JPH0646196B2 - サイトメガロウイルスの検定のための診断系 - Google Patents
サイトメガロウイルスの検定のための診断系Info
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- JPH0646196B2 JPH0646196B2 JP60502210A JP50221085A JPH0646196B2 JP H0646196 B2 JPH0646196 B2 JP H0646196B2 JP 60502210 A JP60502210 A JP 60502210A JP 50221085 A JP50221085 A JP 50221085A JP H0646196 B2 JPH0646196 B2 JP H0646196B2
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- cytomegalovirus
- cells
- cmv
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- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/08—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from viruses
- C07K16/081—DNA viruses
- C07K16/085—Orthoherpesviridae (F), e.g. pseudorabies virus or Epstein-Barr virus
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Description
【発明の詳細な説明】 技術分野 本発明は、サイトメガロウイルスの検定のための診断
系、及びとくに生物学的サンプル中のサイトメガロウイ
ルスの存在を検定するための、サイトメガロウイルスに
より感染された細胞に関するウイルス抗原又はリガンド
と免疫反応する哺乳動物モノクローナル抗体に関する。
系、及びとくに生物学的サンプル中のサイトメガロウイ
ルスの存在を検定するための、サイトメガロウイルスに
より感染された細胞に関するウイルス抗原又はリガンド
と免疫反応する哺乳動物モノクローナル抗体に関する。
背景 先天性巨細胞封入体症（ＣＩＤ）、一般化唾液腺ウイル
ス病、サイトメガリー、及び封入体症は、サイトメガロ
ウイルス（ＣＭＶ）感染により起される病気の同義語で
ある。ＣＭＶは、潜伏感染から重大な先天的疾病までの
広い範囲の臨床の病気に関係する。ウェラー(Weller),
T.,N.Engl.J.Med.,２８５，２０３及び２６７（１９７
１）。
ス病、サイトメガリー、及び封入体症は、サイトメガロ
ウイルス（ＣＭＶ）感染により起される病気の同義語で
ある。ＣＭＶは、潜伏感染から重大な先天的疾病までの
広い範囲の臨床の病気に関係する。ウェラー(Weller),
T.,N.Engl.J.Med.,２８５，２０３及び２６７（１９７
１）。
たとえば、病気は、免疫抑制治療中の患者及び偶然の感
染にあった人において起こる。事実、ＣＭＶは、同種骨
髄移植後の最も一般的な感染となってきており、移植手
術の成功、不成功の重要な決定要素である〔ナイマン(N
eiman)ら、J.Infect.Dis.,１３６，７５４（１９７
７）〕。
染にあった人において起こる。事実、ＣＭＶは、同種骨
髄移植後の最も一般的な感染となってきており、移植手
術の成功、不成功の重要な決定要素である〔ナイマン(N
eiman)ら、J.Infect.Dis.,１３６，７５４（１９７
７）〕。
腎臓同種（ホモ）移植後の免疫抑制治療をうけている成
人のうち９０％以上が、もし彼らが手術前にサイトメガ
ロウイルスを持っていたなら、進行性サイトメガロウイ
ルス感染を進展する。血清陰性患者の約半分が結局、免
疫抑制治療において感染される。血清陽性提供者から腎
臓を受けた血清陰性受容者もまた常に、術後感染を進展
し、症状を進展するであろう。
人のうち９０％以上が、もし彼らが手術前にサイトメガ
ロウイルスを持っていたなら、進行性サイトメガロウイ
ルス感染を進展する。血清陰性患者の約半分が結局、免
疫抑制治療において感染される。血清陽性提供者から腎
臓を受けた血清陰性受容者もまた常に、術後感染を進展
し、症状を進展するであろう。
サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）感染は、ヘルペスウイ
ルスの生理化学的及び電子顕微鏡的特徴を持つ種特異的
な因子によって起こされる。ヒトＣＭＶは、ＣＩＤの幼
児からまた学齢期児童のアデノイド組織から１９５０年
代中ごろに繊維芽細胞培養物中において初めて分離され
た。細胞変性作用が、組織培養物において知られてお
り、それは大きな核内封入を特徴とする。ウイルスの伝
播が、後記のような特別の血清学的テストの開発の理由
を与えた。
ルスの生理化学的及び電子顕微鏡的特徴を持つ種特異的
な因子によって起こされる。ヒトＣＭＶは、ＣＩＤの幼
児からまた学齢期児童のアデノイド組織から１９５０年
代中ごろに繊維芽細胞培養物中において初めて分離され
た。細胞変性作用が、組織培養物において知られてお
り、それは大きな核内封入を特徴とする。ウイルスの伝
播が、後記のような特別の血清学的テストの開発の理由
を与えた。
サイトメガロウイルス感染は世界的に広がっている。し
かしサイトメガロウイルスは、高度に伝染性の感染を引
き起こさない。すなわち、かなりの数の個人が成人期に
おける感染に感受性を有したままである。ＣＭＶは、唾
液、上部気管、尿、乳、頚部分泌物、精液、排泄物、及
び血液中の循環する白血球から分離されている。ウイル
スはたぶん、感染された個人との濃厚感染により、又は
無症候の血液提供者からの輸血により移される。
かしサイトメガロウイルスは、高度に伝染性の感染を引
き起こさない。すなわち、かなりの数の個人が成人期に
おける感染に感受性を有したままである。ＣＭＶは、唾
液、上部気管、尿、乳、頚部分泌物、精液、排泄物、及
び血液中の循環する白血球から分離されている。ウイル
スはたぶん、感染された個人との濃厚感染により、又は
無症候の血液提供者からの輸血により移される。
詳しくは、サイトメガロウイルス感染の一つのタイプ
が、輸血を受けた患者について述べられている。輸血後
ＣＭＶ単核症(mononucleosis)と言われるこの状態は、
血の投与後２〜４週間で現われる。
が、輸血を受けた患者について述べられている。輸血後
ＣＭＶ単核症(mononucleosis)と言われるこの状態は、
血の投与後２〜４週間で現われる。
後天性サイトメガロウイルス感染はまた、自己免疫容血
病、胃腸管の潰瘍性病変、移植後肺炎及び血小板減少性
紫斑病に関係する。しかし誕生後に獲得したＣＭＶ感染
の多くにとって、回復はたいした合併症を伴わない。
病、胃腸管の潰瘍性病変、移植後肺炎及び血小板減少性
紫斑病に関係する。しかし誕生後に獲得したＣＭＶ感染
の多くにとって、回復はたいした合併症を伴わない。
単核症様の症候を持つ患者におけるサイトメガロウイル
ス感染の診断は、小水泡病変からのウイルス分離により
確立される。ＣＭＶによる感染に応答して作られた抗体
は、中和（ＮＴ）、補体固定（ＣＦ）、免疫螢光及び血
小板凝固（ＰＡ）法により検定できる〔ウェラー、N.En
g.J.Med.,２８５，２０３（1971）参照〕。しかし現在
利用できる血清学的テストは、他の細胞関連ヘルペスウ
イルスとの交叉反応およびたとえばＣＦ抗体が正常対象
において幅広く変動する傾向の故に、ＣＭＶ感染を診断
するときに注意深く解釈されなければならない。
ス感染の診断は、小水泡病変からのウイルス分離により
確立される。ＣＭＶによる感染に応答して作られた抗体
は、中和（ＮＴ）、補体固定（ＣＦ）、免疫螢光及び血
小板凝固（ＰＡ）法により検定できる〔ウェラー、N.En
g.J.Med.,２８５，２０３（1971）参照〕。しかし現在
利用できる血清学的テストは、他の細胞関連ヘルペスウ
イルスとの交叉反応およびたとえばＣＦ抗体が正常対象
において幅広く変動する傾向の故に、ＣＭＶ感染を診断
するときに注意深く解釈されなければならない。
サイトメガロウイルス感染に対する満足な処置法はな
い。コルチコステロイド、ガンマグロブリン及び抗ウイ
ルス剤たとえばデオキシウリジン、フロクスウリジン、
シトシンアラビノシド及びアデニンアラビノシドの使用
は、臨床において、はっきりしない有効性又は無効性を
報告されている。しかしこれら報告は、処置された個人
数が少ないこと、同時に働く多数の因子、及び異なる時
点にテストされた個人におけるウイルス分泌の可変性の
故に評価が困難である。
い。コルチコステロイド、ガンマグロブリン及び抗ウイ
ルス剤たとえばデオキシウリジン、フロクスウリジン、
シトシンアラビノシド及びアデニンアラビノシドの使用
は、臨床において、はっきりしない有効性又は無効性を
報告されている。しかしこれら報告は、処置された個人
数が少ないこと、同時に働く多数の因子、及び異なる時
点にテストされた個人におけるウイルス分泌の可変性の
故に評価が困難である。
発明の概要 本発明は、哺乳類動物モノクローナル受容体（レセプタ
ー）、受容体を作る方法及び受容体を用いる診断に関す
る。モノクローナル受容体は、ミエローマ細胞系統、及
びサイトメガロウイルスに関連するウイルス抗原と反応
する抗体を作るヒ臓細胞からの細胞融合により形成され
たハイブリドーマにより作られる。
ー）、受容体を作る方法及び受容体を用いる診断に関す
る。モノクローナル受容体は、ミエローマ細胞系統、及
びサイトメガロウイルスに関連するウイルス抗原と反応
する抗体を作るヒ臓細胞からの細胞融合により形成され
たハイブリドーマにより作られる。
本発明の一面において、マウスモノクローナル受容体
が、ハイブリドーマＡＴＣＣ ＨＢ８５５４により作ら
れる。Ｌ−１４と名付けられたこのモノクローナル受容
体は、マウスミエローマ系統Ｐ３Ｘ６３−Ag８．６５
３、及びＣＭＶ感染した細胞を含む分離物で予め免疫化
したマウスからのマウスヒ臓細胞からの細胞融合により
形成された。
が、ハイブリドーマＡＴＣＣ ＨＢ８５５４により作ら
れる。Ｌ−１４と名付けられたこのモノクローナル受容
体は、マウスミエローマ系統Ｐ３Ｘ６３−Ag８．６５
３、及びＣＭＶ感染した細胞を含む分離物で予め免疫化
したマウスからのマウスヒ臓細胞からの細胞融合により
形成された。
本発明の他のマウスモノクローナル受容体は、ハイブリ
ドーマＡＴＣＣ ＨＢ８６２２、ＡＴＣＣ ＨＢ８６２
３及びＡＴＣＣＨＢ８６２４により作られる。各々、Ｋ
−２５、Ｅ−２８、及びＡ−３３と名付けられたこれら
モノクローナル受容体はまた、マウスミエローマ系統Ｐ
３Ｘ６３−Ag８．６５３、及びＣＭＢ感染した細胞を含
む分離物により予め免疫化したマウスからのマウスヒ臓
細胞からの細胞融合により形成された。
ドーマＡＴＣＣ ＨＢ８６２２、ＡＴＣＣ ＨＢ８６２
３及びＡＴＣＣＨＢ８６２４により作られる。各々、Ｋ
−２５、Ｅ−２８、及びＡ−３３と名付けられたこれら
モノクローナル受容体はまた、マウスミエローマ系統Ｐ
３Ｘ６３−Ag８．６５３、及びＣＭＢ感染した細胞を含
む分離物により予め免疫化したマウスからのマウスヒ臓
細胞からの細胞融合により形成された。
本明細書で示すように、サイトメガロウイルスに対する
モノクローナル抗体は、サイトメガロウイルス感染を研
究するため、及び生物学的液中のサイトメガロウイルス
のレベルを測定するため及びそのようなレベルと病気と
の関連のための検定法を開発するための有用なプローブ
である。
モノクローナル抗体は、サイトメガロウイルス感染を研
究するため、及び生物学的液中のサイトメガロウイルス
のレベルを測定するため及びそのようなレベルと病気と
の関連のための検定法を開発するための有用なプローブ
である。
とくに、本発明の一実施態様は、サイトメガロウイルス
に関連するウイルス抗原又はリガンドの存在を検定する
ための診断系に関する。この系は、有効量の本発明のモ
ノクローナル抗体を活性成分として含む第一の包装を含
む。所定量のこれら抗体が、サイトメガロウイルスに関
連する特定のウイルス抗原を含む生物学的サンプルの所
定量と混合されると、免疫反応により複合体が形成され
る。複合体の存在は、好ましくは系の第二の包装に含ま
れるラベル又は指示手段により検出できる。
に関連するウイルス抗原又はリガンドの存在を検定する
ための診断系に関する。この系は、有効量の本発明のモ
ノクローナル抗体を活性成分として含む第一の包装を含
む。所定量のこれら抗体が、サイトメガロウイルスに関
連する特定のウイルス抗原を含む生物学的サンプルの所
定量と混合されると、免疫反応により複合体が形成され
る。複合体の存在は、好ましくは系の第二の包装に含ま
れるラベル又は指示手段により検出できる。
本発明の別の面において、上述のモノクローナル受容体
を作るハイブリドーマを調製する方法が意図されてい
る。この方法は、 （ｉ） 哺乳動物をサイトメガロウイルス感染細胞によ
り免疫化すること、 （ii） この哺乳動物からヒ臓を除去し、ヒ臓細胞の懸
濁物を作ること、 （iii） 細胞融合プロモーターの存在下でヒ臓細胞を
哺乳動物ミエローマ細胞と融合すること、 （iv） 融合細胞を複数の独立したくぼみ又は容器にお
いて、非融合ミエローマ細胞の増殖を支持しない倍地で
希釈し培養すること、 （ｖ） ハイブリドーマを含む各くぼみの上澄みをサイ
トメガロウイルスに対し、ウイルス抗原に対する受容体
の存在について検定すること、及び （vi） ウイルス抗原に対するモノクローナル受容体を
作る望むハイブリドーマを選択しクローニングすること を含む。
を作るハイブリドーマを調製する方法が意図されてい
る。この方法は、 （ｉ） 哺乳動物をサイトメガロウイルス感染細胞によ
り免疫化すること、 （ii） この哺乳動物からヒ臓を除去し、ヒ臓細胞の懸
濁物を作ること、 （iii） 細胞融合プロモーターの存在下でヒ臓細胞を
哺乳動物ミエローマ細胞と融合すること、 （iv） 融合細胞を複数の独立したくぼみ又は容器にお
いて、非融合ミエローマ細胞の増殖を支持しない倍地で
希釈し培養すること、 （ｖ） ハイブリドーマを含む各くぼみの上澄みをサイ
トメガロウイルスに対し、ウイルス抗原に対する受容体
の存在について検定すること、及び （vi） ウイルス抗原に対するモノクローナル受容体を
作る望むハイブリドーマを選択しクローニングすること を含む。
本発明の更に別の面において、上述のモノクローナル受
容体を作る方法が意図されている。この方法は、ここで
述べるハイブリドーマの一つを適当な培養基で培養する
こと、及びハイブリドーマを含む培養基から受容体を回
収することを含む。
容体を作る方法が意図されている。この方法は、ここで
述べるハイブリドーマの一つを適当な培養基で培養する
こと、及びハイブリドーマを含む培養基から受容体を回
収することを含む。
本発明のまた別の面において、上述のモノクローナル受
容体を作る別の方法が意図されている。この方法は、こ
こで述べるハイブリドーマの一つを哺乳動物に注射する
こと、及び該哺乳動物の悪性腹水又は血清から受容体を
回収することを含む。
容体を作る別の方法が意図されている。この方法は、こ
こで述べるハイブリドーマの一つを哺乳動物に注射する
こと、及び該哺乳動物の悪性腹水又は血清から受容体を
回収することを含む。
本明細書で述べられるハイブリドーマ及びそれから作ら
れるモノクローナル受容体は、Ｌ−１４、Ｋ−２５、Ｅ
−２８、及びＡ−３３という名称により同定され、言及
される特定の物質は文脈から明らかになるであろう。
れるモノクローナル受容体は、Ｌ−１４、Ｋ−２５、Ｅ
−２８、及びＡ−３３という名称により同定され、言及
される特定の物質は文脈から明らかになるであろう。
ハイブリドーマＬ−１４は、１９８４年５月２日に、ア
メリカン タイプ カルチュア コレクション(America
n Type Culture Collection)、ロックビル、メリーラン
ド州、に寄託され、ATCC寄託番号ＨＢ８５５４を与えら
れた。ハイブリドーマＫ−２５、Ｅ−２８、及びＡ−３
３は１９８４年９月２７日に、アメリカンタイプ カル
チュア コレクション、ロックビル、メリーランド州
に、寄託され、各々ＡＴＣＣ寄託番号ＨＢ８６２２、Ｈ
Ｂ8623及びＨＢ８６２４を与えられた。
メリカン タイプ カルチュア コレクション(America
n Type Culture Collection)、ロックビル、メリーラン
ド州、に寄託され、ATCC寄託番号ＨＢ８５５４を与えら
れた。ハイブリドーマＫ−２５、Ｅ−２８、及びＡ−３
３は１９８４年９月２７日に、アメリカンタイプ カル
チュア コレクション、ロックビル、メリーランド州
に、寄託され、各々ＡＴＣＣ寄託番号ＨＢ８６２２、Ｈ
Ｂ8623及びＨＢ８６２４を与えられた。
モノクローナル受容体は、ＣＭＶ感染細胞と特異的に反
応する。とくに、モノクローナル受容体Ｌ−１４は、Ｃ
ＭＶ感染後初期に（３時間以内）に現われ、そして感染
サイクルの全体を通して細胞核内局在化されたままの蛋
白質と反応する。モノクローナル受容体Ｋ−２５、Ｅ−
２８及びＡ−３３は、同じ特異性をもって反応する。
応する。とくに、モノクローナル受容体Ｌ−１４は、Ｃ
ＭＶ感染後初期に（３時間以内）に現われ、そして感染
サイクルの全体を通して細胞核内局在化されたままの蛋
白質と反応する。モノクローナル受容体Ｋ−２５、Ｅ−
２８及びＡ−３３は、同じ特異性をもって反応する。
モノクローナル受容体の特異性の故に、ＣＭＶ以外のウ
イルスに対して向けられた多価ヒト血清からの抗体を用
いると起こるであろう偽りの陽性結果の問題を除去する
ことができる。
イルスに対して向けられた多価ヒト血清からの抗体を用
いると起こるであろう偽りの陽性結果の問題を除去する
ことができる。
結局、本モノクローナル抗体は、組織培養物、血サンプ
ルおよび他の体成分においてＣＭＶ感染を迅速かつ特異
的に検出するために用いることができる。
ルおよび他の体成分においてＣＭＶ感染を迅速かつ特異
的に検出するために用いることができる。
本発明の他の利点、利益及び使用は、以下の詳細な説
明、実施例及び請求の範囲から、当業者にとって明らか
となろう。
明、実施例及び請求の範囲から、当業者にとって明らか
となろう。
図面の簡単な説明 本開示の一部を成す図面において： 第１図及び第２図は、成人単核症患者からのＣＭＶ感染
細胞を含むＣＭＶ分離物に対する本発明のモノクローナ
ル抗体の反応性の免疫螢光研究を示す。健常な血提供者
からの末梢血リンパ球（ＰＢＬ）が、Ｉ−Ｇと名付けら
れたＣＭＶ分離物系統で予め感染された繊維芽により４
日間培養された。次にＴリンパ細胞を、赤血球ロゼット
化法〔モレッタ（Moretta）ら、ジャーナル オブイミ
ュノロジー（J．Immunol.）、１２２，９８４（１９７
９）参照、この開示を引用してここに含める〕により培
養物から分離し、ガラススライド上に置き、乾燥し、ア
セトン中で１０分間固定した。単球及びＢリンパ細胞夾
雑は、免疫螢光法により測定した0.1 ％未満であった。
ＣＭＶ感染に関連する前初期(immediate-early)ウイル
ス抗原の存在は、モノクローナル受容体Ｌ−１４により
測定した。結合した免疫グロブリンは、フルオレセイン
を接合したヤギ抗マウス免疫グロブリン（リットン−バ
イオネテックス（Litton-Bionetics）により可視化され
た。
細胞を含むＣＭＶ分離物に対する本発明のモノクローナ
ル抗体の反応性の免疫螢光研究を示す。健常な血提供者
からの末梢血リンパ球（ＰＢＬ）が、Ｉ−Ｇと名付けら
れたＣＭＶ分離物系統で予め感染された繊維芽により４
日間培養された。次にＴリンパ細胞を、赤血球ロゼット
化法〔モレッタ（Moretta）ら、ジャーナル オブイミ
ュノロジー（J．Immunol.）、１２２，９８４（１９７
９）参照、この開示を引用してここに含める〕により培
養物から分離し、ガラススライド上に置き、乾燥し、ア
セトン中で１０分間固定した。単球及びＢリンパ細胞夾
雑は、免疫螢光法により測定した0.1 ％未満であった。
ＣＭＶ感染に関連する前初期(immediate-early)ウイル
ス抗原の存在は、モノクローナル受容体Ｌ−１４により
測定した。結合した免疫グロブリンは、フルオレセイン
を接合したヤギ抗マウス免疫グロブリン（リットン−バ
イオネテックス（Litton-Bionetics）により可視化され
た。
第１図において、細胞の１５％が核又は近核螢光を示し
た。同様の結果が、Ｅ−３と名付けられたモノクローナ
ル抗体により得られた〔ゴールドステイン（Goldstei
n）ら、インフェクション アンド イミュニティ（Inf
ection and Immunity）、３８，２７３（１９８２）参
照、この開示を引用することによりここに含める。
た。同様の結果が、Ｅ−３と名付けられたモノクローナ
ル抗体により得られた〔ゴールドステイン（Goldstei
n）ら、インフェクション アンド イミュニティ（Inf
ection and Immunity）、３８，２７３（１９８２）参
照、この開示を引用することによりここに含める。
第２図に示すように、このＴリンパ細胞調製物からの細
胞は、Ｃ−５と名付けられたモノクローナル抗体により
後期ＣＭＶウイルス抗原を調べたとき、螢光性でなかっ
た。〔ゴールドステインら（前出）〕。
胞は、Ｃ−５と名付けられたモノクローナル抗体により
後期ＣＭＶウイルス抗原を調べたとき、螢光性でなかっ
た。〔ゴールドステインら（前出）〕。
発明の詳しい記述 Ｉ．序論 「受容体」という言葉は、リガンドに結合する生物学的
に活性な分子を意味するためにここで用いられる。本発
明の受容体分子は、実質上完全な抗体、又は抗体のイデ
ィオタイプ含有ポリアミド部分である。受容体分子の生
物学的活性は、受容体をその抗原性リガンドと水成培養
液中で少なくとも生理的pH値及びイオン強度において混
合すると受容体がその抗原性リガンドに結合することに
より証明される。好ましくは、受容体はまた、約５〜約
９のpH値範囲及びたとえば蒸留水から約１Ｍの塩化ナト
リウム溶液までのイオン強度において抗原性リガンドに
結合する。
に活性な分子を意味するためにここで用いられる。本発
明の受容体分子は、実質上完全な抗体、又は抗体のイデ
ィオタイプ含有ポリアミド部分である。受容体分子の生
物学的活性は、受容体をその抗原性リガンドと水成培養
液中で少なくとも生理的pH値及びイオン強度において混
合すると受容体がその抗原性リガンドに結合することに
より証明される。好ましくは、受容体はまた、約５〜約
９のpH値範囲及びたとえば蒸留水から約１Ｍの塩化ナト
リウム溶液までのイオン強度において抗原性リガンドに
結合する。
抗体のイディオタイプ含有ポリアミド部分（抗体結合部
位）は、イディオタイプを含みかつリガンドに結合する
抗体分子の部分である。そのような部分として、周知の
酵素的開裂法により抗体から調製されるFab，Fab′，及
びＦ（ab′）２フラグメントが挙げられる。たとえばセ
オフィロポウロス(Theofilopoulos)とディクソン(Dixo
n)の米国特許第４，３４２，５６６号明細書参照。イデ
ィオタイプ含有ポリアミドがそれから得られる抗体は免
疫原に対して生じられた又は免疫原により誘発されたと
記述されるので、イディオタイプ含有ポリアミド受容体
もまた、抗体からイディオタイプ含有ポリアミドを得る
ために開裂工程が必要であることを理解したうえで、
「生じられた」又は「誘発された」と言われるであろ
う。しかし、完全な抗体が好ましく、そしてこれが本発
明の受容体分子の例として用いられるであろう。
位）は、イディオタイプを含みかつリガンドに結合する
抗体分子の部分である。そのような部分として、周知の
酵素的開裂法により抗体から調製されるFab，Fab′，及
びＦ（ab′）２フラグメントが挙げられる。たとえばセ
オフィロポウロス(Theofilopoulos)とディクソン(Dixo
n)の米国特許第４，３４２，５６６号明細書参照。イデ
ィオタイプ含有ポリアミドがそれから得られる抗体は免
疫原に対して生じられた又は免疫原により誘発されたと
記述されるので、イディオタイプ含有ポリアミド受容体
もまた、抗体からイディオタイプ含有ポリアミドを得る
ために開裂工程が必要であることを理解したうえで、
「生じられた」又は「誘発された」と言われるであろ
う。しかし、完全な抗体が好ましく、そしてこれが本発
明の受容体分子の例として用いられるであろう。
本発明で有用な受容体は、モノクローナル抗体である。
「モノクローナル抗体」は、唯一種類の受容体分子を分
泌するハイブリドーマと呼ばれる単一細胞のクローンに
より作られた受容体である。ハイブリドーマ細胞は、抗
体産生細胞とミエローマ細胞又は他の自己永続性系統か
ら融合される。
「モノクローナル抗体」は、唯一種類の受容体分子を分
泌するハイブリドーマと呼ばれる単一細胞のクローンに
より作られた受容体である。ハイブリドーマ細胞は、抗
体産生細胞とミエローマ細胞又は他の自己永続性系統か
ら融合される。
本発明のモノクローナル抗体を作る方法は周知である。
そのような受容体は、コーラーKohler)とミルステイン
(Milstein)、ネイチア(Nature)、２５６，４９５（１９
７５）により最初に記載された。これを引用することに
より、ここに含める。モノクローナル抗体は典型的に
は、ハイブリドーマ組織培養物から、又はハイブリドー
マ組織が導入された哺乳動物から得た腹水から得られ
る。両方法がここで述べられる。
そのような受容体は、コーラーKohler)とミルステイン
(Milstein)、ネイチア(Nature)、２５６，４９５（１９
７５）により最初に記載された。これを引用することに
より、ここに含める。モノクローナル抗体は典型的に
は、ハイブリドーマ組織培養物から、又はハイブリドー
マ組織が導入された哺乳動物から得た腹水から得られ
る。両方法がここで述べられる。
II．検討 先述のように、ヒトサイトメガロウイルス感染はしばし
ば、特に異種移植の臨床移植における厳しい免疫抑制
〔グレン(Glenn)、Reu.Infect.Dis.,３，１１５１（１
９８１）、及び後天性免疫不全症候群〔スタール(Stah
l)ら、Am.J.Med.,７３，１７１（１９８２）〕に伴われ
る。ウイルスがどこに収容されるか、ウイルスゲノムが
どのように発現されるか、及び免疫抑制がウイルスによ
り直接に又は他のメカニズムにより間接的に仲介される
のかどうかは重要であるが、しかしまだ解明されていな
い。
ば、特に異種移植の臨床移植における厳しい免疫抑制
〔グレン(Glenn)、Reu.Infect.Dis.,３，１１５１（１
９８１）、及び後天性免疫不全症候群〔スタール(Stah
l)ら、Am.J.Med.,７３，１７１（１９８２）〕に伴われ
る。ウイルスがどこに収容されるか、ウイルスゲノムが
どのように発現されるか、及び免疫抑制がウイルスによ
り直接に又は他のメカニズムにより間接的に仲介される
のかどうかは重要であるが、しかしまだ解明されていな
い。
この研究においては、ＣＭＶが、Ｔ及びＢ細胞、天然の
キラー細胞及び単球を含むヒト末梢血液リンパ細胞（Ｐ
ＢＬ）を感染できることが示された。感染は、ＣＭＶ感
染患者から採られたウイルスの新しい（又は低パッセー
ジ）分離物により最も良く示される。
キラー細胞及び単球を含むヒト末梢血液リンパ細胞（Ｐ
ＢＬ）を感染できることが示された。感染は、ＣＭＶ感
染患者から採られたウイルスの新しい（又は低パッセー
ジ）分離物により最も良く示される。
更に、感染は、不稔性であり、これはＣＭＶゲノムの発
現が前初期ウイルスポリペプチド又はリガンドの合成に
限られ、後期ＣＭＶ遺伝子生成物の発現が証明されずま
た感染性ウイルスが作られないことを意味する。
現が前初期ウイルスポリペプチド又はリガンドの合成に
限られ、後期ＣＭＶ遺伝子生成物の発現が証明されずま
た感染性ウイルスが作られないことを意味する。
ＣＭＶにより不稔的に感染されたリンパ細胞は、フィト
ヘマグルチニン（ＰＨＡ）に反応しての増殖及び細胞毒
エフェクター細胞として働く能力を含むいくつかの機能
を失う。ＰＨＡは、有糸分裂刺激物質（分裂促進物質）
であり、これはリンパ細胞を含む培養基に加えられると
非分裂性リンパ細胞の成長、分化及び増殖を促進する。
ヘマグルチニン（ＰＨＡ）に反応しての増殖及び細胞毒
エフェクター細胞として働く能力を含むいくつかの機能
を失う。ＰＨＡは、有糸分裂刺激物質（分裂促進物質）
であり、これはリンパ細胞を含む培養基に加えられると
非分裂性リンパ細胞の成長、分化及び増殖を促進する。
マウスＣＭＶによる従来の研究は、ウイルスが潜伏状態
でマウスＢリンパ細胞のサブセット中に収容されること
を示唆した「オルディング(Olding)ら、J.Exp.Med.,１
４１，５６１（１９７５）〕。しかし今日まで、いくつ
かの研究所研究者は、ヒトＣＭＶによる同じタイプの感
染を示すことに失敗している。
でマウスＢリンパ細胞のサブセット中に収容されること
を示唆した「オルディング(Olding)ら、J.Exp.Med.,１
４１，５６１（１９７５）〕。しかし今日まで、いくつ
かの研究所研究者は、ヒトＣＭＶによる同じタイプの感
染を示すことに失敗している。
ここで用いる「潜伏状態」又は「潜伏感染」という言葉
は、ウイルスが慣用の細胞培養評価により組織又は分泌
物中に検出されえず、しかしにも拘らず非複製状態で、
又は検出できないたぶん間欠性のレベルの複製で存続す
ることを意味する。
は、ウイルスが慣用の細胞培養評価により組織又は分泌
物中に検出されえず、しかしにも拘らず非複製状態で、
又は検出できないたぶん間欠性のレベルの複製で存続す
ることを意味する。
感染性ＣＭＶはたまに、臨床ＣＭＶ感染を持つ患者から
得たバフィコート(buffy coat)調製物〔リナルド(Rinal
do)ら、J.Infect.Dis.,１３３，４２１（１９７５）及
びジョーダン(Jordan)、Reu.Infect.Dis.,５，２０５
（１９８３）〕中で見い出され、しかし関係する特定の
細胞は同定されなかった。加えて、ほとんどの研究者
は、健康な提供者から導かれた白血球培養物からＣＭＶ
を分離することに失敗し〔リナルド、出前、及びジョー
ダン、前出〕、そして今日までＰＢＬ中のＣＭＶの実験
室適応株の複製は確認できるように証明されていない
〔リナルドら、J.Immunol.,１２０，１３０（１９７
８）及びワーレンら、Scand.J.Immunol.,１３，５８１
（１９８１）〕。
得たバフィコート(buffy coat)調製物〔リナルド(Rinal
do)ら、J.Infect.Dis.,１３３，４２１（１９７５）及
びジョーダン(Jordan)、Reu.Infect.Dis.,５，２０５
（１９８３）〕中で見い出され、しかし関係する特定の
細胞は同定されなかった。加えて、ほとんどの研究者
は、健康な提供者から導かれた白血球培養物からＣＭＶ
を分離することに失敗し〔リナルド、出前、及びジョー
ダン、前出〕、そして今日までＰＢＬ中のＣＭＶの実験
室適応株の複製は確認できるように証明されていない
〔リナルドら、J.Immunol.,１２０，１３０（１９７
８）及びワーレンら、Scand.J.Immunol.,１３，５８１
（１９８１）〕。
もしリンパ細胞が不稔的に感染されたのなら、これが、
なぜそのような共培養評価及び後期ＣＭＶ遺伝子生成物
の検出の方法が陰性であったのかを説明する。この理由
から、ＰＢＬ中のＣＭＶ発現は、前初期ならびに後期Ｃ
ＭＶ遺伝子に関連するポリペプチドを検出するために特
異的に作られたモノクローナル抗体を用いてここで研究
された。〔ホネス(Honess)ら、J.Virol.,１９，２３１
（１９７４）〕。
なぜそのような共培養評価及び後期ＣＭＶ遺伝子生成物
の検出の方法が陰性であったのかを説明する。この理由
から、ＰＢＬ中のＣＭＶ発現は、前初期ならびに後期Ｃ
ＭＶ遺伝子に関連するポリペプチドを検出するために特
異的に作られたモノクローナル抗体を用いてここで研究
された。〔ホネス(Honess)ら、J.Virol.,１９，２３１
（１９７４）〕。
さらに、感染患者から最近導かれたウイルス株（ＣＭＶ
分離物）と、ウイルス繊維芽又は実験室適応株との間の
生物学的差違の観察を考えて〔総説のためにウェラー、
N.Engl.J.Med.,２８５，２０３１９７１）参照〕、両種
のウイルスが研究された。
分離物）と、ウイルス繊維芽又は実験室適応株との間の
生物学的差違の観察を考えて〔総説のためにウェラー、
N.Engl.J.Med.,２８５，２０３１９７１）参照〕、両種
のウイルスが研究された。
本発明のハイブリドーマを形成するために用いられるリ
ンパ細胞は、任意の哺乳動物、たとえば霊長類、げっ歯
類（たとえばマウス又はラット）、ラビット、モルモッ
ト、ウシ、イヌ、ヒツジ、ブタなどから導くことができ
る。適当なように宿主が、免疫原、この例ではＣＭＶ感
染細胞の注射により感作さく促進注射され、次にヒ臓を
分離される。
ンパ細胞は、任意の哺乳動物、たとえば霊長類、げっ歯
類（たとえばマウス又はラット）、ラビット、モルモッ
ト、ウシ、イヌ、ヒツジ、ブタなどから導くことができ
る。適当なように宿主が、免疫原、この例ではＣＭＶ感
染細胞の注射により感作さく促進注射され、次にヒ臓を
分離される。
ミエローマ細胞系統が、リンパ細胞と同じ種からのもの
であることが好ましい。従って、マウス−マウスハイブ
リッド〔シェルマン(Shulman)ら、ネイチア、２７６，
２６９（１９７８）〕又はラット−ラットハイブリッ
ド）〔ガルフレ(Galfre)ら、ネイチア、２７７，１３１
（１９７９）〕が典型的に用いられる。しかし、いくつ
かのラット−マウスハイブリッドもまた、ハイブリドー
マの形成に成功裡に用いられた〔ゴディング、「細胞融
合によるモノクローナル抗体の産生」、手段としての抗
体、マルカロニス(Marchalonis)ら編、ジョーン ウィ
リー アンド サンズ社、ｐ２７３（１９８２）〕。本
発明で用いられる適当なミエローマ系統としては、ＭＰ
Ｃ−１１（ＡＴＣＣ ＣＲＬ １６７），Ｐ３Ｘ６３−
Ａｇ８．６５３（ＡＴＣＣ ＣＲＬ １５８０），Ｓｐ
２／０−Ａｇ１４（ＡＴＣＣ ＣＲＬ １５８１），Ｐ
３Ｘ６３ Ａｇ８Ｕ．１（ＴＡＣＣ ＣＲＬ １５９
７），Ｙ３−Ａｇ１．２．３．（コレクチオン ナショ
ナーレ ド クルチュル ド ミクロオルカニズムス(C
ollection Nationale de Cultures de Microorganism
s)，パリ、フランスに寄託、No.Ｉ−０７８）及びＰ３
Ｘ６３ Ａｇ８（ＡＴＣＣ ＴＩＢ ９）が挙げられ
る。ミエローマ系統Ｐ３Ｘ６３−Ａｇ８．６５３が本発
明で用いるのに好ましい。
であることが好ましい。従って、マウス−マウスハイブ
リッド〔シェルマン(Shulman)ら、ネイチア、２７６，
２６９（１９７８）〕又はラット−ラットハイブリッ
ド）〔ガルフレ(Galfre)ら、ネイチア、２７７，１３１
（１９７９）〕が典型的に用いられる。しかし、いくつ
かのラット−マウスハイブリッドもまた、ハイブリドー
マの形成に成功裡に用いられた〔ゴディング、「細胞融
合によるモノクローナル抗体の産生」、手段としての抗
体、マルカロニス(Marchalonis)ら編、ジョーン ウィ
リー アンド サンズ社、ｐ２７３（１９８２）〕。本
発明で用いられる適当なミエローマ系統としては、ＭＰ
Ｃ−１１（ＡＴＣＣ ＣＲＬ １６７），Ｐ３Ｘ６３−
Ａｇ８．６５３（ＡＴＣＣ ＣＲＬ １５８０），Ｓｐ
２／０−Ａｇ１４（ＡＴＣＣ ＣＲＬ １５８１），Ｐ
３Ｘ６３ Ａｇ８Ｕ．１（ＴＡＣＣ ＣＲＬ １５９
７），Ｙ３−Ａｇ１．２．３．（コレクチオン ナショ
ナーレ ド クルチュル ド ミクロオルカニズムス(C
ollection Nationale de Cultures de Microorganism
s)，パリ、フランスに寄託、No.Ｉ−０７８）及びＰ３
Ｘ６３ Ａｇ８（ＡＴＣＣ ＴＩＢ ９）が挙げられ
る。ミエローマ系統Ｐ３Ｘ６３−Ａｇ８．６５３が本発
明で用いるのに好ましい。
最終的に作られるハイブリドーマ細胞は、そのような細
胞のために周知の通常のインビトロ組織培養法により培
養されることができる。より好ましくは、ハイブリドー
マ細胞は、同様に周知の方法を用いて動物において培養
され、モノクローナル受容体はそのように発生された腹
水から得られる。腹水発生のために用いられる動物は典
型的には、スクリプス クリニック アンド リサーチ
ファンデーション(Scripps Clinic and Research Fou
ndation)、ラ ジョラ、カリフォールニアのマウス舎で
飼育されたＢＡＬＢ／Ｃマウスであるが、しかしマウス
以外の動物がハイブリドーマの調製のために用いられる
場合にはマウス又はこの動物タイプを腹水の製造のため
に用いることができる。
胞のために周知の通常のインビトロ組織培養法により培
養されることができる。より好ましくは、ハイブリドー
マ細胞は、同様に周知の方法を用いて動物において培養
され、モノクローナル受容体はそのように発生された腹
水から得られる。腹水発生のために用いられる動物は典
型的には、スクリプス クリニック アンド リサーチ
ファンデーション(Scripps Clinic and Research Fou
ndation)、ラ ジョラ、カリフォールニアのマウス舎で
飼育されたＢＡＬＢ／Ｃマウスであるが、しかしマウス
以外の動物がハイブリドーマの調製のために用いられる
場合にはマウス又はこの動物タイプを腹水の製造のため
に用いることができる。
III．結果 Ficoll-Pague（商標、シグマ ケミカル（Sigma Chemic
al）社、セントルイス、ミズリー）での密度勾配遠心分
離により健常ヒト提供者の血から取った末梢血リンパ細
胞（ＰＢＬ）が、種々のＣＭＶ症候群を持つ患者から最
近分離されたＣＭＶ（表１）、又はプラーク精製された
実験室株ＡＤ−１６９を用いて、0.01〜1.0の多重度で
感染された。最近の分離物は、ＲＰＭＩ−1640培地＋５
％胎児ウシ血清中で１２パッセージ末梢の間、ヒト包皮
繊維芽中で繁殖された。患者分離物からのウイルスは細
胞マトリックスを著しく伴うので（ウェラー、前出）、
感染した又は擬感染した繊維芽は音波処理され、この物
質は４日間までＰＢＬにより培養された。
al）社、セントルイス、ミズリー）での密度勾配遠心分
離により健常ヒト提供者の血から取った末梢血リンパ細
胞（ＰＢＬ）が、種々のＣＭＶ症候群を持つ患者から最
近分離されたＣＭＶ（表１）、又はプラーク精製された
実験室株ＡＤ−１６９を用いて、0.01〜1.0の多重度で
感染された。最近の分離物は、ＲＰＭＩ−1640培地＋５
％胎児ウシ血清中で１２パッセージ末梢の間、ヒト包皮
繊維芽中で繁殖された。患者分離物からのウイルスは細
胞マトリックスを著しく伴うので（ウェラー、前出）、
感染した又は擬感染した繊維芽は音波処理され、この物
質は４日間までＰＢＬにより培養された。
その後、ＰＢＬは３度洗われ、空気乾燥及びガラス ス
ライドへの細胞のアセトン固定により免疫螢光研究のた
めに準備された。スライドを水で洗った後に、各スライ
ドを、ペプシン消化しアフィニティ精製したフルオレセ
インラベルしたヤギ抗マウス免疫グロブリン（リットン
−バイオネテックス）の１：５０希釈により４℃で３０
分間処理し、水で洗い、そして位相及び螢光顕微鏡法に
よりツアイス(Zoiss)顕微鏡を用いて観察した。これら
の研究は、ＰＢＬ中の前初期（後期でなく）ＣＭＶウイ
ルス抗原を明らかにした（表１）。
ライドへの細胞のアセトン固定により免疫螢光研究のた
めに準備された。スライドを水で洗った後に、各スライ
ドを、ペプシン消化しアフィニティ精製したフルオレセ
インラベルしたヤギ抗マウス免疫グロブリン（リットン
−バイオネテックス）の１：５０希釈により４℃で３０
分間処理し、水で洗い、そして位相及び螢光顕微鏡法に
よりツアイス(Zoiss)顕微鏡を用いて観察した。これら
の研究は、ＰＢＬ中の前初期（後期でなく）ＣＭＶウイ
ルス抗原を明らかにした（表１）。
前初期ポリペプチド（ウイルス抗原）は、大きな７２ダ
ルトンの前初期蛋白質に結合するＥ−３と呼ばれるモノ
クローナル抗体により検出された〔ゴールドステイン
ら、インフェクション アンド イミュニテイ(Infecti
on and Immunity)、３８，２７３（１９８２）〕。類似
の着色が、ウイルスに誘発された細胞変性効果のはるか
前である感染後３時間以内に合成された核抗原に対し、
感染された繊維芽中で結合するＬ−１４と呼ばれる別の
モノクローナル抗体により得られた。
ルトンの前初期蛋白質に結合するＥ−３と呼ばれるモノ
クローナル抗体により検出された〔ゴールドステイン
ら、インフェクション アンド イミュニテイ(Infecti
on and Immunity)、３８，２７３（１９８２）〕。類似
の着色が、ウイルスに誘発された細胞変性効果のはるか
前である感染後３時間以内に合成された核抗原に対し、
感染された繊維芽中で結合するＬ−１４と呼ばれる別の
モノクローナル抗体により得られた。
感染の初期に存在するＣＭＶ誘発繊維芽抗原に対しやは
り特異的なＧ−１０と呼ばれるモノクローナル抗体は、
同じ調製において感染ＰＢＬに結合しなかった。Ｇ−１
０は、ウイルス細胞変性効果進展の前に感染繊維芽にお
いて合成される６０ダルトン蛋白質と反応する。この抗
体のすばらしい特異性は、ウイルスゲノムの発現におけ
るブロッキングの測定を可能にするであろう。
り特異的なＧ−１０と呼ばれるモノクローナル抗体は、
同じ調製において感染ＰＢＬに結合しなかった。Ｇ−１
０は、ウイルス細胞変性効果進展の前に感染繊維芽にお
いて合成される６０ダルトン蛋白質と反応する。この抗
体のすばらしい特異性は、ウイルスゲノムの発現におけ
るブロッキングの測定を可能にするであろう。
許容できない感染の典型として、上記細胞は後期のＣＭ
Ｖポリペプチドに対し特異的なＣ−５と呼ばれるモノク
ローナル抗体〔ゴールドステインら、前出〕に対する抗
原を発見せず、成熟したビリオンが電子顕微鏡により見
えず、共培養評価において感染性ウイルスの証拠はなか
った。すなわち、ＰＢＬは、ＣＭＶにより感染されう
る；感染は不稔的である。またＣＭＶ遺伝子発現は制限
されている。
Ｖポリペプチドに対し特異的なＣ−５と呼ばれるモノク
ローナル抗体〔ゴールドステインら、前出〕に対する抗
原を発見せず、成熟したビリオンが電子顕微鏡により見
えず、共培養評価において感染性ウイルスの証拠はなか
った。すなわち、ＰＢＬは、ＣＭＶにより感染されう
る；感染は不稔的である。またＣＭＶ遺伝子発現は制限
されている。
本明細書で示すように、７つの低バッセージのヒト分離
物の６つにより感染されたＰＢＬにおける前初期遺伝子
発現（表１）。繊維芽適応実験室株ＡＤ１６９による８
つの試みの僅か１つにおいて、前初期ポリペプチドの弱
い発現が示され、これはＰＢＬの１％未満で起こった。
このことが個々のＣＭＶ株の間の異なる細胞親和性を示
すのか、又は繊維芽中での増殖に対するウイルス実験室
株の適応を示すのか、又はこれら因子の両者であるのか
は今のところ不明である。
物の６つにより感染されたＰＢＬにおける前初期遺伝子
発現（表１）。繊維芽適応実験室株ＡＤ１６９による８
つの試みの僅か１つにおいて、前初期ポリペプチドの弱
い発現が示され、これはＰＢＬの１％未満で起こった。
このことが個々のＣＭＶ株の間の異なる細胞親和性を示
すのか、又は繊維芽中での増殖に対するウイルス実験室
株の適応を示すのか、又はこれら因子の両者であるのか
は今のところ不明である。
分離したすぐのかつ実験室適応した株の間の同様の分枝
が、別のヘルペスイウルス、エプステイン−バール（Ep
stein-Barr）ウイルス（ＥＢＶ）について最近示されて
いる。シックスベイ（Sixbey）ら、ネイチア（ロンド
ン）、３０６，４８０（1980）は、ＥＢＶの最近分離さ
れた、しかし実験室適応していない株がヒト上皮細胞を
感染できたこと及び同様にウイルスゲノム発現は感染細
胞において不完全であったことを示した。
が、別のヘルペスイウルス、エプステイン−バール（Ep
stein-Barr）ウイルス（ＥＢＶ）について最近示されて
いる。シックスベイ（Sixbey）ら、ネイチア（ロンド
ン）、３０６，４８０（1980）は、ＥＢＶの最近分離さ
れた、しかし実験室適応していない株がヒト上皮細胞を
感染できたこと及び同様にウイルスゲノム発現は感染細
胞において不完全であったことを示した。
ＣＭＶが感染するＰＢＬのサブセットを確かめるため
に、ウイルスを予めインキュベートしたＰＢＬが、赤血
球ロゼッティング〔モレタ（Moretta）ら、J.Immunol.,
１２２，９８４（1979）〕により又はモノクローナル抗
体と螢光活性化細胞ソーター〔オルドストン（Oldston
e）ら、バイロロジー(Viralogy)、１２７，４２６（198
3）〕により分離された。二色免疫螢光法〔デュトコ(Du
tko)ら、J.Exp.Med.,１５４，１６３６（１９８１）及
びデュトコら、J.Cell.Biochem.,Supp.８Ｂ（１９８
４）〕は、(a)モノクローナル抗体マーカーＯＫＴ３
（パンＴ）〔ＡＴＣＣ ＣＲＬ ８００１〕，ＯＫＴ４
（ヘルパー）〔ＡＴＣＣ ＣＲＬ ８００２〕，ＯＫＴ
８（サプレッサー−細胞毒性）〔ＡＴＣＣ ＣＲＬ ８
０１４〕により定義されるＴリンパ細胞の１〜１５％；
(b)Ｍｏ２によりマークされた単球、(c)Leu-７でラベル
された天然のキラー細胞及び(d)表面免疫グロブリンに
対する抗体により同定されるＢリンパ細胞において前初
期蛋白質合成を明らかにした。前初期抗原を発現する細
胞数は、感染のために用いた臨床分離物によって変わ
る。
に、ウイルスを予めインキュベートしたＰＢＬが、赤血
球ロゼッティング〔モレタ（Moretta）ら、J.Immunol.,
１２２，９８４（1979）〕により又はモノクローナル抗
体と螢光活性化細胞ソーター〔オルドストン（Oldston
e）ら、バイロロジー(Viralogy)、１２７，４２６（198
3）〕により分離された。二色免疫螢光法〔デュトコ(Du
tko)ら、J.Exp.Med.,１５４，１６３６（１９８１）及
びデュトコら、J.Cell.Biochem.,Supp.８Ｂ（１９８
４）〕は、(a)モノクローナル抗体マーカーＯＫＴ３
（パンＴ）〔ＡＴＣＣ ＣＲＬ ８００１〕，ＯＫＴ４
（ヘルパー）〔ＡＴＣＣ ＣＲＬ ８００２〕，ＯＫＴ
８（サプレッサー−細胞毒性）〔ＡＴＣＣ ＣＲＬ ８
０１４〕により定義されるＴリンパ細胞の１〜１５％；
(b)Ｍｏ２によりマークされた単球、(c)Leu-７でラベル
された天然のキラー細胞及び(d)表面免疫グロブリンに
対する抗体により同定されるＢリンパ細胞において前初
期蛋白質合成を明らかにした。前初期抗原を発現する細
胞数は、感染のために用いた臨床分離物によって変わ
る。
第１図は、ロゼッティング法により陽性に選択され、次
に前初期抗原特異的モノクローナル抗体Ｌ−１４により
調べられたＣＭＶ感染Ｔリンパ球を示す。同様の結果
が、前初期抗原特異的プローブＥ−３を用いて（後期Ｃ
ＭＶ遺伝子生成物を検出するモノクローナル抗体である
Ｃ−５を用いるのでなく）得られた。
に前初期抗原特異的モノクローナル抗体Ｌ−１４により
調べられたＣＭＶ感染Ｔリンパ球を示す。同様の結果
が、前初期抗原特異的プローブＥ−３を用いて（後期Ｃ
ＭＶ遺伝子生成物を検出するモノクローナル抗体である
Ｃ−５を用いるのでなく）得られた。
初期ウイルス遺伝子の制限された発現を伴うＣＭＶの限
定された複製は、ヒトＣＭＶ感染マウス〔ラ フェミナ
(La Femina)ら、J.Gan.Virol.,６４，３７３（１９８
３）〕及びラビット細胞〔デマルチ(De Marchi)、バイ
ロロジー、１２９，２７４(1983)〕について最近記載さ
れている。初期ＲＮＡ翻訳に限定されたマウスＣＭＶの
複製は、非分化マウス奇形癌腫細胞において起こる〔デ
ュトコら、J.Exp.Med.,前出〕。これら種々のモデルに
おけるウイルス翻訳は共通のメカニズムでブロックされ
るのかも知れず、デマルチは、生産的感染と非生産的感
染がこれら初期翻訳のいくつかがポリソームを伴うレベ
ルにおいて異なるかも知れないことを示唆する証拠を示
した〔バイロロジー、１２９，２８７（１９８３）〕。
定された複製は、ヒトＣＭＶ感染マウス〔ラ フェミナ
(La Femina)ら、J.Gan.Virol.,６４，３７３（１９８
３）〕及びラビット細胞〔デマルチ(De Marchi)、バイ
ロロジー、１２９，２７４(1983)〕について最近記載さ
れている。初期ＲＮＡ翻訳に限定されたマウスＣＭＶの
複製は、非分化マウス奇形癌腫細胞において起こる〔デ
ュトコら、J.Exp.Med.,前出〕。これら種々のモデルに
おけるウイルス翻訳は共通のメカニズムでブロックされ
るのかも知れず、デマルチは、生産的感染と非生産的感
染がこれら初期翻訳のいくつかがポリソームを伴うレベ
ルにおいて異なるかも知れないことを示唆する証拠を示
した〔バイロロジー、１２９，２８７（１９８３）〕。
何らかの関連する機能的欠陥がＣＭＶで不稔的に感染さ
れたＰＢＬ中に存在するかどうかが次に調べられた。そ
のような欠陥は、インビトロで起こるリンパ球機能にお
ける機能的異常と同様であろう〔グレン(Glenn)、前
出、スタール、前出、及びキナン(Quinnan)ら、Ｎ．Eng
l.Med.,３０７，６１３（1983）〕。ＰＢＬを感染した
最近のＣＭＶ臨床分離物の総て（表１）が、繰り返し実
験においてＰＢＬの予期されたＰＨＡ増殖応答を抑制し
た（８１％）。代表的研究のデータを表２に示す。
れたＰＢＬ中に存在するかどうかが次に調べられた。そ
のような欠陥は、インビトロで起こるリンパ球機能にお
ける機能的異常と同様であろう〔グレン(Glenn)、前
出、スタール、前出、及びキナン(Quinnan)ら、Ｎ．Eng
l.Med.,３０７，６１３（1983）〕。ＰＢＬを感染した
最近のＣＭＶ臨床分離物の総て（表１）が、繰り返し実
験においてＰＢＬの予期されたＰＨＡ増殖応答を抑制し
た（８１％）。代表的研究のデータを表２に示す。
対称的に、実験室適応株ＡＤ１６９、及びＰＢＬを感染
するのに失敗した臨床分離物Ｉ−Ｐは、ＰＨＡ評価にお
いて最小に抑制的であった（３％、表２）。リンパ球生
育性は、トリパンブルーの除去により測定して、擬感染
及びウイルス感染ＰＢＬにおいて異ならなかった。
するのに失敗した臨床分離物Ｉ−Ｐは、ＰＨＡ評価にお
いて最小に抑制的であった（３％、表２）。リンパ球生
育性は、トリパンブルーの除去により測定して、擬感染
及びウイルス感染ＰＢＬにおいて異ならなかった。
他の研究において、最近のＣＭＶ分離物（しかしＡＤ１
６９ではなく）は、天然キラー細胞〔シュリエル(Shrie
r)ら、J.Cell.Biochem.,Supp８Ｂ（１９８４）〕及びウ
イルス特異性のＨＬＡ制限された細胞毒性Ｔリンパ細胞
がその適当なターゲットを分解する能力を抑制した。す
なわち、低パッセージＣＭＶ分離物は、リンパ細胞を感
染でき、プロセスにおいて、その専門化された機能を変
える。この観察は、天然キラー細胞活動及び細胞毒的Ｔ
リンパ細胞応答における欠陥が深大な予後と相関する〕
キナンら、前出〕ことを考えると、移植患者におけるＣ
ＭＶ感染に比べ重要である。
６９ではなく）は、天然キラー細胞〔シュリエル(Shrie
r)ら、J.Cell.Biochem.,Supp８Ｂ（１９８４）〕及びウ
イルス特異性のＨＬＡ制限された細胞毒性Ｔリンパ細胞
がその適当なターゲットを分解する能力を抑制した。す
なわち、低パッセージＣＭＶ分離物は、リンパ細胞を感
染でき、プロセスにおいて、その専門化された機能を変
える。この観察は、天然キラー細胞活動及び細胞毒的Ｔ
リンパ細胞応答における欠陥が深大な予後と相関する〕
キナンら、前出〕ことを考えると、移植患者におけるＣ
ＭＶ感染に比べ重要である。
結論として、ＣＭＶはリンパ細胞を不稔的に感染でき、
その機能のいくつかを変えることが示された。すなわ
ち、不稔的に感染された融合ＰＢＬがある患者における
ウイルスのソースであるという可能性が、まだ完全に理
解されていないメカニズムにより不稔から完全複製への
進化後に存在する。
その機能のいくつかを変えることが示された。すなわ
ち、不稔的に感染された融合ＰＢＬがある患者における
ウイルスのソースであるという可能性が、まだ完全に理
解されていないメカニズムにより不稔から完全複製への
進化後に存在する。
IV．モノクローナル受容体の製造 たとえばモノクローナル受容体Ｌ−１４は、コーラー(K
ohler)ら、ネイチア、２５６，４９５（１９７５）の標
準ハイブリドーマ法を用いてＣＭＶ分離物による免疫化
によって作られた。詳しくは、ＢＡＬＢ／Ｃマウスが、
完全なフロイントのアジュバント中の約５×１０６のＨ
ＣＭＶ（ヒトサイトメガロウイルス）ＡＤ１６９感染ヒ
ト繊維芽細胞により腹膜内注射により免疫化された。３
週間後に、マウスは再び同様に注射された。更に３週間
後に、マウスを３日連続でリン酸塩緩衝した食塩水（Ｐ
ＢＳ）中のＡＤ１６９感染細胞により静脈内的に免疫化
された。次にマウスを殺した。
ohler)ら、ネイチア、２５６，４９５（１９７５）の標
準ハイブリドーマ法を用いてＣＭＶ分離物による免疫化
によって作られた。詳しくは、ＢＡＬＢ／Ｃマウスが、
完全なフロイントのアジュバント中の約５×１０６のＨ
ＣＭＶ（ヒトサイトメガロウイルス）ＡＤ１６９感染ヒ
ト繊維芽細胞により腹膜内注射により免疫化された。３
週間後に、マウスは再び同様に注射された。更に３週間
後に、マウスを３日連続でリン酸塩緩衝した食塩水（Ｐ
ＢＳ）中のＡＤ１６９感染細胞により静脈内的に免疫化
された。次にマウスを殺した。
ヒ臓をマウスから取出し、プールし、そして単一の細胞
懸濁物を作った。次にヒ臓細胞を、細胞融合プロモータ
ー（ポリエチレングリコール２０００）の存在下で等数
のＰ３Ｘ６３−Ａｇ８．６５３ミエローマ細胞と融合い
た。MabＬ−１４を産生するハイブリドーマが、ヒ臓細
胞を９６のくぼみのプレートに植え、そして非融合ミエ
ローマ細胞の増殖を支持しない、１０％胎児ウシ血清
（ＦＣＳ）、ヒポキサンチン、アミノプテリン及びチミ
ジン（すなわちＨＡＴ培養基）を含むデュルベッコ（Du
lbecco）の変性イーグル培地（ＤＭＥＭ）中で増殖させ
ることにより選択された。
懸濁物を作った。次にヒ臓細胞を、細胞融合プロモータ
ー（ポリエチレングリコール２０００）の存在下で等数
のＰ３Ｘ６３−Ａｇ８．６５３ミエローマ細胞と融合い
た。MabＬ−１４を産生するハイブリドーマが、ヒ臓細
胞を９６のくぼみのプレートに植え、そして非融合ミエ
ローマ細胞の増殖を支持しない、１０％胎児ウシ血清
（ＦＣＳ）、ヒポキサンチン、アミノプテリン及びチミ
ジン（すなわちＨＡＴ培養基）を含むデュルベッコ（Du
lbecco）の変性イーグル培地（ＤＭＥＭ）中で増殖させ
ることにより選択された。
２〜３週後に、各くぼみ中の細胞クローン上の上澄みを
採取し、ＨＣＭＶに対する抗体の存在についてＥＬＩＳ
Ａ評価（後述するような酵素結合免疫吸着体評価）によ
りテストした。陽性のくぼみを、限界希釈により二度ク
ローンした。二回のクローニングの後にＨＣＭＶ特異的
抗体を作り続けるこれらクローンを、多量の上澄み液を
作るために膨張させた。
採取し、ＨＣＭＶに対する抗体の存在についてＥＬＩＳ
Ａ評価（後述するような酵素結合免疫吸着体評価）によ
りテストした。陽性のくぼみを、限界希釈により二度ク
ローンした。二回のクローニングの後にＨＣＭＶ特異的
抗体を作り続けるこれらクローンを、多量の上澄み液を
作るために膨張させた。
モノクローナル受容体Ｋ−２５、Ｅ−２８及びＡ−３３
が、モノクローナル受容体Ｌ−１４について上述したの
と同様にして作られた。
が、モノクローナル受容体Ｌ−１４について上述したの
と同様にして作られた。
あるいは、本発明のモノクローナル受容体は、特定のハ
イブリドーマをマウスのような動物の腹腔中にたとえば
注射により導入することにより作ることができる。好ま
しくは同種の（Syngenic）又は半同種の哺乳動物が用い
られ、これは米国特許4,361,549号明細書に記載されて
おり、これを引用することによりここに含める。ハイブ
リドーマの導入は、適当な増殖期間たとえば１〜２週間
後に抗体産生ハイブリドーマの形成をひき起こし、高濃
度の受容体の産生を結果し、これは宿主マウスの血流及
び腹腔滲出物（腹水）から回収できる。宿主マウスはそ
の血液及び腹水中に通常の受容体をも持つけれど、通常
の受容体の濃度はモノクローナル受容体濃度の僅か約５
％である。
イブリドーマをマウスのような動物の腹腔中にたとえば
注射により導入することにより作ることができる。好ま
しくは同種の（Syngenic）又は半同種の哺乳動物が用い
られ、これは米国特許4,361,549号明細書に記載されて
おり、これを引用することによりここに含める。ハイブ
リドーマの導入は、適当な増殖期間たとえば１〜２週間
後に抗体産生ハイブリドーマの形成をひき起こし、高濃
度の受容体の産生を結果し、これは宿主マウスの血流及
び腹腔滲出物（腹水）から回収できる。宿主マウスはそ
の血液及び腹水中に通常の受容体をも持つけれど、通常
の受容体の濃度はモノクローナル受容体濃度の僅か約５
％である。
ハイブリドーマ上澄み中に存在する特定のモノクローナ
ル受容体は、精製なしで用いることができ、又は受容体
はSepharose６Ｂ又は４Ｂ（商標、ファーマシア ファ
インケミカルズ (Pharmacia Fine Chemicals)、ピスカ
タウエイ、ニュージャージィ）のような免疫吸着体に結
合されたＡＤ１６９感染細胞を用いるアフィニティクロ
マトグラフィ及び続いての約2.5のpH値でのグリシン塩
酸塩のような酸性緩衝液を用いる免疫吸着体からの溶出
のような標準的方法を用いて、マウスの腹水又は血清か
ら回収できる。
ル受容体は、精製なしで用いることができ、又は受容体
はSepharose６Ｂ又は４Ｂ（商標、ファーマシア ファ
インケミカルズ (Pharmacia Fine Chemicals)、ピスカ
タウエイ、ニュージャージィ）のような免疫吸着体に結
合されたＡＤ１６９感染細胞を用いるアフィニティクロ
マトグラフィ及び続いての約2.5のpH値でのグリシン塩
酸塩のような酸性緩衝液を用いる免疫吸着体からの溶出
のような標準的方法を用いて、マウスの腹水又は血清か
ら回収できる。
Ｖ．診断系及び方法 前述したように、特定の抗原が補助体(aid)として生物
学的サンプル中に存在するかどうかを決定することが、
たとえば特定の病気の診断においてしばしば望ましい。
学的サンプル中に存在するかどうかを決定することが、
たとえば特定の病気の診断においてしばしば望ましい。
診断剤系の例として、酵素結合免疫吸着体評価（ＥＬＩ
ＳＡ）が挙げられ、そこでは指示基は抗体に結合された
ホースラディッテュペルオキシダーゼのような酵素であ
る。あるいは、指示基が抗体中に存在する 125Ｉのよう
な放射性元素であるラジオイムノアッセイが挙げられ
る。
ＳＡ）が挙げられ、そこでは指示基は抗体に結合された
ホースラディッテュペルオキシダーゼのような酵素であ
る。あるいは、指示基が抗体中に存在する 125Ｉのよう
な放射性元素であるラジオイムノアッセイが挙げられ
る。
本発明に従い、サイトメガロウイルスに関連するウイル
ス抗体の存在を評価するための診断系は、評価されるべ
き混合されたサンプルと免疫反応して免疫反応物を形成
し、この反応物の存在が指示手段によりシグナルされる
ものであるところのモノクローナル抗体を含む。
ス抗体の存在を評価するための診断系は、評価されるべ
き混合されたサンプルと免疫反応して免疫反応物を形成
し、この反応物の存在が指示手段によりシグナルされる
ものであるところのモノクローナル抗体を含む。
指示手段は、最初に述べた抗体と同じクラスの抗体に対
して同じ種の動物から生じられたところの、酵素を結合
した第二の抗体を含むことができる。この指示手段は、
免疫反応物中に存在する最初に述べた抗体に結合するこ
とにより免疫反応をシグナルする。この系において、シ
グナルは、結合された酵素と加えられた基質の反応によ
り示される。指示手段はまた、抗体に結合された放射性
元素を含むことができる。
して同じ種の動物から生じられたところの、酵素を結合
した第二の抗体を含むことができる。この指示手段は、
免疫反応物中に存在する最初に述べた抗体に結合するこ
とにより免疫反応をシグナルする。この系において、シ
グナルは、結合された酵素と加えられた基質の反応によ
り示される。指示手段はまた、抗体に結合された放射性
元素を含むことができる。
第一及び第二の抗体は、評価されるべき体成分又は培養
上澄みの所定量の存在下で所定量で混合されると、指示
手段によりシグナルされる免疫反応の量を提供する。免
疫反応の量は、サイトメガロウイルス感染細胞が体成分
中に存在しない場合、既知免疫反応量と異なる。
上澄みの所定量の存在下で所定量で混合されると、指示
手段によりシグナルされる免疫反応の量を提供する。免
疫反応の量は、サイトメガロウイルス感染細胞が体成分
中に存在しない場合、既知免疫反応量と異なる。
ＣＭＶ感染を検出するために用いるのに適する他の免疫
学的評価法としては、少なくとも下記の三つの形の酵素
イムノアッセイ（ＥＩＡ）が挙げられる：イムノエンザ
イモメトリックテスト、抗原又は抗体のためのサンドイ
ッチ法、及びホモジニアスＥＩＡ。
学的評価法としては、少なくとも下記の三つの形の酵素
イムノアッセイ（ＥＩＡ）が挙げられる：イムノエンザ
イモメトリックテスト、抗原又は抗体のためのサンドイ
ッチ法、及びホモジニアスＥＩＡ。
ＥＬＩＳＡテストは、最初に開発されたものであり、標
準的競争ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）手順にちなん
でパターン化される。前述したように、ラベルした抗原
及びラベルしていない抗原が、限られた量の固相抗体へ
の付着を競争する。置き換えられた酵素ラベルが定量さ
れ、続く計算はＲＩＡ法とほぼ同じである。
準的競争ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）手順にちなん
でパターン化される。前述したように、ラベルした抗原
及びラベルしていない抗原が、限られた量の固相抗体へ
の付着を競争する。置き換えられた酵素ラベルが定量さ
れ、続く計算はＲＩＡ法とほぼ同じである。
イムノエンザイモメトリック法においては、未知量の抗
原が過剰の酵素ラベルされた抗体と反応させられ、次
に、ラベルされた抗体のための固相抗原が加えられる。
固相抗原と反応した過剰のラベルされた抗体分子を遠心
分離により除き、酵素活性が可溶相中に残る。可溶相に
伴う酵素活性をその後測定し、それにより未知サンプル
中の抗原濃度の尺度が得られる。
原が過剰の酵素ラベルされた抗体と反応させられ、次
に、ラベルされた抗体のための固相抗原が加えられる。
固相抗原と反応した過剰のラベルされた抗体分子を遠心
分離により除き、酵素活性が可溶相中に残る。可溶相に
伴う酵素活性をその後測定し、それにより未知サンプル
中の抗原濃度の尺度が得られる。
サンドイッチ法は、抗原の多価性、及び二つの異なる抗
体分子に同時に結合するその能力に依存する。第一抗体
分子は通常、固相反応体である。それは、未知サンプル
中の総ての抗原分子の結合（複合体化）を保証すべく過
剰に用いられる。評価されるべきサンプルの混合及び抗
原−抗体複合体形成反応の完了後に、過剰の酵素ラベル
された抗体を加え、第一の混合物から得られた複合体と
インキュベートした。すると、ラベルした抗体が、抗原
上の利用しうる決定基と結合する。結合されなかったラ
ベルした抗体は、洗って除かれ、結合したラベルの酵素
活性が測定される。先のように、複合体に結合された酵
素の量は、被評価サンプル中の抗原量の間接的尺度であ
る。
体分子に同時に結合するその能力に依存する。第一抗体
分子は通常、固相反応体である。それは、未知サンプル
中の総ての抗原分子の結合（複合体化）を保証すべく過
剰に用いられる。評価されるべきサンプルの混合及び抗
原−抗体複合体形成反応の完了後に、過剰の酵素ラベル
された抗体を加え、第一の混合物から得られた複合体と
インキュベートした。すると、ラベルした抗体が、抗原
上の利用しうる決定基と結合する。結合されなかったラ
ベルした抗体は、洗って除かれ、結合したラベルの酵素
活性が測定される。先のように、複合体に結合された酵
素の量は、被評価サンプル中の抗原量の間接的尺度であ
る。
主な指示基又はラベルがホースラディッシュペルオキシ
ダーゼ（ＨＲＰ）又はグルコースオキシダーゼのような
酵素である場合、免疫反応が起こり抗体−抗原複合体が
形成されたことを可視化するために、追加的な剤が必要
である。ＨＲＰのためのそのような追加的剤としては、
過酸化水素及び酸化染料前駆体たとえばジアミノベンジ
ジンが挙げられる。グルコースオキシダーゼと共に用い
られる追加的剤は、２，２′−アジノ−ジ−（３−エチ
ル−ベンズチアゾリン−６−スルホン酸）（ＡＢＴＳ）
である。
ダーゼ（ＨＲＰ）又はグルコースオキシダーゼのような
酵素である場合、免疫反応が起こり抗体−抗原複合体が
形成されたことを可視化するために、追加的な剤が必要
である。ＨＲＰのためのそのような追加的剤としては、
過酸化水素及び酸化染料前駆体たとえばジアミノベンジ
ジンが挙げられる。グルコースオキシダーゼと共に用い
られる追加的剤は、２，２′−アジノ−ジ−（３−エチ
ル−ベンズチアゾリン−６−スルホン酸）（ＡＢＴＳ）
である。
「指示基」又は「ラベル」という言葉は、受容体に結合
された又は別々に用いられる単一原子又は分子を包含す
るものとしてここで用いられ、これら原子または分子が
単独で用いられる又は追加的剤と組合わせて用いられる
かに拘らない。そのような指示基又はラベルは自体、免
疫化学において周知である。
された又は別々に用いられる単一原子又は分子を包含す
るものとしてここで用いられ、これら原子または分子が
単独で用いられる又は追加的剤と組合わせて用いられる
かに拘らない。そのような指示基又はラベルは自体、免
疫化学において周知である。
指示基又はラベルは、好ましくは受容体と共に供給さ
れ、それと一緒に又は別々の包装されることができる。
過酸化水素及びジアミノベンジジンのような追加的剤も
また、ＨＲＰのような指示基が用いられるとき系に含め
られることができる。そのような物質は、多くの指示基
と同様に容易に市販入手でき、診断系と一緒に供給され
る必要はない。また、過酸化水素のようないくつかの剤
は貯蔵中に分解し、あるいはいくつかの放射性元素のよ
うに短寿命であり、最終ユーザーにより入手されるのが
より良い。
れ、それと一緒に又は別々の包装されることができる。
過酸化水素及びジアミノベンジジンのような追加的剤も
また、ＨＲＰのような指示基が用いられるとき系に含め
られることができる。そのような物質は、多くの指示基
と同様に容易に市販入手でき、診断系と一緒に供給され
る必要はない。また、過酸化水素のようないくつかの剤
は貯蔵中に分解し、あるいはいくつかの放射性元素のよ
うに短寿命であり、最終ユーザーにより入手されるのが
より良い。
ＣＭＶウイルス抗原の存在を決定するために、更に別の
診断評価法を用いることができる。たとえば、ＣＭＶ感
染細胞は、固定した組織切片の細胞質染色により、又は
螢光活性化細胞ソーター（フローサイトフルオロメトリ
ー）の使用により検出できる。
診断評価法を用いることができる。たとえば、ＣＭＶ感
染細胞は、固定した組織切片の細胞質染色により、又は
螢光活性化細胞ソーター（フローサイトフルオロメトリ
ー）の使用により検出できる。
螢光活性化細胞ソーター（ＦＡＣＳ）を用いるフローサ
イトフルオロメトリーは、Ｔリンパ細胞とＢリンパ細胞
を分離する一つの方法である。ＦＡＣＳにおいて、螢光
ラベルたとえばＦＩＴＣ（フルオレセイン イソチオシ
アネート）、ＴＲＩＴＣ（テトラメチル ローダミン
イソチオシアネート）でタグされた細胞の一つを各小滴
が含むように、小さなノズル中で超音波振動により小滴
が発生される。小滴だ一つずつレーザービームを通過す
るとき、各細胞は、その螢光の強度、色及び偏光に関し
て分析される。細胞が或る予め選定した基準を満たすか
どうか決定するために、個々の細胞からの特徴的シグナ
ルを分析する。もし満たすなら、その細胞を含む小滴を
荷電し、それが電場を通るときに偏向して主流から分け
る。Ｔ又はＢ細胞に適当な螢光抗体を付着することによ
って、細胞懸濁物から一方又は他方の細胞群を分離でき
る。
イトフルオロメトリーは、Ｔリンパ細胞とＢリンパ細胞
を分離する一つの方法である。ＦＡＣＳにおいて、螢光
ラベルたとえばＦＩＴＣ（フルオレセイン イソチオシ
アネート）、ＴＲＩＴＣ（テトラメチル ローダミン
イソチオシアネート）でタグされた細胞の一つを各小滴
が含むように、小さなノズル中で超音波振動により小滴
が発生される。小滴だ一つずつレーザービームを通過す
るとき、各細胞は、その螢光の強度、色及び偏光に関し
て分析される。細胞が或る予め選定した基準を満たすか
どうか決定するために、個々の細胞からの特徴的シグナ
ルを分析する。もし満たすなら、その細胞を含む小滴を
荷電し、それが電場を通るときに偏向して主流から分け
る。Ｔ又はＢ細胞に適当な螢光抗体を付着することによ
って、細胞懸濁物から一方又は他方の細胞群を分離でき
る。
VI．酵素結合免疫吸着体評価（ＥＬＩＳＡ） 評価されるべきターゲット細胞を洗い、pH7.4のリン酸
塩緩衝食塩水（ＰＢＳ）中に再懸濁し、次に５０μの
サンプル組成物を用いてくぼみ当り約５×１０４の細胞
で、平底ポリビニル マイクロタイタープレート（ダイ
ナテック(Dynatech)、アレキサンドリア、バージニア）
に入れた。プレートを次に乾燥オーブン中で３７℃で一
夜インキュベートした。乾燥したプレートを、使用する
まで４℃で貯蔵した。ＥＬＩＳＡ評価の前に、乾燥した
プレートを、0.1％ポリオキシアルキレン（２０）ソル
ビタンモノラウレート（Tween２０：商標）及び0.02％T
himerosal（商標：エチル水銀チオサリチル酸ナトリウ
ム、シグマケミカル(Sigma Chemical)社、セントルイ
ス、ミズリー）を含むpH7.4の１０ｍＭのＰＢＳで各２
分間２度洗うことによって再び水和させた。
塩緩衝食塩水（ＰＢＳ）中に再懸濁し、次に５０μの
サンプル組成物を用いてくぼみ当り約５×１０４の細胞
で、平底ポリビニル マイクロタイタープレート（ダイ
ナテック(Dynatech)、アレキサンドリア、バージニア）
に入れた。プレートを次に乾燥オーブン中で３７℃で一
夜インキュベートした。乾燥したプレートを、使用する
まで４℃で貯蔵した。ＥＬＩＳＡ評価の前に、乾燥した
プレートを、0.1％ポリオキシアルキレン（２０）ソル
ビタンモノラウレート（Tween２０：商標）及び0.02％T
himerosal（商標：エチル水銀チオサリチル酸ナトリウ
ム、シグマケミカル(Sigma Chemical)社、セントルイ
ス、ミズリー）を含むpH7.4の１０ｍＭのＰＢＳで各２
分間２度洗うことによって再び水和させた。
非特異的結合を低減するために、ハイブリドーマ上澄み
は、希釈剤としての１％ＢＳＡ含有洗滌緩衝液で１：２
で希釈した。希釈されたハイブリドーマ上澄みの５０μ
を次に各くぼみに加え、モノクローナル抗体含有上澄
み（たとえばMabＬ−１４）と評価される細胞とを接触
させて受容体をそのウイルス抗原に結合するために、ジ
ャイロシェーカー上で４℃で１時間インキュベートし
た。各２分間の２回の洗滌後に、１：１０００希釈され
たペルオキシダーゼラベルしたヤギ抗マウス IgG＋ IgM
（タゴ（Tago）、バーリンガム、カリフォールニア）の
５０μを各くぼみに加え、反応混合物を４℃で１時間
インキュベートして、ラベルされた抗体を、結合された
モノクローナル抗体に結合させた。
は、希釈剤としての１％ＢＳＡ含有洗滌緩衝液で１：２
で希釈した。希釈されたハイブリドーマ上澄みの５０μ
を次に各くぼみに加え、モノクローナル抗体含有上澄
み（たとえばMabＬ−１４）と評価される細胞とを接触
させて受容体をそのウイルス抗原に結合するために、ジ
ャイロシェーカー上で４℃で１時間インキュベートし
た。各２分間の２回の洗滌後に、１：１０００希釈され
たペルオキシダーゼラベルしたヤギ抗マウス IgG＋ IgM
（タゴ（Tago）、バーリンガム、カリフォールニア）の
５０μを各くぼみに加え、反応混合物を４℃で１時間
インキュベートして、ラベルされた抗体を、結合された
モノクローナル抗体に結合させた。
結合されたペルオキシダーゼ活性を評価するために用い
られる基質は、使用の直前に調製され、0.12％過酸化水
素を含むpH6.0の８０ｍＭクエン酸塩−リン酸塩緩衝液
中の４００μｇ／ｍｌのｏ−フェニレンジアミン（シグ
マケミカル社、セントルイス、ミズリー）より成った。
二回の最終洗滌後に、基質溶液の５０μを各くぼみに
加え、暗やみ中で１５分間、色が進展するのを許した。
色の進展は、４Ｍ硫酸２５μを各くぼみに加えて停止
され、４９２ｎｍでの光学的吸光度をマルチスキャン(M
ultiskan)ＥＬＩＳＡプレートソーダーで測定した。
られる基質は、使用の直前に調製され、0.12％過酸化水
素を含むpH6.0の８０ｍＭクエン酸塩−リン酸塩緩衝液
中の４００μｇ／ｍｌのｏ−フェニレンジアミン（シグ
マケミカル社、セントルイス、ミズリー）より成った。
二回の最終洗滌後に、基質溶液の５０μを各くぼみに
加え、暗やみ中で１５分間、色が進展するのを許した。
色の進展は、４Ｍ硫酸２５μを各くぼみに加えて停止
され、４９２ｎｍでの光学的吸光度をマルチスキャン(M
ultiskan)ＥＬＩＳＡプレートソーダーで測定した。
VII．間接的免疫螢光評価 非固定組織培養細胞（１０６）をＰＢＳ中で洗い、次に
エッペンドルフ(Eppendorf)遠心分離機で遠心分離し
た。洗滌液を除いた後に、細胞をたとえばMabＬ−１４
上澄みの５０μ中に再懸濁して、細胞を抗体と接触さ
せた。このように形成した細胞−抗体混合物を、氷上に
４５分間維持して受容体を細胞に結合させ、次に２ｍｌ
ＦＣＳを通して遠心分離（２００×ｇ）した。
エッペンドルフ(Eppendorf)遠心分離機で遠心分離し
た。洗滌液を除いた後に、細胞をたとえばMabＬ−１４
上澄みの５０μ中に再懸濁して、細胞を抗体と接触さ
せた。このように形成した細胞−抗体混合物を、氷上に
４５分間維持して受容体を細胞に結合させ、次に２ｍｌ
ＦＣＳを通して遠心分離（２００×ｇ）した。
その後、結合しなかった抗体及びＦＣＳを除いた。細胞
沈澱物を、１：５０希釈されたフルオレセインラベルさ
れたヤギ抗マウス抗血清（タゴ、バーリンガム、カリフ
ォールニア）の５０μで再懸濁し、氷上で更に４５分
間インキュベートして、ラベルされた抗マウス抗体を、
結合された MabＬ−１４受容体と接触させ結合させた。
上述のように、結合していない第二抗体を除去し、細胞
をＰＢＳ中１％ホルムアルデヒドで固定した。細胞結合
フルオレセインは、前述のように螢光活性化細胞ソータ
ー（ＦＡＣＳ）（サイトフルオログラフ(Cytofluorogra
f)、オルソ ダイアグノスチックス(Ortho Diagnostic
s)、ウエスト ウッド、マサチューセッツ）を用いて測
定された。
沈澱物を、１：５０希釈されたフルオレセインラベルさ
れたヤギ抗マウス抗血清（タゴ、バーリンガム、カリフ
ォールニア）の５０μで再懸濁し、氷上で更に４５分
間インキュベートして、ラベルされた抗マウス抗体を、
結合された MabＬ−１４受容体と接触させ結合させた。
上述のように、結合していない第二抗体を除去し、細胞
をＰＢＳ中１％ホルムアルデヒドで固定した。細胞結合
フルオレセインは、前述のように螢光活性化細胞ソータ
ー（ＦＡＣＳ）（サイトフルオログラフ(Cytofluorogra
f)、オルソ ダイアグノスチックス(Ortho Diagnostic
s)、ウエスト ウッド、マサチューセッツ）を用いて測
定された。
モノクローナル受容体Ｋ−２５、Ｅ−２８及びＡ−３３
を用いて、同様の結果を得ることができる。
を用いて、同様の結果を得ることができる。
上述は、本発明を例示するものであって、限定すること
を意図するものではない。本発明の真の精神及び範囲を
離れることなく、多数の変更及び修正を行うことができ
る。
を意図するものではない。本発明の真の精神及び範囲を
離れることなく、多数の変更及び修正を行うことができ
る。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.5 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 (Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｒ 1:91） (56)参考文献 Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ Ｉｍｍｕ ｎｉｔｙ，36（３），924−932（1982）； 38（１），273−281（1982) Ａｎｎａｌｅｓ ｄｅ Ｖｉｒｏｌｏｇ ｉｅ （Ｐａｒｉｓ），134（２）165− 180（1983) Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｌｉｎｉｃａ ｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，18 （２），331−343（1983) Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃ ｉ．ＵＳＡ，81（３），876−880（1984)
Claims (9)
- 【請求項１】サイトメガロウイルスにより哺乳動物にお
いて誘発されたウイルス抗原と反応する抗体を産生する
リンパ細胞と、ミエローマ細胞との融合により形成され
たハイブリドーマによって作られる哺乳動物モノクロー
ナル抗体の有効量を活性成分として含有する、リンパ細
胞におけるサイトメガロウイルスの存在を検定するため
の診断用組成物。 - 【請求項２】抗体が、免疫マウス脾臓細胞とＰ３Ｘ６３
−Ａｇ８．６５３ミエローマ細胞との融合により形成さ
れたハイブリドーマにより作られたものである請求の範
囲１記載の組成物。 - 【請求項３】モノクローナル抗体が指示基を含有するも
のである請求の範囲１記載の組成物。 - 【請求項４】サイトメガロウイルスにより哺乳動物にお
いて誘発されたウイルス抗原と反応する抗体を産生する
リンパ細胞と、ミエローマ細胞との融合により形成され
たハイブリドーマによって作られる哺乳動物モノクロー
ナル抗体と、液体試料を反応させる工程、及び ウイルス抗原／モノクローナル抗体複合体の生成を測定
する工程 を含む液体試料中のサイトメガロウイルスの存在を検定
する方法において、 前記抗原が末梢血リンパ細胞中で誘発されたものであ
り、前記液体試料が末梢血リンパ細胞を含むものである
ことを特徴とする上記方法。 - 【請求項５】ハイブリドーマがハイブリドーマＡＴＣＣ
ＨＢ ８５５４である請求の範囲４記載の方法。 - 【請求項６】ハイブリドーマがハイブリドーマＡＴＣＣ
ＨＢ ８６２２である請求の範囲４記載の方法。 - 【請求項７】ハイブリドーマがハイブリドーマＡＴＣＣ
ＨＢ ８６２３である請求の範囲４記載の方法。 - 【請求項８】ハイブリドーマがハイブリドーマＡＴＣＣ
ＨＢ ８６２４である請求の範囲４記載の方法。 - 【請求項９】モノクローナル抗体が指示基を含有するも
のである請求の範囲４〜８項のいずれか１項記載の方
法。
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