JPH06500004A - 蛋白質組成物の製造 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 蛋白！組成物の製造 本発明は蛋白ｔｍｍ初物製造、特に食用蛋白ｉｌｌ成物（ｅｄｉｂｌｅ　ｐｒｏ ｔｅｉｎａｃｅｏｕｓｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ　）の製造に関する。

英国特許第Ａ１２１０３５６号と英国特許第Ａ１３４６０６１号は炭素源と他の 必須栄養素とを含む培地における好気性条件下での真菌類の無毒性菌株の培養に よる食用蒼白′ｉｔ組成物の製造に関し、この培養は炭素源が成長制限栄養素で あるような形式で行われている。

英国特許第Ａ２１３７２２６号は酸素が成長制限栄養素であるような形式で培ば ならない、これに関する困難性は蛋白質組成物の構造がそれを構成する糸状ある ０分枝形成度の有用なインジケーター（指！Ｉ）は「菌糸成長単位長さ」である 、これは菌糸体の全フィラメントの全長を菌糸体中の菌糸先端の総数によって除 することによって決定される。

糸状微生物の菌糸の分校が糸状微生物を培養する培地中のカルシウムイオンの濃 度のＩ！Ｉｆｆによって制御されうることか判明した。

従って、本発明は糸状微生物からの蛋白質組成物の製造方法において、前記糸状 微生物が所望の価値を有する菌糸成長単位長さを有し、次の工程：（１）　炭素 源と他の必須栄養素源とを含む培地において好気性条件下で前記糸例えば菌糸成 長単位長さを検査する工程；及び（１１ｉ）　所望の範囲内の前記検査結果を得 るように、前記培地中のカルシウム含量を制御する工程 を含む方法を提供する。

菌糸成長単位長さは例えば顕微鏡を用いて直接測定することができるが、菌糸成 長単位長さの変化によって変化する物理的性質の測定を、測定の容易さのために 、製造プロセス中に代用することができる。

本発明はまた、炭素源と他の必須栄養素源とを含む培地中の好気性条件下で２ｐ 　（Ｆｕｓａｒｉｕｍ）属を培養することを含み、培地が１０１〜１０−Ｓモル 、好ましくは１０−ｓ〜１０−ｓモルの範囲内のカルシウムイオンを含むことを 特徴とするフザリウム属の糸状微生物からの蛋白ｔｍｍ初物製造方法をも含む。

培養は例えばケモスタット（ｃｈｅｓｏｓｔａｔ）培養又はタービドスタット（ ｔｕｒｂ　ｉ　ｄｏｓ　ｔａ　ｔ）培養におけるように、公知の形式で実施する ことができる。しかし、改良された生産性を得るためには、培養をタービドスタ ット培養で、すなわち存在する微生物細胞の大部分がカルシウム制限以外の特定 の栄養素制限を受けないような培養において実施することが望ましい、培養をタ ービドスタット培養で実施する場合には、発酵器（ｆｅｒｓｅｎ　ｔｅｒ）内の 微生物細胞の成長が流体力学的に制御される。

培養はバッチ式又は連続式に実施される。培養が連続的であることが好ましい。

プロセスを実施する温度は受容される収量と転化率とを得るために、培養中の特 定の微生物に応じて選択される。典型的な温度は２５〜３４℃の範囲内である。

同様に、プロセスを実施するｐｉ（は好ましくは、特定の微生物の最大成長が示 されるような範囲内に維持する。典型的に、ｐＨは５．０と８．０の範囲内であ り、より通常には約ｐＨ６である。

培地中で、炭素源は適当な如何なる炭素源でも良く、例えばデンプン、デンプン 含を物質もしくはこれらの加水分解生成物、例えばグルコース、スクロース、ス クロース含有物質もしくは加水分解スクロース、すなわち払化垢、又はこれらの 混合物でありうる。このように、炭素源は加水分解されたジャガイモ殿粉、糖蜜 、グルコース、マルトース、加水分解された豆殿粉又はカッサバ殿粉を含みうる ９代替え炭素源、例えば動物起源の炭素Ｓ（例えば乳ホエー）を用いることも制 限されないように、培地中に維持される。溶解酸素張力（ｄｉｓｓｏｌｖｅｄ　 ｏｘｙｇｅｎｔｅｒ＋５ｉｏｎ）　（ＤＯＴ）は充分なレベルに維持されるが、 培養物（ｃｕｌ　ｔｕｒｅ）の大部分が酸素制限状態にないようなレベルである ことが好ましい。上述した栄養素の他に、例えばビオチンのような、１種以上の ビタミンを培地に含むこともできる。

プロセス中に、培地を好ましくは連続的に培養物に供給し、培養物を連続的に発 酵器から取り出す。取り出した培養物を次に、それから糸状微生物を分離するよ うに処理する。典型的な処理では、取り出した培養物を熱処理し、濾過し、得ら れたフィルターケーキを次に食品への使用に適した状態に調製する。

培地を連続的に供給し、培養物を連続的に取り出す場合には、発酵器中の個々の ミセルの総数をコニデージョン（ｃｏｎｉｄａｔｉｏｎ）と細胞破壊とによる新 しい菌糸フラグメント（スターター細胞）の発生によって測定する。培養中に、 スターター細胞が培養物中に連続的に生産されることが重要である。理想的には 、これらのスターター細胞が培養物から細胞が取り出される速度とほぼ同じ速度 で発生すべきである。スターター細胞が製造されない場合には、当然培養物の「 洗浄（ｗｏｓｈ−ｏｕｔ）　Ｊが生ずる。

−触に、菌糸成長単位長さは発酵器内のカルシウムイオン濃度の直接の関数であ る０通常、１０−５Ｍのカルシウムイオン濃度までは、菌糸成長単位長さはカル シウムイオン濃度の対数に比例して変化する。約１０−’Ｍを超えるカルシウム イオン濃度では、菌糸成長単位長さはカルシウムイオン濃度の変化にあまり敏感 でなくなる。

約１０−’Ｍのカルシウムイオン濃度はキレート化剤を用いて得ることができる 。

カルシウムイオンのこのような低い濃度に達するためには、糸状微生物の培養に カルシウム源として用いられないような原料物質、例えば栄養素の全部ではない としても大部分が実質的にカルシウムを含まないことが必要である。

このように、糸状微生物の培養は実際に、カルシウムイオン濃度が１０−９〜１ ０−’Ｍの範囲内である培地において実施することができる。好ましくは、カル シウムイオン濃度は１０−”〜１０−’Ｍである。

連続的サンプル採取とサンプル中の糸状微生物の菌糸成長単位長さの算出との間 の時間間隔は、例えば発酵器のサイズ、用いる培養の形式すなわちバッチ式又は 連続式、ケモスタット又はタービドスタット、用いる特定の糸状微生物等のよう な要素によって決定される。連続的サンプルの間の通常の時間間隔は４時間〜２ ４時間の範囲内である。

ここに述べるようなカルシウムイオン濃度の調節は培養中の糸状微生物の比成長 率と成長収率（Ｇｒｏ＠ｔｈ　Ｙｉｅｌｄ）とにも影響を与える。比成長率は５ ｔｅｅｌｅ等、Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｇｅｎｅｒａｌ　ＭｉｃｒｏｂＬｏｌｏ ｇＶ、　９１＋　３６２−３６８　（１９７５）によって定義されるとおりであ る。成長収率は培養中に供給される炭素源（例えばスクロース）の単位量あたり の培養中に生産されるバイオマス量として定義される。

糸状微生物は好ましくは真菌類、特にフザリウム菌株、詳しくは１９７０年２月 ２６日に寄託されたフザリウム・グラミネアルム・シュワーベ（Ｆｕｓａｒｉｕ ＋＊肛阻膿訂憇Ｓｃｈｗａｂｅ）菌株Ｉ　Ｍ　Ｉ　１４５４２５と、１９７１年 １月１４日に寄託された１５４２０９〜１５４２１３　（これらの全ては１９７ ６年２月３日に公けに入手可能になった）又はこれらの菌株の変異体すなわち突 然変異株である。フザリウム・グラミネアルムのこれらの特定の菌株は英国特許 第１３４６０６１号（この開示はここに参考文献として関係する）に述べられて おり、ＣＡＢ　Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ　ＭｙｃｏｌｏｇｉｃａｌＩｕｓｔ ｉｔｕｔｅ　（Ｉ　Ｍ　Ｉ　）　（イングランド、サリー州、リッチモンド、キ ュー、フェリーレーン）に寄託されている。菌株１４５４２５はブタペスト条約 の下にＩＭＩ３４６７６２としても寄託され、又Ａ　Ｔ　ＣＣ２０３３４として も＾−ｅｒｉｃａｎ　Ｔｙｐｅ　ＣｕｌｔｕｒｅＣｏｌｌｅｃｔｉｏ口（米国メ リーランド州２０８５２．　ロックヴイル、パークローン　ドライブ１２３０１ ）に寄託されている。

本発明を下記実施例によって説明する。これらの実施例中では、微生物フザリウ ム・グラミネアルム・シュワーベ菌株Ｉ　Ｍ　Ｉ　１４５４２５を用いた。これ は土の上で４°Ｃに維持した。　Ｖｏｇｅｌの寒天培地（Ｈ，Ｊ、Ｖｃｇｅｌ、 　Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ　Ｇｅｎｅｔｉｃｓ　Ｂｕｌｌｅｔｉｎ。

１３、４２〜４４頁、　１９５６）上で７日間成長させた平板培養から蒸留水中 に胞子懸濁液を回収した。胞子懸Ｗａ液を２層のレンズ組織（ｌｅｎｓ　ｔｉｓ ｓｕｅ）（Ｗｈａｔｓａｎ）に通して濾過して、菌糸体バイオマスを除去し、胞 子を１５００　ｇにおける３分間の遠心分離２回、各遠心分離後蒸留水１０Ｉｒ ｉ中に再懸濁させることによって洗浄した。

フザリウム・グラミネアルム（Ｉ　Ｍ　Ｉ　１４５４２５）を、炭素源としてグ ルコースを含み、添加カルシウムを含まず、バッファー（ｐ）１６）として２− （Ｎ−モルホリノ）エタンスルホン酸（Ｍ　Ｅ　Ｓ　）　５０ｍＭを含む、２５ ０ｔｄ不フロス（ｒ＋ｅｐｈｌｏｓ）フラスコ中の２０ＩＩｉ量のＶｏｇｅｌ培 地中で成長させた。

各フラスコを１０−６胞子懸濁液０．２Ｈ１を加えてインキュベートし、２．５ ｃ１１ストロークの回転シューカー上で２０Ｏｒｐｍにおいて振とうした。

この培地の基底カルシウム濃度は３．５μＭ（３，５Ｘ　１０−”Ｍ）であった （原子吸収を用いた測定）。

実施例において、菌糸成長単位長さくＧ）は、成長培地に懸濁させ、顕微鏡スラ イドに塗布した菌糸体を用いて光学的に測定した。

Ｇ＝Ｌ／Ｔ 〔式中、Ｌ＝菌糸の全長、 Ｔ＝菌糸先端の数〕 によって定義される菌糸成長単位長さの各僅に対して、顕微鏡スライドを横切っ て移動するトランゼクトに沿って２５菌糸体フラグメントが測定された。５個以 上の先端を存する全てのフラグメントは、他のフラグメントと分離不能な程度に からまらないかぎり、測定された。

叉施別上 Ｃａ”イオン濃度が１０−９〜１０−７範囲内である、一連の実験を実施した。

このような濃度は０．５〜１５ｍＭのキレート他剤濃度が得られるように、フィ ルター殺菌した（０．２２μ麟、←ｈａ　ｔａ＋ａｎ）キレート化剤、エチレン グリコール−ビス（Ｂ−アミノエチルエーテル）　Ｎ、　Ｎ、　Ｎ’、Ｎ’−四 酢酸（ＥＧＴＡ）を培地に加えることによって得られた。

宜施例又 Ｃａ”イオン濃度が１０−７〜１０−’範囲内である、実施例１と同様な一連の 実験を実施した。このような濃度は種々な濃度のフィルター殺菌塩化カルシウム （ＣａＣ１□）を１−ＭＥＧＴＡ含有培地に加えることによって得られた。

Ｉ施班ｌ 遊＠Ｃａ’″濃度が１０−’〜１０−”Ｍである、実施例１及び２と同様な一連 の実験を実施した。このような濃度は培地に塩化カルシウムのみを加えることに よって得られた。

比成長率、消費された栄養素炭素から生産された細胞炭素への転化に関する成長 収率、菌糸成長単位長さ及び菌糸直径の値を各実験シリーズで測定し、表Ｉに３ ００μ閘未満の菌糸成長単位長さを有する生成物は良好な分校を示し、ある種の 食品にとって魅力的なテクスチャーを有する。

国際調査報告 国際調査報告 フロントページの続き （５１）　Ｉｎｔ、　Ｃ１，５識別記号　庁内整理番号Ｃｌ２Ｐ　２１１００　 Ａ　８２１４−４Ｂ／／ＣＣ１２Ｎ　１／３８ Ｃ１２Ｒ１ニア７） （Ｃ１２Ｐ　２１１００ Ｃ１２Ｒ１ニア７） （７２）発明者　ロブソン、ジョフレー・デーピッドイギリス国マンチェスター 　エム１６・８キユーダブリユー、ホレイ・レンジ、アソル・ロード　２７ Ｉ （７２）発明者　ウィーブ、マリリン・ゲイルイギリス国チェシャー　ニスケイ ４・４エヌエックス、ストックボート、ヒートン・ムーア、ヒートン・ムーア・ ロード　３８（７２）発明者　ネイラー、トーマス・ウィリアムイギリス国シー ・オブ・ダラム　ディーエル５・６アールエイ、ニュートン・エイクリフ、ヘイ ヒントン・ヴイレッジ、ウェスト・グリーン　６．ダフニ・ハウス

Claims (11)

【特許請求の範囲】
1. １．ｉ）糸状微生物を好気性条件下で炭素源及び他の必須栄養源を含有する培地 中で培養し； ｉｉ）菌糸の分枝形成の指標の検査、例えば前記糸状微生物の菌糸成長単位長さ の検査を行い；そして ｉｉｉ）前記培地のカルシウム含有量を調整して検査結果を望ましい範囲内に維 持することからなる、糸状微生物から蛋白質組成物を製造する方法。
2. ２．炭素源及び他の必須栄養源を含有する培地中であって、カルシウムイオンを １０−９〜１０−５モル、好ましくは１０−８〜１０−５モル含むことを特徴と する培地中で好気性条件下でフザリウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ）属の微生物を培養 することからなる、フザリウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ）属の糸状微生物から蛋白質 組成物を製造する方法。
3. ３．存在する細胞がカルシウムイオンの制限以外のいかなる栄養的制限も受けな い請求の範囲第１項又は第２項記載の方法。
4. ４．希釈率を調整することによって細胞の生長を制御し、前記方法を連続的に実 施する、請求の範囲第１項〜第３項のいずれか１項記載の方法。
5. ５．培養が連続的である請求の範囲第１項〜第４項のいずれか１項に記載の方法 。
6. ６．温度が２５℃〜３４℃の範囲である請求の範囲第１項〜第５項のいずれか１ 項に記載の方法。
7. ７．ｐＨが５．．〜８．０の範囲である請求の範囲第１項〜第６項のいずれか１ 項に記載の方法。
8. ８．栄養培地が、炭素源としてデンプン、デンプン加水分解生成物、グルコース 、スクロース若しくは加水分解されたスクロース、又はこれらの混合物を含む請 求の範囲第１項〜第７項のいずれか１項に記載の方法。
9. ９．キレート剤が存在する請求の範囲第１項〜第８項のいずれか１項に記載の方 法。
10. １０．微生物がフザリウム・グラミネアルム・シュワーべ（Ｆｕｓａｒｉｕｍｇ ｒａｍｉｎｅａｒｕｍＳｃｈｗａｂｅ）菌株ＩＭＩ１４５４２５及び１５４４２ ０９〜１５４２１３又は突然変異株又はそれらの誘導体のうちの少なくとも１種 である請求の範囲第１項〜第９項のいずれか１項に記載の方法。
11. １１．上記培養工程から得られた培養物を熱処理し、濾過し、食物製品用に適し た状態に調製する請求の範囲第１項〜第１０項のいずれか１項に記載の方法。