JPH06500011A - 形質転換された微生物によるメラニンの製造 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 形質転換された微生物によるメラニンの製造生物要約ポリマーのメラニンの製造 であるメラニン形成は菌類から哺乳類にわたるほとんどの門（ｐｈｙ　Ｉａ）に おいて天然の広範囲にわたる現象である。チロシナーゼ（Ｅ、Ｃ，１，１４，１ ８，１）はメラニン形成を触媒することで知られ、そして細菌、菌類、裸子植物 、被子植物、節足動物及びを索動物に存在している。羽、毛、眼、昆虫キューテ ィクル、果実及び種子において見い出せる黒色、茶色、淡黄色及びチンダルブル ー色素は通常メラニンであり、そしてチロシナーゼの作用に由来すると考えられ ている。この酵素は普遍的でない、即ちこれは原核生物においては比較的稀に見 い出され、種々の高等植物においては欠如しており、そして一般的に高等動物に おける皮膚の特定の細胞に限定されているが、内部組織、例えば原質、眼及び内 耳においても見い出せつる。メラニンは皮膚の光防御機能が知られているが、眼 及び内耳におけるその役割は知られていない。

哺乳類メラニンは２種類の化学分類；ニーメラニン（３，４−ジヒドロキシフェ ニルアラニン〔ドーパ〕酸化生成物に由来する茶色から黒色の色素）及びフェオ メラニン（システイニルドーパ酸化生成物由来の赤色から黄色の色素）に分けら れている。これらの色素の扱いにくい性質はその特徴付は及び定量化を困難にし ている。人間において、ニーメラニン及びフェオメラニンは均質混合物として存 在し、ニーメラニン対フェオメラニンの比は一般に決定されている。

メラニンの段階的生合成を図１に示す。ニー及びフェオメラニン形成の最初の二 段階はチロシナーゼのチロシンヒドロキシラーゼ（ＴＨ）及びドパオキシダーゼ （ＤＯ）活性によって触媒される。

ニー及びフェオメラニン形成は共にドーパキノンへと同一の経路を介して進む。

スルフヒドリル化合物の非存在下において、ニーメラニンが得られる。ドーパキ ノン及びその後の環化された中間体は一連の非酵素段階を経てニーメラニンを形 成せしめつる。ドーパキノンに至る反応は室温で自発的に進み、そして本来は制 御されていないと考えられている。ニーラミンまでの途中の後ドーパキノン反応 のうちのいくつかに関する速度定数Ｋが報告されている。

速度定数　Ｋ ドーパキノン　シクロドーパ　１３４Ｓ　−’（１）　Ｈ５，４）ドーパキノン ＋　ドーパクロム＋ シクロドーパ　ドーパ　１０”Ｓ　−’Ｍ　−’（ｐＨ７，７）ドーパクロム５ ，６−シヒトロキシイントル５，８×１Ｏ−ｓＳ−Ｉ（ｐＨ５，１）メラニン形 成の化学的制御は、反応媒体にとって固有な核試薬及び電子試薬による一般的な 酸−塩基触媒又は静電触媒の結果であると考えられている。より明白には、反応 媒体のイオン強度の変化がメラニン形成前駆体及び中間体の極性に影響を及ぼす ことによって触媒性を制御している。この反応媒体自体は、永久又は誘発化双極 子に影響を及ぼす溶媒−溶質相互作用を生じせしめつる。制御は、ｐＨにおける 変化が反応体又は媒体のイオン化の程度を変えるときも現れる。最後に、反応体 又は媒体の中での分子相互作用、例えば水素結合、二重化又はイオン対形成がメ ラニン形成を制御しつる。

以下の「メラニン要因」を、メラニンポリマーを定義、特徴付は又は定量しよう とする際に念頭に入れておかなければならない：１、　メラニン形成はメラニン を提供するだけでなく、いくつかのｒフランクロム」、例えば５，６−シヒドロ キシインドル、システイニルドーパ及びトリコクロムも提供する。

２　メラニンはより適切にはメラノタンパク質と呼ばれ、そして発色団に密接に 結合しているタンパク質断片より成る。

３、　メラニンは天然において粒子として存在していることが知られ、モして単 離手法はこのメラニン顆粒の性質を不可逆的に変えうることが実証されている。

４、　メラニンのアルカリ過酸化物処理は、メラニン遊離酸（ＭＦＡ）と呼ばれ る「可溶化」メラニンをもたらす。

５、　１００″Ｃ以上に熱すると、メラニンは容易に二酸化炭素を発生せしめる （この過程はポリマーの中に存在しているアリールカルボン酸残基の脱炭酸化と 考えられている）。

６、　メラニンはイオン交換特性を示し、これは色素の生物学的機能にとって重 要であると考えられている。

動物及び植物系から単離されたメラニンの物理学的、化学的及び生物学的特性を 考慮している報告を含む論文が豊富にある。しかしながら、報告されている単離 技術は不完全に考案されている。これらは化学的に苛酷であり、そしてメラニン の固有な反応性をほとんど考慮していない。以下の３例は論文に一般的に言及さ れているプロトコールを示す。

Ａ、　「・・・メラニン化菌類をＨＰメラノーマより集め、そして次にメラニン をテトラヒドロフラン（ＴＨＦ）でよく洗って不純物を抽出する。この段階にお いて、ＴＨＦは黄色に着色されている。次にこのサンプルを乾かし、そしてアル カリ溶液、例えばエチレンジアミン水溶液（３０／１００の容量比）及び／又は ＩＮのＮＨ，ＯＨ水溶液に溶かす。大量の１２ＮのＨＣＬ水溶液をこのメラニン 溶液に注ぎ入れ、次いてこれを３０時間煮沸し、そして沈降するように放置する 。沈殿したメラニンを集め、繰り返し洗い、次いで透析し、そして乾かす。

最後にメラニンをＴＨＦで繰り返し洗い、ＴＨＦが無色となるまでにし、次いで 乾かす。」　“Ｃｈｅｍｉｃｏ　−Ｐｈｙｓｉｃａｌ　ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ　 ｏｆ　Ｍｅｌａｎｉｎ（■）°より。

Ｂ、「遠心により集めた黒色の沈殿物をＩＩＨｃＩＯ中で室温で７日間放置する 。遠心後、このメラニンを１％のＨＣｌ、蒸留水、そして最後にアセトンでよく 洗うｏ　Ｊ　”Ｔｈｅ　５ｔｒｕｃｔｕｒｅ　ｏｆ　Ｍｅｌａｎｔｎｓ　ａｎｄ Ｍｅｌａｎｏｇｅｎｅｓｉｓ　（ＩＩ　）″より・Ｃ，ｒ眼を切開して虹彩、毛 様体及び網膜色素上皮を分ける。これらの画分をプールし、そして蒸留水に懸濁 し、次いでホモジネートする。このホモジネート品を４層のガーゼで濾過し、そ してこの濾液を等容量の濃ＨＣＩと混合して最終濃度６ＮのＨＣＩとする。この 混合物を２４時間攪拌し；この沈殿物を遠心により取り出し、６ＮのＨＣＩに再 懸濁し、そして４８時間還流させる。この沈殿物を水で４〜６回洗い、そして水 に懸濁する。」　Ｄｏ　ｔｈｅ　Ｍｅｌａｎｉｎｓ　ｆｒｏｍＢｌｕｅ　ａｎｄ 　Ｂｒｏｗｎ　Ｈｕｍａｎ　Ｅｙｅｓ　Ｄｉｆｆｅｒ’　Ｍｅｎｏｎ、　Ｉ　、 　Ａ、ら著、ＰｉｇｍｅｎｔＣｅｌｌ　１９８１．日本国仙台の第６回国際色素 細胞会議の会報、頁１７−２２　（１９８１）より。

以下に叙述するメラニンの仮説的構造は、この５０年間にわたる莫大な数のグル ープの研究を組入れている。参考のため３　ｗａｎ、　Ｇ、　Ａ。

のＦｏｒｔｓｃｈｒｉｆｆｅ　ｏｆ　Ｃｈｅｍ　、Ｏｒｇ、　Ｎａｔｕｒｓｔ、 　ｘ　ｘ　ｘ　１．５５２．　（１９７４）　；Ｐｒｏｔｏ、　Ｇ、のＭｅｄｉ ｃａｌ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　Ｒｅｖｉｅｗｓ　８　、５２５　（１９８８）　： 及びＩｔｏ、　Ｓ、　Ｂｉｏｃｈｉｍ、　Ｂｉｏｐｈｙｓ、　Ａｃｔａ　８８３ ．１５５　（１９８６）を参照のこと。

メラニンの研究は生合成の数の多くの経路の発見及び更にはメラニンは関連する 広範囲にわたる種々の化学物質の発見をもたらした。

菌類メラニンは壁結合メラニン及び細胞外メラニンとして見い出されている。メ ラニン化菌類のほとんとの菌糸、分生子及び菌核の壁は二枚の異なる層、即ち、 電子半透明な内層及び電子−密集顆粒を含む外層を有することか明らかとなって いる。集められた証拠は、これらの顆粒がメラニンであることを示している。Ｗ ｈｅｅｌｅｒ、ＩＪ、　Ｈ。

らεＸｐＭｙｃｏ１．３　、３４０　（１９７９）。細胞外メラニンは細胞壁か ら離れて合成される。これらは二つのメカニズム、即ち（ａ）媒体の中へと分泌 されるフェノールオキシダーゼ（時折りフェニルオキシダーゼと呼ばれる）によ るフェノール顕化合物の酸化、及び（ｂ）自己酸化により、又は自己溶解中に放 出される酵素のいづれかによる、媒体の中へと分泌されるフェノール類の酸化に よってフェノールから合成される。Ｗｈｅｅｌｅｒ、　Ｍ、　Ｈ，らのＣａｎ　 Ｊ、　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ　、２４．２８９（１９７８）。

チロシナーゼを分泌する菌類又は細菌はまわりの媒体の脱色を引き起こす。この 脱色はチロシンを媒体に付加することによって増強されうる。Ｈｏ１ｌｉｓ、　 Ｊ、　Ｐ、のＰｈｙｔｏｐａｔｈｏｌｏｇｙ　４２．２７３　（１９５２）　； Ｎｕｒｕｄｅｅｎ、　Ｔ、　Ａ、らのＪ、　Ｃｌ１ｎ、　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、 　１０．７２４　（１９７９）。細胞外メラニンはアクチノマイセテス（Ａｃｔ ｉｎｏｍｙｃｅｔｅｓ）、　１Ｎ菌及び菌類において見られる。細胞外チロシナ ーゼの製造又は分泌をコントロールする遺伝子はステレブトマミセス　スカビエ ス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓｓｃａｂｉｅｓ）［Ｇｒｅｇｏｒｙ、　Ｋ、　Ｆ 、らＪ、　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、　８７．１２８７　（１９６９）］及びリゾビ ウム　フｘ−ズオリ（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ　ｐｈａｓｅｏｌｉ）株１２３３　Ｅ Ｂｅｙｎｏｎ。

Ｊ、　Ｌ、ら、Ｊ、　Ｇｅｎ　Ｍｉｃｒｏｆ＋ｉｏ１．１２０．４２１　（１９ ８０）］におけるプラスミド上で見い出されている。ビブリオ　コレラ（Ｖｉｂ ｒｉｏ　ｃｈｏｌｅｒａｅ）におけるチロシナーゼ遺伝子は染色体上にある。Ｂ ｅ１ｌ　Ａ、　Ａ、らＡｎｎ。

Ｒｅｖ、　Ｐｈｙｔｏｐａｔｈｏｌ、２４．４１１　（１９８６）。

あるメラニン経路において、ニーメラニンの合成はチロシンによって仲介され、 これはこの生合成における最初の２段階を触媒せしめることが一般的に認められ ている。この初期反応はチロシンのヒドロキシル化を含んでいる。酸素原子がチ ロシンのヒドロキシル基の隣に取り込まれ、３．４−ジヒドロキシフェニルアラ ニン（ＤＯＰＡ）が作られる。次にチロシナーゼはＤＯＰＡからドーパキノンへ の変換を触媒する。生成されるドーパキノンは生理学的なｐＨでは安定でない。

［１１１のアミノ基は環化してシクロドーパをもたらし、次いでこれは赤色化合 物ドーパクロムへと直ちに酸化される。次の段階は５゜６−ジヒドロキシインド ール（ＤＩ（０をもたらすための転移及び脱炭酸化であるか、又は脱炭酸化を伴 わないで５．６−シヒドロキシインドールー２−カルボン酸（ＤＨＩＣＡ）をも たらすことである。ニーラミンはドーパキノン、ドーバクａム、ＤＨ【及びＤＨ ｒＣＡ又はそれらの組合せの重合により生成される。これらは動物における茶色 色素を生成する。Ｍａｓｏｎ、　Ｈ，Ｓ、、　Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ、　 １７２．　８３　（１９４８）　；及びＰａｗｅｌｅｋ、　Ｊ、　Ｍ、らＡｍ、 　Ｓｃｉ、　７０．１３６　（１９８２）。Ｃｒ１ｐｐａら、ＴｈｅＡｌｋａｌ ｏｉｄｓ　３６　、２５３　（１９８９）、Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ　Ｎ 、　Ｙ、、　Ｎ、　Ｙ、。

動物の赤色、茶色及び黄色色素であるフェオメラニンはシステイニルＤＯＰＡ混 合物のポリマーであり、これはシスティンとチロシンの混合物に由来する。Ｆｉ ｔｚｐａｔｒｊｃｋ、　Ｔ、　Ｂ、らの、Ｂｉｏｌｏｇｙ　ａｎｄ　Ｄｉｓｅａ −ｓｅｓ　ｏｆ　Ｄｅｒｍａｌ　Ｐｉｇｒｎｅｎｔａｔｉｏｎ、頁３、東京大学 出版、東京。トリクロムもメラニンとともに分類され、なぜならそれらは黄色、 赤色及び紫色の色素であり、そしてチロシンの酸化に由来するからである。

窒素を微量に又は全く含まないアロメラニンはフェノール系前駆体、主としてカ テコール及び１，８ジヒドロキシナフタレンから生成される。

チロシナーゼだけがメラニンを製造する酵素ではない。菌類の外壁において見い 出されている酵素、ラッカーゼはＤＯＰＡの酸化にとって重要である。ラッカー ゼはチロシンを容易には酸化しないであろう。Ｓｉｍｏｎ、　Ｌ、　Ｔ、ら、Ｊ 、　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、　１３７．５３７　（１９７９）　、色素製造器官に 存在するその他の酵素はクリプトコツカス　ネオホルマン（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃ ｃｕｓ　ｎｅｏｆｏｒｍａｎ）のフェニルオキシダーゼ、並びにカテコール　オ キシダーゼ及び植物のその他のポリフェノール　オキシダーゼである。Ｍｏｙｅ ｒ、　Ａ、　Ｍ、ら、Ｐｈｙｔｏｃｈｅｍ、　１８．１９３　（１９７９）。

γ−グルタミニルー３，４−ヒドロキシベンゼン（ＧＤＨＢ）メラニンは、アガ リカス　ビスポラス（Ａｇａｒｉｃｕｓ　ｂｉｓｐｏｒｕｓ）におけるチロシナ ーゼのその作用によって、γ−グルタミニルー４−ヒドロキシベンゼン（ＧＨＢ ）から合成される。Ｈｅｇｎａｕｅｒ、　Ｈら、Ｅｘｐ、　Ｍｙｃｏｌ、９゜２ ２１０ウステイラゴ　メイデイス（Ｕｓｔｉｌａｇｏ　ｍａｙｄｉｓ）はカテコ ールをメラニンへと代謝せしめるものと考えられている。Ｕ、メイデスの冬胞子 （Ｔｅｌｅｏｓｐｏｒｅ）は、０，０４で固定した際に、高電子密度のメラニン を提供する。Ｐａｔｇｉｅｔｅｒ、　Ｈ，Ｊ、ら、Ｊ、　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、 ９１゜１５２６　（１９６６）。

１、　８−ジヒドロキシナフタレン（ＤＨＮ）メラニンの生合成はペンタケチド より提供される。種々の中間体が生じ、その中にはｌ、３゜６．８−テトラヒド ロキシナフタレン、シタローン、１．　３．　８−トリヒドロキシルナフタレン 、バーメローン（ｖｅｒｍｅｌｏｎｅ）、ジヒドロキシナフタレン、ジヒドロキ シナフタレンｌ、ｌ−ダイマー及びジヒドロキシナフタレン２．２−ダイマーが 含まれる。突然変異はりダクターゼ又はデヒドラターゼ酵素の排除をブロックし 、そして酵素阻害剤、例えばトリジクラゾールは大量の迂回産物の発生を起こさ せる。Ｗｈｅｅｌｅｒ、　Ｍ、　Ｈ，ら、Ａｒｃｈ、　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、　 １４２．２３４　（１９８５）　；及び５ｔｉｐａｎｏｖｉｃ、　Ｒ，Ｄ、ら、 Ｐｅ５ｔｉｃ、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、　Ｐｈｙｓｉｏｌ、ｌ　３゜１９８　（１９ ８０）。

培養条件は種々の微生物の間で変わる。ある微生物における細胞外メラニンの製 造は、チロシンの濃度がその飽和点であるＯ、　１％にまで上昇するに従って増 大することが示されている。このパーセンテージはチロシンにおいて超飽和であ ると考えられている。Ｈｏ１ｌｉｓ。

Ｊ、　Ｐ、　（１９５２）、前記。酵母自己分解物及びカゼイン加水分解物は、 ０．１％のチロシンを含む培地の中でのステレブトマイシス　スキャＨｏ１ｌｉ ｓ、　Ｊ、　Ｐ、（１９５２）、前記。

メラニンの製造は種々の炭素源により抑制されることも示されている。特定の炭 素源は微生物によって異なる。Ｎｕｒｕｄｅｅｎ、　Ｔ、　Ａ、　ら（１９７９ ）、前記は、培地の中でのグルコースの濃度の増大は全ての血清型のクリプトコ ツカス　ネオホルマンの色素沈着を引き下げるこ素を製造する。Ｃ，ネオホルマ ンのフェニルオキシダーゼはチロシに、色素製造細菌であるグルコノバクタ−オ キシダン（Ｇｌｕｃｏｎｏ−ｂａｃｔｅｒ　ｏｘｙｄａｎｓ）はグルコース及び チロシンの存在下においてメラニンを製造するが、炭素源としてスクロース、フ ルクトース、ツルＰａｖｌｅｎｋｏ、　Ｇ、　Ｖ、ら、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇ ｙ　ＵＳＳＲ５０、５３９（１９８１）。

数種の菌類が細胞外外来性メラニンを製造することで知られてい質、炭水化物及 び脂質に由来する。合成は培地の中へのチロシナーゼの分泌を必要とする。

ストレプトミセス属の数多くの種が、ｍｅｌ遺伝子座がらのチロシＢｅｒｎａｎ 、　Ｖ、らＧｅｎｅ　３７．１０１　（＋９８５））　、そして推定ＯＲＦ　４ ３８タンパク質（Ｍ　ｒ　＝　１４．７５４）及びチロシナーゼ（Ｍ　ｒ　＝　 ３０．６１２）をコードする解放解読枠（０ＲＦ）を含むことが示されている。

ＯＲＦ　４３８及びチロシナーゼはＳ、アンチビオチカスの中で同一のプロモー ターによって転写されるものと考えられ、そしてこの両方の遺伝子はメラニン製 造にとって必要である。Ｂｅｒｎａｎ、　Ｖ、ら（１９８５）前記。遺伝子的証 拠に基づき、ＯＲＦ　４３８タンパク質はチロシナーゼのトランス作用与してい るか、又は銅をアポチロシナーゼに運搬するメタロチオネイン様タンパク質とし て働きうるちのと考えられている。Ｂｅｒｎａｎ。

■、ら、（１９８５）前記；　Ｌｅｅ、　Ｙ、　−Ｈ，Ｗ、ら（１９８８）前記 。Ｓ、ゲラウセセンス（Ｓ　、　ｇｌａｕｃｅｓｃｅｎｓ）のｍｅｌ配座はチロ シナーゼの上流にほぼ同一のＯＲＦ配列を有し、それはおそらく類似の機能とし て働くであろう。Ｈｕｂｅｒ、　Ｍ、らＢｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　２４６０３ ８　（１９８５）　；　Ｈｕｂｅｒ、　Ｍ。

らＮｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、ｌ　５８１０６　（１９８７）。しか しながら、０ＲＦ４３８タンパク質の存在は生体内では確認されていない。

天然のＥ、コリはチロシナーゼ遺伝子を育さず、且つメラニンを製造しない。ス トレプトミセス　リビダンス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｌ１ｖｉ−ｄｏｎｓ ）のチロシナーゼ遺伝子をコードするプラスミドｐ［Ｊ７０３のＢｃｌｒフラグ メントがプラスミドＹＥｐ１３の中のＢａｍ８１部位にクローンされており、そ してＥ、コリ（Ｅ、ｃｏｌｉ）　ＨＢＩＯＩの中に形質転換されている。検出可 能なチロシナーゼの発現又はメラニンの発現は認められていない。Ｎａｙａｋ、 　Ｋ、ら、Ｉｎｄｉａｎ　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ＆ 　Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃｓ　２５．５１５　（１９８８）。

Ｋｗｏｎの承認された米国特許第４．８９８．８１４号はヒトチロシナーゼのｃ ＤＮＡクローンを開示し、そしてＥ、コリの中でのｃＤＮＡの発現にょるヒトチ ロシナーゼの作成の方法を請求の範囲としている。

グラム陰性海洋細菌であるシエワネラコルウェリアナ（Ｓｈｅｗａｎｅ−１１ａ 　ｃｏｌｗｅｌｌｉａｎａ）におけるメラニンの製造は、粗抽出物の中のＬ−Ｄ ＯＰＡ合成物を測定することによって分析されている。メラニン合成物をコード する領域は地図化され且つシーケンス化されている。

−組の解放解読枠（０ＲＦ）が見つけられている。一方のＯＲＦはチロシナーゼ 遺伝子に相当することが見い出されている。下流のＯＲＦは未知の機能のポリペ プチドをコードする。下流ＯＲＦの欠失は、チロシナーゼ遺伝子によって形質転 換せしめたＥ、コリにおける色素沈着に何ら効果を及ぼさないことが見い出され ている。Ｆｕｑｕａ、　Ｗ、ら、Ａｂｓｔｒａｃｔ、　Ａｍｅｒｉｃａｎ　５ｏ ｃｉｅｔｙ　ｆｏｒ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ　Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ、　Ｄ 、　Ｃ。

Ｂｒａｎｃｈ　ｏｆ　Ｇｅｏｒｇｅ　Ｍａｓｏｎ　ＩＪｎｉｖｅｒｓｉｔｙ　（ １９９０）。

発明の概要 本発明はメラニン、その前駆体及びその類似体（以降、メラニンとして一般的に 呼ぶ）を製造するためのプロセスに関する。本発明により、メラニンは培地１リ ットル当り乾燥重量的０．２グラム以上の量において製造される。メラニンの高 められた製造は、増殖培地の組成を操作することにより、及び／又は発酵条件を 希薄化することにより、及び／又は微生物と遺伝子操作にかけることにより、及 び／又はメラニンを製造するよう突然変異誘発することによって達成されうる。

メラニンを製造する微生物は、それが由来する微生物について当業界において知 られる種々の培地の中で一般に増殖するであろう。しかしなから、増殖培地は、 メラニンの生産性を高めるため、又はメラニン前駆体もしくは誘導体の生産を誘 発するため、及び／又はメラニンの生産に陰性的な影響を及ぼす要因を欠損せし めるための特定の要因の付加によって高められつる。更に、微生物によって製造 されたメラニンの組成は、その増殖培地の中へと導入された前駆体によってコン トロールされうる。

適切なる微生物は当業界における数多くの常法による突然変異誘発及び／又は形 質転換によって製造される。突然変異誘発は数多くの方法によって行われ、それ には例えば輻射及び突然変異誘発化学物質への暴露が含まれる。メラニン前駆体 の変換を触媒する酵素、及び所望の宿主の中での発現のための適当なプロモータ ーをコードする遺伝子を含むベクターが、メラニンを製造しないか、又は商業的 に不満足な量においてメラニンを製造するいづれかの微生物を形質転換させるた めに用いられる。

（ｐＢＧＣ６２０，３）を含むＥ、コリ発現プラスミド。アンピシリン耐性遺伝 子（ＡＭＰ）、Ｔ７プロモーター（Ｔ７）およびリポソーム結合部位（ＲＢＳＩ およびＲＢＳ２）がボックス内に示されている。チロシナーゼ（ｐＢＧｃ６１９ ）または０ＲＦ４３８　（ｐＢＧＣ６２０，３）の最初の７つのコドン（大文字 ）を経たＲＢＳＩ　（下線）からのベクター配列は、５　’　−ａａｇｇａｇａ ｔａｔａｃａｔＡＴＧＧＣＴＡＧＡＡＴＴＧＣＣＡＴＧＧＣＣ−３’である。チ ロシナーゼ（ｐＢＧＣ６２０、３）のＡＴＣ開始コドンを経たＲＢ２　（下線） からのＳ、アンチバイＥ、コリ細胞の５ＤＳ−ＰＡＧＥ、（Ａ　）リファンピシ ンの存在下で生体内で合成されたタンパク質の（”Ｓ）メチオニンオートラジオ グラフ（レーン１、ｐ８Ｇｃ６２９　、レーン２、ｐＴ７−７ブクタ一対照；レ ーン３、ｐＢＧｃ６２０．２　；レーン４、ｐＢＧｃ６２０．３　）。図示した フィルムは２時間露出である。（Ｂ）クーマシーブルー染色ゲル（レーンｌ、ｐ Ｔ７−７ベクタ一対照；　レーン２、ｐＢＧｃ６１９　；　レ−ン３、ｐａｃｅ ６２０．２　；レーン４、ｐＢＧｃ６２０．３）。分子量マーカーの位１ｔ（ｋ Ｄ）が左側に、そしてチロシナーゼ（ｔｙｒ）と０ＲＦ４３８（ｏｒｆ）の位置 が右側に示されている。

ｐＢｓ１０２４．　ｐＢｓ１０２５およびｐＢＳ１０２６）の遺伝子作製プロト コール。

［Ｎ７．チロシナーゼおよび０ＲＦ４３８を生産する形質転換Ｅ、コリ細胞の５ ＤＳ−ＰＡＧＥ。

本発明は、メラニン、並びにメラニン、それらの前駆体およびそれらの誘導体（ 以後総称的にメラニンと呼ぶ）の生産方法に向けられる。本発明によれば、増殖 培地ＩＩ！あたり約０．２　ｇより多い乾燥重量においてメラニンが生産される 。この増強されたメラニン生産は、増殖培地の構成を操作することにより、そし て／または醗酵条件を弱めることにより、そして／または微生物を遺伝子操作す ることにより、そして／またはメラニンを生産させるための突然変異誘発により 、達成することができる。本発明は、（ａ）微生物を形質転換せしめてチロシナ ーゼおよび／またはメラニンの生産能力または増強された生産能力を有する微生 物を製造することができる、遺伝子、プロモーター、シグナル配列および調節配 列：　（ｂ）メラニンの生産能力または増強された生産能力を有する微生物：　 （Ｃ）微生物を用いたメラニンの生産方法：　（ｄ）’微生物の培養物からのメ ラニンの単離方法；　（ｅ）増殖培地１１あたり約０．２ｇより多い乾燥重量に おいてメラニンを生産することができる増殖培地および培養条件、を包含する。

明細書および請求の範囲の明確且つ一貫した理解（用語に与えられる範囲を含む ）を与えるため、次の定義を提供する。

メラニン：メラニンは反応性中間体の重合により生産される重合体である。その 重合機構としては、自動酸化、酵素触媒酸化およびラジカル開始重合が挙げられ るが、それらに限定されない。反応性中間体は前駆体から化学的にまたは酵素的 に生産される。適当な酵素としては、ペルオキシダーゼおよびカタラーゼ、ポリ フェノールオキシダーゼ、チロシナーゼ、チロシンヒドロキシラーゼまたはラッ カーゼが挙げられるが、それらに限定されない。反応性中間体に変換される前駆 体はヒドロキシル化芳香族化合物である。適当なヒドロキシル化芳香族化合物と しては、１）芳香族または多環式芳香族炭化水素のフェノール、ポリフェノール 、アミノフェノールおよびチオフェノール（例えばフェノール、千ロジン、ピロ ガロール、３−アミノチロシン、チオフェノールおよびα−ナフトールであるが それらに限定されない）：２）芳香族複素環式または多複素環式炭化水素のフェ ノール、ポリフェノール、アミノフェノールおよびチオフェノール（例えば２− ヒドロキシピロール、４−ヒドロキシ−１，２−ピラゾール、４−ヒドロキシピ リジン、８−ヒドロキシキノリンおよび４．５−ジヒドロキシベンゾチアゾール であるがそれらに限定されない）が挙げられるが、それらに限定されない。

活性化物質タンパク質；酵素の活性および／またはメラニン形成を変更、活性化 または増強する遺伝子産物。それは、トランス活性化因子として、アポ酵素にイ オンを輸送するメタロチオネイン様タンパク質として、または細胞からの酵素の 分泌において機能し得る。

例えば、０ＲＦ４３８遺伝子およびチロシナーゼコード配列の３′側のＯＲＦは 、記載の方法の全てにおいてメラニン形成を増強する活性化物質タンパク質をコ ードする。

メラニンを生産する微生物は自然界に広く分布している。例としては、ストレプ トミセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ＞、リゾビウム（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）、 アガリカス（Ａｇａｒｉｃｕｓ）、ウスチラゴ（Ｕｓｔｉｌａｇｏ）、クリプト コツカス（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）、グルコノバクタ−（Ｇｌｕｃｏｎｏｂ ａｃｔｅｒ）　、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）　、キサントモナ ス（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ）　、コクリオボラス（Ｃｏｃｈｌｉｏｂｏｌｕｓ ）、プレオスポーラ（Ｐｌｅｏｓｐｏｒａ）　、アルターナリア（Ａｌｔｅｒｎ ａｒｉａ）、アウロバシジウム（Ａｕｒｏｂａｓｉｄｉｕｍ）、ボトリチス（Ｂ ｏｔｒｙｔｉｓ）、クラドスポリウム（Ｃｌａｄｏｓｏｒｉｕｍ）　、ジブロブ イア伊とｐｌｏｃｆｉａ）　、スクレロチウム（Ｓｃｌｅｒｏｔｉｕｍ）、ベル チシリウム（Ｖｅｒｔｉｃ−ｉｌｌｉｕｍ）　、ユーロチウム（Ｅｕｒｏｔ　ｉ ｕｍ）、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉ　ｆｌｕｓ）、スタキボトリス（Ｓｔ ａｃｈｙｂｏｔｒｙｓ）、ヘンダーソヌラ（Ｈｅｎｄｅｒｓｏｎｕ　ｌａ）、ス トレプトベルチシリウム（Ｓｔｒｅｐｔｏｖｅｒｔｉｃｉｌｌｉｕｍ）およびミ クロ％ノスポーラ（Ｍｉｃｒｏｍｏｎｏｓｐｏｒａ）が挙げられるが、それらに 限定されない。

数種の微生物は、遺伝子操作してメラニンを生産できるようにすることができる 。そのような微生物としては、ストレプトミセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ） 、エスチェリシア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）　、ｔ＜シラス」−ｃｉｌｌｕｓ ）　、ストレプトコッカス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）　、サルモネラ（Ｓ ａｌｍｏｎｅｌｌａ）、スタフ４０コツカス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ） およびビブリオ（Ｖｉｂｒｉｏ）が挙げられるが、それらに限定されない。

細胞外メラニン並びにそれらの誘導体および前駆体は、それらが合成された培地 から容易に取り出せるため、微生物中での工業顔料生産が可能である。

メラニンまたはメラニン類似体を生産する微生物は改変によって増大させること ができる。一般的改変としては、プラスミド挿入および突然変異が挙げられる。

突然変異は当業界で常用される様々な手段によって達成される。微生物を紫外線 もしくはガンマ線照射または変異原性化学物質に暴露することができる。

上述したように、本発明は、培地１１あたり約０．２グラムより多量、特に約０ ．５グラムより多量、好ましくは約１．０グラムより多量、最も好ましくは約２ ．０グラムより多量における、増強されたメラニン生産に向けられる。この増強 は、微生物の増殖条件、例えば培地の構成の変更または醗酵の弱化により、およ び／または遺伝子操作および／または突然変異により、達成することができる。

Ａ、増殖条件 使用する培地の基本組成は多数の考慮すべき事項に依存する。培地は通常、メラ ニン生産用に増殖させる微生物に類似した微生物を増殖させるための当業界で既 知である培地から選択される。様々な炭素源および窒素源が利用可能でありそし て相互に交換可能である。

増殖を増強するために、微生物の特定の要求を考慮し且つそれらの要求に応じる 。例えば、微生物は特定のアミノ酸の存在を要求することがある。全ての微生物 は金属イオン、例えば銅やマンガンイオンを要求するが、それらの濃度条件にお いて異なる。微生物は成る種の代謝産物の存在によって阻害される。阻害は微生 物ごとに広範に異なる。

微生物の代謝的要求に加えて、メラニン生産を増強するために利用可能である基 質を考慮すべきである。前駆体の存在が、メラニンの生産量を増加させるかまた は生産されるメラニンの組成を変更してその色もしくは分子量を変えることがあ り、または他の望ましい生産物の生産をもたらすことがある。チロシナーゼは銅 を要求する。

従って、培地を毒性化することなく該酵素の補因子として働くのに十分な濃度で 微量金属が存在しなければならない。

醗酵培地の温度は微生物の最適増殖にとって重要である。典型的な土壌微生物は 約１０３〜約３０°Ｃにおいて良好に増殖するが、一方Ｅ、コリは３７℃で最適 に増殖し、そして高熱性微生物は５０℃付近およびそれより高温で最も良く増殖 する。

培地のｐＨは通常６．８〜７．２に維持される。同じく微生物の要件を提供する 緩衝剤がしばしば選択される。培地のｐＨを維持するのを助けるためにしばしば リン酸緩衝液が使われる。

酸化的微生物は通気を要求する。小さい容器中では攪拌または振盪で十分である 。大きい醗酵容器では、酸素を系中に散布させ、そして羽根車が最適な溶解酸素 レベルを与えるのに十分な速度で培地を攪拌する。最適な溶解酸素レベルはある 種の微生物について２０〜９０％付近であろう。

メラニンの生産を増強する１つの手段は、増殖培地の変更によるものである。本 出願人は、幾つかの要因を変更してメラニン生産を大きく増加させることができ ることを発見した。第一の要因は醗酵条件を弱めることである。これは、培養さ れる微生物に対する酸素利用可能性を高レベルに維持することによって達成され る。利用可能な酸素が低レベルであったりまたは攪拌の程度が低かったりした場 合、メラニンの収量は減少する。第二の要因は、適当な基質の存在、例えばチロ シンを含むカゼイン氷解物またはカゼインペプトンの存在である。それらの基質 のいずれかがメラニン生産にとってカザミノ酸よりも優れていることが発見され た。第三の要因は前駆体の存在である。１．６ｇ／ｌの千ロジン濃度で最高の収 量が得られることがわかった。第四の要因は、リプレッサーとして作用する炭水 化物または他の物質を培地から削除することである。

メラニンの生産を調節または増強する第二の手段は、活性化因子および／または 他のＤＮＡ調節配列、例えばチロシナーゼ遺伝子の３′調節配列を含めることで ある。後述するように、ｐ［Ｊ７０２からのｍｅｔ遺伝子座は、活性化因子コー ド配列とチロシナーゼコード配列を含む。３′調節配列はＳ、アンチビオチカス （Ｓ、ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｕｓ）株由来のｍｅｔ領域を含むＥ、コリ中でのメ ラニン生産を調節するのにも有用であった。

一般に、微生物の培養物を上記の選択した培地中で増殖させて、所望のレベルの メラニンを生産させる。メラニン生産は、様々な時間間隔で、４００　ｎｍにお いて（ＯＤ、。。）無細胞培地の光学濃度（ＯＤ）を測定することによって観察 される。ＯＤ　＜。。はメラニンの収量に正比例する。ＯＤ、。。をモニタリン グし、そしてＯＤが平らになった時、培地を収集する。メラニンを生産するＥ、 コリ培養物では、ＯＤを６０ＯｎＩｎで読んだ。

Ｓ、リビダンス（Ｓ、　１ｉｖｉｄａｎｓ）　ＴＫ　６４　（ｐ［Ｊ７０２）を 増殖させる培地を変更することにより、メラニン生産の大きな増加を達成するこ とができる。メラニン経路の代謝リプレッサーを欠く培地を考案することにより 、メラニン生産を固定容積のバイオリアクター中で約１００ｍｇ　／　１から約 ４．０ｇ／Ｉ！またはそれ以上に増加できることが有益にも発見された。遺伝子 変更されたＥ、コリを使ったメラニンの生産レベルも同様である。

本発明は、窒素源を１または複数のメラニン前駆体豊富にした増殖培地を包含す る。更に該培地はグルコースを欠いている。カゼイン氷解物またはカザミノ酸を 使ったよりもカゼインペプトンを使った方がより高いメラニン生産が達成される ことがわかった。培地からグルコースを除去することによりストレプトミセス・ リビダンス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｒｉｖｉｄａｎｓ）中でのチロシナー ゼ生産が増強されることも発見された。この効果には少なくとも２つの説明が可 能であるが、本出願人はこれらの説明には縛られない。グルコースはＳ、リビダ ンスにとって好ましい炭素源およびエネルギー源であるかもしれない。可能な説 明は、グルコースがメラニン生産の生化学経路においてチロシナーゼまたは他の 成る酵素の代謝的阻害剤であるというものである。

ストレプトミセス株を使ってメラニンを生産する場合、約１０３〜約１０７、好 ましくは約１０’〜約１０＠個の胞子／−の接種材料が高いメラニン収量をもた らす。加えて、約２４〜４８時間齢の中間対数期にある出発培養物を、１０％容 積まで醗酵容器に添加することができる。寒天指示プレート〔指示プレートにＣ ｕ５Ｏａ　・５Ｈ２０（０，２ｍＭ）とＬ−チロシン（０，３ｇ＃）を補足した 〕上でのメラニン生産のためには、コロニーを３０℃で一晩増殖させ、次いで４ ２°Ｃで１時間させ、そして可視色素形成を考慮した３０℃での追加の増殖（３ 時間または一晩）を行った。液体培養におけるメラニン生産の場合、−晩培養物 （３０°Ｃ）を新鮮なＬＢ培地中に１：５０希釈し、３０°Ｃで５時間増殖させ 、４２°Ｃの振盪水浴に３０分間移し、次いで継続した一晩増殖のため３０℃に 戻した。液体培養におけるメラニン生産もＣｕＳＯ４・５Ｈ２０とＬ−チロシン を要求した。

メラニン（メラニン類似体を含む）を生産することに加えて、微生物の培養はチ ロシナーゼおよび関連ＯＲＦのタンパク質生産物をもたらす。培養する微生物に 依存して、チロシナーゼは細胞内もしくは細胞周辺腔内に見つかるか、または培 地中に排出され得る。チロシナーゼの生産は、チロシナーゼおよび関連する０１ ２Ｆ生産物それ自体の回収、または酵素バイオリアクターもしくは細胞バイオリ アクターといったバイオリアクター中で利用されるチロシナーゼおよび関連する ＯＲＦ生産物を含む微生物、特にＥ、コリ、の回収を可能にする。次いで、メラ ニン前駆体から反応性中間体を製造することが可能であり、それはまた別の効用 を見出すことができる。

メラニンおよびメラニン類似体が生産されるような様々な前駆体を増殖培地に添 加することによってメラニンの組成を変えることができる。外因性前駆体を培地 に添加するとメラニン類似体が生産される。研究者らにより下記に挙げられるよ うな（ただし限定ではない）適当な前駆体が発見されている： ■−システィンエチルエステル　３−ニトロ−Ｌ−チロシン３−フルロ−ＤＬ− チロシン　３−メトキシ−し−チロシンし一プロリン　（±）−シネフリン ＤＬ−ｍ−チロシン　３−ヨード−Ｌ−チロシン３．４−ジヒドロキシ桂皮酸　 グリシル−し−チロシンＬ−３，４−ＤＯＰＡメチルエステル　ＤＬ−オフドパ ミン４−ヒドロキシインドール　チラミン Ｌ−システィン　Ｌ−メチオニン ５．６−ジメト牛ジインドール　（−）−アルテレノールＤ−ＤＯＰＡ　５−ヒ ドロキシトリプタミンし一チロシンエチルエステル　硫酸プロタミンＬ−チロシ ン　Ｌ−ＤＯＰＡ および前駆体の組合せ。

それらの前駆体の利用を通して、メラニンの化学的性質並びにメラニンの色（赤 、青、緑、黒、茶、橙、紫および黄色を含むがそれらに限定されない）を変える ことが可能である。その上、培地に例えば金属イオンを加えることにより、様々 な色のメラニンを生産することができる。

Ｂ、遺伝子操作 下記の記載を考慮して当業界で公知の技術を使って、本発明のキメラ遺伝子およ びベクターが作製されそして微生物を形質転換するのに使われる。適当な技術は Ｍａｎｉａｔｉｓ、　Ｔら、Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ。

第１版、Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、　Ｎ ｅｗ　Ｙｏｒｋ　（１９８２）　；ｉｏｏ巻（１９８３）、第１０１巻（１９８ ３）、第１１８巻（１９８６）および第１５２−Ｓ、　Ｂ、他纏、　Ｋｌｕｗｅ ｒ　Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ、　Ｄｏｄｒｅｃｈｔ　（１９８ ８）中に（１９７２）並びに前に挙げた参考文献中に記載されている。Ｈｏｐｅ ｗｏｏｄ。

Ｄ、　Ａ、ら、”Ｇｅｎｅｔｉｃ　Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｓｔｒｅ ｐｔｏｍｙｃｅｓ　：　Ａ　Ｌａｂｏｒａ−ｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ”、　Ｔｈ ｅ　Ｊｏｈｎ　Ｉｎｎｅｓ　Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ、　Ｎｏｒｗｉｃｈ、　Ｅｎ ｇｌａｎｄ（１９８５）。

当業界で常用される様々な方法のいずれかにより、任意の源からＤＮＡ断片を単 離しそして調製することができる。例えば、ＤＮＡ配列は、ゲノムクローンの遺 伝子バンクからまたは単離した染色体ＤＮＡから直接単離することができる。制 限エンドヌクレアーゼは、制御され、倍位特異的で且つ予想可能な様式で、ＤＮ Ａを消化、分析および制限することを可能にするため、有用である。例えばＥＣ ＯＲＩによる消化から得られるＤＮＡ配列は、プラスミドＤＮＡ中のＥｃｏＲＩ 認識部位のところの開口部にぴったり合うだろう。相補的（「粘着」）末端はＴ ４ＤＮＡリガーゼにより接着することができる。

消化されたＤＮＡは、ポリアクリルアミドまたはアガロースゲル電気泳動により 分子量に基づいて分離することができる。電気泳動ゲル上で分離されたＤＮＡ断 片は、多数の当業界で公知の方法によって同定することができる。それらをタン パク質またはＲＮＡと結合せしめ、電気泳動により同定することができる。それ らをゲルから硝酸セルロース濾紙に上方移行せしめた後、ＲＮＡまたはＤＮＡプ ローブにより探査することができる。ＲＮＡまたはＤＮＡプローブは放射性種ま たは検出可能な酵素を担持している。Ｓｍ１ｔｈ、　Ｇ、ら、Ａｎａｌ、　Ｂｉ ｏｃｈｅｍ。

１０９、１２３　（１９８０）　：およびＳ’ｏｕｔｈｅｒｎ、　Ｅ、　Ｍ、、 　Ｊ、　ＭａＬ、　Ｂｉｏｌ、　９８゜５０３　（１９７５）。合成オリゴヌク レオチドＤＮＡプローブは、通常、長さが約１２塩基以上である。ＤＮＡまたは ＲＮＡ試料の配列が既知であるならば、正確なプローブを合成することができる 。Ｌａｔｈｅ、　Ｒ，、Ｊ。

Ｍａｔ、　Ｂｉｏｌ、、　１８３．１　（１９８５）。アガロースゲル上で分離 しそして硝酸セルロース上にブロッティングしたＤＮＡ断片に、ニックトランス レーションにより作製した２２ｐ−標識ＤＮＡプローブをハイブリダイズせしめ ることができる。この方法はサザンブロットハイプリダイゼーションとして知ら れている。Ｗａｈｌ、　Ｇ、ら、Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ。

りまたは化学合成により調製することもできる。

メラニンの生産を触媒する酵素のアミノ酸配列が既知であるならば、ＤＮＡ配列 を化学合成することができる。幾つかの従来技術を使って該酵素のアミノ酸配列 を決定することができる。アミノ酸配列の一部分を決定しそしてそれを使って逆 転写用プライマーを調製することができる。ＤＮＡ配列は該酵素の特定のアミノ 酸配列をコードすることができる。あるいは、ＤＮＡ配列は該酵素の全部または 一部分をコードする配列を含むことができる。例えば、ＤＮＡ配列がチロシナー ゼの全アミノ酸配列をコードすることができ、またはチロシナーゼのアミノ酸配 列の実質的部分をコードすることができる。

ＤＮＡ配列は該酵素をコードするもの以外のアミノ酸を含む融合タンパク質をコ ードすることもできる。チロシナーゼ遺伝子は、ストレプトミセス・アンチバイ オチフスＤＮＡからＢｃｌ　Ｉでの消化によってクローニングされている。ＤＮ Ａ断片を、Ｂｃｌ　Ｉで開裂したｐｒＬ３７にまたはＢａｍ　Ｈ［で消化したｐ ｌＪ４１に連結せしめた。次いで連結混合物を用いてストレプトミセス・リビダ ンス１３２６を形質転換せしめた。

Ｋａｔｚ、　Ｅ、ら（１９８３）前掲。その上、チロシナーゼ遺伝子はメラニン を生産する任意の生物体から単離することができる。特に、ヒト毛包、メラニン 細胞または黒色腫、イカ、赤雄鶏、細菌および真菌から単離することがてきる。

例えば、ヒトチロシナーゼ遺伝子は米国特許第４．８９８．８１４号に記載され たようにして得ることができる。

形質転換ベクタ一 本発明のベクターは、メラニンの製造を触媒する酵素をコードするＤＮＡを含む ベクターである。そのＤＮＡは、意図された宿主又は外来性ＤＮＡに生来であり 得る。外来性ＤＮＡは、形質転換されるべき生物に天然では見出されない又はそ れに対して外来性であるＤＮＡである。それは宿主生物を形質転換するためにク ローニングベクター中に挿入され得る。本発明の外来性ＤＮＡは、天然でメラニ ンを製造する生物のＤＮＡに由来し、又はそのＤＮＡに対して実質的な配列相同 性を有する。本発明のベクターは、標準技法により製造される。出発材料として 利用され得る適切なベクターは、当業界において既知である。

ベクターの構成は、適切な宿主、たとえばＥ、コリ（Ｅ、　Ｃｏ１１）において 行われ得る。メラニンの形成を触媒する酵素をコードするＤＮＡ配列は、従来の 手段により得られ、そして微生物の形質転換のために適切ないづれかのベクター 中に挿入される。

前記酵素又はその一部をコードするＤＮＡ配列は、その酵素が正しく発現される ような態様で適切なベクター中に挿入される。換言すれば、そのＤＮＡ配列は、 正しいアミノ酸配列が宿主におけるＤＮＡ配列の発現に基づいて生成されるよう に正しい配向で且つ読み枠を整合して配置される。従来の技術によれば、特定の 宿主微生物において操作可能なプロモーター及び所望する酵素をコードするＤＮ Ａ配列を含むキメラ性ＤＮＡ配列が一般的に構成される。そのキメラ性ＤＮＡ配 列は、さらに、宿主において操作可能な３′非−コード配列も含むことができる 。キメラ性ＤＮＡ配列は、既知の宿主形質転換ベクターの制限部位中に、前記酵 素をコードするＤＮＡ配列を挿入することによって適切なベクター内で現場調製 され得る。他方、そのキメラ性遺伝子は、形質転換ベクターを生成するために、 まず構成され、そして次に、ベクター中は挿入される。そのベクターは、酵素の 高められた生成を導くエンハンサ−配列及び／又は強いプロモーターを用いるこ とによってさらに変性され得る。

典型的なベクターは、耐抗生物質性のための／又は複数のマーカー遺伝子、複製 の起点、及び制限フラグメントをクローニング又はサブクローニングするための 種々の有用な制限部位を含むベクターである。多くの微生物、たとえばストレプ トミセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）及びＥ、コリ（但しこれだけには限定さ れない）を形質転換するために有用である多くの数のベクターがこれまでに記載 されて来た。

たとえば、Ｃｌｏｎｉｎｇ　Ｖｅｃｔｏｒｓ、　Ｐｏｕｗｅｌｓ、　Ｐ、　Ｈ， など、ＥｌｓｅｖｉｅｒＳｃｉｅｎｃｅ　Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ　Ａｍｓｔｅｒ ｄａｍ　（１９８５）を参照のこと。

多くの数の天然に存在するストレプトミセスのプラスミドがこれまで記載されて いる。２種のそのような単離体、すなわち５ＬＰ１．２及びｐｌＪｌｏｌは、一 連の有用なプラスミドベクターの基礎を形成して来た。Ｔｈｏｍｐｓｏｎ、　Ｃ ，Ｊ、など、、　Ｇｅｎｅ　２０．　５　［１９８２）。５ＬＰ１．２　が最大 の検出されるメンバーである５ＬＰＩフアミリーのプラスミドが、Ｓ、コエリカ ラー（Ｓ、ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ）　Ａ　３　（２）との相互特異的接合の後、 Ｓ、リビダンス　６６　（Ｓ、　１ｉｖｉｄａｎｓ）において自律的レプリコン として発見された。５ＬＰＩレプリコンは、Ｓ、コエリヵラーゲノムに組込まれ るが、しかし種々の長さの隣接するＤＮＡと共に切断され得、Ｓ、リビダンスに おいて自律的になる。その５ＬＰＩプラスミドは、Ｓ、リビダンスにおける染色 体当たり４〜５のコピー数で安定して存在し、そして狭い宿主範囲を有する。

８、９　ｋ　ｂ　（７）フラスミＦｐｌＪ１０１カＳ、’）　ヒダンスｌ５Ｐ５ ４３４　ｊ：発見され（Ｋｉｅｓｅｒ、　Ｊ、など、、　Ｍｏ１．　Ｇｅｎ、　 Ｇｅｎｅｔ、　１８５．２２３　（１９８２）、そして広範囲の種類のストレプ トミセス種に接合的にトランスファーされ得る。類似する性質を有するが、しか し小さい誘導体（たとえば、ｐ［Ｊ１０２）が、プラスミドから単離された。Ｋ ｉｅｓｅｒ、　Ｔ、など（１９８２）前記を参照のこと。プラスミドｐｒＪ１０ １は、はとんどの宿主において同等の染色体当たり１００〜３００のコピー数及 び２．１ｋｂ以下の最小のレプリコンを有する。耐薬物性決定基を担持する誘導 体はベクターとして作用するように構成されており、そしてＥ、コリとストレプ トミセスとの間のシャトルベクターとして使用され得るキメラ性プラスミドが利 用できる。

適切なファージφＣ３１は、ストレプトミセス内に広い宿主範囲を有し、そして 部位特異的組込み出来事を通してＳ、コエリカラ−Ａ　３　（２）を溶原化する 。Ｌｏｍｏｖｓｈａｙａ、　Ｍ、など、、　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ　Ｒｅｖ、　４ ４゜２０６　（１９８０）を参照のこと。４２．４ｋｂまてのＤＮＡは種々のフ ァージ粒子内にパッケージされ得るが、しかし３２ｋｂ（多くても）のＤＮＡは プラーク形成のために不可欠な遺伝子情報を含む。欠失を含むφＣ３１の誘導体 はベクターとして使用され得、そして組換えファージは、溶菌的に増殖され得、 又は適切なストレプトミセス株を溶原化するために使用され得る。

種々のストレプトミセスからクローン化された制限数の遺伝子は、ベクターの構 成において重要であった。Ｓ、フラジアエ（Ｓ、　ｆｒａｄｉａｅ）からのアミ ノグリコシドホスホトランスフェラーゼ遺伝子、Ｓ、フラジアエからのアミノグ リコシド　アセチルトランスフェラーゼ遺伝子（ａａｃ）及びＳ、アズレウス（ Ｓ、　ａｚｕｒｅｕｓ）からのリポソームＲＮＡメチラーゼ遺伝子（チオストレ プトン−耐性（ｔｓｒ）を付与する）は、挿入性不活性化を可能にするベクター を生成するために対で組合して使用されて来た。つい最近、チロシナーゼ遺伝子 、すなわちｍｅｔ（この生成物はチロシンからのカッ色メラニン色素の合成を支 配する）がＳ、アンチビオチカス（Ｓ　、　ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｕｓ）からク ローン化され、そして組換え体の眼での認識を可能にするベクターを構成するた めに使用されて来た。Ｋａｔｚ、　Ｅ、など、　、　（１９８３）前記を参照の こと。

プラスミドベクターｐｒＪ７０２は、広範囲のストレプトミセス中へのＤＮＡの 一般化されたクローニングのために有用であり、それは組換えプラスミドを含む 形質転換体コロニーの眼での認識を可能にする。

ベクターｐｌＪ７０２は、遺伝子選択のだめのチオストレプトン耐性法定期、ｔ ｓｒ及びその生成物がチロシンからのカッ色メラニン色素の合成を指図するチロ シナーゼ遺伝子、ｍｅｌを含む。ｍｅｌ遺伝子の挿入不活性化は、非メラニン− 生成形質転換体を導き、そして損なわれていないｍｅｌ遺伝子座は暗カッ色コロ ニーを生成する。Ｂｇｌ　ＩＦ。

Ｓａｃ　Ｉ及びｓｐｈ　ｒのためのユニーク部位は、ｍｅｌ遺伝子に存在する。

そのベクターはまた、組換え体の容易な認識を伴わないが、Ｋｐｎ　Ｉ又はＰｓ ｔ　Ｉにより生成されるＤＮＡフラグメントをクローニングするために使用され 得る。ＢａｍＨＩ及びＸｈｏ　［のためのユニーク制限部位はクローニングのた めに利用できず、そしてそのユニークＣ１ａ　Ｉ部位での挿入はｔｓｒ遺伝子を 不活性化し、遺伝子選択を排除する。そのベクターのコピー数は４０〜３００で ある。

ｐ［Ｊ７０２ベクターは、Ｓ、アズレウスからの１．１　ｋ　ｂのＢａｔ　Ｉフ ラグメントから成り、ｔｓｒ遺伝子（Ｔｈｏｍｐｓｏｎなと、（１９８２）、前 記）、Ｓ。

リビダンス（Ｓ　、ｌ　１ｖｉｄａｎｓ）プラスミドｐｌＪ１０２　（Ｋｉｅｓ ｅｒ、　Ｔ、など。

（１９８２）、前記）からの３．０ｋｂの２種の隣接するＢａ１Ｉフラグメント 及びｍｅｌ遺伝子を含むＳ、アンチビオチカスからの１．５５　ｋ　ｂのＢａｌ 　Ｉフラグメントを含む。

ｐＢＲ３２２誘導のプラスミドは、Ｅ、コリ形質転換に使用するためにひじょう に一般的である。それらは、Ｅ、コリが都合良く形質転換される場合、耐抗生物 質性を付与する１対の耐抗生物質性遺伝子を有する。典型的には、ＤＮＡセグメ ントの挿入は、１つの耐抗生物質性遺伝子が不活性化されるように行われる。次 に、選択は、第２の遺伝子により付与される耐抗生物質性を示すＥ、コリについ て選択することによって達成される。Ｂｏｌｉｖａｒ、　Ｆ、など、、Ｇｅｎｅ ２．　９５（１９７７）　；及び５ｕｔｃｌｉｆｔ、　Ｊ、、　Ｐｒｏｃ、　Ｎ ａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、、　ＵＳＡ　７５゜３７３７　（１９７８）を 参照のこと。

形質転換ベクターのもう１つの例はバクテリオファージである。

Ｍ１３シリーズは、一本鎖環状ＤＮＡを含む変性された繊維状Ｅ、コリバクテリ オファージである。ＭＢシリーズは、β−ガラクトシダーゼのための１ａｃＺ遺 伝子を担持し、そして青色を生成するためにガラクトース相同Ｘｇａｌを代謝す る。１ａｃＺを遺伝子のアミノ末端に位置するポリリンカー配列中へのクローン された挿入体の配置がその遺伝子を不活性化する。ＭＢ及び不活性化されたＩａ ｃＺ　（クローン化された挿入体を表わす）を担持する微生物は、それらの青色 の欠失により活性１ａｃＺ遺伝子及びＭＢを担持する微生物と区別され得る。Ｍ ｅｓ−ｓｉｎｇ、　Ｊ、など、、　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃ ｉ、、　ＵＳＡ　７４．３６４２　（１９７７）　；及びＭｅｓｓｉｎｇ、　Ｊ 、、　Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、第１ｏｔ巻、２０　（１ ９８３）を参照のこと。

他の形質転換ベクターは、プラスミドのｐＵＣシリーズである。それらは、耐ア ンピシリン性遺伝子及びｐＢＲ３２２からの複製の起点、並びにＥ、コリの１ａ ｃＺを遺伝子の一部を含む。ｌａｃ領域は、ＭＢシリーズにおける部位と同一の 制限エンドヌクレアーゼ認識部位のポリリンカー配列を含む。ｐＵＣシリーズは 、それらがクロラムフェニコールにより増幅され得る利点を有する。ＤＮＡフラ グメントがｌａｃ領域中にクローン化される場合、Ｉａｃ遺伝子は不活性化され る。ｐＵＣプラスミド及び不活性化された１ａｃＺ遺伝子を含むＥ、コリがイソ プロピルチオガラクトシド（ＩＰＴＧ）及び５−ブロモ−４−クロロ−３−イン ドリルβ−Ｄ−ガラクトピラノシド（Ｘｇａｌ）の存在下で増殖される場合、そ のコロニーは白色である。それがｐＵＣプラスミド及び活性１ａｃＺ遺伝子を担 持する場合、そのコロニーは青色である。

Ｖｉｅｉｖａ、　Ｊ、など、、　Ｇｅｎｅ　１９．２５９　（＋９８２）を参照 のこと。細菌は、当業界において知られている手段により形質転換される。

微生物の形質転換 ストレプトミセス属は、アクチノミセタレス（Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔａｌｅｓ ）目の細菌の３種の好気性属の１つである。ストレプトミセスは、ダラム陽性、 菌糸状、胞子形成細菌である。いくつかの天然に存在するストレプトミセスのプ ラスミドが記載されている。ストレプトミセス　リビダンスＴＫ６４は、チロシ ナーゼ遺伝子を有さず、そしてメラニンを生成しない。プラスミドｐｌＪ７０２ は、チロシナーゼ遺伝子を有し、そして高いコピー数のプラスミドである。これ は、染色体上にチロシナーゼ遺伝子を有する株よりもチロシナーゼ生成において 少なくとも３倍の上昇をもたらす。プラスミドｐＩＪ７０２も、細胞外メラニン の生成のための高い可能性にストレプトミセスリビダンスＴＫ６４を形質転換す るために使用された。形質転換は、当業界において標準の手段により行われる。

同様に、チロシナーゼ遺伝子は、種々の宿主微生物を形質転換するために有用で あるベクター中への挿入の後、種々の微生物を形質転換するために使用され得る 。

Ｂｌｕｅｓｃｒｉｐｔ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、　Ｌａｊｏｌｌａ、ＣＡから得 られた）は、β−ガラクトンダーゼ色彩インジケーター及びｌａｃプロモーター を有するｐＵＣ誘導体である。Ｂｌｕｅｓｃｒｉｐｔプラスミドは、チロシナー ゼ遺伝子を挿入することによって変性された。この変性されたプラスミドは、着 色されたコロニーを形成するＥ、コリを都合良く形質転換するために使用された 。

Ｅ、コリにおける高レベルのメラニン生成は、Ｓ、アンチビオチカスのｍｅｌ遺 伝子底からの０ＲＦ５’と共にチロシナーゼ遺伝子の同時発現を必要とすること が見出された。ｐｒＪ７０２におけるｍｅｌ遺伝子座は、０ＲＦ４３８と命名さ れるＯＲＦ及びチロシナーゼ遺伝子の両者を含む。Ｓ、アンチビオチカスＡＴＣ Ｃ８６６３のｍｅｌ遺伝子座は、Ｓ、アンチビオチカスＩＭＲＵ３７２０のｍｅ ｔ遺伝子座に対して高い程度の相同性を育する。Ｓ、アンチビオチカスＡＴＣＣ ８６６３は、ｐ［Ｊ７０２を生成するために使用されるＳ、アンチビオチカス［ ＭＲＵ３７２０株とは異なる株である。

Ｓ、アンチピオチカスＡＴＣＣ８６６３からのチロシナーゼ遺伝子の配列決定は 、Ｓ、アンチビオチカス［ＭＲＵ３７２０とは異なるいくつかのヌクレオチドを 示した。新規のこれまで記載されていない配列３′〜チロシナーゼコード領域か 同定され、クローン化され、そして配列決定された。その３′配列の部分は、チ ロシナーゼ活性化物質として作用する。その新規３′配列は、メラニン形成して 関与する機能的タンパク質をコードする指定上の読取り枠を含む。

Ｔ７／Ｅ、コリチロシナーゼ発現システムがクローンし、そしてＳ、アンチビオ チカスＡＴＣＣ８６６３チロシナーゼ遺伝子領域を同定するために使用された。

そのＴ７／Ｅ、　コリチロシナーゼ発現システムは、ストレプトミセスプラスミ ドクローニングよりも多くの利点、たとえば高い割合の形質転換、急速なメラニ ン検出、続＜　ＤＮＡ抽出の容易性及びサブクローニング、地図形成及びＤＮＡ 配列決定の操作を付与する。

Ｔ７／Ｅ、コリチロシナーゼ発現システムは、Ｔ　７　ＲＮＡポリメラーゼをま たは生成するＥ、コリの宿主株においてクローンされた遺伝子の選択的転写を方 向づけるバクテリオファージエフプロモーターベクターを用いる２種のプラスミ ドＴ７プロモーター／Ｔ７ポリメラーゼシステムである。Ｔａｂｏｒ、　Ｓ、な ど、、　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ。

Ｓｃｉ、　ＵＳＡ、８２．１０７４　（１９８５）を参照のこと。

誘発されたチロシナーゼ遺伝子を含む組換えＥ、コリ細胞は、銅及び千ロジンに より補充される場合、寒天プレート上に及び液体培地にメラニン色素を生成した 。しかしながら、０ＲＦ４３８の発現は、Ｅ、コリにおける高レベルのメラニン 生成のために必要とされることが見出された。さらに、３′調節配列の存在はま た、メラニン生成を増強する。

Ｅ、コリに３８（ｐＧＰｌ−２）中に形質転換される場合、たとえばプラスミド ｐＢＧｃ６２０．３は、０ＲＦ４３８の翻訳のためのバクチリオフ了−ジＴ７リ ポソーム結合部位（ＲＢＳ　ｌ　）を使用し、そしてチロシナーゼの翻訳のため の純粋なＳ、アンチビオチカスＲＢＳ２を使用するキメラ性ピーシストロン性（ ｂｉ−ｃｉｓｔｒｏｎｉｃ）転写体を付与する。ｐＧＰｌ−２は、ＰＬプロモー ターにより駆動されるＴ　７　ＲＮＡポリメラーゼをコードする。プロモーター が４２℃でのヒートショックにより活性化される場合、その誘発されたＴ　７　 ＲＮＡポリメラーゼは、Ｔ７プロモーターの後ろに、ｐＴ７−７にクローン化さ れて遺伝子を選択的に発現する。ｐＧＰｌ−２はまた、選択可能マーカーとして 耐カナマイシン性遺伝子を含む。両プラスミドを有する二重形質転換体は、それ ぞれ１００μｇ／ｍｌでアンピシリン及びカナマイシンを有するＬｕｒｉａ　Ｂ ｒｏｔｈ（Ｌ　Ｂ）寒天プレート上で３０℃で選択された。

Ｅ、コリにおけるメラニンの生成は、Ｔ７プロモーター及びリポソーム結合部位 の制御下にチロシナーゼ遺伝子、及び図１７に示されるように別のＴ７プロモー ター及びリポソーム結合部位の制御下にＯＲＦ　、たとえば０ＲＦ４３８を配置 することによって高められ得る。この配置において、メラニンの生成は、上記及 び図４に示される配置を育するＩ）ＢＧＣ６２０，３によるメラニンの生成より も、少なくとも４倍及びたぶん１０〜１５倍まで高められる。

メラニン色素中への導入のために他の前駆体化合物、たとえば上記列挙の化合物 をスクリーンすることは、Ｔ７／Ｅ、コリチロシナーゼ発現システムを用いて可 能である。その得られるメラニン相同体は、ユニークな色彩及び他の化学的特徴 のために選択される。Ｅ、コリのアミノ酸生合成路において過剰生成性変異体を 同定するために、添加される前駆体の不在下で、増強されたメラニン生成につい てスクリーンすることが可能である。組換えＥ、コリ細胞におけるメラニン表現 型についてスクリーンする能力は、新規のメラニンの生成、及び変性された触媒 性質を有するチロシナーゼのタンパク質構築のための新規機会を付与する。

突然変異誘発 突然変異は、メラニンを生成できる微生物において誘発され得る。

突然変異は、メラニンの生成の低下、上昇又は未変化を導くことができる。メラ ニンの増強された生成を導（突然変異が選択される。

突然変異は、放射線、たとえば紫外線又はγ線、並びに化学的突然変異誘発物質 、たとえば臭化エチジウム及びエチルイタンスルホネートを包含する当業界にお いて知られている技法により誘発され得る。

Ｃ，メラニンの精製 メラニンを、室温及び１００°Ｃで０．５ＮのＮａｕＨにより細菌細胞から精製 した。着色された画分は、（１）酸及び塩基に溶解性であり；（２）エチルアル コール及び塩基に溶解性であり：そして（３）塩基にのみ溶解性であることが見 出されたｏ　Ｐａｖｌｅｎｋｏ、　Ｇ、　Ｖ、など、　（１９８）、前記を参照 のこと。

溶解性メラニンを、培地から抽出し、そして精製することができる。これは、ま ず、細胞及び粒状物質を濾過又は遠心分離により除去することによって行われ得 る。濾過が使用される場合、種々の濾過方法、たとえばガラスウールを通しての 濾過が当業界において知られている。遠心分離が使用される場合、５．ＯＯＯＸ ｇで通常十分である。次にメラニンは、ｐＨ２〜４、好ましくは約３で沈殿せし められる。沈殿されたメラニンは、濾過又は遠心分離により除去される。そのメ ラニンは、高いｐＨ１すなわち約７．０〜約９．０のｐＨ１好ましくは約８．０ のｐＨでの連続的な再溶解及び低いｐＨでの沈殿、続く濾過又は遠心分離により 洗浄される。メラニンはまた、分子量濾過、たとえば逆浸透を用いて濃縮され得 る。塩沈殿は、低いｐＨでのメラニンの沈殿と同じように効果的である。

本発明はさらに、次の非制限的な例により例示される。

チロシナーゼの精製 チロシナーゼを、ストレプトミセス培養物における増殖培地中に分泌する。チロ シナーゼは、Ｅ、コリにおいて細胞内に保持される。

細胞内チロシナーゼは、文献において十分に定義された標準方法によりＥ、コリ から精製され得る。Ｓａｍｂｒｏｏｋなど、　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｃ，ｎｉｎ ｇ（１９８９）を参照のこと。

０ＲＦ４３８タンパク質の精製 ０ＲＦ４３８タンパク質は、Ｅ、コリにおいて細胞内に保持され、そして標準方 法に従って精製される。さらに、精製はＦａｓｔ　ＰｒｏｔｅｉｎＬｉｑｎｉｄ 　Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ（ＦＰＬＣ）を通して達成される。

次の例において生成されるメラニンは、次の方法により増殖培地から精製される 。

培養物をガラスウールを通して濾過し、菌糸を除去した。他方、粒状物質及び細 胞を、５．０００Ｘｇでの遠心分離により増殖培地から除去した。メラニンを含 む培地のｐＨを、Ｈｃｌにより約３．０に減じた。沈殿されたメラニンを、６． ８００　Ｘｇでの遠心分離により除去した。次に、沈殿物を除去し、そしてｐ　 Ｈ８，０で再溶解した。その再溶解されたメラニンを、滅菌された蒸留水により その液体の値を二倍にすることによって洗浄した。沈殿、除去、再溶解及び洗浄 の工程を、いづれかの非沈殿性不純物を実質的に除去するために４度くり返した 。生成物を、所望により、２００°Ｃで４８時間、オーブンにおいて乾燥せしめ る。

例２は、メラニンの従来技術の生成を示す。その方法は、Ｈｏｐｗｏ−ｏｄ、　 Ｄ、　Ａ、など、、　’Ｇｅｎｅｔｉｃ　Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｓ ｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　：　ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ”　Ｔｈ ｅ　Ｊｏｈｎ　ｒｎｎｅｓ　Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ　（１９８５）から取られる 。

ストレプトミセス　リビダンスＴＫ６４　（ｐｌＪ７０２）によるメラニンの製 造。

増殖培地の調製 ＭＭＴ培地を、下記のようにして次の成分から調製した。

ＭＭ培地： Ｌ−アスノロラギン　０．５　ｇ Ｋ２ＨＰＯ４０，５ｇ ＭｇＳＯ，・７ＨＪ　Ｏ，２ｇ ＦｅＳＯａ　”　７１ｈ８　０．０１　ｇＨ，０１０００ｒｎｌ 前記成分を水に溶解し、ＮａＯＨにより７．０〜７．２のｐＨに調整し、その１ ００　ｄを５００−のフラスコ中に入れ、そして２０分間オートクレーブ処理し た。

次に滅菌された原液を調製した： Ｉ　Ｄｉｆｃｏカサミノ酸（３０％）（５０ｘ原液）＊　グルコース（５０％） （５０Ｘ原液）＊　ＣｕＳＯ４”　５Ｈ２０（０，５０％）（１０００ｘ原液） Ｌ−チロシン（３％）（３３，３Ｘ原液）Ｌ−ロイシン（５％） ＊　Ｔｉｇｅｒ　Ｍｉｌｋ Ｌ−アルギニン（０，７５％） Ｌ−シスチン　（０，７５％） Ｌ−ヒスチジン（１，０％）　（１３３，３ｘ原液）ＤＬ−ホモセリン（０，７ ５％） Ｌ−フニエルアラニン（０，７５％）　溶解しないＬ−プロリン（０，７５％） 　白色のミルクの様な溶液アデニン（０，１５％）　を完全に形成するウラシル （０，１５％） ニコチンアミド（０，０１％） チアミン（０，０１％） ＊　それらのすべての原液を、培地を製造する前、オートクレーブ処理した。

次の成分を、ＭＭＴ培地を調製するために組合した：１００　ｄのＭＭ培地 ２−のカサミノ酸 ２ｄのグルコース ７５０μｊ７のＴｉｇｅｒ　Ｍｉｌｋ チロシン及びメラニン製造のためには、次の成分がまた含まれた＝１００μｆの Ｃｕ５Ｏ，−５８２０ ３−のチロシナーゼ　インデューサ− ＴＫ　６４　（ｐ［Ｊ７０２）の接種及び増殖少量の細菌を、プレートの上部か ら剥ぎ取り、そして混合された１０−の殺菌された水中に移し、そしてＩＩＩＪ Ｔｌｏｏｒｎｉを含む６個の５００−フラスコ中にピペットにより移した。培養 物を３０°Ｃ及び１２０ＰＰＭで３日間増殖せしめた。

結果 メラニンを例１に記載されるようにして抽出した。メラニンの収率は、乾量で約 ０．５ｇ／ｌであった。

興ユ 窒素源の変性による増強されたメラニン製造増殖培地の調製 ０．５ｇ／４７のに２ＨＰＯ４，０，２ｇ／Ｉ！のＭｇ５Ｏａ　・Ｈ２Ｏ，０， ０１ｇ／　１のＦ＝ＳＯ４，８ｇ　／　ｌのカゼイン加水分解物、０．３ｇ／Ａ ’のチロシン、ｌＯｇ／ｌのグルコース、０．０００５％のＣＯ３Ｏ４及び０． １ｇ／ｊ’のし一メチオニンを含む培地を調製した。

Ｔ　４６４（ｐ［Ｊ７０２）の接種及び増殖１１１の培地を、３３３−の増殖培 地を含むＩｆのフラスコにおける１、　４　Ｘ　１０　’の胞子／ｒｎｌのＳ、 リビダンスＴＫ６４　（ｐ［Ｊ７０２）により接種した。培養物を、１５０ＰＰ Ｍで振盪しながら３ピＣで３日間、増殖せしめた。

椎困 メラニンを例１に記載されるようにして精製した。

湿量で１１当たり合計１．５８　ｇを得た。

例４ 炭水化物インヒビターの除去による増強されたメラニン製造増殖培地の調製 例３の培地調製法をくり返した。但し、グルコースは炭素源として除去された。

ＴＫ６４　（ｐ■Ｊ７０２）の接種及び増殖ｌｌのフラスコにおける２５０−の 培地を、５．８　Ｘ　１０３の胞子／−のＳ、リビダンスＴＫ６４　（ｐｌＪ７ ０２）により接種した。培養物を、１７０ＰＰＭで振盪しながら、３０℃で３日 間、増殖せしめた。

結果 メラニンを、例１に記載されるようにして精製した。湿量で９ｇ／Ｉ！のメラニ ンを得た。

例４の培地調製法をくり返した。但し、カゼイン加水分解物（Ｓｉｇｍａ　Ｃｈ ｅｍｉｃａｌから得られた）と、カゼインペプトンの同量と交換し、そしてＬ− メチオニンを除去した。

ＴＫ６４　（ｐ［Ｊ７０２）（７）接種及び増殖２５０　ｍｌの培養培地を含む 個々のｌＩ！のフラスコを、５．８　Ｘ　１０　”の胞子／−のＳ、リビダンス ＴＫ６４　（ｐｌＪ７０２）により接種した。培養物を、１５０ＰＰＭで振盪し ながら、３０°Ｃで９０日間インキュベートした。

悶 メラニンを例１に記載されるようにして精製し、そして１２ｇ／ｌの乾量てのメ ラニンか得られた。

例６ チロシンによるメラニン製造の増強 増殖培地の調製 例５の培地調製法をくり返した。但し、カゼイン加水分解物の量　。

を、種々の量のカゼインペプトンにより交換し、そして種々の量の千ロジンを添 加した。異なったフラスコにおいて、ｇ／ｌでのチロシンの濃度は、０．３．　 ０．６．　０．９．　１．２及び１．５であった。

ＴＫ６４　（ｐｌＪ７０２）の接種及び増殖２５０　ｍｌの培養培地を含む個々 のＩＩ！のフラスコを、５．８Ｘ１０’の胞子／ｒＩＬｌのＳ、リビダンスＴＫ 　６４　（ｐ［Ｊ７０２）により接種した。培養物を、１５０ＰＰＭで振盪しな がら、３０°Ｃて９０．５時間インキュベートした。

結果 フラスコ中の培養培地の４００ｎｍ（ＯＤ　４０゜）での光等密度をある間隔で 読み取った。９０．５時間のインキュベーションの後の平均光学密度は次の通り であった： １、５　１．５２３ メラニンを例１に記載されるようにして精製した。メラニンの収率は、フラスコ における培地１１当たり湿量で２６ｇであり、ここでチロシンの濃度は１．５ｇ ／Ａ’であった。

増殖培地を例５におけるようにして調製した。培地は１．５ｇ／ｌのチロシンを 含む。この培地は、アミノ酸を除くグルコース又は他の炭素源を含まない。

ＴＫ６４　（ｐ［Ｊ７０２）の接種及び増殖Ｓ、ｌＪヒダンスＴＫ　６４　（ｐ ｒＪ７０２）（７）胞子原液を、水でｌ：１（Ｈ：希釈した。開始培養物を、１ １のフラスコにおける培養培地２５０　ｄに希釈胞子原液５０μｌを添加するこ とによって生成した。その開始培養物を、それが中間対数相に達するまで、振盪 しながら、３０°Ｃでインキュベートした。

次に開始培養物を、増殖培地２０Ｉ！を含む３０１の発酵器に移した。培地の最 大光学密度が４００ｎｍ（ＯＤ　Ａ。。）で得られるまで、インキュベーション を２２５ＰＰＭでの一定の混合を伴って３０°Ｃで行った。発酵の間の空気添加 は、４０時間、１分当たり空気ＩＩ！での一定の空気流により、及び４０〜６０ 時間、１分当たり空気２．５１での空気流により、次に残３６０〜１２０時間、 １分当たり３．０１の空気流により行われた。

結果 メラニンを例１に記載されるようにして精製した。メラニン収率は、１１当たり 乾量で約１．７ｇであった。

例８ 増殖培地を例５におけるようにして調製した。培地は１．５ｇ／ｌのチロシンを 含む。この培地は、アミノ酸を除くグルコース又は他の炭素源を含まない。

ＴＫ　６４　（ｐｌＪ７０２）の接種及び増殖Ｓ、リビダンスＴＫ　６４　（ｐ ［Ｊ７０２）の胞子原液を、水で１：１０に希釈した。開始培養物を、１１のフ ラスコにおける培養培地２５０−に希釈胞子原液５０μｌを添加することによっ て生成した。その開始培養物を、それが中間対数相に達するまで、振盪しながら 、３０°Ｃでインキュベートした。次に開始培養物を、増殖培地３５１を含む４ ２Ｉ！の発酵器に移した。培地の最大光学密度が４００ｎｍ（ＯＤ、。。）で得 られるまで、インキュベーションを２２５ＰＰＭでの一定の混合を伴って３０° Ｃで行った。発酵の間の空気添加は、３６時間、１分当たり空気１．５１での一 定の空気流により、及び３６〜４８時間、１分当たり空気４，０１での空気流に より、次に残４８〜１２０時間、１分当たり５．０１の空気流により行われた。

消泡剤を４８時間後、毎日添加した。

結果 メラニンを例１に記載されるようにして精製した。メラニンの収率は、１４７当 たり乾量て約２．０ｇであった。

プラスミドｐ［Ｊ７０２を担持するストレプトミセスリビダンスを、Ａｍｅｒｉ ｃａｎ　Ｔｙｐｒ　Ｃｕ１ｔｕｒｅ　Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏｎから得た。それはＡ ＴＣＣ寄託番号３５２８７を有する。Ｓ、アンチビオチカス［ＭＲｔ１３７２０ の一遺伝子座からの０ＲＦ４３８遺伝子及びチロシナーゼ遺伝子は、プラスミド ｐｌＪ７０２における１２９個の塩基対（ｂ　ｐ）の５ｐｈｌ／Ｂｅ１ｌフラグ メント以上に得られる。Ｂｅｒｎａｎ、　Ｖ、など、、（１９８５）、前記を参 照のこと。０ＲＦ４３８及びチロシンをプラスミドｐＴ　７−７　（Ｓ、　Ｔａ ｂｏｒから得られた）中にクローン化し、ｐＢＧｃ６２０゜３を製造した。プラ スミドｐＴ７−７は、ｐＴ７−５の誘導体である。Ｔａｂｏｒ、　Ｓ、など、、 　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ。

Ｓｃｉ、　ＵＳＡ　８２．１０７４　（１９８５）を参照のこと。プラスミドｐ Ｔ７−７は、Ｔ７バクテクオフアージ　プロモーター、及びポリリンカーの上流 に強いリポソーム結合部位を有する。それは、フィルインされたＥｃｏＲ１部位 が使用される場合、Ｎ−末端で４個の特別なアミノ酸を含む融合タンパク質を付 与する。

０ＲＰ４３８の出発コドンでの５ｐｈ１部位を、ヤエナリ（ｍｕｎｇ　ｂｅａｎ ）ヌクレアーゼにより消化し、そしてＮｃｏｌリンカ−（５’　−ｄＣＡＡＧＣ ＴＴＧ−３′）に連結した。チロシナーゼのＴＣＡ終結コドンでのＢｃ１１部位 を、フレノウを用いてフィルインし、そしてＨｉｎｄｌｌＩリンカ−（５′−ｄ ＣＡＡＧＣＴＴＧ−３’　）に連結した。ｐＴ７−７をＥｃｏＲｌにより切断し 、フレノウによりフィルインし、Ｎｃｏｌリンカ−（５’　−ｄＣＡＡＧＣＴＴ Ｇ−３′）に連結し、そしてＨｉｎｄｌｌＩにより切断した。０ＲＦ４３８タン パク質及びチロシナーゼをコードする１３０７ｂｐのＮｃｏｌ／Ｈｉｎｄｌ［［ フラグメントを、ｐＴ７−７中に連結し、ｐＢＧＣ６２０，３を製造した。

Ｎｃｏｌリンカ−を有する０ＲＦ４３８は、Ｎ−末端で５つの特別なアミノ酸を 有する融合タンパク質（Ｎｌ２−Ｍｅｔ−Ａｌａ−Ａｒｇ−ｔｉｅ−Ａｌａ−Ｏ ＲＦ３８−ＣＯＯＨ）として発現される。プラスミドｐＢＧｃ６１９は、次の通 りにｐＴ７−７中にクローン化されたチロシナーゼ（ＯＲＦ４３８を有さない） を含む。

ＮＣ０１部位は、プラスミドｐｌＪａ　／ｍｅｌ＃３におけるチロシナーゼのＡ ＴＧ開始コドンてのオリボタクレオチド変異誘発により構築された（Ｍ、　Ｋｕ ｍａｇａｉ、未公開）。次に、チロシナーゼコード領域を、変性されたＮｃｏｌ ／Ｈｉｎｄｌ［Ｉ　ｐ　Ｔ　７−７ベクター（上記のような）中にＮｃｏｌ／Ｈ ｉｎｄｌｌ［フラグメントとして連結し、ｐＢＧｃ６１９を得た。２図を参照の こと。従ってチロシナーゼは、Ｎ−末端で５つの特別なアミノ酸を有する、ｐＢ Ｇｃ６１９における融合タンパク質（Ｎｌ２−Ｍｅｔ−Ａｌａ−Ａｒｇ−［１ｅ −Ａｌａ−チロシナーゼ−ＣＯＯＨ）として発現される。プラスミドｐＢＧＣ６ ２０，２はｐＢＧＣ６２０，３と同一である。但し、０ＲＦ４３８コ一ド配列に おける読取り枠変異で異なる。それらのすべてのクローンにおける読取り枠の割 当ては、３図図に示されるように、同定されたインビボトランスロケーション生 成物と調和する。

！専 プラスミドｐＢＧｃ６１９　、ｐＢＧｃ６２０．２及びｐＢＧｃ６２０．３を、 プラスミドｐＧＰ１−２を有するＥ、　）り株に３８中に形質転換した（Ｔａｂ ｏｒなど、前記）。ｐＧＰｌ−２は、Ｐ２プロモーターにより駆動されるＴ７Ｒ ＮＡポリマラーゼをコードする（Ｔａｂｏｒなど、前記）。プロモーターが活性 化される場合（４２°Ｃでのヒートショックによる）、誘発されたＴ　７　ＲＮ Ａポリメラーゼが、Ｔ７プロモーターの後方でｐＴ７−７にクローンされた遺伝 子を選択的に発現する。ｐＧＰｌ−２は、選択可能マーカーとして耐カナマイシ ン性遺伝子を含む。両プラスミドを有する二重形質転換体を、３０℃でＬｕｒｉ ａブイヨン（ＬＢ）寒天プレート（それぞれ１００μｇ／−でのアンピシリン及 びカナマイシン）上で選択した。寒天インジケータープレート（インジケーター プレートは、ＣＬＩＳＯ４・５ＨｚＯ（０，２ｍ　Ｍ）及びＬ−チロシン（０， ３ｇ／ｉ’）により補充された）上でのメラニン製造のために、コロニーを３０ °Ｃで一晩、増殖し、次に４２°Ｃで１時間増殖し、そして３０°Ｃでさらに増 殖（３時間〜−晩）、眼に見える色素形成を可能にした。液体培地におけるメラ ニン製造のために、−晩の培養物（３０℃）を、新しいＬＢによりに５．０に希 釈し、そして３０°Ｃで５時間、増殖し、４２°Ｃの振盪水浴に３０分間、移し 、そして次に、連続しての一晩の増殖のために３０℃の水浴に戻した。液体培養 でのメラニン製造はまた、ＣｕＳＯ４・５Ｈ２０及びＬ−チロシンの添加を必要 とする。

ゲルを、５０％メタノール／１０％酢酸におけるクーマシーブリリアントブルー Ｒ（０，２５％）において２時間インキュベートし、そして３０％メタノール／ １０％酢酸において一晩、脱色した。

メラニン製造の定量化 ｐＴ７−７、ｐＢＧｃ６１９　、　ｐＢＧｃ６２０．２及びｐＢＧｃ６２０．３ を有するＥ。

コリＫ　３８　／ｐＧＰ１−２の一晩の培養物を、新鮮なＬＢブイヨン５０艷に より希釈し、モして３０°Ｃで５時間、増殖せしめた。その培養物を、４２°Ｃ の振盪水浴に３０分間移した。その培養物を３０°Ｃに戻した。ＣＬＩＳＯ４・ ５Ｈ，０（０，２ｍＭ）及びＬ−チロシン（１，５ｇ／ｊ７）を前記培地に添加 した。その培養物を２４時間インキュベートした。

２４時間培養物を、水で１：１０に希釈し、そしてブランクとしてｐＴ７−７ベ クタ一対照を有する０ＭＳ２００　Ｖａｒｉａｎ走査スペク走査スペクトロメー タ取上た。Ｅ、コリ／ｐＢＧｃ６２０．３の培養物は、黒の色素を要した。黒の 色素を示す希釈された培養物は、すべてのサンプルにおいてほぼ同一である、４ ００〜７００　ｎｍ間で広い吸光度プロフィールを示した。定量化は、６７００ ｍで測定された。

チロシナーゼ遺伝子 一晩の培養物（上記のような）を、新鮮なＬＢブイヨン５０−により１・５０に 希釈し、そして３０°Ｃで５時間、増殖せしめた。次に、その培養物を４２°Ｃ の振盪水浴に３０分間、移し、そして３０°Ｃの水浴に９０分間、戻した。その 培養物のアリコート（２０ｍｌ）を、６．０００　ｇで５分間の遠心分離により 収穫した。

Ｅ、コリにおけるチロシナーゼの現場アッセイのために、湿量での細胞１００　 ■を洗浄し、そして５０ｍＭのＨｅｐｅｓ−ＫＯＨ弛緩液（ｐＨ６，８）ｌｄ、 フェニルメチルスルホニル　フリトリド１ｒｎｌ及びジチオトレイトール１−に 再懸濁した。細胞を、Ｃｈｏｕｄａｒｙ、　Ａｎａｌ、　Ｂｉｏ−ｃｈｅｍ、　 １３８．４２５１　（１９８４）から変性されたような１００μｉ’のトルエン ：エタノール（１：　４．ｖ／ｖ）の添加の後、３０秒間、攪拌することによっ て浸透化した。次に、細胞のアリコート（５０μｌ）を、５０ｍＭのＨｅｐｅｓ −ＫＯＨ（ｐＨ６，８）　、ＣａＳＯ４・５Ｈ２０（０，２ｍＭ）及び過剰飽和 Ｌ　−ＤＯＰＡ　（１８ｍＭ）の溶液ｌｉ中において室温でアッセイした。Ｌ　 −ＤＯＰＡのドパクロームへの酸化を、一対の石英キュベツトにおいて４７５ｎ ｍで１０分間にわたって分光的にモニターした（０ＭＳ２００、　Ｖａｒｉａｎ ）。対照キュベツトは、ｐＴ７−７ベクターのみを有する細胞を含む完全な酵素 アッセイミックスを含んだ。酵素活性の量を、３６００のドパクロームのための モル消衰係数を用いて、傾斜の上方への初期変化から計算した。Ｌｅｒｃｈ、　 Ｋ、など、、Ｅｕｒ、　Ｊ、　Ｂｉｏｃｈｅｍ３１、４２７　（１９７２）を参 照のこと。比活性は、μモルの酸化されたＬ−ＤＯＰＡ／分／−細胞で与えられ る。ｐＢＧｃ６２０．３を含む。Ｅ、コリは、８．５５の比活性を有する。ｐＢ ３１０１２．７を含むＥ、コリは１３．９の比活性を有する。ｐＢｓ１０２４を 含むＥ、コリは２０．０１の比活性を有する。

Ｅ、コリ細胞のリゾチーム／清浄剤溶解Ｅ、コリの細胞ペレットを３〜５容量の 水冷１０ｍＭのトリス−ＭＣＩ（ｐ　Ｈ７，４）、１ｍＭのジチオスレイトール （ＤＴＴ）、０．１ｍＭのフェニル　メチル　スルホニルフルオリド（ＰＭＳＦ ）及び２■／−のリゾチームの中に懸濁し、そして氷上で２０分間インキュベー トした。次にこの懸濁細胞を０．５％のデオキシコール酸ナトリウム及び０．１ ■／−のＤＮａｓｅ　Ｉに調整し、そして氷上で３０分間インキュベートした。

次にこの懸濁細胞を０．２％の硫酸プロタミンに調整し、そしてゆっくり攪拌し なから４°Ｃで２０分間インキュベートした。

細胞破片を〜１５．０００　ｇで１５分間にわたる遠心によって除去した。

この上清液を硫酸アンモニウムにより６０％飽和に調整した（４°Ｃでゆっくり 攪拌しながら１時間かけて）。沈殿したタンパク質を〜１５、０００　ｇで１５ 分間の遠心により取り出した。このタンパク質ベレットを少容量の緩衝液に懸濁 し、そして基質としてＬ−ＤＯＰＡを用いるチロシナーゼ酵素アッセイのための アリコート採取した。この６０％硫酸アンモニウム画分中の比活性は、タンパク 質の■当り、１分間当り１．７３μモルのＬ　−ＤＯＰＡの酸化であった。

図３ＡはＴ　７　ＲＮＡ転写物由来の生体内合成タンパク質（リフアビジンの存 在下において、Ｔ　７　ＲＮＡポリメラーゼのみが活性であり続けている）の５ ＤＳ−ＰＡＧＥオートラジオグラフィーを示す。ｐＢＧｃ６１９において、チロ シナーゼの予測のサイズに相当する３０ｋＤの単独タンパク質バンドが観察され た（図３Ａ、レーンｌ）。ベクターのみのコントロールはゲル上に何ら標識化タ ンパク質を示さなかった（図３Ａ、レーン２）。

クローンｐＢＧｃ６２０．２及びｐＢＧｃ６２０．３に関して、どちらの場合も ３０ｋＤにて同じチロシナーゼバンドが観察された（図３Ａ、レーン３及び４） 。これらのクローン両者におけるチロシナーゼの発現はｐＢＧｃ６１９に比べて 有意に低められている：この相違はＲｅ５ｔ　（バクテリオファージエフ由米） 対ＲＢＳ２（Ｓ、アンチオバイオチカス由来）の翻訳効率に反映しうる。図３Ａ は更に、０ＲＦ４３８の〜１２ｋＤ枠外翻訳（レーン３）、並びにクローンｐＢ ＧＣ６２０，２及びｐＢＧｃ６２０．３それぞれに由来する１５ｋＤの全長０Ｒ Ｆ４３８タンパク質（レーン４）を示している。適切なサイズの１５ｋＤの全長 ０ＲＦ４３８タンノくり質を製造するクローンｐＢＧｃ６２０．３が優れたメラ ニン製造体であることが見（１出され、そしてこれは最も高いレベルの試験管内 チロシナーゼ活性も示した（以下参照）。他のクローンｐＢＳ６２３はチロシナ ーゼを有さない０ＲＦ４３８タンパク質をコードする。０ＲＦ４３８タンノくり 質は、ｐＢＧｃ６２０、３又はＰＢＳ６２３を保有するＥ、コリ形質転換体にお ける全細胞タンパク質の約５％までにて発現される。

クマジー染色ゼル上では、ベクターのみのコントロールに対比させてのチロシナ ーゼの高められたレベルは全ての遺伝子作製体に関して検出されなかった（図３ Ｂ）。これはゲル上に高いツク・ツクグランドを生じせしめるＥ、コリにおける その他の内因生タンノくり質（２９−３０ｋＤ）にある程度起因する。しかしな がらクローンｐＢＧｃ６２０．３においては、全長０ＲＦ４３８タンパク質に相 当する主要染色性タンパク質バンドが観察された（図３Ｂ、レーン４）。ｐＢＧ ｃ６２０．３から発現された誘発化０ＲＦ４３８タンパク質は細胞において量的 に主要なタンパク質であった。

高いレベルのメラニン色素はクローンｐＢＧｃ６２０．３を含むプレート上での み蓄積された。前記のオートラジオグラフィーにより示される通り、これがチロ シナーゼ及び全長０ＲＦ４３８タンノ（り質を製造する唯一のクローンであった 。クローンｐＢＧｃ６２０．２も一夜の増殖の後に微量のメラニン産物を示した が、そのレベルはｐＢＧｃ６２０．３に比べて劇的に低かった。ｐＢＧｃ６１９ 及びベクターのみのコントロールのクローンは、アガープレート上での一夜増殖 の後にメラニン色素沈着を全く示さなかった。クローンｐＢＧｃ６２０．３から のメラニンの製造はアガープレートへの銅及びＬ−チロシンの添加に依存した。

熱誘発後の一夜増殖の比較を、Ｌ−チロシン（Ａ）　、Ｎ−アセチル−し−チロ シン（Ｂ）及びＬ−チロシンエチルエステル（Ｃ）を保ったクローンｐＢＧｃ６ ２０．３に関して行った。このチロシン顕似体の両者は、黄色から茶色の種々の 影に至る色調に範囲する強い色素沈着を提供した。更に、クローンｐＢＧｃ６２ ０．３におけるし一チロシン由来の強い異色メラニン色素の発色は、アガプレー トへの第二鉄イオン（ＦｅＣ１＝）の添加によって大いに刺激された。試験した 基質それぞれにより、メラニン色素がＥ、コリのコロニー及び周囲のアガー培地 の中で識別された。機能的なチロシナーゼ遺伝子を欠＜Ｅ、コリコントロールは 色素を全く製造しなかった。

ｐＢＧｃ６２０．３の液体培養物も、熱誘発させ、且つ銅及びＬ−チロシンの存 在下において３０°Ｃで一夜増殖させたときに強いメラニン色素沈着を示した。

ｐＢＧｃ６２０．３の液体培養物中のメラニンの形成は色素の最大製造のため、 熱誘発に続いて２４〜４８時間にわたるインキュベーションを必要とする。Ｅ、 コリのベクターのみのコントロールの培養物は、同じ培地の中で誘発及び−夜増 殖された後に識別可能なメラニンを全く示さなかった。

上記３種の異なった遺伝子構造体を有するＥ、コリ培養物に生成されるメラニン の量をまた測定した。クローンｐＢＧｃ６２０．３は、熱誘導及び液体培養での 一晩の増殖の後、はるかに卓越したメラニン生成体であった（表１）。この培養 物は、濃い黒色のメラニン表現室を示し、そしてベクタ一対照よりもＯＤ　６７ ０ｎｍで３．８２の吸光度単位高かった。６７０ｎｍでのメラニン吸光度の大部 分は、増殖培地に細胞外に存在した。メラニン製造は、野生型チロシナーゼ（ｐ ＢＧｃ６２０．２）を有するフレーム外０ＲＦ４３８タンパク質を製造する液体 培養物において有意に減じられた（８％のｐＢＧｃ６２０．３レベルに）。０Ｒ Ｆ４３８配列を有さないチロシナーゼ融合タンパク質を生成する一晩の培養物に おいていづれのメラニン吸光度も検出されなかった（ｐＢＧｃ６１９　；表１） 。

しかしながら、より長いｐＢＧｃ６１９の培養は、ベクターバックグラウンド以 上である弱いメラニン色素化（誘発の後７２時間以上）を示した（データは示さ れていない）。

細胞内チロシナーゼ活性を、Ｅ、コリの熱誘発された液体培養物からの細胞ペレ ットにおいて測定した。最高の酸素活性は、クローンｐＢＧｃ６２０．２及びｐ ＢＧｃ６２０．３からの細胞ペレットに見出された（表２）。しかしながら、そ れらのクローンにおけるチロシナーゼ活性の相対的レベルは、最終メラニン生成 に比例しなかった（表１）。

従って、それらの２種のクローン間の差異は、機能的な０ＲＦ４３８タンパク質 の存在又は不在に由来する。ひじように低レベルのチロシナーゼ活性がクローン ｐＢＧｃ６１９に検出され（表２）、これは−晩の増殖の後、液体培養物におい て（表１）、又は寒天プレート上においてメラニン表現型を示さなかった。酵素 アッセイの時間にわたってｐＴ７−７ベクタ一対照においていづれのバックグラ ウンドチロシナーゼ活性も検出され得なかった。さらに、誘発された培養物はい づれの検出可能な細胞外チロシナーゼ活性も有さなかった。チロシナーゼを、酵 素活性が最高である場合、熱誘発の２時間後、測定した。

表１．チロシナーゼ誘発の２４時間後、Ｅ、コリの液体培養物におけるメラニン 製造。

ｐＢＧｃ６１９　０．００　− ｐＢＧＣ６２０，２ｏ、３１　ｏ、ｏ　８ｐＢＧｃ６２０．３　３．８２　１． ００＊：培養物を水で１：ｌＯに希釈し、そしてブランクとしてｐＴ７−７ベク タ一対照に対して読み取った。

表２．熟読発の２時間後、Ｅ、コリの液体培養物における細胞内チロシナーゼ活 性。

ｐＢＧＣ６１９０，７９０，０７０ ｐＢＧｃ６２０．２　５．２７　０．６１６ｐＢＧｃ６２０．３　８．５５　１ ．０００＊：ペレット化された細胞ｌ−当たりの酸化されたμモルのし−ＤＯＰ Ａ／分、メラニンは、０．２ｇ／ｌの乾量〜３．Ｏｇ／ｌの乾量のＥ、コリ範囲 で生成する。

例１Ｏ ストレプトミセス　アンチビオチカスＡＴＣＣ８６６３を、Ｎ２アミノ培地にお いて増殖した。Ｋａ＋ｚ、　Ｅ、　ａｎｄ　Ｇａ５５．　Ｗ、　Ａ、　Ｂｉｏｃ ｈｅｍ。

Ｊ、　７３　：　４５８　（１９５９）を参照のこと。全核酸を、Ｈｏｐｗｏｏ ｄ、　Ｄ、　Ａ、など、。

前記例２．　（１９８５）の方法により単離した。Ｓ、アンチビオチカス８６６ ３ＤＮＡを、ｐＩＪ７０２チロシナーゼ遺伝子（１，５ｋ　ｂのＢｃｌ　Ｉフラ グメント）によりプローブした。サザンプロット合成は、多くの制限部位及びＤ ＮＡフラグメントサイズがＳ、アンチビオチカス　チロシナーゼ遺伝子間に保存 されたことを示した。サザンプロットのデータは、６〜８ｋｂのＳａｃ　Ｉ／Ｂ ｍＨＩフラグメントがＳ、アンチビオチカス８６６３ゲノムからクローン化され 、そしてこのフラグメントが０ＲＦ４３８株配列の３′末端、完全な８６６３チ ロシナ一ゼコード配列及び６ｋｂのＤＮＡ３’〜チロシナ一ゼコード配列を含む ことを示した。

ｐＢｓｃ６２０．３　（前記でｐＢＧｃ６２０．３として命名された）を、チロ シナーゼ（ｐＩＪ７０２）遺伝子の３′末端近くにＢｃｌ　Ｉ部位を挿入するこ とによってｐＢ３１０１２．７を製造するために変性した。４図を参照のこと。

０ＲＦ４３８の３′末端及び全体のｐｒＪ７０２チロシナーゼを含む、ｐＢｓ１ ０２１．７からの８９０ｂｐのＳａｃ　Ｉ／Ｂｅｔ　Ｉフラグメントを除いた。

Ｓ、アンチビオチカス８６６３染色体ＤＮＡをＳａｃ　Ｉ／ＢａｍＨＩにより消 化し、そして長さ６〜８ｋｂのＤＮＡフラグメントを低溶融アガロースから回収 した。そのＳａｃ　Ｉ／ＢａｎＨＩフラグメントを、８９０ｂｐのフラグメント が除去されているｐＢｓ１０１２．７に連結し、そしてＥ、コリＣ−６００を形 質転換した。形質転換されたＥ、コリＣ−６００からのプラスミドＤＮＡを用い て、Ｅ、コリＫ　３８　（ｐＧＰｌ−２）を形質転換した。その形質転換された Ｅ、コリをプレート化し、そして３０°Ｃで一晩、増殖し、４２°Ｃて１時間熱 シヨツクし、次に３０°Ｃてインキュベートした。メラニンを生成するクローン を、ｐＢｓ１０１８と命名し、これはＳ、アンチビオチカス［ＭＲＶ３７２０か らの０ＲＦ４３８とＳ、アンチビオチカスＡＴＣＣ８６６８からの０ＲＦ４３８ 株配列との間のハイブリッドを含む。

ｐＢｓ１０１８のプラスミド地図（図４及び５）は、８６６３チロシナーゼ遺伝 子がｐ［Ｊ７０２チロシナーゼと異なる（Ｂａｌ　Ｉ部位からの５ｓｂｐのＳａ ｌ　Ｉ部位及び停止コバンの欠失）ことを示す。また、６ｋｂのＤＮＡ３’〜チ ロシナーゼ遺伝子を前記のようにしてクローン化した。

ｐＢｓ１０１８のいくつかの欠失又はサブクローン（６図）を調製しくｐＢＳ１ ０２２、１０２４．１０２５及び１０２６）　、種々の長さのチロシナーゼ３’ ＤＮＡがメラニン生成及びチロシナーゼ発現に対して有する効果を研究した。

ｐＢｓ１０１２．７、　ｐＢｓ６２０．３．　ｐＢｓＩ０１８．　ｐＢｓ１０２ ２．　ｐＢｓ１０２４．　ｐＢｓ１０２５又はｐＢｓ１０２６を存するＥ、コリ Ｋ　３８　／ｐＧＰ１−２の液体培養物を、４２°Ｃで熱ショックせしめ〔誘発 し〕、そして（”Ｓ）メチオニンによりパルスラベルした。図７は、個々のｐＢ ｓ１０１２．７．　ｐＢｓ１０１８．　ｐｕｓ１０２２、　ｐＢｓ１０２４．　 ｐＢｓ１０２５及びｐＢｓ１０２６からのチロシナーゼ及び０ＲＦ４３８タンパ ク質の予想されるサイズのタンパク質バンドの存在を〜３０ｋＤ及び〜１５ｋＤ て示す。

熱誘発された液体培養物におけるメラニン色素化を、ＯＤｓ７ｏｎｍにより決定 した。ｐＢｓ１０２４は、卓越したメラニン生成体であることが決定された。ｐ Ｂｓ６２０．３を対照として使用した。図８を参照のこと。

ｐＢｓ１０２４におけるメラニン製造は、使用された前駆体に依存して、０．２ ｇ／ｌの乾量〜３．Ｏｇ／ｌの乾量の範囲である。

例１１ Ｅ、コリＫ　３８　（ｐＧＰｌ−２）／ｐＢｓ１０２４又はＩ）ＢＧＣ６２０， ３を、Ｎ−アセチル−し−チロシンにより補充された液体培地において増殖した 。ピンク色の色素をその増殖培地から単離した。

例１２ Ｅ、コリＫ　３８　（ｐＧＰｌ−２）／ｐＢＧｃ６２０．３又はＰＢＳ１０２４ を、Ｎ−チロシンエチルエステルにより補充された液体培地において増殖した。

黄色の色素をその増殖培地から単離した。

例１３ Ｅ、コリＫ　３８　（ｐＧＰｌ　−２）　／ｐＢＧｃ６２０．３又はｐＢｓ１０ ２４を、色素が緑色になるまで、Ｎ−アセチル−Ｌ−チロシンにより補充された 液体培地において増殖した。緑色の色素を、前記増殖培地から単離した。

プラスミドｐＢｓ１３０を、図ＩＩ及び１２に示されるようにして調製した。手 短に言及すれば、ｐｒＪ７０２をｐＢＲ３２２中にクローン化し、ｐｒＪ／Ｐｖ ｕＩＩフラグメントをｐＢｓｌｌｏから単離し、そしてρｔｌｃ１９からの大き なＳａｃ　Ｉ／Ｐｖｕ　ＩＩフラグメントに連結し、ｐＢＳ１１５を製造した。

ｍｅｌ遺伝子を含むＨｉｎｄ　Ｉ［［／　ＥｃｏＲＩフラグメントをｐＢｓｌ１ ５から単離し、そしてｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ　ＫＳ　（＋）からの大きなＨｉ ｎｄＩ［Ｉ／ＥｃｏＲＩフラグメントに連結し、ｐＢｓ１２０を製造した。畦遺 伝子を含むＸｈｏ　Ｉ／Ｓｍｄ　ＩフラグメントをｐＢｓ１２０から単離し、Ｘ ｈｏ　Ｉリンカ−を付加し、匠Ｉにより消化し、そしてｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ 　ＫＳ　（＋）のＸｈｏ　Ｉ部位中にクローン化し、ｐＢｓ１３０を製造した。

プラスミドｐＢ３６２０．３を、Ｓａｌ　Ｉにより一部消化し、チロシナーゼ活 性を破壊するために領域９５４〜１２２１を除去した。フラグメントを単離し、 そしてｌＮＩ＆に示されるように、再連結し、ｐＢＳ６２３を製造した。ｍｅｌ −プラスミドｐＢＳ６２３を含むＥ、コリ株は、野生型チロシナーゼよりも６９ 個のアミノ酸短い切断された不活性チロシナーゼを製造した。

プラスミドｐＢＳ６３４を、図１３に示されるように調製した。手短に方向づけ された突然変異誘発を用いてチロシナーゼの出発コドンで構築し、プラスミドｐ Ｍｃ　／ｍｅｌ　Ｎｄｅ　Ｉ　１２を製造した。チロシナーゼの出発コドンでＮ ｄｅ　Ｉ部位と共にｍｅｌ遺伝子を含むｐＭｃ　／ｍｅｌ　ＮｄｅＩ　＃２のＳ ａｃ　Ｉ　／Ｅｃｏ　ＲＶフラグメントを、Ｈｉｎｄｌ［により消化し、フレノ ウフラグメントによりフィルインし、そしてＳａｃ　Ｉにより消化し、Ｓａｃ　 Ｉ／ＨｉｎｄＩＩＩフラグメントを除去した。その得られるベクターを、ｐＢＳ ６３４として同定し、そしてその地図は図１４に示される。

０ＲＦ−チロシナーゼ遺伝子を含むｐＢＳ６３４からのＮｄｅ　Ｉ／Ｂｃｌ　Ｉ フラグメントを単離し、そしてｐＴ７−７中にクローン化し、図１５に示される ｐＢＳ６３５を製造した。チロシナーゼコード配列は、ｐＢｓ６３５におけるＴ ７プロモーター及び遺伝子１ｏリポソ一ム結合部位（ＲＢＳ）の後方に、場合に よっては位置する。新しく構成されたＴ７プロモーター／ＲＢＳ　／チロシナー ゼコード配列を含むｐＢＳ６３５からのＢｇｌ　ＩＩ／Ｂｃｌ　Ｉフラグメント を、ｐＢＳ６２３のＢｇｌ　ＩＩ部位中にクローン化し、図１７に示されるｐＢ ３６３６を製造した。図１７に示されるように、ｐＢＳ６３６は、０ＲＦ４３８ 及びチロシナーゼ遺伝子を独立して駆動する２つのＴ７プロモーターを有する。

それらの遺伝子の個々がまた、それらの天然のリポソーム結合部位の代わりにＴ ７リポソーム結合部位を利用するために構成される。

記載されるようにして増殖し、そして培地を例９に記載されるようにしてメラニ ン製造についてアッセイした。少なくとも４倍のメラニン製造が、ｐＢｓ６２０ ．３に比較して、ｐＢ６３６に関して見出された。

本発明は好ましい態様の詳細により開示されて来たが、その開示は例示的であっ て、制限的ではなく、それは本発明の範囲内で当業者により変性され得る。

ＦＩＧ、　３Ａ ＦＩＧ、　３Ｂ ＦＩＧ、　６Ｄ 口Ｇ、７ ＯＤ６７０ｎｍ ＦＩＧ、　８ ＦＩＧ、　１２Ａ ＦＩＧ、　１２Ｅ （図１２Ｃ）から ＦＩＧ、　１３Ａ ＦＩＧ、　１３Ｂ ＦＩＧ、　１４ 手続補正書（方式） ％式％ １、事件の表示 ＰＣＴ／ＵＳ９１１０４４９２ ２、発明の名称 形質転換された微生物によるメラニンの製造３、補正をする者 事件との関係　特許出願人 名称　バイオソース　ジェネティクス コーポレイション ４、代理人 住所　〒１０５東京都港区虎ノ門−丁目８番ＩＯ号５、補正命令の日付 ６、補正の対象 （１）特許法第１８４条の５第１項の規定による書面の「特許出願人の代表者」 の欄 （２）明細書、請求の範囲及び要約書の翻訳文（３）図面の翻訳文 （４）委任状 ７、補正の内容 （１）（ト）別紙の通り （２）明細書、請求の範囲及び要約書の翻訳文の浄書（内容に変更なし） （ｆｆｉ　図面の翻訳文の浄書（内容に変更なし）８、添付書類の目録 （１）訂正した特許法第１８４条の５ 第１項の規定による書面　１通 （２）明細書、請求の範囲及び 要約書の翻訳文　各１通 （３）図面の翻訳文　１通 （４）委任状及びその翻訳文　各１通 国際調査報告 ５ｅｒｉａｌ　Ｎｏ、ｐｃｉ／ｕｓ　９１ｚｅの４４９２ｔｊｒａｕｐ　Ｉ、　 Ｃ１ａｉｌＩｓ　１−２１１１１　ｄｒａＶｎ　ｔｏ　ａｃｕｌｔｕｒｅａｎｄ ｗｔ）ｍｏＺｐ＋℃ｋｉｄｍｅｌａｎｉｎｓ　ｂｙ　ｒｅｃ：０ｅａｂｉｎａｒ ’ｔ　ｍｅａｎｌｌ＋　ｅ１ｍａｌｌｌｆｉ＃ｄ　ｌｌ’Ｉ　Ｃ１ａｓｓ　４３ ５゜Ｇｒｏｕｐ　ＩＩ、　Ｃ１ｌ工ｍｍ　２１−２３．　ｄｒａＶｎ　ｔｏ　ａ ｎ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｖｅｃｔｏｒ。

ｃｌａｓｓｉｆｉｅｄ　ｚｎ　Ｃ１ａｓｓ　４コ５．　ｇｕｂｃ上ａｓｓ　３２ （ｈ。

Ｇｒｏｕｐ　１１１．　Ｃ１６１ｍ　ｊ４．　ｄｒａｗｎ　ｔｏ　ｔｙｒｏｓｚ ｎａ＊ｅ＋　ｃｌａｓｓｉｆｉｅｄ　１ｎＣ１ａｓｓ　５３の、ｓｕｂｃｌａｉ ｍ　３５のや。

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Ｇｒｏｕｐ　Ｖｌ、Ｃよａｘｅ　２７．　ｄｒａｖｒ＋　ｔｏ　ｍ　ｔｙｒｏｓ ｉｎｅ’ｓ　ｇｏｎｅ、　ｃ１ｍ＊＊ｔｆｉｅｄｉｎ　Ｃ１ａｓｓ　５３６．　 ｓｕｂｃｌａｉｍ　２７゜Ｇｒｏｕｐ　ＶｘＸ、　Ｃｌａｉｍ　２１１．　ｄｒ ａｗｎ　ｔＱ　ａｎ　＠ＣｔｉＶ＠ｔｏｒ　ｇｅｒ＋＠ｌ　ｃｌａｓｓｉｆｉｅ ｄＧｒｏｕｐ　ＶＩＩＬ　Ｃｌａｉｍ　２９−３Ｂ、　ｄｒａＶｎ　ｔｏ　ＩＩ 　＋ｍｅｔｈｏｄ　ｏ（＋＋ｎｋｉｎｇｔｙｒｏ＊１ｎａ＊ｅ　ｂｙ　ｒｅｃｏ ＋ａｂｉｎａｒ＋ｔ　ｔｅｃｈｒ＋ｏｌｏｑｙ、ｃｌａｓｓｉｆｉｅｄ　ｉｎ　 ４コ！Ｌ　ｇｕｂｅ撃高■■ Ｇｒｏｕｐｓ　Ｘ、ＶＩＩ工、ａｎｄ　ＸＸ　ａｒｅ　ｍｕｔｕａｌｌｙ　ｅｘ ｃｌｕｓｉｖｅ　ａｎｄ　ｄｉｓｔｉｎｃｔＧｒｏｕｐｓ　１ｌ−ＶＨａｒｅ　 ｍｕｔｕａｌｌｙ　ｅｘｅｌｕｓｉｖｅ　ａｎｄ　ｄｉｓｔｉｎｃｔ　ｐｒｏｄ ｕｃｔ＋ｗ。

Ｕｐｏｎ　Ｑ五ｅｃｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｇｒｏｕｐ　１．　ｆｕｒｔｈｅｒ　ｅｌ ｅｃｔｉｏｎ　ｏｆ　５ｐｅｃｉｅｓ　ｉｓＴｈｅ　（Ｊａｔｗｎｍ　ｏｆ　Ｇ ｒｏｕｐ　Ｘ　ｖｔｌ　ｂｅ　ｅｘ−＋ｍ１ｎｅｄ　ｃａｓ＋ｍｅｎ＊ｕｒａｔ ｅ　ｗｉｔｈ　ｔｈｅａｐｓｅｌｏｍ・工＠ＣｔＬＯ１’ｌ。

フロントページの続き （５１）　Ｉｎｔ、Ｃ１，５識別記号　庁内整理番号Ｃｌ２Ｐ　１７／１６　８ ９３１−４Ｂ／／ＣＣ１２Ｎ　１／２１ Ｃ１２Ｒ１：１９） （Ｃ１２Ｎ　９１０２ Ｃ１２Ｒ１：１９） （Ｃ１２Ｎ　９１０２ Ｃ１２Ｒ１：４８） （Ｃ１２Ｎ　１５１５３ Ｃ１２Ｒ１：４８） （８１）指定回　ＥＰ（ＡＴ、ＢＥ、ＣＨ，ＤＥ。

ＤＫ、　ＥＳ、ＦＲ，ＧＢ、　ＧＲ，ＩＴ、　ＬＵ、　ＮＬ、　ＳＥ）、ＡＵ、 ＣＡ、ＪＰ、ＫＲ （７２）発明者　ガーガー、ステイーブン　ジェイ、、ジュニア アメリカ合衆国、カリフォルニア　９５６８８゜ペイ力ビル、コツトンウッド　 ストリート（７２）発明者　スパーロー、ジエナディエ　ジー。

アメリカ合衆国、カリフォルニア　９５６８８゜ベイカビル、レンザム　ドライ ブ　２４９Ｉ （７２）発明者　ターペン　トーマス　エイチ。

アメリカ合衆国、カリフォルニア　９５６８８゜ペイ力ピル、ウッデレスト　ド ライブ （７２）発明者　グリル、ローレンス　ケー。

アメリカ合衆国、カリフォルニア　９５６８８゜ペイ力ビル、カントロー　ロー ド　３５７０（７２）発明者　チェドケル、マイルズ　アール。

アメリカ合衆国、カリフォルニア　９５６８７゜ペイ力ビル、スタンレー　コー ト１９０

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．メラニンの製造方法であって、メラニン製造微生物を弱められた発酵条件下 で適切な増殖培地において、その培地中のメラニンの濃度が少なくとも約３．３ ｇ湿量／ｌになるまで増殖し、そして前記増殖培地からメラニンを抽出すること を含んで成り、前記徴生物がメラニンの製造において有用な複数のＤＮＡ配列を 含むように形質転換され、ここで第１ＤＮＡ配列がメラニン製造酵素をコードし 、そして第２ＤＮＡ配列が活性化物質をコードすることを特徴とする方法。 ２．メラニンの製造方法であって： （ａ）メラニンの製造において有用な複数のＤＮＡ配列を含む発現ベクターを調 製し、ここで第１ＤＮＡ配列がメラニン製造酵素をコードし、そして第２ＤＮＡ 配列が活性化物質をコードし；（ｂ）前記ベクターにより宿主細菌を形質転換し ；（ｃ）前記形質転換された細菌を、適切な増殖培地において、その培地におけ るメラニンの濃度が少なくとも約３．３ｇ湿量／ｌになるまで増殖し；そして （ｄ）前記増殖培地からメラニンを抽出することを含んで成る方法。 ３．前記第１ＤＮＡ配列が、オキシドレダクターゼ、チロシンヒドロキシラーゼ 、チロシナーゼ、ラッカーゼ及びポリフェニルオキシダーゼから成る群から選択 された遺伝子生成物をコードする請求の範囲第１又は２項記載の方法。 ４．前記第１ＤＮＡ配列がチロシナーゼをコードする請求の範囲第１又は２項記 載の方法。 ５．前記微生物が前記ＤＮＡ配列の追加の３′変性又は遺伝子コード配列により 形質転換される請求の範囲第１〜４のいづれか１項記載の方法。 ６．前記微生物が前記第１ＤＮＡ配列の分泌を可能にするシグナル配列をコード するＤＮＡ配列により形質転換される請求の範囲第１〜５のいづれか１項記載の 方法。 ７．前記第１ＤＮＡ配列が菌類、細菌、ヒト、動物又は植物から得られる請求の 範囲第１〜６のいづれか１項記載の方法。 ８．前記微生物が細菌又は菌類である請求の範囲第１〜７のいづれか１項記載の 方法。 ９．前記微生物がストレプトミセス又はエスチエリシア細菌である請求の範囲第 １〜８のいづれか１項記載の方法。 １０．前記ストレプトミセスがストレプトミセスリビダンス、ストレプトミセス スカビエス、ストレプトミセスアンチビオチカス、ストレプトミセスコエリカラ ー（ｃｏｅｌｉｃｅｌｏｒ）、ストレプトミセスフラジアエ、ストレプトミセス グラウセセンス（ｇｌａｕｃ−ｅｓｅｎｓ）、ストレプトミセスベネズラエ（ｖ ｅｎｅｚｕｌｌａｅ）及びストレプトミセスアズレウスから成る群から選択され る請求の範囲第９項記載の方法。 １１．前記エスチエリシアがＥ．コリである請求の範囲第９項記載の方法。 １２．前記増殖培地が１又は複数のメラニン前駆体を含む請求の範囲第１〜１１ のいづれか１項記載の方法。 １３．前記前駆体がカゼイン加水分解物又はカゼインペプトンにより供給される 請求の範囲第１２項記載の方法。 １４．前記前駆体が１−システインエチルエステル、３−ニトロ−Ｌ−チロシン 、３−フルオロ−ＤＬ−チロシン、３−メトキシ−Ｌ−チロシン，Ｌ−プロリン 、（＋）−シネフリン、ＤＬ−ｍ−チロＤＬ−オクトパミン、４−ヒドロキシイ ンドール、チラミン、Ｌ−システイン、Ｌ−メトイオニン、５，６−ジメトキシ インドール、（−）−アルテレノール、Ｄ−ＤＯＰＡ、５−ヒドロキシトリプタ ミン、Ｌ−チロシンエチルエステル、Ｌ−チロシン及びＬ−ＤＯＰＡから成る群 から選択される請求の範囲第１２項記載の方法。 １５．１つの前駆体がチロシンであり、そして１又は複数の前駆体が１−システ インエチルエステル、３−ニトロ−Ｌ−チロシン、３−フルオロ−ＤＬ−チロシ ン、３−メトキシ−Ｌ−チロシン、Ｌ−プロリン、（±）−シネフリン、ＤＬ− ｍ−チロシン、３−ヨード−Ｌ−チロシン、３，４−ジヒドロキシケイ皮酸、グ リシル−Ｌ−チロシン、Ｌ−Ｂ−３，４−ＤＯＰＡメチルエステル、ＤＬ−オク トパミン、４−ヒドロキシインドール、チラミン、Ｌ−システイン、Ｌ−メトイ オニン、５，６−ジメトキシインドール、（−）−アルテルノール、５−ヒドロ キシ−Ｄ−ＤＯＰＡ、５−ヒドロキシトリプタミン、Ｌ−チロシンエチルエステ ル及びＬ−ＤＯＰＡから成る群から選択される請求の範囲第１２項記載の方法。 １６．前記微生物がベクターｐＢＳ１０５５又はｐＢＳ１０５７を含むＳ．リビ ダンスである請求の範囲第１〜１５のいづれか１項記載の方法。 １７．前記微生物がＳ．リビダンスＴＫ６４である請求の範囲第１６項記載の方 法。 １８：前記微生物がｐＧＰ１−２を有する及びまた、ベクターｐＢＧＣ６２０， ３，ｐＢＳ１０１２．７，ｐＢＳ１０１８，ｐＢＳ１０２２，ｐＢＳ１０２４， ｐＢＳ１０２５，ｐＢＳ１０２６及び／又はｐＢＳ６３６のいづれかを含むＥ． コリである請求の範囲第１〜１７項のいづれか１項記載の方法。 １９．前記微生物がＥ．コリＫ−３８，Ｃ６００，ＪＭ１０１又はＪＭ１０９で ある請求の範囲第１８項記載の方法。 ２０．増殖培地、及びメラニンの製造に有用な複数のＤＮＡ配列を含む微生物を 含んで成る培養物であって、第１ＤＮＡ配列がメラニン生成酵素をコードし、そ して第２ＤＮＡ配列が活性化物質をコードし、そして少なくとも約３．３ｇ湿量 のメラニン／培地１ｌを生成することができる培養物。 ２１．ストレプトミセスアンチビオチカスＡＴＣＣ８６６３のチロシナーゼ遺伝 子を含む発現ベクター。 ２２．チロシナーゼに対する陽性の活性化物質機能を有するタンパク質をコード する遺伝子配列をさらに含み、そして前記遺伝子配列がストレプトミセスアンチ ビオチカスＡＴＣＣ８６６３から単離される請求の範囲第２１項記載の発現ベク ター。 ２３．ｐＢＳ１０５５又はｐＢＳ１０５７である請求の範囲第２１又は２２項記 載の発現ベクター。 ２４．ストレプトミセスアンチビオチカスＡＴＣＣ８６６３からの精製されたチ ロシナーゼタンパク質。 ２５．ストレプトミセスアンチビオチカスＡＴＣＣ８６６３からの精製された活 性化物質タンパク質。 ２６．ストレプトミセスアンチビオチカスＩＭＲＵ３７２０のＯＲＦ４３８及び Ｓ．アンチビオチカスＡＴＣＣ８６６３のＯＲＦ４３８株のキメラのタンパク質 生成物である精製された活性化物質タンパク質。 ２７．ストレプトミセスアンチビオチカスＡＴＣＣ８６６３からの精製されたチ ロシナーゼ遺伝子。 ２８．ストレプトミセスアンチビオチカスＡＴＣＣ８６６３からの精製された活 性化物質遺伝子。 ２９．活性チロシナーゼの製造方法であって：（ａ）チロシナーゼのためのコー ド配列を含むＤＮＡフラグメント及び活性化物質タンパク質のためのコード配列 を含むＤＮＡフラグメントによりＥ．コリ細胞を形質転換し；そして（ｂ）前記 形質転換されたＥ．コリ細胞を適切な培地において増殖することを含んで成る方 法。 ３０．前記活性チロシナーゼを抽出することをさらに含んで成る請求の範囲第２ ９項記載の方法。 ３１．前記活性チロシナーゼの特異的活性が少なくとも約１．５０モルの酸化さ れたＬ−ＤＯＰＡ／分／ｍｇチロシナーゼである請求の範囲第２９又は３０項記 載の方法。 ３２．前記増殖培地からＥ．コリ細胞を除去し、そして前記細胞を透過性にする ことをさらに含んで成る請求の範囲第２９〜３１のいづれか１項記載の方法。 ３３．前記透過性にされたＥ．コリ細胞におけるチロシナーゼの特異的活性が少 なくとも約７．５０μモルの酸化されたＬ−ＤＯＰＡ／分／ｍｌ細胞である請求 の範囲第３２項記載の方法。 ３４．前記透過性にされたＥ．コリ細胞におけるチロシナーゼの特異的活性が少 なくとも約１３９μモルの酸化されたＬ−ＤＯＰＡ／分／ｍｌ細胞である請求の 範囲第３２項記載の方法。 ３５．前記透過性にされたＥ．コリにおけるチロシナーゼの特異的活性が少なく とも約２０．０１μモルの酸化されたＬ−ＤＯＰＡ／分／ｍｌ細胞である請求の 範囲第３２項記載の方法。 ３６．前記活性化物質タンパク質がＯＲＦ４３８によりコードされる請求の範囲 第２９〜３５のいづれか１項記載の方法。 ３７．前記活性化物質タンパク質がストレプトミセスアンチビオチカスＡＴＣＣ ８６６３からの読み取り枠によりコードされる請求の範囲第２９〜３５のいづれ か１項記載の方法。 ３８．前記活性化物質タンパク質がハイブリツドコード配列によりコードされる 請求の範囲第２９〜３５のいづれか１項記載の方法。 ３９．活性チロシナーゼの製造方法であって：（ａ）チロシナーゼのためのコー ド配列を含むＤＮＡフラグメント及び活性化物質タンパク質のためのコード配列 を含むＤＮＡフラグメントにより単細胞生物を形質転換し；そして（ｂ）前記形 質転換された単細胞生物を適切な培地において増殖することを含んで成る方法。 ４０．前記単細胞生物が酵母である請求の範囲第３９項記載の方法。 ４１．前記単細胞生物がストレプトミセスである請求の範囲第３９項記載の方法 。