
１を沈降させ、しかしＫｉ−ＭｕＳＶでコードされたｐ
２１は沈降させないモノクローナル抗血清（Ｙ１３−２
３８）（レーン１ｂおよび２ｂ）またはＨａ−ＭｕＳＶ
およびＫｉ−ＭｕＳＶのｐ２１を両方検出するモノクロ
ーナル抗血清（Ｙ１３−２５６９）（レーン１ｃおよび
２ｃ）で免疫沈降させる。Shih,T.Y.,Weeks,M.O.,Youn
g,Ｈ．Ａ．およびScolnick,E.M.Virology９６：６４−
７９（１９７９）を参照されたい。試料当り２０×１０
６ｃｐｍの溶解物を12.5パーセントＳＤＳ−アクリルア
ミドゲルの電気泳動で分離した。
標識した。その後溶解物を調製し、非免疫血清（レーン
１ａおよび２ａ）、Ｈａ−ＭｕＳＶでコードされたｐ２
１を沈降させ、しかしＫｉ−ＭｕＳＶでコードされたｐ
２１は沈降させないモノクローナル抗血清（Ｙ１３−２
３８）（レーン１ｂおよび２ｂ）またはＨａ−ＭｕＳＶ
およびＫｉ−ＭｕＳＶのｐ２１を両方検出するモノクロ
ーナル抗血清（Ｙ１３−２５６９）（レーン１ｃおよび
２ｃ）で免疫沈降させる。Shih,T.Y.,Weeks,M.O.,Youn
g,Ｈ．Ａ．およびScolnick,E.M.Virology９６：６４−
７９（１９７９）を参照されたい。試料当り２０×１０
６ｃｐｍの溶解物を12.5パーセントＳＤＳ−アクリルア
ミドゲルの電気泳動で分離した。
図１ＢはＥＪ細胞クローン（レーン１、ａ−ｃ）および
Ｈｂ１−５細胞（レーン２、ａ−ｃ）の細胞溶解物から
免疫沈降したｐ２１蛋白質の比較を示す。これらのデー
タは正常膀胱細胞からの抗−ｐ２１血清により放射標識
蛋白質の少くとも２つのバンドが特異的に免疫沈降した
事を示す。膀胱癌細胞の蛋白質パターンの詳細な解析に
よりバンドの複雑な配列が明らかになつた：近い間隔の
２重バンドが２対。ｐ２１バンドの強度を非特異的に沈
降させたバツクグラウンドのバンドの強度の比較によ
り、正常および癌細胞のｐ２１蛋白質は同程度の量存在
する事が明らかとなつた。
Ｈｂ１−５細胞（レーン２、ａ−ｃ）の細胞溶解物から
免疫沈降したｐ２１蛋白質の比較を示す。これらのデー
タは正常膀胱細胞からの抗−ｐ２１血清により放射標識
蛋白質の少くとも２つのバンドが特異的に免疫沈降した
事を示す。膀胱癌細胞の蛋白質パターンの詳細な解析に
よりバンドの複雑な配列が明らかになつた：近い間隔の
２重バンドが２対。ｐ２１バンドの強度を非特異的に沈
降させたバツクグラウンドのバンドの強度の比較によ
り、正常および癌細胞のｐ２１蛋白質は同程度の量存在
する事が明らかとなつた。
上記のデータは転写の活発化がＥＪ発癌遺伝子により示
される新しい活性の原因ではない事を示している。この
結論は用いたハイブリダイゼーシヨンの条件下、発癌遺
伝子プローブがヒトｃ−Ｈａ−ｒａｓ遺伝子の転写物に
独占的に反応するという事実に一部依存している。蛋白
質のデータの解釈はあまり明確ではないが、両方の細胞
がHarvey−特異血清に反応性のある同じような量の蛋白
質を持ち、これらの蛋白質は集合的に“ｐ２１”と称さ
れる事は明らかである。
される新しい活性の原因ではない事を示している。この
結論は用いたハイブリダイゼーシヨンの条件下、発癌遺
伝子プローブがヒトｃ−Ｈａ−ｒａｓ遺伝子の転写物に
独占的に反応するという事実に一部依存している。蛋白
質のデータの解釈はあまり明確ではないが、両方の細胞
がHarvey−特異血清に反応性のある同じような量の蛋白
質を持ち、これらの蛋白質は集合的に“ｐ２１”と称さ
れる事は明らかである。
膀胱上皮細胞が膀胱癌細胞の正常前駆体の代表ではない
という可能性が残つている。ｒａｓ遺伝子は一つの細胞
種においてはトランスフオーメーシヨンを誘導する事な
く高い水準で発現され、第２の細胞種において不適当に
発現される場合にのみこの表現型を達成する可能性があ
るので、上記可能性は解釈を難かしくする。それ故、２
つの遺伝子を同じ細胞のバツクグラウンド下において転
写および翻訳の程度を測定した。
という可能性が残つている。ｒａｓ遺伝子は一つの細胞
種においてはトランスフオーメーシヨンを誘導する事な
く高い水準で発現され、第２の細胞種において不適当に
発現される場合にのみこの表現型を達成する可能性があ
るので、上記可能性は解釈を難かしくする。それ故、２
つの遺伝子を同じ細胞のバツクグラウンド下において転
写および翻訳の程度を測定した。
両方の遺伝子の分子クローンをＮＩＨ３Ｔ３細胞に導入
した。ＥＪ発癌遺伝子を獲得したコロニーは容易にその
トランスフオームした形態から同定される。しかしなが
ら、正常対立遺伝子のクローンを獲得した細胞は、挙動
上の明瞭な変化による同定をすることができない。
した。ＥＪ発癌遺伝子を獲得したコロニーは容易にその
トランスフオームした形態から同定される。しかしなが
ら、正常対立遺伝子のクローンを獲得した細胞は、挙動
上の明瞭な変化による同定をすることができない。
この為、優性で選択できるEcogpt遺伝子のクローンを１
０倍過剰量のクローン化ＥＪ発癌遺伝子またはクロン化
始原発癌遺伝子（ｐＥＣ）と一緒にＮＩＨ３Ｔ３細胞に
トタンスフエクトした。特に２×１０６細胞当り、７５
マイクログラムのＮＩＨ３Ｔ３キヤリアＤＮＡ、５００
ｎｇのｐＥＪまたはｐＥＣ ＤＮＡ、および５０ｎｇの
ｐＳＶＺｇｐｔを用い、既知の技術を用いトランスフエ
クシヨンを実施した。Graham,Ｆ．Ｌ．およびVan der E
b,A.J.Virology５２：４５６−４７１（１９７３）；お
よびAndersson,P.,Goldfarb,Ｍ．Ｐ．およびWeinberg,
R.A.Cell１６：６３−７５（１９７９）を参照された
い。各々の場合、Ecogpt遺伝子により与えられるミコフ
エノール酸への抵抗性でコロニーを選択した。Mullgan,
Ｒ．およびBerg,P.Proc.Natl.Acad.Sci.ＵＳＡ７３：２
０７２−２０７６（１９８１）を参照されたい。
０倍過剰量のクローン化ＥＪ発癌遺伝子またはクロン化
始原発癌遺伝子（ｐＥＣ）と一緒にＮＩＨ３Ｔ３細胞に
トタンスフエクトした。特に２×１０６細胞当り、７５
マイクログラムのＮＩＨ３Ｔ３キヤリアＤＮＡ、５００
ｎｇのｐＥＪまたはｐＥＣ ＤＮＡ、および５０ｎｇの
ｐＳＶＺｇｐｔを用い、既知の技術を用いトランスフエ
クシヨンを実施した。Graham,Ｆ．Ｌ．およびVan der E
b,A.J.Virology５２：４５６−４７１（１９７３）；お
よびAndersson,P.,Goldfarb,Ｍ．Ｐ．およびWeinberg,
R.A.Cell１６：６３−７５（１９７９）を参照された
い。各々の場合、Ecogpt遺伝子により与えられるミコフ
エノール酸への抵抗性でコロニーを選択した。Mullgan,
Ｒ．およびBerg,P.Proc.Natl.Acad.Sci.ＵＳＡ７３：２
０７２−２０７６（１９８１）を参照されたい。
非選択セグメントの導入が選択可能遺伝子との共トラン
スフエクシヨンより確められるのでこの戦略を用いた。
Wigler,Ｍ．らCell１６：７７７−７８５（１９７９）
を参照されたい。この例では、ＥｃｏｇｐｔおよびｐＥ
Ｊの共トランスフエクシヨンにより誘導される７５パー
セントのミコフエノール酸耐性コロニーが形態的にトラ
ンスフオームしている事が観察された；予期した通り、
ｐＥＣによる共トランスフエクシヨン後現われるコロニ
ーはトランスフオームしていなかつた。
スフエクシヨンより確められるのでこの戦略を用いた。
Wigler,Ｍ．らCell１６：７７７−７８５（１９７９）
を参照されたい。この例では、ＥｃｏｇｐｔおよびｐＥ
Ｊの共トランスフエクシヨンにより誘導される７５パー
セントのミコフエノール酸耐性コロニーが形態的にトラ
ンスフオームしている事が観察された；予期した通り、
ｐＥＣによる共トランスフエクシヨン後現われるコロニ
ーはトランスフオームしていなかつた。
両方の種類のコロニーの細胞ＤＮＡをｐＥＣまたはｐＥ
Ｊ配列が存在するか否かのために分析した。クローン化
発癌遺伝子または始原発癌遺伝子の各々の無傷のコピー
から6.6Ｋｂフラグメントを遊離する事が期待されるエ
ンドヌクレアーゼＢａｍＨＩで各々のＤＮＡ１０マイク
ログラムを消化した。消化されたＤＮＡは１パーセント
アガロースゲルを通して分画し、ニトロセルロースペー
パーに移す。５×１０６ｃｐｍのｒａｓ−特異プローブ
（前に記載したものと同じ）をフイルターに結合したＤ
ＮＡとインキユベートする。結果は図２Ａに示してあり
レーンは：レーン１、ＮＩＨ３Ｔ３ＤＮＡ；レーン２お
よび３、ｐＥＪでトランスフエクトした細胞株からのＤ
ＮＡ：ＥＪ／Ｇｐｔ−２（２）およびＥＪ／Ｇｐｔ−３
（３）；レーン４および５、ｐＥＣでトランスフエクト
した細胞株からのＤＮＡ：ＥＣ／Ｇｐｔ−１（４）およ
びＥＣ／Ｇｐｔ−５（５）。
Ｊ配列が存在するか否かのために分析した。クローン化
発癌遺伝子または始原発癌遺伝子の各々の無傷のコピー
から6.6Ｋｂフラグメントを遊離する事が期待されるエ
ンドヌクレアーゼＢａｍＨＩで各々のＤＮＡ１０マイク
ログラムを消化した。消化されたＤＮＡは１パーセント
アガロースゲルを通して分画し、ニトロセルロースペー
パーに移す。５×１０６ｃｐｍのｒａｓ−特異プローブ
（前に記載したものと同じ）をフイルターに結合したＤ
ＮＡとインキユベートする。結果は図２Ａに示してあり
レーンは：レーン１、ＮＩＨ３Ｔ３ＤＮＡ；レーン２お
よび３、ｐＥＪでトランスフエクトした細胞株からのＤ
ＮＡ：ＥＪ／Ｇｐｔ−２（２）およびＥＪ／Ｇｐｔ−３
（３）；レーン４および５、ｐＥＣでトランスフエクト
した細胞株からのＤＮＡ：ＥＣ／Ｇｐｔ−１（４）およ
びＥＣ／Ｇｐｔ−５（５）。
正常マウスｒａｓ遺伝子相同体はｐＥＪプローブと非常
に弱くハイブリダイズする。Parada,L.F.,Tabin,C.J.,S
hih,Ｃ．およびWeinberg,R.A.Nature２９７：４７４−
４７９（１９８２）を参照されたい。従つて、その存在
は結果に不鮮明さをもたらさない。トランスフエクトし
たｐＢＲ３２２配列がデータの解釈を妨害しない事を確
めるため、ｒａｓ−特異配列をｐＥＪから作り、プロー
ブとして使用した。始原発癌遺伝子でトランスフエクト
された非トランスフオームコロニーの７５％およびトラ
ンスフオームした発癌遺伝子でトランスフエクトされた
コロニーの全てが、6.6Ｋｂの泳動部にｐＥＪ−相同体
配列の存在を示した。
に弱くハイブリダイズする。Parada,L.F.,Tabin,C.J.,S
hih,Ｃ．およびWeinberg,R.A.Nature２９７：４７４−
４７９（１９８２）を参照されたい。従つて、その存在
は結果に不鮮明さをもたらさない。トランスフエクトし
たｐＢＲ３２２配列がデータの解釈を妨害しない事を確
めるため、ｒａｓ−特異配列をｐＥＪから作り、プロー
ブとして使用した。始原発癌遺伝子でトランスフエクト
された非トランスフオームコロニーの７５％およびトラ
ンスフオームした発癌遺伝子でトランスフエクトされた
コロニーの全てが、6.6Ｋｂの泳動部にｐＥＪ−相同体
配列の存在を示した。
陽性のコロニーはまたプローブにアニールされた他のサ
イズのＢａｍＨＩフラグメントを持つ。これらはトラン
スフエクシヨン過程の間に分解したクローンのコピーで
ある。
イズのＢａｍＨＩフラグメントを持つ。これらはトラン
スフエクシヨン過程の間に分解したクローンのコピーで
ある。
発癌遺伝子の無傷のコピーを含有する２つの細胞株およ
び始原発癌遺伝子の無傷のコピーと殆んど等しいものを
含有する２つの細胞株を更に別の分析の為に選択する。
図３に５００Ｘに倍率での位相差顕微鏡で撮つたこれら
の細胞株の写真を示した。ｐＥＪでトランスフエクトし
た細胞株はコンフルエントの状態（ＥＪ／Ｇｐｔ−２，
写真３Ａ）およびサブコンフルエント（ＥＪ／Ｇｐｔ−
３，写真３Ｂ）で示してある。ｐＥＣでトランスフエク
トした細胞株もまたコンフルエント（ＥＣ／Ｇｐｔ−
５，写真３Ｃ）およびサブコンフルエント（ＥＣ／Ｇｐ
ｔ−１，写真３Ｄ）で示してある。
び始原発癌遺伝子の無傷のコピーと殆んど等しいものを
含有する２つの細胞株を更に別の分析の為に選択する。
図３に５００Ｘに倍率での位相差顕微鏡で撮つたこれら
の細胞株の写真を示した。ｐＥＪでトランスフエクトし
た細胞株はコンフルエントの状態（ＥＪ／Ｇｐｔ−２，
写真３Ａ）およびサブコンフルエント（ＥＪ／Ｇｐｔ−
３，写真３Ｂ）で示してある。ｐＥＣでトランスフエク
トした細胞株もまたコンフルエント（ＥＣ／Ｇｐｔ−
５，写真３Ｃ）およびサブコンフルエント（ＥＣ／Ｇｐ
ｔ−１，写真３Ｄ）で示してある。
細胞総ＲＮＡをすべてのトランスフエクトした細胞株か
ら調製する。次いで、ＲＮＡ調製物をホルムアルデヒド
ゲル上で泳動し、ニトロセルロースフイルターに移し、
ｒａｓ−特異ＤＮＡでプローブした。前に記載した方法
を用い、結果を図２Ｂに示した（図中のレーンにおい
て：レーン１，ＮＩＨ３Ｔ３細胞からのＲＮＡ；レーン
２，ＥＪ／Ｇｐｔ−２細胞；レーン３，ＥＪ／Ｇｐｔ−
３細胞；レーン４，ＥＣ／Ｇｐｔ−１細胞；レーン５，
ＥＣ／Ｇｐｔ−５細胞）。
ら調製する。次いで、ＲＮＡ調製物をホルムアルデヒド
ゲル上で泳動し、ニトロセルロースフイルターに移し、
ｒａｓ−特異ＤＮＡでプローブした。前に記載した方法
を用い、結果を図２Ｂに示した（図中のレーンにおい
て：レーン１，ＮＩＨ３Ｔ３細胞からのＲＮＡ；レーン
２，ＥＪ／Ｇｐｔ−２細胞；レーン３，ＥＪ／Ｇｐｔ−
３細胞；レーン４，ＥＣ／Ｇｐｔ−１細胞；レーン５，
ＥＣ／Ｇｐｔ−５細胞）。
これらの細胞中のｐ２１のレベルもまた試験した。細胞
溶解物を調製し、免疫沈降させ、前に記載した方法で分
析した。結果を図２Ｃに示した：非−免疫血清（レーン
１，２，７，８）またはＨａ−ＭｕＳＶ ｐ２１を沈降
させるモノクローナル抗血清（Ｙ１３−２３８）（レー
ン３−６）を用いて免疫沈降した。細胞溶解物はＥＪ／
Ｇｐｔ−２（レーン１，３）；ＥＣ／Ｇｐｔ−１（レー
ン２，４）；ＥＪ／Ｇｐｔ−３（レーン５，７）および
ＥＣ／Ｇｐｔ−５（レーン６，８）から調製した。観察
される如く、ｐ２１に対するモノクローナル血清はｐＥ
ＣおよびＰＥＪトランスフエクト細胞中の同量のｐ２１
蛋白質を沈降させる。
溶解物を調製し、免疫沈降させ、前に記載した方法で分
析した。結果を図２Ｃに示した：非−免疫血清（レーン
１，２，７，８）またはＨａ−ＭｕＳＶ ｐ２１を沈降
させるモノクローナル抗血清（Ｙ１３−２３８）（レー
ン３−６）を用いて免疫沈降した。細胞溶解物はＥＪ／
Ｇｐｔ−２（レーン１，３）；ＥＣ／Ｇｐｔ−１（レー
ン２，４）；ＥＪ／Ｇｐｔ−３（レーン５，７）および
ＥＣ／Ｇｐｔ−５（レーン６，８）から調製した。観察
される如く、ｐ２１に対するモノクローナル血清はｐＥ
ＣおよびＰＥＪトランスフエクト細胞中の同量のｐ２１
蛋白質を沈降させる。
これらのデータは、これら特定のｐＥＪトランスフエク
ト細胞中で、獲得されたｐＥＪのコピーの一部のものの
みが活性であり、一方で他の細胞中のトランスフエクト
されたｐＥＣ遺伝子の全てのコピーが活性である可能性
も形式上は否定できないので、細胞中で２つのクローン
化遺伝子が同じ速度で転写されるかどうかという質問に
完全に答えるわけではない。そのような場合、観察され
る蛋白質またはＲＮＡの同じようなレベルが正確に２つ
の遺伝子の固有の転写活性を反映しているわけではな
い。
ト細胞中で、獲得されたｐＥＪのコピーの一部のものの
みが活性であり、一方で他の細胞中のトランスフエクト
されたｐＥＣ遺伝子の全てのコピーが活性である可能性
も形式上は否定できないので、細胞中で２つのクローン
化遺伝子が同じ速度で転写されるかどうかという質問に
完全に答えるわけではない。そのような場合、観察され
る蛋白質またはＲＮＡの同じようなレベルが正確に２つ
の遺伝子の固有の転写活性を反映しているわけではな
い。
しかしながら、一つの点は明確になつた： ＥＪ−特定ｐ２１のあるレベルトランスフオーメーシヨ
ンが誘導され、一方同じレベルの始原発癌遺伝子−特定
のｐ２１は細胞の表現型に影響を及ぼさない。ｐ２１蛋
白質はこれらの遺伝子で暗号されるただ１つの明らかな
遺伝子産物であるので、ＥＪ発癌遺伝子および始原発癌
遺伝子間の機能の相違はｐ２１蛋白質中の構造変化に誘
導されるに違いないと結論される。反対に、調節的変化
は発癌遺伝子のトランスフオーム化活性に決定的でない
ように思われる。
ンが誘導され、一方同じレベルの始原発癌遺伝子−特定
のｐ２１は細胞の表現型に影響を及ぼさない。ｐ２１蛋
白質はこれらの遺伝子で暗号されるただ１つの明らかな
遺伝子産物であるので、ＥＪ発癌遺伝子および始原発癌
遺伝子間の機能の相違はｐ２１蛋白質中の構造変化に誘
導されるに違いないと結論される。反対に、調節的変化
は発癌遺伝子のトランスフオーム化活性に決定的でない
ように思われる。
このため、以前に検出されていた異つた細胞からのｐ２
１蛋白質の移動速度の僅かな変化（図１ｂおよび２ｃ）
に新たな重要性が与えられる。それ故、ｐ２１蛋白質を
移動の相違がより容易に分離できるような条件下で再分
析した。結果を図４に示した。詳細には、細胞を３時間
３５Ｓ−メチオニンで代謝的に標識する；細胞溶解物を
調製し、免疫沈降させ、前に記載した如く分析する。細
胞株ＥＪ／Ｇｐｔ−３（レーン１，３）および細胞株Ｅ
Ｃ／Ｇｐｔ−１（レーン２，４）からの溶解物をモノク
ローナル抗ｐ２１抗血清Ｙ１３−２３８（レーン１，
２）または非免疫血清（レーン３，４）で沈降させる。
模式的泳動図（レーン５：ＥＪ／Ｇｐｔ−３；レーン
６：ＥＣ／Ｇｐｔ−１）に動力学的データおよび以前に
公表された実験に基づいての検出されたｐ２１バンドの
相対的位置およびこれらのバンドの関係（矢印）の両方
を示した。Shih,Ｔ．Ｙ．らＪ．Virol.４２：２５３−
２６１（１９８２）を参照されたい。
１蛋白質の移動速度の僅かな変化（図１ｂおよび２ｃ）
に新たな重要性が与えられる。それ故、ｐ２１蛋白質を
移動の相違がより容易に分離できるような条件下で再分
析した。結果を図４に示した。詳細には、細胞を３時間
３５Ｓ−メチオニンで代謝的に標識する；細胞溶解物を
調製し、免疫沈降させ、前に記載した如く分析する。細
胞株ＥＪ／Ｇｐｔ−３（レーン１，３）および細胞株Ｅ
Ｃ／Ｇｐｔ−１（レーン２，４）からの溶解物をモノク
ローナル抗ｐ２１抗血清Ｙ１３−２３８（レーン１，
２）または非免疫血清（レーン３，４）で沈降させる。
模式的泳動図（レーン５：ＥＪ／Ｇｐｔ−３；レーン
６：ＥＣ／Ｇｐｔ−１）に動力学的データおよび以前に
公表された実験に基づいての検出されたｐ２１バンドの
相対的位置およびこれらのバンドの関係（矢印）の両方
を示した。Shih,Ｔ．Ｙ．らＪ．Virol.４２：２５３−
２６１（１９８２）を参照されたい。
図４のデータはｐＥＪおよびｐＥＣでトランスフエクト
されたものでは各々ｐ２１の２つのバンドが現われる事
を示している。より高い分子量のｐＥＪトランスフエク
トｐ２１蛋白質はより高い分子量のｐＥＣトランスフエ
クト蛋白質よりゆつくりと移動し、より低い分子量のｐ
ＥＪトランスフエクトｐ２１はより低い分子量のｐＥＣ
トランスフエクトｐ２１よりよりゆつくり移動した。各
々の場合よりゆつくり移動するバンドはより急速に移動
するバンドの動力学的前駆体の如く行動した。ｖ−Ｈａ
−ｒａｓのｐ２１蛋白質についての相当する従来データ
は、高分子量側のバンドは翻訳後に切断を受けて低分子
量側のより速く移動するバンドに変ることを示してい
る。Shih Ｔ．Ｙ．らＪ．Virol４２：２５３−２６１
（１９８２）を参照されたい。
されたものでは各々ｐ２１の２つのバンドが現われる事
を示している。より高い分子量のｐＥＪトランスフエク
トｐ２１蛋白質はより高い分子量のｐＥＣトランスフエ
クト蛋白質よりゆつくりと移動し、より低い分子量のｐ
ＥＪトランスフエクトｐ２１はより低い分子量のｐＥＣ
トランスフエクトｐ２１よりよりゆつくり移動した。各
々の場合よりゆつくり移動するバンドはより急速に移動
するバンドの動力学的前駆体の如く行動した。ｖ−Ｈａ
−ｒａｓのｐ２１蛋白質についての相当する従来データ
は、高分子量側のバンドは翻訳後に切断を受けて低分子
量側のより速く移動するバンドに変ることを示してい
る。Shih Ｔ．Ｙ．らＪ．Virol４２：２５３−２６１
（１９８２）を参照されたい。
これらｐ２１蛋白質は全部少しもリン酸化されていない
と思われるので、ｐＥＪおよびｐＥＣ蛋白質間の移動速
度の相違にはアミノ酸の数またはコンホメーシヨンの変
化が寄与する可能性が最も高い。
と思われるので、ｐＥＪおよびｐＥＣ蛋白質間の移動速
度の相違にはアミノ酸の数またはコンホメーシヨンの変
化が寄与する可能性が最も高い。
図４のデータおよび模式図は正常およびトランスフオー
ムした膀胱細胞で観察されるｐ２１蛋白質の複雑さ（図
１ｂ）の説明を提供する：正常細胞は始原発癌遺伝子の
発現による２つのバンドを示し；癌細胞は４つのバンド
を示すように思われ、２つはこれらの細胞の発癌遺伝子
により特定され、２つは他の相同染色体の正常始原発癌
遺伝子による。
ムした膀胱細胞で観察されるｐ２１蛋白質の複雑さ（図
１ｂ）の説明を提供する：正常細胞は始原発癌遺伝子の
発現による２つのバンドを示し；癌細胞は４つのバンド
を示すように思われ、２つはこれらの細胞の発癌遺伝子
により特定され、２つは他の相同染色体の正常始原発癌
遺伝子による。
発癌遺伝子および始原発癌遺伝子からのｐ２１蛋白質間
に観察される物理的相違は、ｐ２１蛋白質におけつ機能
的に重要な変化を反映するか、またはそうではなく、ト
ランスフオーメーシヨンの過程に影響を及ぼさない相違
を反映している可能性もある。これを決定する為、蛋白
質の移動速度の変化を支配し、遺伝子機能の変化を起こ
すような発癌遺伝子の遺伝子領域をつきとめるための一
連の独立した実験を計画した。これらの実験はイン ビ
トロでの２つの遺伝子のクローン間の相同的組換えに基
づくものである。
に観察される物理的相違は、ｐ２１蛋白質におけつ機能
的に重要な変化を反映するか、またはそうではなく、ト
ランスフオーメーシヨンの過程に影響を及ぼさない相違
を反映している可能性もある。これを決定する為、蛋白
質の移動速度の変化を支配し、遺伝子機能の変化を起こ
すような発癌遺伝子の遺伝子領域をつきとめるための一
連の独立した実験を計画した。これらの実験はイン ビ
トロでの２つの遺伝子のクローン間の相同的組換えに基
づくものである。
実験の原理は、発癌遺伝子クローン（ｐＥＪ）から制限
フラグメントを取り出し、これを用いて始原発癌遺伝子
クローン（ｐＥＣ）の相同部分と置き換えることであ
る。同時に、始原発癌遺伝子クローンのフラグメントを
発癌遺伝子クローン中にスプライシングし、逆の組み変
えも実施する。これらの組み換え構成物のトランスフオ
ーム活性をトランスフエクシヨン検定で試験する。検定
は発癌遺伝子のフラグメントを始原発癌遺伝子クローン
中に組込んだときトランスフオーム活性を発揮し、反対
に、逆の組換えにおいて、対応する始原発癌遺伝子フラ
グメントを発癌遺伝子クローン中に挿入した場合活性を
喪失する事を測定する。図５に実施した特定の構成のダ
イヤグラムおよび得られたトランスフエクシヨンおよび
トランスフオーメーシヨンのデータを示した。
フラグメントを取り出し、これを用いて始原発癌遺伝子
クローン（ｐＥＣ）の相同部分と置き換えることであ
る。同時に、始原発癌遺伝子クローンのフラグメントを
発癌遺伝子クローン中にスプライシングし、逆の組み変
えも実施する。これらの組み換え構成物のトランスフオ
ーム活性をトランスフエクシヨン検定で試験する。検定
は発癌遺伝子のフラグメントを始原発癌遺伝子クローン
中に組込んだときトランスフオーム活性を発揮し、反対
に、逆の組換えにおいて、対応する始原発癌遺伝子フラ
グメントを発癌遺伝子クローン中に挿入した場合活性を
喪失する事を測定する。図５に実施した特定の構成のダ
イヤグラムおよび得られたトランスフエクシヨンおよび
トランスフオーメーシヨンのデータを示した。
図５の制限地図は、ｐＢＲ３２２に挿入した6.6Ｋｂ
ＢａｍＨＩ断片内の種々の酵素に対する切断部位を示し
た。明瞭に特定されていない幾つかの他の部位にも作用
するＸｍａＩを除いて、酵素に対する全ての特異的部位
を示した。ＢｓｔＥIIの最初の部位とＫｐｎＩ部位との
間のＸｍａＩ部位のみを示した。地図上の黒く塗りつぶ
した箱型部分は暗号付けしているエクソンの場所を示し
ている。
ＢａｍＨＩ断片内の種々の酵素に対する切断部位を示し
た。明瞭に特定されていない幾つかの他の部位にも作用
するＸｍａＩを除いて、酵素に対する全ての特異的部位
を示した。ＢｓｔＥIIの最初の部位とＫｐｎＩ部位との
間のＸｍａＩ部位のみを示した。地図上の黒く塗りつぶ
した箱型部分は暗号付けしているエクソンの場所を示し
ている。
図５において、ｐＥＪから誘導されたセグメントを塗り
つぶした帯として、ｐＥＣからのセグメントを白抜帯と
してｐＥＪ／ｐＥＣキメラを示した。各々の示したフラ
グメントを得るために必要とされる完全または部分消化
によつて、示した酵素でｐＥＪおよびｐＥＣを切断す
る。生成物を1.2パーセントアガロースを通す電気泳動
により分離し、ＮａＩを溶融して溶離させ、ガラスビー
ズに吸着させる。ｐＢＲ３２２を含むフラグメントを子
牛腸ホスフアターゼで処理する。図５に示したフラグメ
ントは酵素Ｔ４−ＤＮＡリガーゼによりまたは酵素を用
いないモツク連結で結合した。ａ−ｅの構成は２分子の
連結で行つた。ｆの構成は同時に３つのフラグメントを
混合し、ｇおよびｈにおいては同時に４つのフラグメン
トを混合した。連結混合物は直接大腸菌のＨＢ１０１株
中へトランスフオームした。モツク連結からのコロニー
が連結の２パーセント以下であるようなコロニーについ
て、適当な制限地図を持つコロニーの存在を分析した。
各々のクローンの２０ｎｇでＮＩＨ３Ｔ３細胞を前に記
載した如くトランスフエクトし、１０−１４日でフオー
カスが見えてくるまで選別せずに保持した。トランスフ
エクシヨンの結果は図５の第１欄に示した。第２欄はス
クリーンされ、その後ＮＩＨ３Ｔ３細胞にトランスフエ
クトされた独立したバクテリアコロニーの数を示してい
る。
つぶした帯として、ｐＥＣからのセグメントを白抜帯と
してｐＥＪ／ｐＥＣキメラを示した。各々の示したフラ
グメントを得るために必要とされる完全または部分消化
によつて、示した酵素でｐＥＪおよびｐＥＣを切断す
る。生成物を1.2パーセントアガロースを通す電気泳動
により分離し、ＮａＩを溶融して溶離させ、ガラスビー
ズに吸着させる。ｐＢＲ３２２を含むフラグメントを子
牛腸ホスフアターゼで処理する。図５に示したフラグメ
ントは酵素Ｔ４−ＤＮＡリガーゼによりまたは酵素を用
いないモツク連結で結合した。ａ−ｅの構成は２分子の
連結で行つた。ｆの構成は同時に３つのフラグメントを
混合し、ｇおよびｈにおいては同時に４つのフラグメン
トを混合した。連結混合物は直接大腸菌のＨＢ１０１株
中へトランスフオームした。モツク連結からのコロニー
が連結の２パーセント以下であるようなコロニーについ
て、適当な制限地図を持つコロニーの存在を分析した。
各々のクローンの２０ｎｇでＮＩＨ３Ｔ３細胞を前に記
載した如くトランスフエクトし、１０−１４日でフオー
カスが見えてくるまで選別せずに保持した。トランスフ
エクシヨンの結果は図５の第１欄に示した。第２欄はス
クリーンされ、その後ＮＩＨ３Ｔ３細胞にトランスフエ
クトされた独立したバクテリアコロニーの数を示してい
る。
トランスフオーム活性のあるクローンは、ｐＥＪおよび
ｐＥＣの一方または他方から由来する來雑物によるもの
でなく、ｐＥＪおよびｐＥＣの結合物由来のキメラであ
ることを立証することが重要である。これは３つの方法
で行つた。２つのフラグメントを同時に連結するより単
純な構成においては、増幅された組換えクローンにより
得られた結果は、連結反応での未増幅生成物およびリガ
ーゼで処理されていない単離されたフラグメントを含む
モツク連結での未増幅生成物を直接トランスフエクトす
る事により立証される。第２の確証は、それぞれの細胞
遺伝子を含むプラスミドｐＥＪおよびｐＥＣは、ｐＢＲ
３２２プラスミドベクターに反対方向に挿入されるとい
う事実に依存している。それ故、組み換え遺伝子の一つ
の両親の起源はフランキングプラスミド領域の特徴的制
限消化により決定される。ｐＥＣの混在はそれ自体では
偽陽性の結果を与え得ないので、始原発癌遺伝子フラン
キング配列を持つ活性クローンはトランスフオーム活性
の遺伝子部分を得た結果生じたに違いない。最後に、そ
の結果は連結反応から得られる幾つかの独立したクロー
ンで確認された。
ｐＥＣの一方または他方から由来する來雑物によるもの
でなく、ｐＥＪおよびｐＥＣの結合物由来のキメラであ
ることを立証することが重要である。これは３つの方法
で行つた。２つのフラグメントを同時に連結するより単
純な構成においては、増幅された組換えクローンにより
得られた結果は、連結反応での未増幅生成物およびリガ
ーゼで処理されていない単離されたフラグメントを含む
モツク連結での未増幅生成物を直接トランスフエクトす
る事により立証される。第２の確証は、それぞれの細胞
遺伝子を含むプラスミドｐＥＪおよびｐＥＣは、ｐＢＲ
３２２プラスミドベクターに反対方向に挿入されるとい
う事実に依存している。それ故、組み換え遺伝子の一つ
の両親の起源はフランキングプラスミド領域の特徴的制
限消化により決定される。ｐＥＣの混在はそれ自体では
偽陽性の結果を与え得ないので、始原発癌遺伝子フラン
キング配列を持つ活性クローンはトランスフオーム活性
の遺伝子部分を得た結果生じたに違いない。最後に、そ
の結果は連結反応から得られる幾つかの独立したクロー
ンで確認された。
図５に観察される如く、３５０ヌクレオチドの長さの遺
伝子領域が発癌遺伝子から始原発癌遺伝子の対応する領
域に移された時、後者に活性を与える事が最終的に同定
された。この領域はＸｍａＩエンドヌクレアーゼの最初
の部位からＬｐｎＩ部位に拡がつている。この領域の５
５パーセントは暗号付けしている最初のエクソンであ
り、１０パーセントはエクソンの５′であり、３５パー
セントは最初のイントロンの一部である。
伝子領域が発癌遺伝子から始原発癌遺伝子の対応する領
域に移された時、後者に活性を与える事が最終的に同定
された。この領域はＸｍａＩエンドヌクレアーゼの最初
の部位からＬｐｎＩ部位に拡がつている。この領域の５
５パーセントは暗号付けしている最初のエクソンであ
り、１０パーセントはエクソンの５′であり、３５パー
セントは最初のイントロンの一部である。
先行実験は発癌遺伝子および始原発癌遺伝子で暗号付け
されたｐ２１蛋白質の移動の相違を同定した。今、トラ
ンスフオーム化障害を含む短い領域の遺伝子が決定され
た。従つて、この領域がまた蛋白質を変化させる特異性
を持つているかどうかを確める事が重要になつてきた。
それ故、イン ビトロで組み換えた生成物でトランスフ
エクトした細胞の免疫沈降を行つた。
されたｐ２１蛋白質の移動の相違を同定した。今、トラ
ンスフオーム化障害を含む短い領域の遺伝子が決定され
た。従つて、この領域がまた蛋白質を変化させる特異性
を持つているかどうかを確める事が重要になつてきた。
それ故、イン ビトロで組み換えた生成物でトランスフ
エクトした細胞の免疫沈降を行つた。
ＮＩＨ３Ｔ３細胞をＥＪ膀胱癌発癌遺伝子、その正常始
原発癌遺伝子、または２つの遺伝子間の組換え体でトラ
ンスフオームし、まず生物学的に0.35パーセント寒天中
でクローン化し、その後１８時間３５Ｓ−メチオニンで
代謝的に標識した。溶解物を調製し、Ｈａ−ＭｕＳＶで
暗号付けされたｐ２１を検出し、Ｋｉ−ＭｕＳＶで暗号
付けされたｐ２１は検出しないモノクローナル抗体（Ｙ
１３−１７２）で免疫沈降する（ＴＣＡ−沈澱可能物の
カウントは５×１０６ｃｐｍ）。Furth,M.E.David,L.
J.,Fleurdelys,Ｂ．およびScolnick,E.M.J,Virol.４
３：２９４−３０４（１９８２）；およびShih,T.Y.,We
eks,M.O.,Young,Ｈ．Ａ．およびScolnick,E.M.Virology
９６：６４−７９（１９７９）を参照されたい。溶解し
た免疫沈降物は、次に１２パーセントＳＤＳ−ポリアク
リルアミドゲルで分離する。その結果を図６に示す：レ
ーン１−７ａ、抗体なし；レーン１−７ｂ、抗Ｈａｒｖ
ｅｙ ｐ２１モノクローナル抗体。細胞溶解物は：ＮＩ
Ｈ３Ｔ３細胞（レーン１）；始原発癌遺伝子〔Payne,G.
S.,Courtneidge,S.A.,Crittendon,L.B.,Fadil,A.M.,Bis
hop,Ｊ．Ｍ．およびVarmus,H.E.Cell２３：３１１−３
２２（１９８１）に記載されているＬＴＲ−活性化３Ｋ
ｂＳａｃＩフラグメント〕でトランスフオームされた細
胞（レーン２）；ＥＪ発癌遺伝子（ｐＢＲ中の6.6Ｋｂ
フラグメント）でトランスフオームされたクローン５０
４−１７（レーン３）；始原発癌遺伝子１Ｋｂ Ｓａｃ
ＩフラグメントをＥＪ発癌遺伝子３Ｋｂ ＳａｃＩフラ
グメントに連結したものでトランスフオームされたクロ
ーン５１１−７４（レーン４）；ＥＪ発癌遺伝子のＸｈ
ｏＩ部位から第２のＢｓｔＥII部位に拡がるフラグメン
トを相同フラグメントが除去された始原発癌遺伝子のク
ローンに連結したものでトランスフオームしたクローン
５１０−９および５１０−１３（レーン５，６）；およ
びＫｐｎＩ部位の左側のＥＪ発癌遺伝子をこの部位の右
側の始原発癌遺伝子に連結したものでトランスフオーム
したクローン５０８−８（レーン７）。
原発癌遺伝子、または２つの遺伝子間の組換え体でトラ
ンスフオームし、まず生物学的に0.35パーセント寒天中
でクローン化し、その後１８時間３５Ｓ−メチオニンで
代謝的に標識した。溶解物を調製し、Ｈａ−ＭｕＳＶで
暗号付けされたｐ２１を検出し、Ｋｉ−ＭｕＳＶで暗号
付けされたｐ２１は検出しないモノクローナル抗体（Ｙ
１３−１７２）で免疫沈降する（ＴＣＡ−沈澱可能物の
カウントは５×１０６ｃｐｍ）。Furth,M.E.David,L.
J.,Fleurdelys,Ｂ．およびScolnick,E.M.J,Virol.４
３：２９４−３０４（１９８２）；およびShih,T.Y.,We
eks,M.O.,Young,Ｈ．Ａ．およびScolnick,E.M.Virology
９６：６４−７９（１９７９）を参照されたい。溶解し
た免疫沈降物は、次に１２パーセントＳＤＳ−ポリアク
リルアミドゲルで分離する。その結果を図６に示す：レ
ーン１−７ａ、抗体なし；レーン１−７ｂ、抗Ｈａｒｖ
ｅｙ ｐ２１モノクローナル抗体。細胞溶解物は：ＮＩ
Ｈ３Ｔ３細胞（レーン１）；始原発癌遺伝子〔Payne,G.
S.,Courtneidge,S.A.,Crittendon,L.B.,Fadil,A.M.,Bis
hop,Ｊ．Ｍ．およびVarmus,H.E.Cell２３：３１１−３
２２（１９８１）に記載されているＬＴＲ−活性化３Ｋ
ｂＳａｃＩフラグメント〕でトランスフオームされた細
胞（レーン２）；ＥＪ発癌遺伝子（ｐＢＲ中の6.6Ｋｂ
フラグメント）でトランスフオームされたクローン５０
４−１７（レーン３）；始原発癌遺伝子１Ｋｂ Ｓａｃ
ＩフラグメントをＥＪ発癌遺伝子３Ｋｂ ＳａｃＩフラ
グメントに連結したものでトランスフオームされたクロ
ーン５１１−７４（レーン４）；ＥＪ発癌遺伝子のＸｈ
ｏＩ部位から第２のＢｓｔＥII部位に拡がるフラグメン
トを相同フラグメントが除去された始原発癌遺伝子のク
ローンに連結したものでトランスフオームしたクローン
５１０−９および５１０−１３（レーン５，６）；およ
びＫｐｎＩ部位の左側のＥＪ発癌遺伝子をこの部位の右
側の始原発癌遺伝子に連結したものでトランスフオーム
したクローン５０８−８（レーン７）。
図６に観察される如く、Ｘｈｏ−ＢｓｔＥII、ＳａｃＩ
−ＳａｃＩ、およびＢｓｔＥII−ＫｐｎＩ組換え体でト
ランスフエクトされた細胞からの溶解物に含まれる蛋白
質はすべてＥＪ蛋白質と一緒に移動し、ＥＣ蛋白質から
のものと異つた移動度であつた。培養物１８時間標識す
ると、より低い分子量の形のｐ２１が高いレベルで標識
され、動力学的に不安定なより高い分子量の形へ標識さ
れた量は検出不能であつた。得られたデータから。発癌
遺伝子によるトランスフオーメーシヨンの表現型および
電気泳動移動の分離の変化には関連があり、およびこの
２つはＤＮＡの同じ３５０ｎｔ（ヌクレオチド）セグメ
ントで暗号されていると結論される。変化した移動速度
は機能的に重要な蛋白質の変化を反映しているのではな
いかと考えられる。
−ＳａｃＩ、およびＢｓｔＥII−ＫｐｎＩ組換え体でト
ランスフエクトされた細胞からの溶解物に含まれる蛋白
質はすべてＥＪ蛋白質と一緒に移動し、ＥＣ蛋白質から
のものと異つた移動度であつた。培養物１８時間標識す
ると、より低い分子量の形のｐ２１が高いレベルで標識
され、動力学的に不安定なより高い分子量の形へ標識さ
れた量は検出不能であつた。得られたデータから。発癌
遺伝子によるトランスフオーメーシヨンの表現型および
電気泳動移動の分離の変化には関連があり、およびこの
２つはＤＮＡの同じ３５０ｎｔ（ヌクレオチド）セグメ
ントで暗号されていると結論される。変化した移動速度
は機能的に重要な蛋白質の変化を反映しているのではな
いかと考えられる。
短い（３５０Ｋｂ）フラグメントが生物的意味を持つて
いる事が示されたので発癌遺伝子および始原発癌遺伝子
からのＤＮＡの配列を決めた。Ｓｅｉｆらの前後ジデオ
キシＤＮＡ配列決定方法およびＭａｘａｍおよびＧｉｌ
ｂｅｒｔの化学的方法で配列を決定した。Seif,I.,Khou
ry,Ｇ．およびDhar,R.Nucl.Acid Res.８：２２２５−２
２３８（１９８０）；およびMaxam,Ａ，Ｍ．およびGilb
ert,W.Proc.Natl.Acad.Sci.ＵＳＡ７４：５６０−５６
４（１９７７）を参照されたい。結果を図７に示した、
図中暗付けＤＮＡストランドを相当するアミノ酸配列と
伴に示してある。ＥＪと始原発癌遺伝子とは、コドンお
よびアミノ酸の双方が異なることが示されている。
いる事が示されたので発癌遺伝子および始原発癌遺伝子
からのＤＮＡの配列を決めた。Ｓｅｉｆらの前後ジデオ
キシＤＮＡ配列決定方法およびＭａｘａｍおよびＧｉｌ
ｂｅｒｔの化学的方法で配列を決定した。Seif,I.,Khou
ry,Ｇ．およびDhar,R.Nucl.Acid Res.８：２２２５−２
２３８（１９８０）；およびMaxam,Ａ，Ｍ．およびGilb
ert,W.Proc.Natl.Acad.Sci.ＵＳＡ７４：５６０−５６
４（１９７７）を参照されたい。結果を図７に示した、
図中暗付けＤＮＡストランドを相当するアミノ酸配列と
伴に示してある。ＥＪと始原発癌遺伝子とは、コドンお
よびアミノ酸の双方が異なることが示されている。
図７に観察される如く、既知の最初のエクソンのｐ２１
暗号付け領域中（特にＸｍａ切断部位から６０番目のヌ
クレオチド）の２つのＤＮＡセグメント間の唯一の相違
があつた。それは正常ラツトおよびヒトｃ−Ｈａ−ｒａ
ｓ遺伝子においてグリシンを暗号化するトリプレツトに
起こつている。ＥＪ発癌遺伝子に観察される配列はバリ
ンを暗号化している。それ故、この変化はｐ２１蛋白質
の機能の変化およびＥＪ膀胱癌で起こるｃ−Ｈａ−ｒａ
ｓ遺伝子の発癌遺伝子の発癌遺伝子活性化に対応する。
暗号付け領域中（特にＸｍａ切断部位から６０番目のヌ
クレオチド）の２つのＤＮＡセグメント間の唯一の相違
があつた。それは正常ラツトおよびヒトｃ−Ｈａ−ｒａ
ｓ遺伝子においてグリシンを暗号化するトリプレツトに
起こつている。ＥＪ発癌遺伝子に観察される配列はバリ
ンを暗号化している。それ故、この変化はｐ２１蛋白質
の機能の変化およびＥＪ膀胱癌で起こるｃ−Ｈａ−ｒａ
ｓ遺伝子の発癌遺伝子の発癌遺伝子活性化に対応する。
この唯一の塩基変化の結果、２つの異つた部位−特異性
エンドヌクレアーゼの切断部位が変化する。始原発癌遺
伝子にはＧＣＣＧＧＣ配列が現れ、これがエンドヌクレ
アーゼＮａｅＩの認識部位となる。この配列はまたエン
ドヌクレアーゼＨｐａＩの認識部位のＣＣＧＧも含んで
いる。これら両方が発癌遺伝子では変化する。何故なら
ば、相当領域の配列がＧＣＣＧＴＣになつているからで
ある。
エンドヌクレアーゼの切断部位が変化する。始原発癌遺
伝子にはＧＣＣＧＧＣ配列が現れ、これがエンドヌクレ
アーゼＮａｅＩの認識部位となる。この配列はまたエン
ドヌクレアーゼＨｐａＩの認識部位のＣＣＧＧも含んで
いる。これら両方が発癌遺伝子では変化する。何故なら
ば、相当領域の配列がＧＣＣＧＴＣになつているからで
ある。
ＮａｅＩエンドヌクレアーゼを個々に用い２つの配列の
間の相違を立証する。ＮａｅＩはＨｐａＩよりＤＮＡを
頻繁に切断しないのでＨｐａＩの代りにＮａｅＩを用い
た。期待される如く、ｐＥＣクローンの挿入切断片はｐ
ＥＪ相対物より１つ多い切断部位を示す。この事はまた
イン ビトロ組換えクローンの遡及検定を提供する。ト
ランスフオーメーシヨンおよび異常なｐ２１移動を指令
する対立遺伝子は、この部位でのＮａｅＩ切断を許さな
い対立遺伝子と正確に同一視される。
間の相違を立証する。ＮａｅＩはＨｐａＩよりＤＮＡを
頻繁に切断しないのでＨｐａＩの代りにＮａｅＩを用い
た。期待される如く、ｐＥＣクローンの挿入切断片はｐ
ＥＪ相対物より１つ多い切断部位を示す。この事はまた
イン ビトロ組換えクローンの遡及検定を提供する。ト
ランスフオーメーシヨンおよび異常なｐ２１移動を指令
する対立遺伝子は、この部位でのＮａｅＩ切断を許さな
い対立遺伝子と正確に同一視される。
図８はＥＪ発癌遺伝子およびその対応する始原発癌遺伝
子のＮａｅＩ制限酵素検定の結果を示す。記載した方法
により、始原発癌遺伝子にはＮａｅＩ制限部位が存在
し、発癌遺伝子により生じる変化でそれが消失している
事が決定された。発癌遺伝子（ｐＥＪ）および始原発癌
遺伝子（ｐＥＣ）および各々がクローン化されているプ
ラスミド（ｐＢＲ３２２）の分子クローンを既知の方法
で各々純化する。各々１マイクログラムを酵素ＮａｅＩ
にて切断し、生じるフラグメントを１５パーセントビス
−アクリルアミドゲルを通しての電気泳動により分離す
る。ゲルは色素エチジウムブロミドを入れる事により染
色し、紫外線下に写真撮影した。
子のＮａｅＩ制限酵素検定の結果を示す。記載した方法
により、始原発癌遺伝子にはＮａｅＩ制限部位が存在
し、発癌遺伝子により生じる変化でそれが消失している
事が決定された。発癌遺伝子（ｐＥＪ）および始原発癌
遺伝子（ｐＥＣ）および各々がクローン化されているプ
ラスミド（ｐＢＲ３２２）の分子クローンを既知の方法
で各々純化する。各々１マイクログラムを酵素ＮａｅＩ
にて切断し、生じるフラグメントを１５パーセントビス
−アクリルアミドゲルを通しての電気泳動により分離す
る。ゲルは色素エチジウムブロミドを入れる事により染
色し、紫外線下に写真撮影した。
図８のレーンは次の通りである：レーン１は既知のサイ
ズのバンドを産生するマーカーレーンとしてφ×１７４
ＤＮＡを酵素ＨａｅIIIで切断；レーン２はｐＢＲ３２
２をＮａｅＩで切断し、プラスミドベクター由来のフラ
グメントを示し；レーン３はｐＥＪ ＤＮＡをＮａｅＩ
で切断；および、レーン４はｐＥＣ ＤＮＡをＮａｅＩ
で切断。
ズのバンドを産生するマーカーレーンとしてφ×１７４
ＤＮＡを酵素ＨａｅIIIで切断；レーン２はｐＢＲ３２
２をＮａｅＩで切断し、プラスミドベクター由来のフラ
グメントを示し；レーン３はｐＥＪ ＤＮＡをＮａｅＩ
で切断；および、レーン４はｐＥＣ ＤＮＡをＮａｅＩ
で切断。
ｐＥＪ ＤＮＡには分子量１２００塩基対と同じ移動を
するバンドが含まれるが、それはｐＥＣレーンでは消失
している。しかしながら、ｐＥＣレーンは２つの余分の
バンドがあり、１つは４００塩基であり、そして他方は
８００塩基の長さであり、それはｐＥＪレーンでは消失
している。このように、ｐＥＣ中のＮａｅＩ部位（１２
００ｂｐバンドを４００および８００塩基の２つのバン
ドに切断する事を許す）はＥＪ発癌遺伝子の創造により
失なわれる。
するバンドが含まれるが、それはｐＥＣレーンでは消失
している。しかしながら、ｐＥＣレーンは２つの余分の
バンドがあり、１つは４００塩基であり、そして他方は
８００塩基の長さであり、それはｐＥＪレーンでは消失
している。このように、ｐＥＣ中のＮａｅＩ部位（１２
００ｂｐバンドを４００および８００塩基の２つのバン
ドに切断する事を許す）はＥＪ発癌遺伝子の創造により
失なわれる。
ｐ２１蛋白質におけるバリンのグリシンへの単純な置換
では、ｐ２１蛋白質の機能面におけるそのような重大な
変化が起こるとは考え難いかも知れない。それにも拘わ
らず、幾つかの考察によれば、この構造変化には重要性
があるように思われる。その第１の根拠は、ヒトｃ−Ｈ
ａ−ｒａｓ遺伝子、ラツトｃ−Ｈａ−ｒａｓ遺伝子およ
びＨａｒｖｅｙ肉腫ウイルスのｖ−Ｈａ−ｒａｓ発癌遺
伝子で暗号化されたｐ２１のこの領域の比較から生じ
る。上記２つの細胞遺伝子の第１のエクソンで暗号化さ
れた３７残基のアミノ酸配列は同一であり、この領域の
偉大な進化の保存を示している。しかしながら、Ｈａｒ
ｖｅｙ肉腫ウイルス発癌遺伝子の分析でラツトの遺伝子
とこの領域でただ一つの位置が異つている事が明らかに
なり、それはＥＪ発癌遺伝子で変化していたものと正確
同じ残基がグリシンからアルギニンに変換していた。従
つてこの決定的残基の変化はそのラツト細胞前駆体から
のｖ−Ｈａ−ｒａｓ遺伝子の活性化および正常ヒト相対
物からのＥＪ膀胱発癌遺伝子の活性化の両方に重要だと
推測される。同様の変化がｒａｓ遺伝子フアミリーの他
のメンバーのＫｉｒｓｔｅｎネズミ肉腫のｖ−Ｋｉ−ｒ
ａｓ遺伝子の発癌遺伝子活性化においても重要である。
Ｋｉｒｓｔｅｎトランスフオーム活性遺伝子は非常にｖ
−Ｈａ−ｒａｓ遺伝子に類似している。Dhar,R.,Ellis,
R.W.,Shih,T.Y.,Oroszlan,S.,Shapiro,B.,Maizel,J.,Lo
wy,Ｄ．Ｒ．およびScolnick,E.M.Science２１７：９３
４−９３６（１９８２）を参照されたい。ｖ−Ｋｉ−ｒ
ａｓのｐ２１およびｖ−Ｈａ−ｒａｓのｐ２１間の唯一
の相違は最初の３６アミノ酸の１２番目でありＫｉｒｓ
ｔｅｎにおける残基はセリンである。Tsuchida,N.,Ryde
r,Ｔ．およびOhtsubo,E.Science２１７：９３７−９３
９（１９８２）を参照されたい。これはＥＪおよびＨａ
ｒｖｅｙ肉腫ウイルスが暗号化したｐ２１における変化
と正確に同じ部位である。ｖ−Ｋｉ−ｒａｓの細胞相同
体の配列情報は調べられていないけれども、このｒａｓ
発癌遺伝子の活性化には１２番目のグリシンの他の新し
いアミノ酸残基への変換が含まれている事は推測されて
いる。
では、ｐ２１蛋白質の機能面におけるそのような重大な
変化が起こるとは考え難いかも知れない。それにも拘わ
らず、幾つかの考察によれば、この構造変化には重要性
があるように思われる。その第１の根拠は、ヒトｃ−Ｈ
ａ−ｒａｓ遺伝子、ラツトｃ−Ｈａ−ｒａｓ遺伝子およ
びＨａｒｖｅｙ肉腫ウイルスのｖ−Ｈａ−ｒａｓ発癌遺
伝子で暗号化されたｐ２１のこの領域の比較から生じ
る。上記２つの細胞遺伝子の第１のエクソンで暗号化さ
れた３７残基のアミノ酸配列は同一であり、この領域の
偉大な進化の保存を示している。しかしながら、Ｈａｒ
ｖｅｙ肉腫ウイルス発癌遺伝子の分析でラツトの遺伝子
とこの領域でただ一つの位置が異つている事が明らかに
なり、それはＥＪ発癌遺伝子で変化していたものと正確
同じ残基がグリシンからアルギニンに変換していた。従
つてこの決定的残基の変化はそのラツト細胞前駆体から
のｖ−Ｈａ−ｒａｓ遺伝子の活性化および正常ヒト相対
物からのＥＪ膀胱発癌遺伝子の活性化の両方に重要だと
推測される。同様の変化がｒａｓ遺伝子フアミリーの他
のメンバーのＫｉｒｓｔｅｎネズミ肉腫のｖ−Ｋｉ−ｒ
ａｓ遺伝子の発癌遺伝子活性化においても重要である。
Ｋｉｒｓｔｅｎトランスフオーム活性遺伝子は非常にｖ
−Ｈａ−ｒａｓ遺伝子に類似している。Dhar,R.,Ellis,
R.W.,Shih,T.Y.,Oroszlan,S.,Shapiro,B.,Maizel,J.,Lo
wy,Ｄ．Ｒ．およびScolnick,E.M.Science２１７：９３
４−９３６（１９８２）を参照されたい。ｖ−Ｋｉ−ｒ
ａｓのｐ２１およびｖ−Ｈａ−ｒａｓのｐ２１間の唯一
の相違は最初の３６アミノ酸の１２番目でありＫｉｒｓ
ｔｅｎにおける残基はセリンである。Tsuchida,N.,Ryde
r,Ｔ．およびOhtsubo,E.Science２１７：９３７−９３
９（１９８２）を参照されたい。これはＥＪおよびＨａ
ｒｖｅｙ肉腫ウイルスが暗号化したｐ２１における変化
と正確に同じ部位である。ｖ−Ｋｉ−ｒａｓの細胞相同
体の配列情報は調べられていないけれども、このｒａｓ
発癌遺伝子の活性化には１２番目のグリシンの他の新し
いアミノ酸残基への変換が含まれている事は推測されて
いる。
前記推測の第２の根拠は、観察された特定のアミノ酸変
化の解析により与えられる。両者の場合とも、グリシン
が比較的かさばつた側鎖を持つアミノ酸に置き換えられ
ている。グリシンは側鎖を欠いているので２０のアミノ
酸の中では他と異なる構造の代表である。その結果、ポ
リペプチド鎖は極端におれたり、たたみ込まれる事を可
能ならしめ、アルフアーヘリツクスの破壊に最も関与す
る。Cantor,Ｃ．Ｒ．およびSchimmel,P.R.Biophysical
Chemistry,Vol.Ｉ，ｐ３０３，Ｗ．Ｈ．Freeman and C
o.,San Francisco（１９８０）を参照されたい。それ
故、バリンまたはアルギニンによるグリシンの置換は蛋
白質の局部的立体化学に急激な変化を示す。
化の解析により与えられる。両者の場合とも、グリシン
が比較的かさばつた側鎖を持つアミノ酸に置き換えられ
ている。グリシンは側鎖を欠いているので２０のアミノ
酸の中では他と異なる構造の代表である。その結果、ポ
リペプチド鎖は極端におれたり、たたみ込まれる事を可
能ならしめ、アルフアーヘリツクスの破壊に最も関与す
る。Cantor,Ｃ．Ｒ．およびSchimmel,P.R.Biophysical
Chemistry,Vol.Ｉ，ｐ３０３，Ｗ．Ｈ．Freeman and C
o.,San Francisco（１９８０）を参照されたい。それ
故、バリンまたはアルギニンによるグリシンの置換は蛋
白質の局部的立体化学に急激な変化を示す。
１２番目の残基のグリシンの消失はｐ２１蛋白質の必須
な領域の有意な変化を示す事が信じられている。その第
１の結果として、この変化は蛋白質のコンホメーシヨン
のずれを起こし、それが更にｐ２１蛋白質の異常な電気
泳動の移動や生合成の変化につながる。第２のより重大
な結果として、ｐ２１蛋白質の機能に対する重大な影響
が生ずる。この変化がｐ２１と細胞標的との相互作用に
影響するのはありそうな事である。他の単一のアミノ酸
変化が細胞および生体生理学に絶大な効果を示した先例
が存在する。これらの内最もよく知られているのは鎌状
赤血球症候群であり、それはグルタミンのバリンへの変
換が赤血球内のヘモグロビンの溶解性に影響を及ぼして
いる。
な領域の有意な変化を示す事が信じられている。その第
１の結果として、この変化は蛋白質のコンホメーシヨン
のずれを起こし、それが更にｐ２１蛋白質の異常な電気
泳動の移動や生合成の変化につながる。第２のより重大
な結果として、ｐ２１蛋白質の機能に対する重大な影響
が生ずる。この変化がｐ２１と細胞標的との相互作用に
影響するのはありそうな事である。他の単一のアミノ酸
変化が細胞および生体生理学に絶大な効果を示した先例
が存在する。これらの内最もよく知られているのは鎌状
赤血球症候群であり、それはグルタミンのバリンへの変
換が赤血球内のヘモグロビンの溶解性に影響を及ぼして
いる。
ここに記載した発見は、発癌においてかなめとなる出来
事としての過剰調節を示す一連の最近の実験に反駁する
ように思える。そのような実験には、鳥類のレトロウイ
ルスの白血病誘発の間にｍｙｃ始原発癌遺伝子の活性化
〔Neel,B.G.,Hayward,W.S.,Robinson,H.L.,Fang,Ｊ．お
よびAstrin,S.M.Cell２３：３２３−３３４（１９８
１）；およびPayne,G.S.,Courtneidge,S.A.,Crittendo
n,L.B.,Fadly,A.M.,Bishop,Ｊ．Ｍ．およびVarmus,H.E.
Cell２３：３１１−３２２（１９８１）を参照された
い〕；およびレトロウイルスのＬＴＲプロモーターおよ
び細胞始原発癌遺伝子のイン ビトロでの融合でトラン
スフオーム活性遺伝子が生ずることの実証〔DeFeo,D.,G
onda,M.A.,Young,H.A.,Chang,E.H.,Lowy,D.R.,Scolnic
k,Ｅ．Ｍ．およびEllis,R.W.Proc.Natl.Acad.SciＵＳＡ
７８：３３２８−３３３２（１９８１）；Blair,D.G.,O
skrsson,M.,Wood,T.G.,Mc Clements,W.L.,Fischinger,
Ｐ．Ｊ．およびVandewoude,G.Science２１２：９４１−
９４３（１９８１）；およびChange,E.J.,Furth,M.E.,S
colnick,Ｅ．Ｍ．およびLowy,D.R.Nature２９７：４７
９−４８３（１９８２）を参照されたい〕がある。これ
らの後者の結果はその幾つかはラツトおよびヒトｃ−Ｈ
ａ−ｒａｓ始原発癌遺伝子のクローンの活性化を実証し
ているので特に密接な関係がある。これらのｃ−Ｈａ−
ｒａｓ遺伝子の蛋白質暗号化配列がこれらウイルス−細
胞キメラ構成の間に構造的変化を受ける事は考えにく
い。むしろ始原発癌遺伝子およびそのＬＴＲ−活性化相
対物の唯一の本質的相違は発現の速度にある事は明らか
である。この事はｒａｓ始原発癌遺伝子は第２の独立し
た機構で活性化できる事を意味し、その機構も原理的に
本明細書に記載した機構と同様に発癌遺伝子形成に重要
である。
事としての過剰調節を示す一連の最近の実験に反駁する
ように思える。そのような実験には、鳥類のレトロウイ
ルスの白血病誘発の間にｍｙｃ始原発癌遺伝子の活性化
〔Neel,B.G.,Hayward,W.S.,Robinson,H.L.,Fang,Ｊ．お
よびAstrin,S.M.Cell２３：３２３−３３４（１９８
１）；およびPayne,G.S.,Courtneidge,S.A.,Crittendo
n,L.B.,Fadly,A.M.,Bishop,Ｊ．Ｍ．およびVarmus,H.E.
Cell２３：３１１−３２２（１９８１）を参照された
い〕；およびレトロウイルスのＬＴＲプロモーターおよ
び細胞始原発癌遺伝子のイン ビトロでの融合でトラン
スフオーム活性遺伝子が生ずることの実証〔DeFeo,D.,G
onda,M.A.,Young,H.A.,Chang,E.H.,Lowy,D.R.,Scolnic
k,Ｅ．Ｍ．およびEllis,R.W.Proc.Natl.Acad.SciＵＳＡ
７８：３３２８−３３３２（１９８１）；Blair,D.G.,O
skrsson,M.,Wood,T.G.,Mc Clements,W.L.,Fischinger,
Ｐ．Ｊ．およびVandewoude,G.Science２１２：９４１−
９４３（１９８１）；およびChange,E.J.,Furth,M.E.,S
colnick,Ｅ．Ｍ．およびLowy,D.R.Nature２９７：４７
９−４８３（１９８２）を参照されたい〕がある。これ
らの後者の結果はその幾つかはラツトおよびヒトｃ−Ｈ
ａ−ｒａｓ始原発癌遺伝子のクローンの活性化を実証し
ているので特に密接な関係がある。これらのｃ−Ｈａ−
ｒａｓ遺伝子の蛋白質暗号化配列がこれらウイルス−細
胞キメラ構成の間に構造的変化を受ける事は考えにく
い。むしろ始原発癌遺伝子およびそのＬＴＲ−活性化相
対物の唯一の本質的相違は発現の速度にある事は明らか
である。この事はｒａｓ始原発癌遺伝子は第２の独立し
た機構で活性化できる事を意味し、その機構も原理的に
本明細書に記載した機構と同様に発癌遺伝子形成に重要
である。
他の癌の発癌遺伝子もまた辿るとｒａｓ遺伝子である。
特に結腸および肺癌は細胞Ｋｉ−ｒａｓ遺伝子の活性化
による発癌遺伝子を有している事が観察されている。De
r,C.,Krontiris,Ｔ．Ｇ．およびCooper,G.M.Proc.Natl.
Acad.Sci.ＵＳＡ７９：３６３７−３６４０（１９８
０）を参照されたい。それ故、多くのこれらの発癌遺伝
子の活性化もまた前に報告されているものと同様に構造
的変化に依存するようである。
特に結腸および肺癌は細胞Ｋｉ−ｒａｓ遺伝子の活性化
による発癌遺伝子を有している事が観察されている。De
r,C.,Krontiris,Ｔ．Ｇ．およびCooper,G.M.Proc.Natl.
Acad.Sci.ＵＳＡ７９：３６３７−３６４０（１９８
０）を参照されたい。それ故、多くのこれらの発癌遺伝
子の活性化もまた前に報告されているものと同様に構造
的変化に依存するようである。
前に記載した如く、ＥＪ発癌遺伝子中のＧｌｙ１２のコ
ドンの変化は、発癌遺伝子におけるこのコドンの変化に
より起こされる発癌またはトランスフオーメーシヨンの
簡単な診断用検定法を可能にする。発癌または関連する
過程の間に起こつたＧｌｙ１２コドンのどんな突然変異
もＮａｅＩおよびＨｐａＩエンドヌクレアーゼの切断認
識部位を変化させ、発癌遺伝子の変化したＤＮＡはこの
部位での切断に抵抗するようになる。それ故、これらの
エンドヌクレアーゼによるこの部位におけるＤＮＡの切
断され易さの試験は、始原発癌遺伝子のこの領域の突然
変異変化の特徴的な試験となる。
ドンの変化は、発癌遺伝子におけるこのコドンの変化に
より起こされる発癌またはトランスフオーメーシヨンの
簡単な診断用検定法を可能にする。発癌または関連する
過程の間に起こつたＧｌｙ１２コドンのどんな突然変異
もＮａｅＩおよびＨｐａＩエンドヌクレアーゼの切断認
識部位を変化させ、発癌遺伝子の変化したＤＮＡはこの
部位での切断に抵抗するようになる。それ故、これらの
エンドヌクレアーゼによるこの部位におけるＤＮＡの切
断され易さの試験は、始原発癌遺伝子のこの領域の突然
変異変化の特徴的な試験となる。
この試験は、目的のＤＮＡを例えばＮａｅＩで処理し、
生じるフラグメントをアガロースゲル電気泳動により分
離し、硝酸セルロースのフイルターに分離したフラグメ
ントを移し、配列特異性の放射標識されたプローブとフ
イルターをインキユベートし、続いてラジオグラフイー
により移されたフラグメントを検出する。方法はよく知
られているものである。Southern,J.Mol.Biol.９８：５
０３−１７（１９７５）を参照されたい。
生じるフラグメントをアガロースゲル電気泳動により分
離し、硝酸セルロースのフイルターに分離したフラグメ
ントを移し、配列特異性の放射標識されたプローブとフ
イルターをインキユベートし、続いてラジオグラフイー
により移されたフラグメントを検出する。方法はよく知
られているものである。Southern,J.Mol.Biol.９８：５
０３−１７（１９７５）を参照されたい。
そのような実験で使用する配列プローブは、始原発癌遺
伝子の領域と重なるか、または始原発癌遺伝子のこの領
域に非常に隣接した所にある多数のＤＮＡセグメントか
ら誘導できる。記載する実施例では、プローブは、変化
したコドンの左側のＮａｅＩ部位から始まり、その右の
ＮａｅＩ部位で終る発癌遺伝子のＮａｅＩフラグメント
であつてよい。正常始原発癌遺伝子を持つ細胞のＤＮＡ
はこの部位でＮａｅＩにより２つの部分に切断され、一
方ＥＪ膀胱癌発癌遺伝子のＤＮＡはＮａｅＩエンドヌク
レアーゼによる処理ではこの部位は影響を受けない。
伝子の領域と重なるか、または始原発癌遺伝子のこの領
域に非常に隣接した所にある多数のＤＮＡセグメントか
ら誘導できる。記載する実施例では、プローブは、変化
したコドンの左側のＮａｅＩ部位から始まり、その右の
ＮａｅＩ部位で終る発癌遺伝子のＮａｅＩフラグメント
であつてよい。正常始原発癌遺伝子を持つ細胞のＤＮＡ
はこの部位でＮａｅＩにより２つの部分に切断され、一
方ＥＪ膀胱癌発癌遺伝子のＤＮＡはＮａｅＩエンドヌク
レアーゼによる処理ではこの部位は影響を受けない。
この検定は、始原発癌遺伝子のＤＮＡのその対応する発
癌遺伝子への変化に対して一般的に応用できる。始原発
癌遺伝子または発癌遺伝子の何れか一方のみのＤＮＡ配
列が制限エンドヌクレアーゼの切断に感受性で、他の配
列は感受性でないことが検定法の基本原理である。
癌遺伝子への変化に対して一般的に応用できる。始原発
癌遺伝子または発癌遺伝子の何れか一方のみのＤＮＡ配
列が制限エンドヌクレアーゼの切断に感受性で、他の配
列は感受性でないことが検定法の基本原理である。
発癌遺伝子により暗号化されたｐ２１蛋白質から始原発
癌遺伝子により暗号化されたｐ２１蛋白質へのアミノ酸
配列の変化の他の結果は、両方の特異的な血清学の試薬
での検出を可能にする。そのような血清学試薬は正常始
原発癌遺伝子が特定するアミノ酸配列を蛋白質のこの部
位で特定でき、または発癌遺伝子が特定する変化したア
ミノ酸配列を蛋白質のこの部位で特定できる。未変化の
蛋白質領域と反応し、その結果ｐ２１蛋白質の正常また
は異常な形の一方と反応性のあるような他の血清学試薬
も用いる事ができる。
癌遺伝子により暗号化されたｐ２１蛋白質へのアミノ酸
配列の変化の他の結果は、両方の特異的な血清学の試薬
での検出を可能にする。そのような血清学試薬は正常始
原発癌遺伝子が特定するアミノ酸配列を蛋白質のこの部
位で特定でき、または発癌遺伝子が特定する変化したア
ミノ酸配列を蛋白質のこの部位で特定できる。未変化の
蛋白質領域と反応し、その結果ｐ２１蛋白質の正常また
は異常な形の一方と反応性のあるような他の血清学試薬
も用いる事ができる。
クローニング技術を用い、始原発癌遺伝子の正常部位ま
たは発癌遺伝子の変化部位で暗号化されるｐ２１蛋白質
を有意の量単離できる。そのような蛋白質セグメントを
用い標準的な抗体産生技術により抗体を産生する。すな
わち、ポリクローナル抗体の産生のため、その蛋白質を
用い、ウサギまたはラツトの如き宿主に免疫し、該蛋白
質に対する抗体を宿主から得られる血清から集める。
たは発癌遺伝子の変化部位で暗号化されるｐ２１蛋白質
を有意の量単離できる。そのような蛋白質セグメントを
用い標準的な抗体産生技術により抗体を産生する。すな
わち、ポリクローナル抗体の産生のため、その蛋白質を
用い、ウサギまたはラツトの如き宿主に免疫し、該蛋白
質に対する抗体を宿主から得られる血清から集める。
さらに、ハイブリドーマ細胞を形成する典型的な融合技
術で単離された遺伝子セグメントの産生する蛋白質に対
する抗体を産生する細胞を用い、モノクローナル抗体を
産生できる。基本的に、これらの技術は抗体産生細胞を
ミエローマ細胞の如き不滅の細胞と融合せしめ、希望す
る抗体を産生する永久増殖性融合細胞ハイブリツドを提
供する事からなり；本願の場合、希望する抗体とは、単
離された遺伝子セグメントにより暗号化されたｐ２１蛋
白質の正常または変異セグメントに対する抗体でる。ハ
イブリツド細胞を抗体産生の助けとなるような条件下で
培養し、その後、細胞培養培地から抗体を集める。その
ようなモノクローナル抗体を産生する技術は文献によく
記載されている。例えば、米国特許第４，１７２，１２
４号および第４，１９６，２６５号（Hilary Koprowski
らに特許された）を参照されたい。その技術はここでは
参照のため含まれる。
術で単離された遺伝子セグメントの産生する蛋白質に対
する抗体を産生する細胞を用い、モノクローナル抗体を
産生できる。基本的に、これらの技術は抗体産生細胞を
ミエローマ細胞の如き不滅の細胞と融合せしめ、希望す
る抗体を産生する永久増殖性融合細胞ハイブリツドを提
供する事からなり；本願の場合、希望する抗体とは、単
離された遺伝子セグメントにより暗号化されたｐ２１蛋
白質の正常または変異セグメントに対する抗体でる。ハ
イブリツド細胞を抗体産生の助けとなるような条件下で
培養し、その後、細胞培養培地から抗体を集める。その
ようなモノクローナル抗体を産生する技術は文献によく
記載されている。例えば、米国特許第４，１７２，１２
４号および第４，１９６，２６５号（Hilary Koprowski
らに特許された）を参照されたい。その技術はここでは
参照のため含まれる。
より具体的には、そのような血清学試薬は既知の方法に
より得る事ができる。Walter,G.,Scheidtmann,K.H.,Car
bone,A.,Laudaro,Ａ．Ｐ．およびDoolittle,R.F.,Proc.
Natl.Acad.Sci.ＵＳＡ，７７：５１９７−５２００（１
９８０）；Lerner,R.A.,Green,N.,Alexander,H.,Liu,F.
T.,Sut-cliffe,Ｊ．Ｇ．，およびSchinnick,T.M.,Proc.
Natl.Acad.Sci.ＵＳＡ，７８：３４０３−３４０７（１
９８１）を参照されたい。
より得る事ができる。Walter,G.,Scheidtmann,K.H.,Car
bone,A.,Laudaro,Ａ．Ｐ．およびDoolittle,R.F.,Proc.
Natl.Acad.Sci.ＵＳＡ，７７：５１９７−５２００（１
９８０）；Lerner,R.A.,Green,N.,Alexander,H.,Liu,F.
T.,Sut-cliffe,Ｊ．Ｇ．，およびSchinnick,T.M.,Proc.
Natl.Acad.Sci.ＵＳＡ，７８：３４０３−３４０７（１
９８１）を参照されたい。
実際に、ペプチドセグメントを標準的な有機合成技術で
合成し、合成されたペプチド配列が研究している目的の
蛋白質領域のアミノ酸配列に正確に対応するようにする
ことができる。次いでこのペプチドをキヤリヤ蛋白質と
結合させ、適切な宿主（例えばマウス）に注射し、免疫
応答を起こす。この方法で免疫された動物の血清を免疫
したペプチドおよびより重要であるが、その一つの領域
にこのアミノ酸配列を持つ蛋白質の両方に対して免疫沈
降させるために用いる事ができる。従つて、正常な始原
発癌遺伝子から発癌遺伝子に転換する際に変化するアミ
ノ酸残基部位を持つオリゴペプチド配列（例えばデカペ
プチド）に対する血清が作れる。そのような血清は正常
のペプチド配列か、または変化した配列に対して作る事
ができる。免疫グロブリン−抗原相互作用の特異性は、
あるオリゴペプチドと反応する血清はその一つの領域に
同じ対応した配列を持つ蛋白質とのみ反応し、その一つ
の領域に変化したこの配列を持つ蛋白質とは交叉反応し
ない事を保証する。
合成し、合成されたペプチド配列が研究している目的の
蛋白質領域のアミノ酸配列に正確に対応するようにする
ことができる。次いでこのペプチドをキヤリヤ蛋白質と
結合させ、適切な宿主（例えばマウス）に注射し、免疫
応答を起こす。この方法で免疫された動物の血清を免疫
したペプチドおよびより重要であるが、その一つの領域
にこのアミノ酸配列を持つ蛋白質の両方に対して免疫沈
降させるために用いる事ができる。従つて、正常な始原
発癌遺伝子から発癌遺伝子に転換する際に変化するアミ
ノ酸残基部位を持つオリゴペプチド配列（例えばデカペ
プチド）に対する血清が作れる。そのような血清は正常
のペプチド配列か、または変化した配列に対して作る事
ができる。免疫グロブリン−抗原相互作用の特異性は、
あるオリゴペプチドと反応する血清はその一つの領域に
同じ対応した配列を持つ蛋白質とのみ反応し、その一つ
の領域に変化したこの配列を持つ蛋白質とは交叉反応し
ない事を保証する。
腫瘍試料または組織ホモジネートまたは自己融解した腫
瘍片からの遊離液から、ここに記載した突然変異誘発変
化に影響されない蛋白質の領域（例えばｃ−末端）と交
叉反応する一般の非特異的ｐ２１血清を用い、ｐ２１蛋
白質を免疫沈降する事ができる。別個に、１２番目の残
基を取り囲むＮ末端正常ペプチドに対して特異的な血清
を同じ溶解液からの蛋白質の免疫沈降に使用できる。も
し非病理組織からの正常ｐ２１を免疫沈降する事ができ
るこのＮ末端特異的血清が目的の試験組織よりｐ２１を
免疫沈降できないなら、この試験組織のｐ２１は正常の
Ｎ末端配列に反応性のある血清と反応する能力に影響す
る形の変化があつたと考えられる。一般の非特異的血清
でこの組織より免疫沈降するｐ２１の量が正常Ｎ末端配
列と反応性のある血清により沈降しうるｐ２１の量の対
照となる。
瘍片からの遊離液から、ここに記載した突然変異誘発変
化に影響されない蛋白質の領域（例えばｃ−末端）と交
叉反応する一般の非特異的ｐ２１血清を用い、ｐ２１蛋
白質を免疫沈降する事ができる。別個に、１２番目の残
基を取り囲むＮ末端正常ペプチドに対して特異的な血清
を同じ溶解液からの蛋白質の免疫沈降に使用できる。も
し非病理組織からの正常ｐ２１を免疫沈降する事ができ
るこのＮ末端特異的血清が目的の試験組織よりｐ２１を
免疫沈降できないなら、この試験組織のｐ２１は正常の
Ｎ末端配列に反応性のある血清と反応する能力に影響す
る形の変化があつたと考えられる。一般の非特異的血清
でこの組織より免疫沈降するｐ２１の量が正常Ｎ末端配
列と反応性のある血清により沈降しうるｐ２１の量の対
照となる。
上記の免疫沈降は、組織試料中の変化したｐ２１の存在
の測定に用いる事ができる。これと別個に、この領域の
正常のアミノ酸配列が異常配列に変化する時どの型の特
異変化が起きているかを診断するため、一連のペプチド
に特異的血清を開発できる。例えば、１２番目残基の暗
号化するコドンで単一の点突然変異による起こるアミノ
酸置換のリストを作る事ができる。これらの各々の置換
に対し、この領域の新しい翻訳のオリゴペプチドを推論
でき、前に記載した使用のための対応するペプチドが合
成される。これらの血清の各々は、各血清を誘導するの
に使用したオリゴペプチド片に対応する変化したｐ２１
と特異的に反応する。
の測定に用いる事ができる。これと別個に、この領域の
正常のアミノ酸配列が異常配列に変化する時どの型の特
異変化が起きているかを診断するため、一連のペプチド
に特異的血清を開発できる。例えば、１２番目残基の暗
号化するコドンで単一の点突然変異による起こるアミノ
酸置換のリストを作る事ができる。これらの各々の置換
に対し、この領域の新しい翻訳のオリゴペプチドを推論
でき、前に記載した使用のための対応するペプチドが合
成される。これらの血清の各々は、各血清を誘導するの
に使用したオリゴペプチド片に対応する変化したｐ２１
と特異的に反応する。
用語“免疫沈降”は更に一連の変化した技術操作により
更に記述する。通常使用される技術は、代謝的に標識し
た蛋白質を免疫沈降し、続いてゲル電気泳動および得ら
れたゲルのオートラジオグラフイーを行うものである。
組織試料を代謝的に標識するのが困難であるので、ここ
では他の方法が良好である；即ち、非標識蛋白質をゲル
電気泳動し、分離した蛋白質をニトロセルロースフイル
ターに移し、目的の蛋白質を、放射−標識免疫グロブリ
ンとフイルターをインキユベートする事により検出す
る。免疫グロブリンは直接ヨード化によりまたは間接的
に第１のイムノグロブリンの定常領域と反応する第２の
放射標識イムノグロブリンとインキユベートすることに
より放射標識化される。
更に記述する。通常使用される技術は、代謝的に標識し
た蛋白質を免疫沈降し、続いてゲル電気泳動および得ら
れたゲルのオートラジオグラフイーを行うものである。
組織試料を代謝的に標識するのが困難であるので、ここ
では他の方法が良好である；即ち、非標識蛋白質をゲル
電気泳動し、分離した蛋白質をニトロセルロースフイル
ターに移し、目的の蛋白質を、放射−標識免疫グロブリ
ンとフイルターをインキユベートする事により検出す
る。免疫グロブリンは直接ヨード化によりまたは間接的
に第１のイムノグロブリンの定常領域と反応する第２の
放射標識イムノグロブリンとインキユベートすることに
より放射標識化される。
本発明の応用についての議論および多くの実験的仕事
は、ヒトの膀胱癌のＥＪ遺伝子およびその始原発癌遺伝
子（ｃ−Ｈａ−ｒａｓ）との相違を検出することに向け
られたが、これらの相違を検出する技術ならびにそれら
に基づく検定法は、非常に普遍性を有する。事実、その
ような技術と検定は、突然変異して野生株の対立遺伝子
とは劇的に異なる機能を帯びた変異対立遺伝子またはジ
ーンを生じた如何なる野生株ジーンまたは対立遺伝子に
対しても適用可能と信じられる。例えばそのような技術
と検定は、野生株遺伝子およびＬｅｓｃｈ−Ｎｙａｎ症
候群に関連する突然変異遺伝子の差を検出するのに適し
ていると期待される。
は、ヒトの膀胱癌のＥＪ遺伝子およびその始原発癌遺伝
子（ｃ−Ｈａ−ｒａｓ）との相違を検出することに向け
られたが、これらの相違を検出する技術ならびにそれら
に基づく検定法は、非常に普遍性を有する。事実、その
ような技術と検定は、突然変異して野生株の対立遺伝子
とは劇的に異なる機能を帯びた変異対立遺伝子またはジ
ーンを生じた如何なる野生株ジーンまたは対立遺伝子に
対しても適用可能と信じられる。例えばそのような技術
と検定は、野生株遺伝子およびＬｅｓｃｈ−Ｎｙａｎ症
候群に関連する突然変異遺伝子の差を検出するのに適し
ていると期待される。
本発明方法は、発癌遺伝子と始原発癌遺伝子の差異を検
出するのに勿論特別の応用と有用性を持つ。一連のｒａ
ｓフアミリーのメンバーについては前に記載した。しか
しながら、ここに記載された技術はｒａｓフアミリーの
メンバー以外の始原発癌細胞の相違の発見も可能とす
る。例えば、ＨＬ−６０細胞株に存在する、前骨髄性白
血病、ある種の結腸癌およびＨａｉｒｙ細胞白血病に関
連する事が知られている発癌遺伝子とその始原発癌遺伝
子との差異はここに記載した方法を用いて決定できる。
これらの差異は記載された型の検定に用いられる。
出するのに勿論特別の応用と有用性を持つ。一連のｒａ
ｓフアミリーのメンバーについては前に記載した。しか
しながら、ここに記載された技術はｒａｓフアミリーの
メンバー以外の始原発癌細胞の相違の発見も可能とす
る。例えば、ＨＬ−６０細胞株に存在する、前骨髄性白
血病、ある種の結腸癌およびＨａｉｒｙ細胞白血病に関
連する事が知られている発癌遺伝子とその始原発癌遺伝
子との差異はここに記載した方法を用いて決定できる。
これらの差異は記載された型の検定に用いられる。
野生型遺伝子とそれに対応する突然変異遺伝子の差異を
検定する非常に一般的な手順は以下の如くである： Ａ．遺伝病の発現に対して遺伝子の正常機能または異常
機能が関連するような遺伝子のインビトロ検定法を開発
する：そのようなインビトロでの検定は、一般に、遺伝
子移植により遺伝子を受けた培養細胞の行動の観察でき
る変化に依存する。
検定する非常に一般的な手順は以下の如くである： Ａ．遺伝病の発現に対して遺伝子の正常機能または異常
機能が関連するような遺伝子のインビトロ検定法を開発
する：そのようなインビトロでの検定は、一般に、遺伝
子移植により遺伝子を受けた培養細胞の行動の観察でき
る変化に依存する。
Ｂ．上述の遺伝子の対立遺伝子を分子クローンとして単
離するために、上述のイン ビトロ検定を用いる。その
ような対立遺伝子は野生型対立遺伝子かまたはその野生
型対立遺伝子の機能不全性変異対立遺伝子である。
離するために、上述のイン ビトロ検定を用いる。その
ような対立遺伝子は野生型対立遺伝子かまたはその野生
型対立遺伝子の機能不全性変異対立遺伝子である。
Ｃ．Ｂ項からの単離対立遺伝子を用い、組換えＤＮＡ技
術を使用して遺伝子の他の対立遺伝子の形を単離する。
即ち、正常対立遺伝子を配列プローブとして使用し、変
異−非野生型対立遺伝子の同定および単離が可能にな
る。
術を使用して遺伝子の他の対立遺伝子の形を単離する。
即ち、正常対立遺伝子を配列プローブとして使用し、変
異−非野生型対立遺伝子の同定および単離が可能にな
る。
Ｄ．イン ビトロ検定系において、野生型対立遺伝子お
よび非野生型対立遺伝子の観察できる差異および別個の
挙動を実証する。
よび非野生型対立遺伝子の観察できる差異および別個の
挙動を実証する。
Ｅ．イン ビトロで野生型および非野生型対立遺伝子の
クローン間で遺伝子組換えを行い、野生型および非野生
型の対立遺伝子による表現型を検定する（Ｄ項）ことに
よりイン ビトロ検出系で組換え体を試験する。このよ
うにして、２つの対立遺伝子間の機能の差に関与する非
野生型対立遺伝子の領域を遺伝的な地図にする。
クローン間で遺伝子組換えを行い、野生型および非野生
型の対立遺伝子による表現型を検定する（Ｄ項）ことに
よりイン ビトロ検出系で組換え体を試験する。このよ
うにして、２つの対立遺伝子間の機能の差に関与する非
野生型対立遺伝子の領域を遺伝的な地図にする。
Ｆ．２つの対立遺伝子の間の機能の相違をコードするこ
とがＥ項で証明された非野生型対立遺伝子の領域の構造
的配列分析を実施する。
とがＥ項で証明された非野生型対立遺伝子の領域の構造
的配列分析を実施する。
Ｇ．その存在が非野生型遺伝子の変化した表現型を決定
する、決定的に変化した配列を同定した後（Ｆ項）、野
生型対立遺伝子を非野生型対立遺伝子に変換した過程で
切断認識部位が変化した部位特異性制限酵素（エンドヌ
クレアーゼ）を決定する。
する、決定的に変化した配列を同定した後（Ｆ項）、野
生型対立遺伝子を非野生型対立遺伝子に変換した過程で
切断認識部位が変化した部位特異性制限酵素（エンドヌ
クレアーゼ）を決定する。
Ｈ．その変化が遺伝子の機能に影響することが前に示さ
れたエンドヌクレアーゼ部位（Ｇ項）の存在または不存
在をスクリーニングすることによつて、試験ＤＮＡがそ
の遺伝子中の該遺伝子およびその非野生型対立遺伝子変
異体の機能の支配を決定することが前記Ｅ項で示された
遺伝子部分中に、配列変化を有するか否かを決定するた
めに、試験サンプルまたは試験組織をスクリーニングす
るための配列プローブとして、クローン化した野生型遺
伝子を使用する。
れたエンドヌクレアーゼ部位（Ｇ項）の存在または不存
在をスクリーニングすることによつて、試験ＤＮＡがそ
の遺伝子中の該遺伝子およびその非野生型対立遺伝子変
異体の機能の支配を決定することが前記Ｅ項で示された
遺伝子部分中に、配列変化を有するか否かを決定するた
めに、試験サンプルまたは試験組織をスクリーニングす
るための配列プローブとして、クローン化した野生型遺
伝子を使用する。
Ｉ．正常野生型対立遺伝子の遺伝子およびその非野生型
変異形により暗号化されたアミノ酸配列を推論する。前
に地図にし、遺伝子の機能に影響がある事（Ｆ項）がわ
かつているヌクレオチド配列の差異が、同様に野生型と
非野生型対立遺伝子が暗号付ける蛋白質のアミノ酸の配
列に影響があるか否かを決定する。
変異形により暗号化されたアミノ酸配列を推論する。前
に地図にし、遺伝子の機能に影響がある事（Ｆ項）がわ
かつているヌクレオチド配列の差異が、同様に野生型と
非野生型対立遺伝子が暗号付ける蛋白質のアミノ酸の配
列に影響があるか否かを決定する。
Ｊ．もし、アミノ酸配列に影響があれば、野生型と非野
生型の蛋白質に対する特異的な血清を開発する。例えば
野生型蛋白質と機能的に異なる非野生型蛋白質の領域の
配列である（Ｉ項）オリゴペプチド片を合成する事がで
きる： 対応する野生型オリゴペプチドを合成する。野生型また
は非野生型蛋白質と反応する特異的な抗血清を引き出す
ための免疫源として両者を用いる。
生型の蛋白質に対する特異的な血清を開発する。例えば
野生型蛋白質と機能的に異なる非野生型蛋白質の領域の
配列である（Ｉ項）オリゴペプチド片を合成する事がで
きる： 対応する野生型オリゴペプチドを合成する。野生型また
は非野生型蛋白質と反応する特異的な抗血清を引き出す
ための免疫源として両者を用いる。
Ｋ．前記特異的抗血清（Ｊ項）を利用し、前記蛋白質の
野生型または非野生型の存在に関して試験細胞または試
験組織の蛋白質をスクリーニングする。
野生型または非野生型の存在に関して試験細胞または試
験組織の蛋白質をスクリーニングする。
Ｌ．前記蛋白質スクリーニングを利用し（Ｋ項）、遺伝
病の表現型を媒介するのに重要な構造の蛋白質の存在を
診断する。
病の表現型を媒介するのに重要な構造の蛋白質の存在を
診断する。
産業上の利用性 ここに記載されている本発明は始原発癌遺伝子およびそ
の対応する発癌遺伝子、そのような遺伝子で暗号化され
た蛋白質の間の差異の決定、そのような蛋白質またはそ
の一部の抗体の製造、および発癌を調べるためそのよう
な始原発癌遺伝子または発癌遺伝子の存在をそのような
抗体を利用して検定するのに有用である。
の対応する発癌遺伝子、そのような遺伝子で暗号化され
た蛋白質の間の差異の決定、そのような蛋白質またはそ
の一部の抗体の製造、および発癌を調べるためそのよう
な始原発癌遺伝子または発癌遺伝子の存在をそのような
抗体を利用して検定するのに有用である。
均等範囲 当業者は日常的試験を行なうだけで、ここに記載した本
発明の特定の具体例に多くの均等範囲を認め、確認でき
る。そのような均等範囲は以下の請求の範囲に含まれる
事を意図する。
発明の特定の具体例に多くの均等範囲を認め、確認でき
る。そのような均等範囲は以下の請求の範囲に含まれる
事を意図する。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 ブラツドレイ，スコツト・エム アメリカ合衆国バージニア州22101，マツ クリーン，ベンジヤミン・ストリート6801 (56)参考文献 米国特許4395486（ＵＳ，Ａ) Ｎａｔｕｒｅ，297（5866），Ｐ．479− 483，1982 Ｓｃｉｅｎｃｅ，216（4543），Ｐ．309 −311，1982 Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ａｂｓｔｒａｃｔ ｓ，97（５），Ｐ．425，ＮＯ．372796, 1982 Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｒｅ ｓ Ｃｏｍｍｕｎ，98（３），Ｐ．844− 849，1981 Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ，252（23）, Ｐ．8740−8746，1977
Claims (20)
- 【請求項１】（ａ）ヒト由来の予め定めた細胞サンプル
へ始原発癌遺伝子またはその発現産物と発癌遺伝子また
はその発現産物を区別できるプローブを添加し、そして （ｂ）該プローブにより、始原発癌遺伝子またはその発
現産物が発癌遺伝子またはその発現産物へ変異されてい
るかどうかを調べ、該変異を癌の指標とする、 ことよりなる始原発癌遺伝子の発癌遺伝子への変異によ
り生じるヒトにおける発癌の検出方法。 - 【請求項２】始原発癌遺伝子がヒトｒａｓ始原発癌遺伝
子であり、そして発癌遺伝子が相当するヒトｒａｓ発癌
遺伝子である、特許請求の範囲第１項記載の検出方法。 - 【請求項３】プローブが、ヒトｒａｓ始原発癌遺伝子の
Ｇｌｙ１２コドンにおけるヒトｒａｓ始原発癌遺伝子と
相当するヒトｒａｓ発癌遺伝子の相違を区別する、特許
請求の範囲第２項記載の検出方法。 - 【請求項４】プローブが、始原発癌遺伝子の発現産物と
発癌遺伝子の発現産物を区別する抗体プローブである、
特許請求の範囲第１項記載の検出方法。 - 【請求項５】始原発癌遺伝子の発現産物と発癌遺伝子の
発現産物の相違がアミノ酸配列における相違である、特
許請求の範囲第４項記載の方法。 - 【請求項６】始原発癌遺伝子がヒトｒａｓ始原発癌遺伝
子であり、そして発癌遺伝子が相当するヒトｒａｓ発癌
遺伝子である、特許請求の範囲第４項記載の検出方法。 - 【請求項７】ヒトｒａｓ始原発癌遺伝子の発現産物と、
相当するヒトｒａｓ発癌遺伝子の発現産物の相違が、ヒ
トｒａｓ始原発癌遺伝子のＧｌｙ１２コドンに存在す
る、特許請求の範囲第６項記載の検出方法。 - 【請求項８】プローブがヌクレオチドプローブである、
特許請求の範囲第１項記載の検出方法。 - 【請求項９】ヌクレオチドプローブが始原発癌遺伝子と
発癌遺伝子のヌクレオチド配列の相違を区別することが
できるものであり、そして該相違が始原発癌遺伝子から
発癌遺伝子への変異の原因である特許請求の範囲第８項
記載の検出方法。 - 【請求項１０】始原発癌遺伝子がヒトｒａｓ始原発癌遺
伝子であり、そして発癌遺伝子が相当するヒトｒａｓ発
癌遺伝子である、特許請求の範囲第９項記載の検出方
法。 - 【請求項１１】ヌクレオチドプローブが、ヒトｒａｓ始
原発癌遺伝子のＧｌｙ１２コドンにおけるヒトｒａｓ始
原発癌遺伝子と相当するヒトｒａｓ発癌遺伝子の相違を
区別する、特許請求の範囲第１０項記載の検出方法。 - 【請求項１２】プローブが始原発癌遺伝子または発癌遺
伝子のいずれかにのみ存在する開列部位に特異的な制限
酵素である、特許請求の範囲第１項記載の検出方法。 - 【請求項１３】制限酵素がＮａｅＩエンドヌクレアーゼ
またはＨｐａＩエンドヌクレアーゼである、特許請求の
範囲第１２項記載の検出方法。 - 【請求項１４】制限酵素プローブが、始原発癌遺伝子と
発癌遺伝子のヌクレオチド配列の相違を区別できるもの
であり、該相違が始原発癌遺伝子から発癌遺伝子への変
異の原因である、特許請求の範囲第１２項記載の検出方
法。 - 【請求項１５】始原発癌遺伝子がヒトｒａｓ始原発癌遺
伝子であり、そして発癌遺伝子が相当するヒトｒａｓ発
癌遺伝子である、特許請求の範囲第１４項記載の検出方
法。 - 【請求項１６】ヒトｒａｓ始原発癌遺伝子のヌクレオチ
ド配列と、相当するヒトｒａｓ発癌遺伝子のヌクレオチ
ド配列の相違が、ヒトｒａｓ始原発癌遺伝子のＧｌｙ
１２コドンに存在する、特許請求の範囲第１５項記載の
検出方法。 - 【請求項１７】ヒトｒａｓ発癌遺伝子がヒト膀胱癌の原
因となる発癌遺伝子である、特許請求の範囲第２、３、
６、７、１０、１１、１５または１６項記載の検出方
法。 - 【請求項１８】プローブが標識されている特許請求の範
囲第１項記載の検出方法。 - 【請求項１９】プローブが放射性物質で標識されてい
る、特許請求の範囲第１８項記載の検出方法。 - 【請求項２０】プローブが非放射性物質で標識されてい
る、特許請求の範囲第１８項記載の検出方法。
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