JPH0648910A - 植物体再生促進剤 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【構成】 光合成原核微生物、例えば、シアノバクテリ
ア類のシネココッカス属（Synechococcus sp.）ＡＴＣ
Ｃ ２７１９２など、に由来する分子量１０，０００〜
３０，０００の蛋白質を含有する植物体再生促進剤。 【効果】 植物の組織とか器官とか培養細胞などの培養
や増殖、あるいは不定胚形成、植物体再生を促進し、ま
た、人工種子ならば、その発芽率を高くできる。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、植物の組織とか器官も
しくはこれらの一部あるいは培養細胞を培養することに
よって、植物体を再生させる植物組織培養法及び人工種
子に関する。

【０００２】

【従来の技術】植物組織培養技術を用いて植物体を再生
させることは、例えば、人工種子の開発に見られるよう
に、近年の植物バイオテクノロジ−の進歩に伴いますま
す重要になりつつある。

【０００３】この植物組織培養技術を用いての植物体再
生法は、出発材料により脱分化系と分化系の２種に大き
く分けられる。

【０００４】脱分化系はカルスや液体培養細胞などの脱
分化した状態を経由して植物体を再生させる方法で、具
体的にはクラスタ−カルスから多くのシュ−トを発生さ
せ、発生した各々のシュ−トから発根させ幼植物体を再
生させる方法と、細胞に直接不定胚（体細胞胚）を形成
し、これを幼植物体にまで再生させる方法とがある。

【０００５】また、分化系では成長点を含む茎頂、休眠
芽、側芽、胚、種子などが出発材料になり、更に成長点
を含まない胚軸、子葉、茎なども用いられる。この系に
は、上述した植物組織にマルチプルシュ−トを形成さ
せ、ついでこれらを切除した単一シュ−トから連続的に
マルチプルシュ−トを発生させる連続シュ−ト生産シス
テムを確立し、最終的に切除したシュ−トから発根させ
幼植物を再生させる方法がある。

【０００６】これら脱分化系、分化系のいずれの方法に
よるにしても、再生効率を高めるために種々の条件につ
いて検討がなされている。例えば、温度とか光量とか光
周期とかといった物理的条件、培地の、無機塩類とかビ
タミンとか糖といった化学的条件、サイトカイニン／オ
−キシンの量比とかジベレリン類やアブシジン酸類など
の添加といった植物ホルモン条件、更には、用いる植物
の齢や組織に関連する条件とか、固体培養か液体培養
（静置培養、回転培養、振盪培養、タンク培養など）か
といった条件などである。

【０００７】

【発明が解決しようとする課題】しかし、植物組織や培
養細胞などを効果的に増殖あるいは分化させたり、植物
組織や培養細胞などからの植物体再生を効率よく促進さ
せたりする植物組織培養法はまだ確立されていない。実
際、脱分化系での植物体再生では、不定胚形成やカルス
からのシュ−トや根の形成を誘導できない植物種も多
い。理由は定かではないが、魚雷型胚まで生長すると不
定胚が生長を停止して植物体にまで再分化する率が極め
て低下するという現象も起こっている。また、分化系で
の植物体再生でも、未だに植物や組織によってはシュ−
ト・根の形成をしないものもある。更に、脱分化系、分
化系のいずれにおいても、植物ホルモンの種類やその添
加量によっては、増殖や分化を阻害する等の問題が発生
している。また、高い発芽率を有する人工種子も完成さ
れていない。各種の植物組織や器官あるいは培養細胞か
らの不定胚形成率を高め、更には不定胚の生長や植物体
への再生を効果的に促進させる方法が望まれるところで
ある。

【０００８】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、上記課題
の解決のために光合成原核微生物に着眼して種々検討を
加えてきたが、蛋白質画分、その中でも、ある特定のも
のが特に有効成分として効果的であることを知見し、本
発明を完成させるに到った。即ち、本発明は、植物の組
織とか器官もしくはこれらの一部あるいは培養細胞を培
養するにあたって使用する植物体再生促進剤であって、
光合成原核微生物由来の分子量１０，０００〜３０，０
００の蛋白質を含有してなる植物体再生促進剤を要旨と
する。

【０００９】利用できる光合成原核微生物としては、シ
アノバクテリア類（「R.Rippka andR.Y.Stanier：J.Ge
n.Microbiol.,111,1-61(1979)」により種々分類されて
いる）や光合成細菌類などがある。シアノバクテリア類
としては、例えば、クロログレオピシス属（Chlorogloe
opisis sp.）、デルモカルパ属（Dermocarpa sp.）、ノ
ストック属（Nostoc sp.）、シネココッカス属（Synech
ococcus sp.）、オスシラトリア属（Oscillatoria s
p.）があり、具体例としては、クロログレオピシス属
（Chlorogloeopisis sp.）ＡＴＣＣ ２７１８１、デル
モカルパ属（Dermocarpa sp.）ＡＴＣＣ ２９３７１、
ノストック属（Nostoc sp.）ＡＴＣＣ ２７８９５、シ
ネココッカス属（Synechococcus sp.）ＡＴＣＣ ２７１
９２、ＡＴＣＣ２９４０４、ＡＴＣＣ ２９５３４、Ａ
ＴＣＣ ２７１７０、オスシラトリア属（Oscillatoria
sp.）ＡＴＣＣ ２７９０６などが挙げられ、また、光合
成細菌類としては、例えば、ハロバクテリウム属（Halo
bacterium sp.）、ロドシュ−ドモナス属（Rhodopseudo
monas sp.）、ロドスピリラム属（Rhodospirillum s
p.）があり、具体例としては、ハロバクテリウム・クチ
ルブルム（Halobacteriumcutirubrum）ＡＴＣＣ ３３１
７０、ハロバクテリウム・メディテラネイ（Halobacter
ium mediterranei）ＡＴＣＣ ３３５００、ハロバクテ
リウム・サッカルボルム（Halobacterium saccharovoru
m）ＡＴＣＣ ２９２５２、ハロバクテリウム・サリナリ
ウム（Halobacterium salinarium）ＡＴＣＣ １９７０
０、ハロバクテリウム・ソドメンセ（Halobacterium so
domense）ＡＴＣＣ ３３７５５、ロドシュ−ドモナス・
アシドフィラ（Rhodopseudomonas acidophila）ＡＴＣ
Ｃ ２５０９２、ロドシュ−ドモナス・ルティラ（Rhodo
pseudomonas rutila）ＡＴＣＣ３３８７２、ロドシュ−
ドモナス・スフェロイデス（Rhodopseudomonas spheroi
des）ＡＴＣＣ １７０２４、ロドシュ−ドモナス・ビリ
ディス（Rhodopseudomonas viridis）ＡＴＣＣ １９５
６７、ロドシュ−ドモナス・ブラスティカ（Rhodopseud
omonas blastica）ＡＴＣＣ ３３４８５、ロドスピリラ
ム・モリシアナム（Rhodospirillum molischianum）Ａ
ＴＣＣ １４０３１、ロドスピリラム・ホトメトリクム
（Rhodospirillum photometricum）ＡＴＣＣ ２７８７
１、ロドスピリラム・ルブラム（Rhodospirillum rubru
m）ＡＴＣＣ ２７７、ＡＴＣＣ １７０３１、ロドスピ
リラム・テヌエ（Rhodospirillum tenue）ＡＴＣＣ ２
５０９３などが挙げられる。また、これら光合成原核微
生物あるいはその変種や変異株に限ることなく、天然か
ら分離した海洋性、淡水性の光合成原核微生物も本発明
において利用できる。更に、これらの菌体を１種または
２種以上併用してもよい。

【００１０】これら光合成原核微生物からの分子量１
０，０００〜３０，０００の蛋白質を用いるが、まず光
合成原核微生物を培養し、その濾液や抽出物を利用する
のが効率的である。培養は、通常、無機塩類等を含む培
地を用い、タンク培養あるいは太陽光を利用した屋外開
放培養で行い得る。尚、光合成原核微生物が天然にある
程度豊富に存在するならば、その菌体の生育存在する海
水あるいは淡水を培養液とすることもできる。

【００１１】光合成原核微生物の培養濾液は、上述した
培養法で得られる培養液を遠心分離あるいは濾過などを
行って取得されるが、更に、この培養濾液を減圧濃縮な
どにより濃縮してもよい。

【００１２】また、光合成原核微生物の抽出物は、例え
ば、前記のようにして得られた菌体を必要に応じて適宜
破砕し、常温または加熱した適当な溶媒と接触させて行
い得る。ここで、溶媒としては、菌体によって種々の溶
媒を単独または複数併用してもかまわないが、一般的に
は水性溶媒が好ましい。水性溶媒としては、水単独ある
いは酸、塩基、塩類、または有機溶媒を溶解した水溶液
などが使用できる。

【００１３】また、上記範囲の分子量の蛋白質は、例え
ば、硫安塩析、有機溶媒沈殿などの分別沈殿法、ゲル濾
過による精製法、陰イオン交換体，陽イオン交換体など
のイオン交換体を用いての精製法、活性炭，シリカゲル
などの吸着力利用による精製法といった一般的な分画法
を必要に応じて適宜組合せ活用し、夾雑している多糖や
核酸成分を除去するために、例えば、ヘミソサミニダ−
ゼ、ガラクトシダ−ゼ、マンノシダ−ゼ、フコシダ−
ゼ、シアリダ−ゼ、グルクロニダ−ゼ、ＤＮａｓｅ、Ｒ
Ｎａｓｅなどの加水分解酵素を用い、分解・低分子化
し、ゲル濾過・透析などを行うことで容易に得られる。
得るものとしては、上記範囲の分子量分布を有するも
の、即ち、１０，０００〜３０，０００の分子量分布を
有するもの、上記範囲内の分子量分布ではあるが、例え
ば、１０，０００〜２０，０００といった制限された分
子量分布を有するもの、上記範囲内の分子量のものであ
るが、例えば、分子量１３，０００とか２６，０００と
かといった実質的にある特定分子量のものと適宜であ
る。また、得たものを、そのまま使用してもよいし、適
宜濃縮あるいは希釈して使用してもよいし、減圧乾燥、
凍結乾燥、噴霧乾燥等により乾燥し粉末としたものを必
要に応じて適宜タブレット化したりして使用してもよい
し、また、これらを混合したものとしたり、通常の培養
に使用される植物ホルモン、ココナッツミルク、カゼイ
ン分解物や酵母抽出物等を目的に応じて併せて含有させ
てもよいし、状態としても、ゲル状その他の適宜になす
ことができる。培地と一体化しておくことも可能であ
り、人工胚乳用物として準備しておけば、高い発芽率の
人工種子ともなる。

【００１４】また、上記範囲の分子量の蛋白質の基本培
地への添加量は、目的とする植物により変動し一概に規
定することは困難であるが、有効な添加量は実験により
容易に決めることができる。例えば、ニンジンの培養細
胞からの不定胚系では、０．１〜１００ｐｐｍ濃度範囲
で添加するとよい。尚、植物組織培養に使用する基本培
地や培養方法などは通常の植物組織培養におけるものと
同様である。即ち、基本培地としては、ムラシゲ＆スク
−グ（Murashige & Skoog）培地（１９６２）（以下
「ＭＳ培地」と略記する）を代表的なものとして挙げら
れるが、その他の植物組織培養に適した種々の培地、あ
るいはそれらの改変培地を適宜選択することもできる。

【００１５】本発明において培養の対象となる植物の種
類は、分化全能性を有し組織培養が可能であれば特に制
限はなくどんな植物でも適用可能である。これらは植物
の組織、器官、あるいはそれらの一部、あるいは培養細
胞を培養に供することができるが、これらを初代培養あ
るいは継代培養したものも培養可能である。従って、不
定胚を形成させたり、植物体を再生させたり、また、植
物体を再生させるにあたって、カルスを培養したり、不
定胚を培養したり、プロトコ−ム状球体を培養したりす
ることができる。

【００１６】

【実施例】以下、最初に製造方法などの例示をするが、
本発明はこれに限定されるものではない。

【００１７】（Ａ）高分子画分の調製 シネココッカス属（Synechococcus sp.）ＡＴＣＣ ２７
１９２をＡＴＣＣ指定の培養条件にて培養後、培養液を
遠心濾過して菌体を得た。次いで、凍結乾燥をし、水に
対して３％となるように菌体を懸濁させ、１００℃で６
０分間熱水抽出し、遠心分離して上澄液を０．４５μｍ
のメンブランフィルタ−を用いて濾過し、抽出物を得
た。

【００１８】この抽出物５０ｍｌをビスカゼ（ＶＩＳＫ
ＡＳＥ）社の透析用セルロ−スチュ−ブ（商品名：セル
ロ−スチュ−ブ３０／３２）を用いて蒸留水１ｌに対し
て透析内液を得、これを凍結乾燥した。

【００１９】 （Ｂ）上記範囲の分子量の蛋白質の抽出・精製 上記（Ａ）で得た高分子画分に核酸分解酵素リボヌクレ
ア−ゼＡ（シグマ社製）を酵素：基質＝１００：１の比
率で添加し核酸を低分子化し、これをトヨパ−ルＨＷ−
５５（東ソ−株式会社製）を用いたゲル濾過により分子
量分画し蛋白質画分（以下、「蛋白質画分Ｐ」と言う。
尚、このようにして得たものには、糖鎖、脂肪鎖などが
結合したものも含まれる。）を得た（凍結乾燥）。

【００２０】蛋白質画分Ｐを分画分子量３０，０００−
１０，０００のメンブランフィルタ−を用いた限外濾過
装置セントリセル（ポリサイエンス社製）を用いて分子
量１０，０００〜３０，０００の画分（以下、「１０〜
３０ｋ蛋白」と言う）を得た（凍結乾燥）。

【００２１】また、蛋白質画分Ｐに対して、ＴＳＫｇｅ
ｌＤＥＡＥ−５ＰＷ（東ソ−株式会社製）を用いた高速
液体クロマトグラフィ−によるイオン交換クロマトを繰
り返し行い、ＳＤＳ−ポリアクリルアミド電気泳動によ
る測定で、±２，０００程度の分布を有するものの、そ
れぞれ代表的に１０，０００、１３，０００、１６，０
００、２６，０００で示せるものを得た（以下、それぞ
れ「１０ｋ蛋白」、「１３ｋ蛋白」、「１６ｋ蛋白」、
「２６ｋ蛋白」と言う）（凍結乾燥）。

【００２２】（Ｃ）ニンジン不定胚の培養 ニンジンの無菌種子の芽生えにおいて胚軸が１０ｃｍ位
に生長したものを約１ｃｍ位に切断し、下記培地中で２
５℃、暗条件下で培養した。培地は基本培地としてＭＳ
培地を使用し、これにショ糖３％、オ−キシン類の植物
ホルモンである２，４−Ｄ（２，４−ジクロロフェノキ
シ酢酸）１ｍｇ／ｌを添加しｐＨ５．５〜ｐＨ５．７に
調整した。約１ヶ月の培養後、培地中の２，４−Ｄ濃度
を０．１１ｍｇ／ｌに減少させた培地に移植し、振盪速
度９０回／分のレシプロ式シェ−カ−を用いて振盪培養
した。その後、１週間に１回の割合で、２，４−Ｄを
０．１１ｍｇ／ｌ含む培地に植え継いでニンジン培養細
胞を得た。

【００２３】そして、このような液体培養で継代培養し
た培養細胞を２，４−Ｄを含まない１／４濃度の基本培
地に移植して培養することにより、不定胚を形成させ
た。

【００２４】 ＜実施例１＞（ニンジン不定胚からの植物体再生） ニンジン不定胚は上記（Ｃ）で得た不定胚から４２５及
び８００μｍのメッシュを用い４２５〜８００μｍの大
きさの不定胚を選別し使用した。得られた心臓型から魚
雷型までの不定胚を、植物ホルモンを含まないＭＳ培地
に上記（Ｂ）で得た１０〜３０ｋ蛋白を１ｐｐｍ添加し
た培地で液体振盪培養した。

【００２５】＜実施例２、３＞（同上） 実施例１において、１０〜３０ｋ蛋白の添加量を１ｐｐ
ｍから５ｐｐｍ、１０ｐｐｍに変えた以外、すべて実施
例１と同様にした。

【００２６】＜実施例４〜６、７〜９、１０〜１２、１
３〜１５＞（同上） 実施例１〜３において、１０〜３０ｋ蛋白に代えて、１
０ｋ蛋白（実施例４〜６）、１３ｋ蛋白（実施例７〜
９）、１６ｋ蛋白（実施例１０〜１２）、２６ｋ蛋白
（実施例１３〜１５）を用いた以外、すべて実施例１〜
３と同様にした。

【００２７】＜実施例１６〜１８＞（同上） 実施例１〜３において、１０〜３０ｋ蛋白に代えて１０
ｋ蛋白と１３ｋ蛋白と１６ｋ蛋白の等重量混合物を用い
た以外、すべて実施例１〜３と同様にした。

【００２８】＜実施例１９〜２１＞（同上） 実施例１〜３において、１０〜３０ｋ蛋白に代えて１３
ｋ蛋白と１６ｋ蛋白と２６ｋ蛋白の等重量混合物を用い
た以外、すべて実施例１〜３と同様にした。

【００２９】＜比較例１〜３＞（同上） 実施例１において、植物ホルモンを含まないＭＳ培地に
上記（Ｂ）で得た１０〜３０ｋ蛋白を添加する代わりに
上記（Ａ）で調製した蛋白質画分を１０ｐｐｍ、５０ｐ
ｐｍ、１００ｐｐｍ用いた以外、すべて実施例１と同様
にした。

【００３０】＜比較例４＞（同上） 実施例１において、植物ホルモンを含まないＭＳ培地に
上記（Ｂ）で得た１０〜３０ｋ蛋白を添加することなく
用いた以外、すべて実施例１と同様にした。

【００３１】以上の各例のものについて、２５℃、明条
件（２０００ルックス、１６時間照明）で７日間培養
し、植物体再生率（不定胚のグリ−ニング及び発芽発根
を認められたものの率）を調べた結果を表１〜表８に示
す。

【００３２】

【表１】（１０〜３０ｋ蛋白）

【００３３】

【表２】（１０ｋ蛋白）

【００３４】

【表３】（１３ｋ蛋白）

【００３５】

【表４】（１６ｋ蛋白）

【００３６】

【表５】（２６ｋ蛋白）

【００３７】

【表６】（１０ｋ蛋白，１３ｋ蛋白、１６ｋ蛋白の混合
物）

【００３８】

【表７】（１３ｋ蛋白，１６ｋ蛋白、２６ｋ蛋白の混合
物）

【００３９】

【表８】

【００４０】＜実施例２２＞（ニンジン不定胚を用いた
人工種子の発芽促進） ニンジン不定胚は上記（Ｃ）で得た不定胚から４２５μ
ｍ及び８００μｍのナイロンメッシュを用いて４２５〜
８００μｍの大きさに生長した不定胚のみを選別使用し
た。選別された不定胚のほとんどは、球状から初期の心
臓型不定胚であった。

【００４１】このようにして得られた不定胚をＭＳ培地
２５ｍｌ中に懸濁し、包埋剤として３重量％のアルギン
酸ナトリウムを含む溶液７５ｍｌと混ぜ合わせ、混液１
００ｍｌを得た。このとき、上記混液１００ｍｌに対し
て上記（Ｂ）で得た１０〜３０ｋ蛋白を１ｐｐｍ添加し
た。得られた最終混液を、５０ｍＭの塩化カルシウム溶
液中に滴下することによって、アルギン酸カルシウムか
らなる人工膜を有する球状の人工種子を得た。

【００４２】＜実施例２３、２４＞（同上） 実施例２２において、１０〜３０ｋ蛋白の添加量を１ｐ
ｐｍから５ｐｐｍ、１０ｐｐｍに変えた以外、すべて実
施例２２と同様にした。

【００４３】＜実施例２５〜２７、２８〜３０、３１〜
３３、３４〜３６＞（同上） 実施例２２〜２４において、１０〜３０ｋ蛋白に代え
て、１０ｋ蛋白（実施例２５〜２７）、１３ｋ蛋白（実
施例２８〜３０）、１６ｋ蛋白（実施例３１〜３３）、
２６ｋ蛋白（実施例３４〜３６）を用いた以外、すべて
実施例２２〜２４と同様にした。

【００４４】＜実施例３７〜３９＞（同上） 実施例２２〜２４において、１０〜３０ｋ蛋白に代えて
１０ｋ蛋白と１３ｋ蛋白と１６ｋ蛋白の等重量混合物を
用いた以外、すべて実施例２２〜２４と同様にした。

【００４５】＜実施例４０〜４２＞（同上） 実施例２２〜２４において、１０〜３０ｋ蛋白に代えて
１３ｋ蛋白と１６ｋ蛋白と２６ｋ蛋白の等重量混合物を
用いた以外、すべて実施例２２〜２４と同様にした。

【００４６】＜比較例５〜７＞（同上） 実施例２２において、混液１００ｍｌに対して上記
（Ｂ）で得た１０〜３０ｋ蛋白を添加する代わりに上記
（Ａ）で調製した蛋白質画分を１０ｐｐｍ、５０ｐｐ
ｍ、１００ｐｐｍ添加して使用した以外、すべて実施例
２２と同様にした。

【００４７】＜比較例８＞（同上） 実施例２２において、混液に上記（Ｂ）で得た１０〜３
０ｋ蛋白を添加することなく使用した以外、すべて実施
例２２と同様にした。

【００４８】以上の各例のものについて、無菌的に２５
℃、明条件（２０００ルックス、１６時間照明）で２５
日間培養し、発芽率を調べた結果を表９〜表１６に示
す。

【００４９】

【表９】（１０〜３０ｋ蛋白）

【００５０】

【表１０】（１０ｋ蛋白）

【００５１】

【表１１】（１３ｋ蛋白）

【００５２】

【表１２】（１６ｋ蛋白）

【００５３】

【表１３】（２６ｋ蛋白）

【００５４】

【表１４】（１０ｋ蛋白，１３ｋ蛋白、１６ｋ蛋白の混
合物）

【００５５】

【表１５】（１３ｋ蛋白，１６ｋ蛋白、２６ｋ蛋白の混
合物）

【００５６】

【表１６】

【００５７】

【発明の効果】本発明の植物体再生促進剤を使用すれ
ば、植物の組織とか器官とかこれらの一部やあるいは培
養細胞といったものの培養、増殖を効果的に促進させる
ことができ、不定胚に形成、植物体の再生を促進させる
ことができるし、人工種子ならば発芽率の高いものたり
得る。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 斎藤 陽子 埼玉県草加市吉町４−１−８ ぺんてる株 式会社草加工場内 (72)発明者 菱沼 清 埼玉県草加市吉町４−１−８ ぺんてる株 式会社草加工場内 (72)発明者 長島 真理子 埼玉県草加市吉町４−１−８ ぺんてる株 式会社草加工場内 (72)発明者 梅津 博紀 埼玉県草加市吉町４−１−８ ぺんてる株 式会社草加工場内 (72)発明者 松永 是 東京都府中市幸町２−41−13府中第三住宅 ２−304

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 植物の組織とか器官もしくはこれらの一
   部あるいは培養細胞を培養するにあたって使用する植物
   体再生促進剤であって、光合成原核微生物由来の分子量
   １０，０００〜３０，０００の蛋白質を含有してなる植
   物体再生促進剤。