JPH06500106A - 細胞培養及び治療に有用なビタレテイン - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 細胞培養及び治療に有用なビタレテイン区立Ω崖μ 本発明は、ナショナル　インスチツート　オブ　ヘルス及び米国政府と共に許可 ＃ＨＬ　１６．７９６、＄ＡＭ　１０，６２８及び＃５Ｏ７ＲＲ０５５８３−２ ５での許可の下での研究の成果で為されたものである。

及五丘１１ １、＆コヱａ野 本発明は、ビタレテインのようなカルボキシ−アミノ−アミドの硫貢−含有炭化 水素誘導体［Ｎ−（２−メルカプト−エタン）−３−カルボキシ−アミノ−プロ パンアミド］　（以下、”ビタレテインモジュレイター”と称する）を有する細 胞活性モジュレイトする新規な一部の化合物を提供する。本発明の化合物は、高 められる生物学的活性で特徴ずけられ、なかんずく、細胞の表現型発現及び生活 力の改良に有用である。特に、本発明の化合物は、細胞寿命期間を増加し、細胞 生体生産性を増加し、培養物中の細胞機能を改良し、培養物に対して細胞耐性を 順応化する。

”細胞形質発現”は、ここで、細胞染色体列の発現にのみ関している”遺伝子型 細胞発現”とは逆に、遺伝学的に及び環境的に決定された個々の細胞の物理学的 、生化学的及び生理学的特性の全領域にわたり、表示されているものとして定義 されるものである。（例えば、Ｄｏｒｌａｎｄ’ｓ　ｌ１ｌｕｓｔｒａｔｅｄ　 Ｍｅｄｉｃａｌ　Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ、２６ｔｈ　Ｅｄｉｔｉｏｎ、　１９７ ４．胃、　Ｂ、　５ａｕｎｄｅｒｓ、　Ｐｈ１ｌａｄｅｌｐｈｉａを参照）、従 って、本発明の化合物の生化学的活性は、条件により影響されるとして、培養物 中の細胞の遺伝的物質の発現の変調を含み、細胞の年齢、用いた培養成いは条件 、及び、適宜に添加した生物学的エフェクター（効果体）の存在をも含むもので ある。

区立立曳遭 本発明は、ナショナル　インスチツート　オブ　ヘルス及び米国政府と共に許可 ＃ＨＬ　１６．７９６、＃ＡＭ　１０．６２８及び＃５Ｏ７ＲＲ０５５８３−２ ５での許可の下での研究の成果で為されたものであり、米国政府は、それに、あ る権利を有する。

ｌ五Ω！１ １．１１立腹嵐至１ 本発明は、ビタレテインのようなカルボキシ−アミノ−アミドの硫黄−含有炭化 水素誘導体［Ｎ−（２−メルカプト−エタン）−３−カルボキシ−アミノ−プロ パンアミド］　（以下、′ビタレテインモジュレイター”と称する）を有する細 胞活性モジュレイトする新規な一部の化合物を提供する。本発明の化合物は、高 められる生物学的活性で特徴ずけられ、なかんずく、細胞の表現型発現及び生活 力の改良に有用である。特に、本発明の化合物は、細胞寿命期間を増加し、細胞 生体生産性を増加し、培１物中の細胞機能を改良し、培養物に対して細胞耐性を 順応化する。

”細胞形質発現”は、ここで、細胞染色体列の発現にのみ関している”遺伝子型 細胞発現”とは逆に、遺伝学的に及び環境的に決定された個々の細胞の物理学的 、生化学的及び生理学的特性の全領域にわたり、表示されているものとして定義 されるものである。（例えば、Ｄｏｒｌａｎｄ’ｓ　ｌ１ｌｕｓｔｒａｔｅｄ　 Ｍｅｄｉｃａｌ　Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ、２６ｔｈ　Ｅｄｉｔｉｏｎ、　１９７ ４．胃、Ｂ、５ａｕｎｄｅｒｓ、Ｐｈ１ｌａｄｅｌｐｈｉａを参照）、従って、 本発明の化合物の生化学的活性は、条件により影響されるとして、培養物中の細 胞の遺伝的物質の発現の変調を含み、細胞の年齢、用いた培養成いは条件、及び 、適宜に添加した生物学的エフェクター（効果体）の存在をも含むものである。

２、従来　の簡単を置引 培養中で連続的に成長できない細胞（不死でない細胞或いは細胞系統）は、予定 できる寿命期間、試験管内で、それは、３つのフェイスに分けられ、成長、成熟 及び減衰（即ち、老化）に相当している。細胞老化は、良く認識されている現象 であり、なかんずく、成熟した個体細胞が再生するに必要な時間を統計的にいえ ば著しく伸ばすにより、また、本質的にエネルギー及びマテリアル要求性を効果 的にする細胞の能力を増すことによる正常な細胞成長パターンを伸長することに より、また、細胞の生体生産性を終わし、統計的に顕著に減少させることにより 、特徴ずけられる、培ＩＩ物中の多くの死亡していない細胞、特に、哺乳動物の 細胞の寿命期間は、例え、最適な培養条件下であったも、時間程度から数週間に もよく変わるものである。突然の、そのような培養物の早過ぎる死は、普通のも のである。不死の細胞と称するものも、不死の昆虫細胞系統或いは哺乳動物腫瘍 細胞系統でも、細胞マスの減衰と一緒に、培養物中の時間の機能として生活力を 無くす傾向がある。更に、哺乳動物肝細胞のような多くの細胞は、実際問題とし て長期間培養物に現在のところ順化できていない。

試験管内の細胞寿命の固有の制限問題は、化学的、工業的及び研究において用い た培養物で重要な意味を有し、特に、哺乳動物細胞生産物の試験管内生産で、リ コンビナント細胞生産物、特に、ペプチド、プロティン母ホルモン、酵素及び免 疫グロブリンのようなグリコプロティンのような最適の生産が、細胞のライフ・ サイクルの予備老化フェーズで得られる場合において、特に関心のある問題であ る。種々の方法が、細胞成長パターンにより存在する制限内での細胞の生産性と 寿命を最大するために、提言され、それらは、一義的には、栄養の素早い補給と 廃棄物の除去の技術により、培養条件の改良に関し、例えば、潅流及び連続培養 法にようなもので、或いは不死化細胞系統を有するパイブリット化のような細胞 の生物学的操作に関する。そのような技術は、一般的には、大きなスケールの適 用でバイオ生産性を改良するためであるが、改良された結果は、細胞成長パター ンの変化に通常貢献するものでは、なかった。更に、そのような細胞バイオ生産 性の改良の先行方法は、培養物に順化しないと考えられる細胞に対して広く適用 できるものではなく；上記の肝細胞は、例えば、現在、既知の培養条件下で、数 時間以上、試験管内で維持できないものである。

細胞成長パターンを生物学的に変更する方法は、細胞伝搬を改良するように低減 されたが、多くのものは、細胞成長因子の使用で予言される。一般的に群とされ る成長因子は、培養物中の細胞の増殖を上げる傾向があり、これらの因子に接触 された細胞は。

急速に、消費され、死亡し、細胞のバイオ生産性にはほとんどない収穫である。

更に、そのような成長因子は、培養物に耐性のある細胞を順化するに有用でなか った。

従って、培養物中の細胞の生活力及び伝搬を促進するに効果的である化合物を提 供するに望ましい。特に、細胞生活力及び細胞バイオ生産性、細胞機能及び細胞 寿命の促進に効果的で、培養物に対して耐性細胞を順化するに効果的である。こ のような化合物は、それ自体のみならず、細胞伸長を促進すると知られ、安定化 各々細胞バイオマスの増加のような、その意図する組合せ効果のためである知ら れ他のバイオエフェクターと組合せて、潜在的に有用である。

免五二見屋 本発明は、集合的に以下”ビタレテイン　モジュレイター”と称する新規な一部 の化合物を提供する。そして、それは、ビタレテイン、Ｎ−（２−メルカプト− エタン）−［３−（カルボキシアミノ）−プロパンアミド］　；ピタレチン、こ の化合物の酸化（或いはジサルフィド）形；これらの化合物の生物学的に活性の 或いは活性化できる配列形、水和物及びそのオリゴマーを提供する。更に、本発 明のモジュレイターは、生物学的に活性で或いは活性化できるビタレテイン或い はビタレチンの同形物或いは類型物及びその相当する再配置形、塩、水和物及び 他のオリゴマーを含むものである。本発明の化合物は、なかんずく、培養物中の 細胞の表現型発現及び生活力を促進するに有用であり、例えば、培養物中の増加 された細胞バイオ生産性の促進、改良された細胞機能の促進、及び培養物に対す る耐性細胞の順化を含むものである。

この新規なりラスの化合物は、広く、多種の目的に、培養物中の細胞の生活力を 促進する。例えば、工業的或いは調査目的のために、細胞生産物の効率的で長期 間の試験管内での細胞生産物の生産を促進する。また、異常及び正常の細胞で培 養物に耐性にする治療的な比較研究にも有用である。また、試験管内の移植体組 織或いは器官の出現及び生産に、また、広く、予め純粋な理論的にバイオメジカ ル適用のための細胞の培養に有用である。モジュレイターは、細胞生産及び生活 力を最適化する広い種類の細胞に遺伝子刺激を与えることにより、少なくとも部 分的に、機能するようであり、意図するバイオ技術、特に、バイオメジカル、効 果的な細胞培養の上に予言される適用の広い範囲での出発点を提供する。

図面の簡単な説明 次の図面では、マウスは、週に３回注射され、誤差バーは、平均値の標準誤差を 示す。

第１図は、食塩液で注射されたマウス；クロード７ン（ＣＩｏｕｄｍｚｎ）Ｓ− ９１メラノマの若い（上の曲線）と老い（下の曲線）マウス（バルブ　（ｘＤＢ Ａ）の平均基底発現を示す。

第２図は、生理的食塩水注封のマウス（下の曲線）に比較して１１００ｎのβ− アレチン／　ｋ　ｇマウス（上の曲線）の注射により生産された腫瘍出現での刺 激性の顕著性を示すものである。

第３図は、１１００１）のビタレテイン／ｋｇ体重で注射したマウスと比較した 、１００ｐのｇβ−アレチン／ｋｇマウス（上の曲線）の注射により生産された 腫瘍出現での刺激性のＩＩＷ性を示すものである。

第４図は、コントロール即ち生理的食塩水−注射のマウス（上の曲線）と非誘導 のβ−アレチンのような不純物の検出を最大にするとタレチンの最終投与量に近 い投与で、ビタレチンー注射のマウス（下の曲線）との腫瘍出現の差異を示すも のである。

第５図は、β−アレチン調製剤で注射のマウスでのとＩｉ３図に示す化合物の比 較割合の１／１０で調製のビタレチンで注射のマウスとの腫瘍出現の顕著な差異 を示し、実施例■■の方法による安定なビタレチンに対するβ−アレチンの近似 量変換を示すものである。

ＩＩ６図は、１１００ｎβ−アレチン／　ｋ　ｇマウスで注射の５匹マウスでの 腫瘍出現の増加（上の曲線、Ｌｏｇ　ｐｇ／ｋｇ＝５；第７図）と比較したｔｏ ｐｇβ−アレチン／ｋｇマウスで注射の５匹のマウスでの腫瘍出現の増加（下の 曲線；Ｌｏｇ　ｐｇ／ｋｇマウス＝１；第７図）のｍｓ性を示すものである。

第７図は、５匹の生理的食塩水−注射のマウス（０）の平均腫瘍出現とβ−アレ チン濃度の増大（ｔｏｐｇ／ｋｇマウスから１１０１ｚ／ｋｇマウス）で１／８ 　ｌｏｇ　（ｔ　Ｏ）で注射の５匹のマウスでの平均腫瘍出現を示すものである 。

第８図は、５匹の生理的食塩水−注射のマウス（０）の平均腫瘍出現とβ−アレ チン濃度の増大（ｔｏｐｇ／ｋｇマウスから１１００ｔｔ／ｋｇマウス）で１／ ８１ｏｇ（ＬＯ）とｌｎｇビタレテインＬ／ｋｇマウスの両方を注射した５匹の マウスでの平均腫瘍出現を示すものである。

第９図は、第８図の組合せ治療を受けたマウスでの平均腫瘍出現と第７図の治療 を受けたマウスでの平均腫瘍出現との差異を示し、即ち、β−アレチンのみを低 減した反応の後に、β−アレチン濃度を変えてときの変更腫瘍出現でのｌｎｇ／ ビタレテインｖ４／　ｋ　ｇマウスのネット効果を示す。

第１０図は、（第９図の反時計回転したもの）；ｌｎｇビタレテインＶ、７ｋｇ マウスの抗重瘍活性を最適化するβ−アレチン濃度を示す。

第１１図は、（第９図の反時計回転したもの）；異なるβ−アレチン濃度を受け たマウスでの腫瘍出現を防止するｌｎｇ／ビタレテインＶ、／ｋｇマウスのネッ ト効果を示す。

第１２図は、５匹の生理的食塩水で予処理されたマウス（０）の平均腫瘍出現と ビタレテインｖ４濃度の増大（ｌｆｇ／ｋｇマウスから１００μｇ／ｋｇマウス ）で１／１２　ｌｏｇ（１０）で予処理された５匹マウスでの平均腫瘍出現を示 すものである。

第１３図は、ビタレテインｖ４を一過で除去された：ＩＲ製で注射した５匹のマ ウスでの平均腫瘍出現を示し、元の、即ち、ビタレテインｖ４の一過されていな い濃度のものでプロ７トしたものである第１４図は、−過されていないビタレテ インＶ、で処理されたマウスでの平均腫瘍出現とビタレテインＶ、を一過、除去 された調製物で処理されたマウスでの平均腫瘍出現との差異を示す。

第１５図は、（第１４図の反時計回転したもの）；腫瘍を低減した一過液の最適 濃度（ｌｎｇビタレテインＶ＊／　ｋ　ｇマウス）及び第１図で観察された古い マウスでのより遅い成長に対する傾向を示す。

第１６図は、（第１４図の反時計回転したもの）；異なるビタレテインＶ、濃度 でのビタレテインｖ４調製物の厘瘍−遅延特性を改良するのに一過のネット効果 を示す。

第１７図は、ビタレテインの増大（１００ｐｇ／ｋｇマウスからＬｏｎｇビタレ テイン／ｋｇマウス）で１／３　ｌｏｇ（１０）で注射された５匹マウスでの平 均腫瘍出現を、５匹の生理的食塩水で予処理されたマウス（０）の平均腫瘍出現 との比較して示す。

第１８図は、（第１７図の反時計回転したもの）；更に、ビタレテインをｔｏｏ ｐｇ／ｋｇマウス或いはそれ以下での調製物で注射の濃度を低減する必要性を示 す。

第１９図は、更に、１）マウスのクロードマン５−９１黒腫の処置を、ポリノミ ナル後退分析と３度の自由度を用いて（下の曲線）、本発明の方法に従って、ビ タレチンの投与量の治療の上限（１００ｐｇ／ｋｇ）を示し、２）可能な汚染物 或いは代謝性を持つ厘瘍出曳の刺激での理論的飽和曲線（上の２つの曲線）、３ ）低い濃度でのビタレチンの治療投与量を説明する理論的飽和曲線を示し、それ は、ビタレチンの古典的飽和熱力学は、ビタレテインに還元され、より高い濃度 で、ビタレテインＶ、に重合すること（ポリノミアル後退分析と４度の自由度； 中間の曲線）を示している。

第２０図は、ＮＫ（天然キラー）を含有するヒト白血球調製物の殺菌効率が、ビ タレチンで６日間細胞を処置する上でヒト白血病細胞（Ｋ５６２）の１００％を 溶菌するのに、９倍増加となることを示す。

第２１図は、ＮＫ細胞含有のヒト白血球調製物で腫瘍細胞（Ｋ５６２）を崩壊す る刺激が、濃度−依存性であり、約１１００ａビタレチン／ｍｌ培養媒体で飽和 し、或いは最大になることを示す。

発明の詳細な説明 １、化皇惣： 本発明の化合物は、生物学的に活性の或いは活性化できる、式Ｉを有するカルボ キシ−アミノ−アミドの硫黄−含有炭化水素誘導体であり、以下、”ビタレテイ ン　モジュレイター”或いは”モジュレイター”と称する。

式中、二重括弧の組は、２が１のとき、電荷を有する分子の部分をまとめている 。

Ｍｌ−（Ｃ−Ｍ）−Ｍ−（Ｃ！ｒ’＠２ｃ）とき）の表現は、Ｍｌ−（Ｃ−Ｍ） −Ｍ−１Ｍ、−（Ｃ−Ｍ）−Ｍ−或いはＭ、−（Ｃ−Ｍ）−Ｎ−を示し、そして −（Ｃ−Ｍ）−＆１−（Ｃが１１５Ｃのとき）は。

−（Ｃ−Ｍ）−賛一或いは−（Ｃ−１−Ｎ−を示す、ＡはＸ、−１，直接結合或 いはＲであり１Ｍ及びＭ、は以下の定義である。

各Ｒは、各々Ｈ或いは更に説明するような水素ラジカルである。

Ｘは、更に定義する生物学的に交換使用できるカチオン成田よりチオン錯体であ る。

Ｘｏは、更に定義する生物学的に交換使用できるイオン或ν１はイオン錯体であ る。

Ｍは、　Ｓ、　Ｏ，Ｎ或いはＮＨである。

Ｍｌは、Ｍｌが、化合物が内部環状或いはスピロ環状であるとき、Ｎ或いはＮＨ である条件下で、Ｓ或いはＯであり。

Ｑは、ＣＲ，或いは直接結合であり、Ｑｌは、ＣＲ，、ＣＲ＋　ＣＲｒ或いは直 接結合であり、Ｙは、０、−（Ｃ−０）−Ｒ−或し１は直接結合であり。

ｚ（０）は、式■の化合物の残り部分に伴う中和部分であり、３は、（ｒ’＋ｐ ◆ΣＳ）〉０のとき、少なくとも、ｑ或いはｑ′の１つが、零であり、錯体の残 りの上の電蕾の合計が、イオン上の電荷とノくランスしており、Ｘ或いはＸ°或 いはイオンＸ及びＸｏである条件下で、ｌｒ／（ｒ’◆ｐ◆Σｓ）Ｉの絶対値で あり。

ｍは０或いは＋１から＋５の全整数であり、ｎは、２が１のとき、１或いは２で あり、２が２のとき、ｎは、１或いは１．５であり、ｐは＋１．０或いは−１で あり、ｑ及びｑ゛は各々独立に＋１或いは零であり、 ｒ及びｒ゛は、各々独立に、＋１から＋４の全整数であり、ｒ。

は、−１から−４の全整数であり、Ｓは−１或いは０であり、ｙは１〜４０であ り、２は＋１或いは＋２であり、化合物は、約１ｏ、ｏ　ｏ　ｏダルトン以下の 分子量を有する。

特に、式１の興味のある化合物は、ｙが１〜約２０であり、特に、約２〜１０で あり、或いは化合物の数平均分子量は、約５゜０００ダルトン以下であり、特に 、化合物の分子量は、少なくとも、約１３０ダルトンである。

式Ｉによる好適な化合物は、式＋１の化合物であり、ここで、”ビタレテイン化 合物”と称する。

（Ｉ＋） 式中、Ｒ＋Ｘ、Ｘｌ、Ｙ＋　Ｚ、ａｌｍＩｎ、ｐ、ｑ′、ｒ、ｒｌ、Ｗ、ｙ及び ２は式■の定義と同じである。

本発明のビタレテイン化合物は、式ＩＩ化合物のジサルフイド形で、異種（混合 物）ジサルフイド、トリサルフィド及び同形成いは異種形のジサルフィド、トリ サルフィドの酸化形（ｍｈｏ）であり、但し、２は２で、ｎは、式ＩＩによると １或いは１．５である。

（Ｈａ） 式中、Ｒ，Ｘ％Ｙ、ｎ、ｍ、ｒ及びｙは１式■での定義と同じである。

更に、本発明のビタレテイン化合物は、ｚ＝１のとき、還元及び酸化あれた形で 、式ＩＩの化合物を含むものである。

（ｌｌｂ） 式中、Ｒ，Ｘ、Ｘ’　、Ｙ、Ｚ、ａ、ｍ、ｎ、ｐ、ｑ’、ｒ、ｒ’、ｗ、ｙ及び ２は式ＩＩの定義と同じである。

特に、意図の基−（−（−ｓ＋　、Ｙ、））　”は、サフオキシ或いはＳ−チオ サル７オキシ酸、特に、サルフェニルク、サルフェニツク或いはサルフェニツク 酸のチオエステル及びイオン化基を有し、ｎ＝２のとき、チオサフエニツク、チ オサル７ｔキシル、チオサルフル或いはチオサルフル酸のイオン化基である。− （−（−５＋□Ｙ、））う１の基の例としては、−３ＯＸ’（サルフェ−ト　） 、−３Ｘ’（チオレート）、−５Ｉ（サルフェニル　イオデード）、−５ｌｌ（ サルフェニル　パーイオデード）、Ｓ、Ｏ，Ｘ′（チオサルフェート）；待にＳ Ｈ（チオール或いはサルフェニルク及びＳＯＨ（サルフェニツク酸）である。上 記のサルフェニル　バーイオダードの例としては、■、或いはＨ，Ｏのような分 子或いは、他の中和部分が、基−（−（−５，Ｙ、））　＋’ｌ　Ｘ’　”　ｌ と一緒にでき、２１＋としての全モノマーとなる。

本発明のモジュレイターは、生物学的に活性或いは活性化できる塩、水和物、キ レート、互変異性体、オリゴマー或いは式Ｉ、１１ａ及びＩｌｂの化合物の再配 置形、及びそれらの再配置形の相当する塩、水和物及びキレートを含む。化合物 の再配置形は、一義的に、次の式Ｉｒｅで示されるような化合物の互変異性体か らの酸化硫黄及び二重結合炭素原子を含む原子に対する核反応から得られる５− 或いは６−員の内部環状生成物である。

式中、Ｒ，Ｘ、Ｘ’、Ｙ、Ｚ、ａ、ｎ％ｍ、ｐ、ｑ　、ｒ、ｒ、ｗ、ｙ及び２は 、式Ｈの定義と同じである。ＡはＲ１−１で、直接結合で、或いはＸで、そして 、二重結合炭素（２，５）のいずれか或いは両方は、示されるように、互変異性 体形である。

式Ｉ或いはＩＩの核化合物、ｆｆｌし、原子０．　Ｍ、　Ｎ或いはＳの１以上は 。

求核にする；は、生体内及び試験管内で容易に生産され、それでは。

内部環状化生産物に、典型的には、水素結合（水和物を含む）、イオン（塩或い はキレート）或いはその両方により安定化されることにより、される。これらの 環状化合物は、生物学的に不活性だが、式Ｉ或いはＩＩの化合物の活性化さｒＬ 得る”保持”形で、相当する活性化合物に容易に再配列されるものである。式■ 及びＩＩの化合物及びそのサブ形は、Ｓ或いはＹを通して内部環状化される、但 し、ｐは零であり、或いは、式１ａ’及びＩｂ’及び次の式に示されるように、 Ｍ、−（Ｃ−Ｍ）−１１−或いは−（Ｃ−Ｍ）−Ｍ−を通して内部環状化される 。

゛７オリゴマー 但し９式Ｉａ’及びＩｂ”において、Ｍ、　Ｍ、、Ｑ、Ｑ、、Ｒ，Ｘ、　Ｘ’、 Ｙ。

ａ、ｎ、ｍ、ｐ、ｑ’、ｒ、ｒ’、ｓ、ｗ及び２は９式１の定義と同じであり、 ”Ｃ”は、環状化を示す。

一般的に、式１の化合物の環状ウレタンを形成するために、左の末端求核Ｍ、（ １）の上の電荷が、他の核Ｍ（３）に移動し、どちらかが、分子の中間の二重結 合炭素（５）を攻撃する。次いで、中央の核Ｍ（６）上の電荷がＲ或いはＸ基を 取り、ウレタンを形成し、或いは、酸化された硫黄原子を攻撃し、式１ａ’に示 されるように、Ｓを変位することにより或いは弐１ｂ°に示されるように、Ｓ或 いはＹ並びにＸ′或いはＺ或いはＸ′とＺの両方を変位することにより、スピロ 環状ウレタンを形成する。全ての場合、化合物の環状化の後は、２或いはｎ或い は両方は、１である。同様に、中央の二重結合炭素（５）は請求核原子Ｓ或いは Ｙ（式１ｂ’　）の１つにより攻撃され、チアジンジン或いは、サルフオキシ或 いはチオサルフオキシ酸エステルを形成る。この後者の場合、スピロ環状ウレタ ンは、中央求核（６）上で得られた電荷が、＊造からの例えば、）１．Ｑ、）１ ．５或いはＮＨｌの変位から得られた左の末端二重結合産業原子（２）を攻撃す る。同様に、中央或いは末端求核（各々原子３或いは６）上の電荷或いは出現す る電荷が、式Ｉの他の七ツマー上に攻撃し、ダイマーを形成し、下記のように、 オリゴマーに重合することができる。

そのサブ式をも含む式Ｕの化合物は、ここで”ビタレテイン化合物”と称する。

”ピタレテイン”と称する参照化合物及びここで、”ビタレチン”と称するその 酸化形は、一義的にこの化合物の生物学的に活性な形と信じられている。約２か ら約２０の七ツマ−を含むビタレテインのオリゴマー、特に約２乃至４の七ツマ −を含むオリゴマーは、特に、その安定性で興味がある。

ビタレチンは、構造式１１ｄにより特徴づけられる。

（Ｉｌｄ） 但し、Ｒ，Ｘ、ｒ及びｙは、式ＩＩの定義と同じである。特に、式ｌｉｄの興味 のある化合物は、ＲがＨで、ＸｆｆｔＺｎ”、Ｃａ”、（Ｃａｌ）”。

（ＣａＯＨ）“であるもの或いは他のカリオン錯体である。ビタレテインの以下 の式１１ｄ’に示されるように、カチオン基及び水素結合が見られ、全構造の安 定性を与え、不安定なカルボキシ−アミノ結合に対して安定である。

（点線は、水素結合を示す） 式！のジサルフィド、サルフェニツク酸或いはサル７エネートは、容易に還元さ れ、相当する遊離子オールとなる、特に、内生の酵素、特に、レダクタアーゼ及 びチオールージサルフィド　イソメラーゼにより触媒される反応で還元される； 特に、ビタレチン（式Ｉ’ｄ）は、ビタレテイン（式Ｉｃｅ）に容易に還元され る：（ＩＩｅ） 式１１ｄ、ＩＩｄ’及びＩＩｅ中、Ｒ，Ｘ、ｒ及びｙは、式ＩＴの定義と同じで ある。好適なカチオンＸは、Ｚｎ”＋Ｃａ”或いは（Ｃａｌ）”或いは（ＣａＯ Ｈ）　”のようなカチオン錯体、特に、Ｚｎ”″である。

特に、興味ある化合物は、ｙが２から約１０、特に２〜４のとき、また特に、Ｒ がＨのときのオリゴマーを含む。式ｒ　［ｅ（式中ｙが４のとき）の化合物のオ リゴマーは、大きい生物学的能力を有するようであり、ここでビタレテインｖ４ と称するオリゴマー、式ＩＩｅ（ｙが４のとき）の化合物とし９式１１ｅ（ｙが ４で、Ｒ＃Ｈでそして、Ｘがカルシウム或いは亜鉛カチオンであるとき）の化合 物とし、以下詳細に論じる。

式Ｉ＋の化合物の生物学的に活性化できる形の例は、生体内でも試験管内でも活 性化でき、或いは式Ｉｌｄ或いはｌｉｅのビタレテインに変換できる。

１）式Ｉｆｆの環状ウレタンのジサルフイド：（Ｉｆｆ） この化合物は、次の式に従ってキレートとして安定化されるようである。

（点線は、イオン或いは水素結合を示す）式中、Ｒ，Ｘ及びｙは、式ＩＩの定義 と同じであり、特（こ１．Ｘ（よ、Ｍｇ＋１であり、キレートは、Ｍｇ（ＯＨ） ｘキレートである。

２）化合物１１ｆの無水塩は、式１１ｆ’の環状ウレタン　イミンをなす。

（ＩＩｆ’） 式中、Ｒは、式ＩＩの定義と同じである。

３）式■■ｇのヒドロキシチアゾリジン（ＩＴｇ） 式中、Ｘ、Ｒ，ｙ及びｒは、式Ｉ＋の定義と同じで、そして、Ａは、式１１ｃに 定義するようにＲ，Ｘ、直接結合或いは−１である４）式１１ｇ’のチアゾリン は、式１１ｇが式Ｉｆｆの化合物の脱水で式１１ｆ’の化合物へなると同様にチ アゾリンと脱水されるものである。

（ＩＩｇ’） 式中、Ｘ、Ｒ，ｒ及びｙは、式ＩＩの定義と同じである。

５）Ｉｌｈのイオン化ヒドロキシチアゾリジンは、次の通りである。

（ＩＩｈ） 式中、Ｒ，Ｘ、ｒ及びｙは、式ＩＩの定義と同じで、或いは式１１ｈのチアゾリ ジンの形で、環状化でＩａ’中のカルボキシ−アミノ部分を通して、次のものを 形成する。

ａ）式１１ｈ’の中間体： は脱水され得る。

ｂ）式！１ｉのスピロ環状ウレタン−チアジンジン或いは（Ｉｌｉ） 或いは、 Ｃ）式１１ｉ　’のイミドカルボネート互変異性体：（Ｉｌｉ’） 式ＩＩｈ’、ＴＩｉ及びＴｒｉ’中、Ｒ，Ｘ、ｒ及びｙは、式ＩＩの定義と同じ である。

ビタレテインの他の可能性のなる活性化再記Ｉ形は、次のものを含む。

６）式ＩＩｊ及び！■ｊ゛の式１１ｆ及びＩｌｆ’の環状ウレタンに相当するサ ル（Ｈ） ７）式１１に、Ｉｌｍ及びｌ１ｍ’の式１１ｇ、ＩＩｈ及びＩ＋ｈ’のチアゾリ ジンに相当する環状サルフェネート。

（ＩＩｋ） （ＩＩＱ＋） は脱水されて、８）式１１に’のジヒドロ−オキサチアジンになる。

（Ｉｌｋ’） 或いは９）相当する化合物： ２）式［１ｎのスピロ環状ウレタン−サルフェネート；（Ｉｌｎ） ｂ）式Ｉｎｎ’の相当するイミドカルホキネート　互変異性体；式１１ｊ−１１ ｎ’の中、Ｘ、Ｒ，ｒ及びｙは、式ＩＴの定義と同じであり、Ａは、式Ｉｎｃの 定義と同じで、更に、種々の式Ｉ＋は、ここに説明されるように、本発明の範囲 内での再配置形であり、特に、式１ａ’及びＩｂ’の定義と同じである。

本発明のモジュレイターは、更に、式■のビタレテイン　モジュレイターの活性 或いは活性化できる誘導体で特徴づけられ、次の式ＩＩ＋、ここで”ビタレテイ ン　誘導体”と称する。

（ＩＩＩ） 式中、Ｍｌは、Ｓ或いはＯＨＭはＳ、０、Ｎ或いはＮＨである。少なくともＭ、 とＭのどちらは、Ｏ以外であり、Ｒ，ＱＳＱ＋。

Ｘ、Ｘｌ、Ｙ、Ｚ、ａ、ｎ、ｍ、ｐ、ｑ、ｑ’、ｒ、ｒ’、ｓ、ｙ、ｗ及び２は 、式１の定義と同じである。ここで点線は、共鳴或いは互変異性体の結合を示し 、式ＩＩ＋の化合物において、内部環状及びスピロ環状化合物であり１Ｍ、は、 式Ｉｖ乃至Ｖｉｅ’で示されたものである特に、式ＩＩ＋の範囲内の誘導体は、 均−或いは混合のサルフィド、均−或いは混合のトリサルフィド及び均−或いは 混合ジサルフィドの酸化形（ｍ＞Ｏ）で、式１１１ａに従ってｚ＝２で、ｎは１ 或いは１．５である。

式中、Ｍ、Ｑ、Ｑ＋、Ｒ，Ｘ、Ｙ、ｍ、ｎ、ｒ及びｙは、式ＩＩＩの定義と同じ である。Ｘは特にＨ，Ｚｎ”、カルシウム或いはカルシウムカチオン錯体である 。

更に、式ＩＩＩの範囲内の誘導体は１式１１１ｂにより、Ｚ！１の式ＩＩＩの化 合物の還元され、及び酸化された形を含む。

式中、Ｍ、Ｍ＋、Ｑ、Ｑ＋、Ｒ，Ｘ、Ｘ’、Ｙ、Ｚ、ａ、ｍ、ｎ、ｐ、ｑ’、ｒ 、ｒ’、ｗ及びｙは、式Ｉ１１の定義と同じであり、Ｘは、Ｈ，Ｚｎ”、カルシ ウム或いはカルシウム　カチオン錯体である。

式ＩＩＩの化合物は、その生物学的−活性化或いは活性化できる互変異性体、キ レート、水和物及び生物学的に交換できる塩（式Ｉ及びＩＩで説明）の形の化合 物及びその再記Ｉ生成物であり、式１ａ’及びＩｂ’に従う核環状化に基づいた 化合物及び更に式１１ｃで説明され９式［１１ｃに概観されるｊうに１式ＩＩＩ の化合物の互変異性体誘導体を含む。

（Ｉｌｌｃ） 式中、Ｍ、Ｑ、Ｑ＋、Ｒ，Ｘ、Ｘ’、Ｙ、Ｚ、ｎ、ｍ、ｐ、ｑ’、ｒ、ｒ’。

Ｗ及び２は、式ＩＩＩの定義と同じで、Ａは１式Ｉｒｅで定義と同じで、二重結 合の炭素原子（２，５）のいずれか或いは両方は、互変異性体形に示される。

本発明の範囲内の更なる化合物は、式Ｈ−Ｖｌのモジニレイター及びそのサブ式 で、式Ｉの化合物中の１はＭである。

（＋Ｖ） 式中、Ｍ、Ｑ、Ｑ＋、Ｒ，Ｙ、ｍ、ｎ及びｙは、式１の定義と同じであり、Ａは 、式ＩＴｃの定義と同じである。

本発明の化合物は、更に、式Ｖの生物学的に活性であり、活性化できる化合物で ある。

（Ｖ） 式中、Ｍ、Ｑ、Ｑ、、Ｒ，Ｙ、ｍ及びｎは、式１の定義と同じである。

本発明の化合物は、式Ｖｌの化合物の生物学的−活性及び活性化できる形を含み 、還元及び酸化形の次のものである。

即ち、 １）式Ｖｌの環状ウレタン類； （Ｖｌ） ここで、ウレタンは、式Ｉｆｆ、　［Ｉｇ及びＩｌｂで定義されたように置換さ れたとき、Ｍ、Ｑ、Ｑ＋、Ｒ，Ｘ、Ｘ’、Ｙ、Ｚ、ｎ、ｍ、ｐ、ｑ’。

ｒ’、ｗ及び２は、式１の定義と同じで、Ａは、式■ｖの定義と同じである。

２）式Ｖｌａの環状イミン類は、式Ｉｆｆ及びＩｆｆ’に示されると同類のウレ タン無水塩をなす。

（Ｖｌａ） 式中、Ｍ、Ｑ、Ｑ＋、Ｒ，Ｘ’、Ｙ、Ｚ、ｎ、ｍ、ｐ、ｑ’、ｒ’、ｗ、ｙ及び ２は１式１の定義と同じである。

３）式Ｖｌｂ及びＶｌｃのスピロ環状化合物は、式ＩＩｈ’とＩｌｎのスピロ環 状ウレタンの先駆物質と同類のものである。

式中、Ｍ、Ｑ、Ｑ、、Ｒ，Ｘ、Ｘ’、Ｙ、Ｚ、ｎ、ｍ、ｐ、ｑ’、ｒ、ｒ’。

Ｗ及び２は、式１の定義と同じである。

４）スピロ環状ウレタンーサルフオキシ（ｎ＝１）酸エステル（式Ｖｌｄ）或い はウレタン−サルフィド（式Ｖｉｅ）は、各々、式Ｖ［ｂ及びＶＴｃの化合物か ら、Ｈ，Ｓ、ＨＪ或いはＨ，Ｏとして各々、サルフィド、ナイトライド或いは酸 化物を無くして形成されたものである。

（Ｖｌｄ） （Ｖｌｅ） 式中、Ｍ、Ｑ、Ｑ＋、Ｒ，Ｘ’、Ｙ、Ｚ、ｎ、ｍ、ｐ、ｑ’、ｒ、’及びＷは、 式１の定義と同じである。

５）式Ｖｌｄ或いはＶｌｅの化合物のイミドカルボネート互変異性体は。

式１１ｉの定義と同じである。

式中、Ｍ、Ｑ、Ｑ、、Ｒ，Ｘ、Ｘ’、Ｙ、Ｚ、ｎ、ｍ、ｐ、ｑ’、ｒ’。

Ｗ及び２は、式ｌの定義と同じである。

本発明のモジニレイタ−は、生物学的に活性な或いは活性化できる塩、水和物、 キレート、互変異性体及び式Ｉの七ツマ−のオリゴマーの再配置形で、特に、式 １１ｄの七ツマ−のオリゴマーは、”ビタレテイン　オリゴマー”と称し、式■ の七ツマ−の重合生成物及びそのサブ式であり、式Ｉａ’及びＩｂ゛による環状 化及びそれに相当する塩、水和物、互変異性体及びこれらのキレートである。式 １ａ’及びＩｂ’で例示される重合により製造されたオリゴマーは、再配置に耐 性であり、本発明のカルボキシ−アミノ−アミドの保持形であるが、エーテル及 びアルコールのような有機溶剤に対して不安定である。式Ｉ及びそのサブ式の七 ツマ−の好適なオリゴマーは、ｙが約２〜１０である場合である。特に、ビタレ テインの製造に有用な方法は、このように、例えば、式ＩＩ＋により製造される もので、特に、４モノマー（式ｌｉｅ及びＩＸでｙ＝４）のビタレテインであり 、特に、少なくとも他のオリゴマー或いは本発明の化合物のマイナーな部分であ る。テトラマー及びビタレチンは、特に活性である。このオリゴマー（ここで、 ”Ｖ、”）の形成は、第２のモノマーの二重結合炭！（２，５）の１つの上に第 １のモノマーの硫買原子が核的に攻撃することにより生じ、第２のモノマーのカ ルボニル酸Ｘ（６）から核酸案を生じる。式Ｉ及びそのサブ式のモノマーの重合 は、例えば１、ｙが約２０以下のオリゴマーである場合、この開始のアルコキシ ド　イオン（開始のダイマリザイションから得られた核的酸素６）を通して、連 鎖していき、ポリマーがそれ自体に上に折り重ね、最後のアルコキシドイオンが 存在しくｖｔの場合第４のもの）、第１の（開始の）七ツマ−と反応する。式Ｖ ｌｌで示される中間のダイマーは、ビタレテインｖ４の合成において、ある条件 下で、副産物として得られる式Ｖ［Ｉ［のベンジル誘導体と比較される（実施例 １［Ａ）。

ビタレテインｖ４の分解と再配置が、エーテルのような有機溶媒重合化を終了す る反応は、最後のアルコキシド　イオンによる第１のアルコキシドの形成を含む 元の核的Ｓの核置換反応であり、七ツマ−サブ単位の環状ポリマーが得られ、そ れは、スペクトル分析で同定される。一旦、ポリマーは、オリゴマーとの塩ブリ ッジを通してカルボキシ−アミノ部分を安定化し、他の活性或いは活性化できる 形との再配置を立体的に防止している。ビタレテイン■、（ビタレテインのテト ラマー、式１１ｅ）は９次の式１７式中、Ｒ，Ｘ、Ｘ’　、Ｚ、ｒ及びＷは、前 記の式Ｉと同じ定義であり、好適には、Ｘ或いはＸｏは、＋１の電荷を有するカ チオンＺｎ　ＯＭの一部であり、Ｘ或いはＸｏは各々Ｈ”で、特に、ＸｏがＺｎ １の一部である場合、ＸはＨ′″であり、ｒは＋１で、ＺはＨ８０であり、Ｗは ２である。式ＩＩで説明したビタレテインＶ、の製造において、４Ｈ”及び２Ｚ ｎ＋１がアミノ−カルボキシレート及びチオレート電荷を中和し、全錯体は、錯 体モル当り水和物８モルを含有するｊｌｅ　Ｔ２　＋）　４２　Ｆ　ｔ＜メ　５ ？　Ｎｌｌ　ｆｉ　１ｍ　イｐ−ｗｈｒ二ｔ、立ｍイ）ｊ学的に＜、１Ｋｋｌｌ により、そして、加熱により、導入され、ポリマーの脱カルボキシ化が得られる 。従って、生成物がなくならないように、Ｍ製法間に注意すべきである。

を与えないものにすべきである。

好適には、炭化水素置換基Ｒは、分子の親水性物質と逆バランスをとる適当な核 部分を有し、本発明のモジュレイターの細胞であり、各Ｘ或いはＸｏは、生物学 的に交換できるように選択される。カチオン或いはカチオン錯体Ｘは、−価、二 価或いは三価で、ｒは、＋１．＋２、＋３である。イオン或いはイオン性錯体Ｘ ′は、−価、二価或いは多価で、ｒ′は、−３〜−１或いは＋１〜＋３である。

Ｘ或いはＸｏは各々イオン或いはイオン性錯体で、はぼ分子の活性部分を逆に不 活性化しないもので、分子の活性部分のバイオ機能と干渉しないものである。そ のようなイオン或いはイオン錯体Ｘ或いはＸｏは、ここで、”生物学的に交換性 イオン”と称する。イオンは、分子を不活性化するが、一方、容易に逆に不活性 化するもののあり、例えば、自然に、酵素により或いは化学的になる。このよう なイオン或いはイオン錯体は、本発明の範囲内であり、不活性分子を作成するの が便利であり、それから、使用のために、活性化する。特に、活性化の目的の分 子を作成し、特定の細胞或いは組織に使用するにおいて、良い。溶液中の本発明 のモジュレイターは、電解濃度に非常に敏感であり、多くの電解液の過剰に存在 すると逆に不活性化され、特に、マグネシウムイオンに敏感である。また、イオ ンＸとＸｏは、モジニレイタ−の生物学的活性形と貯蔵形が良いモジュレイター の相当する貯蔵形との間に存在する平衡を変え得る。逆も真なる。

カチオンＸの例は、活性或いは活性化の形でも分子を安定化するもので、Ｃａ　 ”　”　ｒ　（Ｃａ　Ｉど、　（ＣａＯＨ）”、及び特にＺｎ＋１を含む。それ は、活性形に良い。Ｍｇ−１は、活性化或いは貯蔵形に良い。イオンＸ°は、Ｈ ”、Ｉ”、パーオキサイド（Ｉｓ−）、Ｚｎ”、或いは（：、＋１である。前記 のように、イオンＸ或いはＸ°上の電荷〉＋１は、２以上の不電荷で分配される と、分子の残りのＳ或いはｐが、分子内或いは分子間で、１以上の塩架橋を作る ；”イオンＸ″は、この場合、イオンの一部となり、また逆もある。＋１より大 きな電荷を有する正のイオンＸ或いはＸｏは、Ｓの電荷を持つ基の間で架橋を形 成し得、Ｓは、−１及び電荷ｐを有する基であり、ｐは所定分子内−１であり、 或いは電荷Ｓを有する２つの基の間で、Ｓは−１であり、ｙ＝ｌで分子を含む； 或いは分子内で、ｙ〉１で、ｊＬｔＩＩｒｐを有する２つの基の間で、或いは、 １つが負電荷Ｓを有し、他が負電荷ｐを有する２つの基の間で、架橋を形成する 。更に、イオンＸ或いはＸｏは、２つの同じ或いは異なる式Ｉの七ツマー或いは オリゴマーの間でキレートを形成し得る。イオンＸとＸ°上の全電荷は、分子上 の全電荷Ｓとｐでバランスしている；然し乍ら、ある場合、分子上の全電荷の一 部は、分子の外の１以上のイオンとバランスしても良い。

式Ｉ乃至ＩＸの化合物において、中和部分ｚ、＋８１は、中和分子或いは式■及 びそのサブ式の化合物と一緒の他の中和部分である。中和部分ｚＷ′＠ｌの例示 は、例えば、ヨウ業、Ｈ２Ｏ、ポリエチレン　グリコール及びポリオキエチレン 　エーテル試薬を含む。

式Ｉの範囲内のモジュレイターのいくつかの不活性だが活性化できる形のものを 同定し、これらを上記に説明し、いくとかの例で、モジュレイターの不活性な” 保持ｗ形であり、生体内或いは試験管内で、１つ以上の活性な形に再配置できる 。生体内再配置或いは試験管内再配置は、生きている細胞の存在下に、上記の固 有の作用の結果となる。それは、本発明の化合物の不活性形を、相当する活性形 に変換することができる。細胞膜のようなプロティンと疎水性環境は、伴い、生 産物の活性形を安定化することができる。不活性だが活性化できる形の再配置は 、下記の他の手段により導入することができる。

本説明内において、′生物学的活性形いは一活性化できる”ということは、式Ｉ 乃至Ｘの範囲内の化合物及びそのサブ式であり、生物学的活性で、或いは以下の ような活性化剤に接触させることにより生物学的に活性な化合物にする：即ち酵 素及び有機溶剤、酸及び塩基のようなバイオケミカル；電磁波、活性線、放射線 エネルギーを含む放射線或いは熱エネルギーである。そのような処理に反応し、 ビオ活性になる不活性化合物は、ここで、′活性化できる”と称し、式■乃至Ｘ の範囲内のものである。

本発明の特定化合物及びモジュレイターの劣化或いは新陳代謝を抑制するとされ る他の物質は、式ＩからＸのモジュレイターと結合して有用である。特に、低濃 度で、固有の酵素により触媒された劣化は、添加されたモジニレイタ−の顕著な 損失の機構を示す。モジュレイターの作用と干渉しないで、これらの酵素を抑制 する化合物は、保持され、低く、効果的な濃度を可能にすることにより、モジュ レイターの作用を高める。

Ｉｆ、化遣」し凶１盈： 本発明による化合物、特に、式１１ｅの化合物（但し、ＲはＨである）は、植物 、動物及び微生物のほぼ完全なスペクトルに対して固有とされるものであり、従 って、本発明の化合物は、良く理解される技術での方法に従って、使用のために 多種の生物から回収され、本離される。下記に規定する細胞の広いスペクトルの 機能に対する化合物の規定したバイオ適用性は、実際の各々の生きている細胞中 にこれらの化合物が、細胞の生命の自己正常化のために偏在していること、或い はほぼ偏在していることによるものである。然し乍ら、固有な化合物は、非常に 少量で生体内に存在すると考えられ、例えば、通常の精製方法により不活性の形 に容易に変換されると知られている。本発明の化合物を利用のために生成物に、 ミトゲン、サポニン、パソゲン、抗原或いは生物学的物質中に存在する他の潜在 的な反応性化合物での汚染を本質的に避けて、且つ、上記のような望ましくない 再配置を防止して、合成すべきであると推奨される。

これらの化合物の最も大きな能力は、式ＩＩｄの範囲内のようであり、それは、 ビス　アニオン性の［Ｎ、Ｎ−（ジチオジー１．２−エタンエジルル）−ビス− （３−カルボキシアミノ−プロパン−アミド）］（式ＩＩｅ）及びビタレテイン のポリマーに基づいくものである。Ｐ−２ゲル　カラムによる一過によるポリマ ー分析で、ビタレテイン（式１１ｅ）のモノマーは、精製中に自然に重合し、マ ルチマー（多分子）になりがちで、特に、ｙが２〜４の場合のオリゴマー及びビ タレテインは、特に非常に高い生物学的活性を有する。

ビタレテインＶｔ（式１１ｅ或いはＩＸ、　Ｙは４でＲはＨである）のＩ”　Ｃ ｌ−ＮＭＲは、均質なサブ単位を示し、テトラマー（ｙ＝４）は、Ｔｅｔｒａｈ ｅｄｒｏｎ　Ｌｅｔｔｅｒ　２２：４３６５−４３６８［１９８１］（ここに文 献として入れる）中のあるオルト−エステル様化合物と報告されたものと似てい る非常に硬い構造である。［”　ＣＩ−ＮＭＲ分析に基づいて、マルチマービタ レテイン構造は、中央のアミドからの核酸素（６）が、他の七ツマ−のカルボニ ル炭素（５）を攻撃してポリマーとなると仮定されるが、多分、チオレートイオ ンが最初に開始するもので、このアミドのカルボニル炭素（５）を攻撃し、カル ボニル酸素（６）から核酸素（アルコキシド　イオン）を形成する。

重合は、アルコキシド　イオンを通して連鎖して、ポリマーがそれ自体の上に折 り重なり、最終アルコキシド　イオンが元の七ツマ−と反応する。重合は、終端 アルコキシド　イオンの重合を開始したチオレート硫賀原子の核置換により終え 、均質な七ツマ−サブ単位を含有する環状ポリマーが得られる。重合した（−Ｃ −Ｏ−）、リング（ｎは約３〜２４で通常、３或いは４、特に４である）のスプ リットのしわよせが、上記のｖ４のＮＭＲ分析で共鳴を観察し、高く抑制クオタ ータナリ炭素原子から計算される範囲に４つのマイナービークが得られた。七ツ マ−の重合は、適用した分析方法によりモノマーの操作から得られるものでな（ 、その理由は、ＮＭＲは、テトラマーが、ゲルー過によるポリマーの分子量の測 定の前に得られたことを示している。

イタレチンが上記の方法により製造されるが、適当な化学的環境中で、ジサルフ ィドをホスゲンと反応せしめることによるβ−アレチンのカルボキシ化は、好適 な合成方法である。これらの２つの可能性のあるバイオモジュレイターの物理的 特性における同様性即ち、熱不安定性、赤外線スペクトルの熱不安定性は、実施 例ｍ、ＩＶ及びＶに説明される。

明のイ　製造　るためのベストモード 本発明の化合物は、出発原料としてＮ、Ｎ’　−ビス−カルボベンゾキシ−（Ｃ ＢＺ）のように保護基でブロックされたβ−アレチンを用いて都合よく製造され た。ブロックされたβ−アレチンを次に本発明の方法により選択的にデブロック し、ベンジル基を除去し、本発明の化合物を収穫した。ブロックされたβ−アレ チン出発原料にための技術は、文献に見られるが、既知の技術は、一般的に、低 い収率と純度或いは両方低い生成物である。厩知の方法で得られる不純物の多く は、生成物の溶解度及びジシクロへキシルカルボジイミドを利用したカップリン グ反応中で生成されるジシクロへキシルウレア副産物の溶解度の両方が足りない ことからのものである。

本発明の方法に従って、生成物純度及び収率は、ｌｉの、ＣＢＺ−或いは同様に ブロックされたβ−アレチンを、Ｎ−ヒドキシサツカライド（Ａｌｄｒｉｃｈ　 Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ、　Ｍｉｌｗａｕｋｅｅ、　Ｗｌ、米国から市販）とカップ リングされ、ジシクロヘキシルカルボジイミド（５ｃｈｖａｒｚ／Ｍａｎｎ、　 Ｏｒａｎｇｅｂｕｒｇ、ＮＹ、米国から市販）を用いて、相当するＮ−ヒドキシ サクシンイミド活性エステルが生成され、更に、Ｊ。

Ａｍ、Ｃｈｅｍ、Ｓｏｃ、　８６；１９３９−１９４２（１９６４）に説明の方 法が行なわれる。

Ｎ−ＣＢＺ−β−アレチン（Ｓｉｇｍａ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ、　Ｓｔ、Ｌｕｔｓ 、ＭＯ５米国）のような市販の出発原料は、先ず、Ｎ−ヒドロキシサクシンイミ ド（Ａｌｄｒｉｃｈ　Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ）とカップリングされ、沈殿或いはジ シクロへキシルウレア副産物が得られる。溶解性活性エステル生成物は、再結晶 化され、システアミン（Ａｌｄｒｉｃｈ　Ｃｈｅ＋＊ｉｃ＠１ｇ）から、パーオ キサイドで酸化され容易に得られるシスタミンの遊離アミノ基とカップリングさ れる。これは、例えば、還元当量が見られなくなるまで、パーオキサイドでアセ トニトリル中にチトレイトすることにより得られるものである。これは、０．１ Ｍ燐酸カリウム緩衝と１０ｍＭの５．５°−ジチオビス−２−二トロペンゾイッ ク酸（Ｓｉｇｍａ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ）の溶液中にペーパーソーク片を用いて、 監視され、乾燥されるのが都合が良く、パーオキシド／システアミン混合物中に チオール残置が、ペーパー上に黄色スポットをなす。パーオキシドの添加した水 は、システアミン副産物とじて作られ、ジシクロへキシルカルボジイミド　カッ プリング（上記）により得られた溶解性Ｎ−ヒドロキシサクシンイミド活性エス テルとカップリングする前に、アセトニトリル　アゼオドローブの繰り返し蒸発 処理により容易に除去される。塩酸塩或いは同様の塩の代わりに、シスタミンの この形を用いると、シスタミンと活性エステルとの反応がより完全になる。即ち 、この反応は、シスタミンの遊離アミンが、活性エステルのカルボニル炭素上を 核的攻撃することに依存している。Ｎ−ヒドロキシサクシンイミドは、この反応 の副産物として再生成される。即ち、ブロックされたβ−アレチンの沈降するか らである。ベンジル基を次にブロックされたβ−アレチンから除去する、例えば 、実施例■Ｉ■及びＩＶに説明されたように除去され、生成物化合物は回収され る。

ＩＩｒ、化量ｊぽとＥ且ユニ 本発明のビタレテイン　モジニレイターは、なかんずく、試験管内の細胞表現型 発現及び細胞生活力を改良し、例えば、培養物中の細胞寿命期間を増し、細胞バ イオ生産性を増し、細胞機能を改良し、そして、耐性細胞を培養物に順化するこ と、特に、細胞バイオ生産性を高め、耐性細胞を培４！物に順化せしめるためで ある。本発明の方法は、特に、通常の培養条件で連続的に成長できない細胞、特 に、”正常”の哺乳動物細胞に適用できる。ここで、′正常”細胞とは、非移転 で、特に、非ビールス移転成いは非腫瘍移転細胞で、ある点で、バイオ生産レベ ルが異常に高いか低い、或いは、機能が抑制されているか、正常な細胞とくらべ 異常に高められているかのような細胞のように、異常な機能である非移転細胞を 含む非腫瘍移転細胞である。

特に、意図する利用性カテゴリは、ａ）通常の条件下で培養物にほぼ耐性の細胞 を培養するための順化すること、即ち、約２週間以下の通常の培養条件下で半寿 命を有するもの或いは、培養物中で正常の生産物、正常の量の生産物を発現しな いもの；ｂ）細胞を不死化細胞に細胞を融合する必要をなくし、細胞生産物の長 いバイオ生産性を得るように、長期間培養を可能にし、例えば、抗体生産性肺臓 細胞或いはリンパ球細胞を不死細胞と融合する必要は、モノクロナール抗体のマ ス化生産のためにであるｉｃ）培養物中の細胞の老化遅延；ｄ）培養物中の成長 因子及び／或いはミトゲンに接触せしめる細胞の生活力の増加せしめる二〇）培 養物中の細胞のバイオマスの増加すること、予防刺激のための接触の前、その間 、その後において細胞を安定化することｉｆ）培養物中の細胞の寿命期間を伸ば すこと、ｇ）培養物中の細胞のバイオ生産性及び機能或いはその両方を増加せし めることｉｈ）培養物中の細胞に対する表現型発現のスペクトルを増加せしめる こと；である。

培養物中の細胞の寿命期間は、細胞の数の倍化レベル（ＰＤＬ）を意味し、各レ ベルは細胞の新ジエネレイションを示す。細胞の数が倍になるに必要な時間が、 用語”ジエネレイシコン”　（Ｔｇ）であり、それは、所定の細胞タイプの成長 段階で変化する。

通常な培養条件では、各細胞タイプは、所定タイプの全ての健康な細胞にために ほぼ同一な数の倍化レベルの予想される数により特徴づけられる寿命期間を有す る。あるヒト細胞が、例えば、通常の培養条件下で、老化の前に、約４０から４ ５倍に数を倍化し、正常な成長を停止し；７ｇ増加及び死亡は一般的に約ＰＤＬ ５０で起こる。

本発明の１つの範囲に従うと、老化の開始を、本発明の範囲内で遅らすものであ る。通常の成長媒体中のこれらの細胞に、上記のビタレテイン　モジニレイタ− の１つ以上を接触せしめることである。本発明のこの方法により、培ｔＩ物中の 所定細胞タイプにより得られる数の倍化レベルは、老化の開始前及び死の前に、 著しく増加する。これらの高い数の倍化レベルにおいて、細胞バイオマスは、大 きく増加し、ＰＤＬ４５からＰＤＬ１０５に増加し、例えば、本発明の方法によ りヒト細胞のために達成される。これは、通常の培養法により得られるバイオマ スと比較して、全細胞マスが、２°で増加する。更に、細胞生産物に対するピー ク生産期間が著しく伸び、他の細胞機能も最適化される。更に、本発明のビタレ テインモジュレイターは、化学剤、生化学剤或いは他の刺激剤、興なるか添加の 機能を発現するものも含め、それに対する高めの細胞反応を除き、生体内での成 長の比較的段階での細胞の同じタイプにより、或いは、通常の培養条件下でも、 反応を除く能力がある。

培養中の細胞の寿命サイクルを直角化するために、例えば、細胞の成長と成熟を 最適にし、老化及び死の段階を最小にするために、細胞を、本発明のビタレテイ ンモジュレイターに老化開始の前に接触せしめることは好適である。細胞老熟化 は、徐々の工程であるので、老化は、ある程度、冒めおき、細胞が、細胞の寿命 の後の段階で、モジュレイターに接触しても、特定の細胞タイプ、培養条件及び 他の因子に依存している。然し乍ら、老化細胞は、定義によると生育や生産はで きない、そこでこの寿命の遅い段階で維持することは、本発明の範囲としては、 逆生産的なものある。明らかに、老化の研究に本来関心があるならば、この段階 での細胞の維持は興味深い。従って、多くの場合、最適な結果を得るために、都 合がよければ、寿命サイクルの早い段階で、細胞をモジュレイターに接触せしめ ることが好適である。

本発明の他の具体例によると、培養物と一般的に親密でないと考えられる細胞を 、本発明のモジュレイターにアダテイブ量晒すことにより、順化する１本発明の この具体例の範囲内の細胞は、通常の培養条件下で短い寿命の細胞（例えば、数 時間から約数週間へ、例えば、２時間から２週間へ）、或いは培養物中に正常な 機能をしないもの（例えば、生体内細胞のホルモン、酵素或いは他のバイオ生産 は一部或いはほぼ完全に試験管内では抑制されている）。生体内での１以上の点 について挙動しない正常の細胞でも、例えば、前記のように、寿命或いは異常の 細胞機能の細胞を、ここで”耐性細胞”と称する。このような耐性細胞は、本発 明の方法により、培養すべき細胞を、本発明により、ビタレテインモジュレイタ ーに晒すことにより、順化できる。好適には、モジュレイターを、培養媒体中に 直接、細胞の導入の前或いは後まもなく、入れることにより行なう。これは、特 定の培養媒体及び特定のビタレテインモジュレイターの媒体中の安定性に依存す る。

本発明の方法により、培養物中の耐性細胞の細胞機能が著しく改良され、或いは 完全に、生体内の正常な細胞機能特性に復帰する、また、細胞寿命は著しく改良 され、はぼ完全に、少なくとも生体内の寿命の特性に復帰される。更に、本発明 の具体例によると、これらの細胞の老化は、モジュレイターの遅延量の存在で、 一般的に遅延され、よ（、細胞機能の全体の増大と潜在的な強化がされる。本発 明の範囲の耐性細胞は、種々の既知の耐性細胞タイプを含み、例えば、リンパ球 、肝細胞、膵臓、神経、甲状腺、胸腺哺乳動物細胞を含む。

本発明のビタレテイン　モジュレイターが、培養される細胞の細胞活性をモジュ レイとするに入れられべき培養物媒体は、本発明の一部を構成しない。例示の有 用な媒体としては、すべての既知の培養媒体、ここで培養のＩＩｓ！＃１の保持 及び／或いは成長を支持する媒体を含む、そのような媒体は、典型的には、少な くとも、培養の特定細胞の成長に適する栄養、溶液の生理的にバランスするもの 、生理的なｐＨ，水、細胞成長に必要なものとして、また細胞保持の、生理的培 養助剤がある。抗生物質のような他の既知の種々の助剤もまた、基底培養媒体に 含まれ、その中にモジニレイタ−が入れられ、特に、細胞連鎖を高めると知られ るもの、また、細胞成長及び寿命を増大するもの、細胞成長因子、ペプチジル、 培養の、ｓａｇａに特定のホルモンも既知のタイプである。これらの及び他の助 剤は、細胞寿命を害し、ある点で機能するものは、ときにより、それらが、ビタ レテインモジュレイターの活性をなくさない限りにおいて、基底培養媒体に含ま せる。−以上のこれらの因子の選択的予防に関して、特定のベプリジルホルモン は、ビタレテインモジュレイターの存在において、作成される媒体に安定性を与 え、これは、グロス細胞抽出中で興味ある細胞を、例えば、器官抽出物を、選択 的に豊富にするための有用な技術である。モジュレイターの代謝を抑制する化合 物も含むことができる本発明のモジュレイターが本発明の実施に入れられる通常 の媒体は、ここで、”基底培養媒体”と称される。基底培養媒体は、本発明にモ ジニレイター中に入れられ、既知の適当な培養技術と組合せて用いられ、それは 、例えば、バッジ或いは連続培養、潅流培養成いは細胞培養物を最大にするに適 するものである。また、連続的栄養の補給或いは他の媒体成分及び細胞廃棄物の 除去にもよる。

広く、本発明のモジニレイタ−は、これらの細胞の成長を支え、そして、不活性 化しない、逆に、モジニレイタ−の機能を害さない培養媒体中で細胞活性度をモ ジニレイトするに適するものである。

培養される細胞は、本発明のモジュレイターにいかなる方法でも接触せしめられ る。モジュレイターは、例えば、栄養媒体中に入れられ、或いは細胞保持要素に 入れられる。細胞は、モジュレイターに予め接触せしめられる。持に、本発明の 具体例では、モジュレイターと支持に用いる出発原料と組合せることにより、モ ジニレイタ−を支持材料中に入れる。中空繊維膜のような天然或いは合成支持具 のために、モジュレイターを合成プレポリマーに入れること、或いは、ゲル支持 具の製造のためのプレゲル、或いは細胞支持具の製造のための液化セルロースは 、１つの例である本発明のモジュレイターと一緒に用いる培養媒体には、場合に よりプロティン補充した基底媒体、特に、血清、例えば、胎児或いは新生の牛血 溝がある。例示の媒体は、Ｅａｇｌｅ’ｓ　Ｂａ５ａｌ　Ｍｅｄｉｕｍ、　Ｅａ ｇｌｅ’ｓ　Ｍｉｎｉｍａｌ　Ｅｓ５ｅｎｔｉａｌ　ＭｅｄｉｕＩＱ、　Ｄｕｌ ｂｅｃｃｏ’ｓ　Ｍｏｄｉｆｉｅｄ　Ｅａｇｌｅ’ｓ　Ｍｅｄｉｕａ＋、　Ｈａ ｍ’ｓ　Ｍｅｄｉａ、例えば、ＦＩＯＭｅｄｉｕｍ、　Ｆ１２　Ｍｅｄｉｕｍ、 Ｐｕｃｋ’ｓ　Ｎ１５　Ｍｅｄｉｕｍ、Ｐｕｃｋ’ｓ　Ｎ１６　Ｍｅｄｉｕｍ、 ｌｌａｙｍｏｔｈ’ｓ　ＭＢ　７５２１　ＭｅｄｉｕＩＩｌ、　ＭｃＣｏｙ’ｓ 　５＾Ｍｅｄｉｕｍ；　ＲＰＭＩ　Ｍｅｄｉｕｍ　１６０３．１６３４、及び１ ６４０；　Ｌｅｉｂｏｖｉｔｚ’ｓ　Ｌｉ２　Ｍｅｄｉｕｍ、ＡＣＴＴ　ＣＲＣ Ｍ　３０、ＭＣＤＢ　Ｍｅｄｉａｌｏｌ、１０２．１０４；　ＣＭＲＬ　Ｍｅｄ ｉａ　１０６６、１４１５．１０６６．１４１５及びＨａｎｋ　’Ｓ或いはＥａ ｒｌ’ｓ　Ｂａ１ａｎｃｅｄ　５ａｌｔ　５ｏｌｕｔｉｏｎである。用いた基底 媒体には、既知おものとして、培養下の細胞の成長を支持するに本質的な栄養を 含有し、共通して、本質的に、アミノ酸、脂肪酸、及びカルボハイドレートであ る。媒体は、添加的本質的な成分、例えば、ビタミン、補因子、痕跡性元素及び 配置量の塩を含む。

他の生物学的化合物は、特定の細胞の生存／機能に必要な化合物で、ホルモン及 び抗生物質が導入される。媒体は、一般的にバ・ｙファ、ｐＨ調整剤、及び同様 のものである。

本発明のモジュレイターを含有する媒体は１種々の細胞、特に成熟核細胞に適用 できるものである。本発明の媒体は、動物細胞の培養に適し、特に、哺乳動物細 胞、植物細胞、昆虫細胞、蛇形動物細胞及びバクテリア、フンジ、モールド、プ ロトゾーア及びリケッチア、特に、抗生物質生産細胞のような微生物を培養する に適する。モジュレイターは、そのような細胞を培養するに適する言わば組織培 養媒体の広くスペクトルでの生きている種々の細胞の生活力を改良するに広く有 用である。その適用としては、ハイブリドーマｌｌｌ１胞系統のようなりローン 化ｍ胞（ＩＩ権生産のための哺乳動物細胞の）；待に、ホルモン、酵素及び免疫 因子のようなプロティン及びペプチド（ワクチン製造のためのビールス感染細胞 の）：（傷を治療のための組織を与える上皮細胞の）；そして、（医学的及び診 断利用のための耐性ｊａＩ＃Ｉの）；そして、生物学的器官及び植込み組織の製 造及び保持に適する媒体中で使用できる。

本発明の方法において培養物に有用な特定の細胞タイプは、哺乳動物ａｌｌ、期 間及び腺から誘導される細胞を含み、例えば、脳、心臓、肺、胃、腸、甲状腺、 副腎、胸腺、上皮小本、章丸、肝臓、腎臓、ぼうこう、膵臓、膵臓、胆嚢、卵巣 、子宮、前立腺、及び皮膚；再生細胞（精子、卵子）；リンパ腺、骨、軟骨及び 間質細胞；免疫ｍａ、マクロファージのようなシトファージ、リンパ球、白血球 、赤血球及び血漿板のような血液細胞を含む。更に、細胞テイプには、植物の幹 、葉、花粉及び子房細胞を含み、微生物、上記のようなビールス；及び昆虫組織 、器官及び膣から誘導される細胞を含む。

本発明のモジュレイターと一緒に有用な培養技術は、固体支持体く特に、例えば 、モルレイヤ或いは懸濁培養での接衝子（アンレッジ；ａｎｃｈｏｒａｇｅ）依 存細胞のため）１例えば、ガラス、炭素、セルロース、中空繊維膜、懸濁粉体膜 及び固体基板を用いることであり、例えば、化合物がビーズ内に取り込まれ、マ トリックス内にトラップされ、或いは混合ジサルフイドのような共有結合の場合 に、アガロースゲルを用いることである。モジュレイターは、一義的に培養物に 有用であり、系統培養、サブ培養、培養物の保持、氷結成いは乾燥培養物量及び カプセル化細胞に有用で、培養物は、通常の媒体から該化合物含有の媒体に、既 知のトランスファ技術により移動せしめる。

本発明の実施によると、細胞を１以上の活性ビタレティン　モジュレイター或い は式Ｉ−Ｘの１以上の活性或いは活性化モジニレイタ−に、試験管内の細胞の培 養を促進するに十分の量、に接触せしめる。これは、処理のない細胞に比べて、 例えば、細胞寿命期間を増大し、細胞バイオマスの生活力の増加、細胞バイオ生 産性、細胞老化の遅延或いは細胞機能の強化或いは正常化が顕著であることであ る。細胞老化を遅延し、培養物に対して耐性細胞順化せしめるモジュレイターは 、特に興味のあることである。

本発明に従う試験管内の細胞の培養を促進するために有用なモジュレイターは、 弐■〜Ｘの活性或いは活性化できる化合物である。ここで用いた、′活性ビタレ ティン　モジュレイター”は、試験管内のさいの培養を促進し、特に、所定培養 物中の細胞の老化を直接に遅延するもの、細胞を、用いた条件下で培養するに順 化する。用語”活性ビタレティンモジュレイタ−１は、それ自体活性でない式Ｉ −Ｘの化合物に関する。然し乍ら、試験管内の細胞の培養を同様に促進する化合 物に活性化できるものである。特に、老化を直接に遅延し、及び／或いは、用い た培養条件下で培養物に細胞を順化するものである。そして、一義的には、逆転 環状化及び互変異性体、脱水反応、水和、塩交換、酸化及び／或いは化合物の遣 元によるものである。また、それは、モジニレイタ−が培養媒体中に入れる前或 いは、培養媒体を、例えば、ｐＨ１塩、０１いはＣＯ３の分圧、酵素の含有率、 ＵＶ或いは他の放射の照射及び温度に関して、適当に調節することによる。”活 性”或いは”活性化できる”のいずれのモジニレイタ−の特徴は、特定の適用に 対して、種々の因子、培養条件及び細胞タイプに依存しており、そして、最適結 果のためのモジュレイターの選択をする。

実際上、天然にある式Ｉ■及びそのサブ式のビタレテイン　モジニレイタ−を用 いることは、一般的に好適である。式ＩＩＩの誘導体は、固有の化合物と考えら れていなく、その代謝経路は現在知られていない。式ＩＩの天然にあるモジュレ イターは、動物、植物、昆虫、蜘蛛形動物及び微生物細胞を含め細胞の広いスペ クトルに対して固有とあると思われ、従って、多く、全部でないが、細胞は、こ れらの生物から誘導され、酵素活性化、利用性及びこれらの化合物の代謝性のた めの良く確立された機構を有すると期待される。従って、効率を最大にし、潜在 的に毒性或いは望ましくない副反応を最小にするために、式Ｉの天然にあるモジ ュレイター或いは本発明の実施で天然のモジュレイターに活性され得るビタレテ インモジュレイターを使用することが、推奨され、また、特に、とタレチン、ビ タレテイン或いはビタレテイン■４について推薦される。

本発明によるモジュレイターの使用は、試験管内での細胞培養物の促進に、特に 、細胞老化を遅らせるため、及び／或いは耐性ｌ８Ｐｉを培養物に順化するため であるが、広い範囲の細胞の適用できるこを意図し、それは、少なくとも、成熟 核生物の代謝経路において、そして、式ＩＩＩ−ＶＩＩＩの非天然の同形、類形 のものと生化学的に等価のものにおいて、式ＩＴの化合物に対する先駆物質のほ とんど全部とする。

細胞成長パターン上に対する本発明のモジュレイターの効果は、典型的には、濃 度依存のものである。効率の最適化、特に、細胞寿命期間性及び細胞機能の最大 化（ｇ４えば、バイオ生産性の程度、及び細胞機能の最大化）に関して、この範 囲以外で、モジュレイターの比較的狭い濃度範囲内で、生じる。細胞成長パター ン及び／或いは細胞機能は、通常培養のものにｔつがちである。また、本発明の 方法は、少なくとも、ある場合、逆転でき、即ち、培養物中の保持される細胞は 、本発明のモジュレイターに接触せしめることにより、その通常寿命期間を超え て、例えば、適当に、モジュレイターを補給しない後まもなく老化を逆転できる 。

本発明により所望の細胞反応を引き出すモジュレイターの量は、ここで、モジュ レイターの”効果的量”と称する。老化を遅延するモジュレイターの最適な量は 、ここで、”老化遅延”量と証するが、老化開始の前に、テスト培ｌＩ物中に変 えた量のモジュレイターを入れ、培養物中の細胞の寿命期間を最大にする濃度を 選択することにより、容易に決定される。前記のように、例えば、選択された細 胞機能を増大するに十分なモジュレイターの量は、よく、細胞活性の他のモジュ レイターに影響を与えるに必要なモジュレイター量と等価である。これは、すべ てについて言えないので、特定の所望の目的結果に対して、モジニレイター濃度 を調整することが有用である。例えば、細胞バイオ生産性を改良するとき、細胞 バイオ生産性期間を改良するとき、細胞機能を強化、改良するとき或いは、細胞 の寿命期特性を改良するときに各々調整することが有用である。

培養物に対する耐性細胞を順化するに必要なモジニレイターの量は、ここで、モ ジュレイターの”順化量”と称される。この場合、培養物中の耐性細胞の寿命期 間は、著しく改良され、細胞機能は、少なくともモジニレイタ−の閾値量で正常 化される。再び、最適順化及び／或いは細胞機能が、培養物中の細胞の成長が十 分になるに必要なモジュレイター量が決められるまで、テスト培養物を、モジュ レイターの種々の濃度に接触せしめることにより、得られる。本発明のこの具体 例において、モジニレイタ−の過剰量は、一般的に順化に悪影響を与えないが、 例えば、上記のような本発明による老化の遅延が望ましい場合には、モジュレイ ターの過剰量は、前記で説明のように、最大の寿命期間を減らす傾向があるので 、回避すべきである。

本発明の細胞生産を促進するためのモジュレイターの効果的濃度のガイドライン としては、特に、細胞表現型発現、機能及び生活力を促進するため、及び特に、 老化の遅延のため、及び細胞の培養物への順化のためでは、約０．Ｏ１ｆｇ〜１ １００ｎ１ｇレテイン　モジスレイター／ミリリットル培養物、好適には、約０ ．１〜１０．０００ｆｇビタレテイン　モジュレイター／ｍｌ培養物が、特にモ ジュレイターの能力と細胞密度に依存して、勧められる。モジュレイターの組合 せを用いる場合、モジュレイターの全量は、通常、これらの範囲にする。ビタレ テイン　モジニレイターの低い濃度での効果的な量は、細胞当りモジニレイタ− １分子に近いので、培養物中に存在する細胞の数、即ち、培養物の細胞密度に従 って、これらの範囲の低い限度でのモジニレイター濃度を調整することが特に重 要である。用いる基底培養媒体は、十分なモジュレイターで補給され、モジュレ イター全濃度が約１〜２ｆｇモジュレイター／ｍｌ媒体であることが最も好適で あり、これは、また、モジュレイターの能力、細胞のタイプ、細胞密度に依存し ている。モジュレイターの上記の濃度範囲は、細胞密度に無関係の培養物に対し てモジュレイターの効果的量であるが、栄養及びモジニレイター供給と廃棄物の 除去の特別の問題が、交合培養物に存在する。従って、交合培養物は、特別な条 件がそれらの環境的必要性のためになされない限り、避けるできである。１０百 万／ｍｌ培養物までは、細胞サイズに依存して、高い細胞密度での交合性増大の ために、細胞濃度の有用な範囲である。

典型的なＩｍｍ密度は、約１０万から１０百万の細胞／ｍｌ培養物であり、上記 の投与量は、そのような密度の基づいたものである。モジュレイターの効果的な 濃度が１分子／１細胞に近付くので、モジニレイタ−濃度は、細胞濃度が増大成 いは減少するにつれて、変化する。

所望に従って細胞活性を正常化するためにビタレテイン　モジュレイターを補給 することは、推奨される。酵素活性の日毎の変化は、はとんどの培養物で、特定 の培養物媒体中及び特定のタイプの用いた細胞で、特定のビタレテイン　モジュ レイターの安定性に依存して、一般的に推奨される。

例示される及び例示されない報告データに基づいて、本発明による培養される細 胞は、ビタレテイン　モジニレイタ−の外生物学的量に対して固有の耐性を示す ようである。これは、濃度として、反応が第１に観察される投与量、ここでは” 閾値投与量”と称される点で増加される。この反応増大は、投与量に従って、最 大反応まで急速になり、この点を”最適投与量”と称する；この点を超えて、細 胞は、増加する投与量に対して低減して反応し、通常の培養で見られるものとな る。基底老化が保持される投与量は、ここで”終点投与量”と称される。約閾値 投与量と終点投与量の間の反応を呈する投与量は、ここで、モジュレイターの” 効果的濃度或いは投与量”と称される。

特定の適用に対する投与量−反応の展開に対するガイドラインは、以下のように される。

反亡　展のガイドライン Ａ、老化を遅延させるためのビタレテイン　モジュレイターを用いる。

本発明による培養されるタイプの細胞を先ずモジュレイターなし制御基底媒体中 で、ジエネレイシッン時間を測定する標準的プラクチスに従って、成長させる。

老化の開始は、良く理解されるように、細胞ジエネレイシ！ン時間の＊＊な増加 によりマークされる。時間的に同じ段階での同じ細胞タイプの試料を次に本発明 によるモジュレイターを例えば、約０．１フエムトグラム（ｆｇ）ビタレテイン 　モジニレイタ−７ｍ１〜約１マイクログラムビタレテイン　モジニレイタ−／ 　ｍ　１培養媒体の範囲含有している同じ媒体中で培養される。但し、これは、 約１百万細胞／ｍｌ培養物の細胞密度に基づき、好適には、１０　ｇ　ｎ□増分 での化合物の投与量は、特定のビタレテイン　モジニレイタ−の効果的な濃度を 局部にするに使用される。次いで、培養物をｌｌｏｇ（ｔ。、増分以下の効果的 な投与量を側面にする範囲にわたり再検査され、効果的な濃度、閾値投与量及び 特定培養物のための最終投与量をすべてにわたり決める。

培ＩＩ物中の細胞の通常の寿命期間及び／或いは老化寿命を２倍にまですること は、本発明に従って、普通に見られるものである。そして、多くの場合、寿命は ３倍かそれ以上増加できる。更（こ、本発明に従って培養した細胞は、表現型に 差があり、処理されない細胞と比べて、生体内での細胞の特徴が強くなると考え られる。

寒皇ヨ 実施例１．Ｎ、Ｎ’　−ビス−ＣＢＺ　−β−アレチン　ＳＳｏ　−ビス　Ｎ− カルボベンゾキシ−β−アラニル　−２−アミノエチル　ヂサルフイドのＡ成 ジシクロへキシルカルボジイミド（２３，３ｇ）溶液を、ジクロロメタン中の乾 燥１０％アセトニトリル全容量約５Ｏ０ｍ１のＮ−ＣＢＺβ−アラニン（２４， ８４ｇ）とＮ−ヒドロキシサクシンイミド（１２，９２ｇ）の溶液中に添加した 。ジシクロへキシルウレア（２４，５１ｇ）が、活性エステル形成の副産物とし て沈殿した。活性エステルは、オイルで乾燥させ、無水エチルエーテルで沈殿さ れる。沈殿物は、ジクロロメタン中で再懸濁し、更にジクロロへキシルウレアを 沈殿させる。得られた活性エステルのジクロロメタン溶液を一過し、シスタミン （８，５ｇ）の予め得た溶液に添加した。所望の生成物：Ｎ、Ｎ’−ビス＝（Ｃ ＢＺ）−β−アレチンがこの混合物から沈殿した。母液、無水エーテル、生成物 のジクロロメタン抽出物及び上記のように回収した活性エステルを乾燥し、沈殿 、再結合して、生成物の収率を出した。生成物は、はとんど水、熱（約７０℃以 上）エチルアセテート及び熱（約３０℃以上）エーテル中に不溶であり、従って 、これらは、不純物を抽出するに使用できる。生成物は、アセトニトリル或いは 水と一緒のジメチルサルフオキシドから再結晶化することができ、再び、エチル アセテート或いはエーテルで洗浄した。後者方法では、生成物融点で１℃上昇、 即ち１８０から１８１℃（補正せず）になった。Ｎ、Ｎ’　−ビ２−　（ＣＢＺ ）　−β−７レチンの収率を理論値に上げる試みが鳥される。理論値の８５〜９ ０％の収率は通常で得られた。真空中でＰ　−０１上で乾燥すると、生成物は一 モル当量の水を保持してい、従って、−水化塩として分析した。

分析：　Ｃ，、Ｈ，、Ｎ、０．Ｓ、Ｈ，Ｏとしての計算値；Ｃ，５３，７８；Ｈ ，６，２５；Ｎ、９．６５実験値：Ｃ，５４，２３；Ｈ，６，５６；Ｎ、９．６ ６試料は、ニューメキシコ州アルバカーキイ、ユニバシテイ　オブ　ニューメキ シコ、化学科のＲｕｂｙ　Ｊｕにより分析された。

実施例１１．ビタレテインのベンジル誘導体のＡ成とＡ、ｌ、次の試薬を添加し 、エーレンマイヤーフラスコ（５００ｍｌ）へ、挙げられた順序に従って混合す る：即ち、実施例■からのＮ、Ｎ’−ビス−（カルボベンゾキシ）−β−アレチ ン（０，７６ｇ）、ジメチル　サルワイド（０，７５ｍ１）、Ｎ、Ｎｏ−ジメチ ルフォルムアミド ｌ）、クロロフォルム（２１ｍｌ）、水（１５０ｍｌ）及びヨウ素（３．３ｇ） 、ヨウ素添加の後、ｐＨが減少はじめた、そして、酸化亜鉛（０．３〜０．４ｇ ）をゆっくり添加することにより５、７に保持した。これを、反応速度を最適に するために、少し酸性ｐＨに維持することは望ましい。この混合物は、制御され た反応を可能にし、有機試薬相から、水性相中に、中間体生成物を連続的に抽出 し、水性相のｐＨを連続的に監視する。反応がサブ側反応を開始し、それは、ｐ Ｈの安定化を提示するときに、水性相を除去し、色が有機相に出なくなるまで、 クロロフォルムでの繰り返し抽出にかけた。この抽出の間に周期的に、ｐＨを、 ＺｎＯの最小量で５、Ｏに再調整した。完全に抽出し、ｐＨ６，Ｏに中和した時 に、水性を、ロトエバボレイク上で低温（く４０℃）で乾燥し、粘性オイル状物 を得た。この過程の間、反応混合物の有機相を水で再抽出し、残量中間体生成物 を回収し、それを、クロロフィルムでの抽出にかけ、ＺｎＯで中和し、第１の抽 出と乾燥した。

合成のこの段階は、所望の化合物の合成での分枝点を示し、この点で、所望の化 合物或いはそのベンジル誘導体が得られる。例えば、ビタレテインＶ４（実施例 ＩＩＩ及び式Ｈ）或いは式Ｖｌｌｌのビタレテインのベンジル誘導体がこの段階 で生成され得る。

ビタレテインのベンジル誘導体を得るために、上記の得られた水性抽出物を、ア セトニトリルの１０容量で処理し、一義的生成物としてベンジル誘導体を沈殿し た。

Ｂ．ビタレテインのベンジル誘　体の特前記で得たベンジル誘導体は、ブロック 化アレチン出発原料として同じ分子重量であった。然し乍ら、多くの点で、Ｎ． Ｎ’　−ビス−（ＣＢＺ）−β−アレチンと似ていない．水に溶解し、独特な［ ”Ｃｌ−及び［’）Ｉ］−ＮＭＲスペクトルを有し、ＩＲスペクトルも同様に区 別できる。ベンジル誘導体は、カルシウム塩として！ｌＩＷｌされたが、ビタレ テインＶ４（以下）の亜鉛塩との差は、前者の高い融点で数える；ベンジル誘導 体は、３００℃以上の温度で溶融したが、一方、出発原料は、１８０−１８１℃ （修正をし）で溶融した。ベンジル誘導体の亜鉛及びカルシウム塩ＮＭＲスペク トルは全く似ているが、塩のみが、これらの差で数えることができたベンジル誘 導体のスペクトルは、チアジンジン或いは環状ウレタン構造と一致していなかっ た。検出できるジサルフィド或いはチオールがなかった。これは、ビタレテイン Ｖ，と同様に、ベンジル誘導体は，硫黄の核反応の各七ツマ−のカルボニル炭素 の１への反応により形成されたことを示唆している。ビタレテインｖ４と興なり ，生産物ベンジル誘導体中のポリマーは，ダイマーと同定され，多分，前記のよ うに，各七ツマ−のチオレートが他の七ツマ−のカルボニル炭素原子と反応する ことにより形成される。

四級炭素は，ｇ１想的にあるようであり，ＮＭＲスペクトルで上電界にシフトし ていない，これは、ビタレテインテトラマー中四級炭素原子は，上電界にシフト しており，ビタレテインテトラマー中よりもベンジル誘導体中の構造拘束が少し あることを示している。元素分析では，ベンジル誘導体で更なる物質結晶化して いることを示し，ダイマー１モル当りカルシウムイオンの２．５当量、酸素２モ ル当量及び水Ｘ１モル当量のダイマーが含有していることで修正された。これは 、２ダイマ一間で酸化カルシウムの架橋して存在していると一致していた。以下 は，上記で得られたベンジル誘導体の元素分析の結果を示し，計算された酸素， 水素及びカルシウムの存在で修正したものである。

分析：　ＣｔＪｘｉＮｔＯｔＳ＊’２．５Ｃａ”″Ｏ″ＯＨ−としての計算値； Ｃ，　４４．　８７；Ｈ，　５。

０６９　；Ｎ．　８．　０５０　実験値：Ｃ．４４．９７；Ｈ，４．９８；Ｎ． ８．０４。

試料は、ニューメキシコ州アルバカーキイ、ユニバシテイ　オプ　ニューメキシ コ、化学科のＲｕｂｙ　ｌｕにより分析された。

実施例ＩＩ＋．ビタレテインｖ４の合成とＡ．企虚．実施例１１Ａでえた乾燥し た水性抽出物に紫外線光（　Ｐｅｎ−線、石英テ／プ、Ｕｌｔｒａ　Ｖｉｏｌｅ ｔ　Ｐｒｏｄｕｃｔｓ．　Ｉｎ（、Ｃａｍｂｒ４ｄｇｅ．　Ｕ．に、）に照射し 、クロロフォルムに、ＵＶ照射下で色が出ないまで、抽出することを繰り返すこ とにより、ベンジル基を除去した。ＵＶ照射は、特に、前記のように、芳香族部 分がなく、深刻で不活性化する再配置或いは分解なしで、生産物を効率的に得る には、推奨される。生産物（芳香族が完全になく）を乾燥し、ＺｎＯの水で中和 し、ジメチルサルフオキシドとアセトニトリルから再結晶させ、ビタレテインｖ ４の亜鉛塩を得た。

Ｂ．ｌ？ヱ上ｆ４＞Ｖ，ｙ）止車； ビタレテインＶ，は、出発原料及びベンジル誘導体とは、明らかに区別された。

５０％以上の収率で上記の方法で得たものは、２３３〜２３５℃（不修正）で溶 融、分解した。ガス発生が、分子の分解を示し、発生したガス（Ｃｏ．）を、Ｎ ，下のＢａ（ＯＨ）＝飽和溶液でトランプし，　Ｂａｃｏｎを回収した。加熱す ると分子が分解し、カルボキシアミド構造とした仮定と一致した。従って、加熱 によるＣＯ，の発生とトラップされたＣＯ，とは、不溶解の炭酸バリウムとされ る。ビタレテインｖｌを含有する炭酸亜鉛の分解から得られる発生ガスの可能性 は認められ、この塩は、３００℃でのＣｏ、発生で分解するからである。スペク トルデータは、ビタレテインＶ．と独特なＮＩＩ造を示し、β−アレチンとの問 題の炭素（２）が共有結合をなしている。ＣＯ，の発生で伴う、鋭いＮ−Ｈスト レッチ共鳴３　２　９　０ｃｍ−’で、また、カルボキシアミド＃ｌｌｌ造に伴 う他の共鳴が、ＩＲスペクトルに見られた。

調製されたビタレテインｖ４は、幾らか湿気があり、残置ジメチルサルフオキシ ドにより再発現できた。次の元素分析は，水を得る分子の傾向を反映していた。

分析：　ＣｔｔＨｔ＋ＮｓＯ＋ｊＳｒ’２Ｚｎ”８Ｈ＋Ｏとしての計算値；Ｃ、 ２７．７２；Ｈ、５、８２；Ｎ、１０．　７８　実験値：Ｃ、２８．５６；Ｈ． 　５．９４；Ｎ，　１０．９６：試料は、ニューメキシコ州アルバカーキイ、二 二バシテイ　オブ　ニューメキシコ、化学科のＲｕｂｙ　Ｊｕにより分析された 。

いくつかの異なる分析の結果は、ビタレテイン　ダイマーは、Ｉ　Ｚｎ”を含有 し、トリマーは、１．５個のｚｎ　＋　１を含有し、テトラマーは、２個のＺｎ ”／１モルポリマー含有した。

アミノエチル　ジサルフィドのＡ成 カルボベンゾキシ基を完全に除去することは、ムハ」■邊」匹。

８６；１２０２−１２０６（１９６４）に説明される方法により行なわれる，　 Ｎ．Ｎｏ−ビス−（ＣＢＺ）−１−アレチンの１モル当り，氷酢酸中の４当量の 臭化水素で１５時間でデブロックした後、β−アレチンは、アセトニトリルで沈 殿させることによりｍ製し、無水エチルエーテルで洗浄し、水で再懸濁し、−過 し、アセトニトリルで生成物との混合塩として沈殿させる。当初の収率は、理論 最大値の８０％以上であった。β−アレチンは、予めＩＭのＫＣＩで溶離させた ダウツクＸ　（Ｄｏｖｅｘ）＾Ｇ　ＩＸ８（塩化形）（Ｄｏｗ　Ｃｈｅｍｉｃａ ｌ　Ｃｏｒｐ．　１１Ｉｉｄｌａｎｄ．ＩＪｉｃｈｉｇａｎ）の３０１１＋ｌＸ １５ｃａ＋の長いカラム上を通過させ、ＤＩ（脱イオン化ン水で完全に洗浄する ことにより，塩化水素塩に変換した。Ｃａ（ＯＨ）、で中和し、水からβ−アレ チンＨＣ１を再結晶化すると、細かい針状で、２２４〜２２５℃融点（補正せず ）のものが得られた。

分析：　Ｃ１＠Ｈ１，Ｎ、Ｏ，５１２ＨＣ１としての計算値；Ｃ，３２，６９： Ｈ１６，５９；Ｎ。

１５．２５　実験値：Ｃ，３２，５２；Ｈ１６，６９；Ｎ、　１５．３２試料は 、二ニーメキシコ州アルバカーキイ、ユニバシテイ　オブ　ニューメキシコ、化 学科のＲｕｂｙ　Ｊｕにより分析された。

Ｂ、ビタレチンの合成、　Ｋｉｎｇ’ｓ　５ｐｅｃｉｌｔｙ　Ｃｏｍｐａｎｙ、 フォートワイン、インヂアナ州、米国から、６．５ｍｇのＺｎＯ及びピリジン（ １２，６ｍｇ；Ｆｉｓｈｅｒ　５ｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、フエイア　ローン、ニュ ーシャーシー州、米国）中のβ−アレチン（６，３５ｍｇ　；実施例ＩＶ、　Ａ 、から）及びジメチルサル７オキシド カンパニイ、セントロイス、ミズリイ州、米国）の憑濁的液に対して、水酸化ナ トリウム含有のガス　トラップを備えた容器中で、０．２ｍｌのホスゲン（２０ ％、トルエン中、フル力　ケミカル　コープ、ロンコンコマ、ニューシャーシー 州、米国）ｅ添加した。４８時間反応後、過剰なホスゲンは、Ｎ，でのアルカリ トラップ中に吹き込んだ。生成物は、アセトニトリル（約５０ｍｌ，フィッシャ ーサイエンティフィック、７エアローン、二ニーーシャーシー州、米国）での容 器中で沈殿せしめた。ビタレチンをアセトニトリルと水から再結晶化できる。

Ｃ．竺又と土ヱΩ丑ｌ 出発原料、β−アレチンは、２２４〜２２５℃（無修正）で溶解し、ビタレテイ ン粉末は２１５〜２２０℃で焼結し、茶色になるが、２４２℃（無修正）まで溶 けないが、この点で、分解し、ガス発生した．この挙動は、ポリマーの分解でガ ス発生するビタレテインＶ，に似ている。２つの化合物の赤外線スペクトルは同 様であるが、ビタレチン　スペクトルは、ポリマーで見られるＣ−Ｏストレッチ 結合を示さなかった。２つの化合物は、熱的に不安定になるカルボキシ−アミノ 基に伴う赤外共鳴を失っていた。こＫは、ビタレチンで、１６００及び１４５５ ｃ＋ｏ−’　（イオン化カルボキシル部分）が消えている主なピークで本当であ る。そして、２８００乃至３３００ｃｍ−’及び９００乃至１３６０ｃＩ１１− ’の領域で失っていた．（即ち、カルボキシ−アミノ基のＮ−Ｈ及びＣ−Ｎ部分 の伴うものである）これは、２４２℃に加熱したとき明らかであった。

実施例Ｖ： ビタレテイン３６．６６　３５．９３　４７．０６車４４．７５　５０．３９　 ３２．９６　１７２．７３Ｖ．　３９．４１本３８．　５１ 誘導体　３３．７９　３５．７６　１５６．４６ｇｇ　４８．３６　３４．６７ 　１７２．２５［’Ｈ］　−ＮＭＲ ａ　ｂ　ｃ　ｄ　ｅ　ｆ β−アレティン２．５２４　３．０８４　−−−　２．６９５　３．３７２　− −−−（Ｚｎ’″゛） β−アレティン２．５１２　３．０８７　−−−　２．６８７　３．３６６　− −−−（÷１．） ビタレテイン Ｖ．（ＤＩＯ）　２．５０２　３．０８１　２．９３７　３．４１６（ＤＭＳＯ −Ｄ６）　２．２００　２．７６３　７．８４　２．４１８　３．１３１　７． ３８誘導体 （Ｄ．０）　２．２３２　３．２０１　２．８４１　３．３３０（ＤＭＳＯ−Ｄ ６）　２．２１０　３．１７６　７．８４　２．５９３　３．３０９　７．２４ ７ビスー（ＣＢＺ）− β−アレチン　２．７４０　３．３０９　８．０８５　２．２５４　３．１９２ 　７．２４（ＤＭＳＯ） レダクターゼ 因子　２．７１　３．０８　２．９０　３．２８（不活性） ａｂ　ｄ　ｅ　ｆ １β−アレチンは、ＺｎＯの存在下で、ＲＥＤＵＣＴＡＣＲＹ［、車（Ｃａｌｂ ｉｏｃｈｅｍ、Ｓａｎ　Ｄｉｅｇｏ．ｈルアｔルニア、米国から市販される特質 還元剤）により還元され、β−アレティンを形成する。後者を夏，と反応させる と、第３の参照化合物、多分、サルフェニル　イオダイドを提供する。

郷エセニ］ ５−ＣＨ，ＣＨ，−Ｎ　）ｌ−Ｎ−Ｃ＝Ｏ０＝Ｃ−ＣＨ，ＣＨ，−Ｎ　）Ｉ−Ｎ −Ｃ＝０〇− ビタレチン　３１７０ｗ　３２９０＋ａ］、５５０ｖ　１５６０ｓ Ｖａ　７１０ｗ　３０８０ｓ　３２９０ｍ１５３０ｍ　１５６０ｇ ２５３ｍ ６５０ｓ ５６ｍ べｌゾル　６９２−５７０ｗ　３３０８ｓ　３３０８ｓ誘導体　１５４２ｓ　１ ５４２ｓ １６３５ｓ　１２５３ｍ ６８４ｓ ビス（ＣＢＺ）　３３４５ｓ　３３４５ｓβ−７レチノ　１５４２ｓ　１５３５ ｓ１６４０ｓ　１２７０ｓ β　ｂ　ｃ　ｄ　ｅ　ｆ Ｓ−ＣＨ，ＣＨ，−Ｎ　Ｈ−Ｎ−Ｃ−００−Ｃ−Ｃ）Ｉ、　ＣＨ，−Ｎ　−Ｎ− Ｈβ−アレチン　６６０冑　３２５０ｗ　３２７０ｖ１５５５ｗ−ｓ　２９７０ ５−ｗ １２８６＋ａ　１４６２ｓ １６２０ｓ　１６２０ｇ １２８ｓ ビタレテインＶ、及びビタレテインは、化合物が溶融し、各々、２３３〜２３５ ℃及び２４２℃（無修正）で分解し、Ｃｏｔを失ったときに、消えた上記の部分 ゛　ｆ”に伴う共鳴が独特であった。

ビタレテイン■、の中で、これらの損失は、追随の損失がない、（Ｃ−０−）、 ポリマー；従って、ビタレテインｖ４のデカルボキシ化形は、β−アレチンのオ リゴマーであり、非デカルボキシ化ポリマーと同様だが、カルボキシ部分がない 。

ビタレテインのピークｉ　３２９０ｍ、　３１７０ｗシールダ３１００．２９９ ０ｍ、　１６６０ｓ、１６００９１．　１５６５ｍ、　１４５５ｇ、　１４１０ ｖ（１４００ン宣ルダー）、　１３３０ｗ（１３１０′／ｉルダー）、　１２６ ０ｍ（１２３０ンｙルダー）、　１１９０ｗ、　１１３５＋ａ、１１００ｍ（１ ０９０シ璽ルダー）、　１０３０＋ａ−ｓ、　９５５ｍ、加熱されたビタレテイ ンのピークｉ　３１５０ｓ（アローｒ）、１６５５ｓ、　１５５０Ｉ１１、１４ ０５ｓ（１４５０と１３９０シ１ルダー）。

次のビタレテインＶ、のＩＲスペクトルは、アセトニトリルを錯体での水和の水 で交換することによりシフトされた。

ビタレテインｖ４のピーク；　３２９０す、３０８０ｓ／ブ”−Ｆ−２５００， １６５０ｓ、　１５６０ｓ、　１５３０ｍ、　１４５３ｗ、　１４１７Ｗ、　１ ３９３９．１３４６Ｗ、１３１８ｗ、　１２５３ｍ、１１ｇＯ３、１１１７ｓ、 　１１１５ｗ／７ｔウルダー、　１０４０ｇ、　１０３０ｓ、９５６ｍ、　７９ ０ｍ（シ鵞ルダー）、　７０９Ｗ／プロづ、６１２ｍ／シャープ、５２６ｍ、こ れらのシフトは、以下の中和されたβ−アレチンのスペクトルに観察されたもの と似ている。

β−アレチンは、ｐＨの変化が通常でなく、即ち、Ｃａ（ＯＨ）ｔで中和され、 その位置と帯強度が大きく変わる。

ピーク（）ＩＣＩ塩）：３２７０ｓ、　３１７０ｇ、２９７０ｇ、２７００ｖ、 　２５５０ｗ、　２０２０ｗ、　１６５７ｓ、１５９５＋ｏ、１５６０ｇ、１４ ５０ｇ、１４０９＠、　１３９０ｖ、１３５４ｖ、１３２５ｍ、　１３００ｗ、 ＞ｗルダー／１２５２ｍ／シ萱ルダー、　１１８８ｍ、１１２９＋ａ、１０９７ ｍ、　１０７９ｗ、　１０３０ｗ、　９ＳＯＷ、９０５ｗ、８２９ｍ、ピーク（ 中和された）　：　３２５０ｗ、３１８０ｗ、２９４０ｒａ／ブトｒ、　２３７ ５ｗ、　２２３０ｓ、２１５７ｇ、１９３６ｗ、１６２０Ｗ、１５５５Ｗ、１４ ６２ｓ、１３４２シ１ルダー、　１４００ｍ、１３４２ｍ、１２８６０１．　１ ２１７１１．　１１８８１１、１１２８ｓ、　１０２０ｍ、８１０ｗ、７１９ｍ 、　６６０ｗ、ベンジル誘導体は、ビタレテインＶ、と相当に相同性を呈示した 。

ピーク；　３３０８ｓ、　３０６０ｗ、　２９４２ｖ、　１６８４ｓ、　１６３ ５ｓ、　１５４２ｓ、　１４４７ｍ、１３８０ｖ、　１３３５ｗ、　１２８６ｗ 、１２５３ｍ、１１９３ｓ、１１７０ｔｉルダー、　１０８０ＩＩｉ、１０４０ ｍ、　９８０ｗ、　７３８ｍ、６９２ｆｆｉ、６０９Ｉ１１．５５０ｗ。

ビス−（ＣＢＺ）−β−アレチンは、ビタレテインＶ、及びそのベンジル誘導体 にａ察される１２００付近のＣ−０共鳴吸収は示さない。

ピーク　ｉ　３３４５ｓ、　３３１０ｓ、　１６８２ｓ、　１６４０ｓ、１５４ ５ｍ７ｙルｆ−５１５３５ｓ、１４５０ｗ、　１４２７ｗ、　１３７５ｗ、　１ ３３２＋ｓ、　１２７０ｍ、　１２３１ｍ、　１１７８ｖ、１１２０ｗ、　１０ ３０ｍ／プローｒ、 次の実施例では、全て１ＩｊＪＨ１は、約３７℃で特定時間培養した。

実施例ｖＩ＝ヒト　然キラーＮＫ）　胞の培養　への順亡イヒトＮＫ細胞を、Ｌ 、Ｅｗ−シ炙、担；９９−１１３．１９８９に説明されるように精製した。細胞 の標準的培養媒体を製造した：１０％ヒトＡＢ−血清、ペニシリン（１００Ｕ／ ｍｌ）及びストレプトマイシン（１００μｇ／ｍｌ）を含有するＲＰＭＩ　１６ ４０（Ｒｏｓｅｖｅｌｌ　Ｐａｒｋ　Ｍｅｗｏｒｉａｌ　［ｎ５ｔｉｔｕｔａ、 Ｗｈｉｔｔａｋｅｒ　Ｍ、＾、　Ｂｉｏｐｒａｄｕｃｔｓ、　１ｌａｌｋｅｒｓ ｖｉｌｌｅ、ＭＤ、米国）で、１１御媒体として役にたつ、Ｘ験媒体を、ビタレ テインｖ４の適当な水性希釈液の２５μｌ　／　ｍ　１を添加することにより作 成し、コントロールと同じ細胞を含有する媒体少量で、次の各最終濃度液を得た 。即ち、０．ｌｆｇ／ｍｌ、１　ｔ　ｇ／ｍ１．１０　ｆ　ｇ／ｍ　＋、１００ 　ｆ　ｇ／ｍ１．１　ｐｇ／ｍ＋及び１０ｐｇ／ｍ１Ｉｌ ＊＊細＠（ｉｘｘｏ’）を種付けし、そして、コントロール及びテスト媒体中で ３７℃で５％ＣＯ１でインキユベートした。ｌｌ胞は、数えて、日毎に、トライ パンブルー（０，１％、燐酸バッファ生理的食塩水）監視により、活性をチェッ クし、そして、同じビタレテインＶ、濃度を含有する媒体は、毎２日で変えて、 生理的ｐＨを保持し、廃棄分を＊ａから除去した。

培ｌＩ物中でＮＫ細胞の数を劇的に安定化でき、ビタレテインＶ。

で観察した。、５日毎に補給しないものでは、細胞がない、即ち、コントロール ではない。ビタレテインＶ、含有媒体中で、７０〜８０％の細胞が１週間以上生 き続けた。効果的な濃度の程度は、この特別の実験では、決められなく、ビタレ テインｖ４の２回投与が、更に研究のために、選択された。

生活力テストの結果は、表１に概略される。

旦　欺ｙ・　Ｕ且ち力１　ｎ区ｈｈ１ ０　９８土２　９８±２　９９１２ １　９６土１．５　９８±２　９９±２．５２　４５±１．８　９７±１．５　 ９８　＊　３３　３０土１．５　９８±２．５　９８±２４　１５土０．５　９ ７±３　９７±３５−２０　０±０　９７　＊　３　９７土３１ｆｇ／ｍ＋−１ ｐｇ／ｍｌの濃度のビタレテインＶ、は、１月の間に、培養物中の細胞の７０〜 ８０％で安定化した。その時、細胞は、機能の研究のために凍結された。コント ロール培養物中に残った細胞はなく、即ち、研究の６日までに、ビタレテインＶ 。

かない。１１１日から培ｌＩ物中に落としたトライパンブルーを排除する能力の コントロール細胞と違い、ビタレテインｖ４補給の媒体中の９７土３％の細胞は 、培養物中で３０日後も生きていた、即ち、染色を除去した。

実施例Ｖｌｌ：匠気立土筬亙及１ 本発明は、更に、以下”ビタレテイン　モジュレイター”と称されるような、ビ タレテイン、カルボキシ−アミノ−アミドの硫黄含有炭化水素を有する生物学的 活性をモジュレイトする化合物の群を利用する方法も提供する。化合物は、高め られた生物学的活性により特徴づけられ、なかんづく、細胞の表現型発現及び生 活力の改良のため、及び、それより誘導される治療的利点のために有用である。

特に、化合物は、例えば、細胞の悪性化により生じた病気、異常の処置に有用で ある。

本発明は、更に、ここに説明した化合物の利用方法に関しており、生物内の異常 な細胞の正常化及び回復を高め、処置困難な細胞を認識し、生物から消失せしめ 、特に、治療的利点のため、生体内治療利点のために利用できる。表！ｌ！型発 現機能細胞、即ち、非機能或いは処置困難な細胞から、生物内に配列、集積して いる細胞、それにより、非生産性で、非機能の、逆転生産性或いはパラン・ｙチ ー或いはパソゲン誘導の細胞は、予防反応の前に、生物内に存在するようにでき 、生物内に機能不足で生産不足を修正する。これは、この原理が、生物の発展及 び維持に重要であり、その理由は、非機能細胞により所望の細胞の過大成長を防 止するからである。このような機構は、エネルギー保存で予防の利点を入れるた めに存在しなければならず、非機能細胞は、所望の機能細胞有する。

病気は、生体内で、化合物が！Ｒｆ！ｌＢ的に不足するためとされ、不足が生じ た細胞により制御される組織内でそれ自体を操作する。

化合物は、非常に低い濃度で効果的であり、生体内で、消える程の少量濃度で生 じるとされ、従って、種々のファクターと条件で不安定である。不足は代謝のバ ランスを失って、自然に生じると考えられ、放射線の結果として、化合物喪失を 通して生じ、また、老化、食不足、バソゲン或いはバラシテック侵入により、そ して、環境中の外米生体に接触することにより生じると思われる。

化合物は、いくつかの病気カテゴリで予防或いは治療を示す：１）過剰或いは不 適切な細胞生産からの病気；２）過剰の或いは不適切な細胞機能からの病気；３ ）付与された或いは異常な免疫スクリーニング（自己免疫及び免疫不足病気を含 む）により生じる病気である。

生体内で、特定の細胞タイプの機能の不足は、３つの機構によへりまとめられる ；１）特定のタイプの新細胞の伝搬を増加させる２こと、２）そのタイプの存在 する細胞を保存すること、３）そのタイプの存在する細胞の機能及び／或いはバ イオ生産性を導入することである。非−或いはダイス機能Ｊｌｌｌｌ胞タイプの 伝搬を増加することは、不足の処方箋でなく、よく、非生産性或いは逆の生産性 結果を与える。存在する細胞を保存し、その機能及びバイオ生産性を導入するこ とにより、機能不足は、予防反応の発現なしで、開放される。

従って、培養物中及び生体内の細胞の生活力及び機能を促進するに効果的な化合 物を提供することは望ましい。これは、ある細胞タイプ、例えば、免疫細胞の伝 搬を保持することを含み、そして、特に、細胞生活力、バイオ生産性、機能及び 寿命を促進するため、そして、耐性細胞を培養物に順化するためである。このよ うな化合物は、それ自体だけでなく、他のバイオエフェクターと組合せても有用 であり、生産細胞バイオマスの安定化及び増殖のような意図する組合せ効果のた めである。

更に、本発明は、ここで”ビタレテインモジェレイターと称する化合物の群を、 病気の処置のために、使用する方法を提供する、これは、ビタレテイン、Ｎ−（ ２−メルカプト−エタン）−［３−（カルボキシアミノ）−プロパンアミド］の 遊離酸或いは塩、ビタレチン、この化合物の酸化（或いはジサルフイド）形、こ れらの化合物の生物学的活性及び活性化できる再配置形、その生物学的に交換で きる塩、水和物、そのオリゴマーをも含む。更に、モジュレイターは、ビタレテ イン或いはビタレチン及びその相当する再配置形の生物学的活性或いは活性化同 形、類似形を含み、また、その塩、水和物及びオリゴマーを含む。化合物は、な かんづく、生体内及び試験管内の細胞の表現型発現及び生活力を促進し、例えば 、増加された細胞寿命の促進、増加された細胞バイオ生産性の促進及び増加され た細胞機能の促進をも含む。このようにこのクラスの化合物は、種々の目的に細 胞の活性を促進し、例えば、効率的で、長期間生産の細胞、市販或いは研究の目 的での細胞生産物を促進し、異常及び正常の細胞の治療学的な比較研究、特に、 耐性細胞を培養物に順化し、試験管内での移植組織或いは器官の開発及び生産及 び広く、予め純粋な理論的なバイオメジカル適用のための細胞の培養に用いるこ とができる。モジュレイターは、少なくとも、広い種類の細胞が細胞生産性と細 胞活性を最適にする機能を有し、目的のバイオ技術、特に、バイオメジカルな適 用（生体内治療を含む）の広いｉ！囲での出発点を提供するものである。

ビタレテインモジュレイターは、なかんずく、有用であり、試験管内及び生体内 において、細胞表現型発現及び細胞生活力を改良し、例えば、細胞寿命を増加し 、細胞バイオ生産性を増加し、細胞機能を増加し、それより得られる治療効果が あり、耐性細胞を培養物に順化し、特に、細胞バイオ生産性と機能を高め、耐性 細胞を培養物に順化するのに有用である。本発明の方法は、特に、通常の培養条 件下で連続的に成長しない、特に、′正常な”哺乳動物細胞に、適用できる。こ こで言う”正常細胞”とは、非移植で、特に、非−ビールス移植で非腫瘍移植細 胞で、ある点では、異常な機能の非移植細胞を含み、そして、バイオ生産性レベ ルが、異常に高いか低い、或いは機能が、正常の細胞機能と比べて、異常に抑制 されているか、高くされている細胞のようなものをも含むものである。

化合物による治療への反応にかけられる病気或いは異常は、３つの一般的なカテ ゴリーになる。即ち、１）不適切な或いは過剰な細胞生産から生じる病気、２） 不適切或いは過剰な細胞機能のいずれかにより生じる病気、及び３）付与された 或いは異常な免疫学的なスクリーニングから生じる病気である。免疫学的異常、 例えば、自己免疫及び免疫不足の病気（ハイポガンマーグロブリネミア、カンジ ダ症、ＡＩＤＳ、狼癒、及びリウマチ関節炎を含むン、老化（早老症も含む）、 甲状ａ５１遭興富（甲状腺炎、及びハイポ−及びハイバーチロイジスム）、蓄積 症、糖尿病及びアテローム性動脈硬化症及び関連心臓病は、すべて、このカテゴ リに入る。同様に、バラシテック及びバソゲン誘導異常も、この第３のカテゴリ に入る。少なくとも、生産物或いは機能の細胞不足或いは過剰が、これら生物を 免疫学的に検査する及び消失させることを免れているので、それを決定する。上 記のカテゴリは、また、ホルモン不足或いは過剰のもの、免疫不足或いは過剰の もの、感染症（バラシテック、バクテリア、ビールス或いはフンガルを含む）及 び早過ぎる老化を含む。群としてのモジュレイターは、効能があり、従って、ホ ルモンのバランス喪失、免疫チャレンジ（感染或いは感染症のような）及び細胞 の早過ぎる老化を含む病気或いは異常に対する細胞の反応を最適にする。

本発明により、モジュレイターのために特別に意図するｌｌ１１ｔ１タイプは、 病気或いは異常から回復するためであり、哺乳動物組織、器官及び腺から誘導さ れる細胞を含み、例えば、脳、心臓、肺、胃、腸、甲状腺、副腎、胸腺、上皮小 体、寧丸、肝臓、腎臓、ぼうこう、膵臓、膵臓、胆嚢、卵巣、子宮、前立腺、及 び皮膚；再生細胞（精子、卵子）；リンパ腺、骨、軟骨及び間質細胞；免疫細胞 、マクロファージのようなシトファージ、リンパ球、白血球、赤血球及び血漿板 のような血液細胞を含む。

身体から細胞を抽出して処置する場合、抽出細胞の次の試験管内操作を行ないモ ジュレイターを利用する。ａ）通常の条件下で培養物にほぼ耐性の細胞を培養す るための順化すること、即ち、約２週間以下の通常の培養条件下で半寿命を有す るもの或いは、培養物中で正常の生産物、正常の量の生産物を発現しないもの； ｂ）細胞を不死化細胞に細胞を融合する必要をなくし、細胞生産物の長いバイオ 生産性を得るように、長期間培養を可能にし、例えば、抗体生産性膵臓細胞或い はリンパ球細胞を不死細胞と融合する必要は、モノクロナール抗体のマス化生産 のためにである；Ｃ）培養物中の細胞の老化遅延、生体内或いは試験管内でそれ から誘導される治療学的利点；ｄ）培養物中の成長因子及び／或いはミトゲンに 接触せしめる細胞の生活力の増加せしめる、生体内或いは試験管内でそれから誘 導される治療学的利点：ｅ）培養物中の細胞のバイオマスの増加すること、予防 刺激のための接触の前、その間、その後において細胞を安定化すること；ｆ）培 養物中の細胞の寿命期間を伸ばすこと、生体内或いは試験管内でそれから誘導さ れる治療学的利点；ｇ）培養物中の細胞のバイオ生産性及び機能或いはその両方 を高め、生体内或いは試験管内でそれから誘導される治療学的利点；ｈ）培養物 中の細胞に対する表！！ｌ！型発曵のスペクトルを増加せしめること；そして、 生体内或いは試験管内でそれから誘導される治療学的利点である。

本発明の他の面によると、異常な及び処置困難な細胞を復帰せしめ或いは消滅せ しめ、化合物のモジニレイト濃度で生体内或いは試験管内で接触することにより 行なう。また、適当なエフェクター細胞或いは試験管内細胞にできる０本発明の 具体例の範囲内の細胞は、バイオ生産性或いは機能が付与されている細胞を含む 。本発明の方法により、バイオ生産性は、少なくとも、正常の生体内バイオ生産 性の特徴；及び／或いは機能を改良するうちに、著しく改良され、また完全に保 持される。そして、異常の及び／或いは処置困難な細胞は消失される。本発明の 具体例ζこよると、病気の開始が、化合物濃度を遅延により、遅延される。

培養される細胞は、本発明のモジュレイターにし）かなる方法でも接触せしめら れる。モジュレイターは、例えば、栄養媒体中毒；入れられ、或いは細胞保持要 素に入れられる。細胞は、モジュレイターに予め接触せしめられる。特に、本発 明の具体例では、モジュレイターと支持に用いた出発原料と組合せることにより モジュレイターを支持材料中に入れる。中空繊維膜のような天然或し）は合成支 持具のために、モジュレイターを合成プレポＩＪマーＧ；入れること、或いは、 ゲル支持具の製造のためのプレゲル、或ν１（よ細胞支持具の製造のための液化 セルロースは、１つの例である。

モジュレイターは、都合のよい生理的に受け入れる担体、生理的食塩水、燐酸バ ッファ生理的食塩水、逆に不活性しなり１もの、モジニレイタ−の疾患を与えな いものである限り、そこに注入する。これは、ｔ、！／、ｔ、ｐ、ｓ、ｃ、及び ｔ、　ｄ、の方法も含む。モジュレイターは、また、逆に不活性の結果にならな 塾１或１１は疾患にならない方法で投与でき、経口的に、また、更に、エンテロ −コートで、肛門投与、扉口投与で、スプレィ形及び粘剤での皮膚投与でもでき る。

本発明の実施によると、細胞を１以上の活性ビタレテイン　モジュレイター或い は式１−Ｘの１以上の活性或いは活性化モジニレイターに、試験管内或いは生体 内の細胞が所望の生物学的反応を促進するに十分の量、に接触せしめる。これは 、処理のなし１細胞に比べると、例えば、細胞寿命期間或いは生活力を増大し、 細胞バイオマスの生活力の増加、細胞バイオ生産性、細胞老化の遅延或いは細胞 機能の強化或いは正常化或いは処置困難な細胞の消失が１１１Ｗである。病気を 遅延し、或いは消滅させ、異常細胞行動を正常化し、及び／或いは処置困難な細 胞を消滅せしめるモジュレイターは、待に興味深い。

本発明に従う試験管内の細胞の培養を促進するために有用なモジュレイターは、 式Ｉ−Ｘの活性或いは活性化できる化合物である。ここで用いた、”活性ビタレ テイン　モジュレイター”は、試験管内の細胞の培養を促進し、特に、所定培養 物中の細胞の老化を直接に遅延するもの、細胞を、用いた条件下で培養するに順 化する。用語”活性化ビタレテインモジュレイター”は、それ自体活性でない式 ■〜Ｘの化合物に関する。然し乍ら、試験管内の細胞の培養を同様に促進する化 合物に活性化できるものである。

特に、老化を直接に遅延し、及び／或いは、用いた培養条件下で培養物に細胞を 順化するものである。そして、一義的には、逆転環状化及び互変異性体、脱水反 応、水和、塩交換、酸化及び／或いは化合物の還元によるものである。また、そ れは、モジュレイターを培養媒体中に入れる前或いは、培養媒体を、例えば、９ Ｈ１塩、０．或いはＣＯ３の分圧、酵素の含有率、ＵＶ或いは他の放射の照射及 び温度に関して、適当に調節することによる。”活性”或いは”活性化できる” のいずれのモジュレイターの特徴は。

特定の適用に対して、種々の因子、培養条件及び細胞タイプに依存しており、従 って、最適結果のためのモジニレイタ−の選択をする。

実際上、天然にある式ＴＩ及びそのサブ式のビタレテイン　モジュレイターを用 いることは、一般的に好適である０式ＩＩＩの誘導体は、固有の化合物と考えら れてなく、その代謝経路は現在知られていない。式ＩＩの天然にあるモジニレイ タ−は、動物、植物、昆虫、蜘蛛形動物及び微生物細胞を含め細胞の広いスペク トルに対して固有とあると思われ、従って、多く、全部でないが、細胞は、これ らの生物から誘導され、酵素活性化、利用性及びこれらの化合物の代謝性のため の良く確立された機構を有すると期待される。従って、効率を最大にし、潜在的 に毒性或いは望ましくない副反応を最小にするために、式Ｉの天然にあるモジュ レイター或いは本発明の実施で天然のモジュレイターに活性さＦＬ得るビタレテ インモジュレイターを使用することが推奨され、また、特に、ピタレチン、ビタ レテイン或いはビタレテインｖ１について推薦される。

本発明によるモジュレイターの使用は、試験管内での細胞培養物の促進に、特に 、細胞老化を遅らせるため、及び／或いは耐性細胞を培養物に順化するためであ るが、広い範囲の細胞の適用できるこを意図し、それは、少なくとも、成熟核生 物の代謝経路において、そして、式ＩＩＩ−Ｖｒｌｌの非天然の同形、類形のも のと生化学的に等価のものにおいて、式ＩＩの化合物に対する先駆物質のほとん ど全部とする。

Ａ、病気或いは異常の処置におけるビタレテイン　モジニレイタ−の利用の一般 的ガイドライン 本発明により所望の細胞反応を引き出すモジニレイタ−の量は、ここで、モジュ レイターの”効果的量”と称する。老化を遅延するモジュレイターの最適な量は 、ここで、′老化遅延”量と証するが、老化開始の前に、テスト培養物中に変え た量のモジニレイタ−を入れ、培養物中の細胞の寿命期間を最大にする濃度を選 択することにより、容易に決定される。前記のように、例えば、選択された細胞 機能を増大するに十分なモジニレイタ−の量は、よく、細胞活性の他のモジュレ イターに影響を与えるに必要なモジニレイター量と等価である。これは、すべて について言えないので、特定の所望の目的結果に対して、モジニレイタ−濃度を 調整することが有用である。例えば、細胞バイオ生産性を改良するとき、細胞バ イオ生産性期間を改良するとき、細胞機能を強化、改良するとき或いは、細胞の 寿命期特性を改良するときに各々調整することが有用である。

本発明の細胞生産を促進するためのモジュレイターの効果的濃度のガイドライン としては、特に、細胞表現型発現、機能及び生活力を促進するため、そして特に 、病気の遅延或いは無くするため、異常細胞行動の正常化のため、及び／或いは 処置困難な細胞を減滅させるために、約０．Ｏ１ｆｇ〜１１００ｎビタレテイン モジュレイター／ミリリットル培養物、好適には、約０．１〜１０、ＯＯＯｆｇ ビタレテイン　モジニレイクー／ｍｌ培養物が、特にモジュレイターの能力と細 胞密度に依存して、勧められる。或いは生体内適用には、約０．ｌｆｇ〜１、Ｏ ＯＯｎｇビタレテインモジュレイター／ｋｇ体重、好適には、約１ｆｇ〜Ｉｏｎ ｇビタレテインモジュレイター／ｋｇ体重が、モジュレイターの効力及び細胞密 度に依存して、推奨される。モジュレイターの組合せを用いる場合、モジュレイ ターの全量は、通常、これらの範囲にする。ビタレテイン　モジニレイタ−の低 い濃度での効果的な量は、細胞当りモジニレイタ−１分子に近いので、培養物中 に存在する細胞の数、即ち、培養物の細胞密度に従って、これらの範囲の低い限 度でのモジュレイター濃度を調整することが特に重要である。用いる基底培養媒 体は、十分なモジュレイターで補給され、モジュレイター全濃度が約１〜２ｆｇ モジニレイター／ｍｌ媒体であることが最も好適であり、これは、また、モジニ レイタ−の能力、細胞のタイプ、細胞密度に依存している。生体内適用のモジュ レイターの全濃度は、１０ｆｇ〜１１００ｐ／ｋｇ！ｒ’、モジュレイターの効 力及び細胞のタイプ及び細胞濃度に依存して、最も好適である。モジニレイタ− の上記の濃度範囲は、細胞密度に無関係の培養物に対してモジニレイタ−の効果 的量であるが、栄養及びモジニレイター供給と廃棄物の除去の特別の問題が、交 会培養物に存在する。従って、交会培養物は、特別な条件がそれらの環境的必要 性のためになされない限り、避けるべきである。１０百万／ｍｌ培養物までは、 細胞サイズに依存して、高い細胞密度での交合性増大のために、細胞濃度の有用 な範囲である。典型的な細胞密度は、約１０万から１０百万の細胞／ｍｌ培養物 であり、上記の投与量は、そのような密度の基づいたものである。モジュレイタ ーの効果的な濃度が１分子／１細胞に近付くので、モジュレイター濃度は、細胞 濃度が増大成いは減少するにつれて、変化する。

Ｂ、生体内適用でのビタレテイン　モジュレイターを用いること本発明によりモ ジニレイトされる生物学的活性は、一般的に、ビタレテインモジニレイターの存 在及び不存在と平行に評価され、モジニレイトされた活性の評価と同じ条件下で 、基底生物学的活性を確立した。モジュレイターは、前記のように投与され、一 方、抑制或いは基底の群は、投与の担体のみを受けた０例えば、５以上の動物の 群を、１　ｏ　ｇ　ｎｕ増殖で、０．ｌｆｇ〜１，０００ｎｇビタレテインモジ ェレイター／ｋｇ体重の量で処置された、（生理的食塩水でｔ、１）、注射によ り、ときにより、モジニレイタ−の代謝の抑制剤を含む）、研究のため、周期的 に例えば、。

週当り３回、処置する。試料或いは測定が採取され、レジメとして保存され、少 なくとも２週間及び１５週間、継続される。データの編為後、ｘ、ｙ、ｚ軸に各 々投与量、週間及び反応をとり、３次元表面でグラフで反応を評価する。モジニ レイタ−の最適濃度は、この方法で容易に同定され、代謝の抑制剤を含む場合、 研究を繰り返し、この濃度を一定に維持し、抑制剤の濃度を変えて、抑制剤の濃 度を最適にする。モジニレイタ−の空間増加で分析を繰り返し、抑制剤の一定の 最適の投与量でし、最適にし、化合物のために濃度の効果的範囲をする。

治療的効果は、ＬＯＯｎｇ抑制剤／ｋｇ体重はどの少なさで、また、ｔｏｏｐｇ ビタレテインモジエレイター／ｋｇ体重以下で得られた。

実施例Ｖ［ＩＩ　：新形成の予　と　置本発明は、ビタレテイン、　［Ｎ−（２ −メルカプト−エタン）−３−カルボキシ−アミノ−プロパンアミド］　（ここ で、”ビタレテイン　モジュレイター”と称する）の硫黄含有炭化水素を有する 生物学的活性度をモジニレイトする化合物群を用いた新規な方法を提供する。化 合物は、高められた生物学的活性により特徴づけられ、なかんづく、通常の生体 内及び試験管内の新形成細胞の通常の表現型発現を再確立するために有用であり 、そして、新形成細胞の免疫サーベイランスを刺激するに有用である。特に、化 合物は、腫瘍成長を抑制し、腫瘍細胞の転移を抑制し、そして、腫瘍を後退させ る。

５！ｉ（新形成）は、一般的に、化学療法、切除、及び／或いは放射線療法で処 置され、その効率は、通常細胞と新形成細胞の間の成長速度の差異に依存してい る。これらの療法は、縁部効果的であると思われる。主な細菌の療法は、腫瘍に 対する身体の防衛性を強化することで、例えば、新形成細胞に対して戦闘的にす ること身体の免疫反応を高めることによる。免疫システムの複雑性によるのみで 、そのような療法は、その価値が証明されていない。

ＮＫ（天然キラー）細胞が初期段階での腫瘍出現に対して重要なエフェクターで あると、Ｉｍｍｕｎｏｂｉｏｌｏｇｙ　ｏｆ　Ｎａｔｕｒａｌ　Ｋ１１ｌｅｒ　 Ｃｅ１ｌｓ、　Ｖｏｌ、Ｉ及びＩＩ、１９８６、ＣＲＣプレス、Ｂｏｃａ　Ｒａ ｔｏｎ、　Ｆｌｏｒｉｄａ、米国）に説明される。また、アトブチイブ免疫療法 （除去、試験管内活性化そして免疫学的反応性リンパ球を感染された動物に戻す こと）を通して、動物にある腫瘍を後退せしめたことが、Ｉｍｍｕｎｅ　Ｒｅ５ ｐ。

ｎ５ｅＳｔｏ　Ｍｅｔａｓｔａｓｅｓ、　ｖｏｌ、Ｉ及びＩｌ、　１９８７、Ｂ ｏｃａ　Ｒａｔｏｎ、　Ｆｌｏｒｉｄａ、米国）に説明されている。従って、細 胞機能を、新形成細胞の細胞移転の機構にあることを妨害する、細胞の機能を正 常化する方法を提供することが望ましい。そして、生体内でも試験管内でも、新 形成細胞に敵対するそれらの生物学的反応を高めるものである。

本発明は、ここで９ビタレテイン　モジニレイタ−と称する化合物の群を、試験 管内或いは生体内に投与することにより、癌の処置方法を提供する。これは、ビ タレテイン、Ｎ−（２−メルカプト−エタン）−［３−（カルボキシアミノ）− プロパンアミド］の遊離酸或いは塩、イタレチン、この化合物の酸化（或いはジ サルフィド）形、これらの化合物の生物学的活性及び活性化できる再配置形、そ の生物学的に交換できる塩、水和物、そのオリゴマーをも含む。更に、モジュレ イターは、ビタレテイン或いはイタレチン及びその相当する再配置形の生物学的 活性或いは活性化同形、類似形を含み、また、その塩、水和物及びオリゴマーを 含む。

この化合物は、なかんづく、正常及び新形成の細胞の表現型発現を促進し、新形 成細胞を正常化し、及び／或いはそれらの細胞を身体から除去する。例えば、正 常な成長サイクル、寿命期間及び特に、腫瘍細胞及び免疫細胞そして、特に、Ｎ Ｋ（天然キラー）細胞の機能を再確立する。

特別に意図する利用カテゴリには、ａ）Ｎ　Ｋ１１ｌ胞の腫瘍細胞を崩壊する能 力を高めること、　ｂ）腫瘍細胞を免疫システムの細胞に有用にすること、Ｃ） 生体内での新形成細胞に交戦的な免疫細胞の寿命期間を伸ばすこと、そして、ｄ ）新形成から転移細胞への細胞変換の作用機溝を妨害することを含む。

本発明の方法に従って、新形成を処理するに有用なモジニレイタ−は式１からＸ までの活性或いは活性化化合物を有する。ここで使用する”活性ビタレテイン　 モジュレイター”は、それ自体試験管内及び生体内で、新形成の処理に効果的な 式■〜Ｘの化合物である。ここで使用する”活性化ビタレテイン　モジュレイタ ー”は、初期形活性でないが、生物学的に或いは他の手段で、逆転環状化、互変 異性体化、脱水化、水和、塩交換、酸化及び／或いは、以下説明する化合物の還 元により、該モジュレイターを培養物媒体に入れる前に、また、化合物が試験管 内に投与される前に、活性化でき、試験管内及び生体内で新形成の処理に同様に 効果的な化合物になる式■〜Ｘの化合物を表わす。或いは、それは、試験管内及 び生体内条件の適当な調整により、例えば、ｐＨ１塩、０．或いはＣＯＩの部分 圧、酵素含有量、ＵＶ或いは他の放射線に晒すこと、及び温度に関して、調整す ることにより、活性化することができる。特定の適用において、”活性”或いは ”活性化”のいずれかとして与えられるモジュレイターの特性は、多種の因子、 細胞及び細胞タイプの環境のためのモジュレイターの選択を含める因子に依存し ており、従って、最適な結果が得られる。

実際上、天然にある式ＩＩ及びそのサブ式のビタレテイン　モジュレイターを用 いることは、一般的に好適である。式ＩＩ＋の誘導体は、固有の化合物と考えら れていなく、その代謝経路は現在知られていないからである。式ＩＩの天然にあ るモジュレイターは、動物、植物、昆虫、蜘蛛形動物及び微生物細胞を含め細胞 の広いスペクトルに対して固有とあると思われ、従って、全部でないが多くの細 胞は、これらの生物から誘導され、酵素活性化、利用性及びこれらの化合物の代 謝性のために良く確立された機構を有すると期待される。従って、効率を最大に し、潜在的に毒性或いは望ましくない副反応を最小にするために、式■の天然に あるモジニレイター或いは本発明の実施で天然のモジュレイターに活性され得る ビタレテインモジュレイターを使用することが、推奨される。また、特に、イタ レチン、ビタレテイン或いは式ＩＴｄ、　Ｉｒｅ及びｒｘのビタレテインｖ４に ついて推薦される。

本発明に従って、新形成の処理のために、生体内或いは試験管内でモジニレイタ −を使用すると、細胞の広い範囲に対して適用でき、それは、少なくとも成熟核 生物、特にヒトの代謝的な経路中の式ＩＩの化合物の先駆物質がほとんど全適用 を意図するためであり、式ＩＩ＋からＶｌｌ＋の非天然の同類及び同形の生物学 的に等価の物を広く適用することができる。

新形成に対する本発明のモジュレイターの効果は、典型的には濃度依存のもので ある。効率の最適化は、新形成が悪影響或いは除去を受け得る、この範囲以外で 、モジュレイターの比較的狭い濃度範囲内で生じる。また、本発明の方法は、少 なくとも、ある場合、逆転でき、即ち、新形成は処理が停止された後、不処理成 長に逆転できる。

モジュレイターは、直接、本発明の方法により、器官に投与でき、例えば、哺乳 動物に、通常のルートで所望の生物学的反応を促進するに十分な量投与される。

それは、逆に不活性しなし）もの、モジニレイタ−の疾患を与えないものである 限り、そこに注入する。これは、ｉ、ｖ、ｉ、Ｉ）、Ｓ、Ｃ０及びｉ、ｄ、の方 法も含む、モジュレイターは、また、逆に不活性の結果にならなり１或いは疾患 にならない方法で投与でき、経口的に、また、更に、エンテロ−コートで、肛門 投与、昇口投与で、スプレィ形及び粘剤での皮膚投与でもできる。

モジュレイターが間接的に本発明に従って投与され、それは、感染身体から免疫 細胞を除去し、ここで説明する培養物中で処理し、標準的方法、例えば、Ｉｍｍ ｕｎｅ　Ｒｅｓ　ｏｎｓｅｓ　ｔｏ　Ｍｅｔａｓｔａｓｅｓ、ｖ。

ｌｕｍｅ　Ｉｆ、１１章、１９８７、ＣＲＣプレス、Ｉｎｃ、　Ｂｏｃａ、フａ Ｉｌダ、米国（ここで述べた引用）に説明される方法に従って、導入することに より、成される。好適には、腫瘍細胞に対する免疫細胞の細胞毒素は、更に、細 胞を試験管内で腫瘍細胞に接触させることにより、特に、感染哺乳動物から誘導 されるもの、モジニレイタ−の代謝機構の抑制剤に、或いはそれらの組合せで再 投与の前に高められる。免疫細胞の細胞毒素が腫瘍細胞に対して高められること は、この文献に説明されている。

本発明の新形成を処置するためのモジュレイターの効果的濃度のガイドラインと しては、約０．０Ｉｆｇ〜１１００ｎビタレテインモジュレイター／ミリリット ル培養物、好適には、約０．１〜１０゜０００　ｆ　ｇビタレテイン　モジュレ イター／　ｍ　１培養物が、持にモジュレイターの能力と細胞密度に依存して、 勧められる。或いは生体内適用には、約０．Ｉｆｇ〜１．０ＯＯｎ　ｇビタレテ インモジニレイター／ｋｇ体重、好適には、約１ｆｇ〜Ｌｏｎｇビタレテインモ ジュレイター／ｋｇ体重が、モジュレイターの効力及び細胞密度に依存して、推 奨される。モジュレイターの組合せを用いる場合、モジュレイターの全量は、通 常、これらの範囲にする。ビタレテイン　モジュレイターの低い濃度での効果的 な量は、細胞当りモジニレイタ−１分子に近いので、培養物中或いは生体内に存 在する細胞の数、即ち、白血病細胞密度のような、目的細胞の密度に従って、こ れらの範囲の低い限度でのモジニレイター濃度を調整することが特に重要である 。用いる基底培養媒体は、十分なモジュレイターで補給され、モジュレイター全 濃度が約１〜２ｆｇモジュレイター／　ｍ　＋媒体であることが最も好適であり 、これは、また、モジュレイターの能力、細胞のタイプ、細胞密度に依存してい る。生体内適用のモジュレイターの全濃度は、１０ｆｇ〜ｔｏｏｐｇ／ｋｇが、 モジュレイターの効力及び細胞のタイプ及び細胞濃度に依存して、最も好適であ る。モジュレイターの上記の濃度範囲は、細胞密度に無関係の培養物に対してモ ジュレイターの効果的量であるが、栄養及びモジニレイター供給と廃棄物の除去 の特別の問題が、交合培養物に存在する。従って、交会培養物は、特別な条件が それらの環境的必要性のためになされない限り、避けるできである。１０百万／ ｍ＋培養物までは、細胞サイズに依存して、高い細胞密度での交会性増大のため に、細胞濃度の有用な範囲である。典型的な細胞密度は、約１０万から１０百万 の細胞／　ｍ　＋培養物であり、上記の投与量は、そのような密度の基づいたも のである。モジュレイターの効果的な濃度が１分子／１細飽に近付くので、モジ ニレイタ−濃度は、細胞濃度が増大成いは減少するにつれて、変化する。

所望により生物学的な活性を調整するためにビタレテイン　モジュレイターを補 給することは望ましい。酵素活性での日毎の変化は、名目上のもので、日毎或い は４８時間で置換することは、一般的に推奨され、典型的には、特定の環境で、 目標の細胞の特定のタイプにおいて、特定のビタレテイン　モジュレイターの安 定性に依存している。

本発明の方法は、特に、哺乳動物の生体内で硬性（非ヘマトリンボイド；血液リ ンパ性）及び軟性（ヘマトリンボイド）腫瘍を低減させるに有用である。これは 、腫瘍の脈管内移植を抑制し、特に、転移腫瘍の細胞を抑制する。化合物は、広 く、腫瘍低減に有用であり、腫瘍成長の抑制、腫瘍転移の抑制、或いはその両方 に有用である。特に、これらは、単独、或いはβ−アレチンと組合せて、或いは 他の代謝性の代謝剤或いは抑制剤と組合せてのいずれでも効果的であると考えら れる。これは、悪性腫の広い範囲特に、黒璽、骨髄腫、リンパ腫、白血病及び癌 腫のような腫瘍、また、卵巣腫瘍、頚部腫瘍、子宮腫瘍、胸部腫瘍（乳鳳瘍）、 肺腫瘍（小さい細胞及び非細胞の癌腫）、結腸及び胃腫瘍、肝＊ａ璽瘍；膵臓腫 瘍、中腸腫瘍、肝臓、骨、膵臓及び前立腺腫瘍；脳腫瘍（第１次及び第２次）、 喉頭及び口内腫瘍；皮膚腫瘍及びホドキンズ病に対して効果的である。モジュレ イターは、なかんづく、新形成の処置に有用であり、１）予防的に、２）腫瘍成 長を抑制するための第１次治療としえ、特に、遅い成長の腫瘍に対して；３）腫 瘍を除去或いは切除の外科的インターベンシコンの後の補助的治療法として、特 に、発病力或いは第１次腫瘍に対して有用である。モジュレイターによる処置は 、激しい腫瘍の展開を抑制し、腫瘍マスを消失させ、腫瘍の後退、腫瘍転移を抑 制すると分かった。抗−腫瘍治療法は、できるだけ早い段階の腫瘍で開始するこ と、特に、大きな腫瘍の出現或いは転移により生じる末端生理的複雑化を回避し 、効果的レジメ（処方箋）の用具についで腫瘍汚物のシステム出現を消失せしめ ることが推奨される。

例示され、また例示されない研究データに基づいて、本発明により処置された新 形成は、ビタレテインモジュレイターの試験管内及び生体内でのエックストラ生 物学的量での固有の抵抗性を示している。これは、濃度を投与量で増加するにつ れて、克服される。その反応は、先ず観察され、ここで、′閾値投与量”と称す る。反応は、投与につれ急速に増大するは、ここで、”最適投与量”と称する投 与量で最大の反応となる。この点を超えると、治療的反応は、典型的に、投与量 増加でも減っていく。基底生物学的活性が残る投与量とは、ここで、”最終点投 与量”と称される、約閾値投与量と最終投与量の間で反応を呈する投与量であり 。

これを、モジニレイブ−の”効果的濃度或いは投与量”と称する。例えば、生体 内及び試験管内でビタレテインの重合で、最適投与量以上の投与量で、ビタレテ インｖ４になると、所望の反応が減ることになり、そして、最終点投与量より大 きな濃度で、予防を行ない得ることとなる。

＾、試験管内でビタレテイン　モジニレイタ−を用いる本発明により目的細胞を 先ずモジュレイターなしのコントロール中で成長せしめ、標準的ブラクチスによ り基底培養媒体中で成長せしめ、腫瘍の毒素を測定する。同じ細胞タイプの試料 で、発展の同じ時間的な段階で、本発明により同じ媒体中で培養する。

即ち、培養は、モジュレイターを、例えば、約０．０１７エムトグラムビタレテ インモジユレイター／　ｍ　１培養物媒体を含有し、培養物中の細胞は、約１百 万細ａ／ｍｌ培養物の細胞密度であり好適には、化合物の投与量は、’　Ｏｇ　 ｎｌの増加で用い、特定のビタレテインモジュレイターの効果的濃度を局部にす るに使用される。培養物は、次に、１１ｏｇｔ＋ａ＋増加以下の効果的は投与量 の範囲にわたり再検査され、効果的濃度、閾値投与量及び特定の培養物の対する 最終点投与量が決められる。試験管内の処理を最適化すると、細胞に、再注入さ れ、腫瘍を抑制、後退させ、標準的方法により、即ち、パルバチオン、酵素、特 定プロティンアッセイ及び磁気共鳴或いは他のイメージ処理法により決める。

Ｂ、生体内適用でビタレテイン　モジュレイターを用いる好適には、用いるモジ ュレイターの生物学的活性は、コントロール群を用いる標準的方法で評価され、 モジニレイト活性の評価と同一の条件下で、基底活性を確立した。モジュレイタ ーは、前記の経路で投与した。一方、コントロール或いは基底群は、投与の担体 のみを受けるものである０例えば、Ｏ，Ｏｌｆｇ−１，０００ｎｇビタレテイン モジェレイター／ｋｇ体重（生理的食塩水で、好適には、モジニレイター代謝の 抑制剤を含有する）で、５匹以上の動物の群を処置した。研究のために、周期的 に、週３回のように行なった。腫瘍試料或いは測定が得られ、保存され、レジメ は少なくとも約２週間続け、約１５週間が好適である。データを編為した後、反 応性をグラフで、３次元表面で評価し、Ｘ、Ｙ、Ｚ軸は、各々、投与量、週間及 び反応性をとる。モジュレイターの最適濃度は、この方法では、容易に同定され 、２が腫瘍出現であるとき、表面が凹面となる０代謝の抑制剤は含有される場を 一定に保持し、抑制剤濃度を変えることにより、抑制剤濃度を最適にする。モジ ュレイターの非常に密接したスペース増大で分析を繰り返すことにより、例えば 、半分１Ｇｇｏ、）、一定の最適な抑制剤投与量で、次に、化合物の最適で効果 的な濃度範囲を決める。治療効果は、１１００ｎ抑制剤／ｋｇ体重の少ない量と 、１００９ｇビタレテインモジュレイター／ｋｇ体重以下の量で、期待される。

Ｃ，＊乳動物新形成でのビタレテイン及び関連化合物の治療学的適用 （ＣＸ　ＤＢＡ）Ｆｌｌママウスらのクロードマン５−９１ネズミ黒腫細胞（Ａ ＴＣＣ１１５２，１、りｏ−７ト３）を成長せしめ、Ｈａｍ’ｓ　ＦＩＺ媒体と １５Ｚ胎児牛血清、ペニシリン（１００Ｕ／ｍ＋）及びストレプトマイシン（１ ００μｇ／ｍ＋）（すべて、Ｓｉｇｍａ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏｍｐａｎｙ、 　Ｓｔ、Ｌｏｕｉｓ、　ＭＯ１米国から入手）を含有する７５ｍ１フラスコ中（ Ｃｏｒｎｉｎｇ　Ｇｌａｓｓ　Ｗｏｒｋｓ、　Ｃｏｒｎｉｎｇ、　＝ｓ−ｉ−り 州、米国）で成長せしめた。培養物を、３７℃で最初５．５％二酸化炭素で、６ Ｘ１０’の細胞／ｍｌで、２日間インキュベートした。培養物を次にトリプシン 処置し、２つの新鮮なフラスコに１／２に分け、１週間保持し、雌マウス（ＤＢ Ａ　Ｘ　ＢＡＬＳ　ｃ）（Ｈａｒｌａｎ　Ｓｐｒａｇｕｅ　Ｄａｖｌｅｙ、　Ｉ ｎｅ、Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ、ＩＮ、米国からのＣＤＦＩ／Ｈｓｄ）に注射 した。注射のため、細胞を先ずトリプシン処理し、３回燐酸緩衝生理的食塩水で 洗浄し、１×１０１細胞／１００μｌ燐酸緩衝生理的食塩水で希釈し、肋骨内で 皮下注射した。

化合物は水に溶解され、適当な滅菌濾過器でｆ過され、滅菌の生理的食塩水（０ ，１ｍ１）で所望の濃度に希釈され、週間当９３回、腹腔内に、２７ガウス、３ ／８インチアレルギシリンジ（Ｂｅｃｔｏｎ　Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ、　Ｒｕｔｈ ｅｒｆｏｒｄ、　ＮＪ、米国）により、注射された。

腹の上の皮膚をゆっくり待ち上げ、内部器官を傷つけることを避けながら、水平 に注射することにより、マウスへの損傷を最小にする。

これらのマウスでの腫瘍成長に悪影響を与えるいくつかのものの定義は、腫瘍モ デルの信頼性を確立し、結論に到達するのに必要であった。例えば、老い（１４ 週、下の曲線、第１図）と若いマウス（４週、上の曲線、第１図）での腫瘍発達 にｍ’ｓな差があった。例えば、老いの（１４週間、下の曲線、第１図）と若い マウス（４週間、上の曲線、第１図）に生理的食塩水を注射しても腫瘍発展に著 しい差があった。触診腫瘍出現は、老いのマウスでは、若いマウスよりも著しく ゆっくりであった。肺のグロス転移は、高められるが、老いマウスでは、若いマ ウスよりＩＩＩＩＦでない。これらの差は、成長因子及び免疫サーベイランスに おいて、年齢−関連の差によると見做される。特別のもの以外、マウスは、年齢 にマツチして、結果をじゃまする複雑性を消失するものであった。

投与された化合物は、微量汚染物からの複雑性を除くため、純粋なものであった 。これは、化合物の汚染が最も可能性のある場合、本当であった。即ち、ホスゲ ネイション工程での、β−アレチン、イタレチンの中間体先駆物質は、腫瘍出現 の相当な刺激を起こした（第２図）、明らかに、β−アレチンでイタレチンの汚 染は、前者の治療効果をなくするものであった。後者が腫瘍促進効果があるため である。ホスゲネイシゴンは、β−アレチン調製の特性を促進する黒厘をほとん ど完全に除去した。ｔｏｏｐｇビタレチン／ｋｇマウスの注射は、β−アレチン の同じ注射投与量で観察された腫瘍促進はなかった（第３図）。そして、腫瘍出 現で何ら顕著な低減はなかった（第４図）。β−アレチンを、イタレチンの１／ １０注射しても、顕著に大きな腫瘍刺激が、後者よりも、前者に観察された。（ １１５図）。イタレチンの注射は、β−アレチンで視察されるに比べ、反応を与 えたが、後者は、大体１００倍高い反応であった。これは、少なくとも、β−ア レチンのビタレチン入の９９％の変換が得られたホスゲネイシ１ンを示した。不 完全な変換からの、或いは理論的に不安定なカルボキシ−アミノ基の分解から、 少量のβ−アレチンが、イタレチンの調製に汚染となった。これは、β−アレチ ンの腫瘍促進効果が、１０ｐｇ／ｋｇマウスでほとんど飽和したので（第６．７ 図）、特別に興味がある。更に、この新形成反応は、再現性がある（第７図を第 ８図と比較する）と下記のように、解明できるものであった。

前記のように、化合物は、はとんどの製薬化合物に関して、低い濃度で効果的で ある。これは、興味ある理論的なジレンマが生じた。化合物は、低い効果的濃度 で投与量されると、代謝されないと仮定しなければならないが、化合物の劣化を 遅らせるようにすると、これらの濃度では、化金物の逆代謝は本質的にない。明 らかに、各目的細胞及び器官の代謝は、これらの考察の全体に影響を与える；例 えば化合物の合成も、劣化もしない細胞内では、化合物の投与のみが、所望の結 果を出すが、劣化及び合成の両方が望ましい細胞の中では、劣化の抑制剤のみの 投与は、望ましい結果を与える。化合物を合成できない、劣化ができる細胞内で は、その劣化抑制剤と化合物の両方の投与が最適の結果となる。同様に、合成が 望まれるが、劣化が望まれない細胞内では、処理なしが必要である。観念的に、 細胞の環境を低い安定状態の化合物濃度にするように調整しなけらばならない。

上記の考察は、化金物が、還元形成いはチオレート形の時、重合する可能性によ り、大きくされる必要がある。ビタレテインをそのサルフェニル　アイオデード の高い濃度に紫外線で照射することにより、合成しようとする場合、約１５％の 物質は、ダイマーの形（自己酸化とチオレートとサルフェニル　アイオデードの 反応から、ジサルフィドが形成されるとする）である。ビタレテインｖ４は、治 療能力がないわけでなかった。そのピタレテイン及びビタレチンの同形としであ るが、固有のエフェクターの劣化を抑制すべきである。この可能性は、ピタレテ インＶ、とβ−７レチンを組合せる治療により実現した。β−アレチンによる腫 瘍出現の刺激（第７図）は、ビタレテインｖ、（第８図）の調製により、開始さ れる点、また、これらの２つの表面（第９．１０．１１図）は、ビタレテインｖ ４の治療効果を規定しており、特に、１１００ｎβ−アレチン／ｋｇマウスにお いてである点に注目すべきである。ビタレテインＶ、は、ピタレテイン及びビタ レチンと同形であるな、固有のエフェクターの機能と干渉する（第１２図）。こ の干渉は、ビタレチン調製物を滅菌ＭＩｌ　１　ｅｘ−ＧＶ濾過器（Ｍｉｌｌｉ ｐｏｒｅ　Ｐｒｏｄｕｃｔｓ　Ｄｌｖｉｓｉｏｎ、　Ｂｅｄｆｏｒｄ、　Ｍ＾、 米国）により一過することにより除去される。そのように、干渉性の同形物の大 部分を除去する（第１３図）。これらの最後の２つ第１２図、第１３図の表面の 差は、ビタレテインＶ、調製物中で治療物質が、デ過器を通っていることを示す （第１４．１５．１６図）。第１５図は、これらの２つの実験においてマウス間 の老化の差により容易に説明される２つの表面の投与量−依存でない差を示し、 若いマウスは、老いマウスよりも、早く腫瘍の発展が見られた。これらの観察と 議論から、ビタレテインは、非常に希釈されたか、安定した形で、重合を避けて 、投与すべきであることが明らかである。物質を、非常に希釈した溶液で合成し 、特性をとることは、実際的でないために、細胞或いは生物には、安定した形の ビタレテインを与える方法が行なわれた。

ビタレテインの合成と投与での問題は、ジサルフイド、β−アレチンからビタレ チンを合成することにより、大部分解決した。

ビタレチンは、チオレート部分がなく、重合されなく、容易に希釈され、投与さ れるとき、固有のチオール及びチオールージサルフィド交換機構により、ビタレ テインに還元されると仮定された。更に、ビタレチンは、β−アレチン及びピタ レテインｖ４とことなり、生体内で非常に効能があり、ピタレチンは、希釈され 、コントロール値よりも低い腫瘍出現レベルになり、従って、抗新形成活性の効 果的な範囲は、示された（第１７図）、ビタレチンの油！ＩＦ窓は、表面及び曲 線で示された場合、より強力であった（第１８及び１９図）。生体内還元は、腫 瘍の新形成反応により、１１００ｐ／ｋｇマウス（１１７図）以上の注射濃度で 示され、これは、ビタレテインＶ、に対する反応と非常に似ていた。ではあるが 、ビタレチンに対する新形成の反応は、ビタレテインＶ、よりもはるかに高い注 射濃度で生じていた。次のいくつかの説明が、この観察に対して仮定された。

１）ビタレチン１１００ｐ／ｋｇ以下マ？Ｘ以下に対する治療反応は、全研究を 分析するＫｒｉｇｉｎｇの領域変化理論アルゴリズム（第１７．１８図）と研究 の遅い点の多項式後退分析（第１９図）とを用いて、近似すると、強く呈示され ていた。ビタレテインｖ４への新形成の反応は、１００ｍ）ｇビタレチン／ｋｇ マウス以下の注射濃度でのピタレテインから形成され、これらの濃度での残りの ビタレテインに対する治療反応により開始された。

２）ビタレチン自体は、ジサルフィドが目的のサブ細胞の部分で、還元能力を超 えた濃度の場合、ビタレテイン効果と干渉した。

３）ビタレテインが腹腔内に形成され、従って、マウスの細胞及びサブ細胞内区 切られ、従って、高い濃度が重合なしで達成され、遊離溶液中で還元化合物内で 達成される。

４）ビタレチンは、成長で蓄積され、先駆物質及び代謝物質を促進する。

新形成度応性の説明にかかわらず、新形成の出現は、１ｏｏｐｇ／ｋｇマウス以 下の濃度の注射で処置されたマウスで著しく少なかった（第１９図参Ｒ）、特に 、ビタレテインｖ４により腫瘍出現を刺激すた理論的飽和プロフィル（上の曲線 ）と比較すると、ビタレテインｖ４の生体内での理論的出現は、ビタレチンから 、ビタレテイン（中間の曲線）から分かる。ビタレテインと他の薬剤と組合せも 、そして、ビタレチン及びビタレテイン劣化の抑制剤と組合せは、特に、ビタレ テインＶ、及び／或いはβ−アレチンも意図されるものである。

Ｄ、ヒトＮＫ（天然キラー）細胞の調整を用いたヒト白血病細胞（Ｋ５６２）の 溶菌の試験管内でのビタレテイン刺激ガラス非接合細胞（ＧＮＡＣ’　ｓ　）を 、Ｌ囚いり」堕；９９−１１３．１９８９に説明されるように、５ｃａｎｄ、　 Ｊ、　ＣＩ　ｉｎ、　Ｌａｂ、　Ｉｎｖｅｓｔ、　２１．　（上記、９７）ニア ７−７９に説明されるＦｉｃｏｌｌ−Ｈｙｐａｑｕｅ；フィコール−ハイプラク 成分を用いて、ガラス上のメッキ、１．　Ｉｍｍｕｎｏｌ、、１１２ｉ４２０− ４２３に説明されたナイロンウールカラムを通しての経路で、作成した。目的に ５６２ヒト白血病細胞（１０，０００）は、１１（ｒでレベルされ、（Ｎｅｗ　 Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｎｕｃｌｅａｒ　Ｒｅ＠ｒｃｈ　Ｐｒｏｄｕｃｔｓ、　Ｄｕｐ ｏｎｔ　Ｃｏｍｐａｎｙ、Ｂ。

５ｔｏｎ、　Ｍ＾、米国）を、＾ｒｔｈｒｉｓｔｉｓ　Ｒｈｅｕｍ、、２７；１ ０９５−１１００に説明されるように、トリプレット中で各エフェクター／目的 の割合で（２５，１２，５或いは６．２５回、多くのエフェクター細胞として） 、或いは２０％トリトン（Ｔｒｉ　ｔｏｎ）Ｔ−１００で、４時間のインキエベ イションの間、エフェクター細胞（ＧＮＡＣ’ｓ）の細胞毒素を測定し、或いは 目的細胞の最大崩壊を、各々測定した。ＧＮＡＣ’　ｓの細胞毒素は、最初及び 、ビタレチン／　ｍ　Ｉ培養物で１．１０．１０８．１０１．１０’、１０″、 １０″濃度で接触の後６日目に測定した。（第２１図の１〜７）。

第１図 第２図 第３図 第４図 第５図 １０ｐｇ／Ｋｇ　βゴレチン　ｏｒ　Ｖ２研究日数 第６図 第７図 腫瘍直径　（ｍｍ） 第８図 Ｍ９図 第１１図 腫瘍直径　（ｍｍ） Ｈ（）　ｎ　Ｏｎ　Ｏ へ　へ　−−■ 腫瘍直径　（ｍｍ） 腫瘍差　（ｍｍ） 第１６図 第１７＠ 一一 第２０図 第２１図 国際調査報告 一一〇−−哨−＾−−−−−哨−９Ｃ〒ハ１彎０１／Ｉ’ｌムフフ＾ＰＣＴ／Ｕ Ｓ９Ｌ１０４フ２６ ［ｗＭｒ＠　ｎ　ｉｎ　１　ｏｒ　２］。

フロントページの続き （３１）優先権主張番号　５４９，４４０（３２）優先臼　１９９０年７月６日 （３３）優先権主張国　米国（Ｕ　Ｓ　）（８１）指定図　ＥＰ（ＡＴ、ＢＥ、 ＣＨ，ＤＥ。

ＤＫ、ＥＳ、ＦＲ，ＧＢ、ＧＲ，ＩＴ、ＬＵ、ＮＬ、ＳＥ）、０Ａ（ＢＦ、ＢＪ 、ＣＦ、ＣＧ、ＣＩ、ＣＭ、ＧＡ、ＧＮ、ＭＬ、ＭＲ，ＳＮ、ＴＤ、ＴＧ）、Ａ Ｕ、ＢＢ、ＢＧ、ＢＲ，ＤＫ、ＦＩ、ＨＵ、ＪＰ、ＫＰ、ＫＲ。

ＬＫ、ＭＣ，ＭＧ、ＭＷ、Ｎｏ、ＰＬ、ＲＯ，ＳＤ、Ｓ

Claims (19)

【特許請求の範囲】
1. １．式 ▲数式、化学式、表等があります▼ の化合物。 但し、式中、二重括弧の組は、ｚが１のとき、電荷ｐを含有する分子の部分を示 し、 Ｍ１−（Ｃ＝Ｍ）−Ｍ−（Ｃは、＃２炭素原子であるとき）は、Ｍ１−（Ｃ＝Ｍ ）−Ｍ−、Ｍ１＝（Ｃ−ＭＡ）−Ｍ−、或いはＭ１−（Ｃ−Ｍ）＝Ｎ−である。 Ｃが＃５炭素原子のときに、−（Ｃ＝Ｍ）−Ｍ−或いは−（Ｃ−ＭＡ）＝Ｎ−で あり、ＡがＸ、−１、直接結合或いはＲであり、Ｍ及びＭ１は、以下の定義であ る、各Ｒが独立にＨ或いは炭化水素ラジカルであり、Ｘは、生物的に交換できる カチオン或いはカチオン性錯体であり、Ｘ′は、生物的に交換できるイオン或い はイオン性錯体であり、Ｍは、Ｓ、Ｏ、Ｎ或いはＮＨであり、Ｍ１は、化合物が 内部環状或いはスピロ環状であるときに、Ｍ１が適当にＮ或いはＮＨであるとの 条件で、Ｓ或いはＯである。 Ｑは、ＣＲ２或いは直接結合であり、Ｑ１は、ＣＲ２、ＣＲ２ＣＲ３或いは直接 結合であり、Ｙは、Ｏ、−（Ｃ−Ｏ）−Ｒ−或いは直接結合であり、ａは、（ｒ ′＋ｐ＋Σｓ）が≧０であり、少なくとも、ｑ或いはｑ′の１つが、零であり、 錯体の残りの上の電荷の合計が、イオン上の電荷とバランスしており、Ｘ或いは Ｘ′或いはイオンＸ及びＸ′である条件下で、１ｒ／（ｒ′＋ｐ＋ΣＳ）１の絶 対値であり、ｍは０或いは＋１から＋５の全整数であり、ｎは、ｚが１のとき、 １或いは２であり、ｚが２のとき、ｎは、１或いは１．５であり、ｐは＋１、０ 或いは−１であり、ｑ及びｑ′は各々独立に＋１或いは零であり、 ｒ及びｒ′は、各々独立に、＋１から＋４の全整数であり、ｒ′は、−１から− ４の全整数であり、ｓは−１或いは０であり、ｙは１〜４０であり、ｚは＋１或 いは＋２であり、化合物は、約１０、０００ダルトン以下の分子量を有する。
2. ２． ▲数式、化学式、表等があります▼ 式の請求項１に記載の化合物。 但し、ｚｗ（０）は、請求項１に記載の化合物に伴う中和部分であり、ｗは、＋ １から＋５の全整数である。
3. ３． ビタレチン或いはビタレテイン或いはその生理学的に交換できる塩。
4. ４． 次の式の請求項２に記載の化合物の内部環状或いはスピロ環状形或いはその互変 異性体で、少なくとも潜在的求核置換基Ｍ１或いはＭ原子（１、３、６）の１つ の求核攻撃により、少なくとも、１つの求核原子Ｓ或いはＹで、各少なくとも１ つが、請求項２に記載のモノマー中で少なくとも１つの二重結合炭素原子（２、 ５）或いはＳ或いはその両方により生産されるもの。 ▲数式、化学式、表等があります▼
5. ５．ｙは、１以上であり、重合化は、請求項２に記載の化合物の第１のモノマー の少なくとも原子Ｍ、Ｍ（３、６）、Ｓ、或いはＹの１つが、少なくとも１つの 他のモノマーの二重結合炭素原子（２、５）の少なくとも１つを攻撃することに より開始される請求項２のビクレテインＶ４を含むポリマー或いはその互変異性 体。
6. ６．以下の式で、請求項２に記載のモノマーの少なくとも求核原子（１、３、６ ）或いは求核原子Ｓ或いはＹの１つがその二重結合炭素原子（２、５）或いはＳ 或いはその両方を求核的に攻撃することにより製造される請求項２に記載の化合 物の内部環状或いはスピロ環状形或いはその互変異性体。 ▲数式、化学式、表等があります▼
7. ７．請求項１に記載のビタレテインモジュレイターの少なくとも１つを、細胞の 機能或いはバイオ生産性を正常化するに十分な量、接触せしめることを特徴とす る細胞機能或いはバイオ生産性を正常化する方法。
8. ８．該細胞は、ヒト細胞を含む哺乳動物である請求項７に記載の方法。
9. ９．該細胞は、免疫細胞或いはバラサイト（寄生虫）或いはビールスを含むバソ ゲンで感染された細胞であり、それが、ビタレテインモジュレイターに、その感 染細胞の免疫サーベイランス或いは抑制性を改良するに十分な量接触せしめるこ とを特徴とする請求項８に記載の方法。
10. １０．該細胞が、試験管内で、少なくとも約１０ａｇのビタレテインモジュレイ ター／ｍｌ細胞培養物に接触せしめ、或いは、生体内で、少なくとも、約１００ ａｇビタレテインモジュレイター／ｋｇ生物重量に接触せしめられることを特徴 とする請求項７に記載の方法。
11. １１．哺乳動物に、請求項１、２、３、４、５或いは６に記載のビタレテインモ ジュレイターの少なくとも１つを、免疫学的サーベウランスを改良し、腫瘍成長 を抑制し、腫瘍を低減し、腫瘍後退を誘導するに十分な量、或いは、適当に、腫 瘍切除と一緒に、投与することを特徴とするヒトを含む哺乳動物の新形成を処置 する方法。
12. １２．哺乳動物に、請求項１、２、３、４、５或いは６に記載のビタレテインモ ジュレイターの少なくとも１つを、哺乳動物の免疫学的機能或いはバイオ生産性 を改良し、正常化するに十分な量、投与することを特徴とするヒトを含む哺乳動 物の自己免疫及び免疫不足の病気或いは異常を含む免疫病気或いは異常を処置す る方法。
13. １３．免疫細胞を哺乳動物から抽出し、試験管内で免疫細胞に、ビタレテインモ ジュレイターと、感染した哺乳動物の免疫機能或いはそのバイオ生産性を刺激す るに十分な量、接触せしめ、その後、刺激された免疫細胞を感染哺乳動物に再導 入し、新形成或いはパラサイト或いはパソゲン誘導の病気或いは異常を含む病気 或いは異常を処置することを特徴とするヒトを含む哺乳動物の免疫細胞機能或い はバイオ生産性を改良する請求項７に記載の方法。
14. １４．請求項１、２、３、４、５或いは６に記載のビタレテインモジュレイター の少なくとも１つを、適用量、細胞に接触せしめることを特徴とする耐性細胞を 培養物に順化する方法。
15. １５．細胞に、請求項１、２、３、４、５或いは６に記載の化合物の少なくとも １つを、細胞の機能或いはバイオ生産性を改良するに十分な量、細胞に接触せし めることを特徴とする正常或いは異常細胞を評価する方法。
16. １６．請求項１、２、３、４、５或いは６に記載のビタレテインモジュレイター の少なくとも１つを、老化遅延化の量、細胞に接触せしめることを特徴とする細 胞の老化を遅らせる方法。
17. １７．ａ）ブロックされたβ−アレチンを、Ｎ−ヒドロキシサクシンイミドとカ ップリングし、活性で溶解性のＮ−ヒドロキシサクシンイミドのβ−アレチンエ ステルを作り、ｂ）その活性エステルにシスタミンの遊離アミンをカップリング し、 ｃ）ブロックされたβ−アレチンを回収し、ｄ）ブロックされたβ−アレチンを 沃素と反応せしめ、生成物をＵＶ光を照射し、選択的に、アルキル及びアリル基 を除去し、カルボキシ部分を除去しないで、所望のモジュレイターを生成し、ｅ ）そのモジュレイターを安定化することを特徴とするビタレテインモジュレイタ ーの合成方法。
18. １８．ａ）ブロックされたβ−アレチンを、Ｎ−ヒドロキシサクシンイミドとカ ップリングし、活性で溶解性のＮ−ヒドロキシサクシンイミドのβ−アレチンエ ステルを作り、ｂ）その活性エステルにシスタミンの遊離アミンをカップリング し、 ｃ）ブロックされたβ−アレチンを回収し、ｄ）ブロックされたβ−アレチンを 酸と反応せしめ、ブロッキング基を除去し、β−アレチンを生成し、ｅ）β−ア レチンをカルボキシ化し、所望のモジュレイターを生成し、 ｆ）該モジュレイターを安定化することを特徴とするビタレテインモジュレイタ ーの合成方法。
19. １９．生物の細胞を、更に、β−アレチンを含むビタレテインモジュレイターの 代謝を抑制する因子の少なくとも１つに接触せしめ、或いは細胞の維持或いは成 長或いはその両方を促進し、ビタレテインモジュレイターの代謝を抑制し、そし て、細胞の維持と成長或いはその両方を促進することを特徴とする請求項７に記 載の方法。