JPH0646855A

JPH0646855A - 酵素の固定化方法

Info

Publication number: JPH0646855A
Application number: JP20360392A
Authority: JP
Inventors: Yoshiaki Kamata; 慶朗鎌田; Masao Motoki; 正雄本木; Yukihiro Matsuura; 幸宏松浦
Original assignee: Ajinomoto Co Inc
Current assignee: Ajinomoto Co Inc
Priority date: 1992-07-30
Filing date: 1992-07-30
Publication date: 1994-02-22

Abstract

(57)【要約】【目的】本発明は安全性の点で問題がなく、連続使用
しても酵素の活性低下を比較的遅くできる酵素の固定化
方法を提供することを目的とする。【構成】担体に吸着させた酵素に対してトランスグル
タミナーゼを作用させ、担体上に架橋化酵素皮膜を形成
させることによって、安全で、連続使用にも安定な固定
化酵素が得られる。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、担体に吸着した酵素活
性物質を担体に被覆させて固定化する方法に関する。詳
しくは、担体に吸着した酵素活性物質どうしを、生体に
影響を及ぼす恐れの化学試薬を用いることなしに共有結
合させて担体を被覆させることで、経済的にしかも食用
材料にも安全に用いることができるように、酵素を固定
化する方法に関する。

【０００２】

【従来技術】生理活性物質、特に酵素を不溶性の担体に
固定化し、連続的かつ経済的に使用する試みは盛んに行
われているが、従来は、酵素を１）不溶性担体に吸着固
定する方法、２）不溶性担体に共有結合によって固定化
する方法、更に３）担体に吸着させた酵素同士に、グル
タルアルデヒド等の化学架橋試薬を用いて架橋させ、担
体上に酵素皮膜を形成させて固定化する方法などが用い
られてきた。しかし、１）は結合力が弱いため、pHや緩
衝液等の外部環境によって酵素が担体から離脱しやす
い。２）は比較的激しい条件下で固定化するため、酵素
の失活を伴ったり、固定化に用いられた化学試薬が残存
する恐れがあり、しかも比較的高価な担体を再利用しに
くい。また３）の方法は２）の方法と同様に酵素の失活
を伴ったり、架橋試薬が残存して生体に影響を及ぼす恐
れがあり、安全性の面から考えても大規模に行われる食
用素材等の処理には利用しにくいという欠点がある。

【０００３】

【発明が解決しようとする課題】本発明の目的は、安全
性の点で問題がなく、連続使用しても酵素の活性低下を
比較的遅くできる、酵素の固定化方法を提供することで
ある。

【０００４】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、上記課題
を解決するために鋭意検討を加えた結果、担体に吸着さ
せた酵素に対してトランスグルタミナーゼを作用させ、
担体上に架橋化酵素皮膜を形成させることによって酵素
を固定化させることにより、上記課題を解決できること
を見いだし、本発明を完成するに至らしめた。即ち、本
発明は担体に吸着した酵素に対してトランスグルタミナ
ーゼを作用させて、担体上に架橋化酵素皮膜を形成させ
ることを特徴とする酵素の固定化方法である。

【０００５】以下に、本発明を詳細に説明する。本発明
に用いられる担体は、酵素が吸着し得るものならどのよ
うなものでも良い。例えばイオン交換樹脂、親和性吸着
体、シリカゲル粒子等を用いることができる。しかし、
それらのなかでもイオン交換樹脂を用いるのが好まし
い。また、本発明に用いられる酵素は、トランスグルタ
ミナーゼの架橋化反応を阻害しないものであれば特に制
限されず、食品用、医薬用等の酵素を用いれば良い。
例えば、トリプシン、アミラーゼ、グルコースオキシダ
ーゼ、カタラーゼなどを挙げることができる。このよう
に、いずれの酵素も使用できるが、とりわけトリプシ
ン、アミラーゼを用いるのが好ましい。また、これらの
酵素を単独で用いても良いが、２種類以上組み合わせて
用いることも可能である。

【０００６】担体と酵素との吸着はまず、担体と酵素を
緩衝液に添加混合することにより、酵素を担体に吸着さ
せればよい。酵素の添加量は特に制限はないが、通常担
体１ｇ当り、０．１−２０ｇ程度の比率で行えば良い。
緩衝液としては、通常用いられるリン酸緩衝液、トリス
−塩酸緩衝液等を用いれば良い。次いでトランスグルタ
ミナーゼを添加し、担体上に架橋化酵素皮膜を生成させ
ればよい。その後、緩衝液、蒸留水等で洗浄すれば、目
的とする固定化酵素が得られる。担体と酵素の間に架橋
が形成される必要はなく、酵素間に架橋が形成されれば
良いので、緩衝液のpHや担体の種類は、トランスグルタ
ミナーゼが作用できる範囲のものであれば良いが、担体
上で用いる酵素の性質に合わせて酵素が吸着しやすいpH
及び担体をあらかじめ選択しておく方が好ましい。

【０００７】また、添加するトランスグルタミナーゼに
は微生物由来のもの（特開平1-27471参照）、モルモッ
ト肝臓由来のもの（特公平1-50382参照）、遺伝子工学
的に生産されたもの（特開平1-300889参照）、植物由来
のもの等のトランスグルタミナーゼ活性を有する限り如
何なる種類のものを用いても良い。本発明におけるトラ
ンスグルタミナーゼの添加量は、例えば微生物由来のト
ランスグルタミナーゼであれば、固定化する酵素1mg当
たりに対し0.001〜100単位、好ましくは0.01〜10単位程
度用いれば良い。かかる範囲を用いる理由は、添加量が
0.001単位以下では十分には酵素が架橋されず、また100
単位以上添加しても効果はそれほど変わらないからであ
る。酵素をトランスグルタミナーゼで固定化するときの
反応条件は、特に拘らないが通常0−60℃、好ましくは3
−40℃で1週間−1分間、好ましくは24時間−30分間反応
させれば良い。反応液のpHは通常pH3−11、好ましくはp
H5−9で反応させれば良い。

【０００８】

【実施例】以下、実施例を挙げて本発明を説明するが、
本発明はこれらの実施例によって何ら制限されるもので
はない。

【０００９】（実施例１）pH2〜12の広域緩衝液（リン
酸とクエン酸で調製）50mlに、トリプシン（シグマ社
製）を5重量％になるように溶解し、陽イオン交換樹脂
（SP-Sephadex C-25、ファルマシア社製）を0.5g加え、
5分間よく振盪した。そこにトランスグルタミナーゼ
（特開平1-27471の方法により調製したもの）をトリプ
シン1mgあたり6単位加え、振盪しながら4℃で15時間反
応させた。反応後、ブフナー漏斗で吸引しながら、0.00
1NのHClを300ml、1NのNaClを300ml、さらに0.001NのHCl
を300ml添加して洗浄し、固定化されなかったトリプシ
ンを除去した。その後凍結乾燥し、固定化酵素を調製し
た（以下、試料と称する）。

【００１０】一方、pH2〜12の広域緩衝液50mlに、陽イ
オン交換樹脂（SP Sephadex C-25、ファルマシア社製）
を0.5g加え、5%トリプシン（シグマ社製）溶液1mlを添
加し、5分間よく振盪した。そこにグルタルアルデヒド
（ナカライテスク社製）を2.5%濃度になるように加え、
振盪しながら4℃で15時間反応させた。反応後、ブフナ
ー漏斗で吸引しながら、0.001NのHClを300ml、1NのNaCl
を300ml、さらに0.001NのHClを300ml添加し、固定化さ
れなかったトリプシンやその他の試薬を洗浄した。その
後凍結乾燥し、固定化酵素を調製した（グルタルアルデ
ヒド固定化酵素）。

【００１１】このようにして調製した各固定化酵素につ
いて、活性に及ぼす固定化時のpHの影響を調べた。活性
は低分子合成基質（BAPA）を用いた活性測定方法（K.A.
Walsh:Method in enzymology,19,62(1970)参照）に準じ
て以下のように行った。凍結乾燥させた固定化酵素を5m
gずつ秤量し、0.001NのHClを1ml添加して膨潤させ、17.
5mgのBAPAをpH7.8のトリエタノールアミン緩衝液50mlに
溶解したものを1ml添加し37℃で1分間反応させた。2.5%
TCAを1ml添加して反応を停止させ、遠心分離（3,000rp
m、15分間）し固定化酵素を除去した後、405nmで上清の
吸光度を測定した。活性は、405nmにおける吸光度を1増
加させる酵素量を1単位とした。結果を図１に示した。

【００１２】図１に示すようにグルタルアルデヒドで固
定化した場合、最大の活性はpH2で得られたが、中性か
らアルカリ性にかけては固定化できなかった。これはト
リプシンがpHの低い所で特に安定であるから固定化でき
ているのであって、中性からアルカリ性にかけてはグル
タルアルデヒドがトリプシンの酵素活性に有害な効果を
持っていることを示唆している。一方、トランスグルタ
ミナーゼで固定化した場合は、pHが11以下であればかな
り広い範囲でトリプシンを安定に固定化できることがわ
かる。これらのことから、グルタルアルデヒドで酵素を
固定化する場合は、固定化時のpHが限定されるので不便
である。しかし、トランスグルタミナーゼで酵素を固定
化する場合は、かなり広い範囲のpHで固定化できるの
で、グルタルアルデヒドに比べ非常に都合が良く、汎用
性の高い技術である。

【００１３】（実施例２）pH8.0の広域緩衝液（リン酸
とクエン酸で調製）に、陽イオン交換樹脂（SPセファデ
ックスC-25、ファルマシア社製）100mgとトリプシン
（シグマ社製）10mgを加え5分間よく振盪した。これに
トランスグルタミナーゼ（特開平1-27471により得たも
の）をトリプシン1mg当り2.8単位添加し、振盪しながら
4℃で15時間反応させた。NaClを2M含むTris-HCl緩衝液
（pH8.0）10mlで3回洗浄し、さらに蒸留水で3回洗浄し
て、架橋化によって固定化されなかったトリプシン（陽
イオン交換樹脂に吸着されているものも当然含まれる）
を取り除き、凍結乾燥して固定化酵素を調製した（試
料）。

【００１４】また、対照として、同様に緩衝液にトリプ
シンと陽イオン交換樹脂を添加混合し、吸着だけで固定
化した固定化酵素を調製した（対照）。即ち対照は、ト
ランスグルタミナーゼを添加していないためトリプシン
の架橋化皮膜が生成されておらず、従ってトリプシンは
陽イオン交換樹脂に吸着したいるだけなので、緩衝液で
の洗浄によって完全に洗い流されるため、それを防ぐた
めに対照は洗浄していない。

【００１５】このようにして調製した両固定化酵素の連
続活性を比較した。連続活性試験は低分子合成基質（BA
PA）を用いた活性測定方法（K.A.Walsh:Method in enzy
mology,19,62(1970)参照）に準じて以下のように行っ
た。内容積約5ml（φ1.2×5cm）のカラムに、0.1gの固
定化酵素を緩衝液（pH10.5）で膨潤させたものを詰め、
37℃恒温槽内に沈め、振盪しながらペリスタポンプを用
いて0.4ml/minの流速で連続的に基質（BAPA）を供給し
た。フラクションコレクターでカラムから溶出した反応
物を分取し、実施例１と同様にして活性を測定した。試
料と対照を比較した連続活性試験の結果を図２に示し
た。

【００１６】図２に示すように、対照は活性がすぐに低
下していた。これは酵素が、単に吸着のみで担体に固定
化されているだけでは、担体から急速に離脱してしまう
ことを示している。一方トランスグルタミナーゼを添加
して固定化した試料は、活性にわずかな低下がみられる
が、対照に比べ高い活性を維持していた。

【００１７】

【発明の効果】このようにして得られた固定化酵素は、
連続使用に対してもかなり安定に活性を保持する。ま
た、本発明の方法により得られた固定化酵素は、たとえ
洗浄が不十分でトランスグルタミナーゼが固定化酵素中
に残存していても、生体に対する影響が少なく、加熱に
より容易に失活させることができる。また、例えばグル
タルアルデヒドで固定化する場合は、固定化を酸性下で
行わないと固定化される酵素の活性が著しく低下するの
に対し、トランスグルタミナーゼを用いれば、固定化さ
れる酵素の活性をあまり低下させずに広い範囲のpHで固
定化できるという利点もある。更に、本発明の固定化酵
素は連続使用しても酵素の活性低下を比較的遅くできる
というメリットもある。従って、本発明の方法は食品用
や医薬品用などの製品に用いる固定化酵素の提供法とし
ては有効である。

【図面の簡単な説明】

【図１】固定化時の緩衝液のpHに対して、グルタルアル
デヒドにより固定化した固定化トリプシンとトランスグ
ルタミナーゼにより固定化した固定化トリプシンの活性
を示したものである。

【図２】トランスグルタミナ−ゼを用いて固定化した固
定化トリプシン及び対照品の連続活性試験の結果を示し
たものである。

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】担体に吸着した酵素に対してトランスグ
ルタミナーゼを作用させて酵素を担体に被覆させること
を特徴とする酵素の固定化方法。
【請求項２】担体がイオン交換樹脂である請求項１記
載の酵素の固定化方法。
【請求項３】酵素がプロテアーゼ及び／叉はアミラー
ゼである請求項１記載の酵素の固定化方法。
【請求項４】トランスグルタミナーゼが微生物由来の
ものである請求項１記載の酵素の固定化方法。
【請求項５】酵素１ｍｇに対してトランスグルタミナ
ーゼを０．００１−１００単位作用させることを特徴と
する請求項１記載の酵素の固定化方法。