JPH06500230A - レトロウイルスＳＩＶｃｐｚ―ａｎｔ及びその用途 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 レトロウィルスＳ　Ｉ　ＶＣ，！−，，，及びその用途後天性免疫不全症候群ま たはＡＩＤＳに対する理解は実質的に進歩してきた。

主要な原因物質は、Ｔ４ヘルパー／インデューサーリンパ球に対する親和性を有 する非形質転換レトロウィルスであることが証明されており（１，２）、全世界 で数百万人が既に感染していると予想されている。このウィルスによる感染は、 少なくとも症例のかなりの割合は、この疾患の特徴である日和見感染の罹病性の 増大を伴うＴ４リンパ球数の進行性欠乏につながる。

疫学的研究は、ＡＩＤＳ症例の大多数に対する病因物質であるヒト免疫不全ウィ ルス１型（ＨＩＶ−１）が、現在量も広範に広まっているＨＩＶであり、中央ア フリカ、ヨーロッパ及び米国において優勢であることを指摘している。

ヒト免疫不全関連レトロウィルスの第二の群であるヒト免疫不全ウィルス２型（ ＨＩＶ−２）は西アフリカで同定された（３．４）。ＨＩＶ−２ウイルスはＥＰ ○−０２３９４２５号に開示されている。ＨＩＶ−１ウイルスはＷＯ３６１０２ ３８３号に開示されている。

ヒト免疫不全ウィルスの比較を複雑にしている一つの特徴はその遺伝的変化性で ある。遺伝的変異体が自然に且つ高頻度で出現するのである。種々のＨＩＶ−１ 分離物の比較により、ゲノムの成る領域は極めて可変性があり、−万能の領域は 適度に良く保存されることが明らかとなった（５−１０）。類似の多形性はＨＩ Ｖ−２についても観察された（１１）。最大の遺伝的安定性を有する領域は、お そらく構造的にまたは酵素的に必須のウィルス蛋白領域をコードしている領域で あろう。最大の総合的遺伝的安定性を有するウィルス遺伝子はｇａｇ及びｐ。

ｌ遺伝子である。一方ｅｎｖ遺伝子の幾らかの領域、並びにｒｅｖ、ｔａｔ、ｓ ｏｒ及びｎｅｆのような調節蛋白をコードしている遺伝子は、高度の変化性を示 す。ｇａｇ及びｐｏｌ遺伝子産物の主要な構造上の特徴の幾つかは、特定のＨＩ Ｖ型の全変異体に共通するだけでな（、少な（とも成る程度まではウィルス型間 で保存されているようである。

ＨｒＶ−１に対して産生された抗血清は、対応するＨＩＶ−１遺伝子産物に対す る親和性より低い親和性ながら、ＨＩＶ−２のｇａｇ及びｐｏｉ遺伝子産物と交 叉反応するが、エンベロープ蛋白に対する血清学的交叉反応性は観察されない。

しかしながら、免疫学的交叉反応性が立証できるにも拘らず、核酸レベルの配列 相同性は僅かであり、これはＨＩＶ−１及びＨＩＶ−２が遺伝学的に別個である ことを示すものである。そして非常に緊縮性の低い条件における場合を除き、こ れら二つのウィルス間の有意なハイブリダイゼーションを検出することはできな い（１１）。

サルの免疫不全ウィルス、またはＳＩＶは、ＨＩＶの最も近い既知の類縁体であ る非ヒト霊長顕しンティウイルスである。ＳＩＶはかつてマカーク（ＳＩＶ、。

、）（１２，１３）、スーティ・マンガベイ（ＳＩＶ、、）（１４，１５）、ア フリカミドリザル（ＳＩＶＡ、１１）（１６）及びマンドリル（ＳＩＶＭＮｏ） （１７）から分離されている。

マンガベイ、ミドリザル及びマンドリルはアフリカの旧世界の霊長類であり、こ れに対してマカークはアジアの旧世界の霊長類である。これら四つのＳＩＶは、 遺伝子配列分析に基づき、ＳＩＶ、、、ｃ及びＳＩＶ、、を一つの遺伝学的群と する三つの別個の群に分類される（１８）。マカークはその自生生息地ではＳＩ Ｖに感染しないように見受けられる（１９）。故に幾らかのマカーク個体が米国 の地域霊長類センター（リージョナル・ブライメイト・センターズ）でスーテイ ー・マンガベイからＳＩＶ、ゆに感染したと考えられる（２０）。

ＨＩＶ−２はその配列レベルにおいて、個々のＳＩＶ、、単離物が互いに異なっ ているのと同程度にＳＩＶ、。と異なっているに過ぎない（１８，２１）。

ＳＩＶＡｏＭ及びＳ　Ｉ　Ｖ、、ＤはＨＩＶ−１及びＨＩＶ−２とは別個のもの であり、Ｓ　Ｉ　ＶＭ、ＤはＨＩＶ−１及びＨＩＶ−２とほぼ等距離にあるよう に思われ（２２）、一方ＳＩＶＡＧＭはＨＩＶ−１よりＨＩＶ−２により近い（ ２３）。血清学的交叉反応性が、異なったＨ　Ｉ　Ｖ／Ｓ　Ｉ　Ｖの構造蛋白間 に観察された。エンベロープ蛋白のレベルにおいては、交叉反応性がＳ　Ｉ　Ｖ 、、ｃ、　Ｓ　Ｉ　Ｖ、、、、５ＩｖＡＧ１１及びＨＩＶ−２のエンベロープ蛋 白間に存在するが、これらのウィルスに感染した非ヒト霊長類由来の血清は、Ｈ ＩＶ−１エンベロープ蛋白と反応しない。５ＩＶ−０陽性マンドリル由来の血清 はＨＩＶ−１またはＨＩＶ−２エンベロープ蛋白と反応しない。

１９８８年にＨＩＶ−１抗体陽性の野生チンパンジー２例がガボン国の熱帯雨林 で観察された。これらのチンパンジーの１頭からレトロウィルスが分離され、Ｓ ＩＶ、、、−６，、−１と命名された。このウィルスはフランス国特許出願第８ ９−０２９６４号（１９８９年３月７日）に開示された。このウィルスは、その 増殖特性、異なる蛋白の分子量を決定するための放射免疫沈降法及びウェスタン プロット並びに血清学的交叉反応性によって特性決定された（２４）。このウィ ルスの配列決定を行なったところ、ＨＩＶ−１と８４％の相同性があった（２５ ）。これが、ＨＩＶ−１群のレトロウィルスに属する非ヒト霊長類由来の最初の レトロウィルスである。

この感染の蔓延及び重要性を決定するために、より多くのチンパンジーをＨＩＶ ／ＳＩＶ抗体について試験した。ＨＩＶ−１抗体陽性の野生チンパンジーの新た な症例が観察された。ザイール国起源のチンパンジー由来の新規な免疫不全ウィ ルスの分離及び特性決定を記載する。

地理的にはこのウィルスは、ＨＩＶが風土病的であるアフリカの一地域に由来し ている。この単離物は、免疫学的に、ＨＩＶ−２よりＨＩＶ−１に対して抗原性 の上でより密接に関連していることが示されている。

したがって本発明は、チンパンジーから分離されＳ　Ｉ　Ｖ、、、、、、と命名 されたレトロウィルス、並びにヨーロピアン・コレクション・オブ・アニマル・ セル・カルチャーズ（ＥＣＡＣＣ）に受理番号Ｖ９００　６１　３２２の下で寄 託された該レトロウィルスの本質的な形態学的及び免疫学的性質を有するこのウ ィルスの変異体に関するものである。

ウィルスの分離は、感染物質の注射を受けたことのない４歳の若い無症候性の雄 のチンパンジー由来の血液から行なった。

このチンパンジーからの血清は、酵素結合免疫吸着検定（ＨＩＶ１＋２ＥＬＩＳ Ａ、ベージング）において陽性（０，Ｄ、　／カットオフの比が６）であった。

市販のＨＩＶ−１ウエスタンプロツト（デュポン・ドウ・ネムーア）において、 明瞭なバンドがｐ２４、ｐ３４、ｇｐ４１、ｇｐ１２０及びｇｐ１６０に、そし て弱いバンドがｐ５５及びｐ６８に観察された。市販のウェスタンプロット（デ ュポン・ドウ・ネムーア）における異なったＨＩＶ−１抗原に対するこのチンバ ンノーの血清の力価は以下の通りである ｐ２４　：　１／１．０００ ｐ３４　：　１／１０００ １００Ｏ・１１５０．０００ ｇｐ１２０：１／１０．０００ ｇｐ１６０：１／１００．０００ このウィルスを、１０％牛脂児血清、２μｇ／ｍｌポリブレン、抗生物質（１０ ０μｇ／ｍｌゲンタマイシン）及び１５０Ｕ／ｍｌインターロイキンー２を添加 した、２ＱｍＭ　Ｈｅｐｅｓを含有する１６４０ＲＰＭＩからなる培地中で、チ ンパンジーのリンパ球と健康なＨＩＶ陰性ヒトドナーからのＰＨＡ刺激リンパ球 との同時培養によって分離した。１３日間培養した後、陽性ＨＩＶ−１抗原捕捉 試験（インノジェネティクス）に基づいて該ウィルスを培養中に検出した。逆転 写酵素（ＲＴ）の存在もまた培養上清中に検出された（５０．ＯＯＯｃｐｍ）。

細胞不含ＲＴ上清及び抗原陽性上清を用いて新たなリンパ球上でこのウィルスを 継代し、再度陽性抗原捕捉試験を実施し、上清中に逆転写酵素活性を検出した。

巨細胞の形成に伴う細胞傷害効果はリンパ球において観察されなかった。このウ ィルスを、健康なヒト血液ドナー由来のＰＨＡ刺激刺激９璋８次いで白血病起源 の連続的セルラインに移した。ウィルス含有上清を、ＨＩＶ−１の含有がわかっ ている培養上清と平行して、下記に詳説する分化抗原捕捉試験で試験した。この 比較結果は、新しい分離物はＨＩＶ−１と同一ではないが近似していることを示 した。次いでこの新しいウィルスを、その蛋白抗原について特性決定した。ウィ ルスの増殖に使用されるセルラインはＣＥＭまたはＭＯＬＴ−４型、または細胞 表面にＴ４レセプターを有する他の不死化セルラインとすることができる。Ｓ　 Ｉ　Ｖｅ．、、ｎ．の連続的増殖に好ましいセルラインはＭＯＬＴ−４及びＣＥ Ｍ−８Ｓ細胞である。Ｓ　Ｉ　Ｖ．、、、、、に感染させたＭＯＬＴ−４細胞は 、１９９０年６月１３日に受理番号Ｖ９００　６１　３２２の下でＥＣＡＣＣに 寄託された。

慢性感染させたセルラインの確立は、例えば以下のように実施した。ＭＯＬＴ＝ ４細胞（１０６細胞／ｍｌ）、好ましくはＭＯＬＴ−４クローン８細胞（Ｎヤマ モト、イエマグチ、日本、から取得）またはＣＥＭ−８Ｓ細胞（ビータ−・ナラ 、フレデリクスバーグ、メリーランド、米国、から取得）を、２０ｍＭ　Ｈｅｐ ｅｓで緩衝化し１０％牛脂児血清を含有するＲＰＭ１１６４０培養基中で、Ｓ　 Ｉ　Ｖ．、、、、、感染ヒトリンパ球（１０６細胞／ｍりと同時培養する。ウィ ルスの産生を抗原捕捉試験（インノンエネティクス、オーガノン）を用いて追跡 した。

ＣＥＭ−８Ｓセルラインについては抗原捕捉試験は直ちに陽性となり、これが持 続した。ＭＯＬＴ−４クローン８細胞については、抗原捕捉試験は同時培養後５ ０日日月陽性となった。細胞傷害効果はどちらのセルラインにも観察されなかっ た。これらの細胞からの上清はウィルスの供給源として使用することができる。

さらに本発明は、下に述べる本質的な形態学的及び免疫学的特性を有する精製さ れたレトロウィルスに関するものである。多くの場合、Ｓ　ＩＶｃ．、、、、の 特異な性質は、他のヒト免疫不全ウィルスＨＩＶ−１及びＨＩＶ−２、並びに他 のサル免疫不全ウィルス、特にガボン由来のＳ　Ｉ　Ｖｃ．、Ｇ．、分離物につ いての同じ型の性質と比較することによって最も良く理解できる。

図面の簡単な説明 １、市販のＨＩＶ−１ウ工スタンプロツト片における抗５ＩＶｃ，．血清の反応 性を示す。ＨＩＶ−１ウ工スタンプロツト片における三つの異なるＳ　Ｉ　Ｖｃ ，、陽性血清の反応性及び力価を示す・ 血清Ｉ　５ＩＶｃ，、、、、が分離された動物からの血清。

血清２　ＳＩＶ．、、、、、が分離された動物からの血清。

血清３　ウィルスが分離できなかったガボン由来の第二のチンパンジーからの血 清。

２、ウェスタンプロットにおけるＨＩｖ−１（ＨＴＬｖ−ＩＩＩＢ）、ＳＩｖｃ ｇｒ−Ｇａｂ及びＳ　Ｉ　Ｖ．、、−、、、のｇａｇ，ｐｏｌ及びｅｎｖ蛋白の 比較に関する。

３、放射免疫沈降法ニ．Ｊ．　ル、ＨＩＶ−１　（ＨＴＬＶ−１　１　ＩＢ）　 、５ＩＶｅ，、−Ｃａｂ及びＳ　Ｉ　Ｖｅ．、−、、、の蛋白の比較に関する。

４、ＨＩＶ−１　（ＨＴＬＶ−Ｉ　Ｉ　ＩＢ）　、５ＩＶｅ．、、、、、Ｓ　Ｉ 　Ｖｅ，、−、、、、　ＨＩＶ−２、５ＩｖＡ６１．１１Ｓ■■工０、及びＳ　 Ｉ　ＶｙＡｃｆ）蛋白の比較に関スル。

５　ヒトポリクローナル及びマウス抗ＨＩＶ−１モノクローナル抗体を用いたウ ィルス分離物の抗原捕捉を示す。

６　異なったＨＩＶ／ＳＩＶ型に対するＳ　Ｉ　Ｖ，ｐ，抗血清の反応性の比較 。

７、電子顕微鏡写真。

形態学 Ｓ　Ｉ　Ｖ．、、、、、感染ＣＥＭ−５Ｓ及びＭＯＬＴ−４細胞の電子顕微鏡写 真は、発芽及びおよそ１３０ｎｍの直径を有する細胞外ウィルス粒子の存在を示 した。

Ｓ　Ｉ　Ｖ．、、、、、は形態学的に池の既知のＨ　Ｉ　Ｖ及びＳＩＶと非常に 似かよっていルカ、ＨＴＬＶ−１、ＨＴＬＶ−１　１及ＵＳＴＬＶ−１０）よう す他（１）Ｉニド及ヒサルのレトロウィルスとは容易に識別される。

蛋白及び糖蛋白抗原 Ｓ　Ｉ　Ｖ．、、、。、感染ＭＯＬＴ−４細胞の培養上清中に存在するウィルス を、ベックマン１９Ｔｉ型ローター中１９．０００ｒｐｍで一夜遠心することに より濃縮した。得られたベレットを電気泳動試料緩衝液（６２．５ｍＭトリス、 ｐＨ６７、２％２−メルカプトエタノール、１％ドデシル硫酸ナトリウム及び１ ０％グリセロールを含有）中に再懸濁し、王たるウィルス抗原を、変性条件の下 でポリアクリルアミドゲル（１２．５％または１０％）上の電気泳動によって分 離した。

分子量を評価する基準を提供するため同ゲルには分子量マーカーを含ませた。分 離後、この蛋白を電気泳動的にニトロセルロース紙に移しくウェスタンプロット ）、次いでこれをホモローガスな抗血清と共にインキュベートした。この手法に おいてＳ　Ｉ　Ｖ．ｏ．−ｍ　ｇ　ａ　ｇ及びｐｏｌ及びｅｎｖ遺伝子産物の分 子量が、ＨＩＶ−１及びＳ　Ｉ　Ｖ．、、、、、についてのそれと比較できる。

ＳＩＶ．、□−ｈｎｌ蛋白について観察された見かけの分子量はＨＩＶ−１及び ｓ　ｒ　ｖｅ，、−６．ｂの両者について観察されたものに近い。にも拘らず、 小さいが再現性のある分子量の差異もまた５ＩＶｒ．ｒ−１ｍｌ並びにＨＩＶ− １及びｓ　ｉ　ｖｅ，、−ｃ．、蛋白間に認められる。蛋白のプロットは、主要 コア蛋白Ｓ　Ｉ　Ｖ．、、、、、が分子量２７．０００を有することを示した。

慣例により、蛋白類はしばしば蛋白に対しては「ｐ」、または糖蛋白に対しては ｒｇｐＪで表わし、この後に、１．０００倍するとそのポリペプチドのおよその 分子量を与える数を続ける。ＳＩＶ．。、−、。１の主要コア蛋白は以後ｐ２７ と呼称する。

測定された分子量の値は真の値の１０％以内で正しいものと予想される。にも拘 らず、使用される電気泳動装置及び緩衝液構成成分の供給源が研究所毎に異なっ ているため、蛋白の分子量値に関して多くの混乱が存在する。故に、ＳＩＶ．い 、−１７，の蛋白抗原の見かけの分子量をＨＩＶ−１またはＳ　Ｉ　Ｖ．ｐ，− 、、、のそれについて比較する場合は、全ての試料を同一のゲル上で電気泳動に 付す必要がある。このようなゲルは、例えば図２に見ることができる。特に、主 要コア蛋白の場合、三つのウィルスのホモローガスな蛋白の分子量値は非常に近 接しているが、ＨＩＶ−１から誘導された蛋白が最も小さいことが明らかである 。ｓ　ｒ　ｖ．、、−ｃ．ｌ，の主要コア蛋白は、かつて報告されているように （２４）ＨＩＶ−１のそれより幾分大きい。Ｓ　Ｉ　Ｖ．、、、□からのホモロ ーガスな蛋白は、Ｓ　Ｉ　Ｖ．、、−ｃ−ｂの主要コア蛋白より大きい。これら の蛋白の算出された分子量を第１表に示す。

第１表 ｇａｇ及びｐｏｌ遺伝子産物の分子量の比較ｇａｇ　エンドヌクレアーゼ゛　膜 透過蛋白　外層膜ＨＩＶ−１　２５　３４　４１−４５　１２０ｓｔｖｃ，、− Ｇ，、　２５．５　３２　４２−４６　１３０ＳＩＶ．、、、、、　２７　３４ 　４４−５０　１４０ＳＩＶ。３．−、イ，は、見かけの分子量が３４．０００ のエンドヌクレアーゼであってＨＩＶ−１からのホモローガスな蛋白と分子量に おいて有意に異なっていないｐｏｌ遺伝子由来ポリペプチドを有する。

異なったウィルスの蛋白プロットを、このウィルスに感染した個体から得られた ホモローガスな血清と共にそれぞれインキュベートすると、エンベロープ蛋白が 見られる。これらの蛋白はｅｎｖ遺伝子から誘導されるものであって、ウィルス のエンベロープ糖蛋白である。膜透過蛋白である最小の糖蛋白は広幅のバンドト シテ移動シ、Ｈ　Ｉ　Ｖ−１　及Ｕ　Ｓ　Ｉ　Ｖ　−　ｐ８−ｃ−　ｌ：ライ’ Ｃは４０．０００及び４５。

０００の間の見かけ土間−の分子量、そしてｓ　ｒ　ｖ．、、、。１については ４４，０００及び５０．０００の間の見かけ上より高い分子量を有する。

外層膜蛋白である、より大きな蛋白は、ＨＩＶ−１については１２０．０００の 分子量を有し、Ｓ　Ｉ　Ｖｃ，、−６．ゎ分離物については幾分高い分子量を、 そして新規な分離物５ＩＶｃ、□１．１については最も高い分子量を有する。

糖蛋白は高度に解糖され、観察される見かけの分子量はこのウィルスの産生に使 用されるセルラインにより同程度まで影響を受ける。エンベロープ蛋白のレベル において異なったウィルス間の相違を決定するためには、ウィルスは同じセルラ インで増殖されねばならない。

ウェスタンプロットに加えてウィルス蛋白抗原は放射免疫沈降検定（ＲＩＰＡ） によって視覚化することもできる。この目的のために、ウィルス蛋白を、ウィル ス感染細胞のインビボで、メチオニンを除去し１０％牛脂児血清を添加したＲＰ Ｍｌ　１６４０中ＵＳ−メチオニン（２００μＣｉ／ｍｌまたは４．１０’細胞 ／ｍ＋）の存在下で代謝的に標識する。１６時間後、標識したウィルスを上清か ら収穫し、細胞を溶菌緩衝液（０，０２Ｍ１−リスｐＨ７，６＋０．１５Ｍ　Ｎ ａＣ１；０．０５Ｍ　ＫＣＩ　：０．００１ｍＭ　ＥＤＴＡ＋０．２ｍＭ　ＰＭ ＳＦ；００５％アプロチニン：１％β−メルカプトエタノール及び２％トリトン Ｘ−１００）中に収穫する。

免疫沈降のために、２．１０’細胞中で収穫したウィルスの当量を、緩衝液中で １０μｍの試験血清と４℃で１時間反応させる。次いで得られた免疫複合体を４ ℃で一夜蛋白Ａ−セファロースに結合させ、よく洗浄し、結合した蛋白を１％Ｓ ＤＳを含有する電気泳動試料緩衝液で溶出する。続いてこの抗原を電気泳動、引 続き蛍光写真法及びオートラジオグラフィーにより分析する。図３においてＨＩ Ｖ−１、Ｓ　Ｉ　Ｖ、、、−Ｇ、、及びＳ　Ｉ　Ｖｅ、、−、、、のＲＩＰＡを 示すが、ここでは各ウィルスをホモローガスな血清を用いて沈澱させ、１２．５ ％ポリアクリルアミドゲル上で分析した。ウェスタンプロットの場合と同様、三 つのウィルスについての主要コア蛋白の分子量の相違、即ちＳ　Ｉ　Ｖ、、、、 、、が最大の分子量を有するということ、並びに外部糖蛋白の相違を直ちに認め ることができる。Ｓ　Ｉ　Ｖ、、、、。

、の外部糖蛋白の分子量はＳ　Ｉ　Ｖｅ、、、、、またはＨＩＶ−１のそれより 高い。分子量の相違がセルラインに関係する因子に起因しないよう、三つのウィ ルスはＭＯＬＴ−４セルライン上で増殖させた。

図４において、各々ホモローガスな血清により沈澱させた異なるＨＩＶ及びＳＩ Ｖの１０％ゲル上のＲＩＰＡを示す。Ｓ　Ｉ　Ｖ、、、−、ｎ、分離物は、示さ れた他のＨＩＶ及びＳＩＶより高い分子量の主要コア蛋白を有する。

ＳＩＶ、い８−１、の蛋白抗原は、二つの異なってはいるが関連する試みによっ てＳ　Ｉ　Ｖｃ、、、、、、　ＨＩ　Ｖ−１及び他のＨＩＶ／ＳＩＶの蛋白抗原 を参考に性質決定することができる。一方では、抗原はＨＩＶ／ＳＩＶに感染し た個体由来の抗血清と交叉反応する能力を基準に特性決定することができる。他 方では、５ＩＶｅｐｒ−ａ□に感染したチンパンジー由来であってＳＩＶ、、□ １１抗原に応答して産生された抗体を含む抗血清を使用して、他のＨＩＶ及びＳ ＩＶ蛋白に対する交叉反応性を試験することができる。Ｓ　Ｉ　Ｖ、、、、、、 及び他のＨＩＶ／ＳＩＶの間の抗原の関係は、下記の実施例において実質的に説 明する。Ｓ　ＩＶ、、、、、、抗血清はＨＩＶ−１及びＳ　Ｉ　Ｖｅｐ、−、、 、ウィルスのｇａｇ、ｐｏｌ及びｅｎｖ産物と交叉反応することから、Ｓ　Ｉ　 Ｖｃ、、、、、はＨＩＶ−１及びｓ　Ｉ　Ｖｃ、、−０，、とより密接に関連し ている。Ｓ　Ｉ　Ｖ、、、、、、抗血清はＨＩＶ−２、Ｓ　Ｉ　ＶＬ、ｃ、　Ｓ 　Ｉ　ＶＡ、、、及び５ＩＶ１１Ｎｏのコア蛋白とのみ交叉反応し、エンベロー プ蛋白とは交叉反応しない。ＨＩＶ−２、Ｓ　Ｉ　Ｖ、、、、、、Ｓ　Ｉ　ＶＡ 、、、及びＳ　Ｉ　ＶＭＩＩＤＩ：対する抗体を有する血清はＳ　Ｉ　Ｖ、、、 、、、のコア蛋白とのみ交叉反応する。抗Ｓ　Ｉ　Ｖｅ、、血清（ＳＩＶｇｅｌ −４ｍｌ及びＳ　Ｉ　Ｖｅ、、−、、、）のみがＳ　Ｉ　Ｖｃ、、−、、、のｇ ａｇＳｐｏｌ及びｅｎｖ産物と反応する。

試験された２５のＨＩＶ−１陽性血清のうち、全ての血清がｓ　ｒ　ｖｃ、、− 、、、のｇａｇ及びｐｏｌ抗原と交叉反応し、５／２５がｇｐ４１と弱い反応を し、モして２５のうちただ一つの血清がＳ　Ｉ　Ｖ、、、、、、のｇｐ１４０と 反応する。この血清はカメルーンの女性からのものであって、ここから異型ＨＩ Ｖ−１ウィルスが分離された。

下記の実施例において、Ｓ　Ｉ　Ｖ、、、、、、は、１　供給源の蛋白の分子量 の違い、 ２、モノクローナル抗体との反応、 ３、ウェスタンプロット上での異なったＨＩＶ−１蛋白に対するＳ　Ｉ　Ｖ、、 、−、。

、抗血清の反応、 と言う基準において、ＨＩＶ−１及び別のチンパンノー分離物Ｓ　Ｉ　ｖｅｐ＋ −ｃａｂとは実質的に異なっていることが証明される。

さらに本発明は、少なくとも一つの抗原、特にＳ　Ｉ　Ｖ、、、、□ルートロウ ィルスの蛋白または糖蛋白を含む組成物に関するものである。このような組成物 は、抗体を検出するための方法及び係る方法を実施するためのキットに使用する ことができる。

Ｓ　Ｉ　Ｖ、、、、□ウィルスは、ＳＩＶ、いＩ−ＩＲ＋または異型ＨＩＶ−１ と接触するに至った霊長類において抗体を検出するための抗原の供給源として使 用できることが判明した。したがって、本ウィルスは既に述べた方法により増殖 させ濃縮することができ、適当な洗浄剤で本ウィルスを処理することにより溶ｌ ！ｉ液が調製できる。総ウィルス溶菌液の調製にとって好ましい洗浄剤は、０． ５％濃度で使用されるトリトンＸ−１００である。別の好ましい洗浄剤は、やは り０．　５％濃度で使用されるノニデノトＰ−４０（ＮＰ−４０）である。

別法として、ウィルス蛋白はそのウィルスの溶菌液から精製することができる。

これらの蛋白を精製する好ましい方法は親和クロマトグラフィーである。例えば ウィルス抗原を調製用ポリアクリルアミドゲル上で分離し、個々の抗原を精製さ れた形で溶出することができる。これらはさらに、個々のウィルス蛋白に特異的 な、例えばウサギにおいて抗血清を作製するために使用することができる。

免疫ウサギ血清から誘導したＩｇＧ分画をＣＮＢｒ−活性化セファロース４Ｂ（ ファルマンア）のような固相と結合させ、ウィルス溶菌液から個々のウィルス抗 原を選択的に除去するのに使用することができる。次いでこれらの蛋白を低ｐＨ 緩衝液を用いて親和支持体から溶離し、標準的クロマトグラフィー技術を用いて さらに精製することができるが、その例がモンテラーロ等、ジャーナル・オブ・ バイｏｏジー（Ｊ、ｏｆ　Ｖｉｒｏｌｏｇｙ）（１９８２）第４２巻１０２９− １０３０頁に掲げられている。

本発明は一般に、Ｓ　Ｉ　Ｖｃ、、、、、感染の診断または予知的価値を有する 試験のために使用できる任意の組成物に関するものである。これらの診断方法は 、ＳＩＶ’ｌｌ＋−１８＋の抗原の少なくとも一つを目的とする、血清または他 の体液中の抗体の検出を含むものである。

好ましい組成物は、ウィルスのコア蛋白またはエンベロープ蛋白またはｐｏｌ遺 伝子から誘導される蛋白のうち少なくとも一つを含む、ウィルス溶菌液または精 製された抗原である。特に好ましいのは、例として以下の蛋白を同時に含む組成 物である・ｐ２７及びｇｌ）１４０；ｐ２７及びｇｐ４４−５０　：　ｐ２７、 ｇｐ４４−５０及びｇｐ１４０；及びｐ２７；ｐ２７、ｐ３４及びｇｐ１４０゜ しかしながら、上記組成物は例としての役割を意味するに過ぎず、本発明は上記 の蛋白または糖蛋白の１またはそれ以上を含む全ての溶菌液または蛋白調製物に 関するということが理解されねばならない。

さらに本発明は、検出されるウィルスの絶対的同定に顧慮することな（、免疫不 全ウィルスによる感染または接触を一般的に診断するために、いずれかのＳｒＶ ｘＤＩ−ａｗｌウィルス溶菌液を、ＨＩＶ−１及び／またはＨＩＶ−２、及び／ またはＳ　Ｉ　Ｖｃ、、、、、から誘導され同様に調製された蛋白と組み合わせ て使用する、任意の組成物に関するものである。例えばこのような組成物はＨＩ Ｖ−１、ＨＩＶ−２、Ｓ　Ｉ　Ｖｅ−−−ｃ−１及びｓ　ｒ　ｖ、、、−、、、 の溶菌液の混合物からなることができ、または以下の物からなることができるニ ー　ＨＩＶ−１、ＨＩＶ−２、Ｓ　Ｉ　Ｖ−１−ｃ−及びＳ　Ｉ　Ｖ、、、−、 、、のコア蛋白、特にＳ　Ｉ　Ｖｅ、、、、、　ｐ２７蛋白に対しホモローガス な、各ウィルス型の主要コア蛋白、 −ＨＩＶ−１、ＨＩＶ−２、Ｓ　Ｉ　Ｖｃ−−−ｃ−及びＳ　Ｉ　Ｖ＋ａ＋−ａ ａｔ）工／ヘロープ糖蛋白、特に５ＩＶｅ、□−，，，ｇｐ１４０に対しホモロ ーガスな、各ウィルス型の外部エンベロープ糖蛋白、 −ＨＩＶ−１、ＨＩＶ−２、Ｓ　Ｉ　Ｖｍ−ａａｂ及ヒＳ　Ｉ　Ｖ＋＋ｅｉ−ａ ａｔノ：’７ｆｆｌ白並びｌ：ＨＩＶ−１、ＨＩＶ−２、及ヒＳ　Ｉ　Ｖ、、− ｓａｇノエンベローブ糖蛋白、特に、５ＩＶｃ、、、、、ｐ２７蛋白に対しホモ ローガスな、各ウィルス型の主要コア蛋白並びにＳ　Ｉ　Ｖ、、、、。、ｇｐ１ ４０に対しホモローガスな、各ウィルス型の主要外部エンベロープ蛋白、 −ＨＩＶ−１、ＨＩＶ−２、Ｓ　Ｉ　Ｖｍ−ｃａＪｃＦｓ　Ｉ　Ｖｃ、、−、ａ ＋ノコ７蛋白及びエンベロープ蛋白、特にＳ　Ｉ　Ｖｃ、、、、、の蛋白ｐ２７ 及びｇｐ１４０に対しそれぞれホモローガスであるもの、並びにＨＩＶ−１、Ｈ ＩＶ−２、Ｓ　Ｉ　Ｖｅ、、−、。

ｂ及びＳ　Ｉ　Ｖ、、、、、、のｐｏｌ遺伝子から誘導される蛋白、特にＳ　Ｉ 　Ｖ、、、−、、、のｐ３４エンドヌクレアーゼ蛋白に対しホモローガスな各ウ ィルス型の蛋白、の組合せ。

さらに本発明は、ポリアクリルアミドゲル電気泳動において単一のハンドを提供 する抗原であって、一般にＳＩＶ、、、〜１．．レトロウィルスの精製された抗 原の一つ、抗Ｓ　Ｉ　Ｖ、、、、、、抗体を有する個体の血清により認識される エピトープを含む抗原に関するものである。

これらのエピトープに対応するアミノ酸配列は、個々の蛋白を調製用電気泳動ま たは親和クロマトグラフィーのいずれかにより単離し、蛋白全体、またはトリプ シンもしくはキモトリプシン消化により酵素的にもしくは化学的手段により生成 させたフラグメントのいずれかのアミノ酸配列を決定することによって、容易に 決定することができる。得られたペプチドまたはポリペプチドは引続きエドマン 減成によって配列決定できる。故に本発明は、ウィルスから直接誘導された、ま たは、細菌性発現ベクターにおいて、もしくは挿入されたＤＮＡを哺乳動物もし くは昆虫の細胞中で発現させるためのウィルス性発現ベクターにおいて、ウィル スの任意のｃＤＮＡフラグメントをクローニングし、発現された蛋白を上記の方 法によって精製することにより産生された、任意の蛋白、糖蛋白もしくはペプチ ドに関するものである。さらに本発明は、メリフィールド合成またはＦｍｏ　ｃ 化学のいずれかにより産生される合成ペプチドに関するものでもあり、このペプ チドは引続きウェスタンブロッティングまたは放射免疫沈降のいずれかによって 等質的状態まで精製することができ、その配列中には天然ｓ　ｒ　ｖｃ、、、、 、に共有されるエピトープが含まれている。ニトロセルロースに結合することの できない小さなペプチドの場合は、これらのペプチドをナイロン膜（ポール・バ イオダインまたはアマ−ジャム）に結合させ、この膜を抗Ｓ　Ｉ　Ｖ、、、、、 、抗血清と反応させることにより検出することができる。特に本発明は、任意の Ｓ　Ｉ　Ｖｃ、、、、、コア蛋白に含まれる、またはそのポリペプチド鎖の一部 としてコア蛋白の組合せから誘導されるエピトープを含み得る蛋白に含まれる、 エピトープに関するものである。さらに本発明は、二つのＳ　Ｉ　Ｖ、、、、、 、エンベロープ糖蛋白のいずれかに含まれるエピトープ、並びに、Ｓ　Ｉ　Ｖｃ 、、、、、エンベロープ糖蛋白の組合せまたはｓ　ｉ　ｖ、、、、、、、、コア 蛋白の組合せから誘導されるエピトープを、そのポリペプチド鎖の一部として含 む任意の蛋白、に関するものである。

さらに本発明は、その合成が、Ｓ　Ｉ　Ｖ、、、、、、蛋白または糖蛋白由来の エピトープをＨＩＶ−１及び／またはＨＩＶ−２の蛋白または糖蛋白由来のエピ トープと共に一つのポリペプチド鎖に組み込む組み替えＤＮＡ法によって組み立 てられる発現ベクターにより支配されるポリペプチドに関するものである。係る 組み立ｒの調ａは、Ｓ　Ｉ　Ｖ、、、−、、、並ヒｌ：ＨＩ　Ｖ−１及びＨＩＶ −２のｃＤＮＡから適切なコード化領域を切り取り、同じ位相のＤＮＡを結合さ せて、必要な信号配列を有する発現ベクター中に挿入された時に、ＨＩＶ−１、 ＨＩＶ−２、ＳＩＶ、。

ｒ−Ｇａｂ及び５ＩＶｅ、ヮー１□のエピトープが含まれるハイブリッド蛋白の 合成を支配するコード化配列を形成させることを含む。

さらに本発明は、特にＳ　Ｉ　Ｖ、、、、、ルトロウイルスにより引き起こされ る潜在的または存在するＡＲＣまたはＡＩＤＳの診断のための、生物学的流体中 の５ＩＶｅ、、−ヮ、に対する抗体の検出方法であって、診断される人の体液を １またはそれ以上のＳ　Ｉ　Ｖｃ、、、、、の蛋白または糖蛋白を含有する組成 物と、または該ウィルスの溶菌液と、またはＳ　Ｉ　Ｖｃｐｍ−ｓａｔに共通す るエピトープを有する抗原と接触させ、Ｓ　Ｉ　Ｖｃ、、、、、抗体と使用され た抗原との間に形成された免疫学的複合体を検出することを特徴とする方法に関 するものである。

好ましい方法は例えば免疫蛍光検定または免疫酵素検定を包含する。免疫蛍光検 定は、典型的には例えば試験される人の血清をＳ　Ｉ　Ｖｃｐ、、、、に感染し た細胞と共にインキュベートし、これを固定し冷アセトンにより透過性を増すこ とを含む。形成された免疫複合体は直接的または間接的方法のいずれかを用いて 検出し、ヒト免疫グロブリンと特異的に反応する抗体の使用を含む。検出は、フ ルオレセインまたはローダミンのような蛍光標識と結合させた抗体を使用するこ とにより達成する。

免疫酵素検定は例えば以下のように実施するニー　ＳＩＶ、、、、、、ウィルス 抽出物または本発明に係る組成物の特異的量を微量定量プレートのウェルに入れ る。

−適当なインキュベーンタン時間の後、過剰の非結合物質を洗浄によって除去す る。

−１またはそれ以上のＳ　ＩＶ、、、、、、の蛋白または糖蛋白抗原に対する抗 体の存在を試験すべき他の体液の血清の適当な希釈物を、ウェルに導入する。

−二の微量定量プレートを、結合反応が起こるのに必要な時間インキュベートす る。

−プレートを完全に洗浄する。

−免疫複合体の存在を、ヒト免疫グロブリンと特異的に結合し、無色または殆ど 無色の物質を高度に着色した生成物に変換することのできる酵素（好ましくは西 洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、またはβ−ガラクトノダ ーセのいずれかであるがこれらに限定される訳ではない）で標識した抗体を用い て検出する。別法として、検出系は、適当な基質の存在下で光を放射する酵素を 使用することもできる。

−形成された生成物の量を視覚的、分光光度的、または発光光度的のいずれかに より検出し、同様に処理された対照と比較する。

やはり使用できる他の検出系は、スタフィロコッカス・アウレウス・コラアン菌 株Ｉから誘導される蛋白Ａ、Ｃ群ストレプトコンカス種（２６ＲＰ６６菌株）か らの蛋白Ｇの使用に基づ（系、またはビオチン−アビジン結合反応の使用を利用 する系を包含する。

１またはそれ以上のｓ　ｒ　ｖｅ、、、、、抗原に対する抗体の存在を免疫酵素 的に検出するもう一つの方法は、ウェスタンプロットである。ウィルス抗原を電 気泳動により分離し、ニトロセルロース膜または他の適当な支持体に移す。次に 、試験されるべき体液をこの膜に接触させ、形成された免疫複合体の存在を既に 述べた方法により検出する。この方法の変法においては、精製されたウィルス抗 原を線または点として適用し、次いで、試験されるべき体液と接触させ、形成さ れた免疫複合体を前記の技術を用いて検出する。

体液中の抗体の存在は凝集によって検出することもできる。Ｓ　Ｉ　Ｖｃ、、、 、、溶菌液群またはＳ　Ｉ　Ｖ、、、、、、溶菌液、抗原または本発明により言 及される抗原組成物を、例えば均一な懸濁液を形成するラテックス粒子の被覆に 使用する。存在する抗原に対する抗体を含む血清と混合すると、このラテックス 粒子は凝集を起こし、大きな凝集体の存在が視覚的に検出できる。

本発明はさらに、ＳＩＶ、。１−Ａｌ１１または前記組成物の標識された抽出物 に関するものである。標識は、例えば酵素的、化学的、蛍光または放射活性のよ うな任意の型とすることができる。

さらに本発明は、体液中のＳ　ＩＶ、、、、、、抗原の存在を検出する方法に関 するものである。これは例えば以下の手法で達成することができる・−ＳＩＶ、 、、−１Ｍこ感染した個体、またはＳ　Ｉ　Ｖ、、、−、、、溶菌液もしくは既 に述べた組成物を注射した動物のいずれかから誘導される抗血清のＩｇＧ画分を 、微量定量プレートのウェルに入れる。

−吸着させるための適当な時間の後、過剰の非結合物質を洗い流す。

−検出すべき抗原を含む体液をこのウェルに入れる。

−微量定量プレートを、結合を起こすのに適当な時間インキュベートさせる。

−次いでプレートを適当な緩衝液で完全に洗浄する。

−結合した抗原の存在を、例えば検出すべき抗原に対して同じく特異的であり、 且つ、標識された（好ましくは前述の酵素のうちの一つによって標識された）、 免疫グロブリンを使用することにより、直接または間接的に検出する。

−次いで適当な基質を加え、存在する抗原の量を測定するために、反応の程度を 対照と比較する。

さらに本発明は、５ＩｖｃＤ□−１６，溶菌液または上記組成物、及び形成され た免疫複合体を検出するための手段からなる、生物学的流体中の抗ＳＩＶ、、□ −ａｗｌ抗体を検出するためのキットに関するものである。

免疫酵素法により特異的抗体を検出するよう設計されたキットの場合、このよう なキットは以下のものを含むであろうニー　好ましくは精製された形の、そして 好ましくは微量定量プレートのような固体支持体に結合させた、Ｓ　Ｉ　Ｖ、、 、、、、溶菌液または既に述べた型のうち一つの組成物。

−検出すべき抗体と結合することのできる免疫グロブリン分画及び酵素の複合体 、または酵素と細菌性蛋白Ａもしくは蛋白Ｇとの間の複合体。

−　ヒト免疫不全ウィルスによって共有されるエピトープを持たない対照抗原。

−検定の実施にとって適当な緩衝液。

−酵素にとって適当な基質。

Ｓ識さｔｌ、ｆ−：妨４原を利用す−る特異的抗体の検出のだＹｌのナツトは以 下のものを含むであろう。

−既に述べた型の過当（：？１識された抗原または抗原の組合せ。

−好ましくは蛋白Ａ、　−・汁ファロース４Ｂ（フフルマンア）のような不溶性 支持体または同等の支持体と結合させた、蛋白Ａもしくは抗ヒト免疫グロブリン 。

−抗ｓ　ｉ　ｖ、、、、、、抗血清により認識されない対照抗原。

−検定の実施にとって適当な緩衝液。

−適当ならば、酵素的に標識された抗原の検出のための基質。

さらに本発明は、生物学的流体中のｓ　ｒ　ｖ、、、、、、抗原の検出のために 開発されたキットであって、 −好ましくは微量定量プレートのような固体支持体に結合させた抗Ｓ　Ｉ　Ｖｃ 。

＋−ｍｓ＋免疫グロブリン、 −酵素と結合させた抗ｓ　ｒ　ｖ、、、、、、免疫グロブリン、−抗Ｓ　Ｉ　Ｖ 、、、、、、免疫グロブリンにより認識されない負の対照抗原、−ＳＩＶ、、、 、、、抗原または既に述べた組成物のうちの一つからなる、正の対照抗原、 −試験の実施にとって適当な緩衝液、 −結合した酵素の検出にとって適当な基質、からなるキットに関するものである 。

さらに本発明は、Ｓ　Ｉ　Ｖｅｐ、、、、レトロウィルスのエンベロープ糖蛋白 または該糖蛋白の一部を、Ｓ　Ｉ　Ｖｃ、、−〇□に対して有効なワクチンの構 成にとって適当な薬学上許容し得る媒質と組み合わせて含有する、免疫原性組成 物に関するものである。さらに本発明は、その配列内にＳ　Ｉ　Ｖｃ、、−。レ トロウィルスの蛋白バックボーンの全てもしくは一部を含む任意のペプチドもし くはポリペプチド、並びに該ペプチドの一般的免疫特性に影響を及ぼさないアミ ノ酸の付加、置換もしくは除去によって得られるペプチドに関するものである。

さらに本発明は、Ｓ　Ｉ　Ｖ、、、、、、抗原または前記に定義される組成物に 含まれるエピトープを特異的に認識する能力により特徴付けられるモノクローナ ル抗体、特に、該抗原に対して特異的に作製され常套的技術により産生されるモ ノクローナル抗体に溪うするものである。本発明は、ｓ　ｉ　ｖ、ｐ、、、、に 感染した霊長類から誘みされるＢ細胞を不死化することにより産生されるモノク ローナル抗体、例えばＢｍ胞ベア、プスタイン〜バーウィルスにより形質転換し 、その形質転換体をサブクローニングすることにより産生されるモノクローナル 抗体にも関するものである。

本発明はまた、１またはそれ以上のＳ　Ｉ　Ｖ、、、、□抗原を認識し、動物を 精製Ｓ　Ｉ　Ｖｃ、、−、、、またはＳ　Ｉ　Ｖｃｐ＋−ａｍ＋抗原もしくは抗 原の組合せ、特にＳ　Ｉ　Ｖｅｐ、−１１，の蛋白もしくは糖蛋白に感染させる ことにより産生される、動物におけるポリクローナル抗血清の産生に関するもの である。

ポリクローナルまたはモノクローナルの抗体は、５ＩＶｃ、□−□、の感染性の 中和、生物学的流体または感染した細胞中での５ＩＶｃ、、−□、抗原の検出、 並びに５Ｉｖｃ、、−□蛋白及び糖蛋白抗原の精製を包含する極めて様々な目的 に使用することができる。

さらに本発明は、一部は少なくともｓ　ｒ　ｖ、、、−□、レトロウィルスまた はこのウィルスの変異体のＲＮＡから誘導される、所望により標識された核酸に 関するものである。

本発明はまた、ｓ　ｒ　ｖ、、、、、レトロウィルスの全ゲノムＲＮＡに対応す るＣＤＮＡの少なくとも一部を含むことを特徴とする、ｃＤＮＡもしくはｃＤＮ Ａの一部またはそれらを含む組み替え体の使用に関するものである。このような ｃＤＮＡは、生物学的流体、組織及び細胞におけるｓｒｖ、、、−□、配列の特 異的検出のためのプローブとして使用することができる。好ましくはこのプロー ブもまた、放射活性的にまたは化学的に、または別法としてプローブの検出を可 能にする酵素的、蛍光的もしくは化学ルミネセントの標識を用いて標識されてい る。５ＩＶｃｐ＋−ａ＊＋の特異的検出及びＳ　Ｉ　Ｖ、、、−、、、感染の診 断のための好ましいプローブは、ｓ　ｒ　ｖ、、、、、、ゲノムに対し相補的な ｃＤＮＡの全部または一部を含むプローブである。

にもかかわらず、Ｓ　Ｉ　Ｖｃ、、、、、感染の診断に使用できるプローブは、 ｓｒｖ。

。ｌ−１１１ゲノムを起源とする全配列またはその天然に存在する変異体を組み 込んでおり、ウィルスコア蛋白（ｇａｇ遺伝子）、二つの型の逆転写酵素、及び エンドヌクレアーゼ（ｐｏｌ遺伝子）、並びに二つのウィルスエンベロープ糖蛋 白（ｅ０ｖ遺伝子）をコードしている配列を含む事が理解される。

さらに本発明は、ベクターからの核酸を含み、該ｃＤＮＡまたは該ｃＤＮＡの一 部をそれに挿入させている、組み替え核酸中に組み込まれた、Ｓ　Ｉ　Ｖ、、、 、、、核酸配列に関するものである。このような組み立て物は、ウィルスｃＤＮ Ａまたはそのフラグメントを天然の宿主以外の生物または細胞中で複製するため に使用することができ、その結果、診断目的に使用される充分量のプローブを提 供することができる。

このような手法により生成されるプローブは、以下の本質的工程を組み入れてい るｓ　ｒ　ｖ、、、、、、の特異的検出のための診断試験に使用することができ るニー　上記のようにして生成したプローブを、前記の方法によって標識する。

−該プローブを、緊縮ハイブリダイゼーション条件の下で、感染した細胞からの ＤＮＡまたは感染した細胞もしくは生物学的流体からのウィルスＲＮＡと接触さ せる。但しそれ以前に該ＤＮＡまたはＲＮＡは好ましくは膜に適用しプローブに 接近し易くしである。

−緊縮条件が維持される状況の下でこの膜を緩衝液により洗浄する。

−好ましくは、プローブが放射活性標識されている場合はオートラジオグラフィ ーによって、またはプローブが化学的に標識されている場合は適当な免疫検出技 術によって、標識されたプローブを検出する。

さらに本発明は、ヒトＴ４リンパ球またはＴ４＋表現型を有する白血病起源のヒ トリンパ球セルラインを、前もってＳ　Ｉ　Ｖ、、３ＩＩＩレトロウイルスの分 離物に感染させたリンパ球またはセルラインと共に培養し、その培養基から該レ トロウィルスを回収し精製することを特徴とする、Ｓ　Ｉ　Ｖ、、、、、、レト ロウィルスの産生方法に関するものである。本発明はまた、該レトロウィルスを 、好ましくは洗浄剤で溶菌し、ＳＩＶレトロウィルスの抗原を含む溶菌液を回収 することを特徴とする、該抗原の産生方法に関するものである。

さらに本発明は、蛋白または糖蛋白をコードしている核酸を発現ベクターに挿入 し、該ベクターによって宿主を形質転換し、形質転換された宿主を培養し、そし て発現された蛋白を回収及び精製することを特徴とする、任意のＳ　Ｉ　Ｖｅｐ 、−、。

１蛋白もしくは糖蛋白または前記定義による逆転写酵素の産生方法に関するもの である。

この方法は、融合蛋白の合成を目的とするまたはしないベクターを含み、また、 細菌性発現ベクター、ワクシニアウィルスのような哺乳動物の発現ベクター、及 び昆虫細胞におけるクローニングされた遺伝子の発現のためのバキュロウィルス に基づくベクターを含むがこれらに限定される訳ではない。

さらに本発明は、非ヒト霊長類モデルの開発のためのＳ　Ｉ　Ｖｃ、、、、、の 使用に関するものである。

このようなモデルの開発は、例えば以下の手法によって達成することができるー 　異なった非ヒト霊長類種を該ウィルスに感染させる。

−二の動物に、Ｓ　Ｉ　Ｖｅ、、、。、感染チンパンジーからのリンパ球を静脈 内注射する、またはＳ　Ｉ　Ｖｃ、、、、、ウィルスの高力価を示す感染したヒ トの細胞を静脈内注射する。

−持続性の感染及びその結果を、異なった時間間隔における感染動物の臨床的お よび生物学的追跡によって調べる。評価すべき種々のパラメータは以下のものを 含むニ ー　臨床的調査ニ ー　−膜状態 −リンパ腺症 −ＣＤ４”リンパ球数の減少 −肝臓または膵臓のメパシー 一　発熱、体重減少 −ＡＩＤＳまたはＡＩＤＳ様疾患の症状の発現−特異的Ｓ　Ｉ　Ｖ、、、、、、 試験を用いるウェスタンプロット及びＲＩＰＡによるＳ　Ｉ　Ｖｅ、、−、、、 に特異的な抗体の検出。

−リンパ球または血漿からのウィルスの分離及び特異的Ｓ　Ｉ　Ｖ、、、、、、 試験による抗原血症の測定。

−中和抗体の存在の決定。

ＡＩＤＳの発症を伴うまたは伴わない持続的な感染が起こると、感染した霊長類 はＨＩＶ−１のための可能性ある動物モデルとして使用することができ、これは ワクチン及び抗ウイルス化学療法物質の試験に利用することができる。

ワクチンの評価は数多くの良く知られた技術により達成することができ、その全 ては、引き続いて行なう感染性ウィルスのチャレンジに対する防御を付与するこ とのできる細胞毒性リンパ球または抗体の産生を誘導するための１またはそれ以 上のウィルス蛋白を含有する免疫原性調製物の投与に依存している。ワクチン接 種の好ましい方法は、経口または注射による免疫原性組成物の投与、殺したまた は弱毒化したウィルスの投与、Ｓ　Ｉ　Ｖ、、、、、、蛋白を発現するワクンニ アのようなウィルス発現ベクターの使用、及びＳ　Ｉ　Ｖ、、、、、、蛋白を発 現または分泌する弱毒化した細菌菌株の経口投与を含む。

抗ウイルス化学療法物質は、Ｓ　Ｉ　Ｖ、ｏ、、、、に霊長類を感染させる前ま たは後にこの物質を実験プロトコルに従って投与することによって評価できる。

感染の予防またはウィルスの複製の阻害という点における該物質の有効性は、上 に概説したように評価することができる。

さらに本発明は、ＨＩＶに対する新規なワクチン及び抗ウイルス産物を評価する ための、ＳＩＶ、、、−７，に持続的に感染した非ヒト霊長類の使用に関するも のである。特に、抗ウイルス化学療法物質を、この系において該物質の投与前及 び後の臨床症状を比較することによって評価することができる。臨床症状に加え て、循環しているウィルス抗原のレベルの測定、ウィルスの分離の容易さ、免疫 機能の測定、並びに適当なプライマー及びプローブをポリメラーゼ連鎖反応（Ｐ ＣＲ）に使用することによるウィルス荷重の定量的見積り、ちまた、この評価に 包含される。

実施例 材料及び方法 ウィルス及び細胞培養 Ａ、ウィルス株及びセルライン −ＨＩＶ−１（ＨＴＬＶ−１［ＩＢ）　、ＨＩＶ−２−ｒｏｄ　（３）　、ＳＩ 　Ｖ、、ｌ−６−−−＋　（２４）　、Ｓ　Ｉ　Ｖ−Ｄ−６１１−＋　（１７） 　、Ｓ　Ｉ　ＶＡｃ−−−ｖ。−、（１６）、Ｓ　ＩＶ、ＡＣ（１２）を比較の 目的に使用した。

−　セルラインＭＯＬＴ−４クローン８（Ｎ　ヤマモト、ヤマグチ、日本、によ り提供された）及びＣＥＭ−８Ｓ　（Ｐ、ナラ、フレデリクスバーグ、メリーラ ンド、米国、により提供された）を連続的ウィルス産生に使用した。

Ｂ、ウィルス分離 チノパンツー及び健康なドナーからのリンパ球を、リンホプレプにが一ド・アン ド・ＣＯｌ、オス口、ノルウェー）により、ヘパリン処理した全血から分離した 。健康なドナーからのリンパ球を、２０ｍＭ　Ｈｅｐｅｓを含みＬ−グルタミニ ／（０，０３％／ｍｌ）、１０％牛脂児血清、ゲンタマイシン（１００μｇ／ｍ ｌ）を添加した］、６４０ＲＰＭＩ培地（ＧＩＢＣＯ）中で０．．５μｇ／ｍｌ のフィトヘマグルチニン（ＰＨＡ、ウェルカム）により刺激した。５　１０’（ ７）ｆンパンジー由来リンパ球を、２０ｍＭ　Ｈｅｐｅｓを含みＬ−グルタミン （０゜０３％／ｍ１Ｌ１０％牛脂児血清（ＧＩＢＣＯ）、ゲンタマイシン（１（ Ｈ’ｌμｇ／ｍｌ）　、２μｇ／ｍｌポリブレン（アルドリソヒ）及び１５０　 Ｕ　／　ｍ　！インターロイキンー２を添加した１６４０ＲＰＭＩ培地（ＧＩＢ ＣＯ）中で、５．１０６のＰＭＡ刺激されｔ：ドナーのリンパ球と、最終濃度１ ．１０’細胞／ｍｌで同時培養した。

培地は３ないし４日毎に新鮮な培地と交換し、その際細胞を計数し、細胞濃度を １．１０’細胞／ｍ　ｌ　ｌ：：ｇ節した。細胞濃度が低下した場合には新たな ＰＨＡ刺激リンパ球を分離物の培養に加えた。さらに培養は、３ないし４日毎に 細胞傷害効果、並びに培養上清中の抗原の存在を、抗原捕捉試験（インノジエネ テイクス、またはオーガノン）によって、及び逆転写酵素活性によって監視した 。

慢性的に感染した永久セルラインを確立するために、ウィルスに感染したリンパ 球の一次培養を、ＭＯＬＴ−４クローン８及びＣＥＭ−５Ｓ細胞と同時培養した 。逆転写酵素活性及び抗原捕捉によってウィルスの産生を監視した。

分化抗原の捕捉 ＨｉＶ−１及び他の関連するヒト免疫不全ウィルスの間の識別を行ない得る試験 系を開発した。二の系は二つの異なったポリクローナルＩｇＧＪ製物の能力の比 較に基づいており、一つは、特に主要コア蛋白に対する非常に高い力価に起因す る広範な抗ＨＩＶ特異性を有し、一つは培養上溝中で洗浄剤処理したウィルスを 捕捉する、専らＨＩＶ−１と反応する低い力価を有する。捕捉された抗原の検出 は、広特異性のＩｇＧ／西洋ワザビベルオキシダーゼ複合体を用いて達成する。

この試験は王としてｐ２４コア蛋白を検出するが、これのみを検出する訳ではな い。

ＨＩＶ−１に対するモノクローナル抗体使用された１５のうち８つのモノクロー ナル抗体は記載されており（２６）、残りのモノクローナル抗体はインノノエネ ティクスにより製造されている。この抗体は、トリトンＸ−１００で破断したＨ ＩＶ−１調製物中で、天然のウィルス蛋白に対して調製した。

蛋白の分析 Ａ、電気泳動 本質的にはマイセルによる記載（２７）に従って、ウィルス蛋白のポリアクリル アミドゲル電気泳動を行なった。

Ｂ、蛋白のプロッティング プロッティングは、ダンにより記載された（２８）バイオラドのトランスプロッ トセル中で４００ｍＡで４時間、炭酸塩緩衝液を用いて実施した。

電子顕微鏡写真 Ｓ　Ｉ　Ｖｃ、、、、、に感染したＭＯＬＴ−４及びＣＥＭ−８Ｓ細胞をカコジ ル酸塩緩衝液中のグルタルアルデヒドで固定し、四酸化オスミウムで染色し、エ ポンに包埋した。薄い切片をアナンシルアセタート及びクエン酸鉛で染色し、透 過型電子顕微鏡で調べた。

放射免疫沈降検定 感染細胞を５ｓＳ−メチオニンにより３７℃で一夜代謝的に標識した（４．）、 ０６細胞／ｍｌにおいて２００μＣｉ／ｍｌ）。上清および細胞を集めた後、ウ ィルスをペレット化し、次いで溶菌緩衝ｉ！（０，０２ＭトリスｐＨ７，６：０ １５ＭＮａＣ１，０，０５Ｍ　ＫＣＩ　：Ｏ，００１ｍＭ　ＥＤＴＡ、Ｑ　２ｍ ＭＰＭＳＦ、０．０５％アプロチニン：１％β−メルカプトエタノール及び２％ トリトンＸ−１００）中で溶菌した。次いで希釈し、たウィルス（２，１０６細 胞から収穫したウィルスに相当）を血清１０μｍと共に４℃で１時間インキュベ ートした。免疫複合体を蛋白Ａセファロースに４℃で一夜吸着させた。洗浄後、 免疫複合体を１％ＳＤＳ　（ドデンル硫酸ナトリウム）及びβ−メルカプトエタ ノールを含有する試料緩衝液で溶出し、１００℃で３分間加熱した。次にこれを １２゜５％または１０％ＳＤＳポリアクリルアミドスラブゲル（ＳＤＳ−ＰＡＧ Ｅ）上で電気泳動に付した。３ｓＳ−メチオニン標識した蛋白を蛍光光度法及び オートラジオグラフィーにより検出した。

血清学 ＨＩＶ−１及びＨＩＶ−２に対する抗体を市販の酵素結合免疫吸着検定（ＨＩＶ −１＋２　ＥＬＩＳＡ、ベージング）によって検定した。使用した確認試験は市 販のＨＩＶ−１（デュポン・ドウ・ネムーア）及びＨＩＶ−２（ダイアグノステ ィクス・バストゥア）ウェスタンプロットであった。

結果 血清学 チンパンジーからの血清は酵素結合免疫吸着検定において陽性（光学密度／カッ トオフの比＝６）であった。市販のＨＩＶ−１ウエスタンプロツト（デュポン・ ドウ・ネムーア）においては、明瞭なバンドがｐ２４、ｐ３４、ｇｐ４１、ｇｐ １２０及びｇｐ１６０に観察され、ｐ５５及びｐ６８には弱いバンドが観察され るのみであった。市販のウェスタンプロット（デュポン・ドウ・ネムーア）にお ける異なったＨＩＶ−１抗原に対するチンパンジー血清の力価を図１に示す。

ｐ２４：１／１０００；ｐ３４：１／１０００；ｇｌ）４１：１１５０．０００ ；ｇｐ１２０　：　１／１０．０００　：ｇｐ１６０　：　１／１００．０００ ゜ウィルスの分離 チンパンジーのリンパ球を健康な非感染ヒトドナーからのＰＨＡ−刺激リンパ球 と同時培養することにより、ウィルスを分離した。１３日間培養した後に、陽性 抗原捕捉試験（インノジェネティクス、オーガノン）により判定してウィルスを 培養中に検出した。逆転写酵素の存在もまた培養上清中に検出された。巨細胞の 形成に伴う細胞傷害効果はリンパ球に観察されなかった。細胞を含まない培養上 清を使用して新たなリンパ球におけるウィルスの継代を行なった。７日後、陽性 抗原捕捉試験が観察され、逆転写酵素活性が上清中に検出された。Ｓ　Ｉ　Ｖ、 、。

、□感染−次リンパ球をＭＯＬＴ−４クローン８及びＣＥＭ−３Ｓ細胞と同時培 養することにより、このウィルスを永久セルラインに移す試みがなされた。

ＣＥＭ−５Ｓセルラインを用いた場合、逆転写酵素活性は７日後に検出され、培 養上清は抗原捕捉試験で陽性であった。ＭＯＬＴ−４クローン８細胞の場合、抗 原捕捉試験は同時培養の５０日後でやっと陽性となった。巨細胞の形成に伴う典 型的な細胞傷害効果はこれらのセルラインでは観察されなかった。

ウィルス蛋白の特性決定 １９Ｔｉベツクマンロ一ター中４℃、１９．０００ｔ／分で一夜遠心することに より、培養上清中のウィルスをペレット化した。ペレット化したウィルスを５Ｄ Ｓ−試料緩衝液中で分離して、ポリアクリルアミドゲル電気泳動、続いて蛋白プ ロッティングにより分析した。図２にＨＩ　Ｖ−Ｉ　Ｓ　Ｉ　Ｖ、、、Ｇ、、及 びＳ　Ｉ　Ｖｃ、。

−１□のウェスタンプロット片を示す。

各ウィルスの溶菌液をホモローガスな血清と反応させた。即ち、ＨＩＶ−１をＨ ｒＶ−１抗体陽性血清と、Ｓ　Ｉ　Ｖｃ、、−、、、ウィルスをこのウィルスが 分離された動物の血清と、モしてＳ　Ｉ　Ｖｃ、、、、、ウィルスをこのウィル スが分離されたチンパンジーの血清と反応させた。

図カラ、Ｓ　Ｉ　Ｖ、、、−、、、遺伝子産物の分子量はＨＩＶ−１及びＳ　Ｉ 　Ｖｃｌｌｌ−Ｇａｂのそれとは異なることが明らかである。蛋白の分子サイズ の比較を第１表に示す。

最も重要な相違は主要コア蛋白の分子量（ｐ２７に対して、ＨＩＶ−１について はｐ２５、そしてＳ　Ｉ　Ｖｃ、、−Ｃ，、についてはｐ２５．５）、及び外部 糖蛋白の分子量である。ウィルス（ＨＩＶ−１、Ｓ　Ｉ　Ｖ−−−−ａ−及びＳ 　ＩＶｃ、、−、、、）の増殖に使用されるセルラインはＭＯＬＴ−４クローン ８セルラインであり、これは三つのウィルス間に観察される相違が異なるセルラ インの影響を受けないようにするものである。

ウェスタンプロットに加えて、ウィルス蛋白抗原は放射免疫沈降（ＲＩ　ＰＡ） によって視覚化することもできる。この目的のためには、ＭＯＬＴ−４クローン ８細胞をウィルスに感染させ、ウィルス蛋白を３ｓＳ−メチオニンで代謝的に標 識した。標識されたウィルスを上清および細胞から収穫した。図３にＨＩＶ−１ 、Ｓ　Ｉ　Ｖｃ、、Ｇ、、及びＳ　Ｉ　Ｖｅ、、−、、、のＲＩＰＡを示す。標 識されたウィルスを培養上清から収穫し、各ウィルスをホモローガスな血清によ って沈澱させた。ウェスタンプロット上で観察されるように、ｓ　ｒ　ｖ、、、 、、、遺伝子産物の分子量はＨＩＶ−１及びＳ　Ｉ　Ｖｃ、、−ｃ、、のそれと 異なることがわかる。Ｓ　Ｉ　Ｖ、、、−、、、の主要コア蛋白及び外部糖蛋白 はＨＩＶ−１及びＳ　Ｉ　Ｖ、、、−６，５の対応蛋白より高い分子量を有する 。

図４において、ウィルス間の相違をより良好に決定するために各々ホモローガス な血清で沈澱させた異なるＨＩＶ及びＳＩｖのＲＩＰＡを示す。即ち、）ＩＩＶ −１ウィルス＋ＨＩＶ−１抗体陽性血清、Ｓ　Ｉ　Ｖ−−−−ａ−を該ウィルス の分離された動物の血清で、Ｓ　Ｉ　ｖｃＢ−ｍｓ＋ウィルスを該ウィルスの分 離された動物の血清で、ＨＩＶ−２をＨＩＶ−２に体陽性血清テ、Ｓ　Ｉ　ＶＡ 、、ｉ−、、、ヲＳ　Ｉ　Ｖ、、−抗体陽性血清で、Ｓ　Ｉ　ＶＭＮＤを５Ｉｖ ＩＩＮＯ抗体陽性血清で、ソＩ、テｓ　Ｉ　Ｖ、、、ヲｓ　Ｉ　Ｖ。

、６抗体陽性血清で沈澱させた。この図はさらに分子量の相違をも示す。

ＨＩＶ−１ｐ２４コア蛋白に対するマウスモノクローナル抗体の交叉反応性ＨＩ Ｖ−１ｐ２４コア蛋白に対して調製されたマウスモノクローナル抗体（ＭＡｂ） のパネルを、ＨＩＶ−１、ＨＩＶ−２、Ｓ　Ｉ　Ｖ、、４．５ＩｖＡＧＩｌ及び ＳＩｖｃｐｔ−ｍａＩの分離物と交叉反応する能力について試験した。原則とし て、その群がＨＩＶ−１ｐ２４分子上の異なるエピトープと反応するモノクロー ナル抗体を含む限り、いかなる抗ＨＩＶ−１ｐ２４モノクローナル抗体のパネル も使用できる。抗体を含む腹水を希釈してマイクロウェルプレートの被覆に使用 した。次に、洗浄剤処理したウィルス含宵上清を、被覆したプレートに加えた。

結合した抗原を、西洋ワサビペルオキシダーゼに結合させた広特異性の抗ＨＩＶ 　ＩｇＧを用いて検出した。得られた結果を図５に示す。

ポリクローナル広スペクトルＩｇＧで被覆した対照ウェルにおいては、全ての密 度を示した。しかしながら、種々のモノクローナル抗体で被覆したウェルにおい て試験した場合はかなり異なったパターンが出現した。前の研究は、試験された ＭＡｂはｐ２・４分子上の少なくとも７つのエピトープに対して反応することを 示した。

Ｓ　Ｉ　Ｖ、、、、□分離物は、同じように試験された異なるモノクローナル抗 体と最も弱い反応をする。この結果は、Ｓ　Ｉ　Ｖ、、、、、、は他の試験され たＨ　Ｉ　Ｖ／ＳＩｖとはｐ２４抗原のレベルで異なることを示している。

血清学的交叉反応 ＳＩＶ、、、−ヮ、と他のＨＩＶ／ＳＩＶとの間の抗原の関係は、実質的には下 記の実施例で説明する。Ｓ　Ｉ　ＶＣＤＩ−１１１１は、より緊密にＨＩＶ−１ 及びＳ　Ｉ　Ｖｃ９．−。

、ｂと関連する。何故ならＳＩＶ、□−，□抗血清はこれらのウィルスのｇａｇ Ｓｐｏｌ及びｅｎｖ産物と交叉反応し、他のウィルス（ＨＩＶ−２、Ｓ　Ｉ　Ｖ 、、、、、ＳＩ　ＶＡ、１１．及びＳ　Ｉ　Ｖ、、、ｄ）とはコア蛋白としか交 叉反応しないからである。Ｈｌｖ−２、Ｓ　Ｉ　Ｖ、−１Ｓ　Ｉ　ＶＡＯＭ、　 及ヒＳ　Ｉ　Ｖ、、、、ニ対スル抗体を含ム血ｆｉｌ；！、Ｓｒ　ｖ、、、、。

、のコア蛋白と交叉反応するのみである。

抗ｓｒｖ、、、血清（Ｓ　Ｉ　Ｖｅ、、、、、及びＳ　Ｉ　Ｖ、−８−ａ、−） のみがＳ　Ｉ　Ｖ、、、−，１のｇａｇＳｐｏｌ及びｅｎｖ産物と反応する。２ ５のＨＩＶ−１陽性血清のうち、全ての血清がＳ　Ｉ　Ｖｃ、、〜、。１のｇａ ｇ及びｐｏｌ抗原と交叉反応し、５つがｇｐ４１と弱く反応し、そしてただ一つ の血清がｇｐ１２０バンドと反応する。ｇｐ１２０バンドと反応する血清は、異 型ＨＩＶ−１ウィルスが分離されたカメルーンの女性からのものである。

論考 新規な免疫不全ウィルスが野生チンパンジーから分離された。この動物は実験的 に感染させられたことが無く、またヒトの血液産物を受け入れたことが無い。

この動物は健康であり、実際ＡＩＤＳまたはＡＩＤＳ様疾患の症候を示していな い。

このウィルスは、ウェスタンプロットにおけるｓ　ｒｖ、、、、、、陽性血清の Ｈｌｖ−１抗原との血清学的交叉反応を基礎とするとＨＩＶ−１に近いように思 われる。

しかしながら、該ウィルスがＨＩＶ−１とは異なることを示す幾つかの論拠があ る。

−ウィルス蛋白の分子量の相違。

−ＨＩＶ−１とは異なった抗ＨＩＶ−１抗血清との交叉反応性の１＜ターン。

−ｐ２４コア蛋白に対して作製されたマウスモノクローナル抗体によって認識さ れるきわめて低下した能力。

Ｓ　Ｉ　Ｖｃ、、−□ウィルスはさらに、ウィルス蛋白の分子量の相違を基礎と すると、他のガボンからのチンパンジー分離物（Ｓ　Ｉ　Ｖｃ、、−６ａｂ）と も異なっている。

図１ 市販のウェスタンプロット（デュポン・ドウ・ネムーア）上での異なるＨＩＶ− １抗原に対する３つの陽性チンパンジー血清の反応性。

血清１　：　Ｓ　Ｉ　Ｖ、、、、、、、、が分離された動物からの血清。

血清２　：　Ｓ　Ｉ　Ｖ、、、、−が分離された動物からの血清。

血清３：ウィルスが分離できなかったガボンの第二のチンノくンジーからの血清 。

図２ ウェスタンプロットによる、ＨＩＶ−１（ＨＴＬＶ−Ｉ　Ｉ　ＩＢ）　、ＳＩＶ 、、、−Ｃａｂ及びＳ　Ｉ　Ｖ、、、−、、、のｇａｇ、ｐｏｌ及びｅｎｖ蛋白 の比較。

ウィルス溶菌液は同じポリアクリルアミドゲル（１０％）上で分離した。各々の ウィルスをホモローガスな血清と反応させた。

第１列：ＨＩＶ−１（ＨＴＬＶ−Ｉ　Ｉ　ＩＢ）とＨＩＶ−１１１性血清。

箪２列：　Ｓ　Ｉ　Ｖ、、、、、、と該ウィルスが分離された動物の血清。

第３列：　Ｓ　Ｉ　Ｖｃ、、、、、と該ウィルスが分離された動物の血清。

図３ 放射免疫沈降（ＲＩ　ＰＡ）　１ｍヨるＨＩＶ−１（ＨＴＬＶ−１１ＩＢ）　、 ＳＩｖｃｐｔ−Ｇａｂ及びＳ　Ｉ　Ｖｅ、−、、のｇａｇ、ｐｏｌ及びｅｎｖ蛋 白の比較。

ウィルス蛋白は１２．５％ポリアクリルアミドゲル上で分離した。各々のウィル スをホモローガスな血清で沈澱させた。

第１列：ＨＩＶ−１（ＨＴＬＶ−Ｉ　Ｉ　ＩＢ）とＨＩＶ−１抗体陽性血清。

第２列：ＳＩＶ、。＋−＋ｓｌと該ウィルスが分離された動物の血清。

第３列：ＳＩＶ、、、−６゜と該ウィルスが分離された動物の血清。

図４ ＲＩＰＡによる異なるＨＩＶ及びＳＩＶの蛋白の比較。

ウィルス蛋白は１０％ポリアクリルアミドゲル上で分離した。各々のウィルスを ホモローガスな血清と反応させた。

第１列・ＨＴＶ−１（ＨＴＬＶ−１１１Ｂ）とＨＩＶ−１抗体陽性血清。

第２列・Ｓ　Ｉ　Ｖ、、、、□と該ウィルスが分離された動物の血清。

第３列　Ｓ　Ｉ　Ｖ、、、Ｇ、ｂと該ウィルスが分離された動物の血清。

第４列　ＨＩＶ−２−ｒｏｄとＨＩＶ−２抗体陽性血清。

第５列：　Ｓ　Ｉ　ＶＡｃｂ＋−ｔｖｏとＳＩＶＡｏＭ抗体陽性血清。

第６列：　ＳＩＶ、Ｎ、、、、とＳ　Ｉ　Ｖｌｌ、ｎ抗体陽性血清。

第７列：　Ｓ　Ｉ　Ｖ、Ａ、、と５ＩＶＩＩＡＣ抗体陽性血清。

図５ ヒトポリクローナル及びマウス抗ＨＩＶ−１ｐ２４モノクローナル抗体を用いた 異なるウィルス分離物の抗原捕捉。

ＨＩＶ−１（ＨＴＬＶ−Ｉ　Ｉ　ＩＢ）ＨＩＶ−２ｒｏｄ 図６ａ ３５８−メチオニンで標識されたＨＩＶ−２ＲＯＤを異なる血清で沈澱させた。

第１列：ＳＩＶ、、、〜１、抗体陽性血清。

第２列：　Ｓ　Ｉ　Ｖ、、、Ｇ、、抗体陽性血清。

第３列・ウィルス分離物が得られなかったガボンからの第二の陽性チンパンジー の血清。

第４列・ＨＩＶ−１抗体陽性血清。

第５列：ＨＩＶ−２抗体陽性血清。

図６ｂ ３ＡＳ−メチオニンで標識されたＳ　Ｉ　Ｖ、、、−Ｇ、、−、を異なる血清で 沈澱させた。

第１列・Ｓ　Ｉ　Ｖ、、、、、、抗体陽性血清。

第２列　Ｓ　Ｉ　Ｖ−、、−、ｃ、ｎ抗体陽性血清。

第３列：ウィルス分離物が得られなかったガボンからの第二の陽性チンパンジー の血清。

第４列・ＨＩＶ−１抗体陽性血清。

箪５列：ＨＩＶ−２抗体陽性血清。

第６列：　Ｓ　Ｉ　ＶＡｃｔ＋抗体陽性血清。

第７列：ＳＩＶ、。抗体陽性血清。

図６０ ｓｒｖ、、□−１１、抗原を有するウェスタンプロット片を異なる血清と共にイ ンキュベートした。

第１列＋　Ｓ　Ｉ　Ｖ、、、、、、抗体陽性血清。

第２列：　Ｓ　Ｉ　Ｖｅａｌ−ｓｃａｂ抗体陽性血清。

第３列・ウィルス分離物が得られなかったガボンからの第二の陽性チンパンジー の血清。

箪４列　異型ＨＩＶ−１（ＨＴＶ−１，、、？。）が分離されたカメルーンの女 性の血清。

東５列ないし第１４列：ＨＩＶ−１抗体陽性血清。

図７ Ｓ　Ｉ　Ｖｃ、、、、、ピリオンの存在の電子顕微鏡写真による証明（ｘ２７． ０００）。

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モノクローナル抗体によるウェスタンプロット上の蛋白の認識に及ぼす移動緩衝 液の組成の改変及びゲル中の蛋白の再生の効果。

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Ａ　Ｂ　Ｃ −−―− Ｆ工にＵＲミ　２ ＋ｌ□９いｒｅ　３ ＦＩＧＵＲＥ　４ Ｆ’ＩＧＵＲＥ　６ｂ 噛　−中　９　−　１ド曙−■１噛−１−・　・　１１　・　−−−ａ −−噸一「漬　令−Ｗ　ＷＲ電９中　・　Ｗ　１胛−−Ｉ−酔　１１１−■　− ）−１−龜　劇■■量　・ −１−■■■■１引−１１噂１■■■夢；　Ｉ［−腸一　−１！”ＺＧＵＲＥ　 ６（：　− ん論ｎ〔畿 国際調査報告 ｍ　＃１ｃＴｍｏｍｍｑ−陣蛇謹ｃ＋ｗ国際調査報告 フロントページの続き （５１）　Ｉｎｔ、　Ｃ１，５識別記号　庁内整理番号Ｃ１２Ｎ　５／２０ Ｃ１２Ｐ　２１１００　Ｃ８２１４−４Ｂ２１１０８　８２１４−４Ｂ Ｃ１２Ｑ　１／６８　Ｚ　７８２３−４８ＧＯＩＮ　３３１５３　Ｖ　８３１０ −２Ｊ３３１５６９　Ｈ９０１５−２Ｊ ／／（Ｃ１２Ｐ　２１１００ Ｃ１２Ｒ１：９２） ８９３１−４Ｂ （７２）発明者　デラポルラー、エリックベルギー国べ一−２０１８アントベル ペン、フレトリストラード２２番 Ｉ Ｃ１２Ｎ　１５１００　Ａ （７２）発明者　ペーテルス、マルティーネベルギー国ベー−２０１８アントベ ルペン、フレトリストラード２２番

Claims (34)

【特許請求の範囲】
1. １．ヨーロピアン・コレクション・オブ・アエマル・セル・カルチャーズ（ＥＣ ＡＣＣ）にＶ　９００　６１　３２２号の下で寄託されている任意のレトロウイ ルスの本質的な形態学的性質を有する、ＳＩＶｃｐｚ−ａｎｔレトロウイルスま たはこのウイルスの変異体。
2. ２．本質的な形態学的及び免疫学的性質が、−該ウイルスはＴ４リンパ球への親 和性を表わす。 −該ウイルスは、これが感染するリンパ球における巨細胞の形成に伴う典型的な 細胞傷害効果を表わさない。 −該ウイルスはおよそ１３０ｎｍの直径を有する。 −該ウイルスはマグネシウムに依存する逆転写酵素活性を有する。 これはＴ４レセプターを有する不死化セルラインで培養することができる。 該ウイルスの溶菌液は、ウェスタンブロット上でＨＩＶ−１のｐ２５及びＨＴＬ Ｖ−１のｐ１９蛋白と免疫学的に識別されるｐ２７蛋白を含む。 −該ウイルスの溶菌液は、ウェスタンブロット分析によりＨＩＶ−１のｇｐ１２ ０及びＨＴＬＶ−１のｇｐ１１０と免疫学的に識別されるｇｐ１４０蛋白を含む 。 −該ウイルスの溶菌液はさらに分子量４４，０００ないし５０，０００ＫＤの膜 透過糖蛋白を含む。 のように特徴付けられる、請求項１の精製されたレトロウイルス。
3. ３．少なくとも一つの抗原、特に請求項１ないし２のいずれかに記載のＳＩＶｃ ｐｚ−ａｎｔレトロウイルスの蛋白または糖蛋白を含む組成物。
4. ４．該レトロウイルスの総抽出物または溶菌液を含有することを特徴とする、請 求項３の組成物。
5. ５．該レトロウイルスの少なくとも一つの内部コア蛋白を含有することを特徴と する、請求項３の組成物。
6. ６．該レトロウイルスの少なくとも一つのエンベロープ蛋白を含有することを特 徴とする、請求項３の組成物。
7. ７．ポリアクリルアミドゲル電気泳動において単一のバンドを提供する抗原であ って、ＳＩＶｃｐｚ−ａｎｔレトロウイルスの精製された抗原の一つに共通する 、抗ＳＩＶｃｐｚ−ａｎｔ抗体を有する霊長類の血清によって認識されるエピト ープを含む抗原。
8. ８．ＳＩＶｃｐｚ−ａｎｔの蛋白または糖蛋白の一つの免疫学的特性を有する精 製された抗原。
9. ９．ＳＩＶｃｐｚ−ａｎｔにより産生された蛋白混合物を自体既知の方法により ゲル電気泳動に付しｐ１６蛋白を単離することによって得られるｐ１６蛋白のア ミノ酸配列または該配列の一部を有する、請求項８の抗原。
10. １０．ＳＩＶｃｐｚ−ａｎｔにより産生された蛋白混合物を自体既知の方法によ りゲル電気泳動に付しｐ２７蛋白を単離することによって得られるｐ２７蛋白の アミノ酸配列または該配列の一部を有する、請求項８の抗原。
11. １１．ＳＩＶｃｐｚ−ａｎｔにより産生された蛋白混合物を自体既知の方法によ りゲル電気泳動に付しｐ３４蛋白を単離することによって得られるｐ３４蛋白の アミノ酸配列または該配列の一部を有する、請求項８の抗原。
12. １２．ＳＩＶｃｐｚ−ａｎｔにより産生された蛋白混合物を自体既知の方法によ りゲル電気泳動に付しｇｐ４４−５０蛋白を単離することによって得られるｇｐ ４４−５０蛋白のアミノ酸配列または該配列の一部を有する、請求項８の抗原。
13. １３．ＳＩＶｃｐｚ−ａｎｔにより産生された蛋白混合物を自体既知の方法によ りゲル電気泳動に付しｇｐ１４０蛋白を単離することによって得られるｇｐ１４ ０蛋白のアミノ酸配列または該配列の一部を有する、請求項８の抗原。
14. １４．特にＳＩＶｃｐｚ−ａｎｔ、ＨＩＶ−１またはＨＩＶ−２レトロウイルス に起因する潜在的または存在するＡＲＣまたはＡＩＤＳの診断のための、血清ま たは髓液のような生物学的流体中のＳＩＶｃｐｚ−ａｎｔ、ＨＩＶ−１またはＨ ＩＶ−２レトロウイルスに対する抗体の検出方法であって、診断されるべき霊長 類の体液を請求項３ないし６のいずれかに記載の組成物または請求項７ないし１ ３のいずれかに記載の抗原と接触させ、この抗ＳＩＶｃｐｚ−ａｎｔ、ＨＩＶ− １またはＨＩＶ−２抗体および使用された抗原の間に形成された免疫複合体を検 出することを特徴とする方法。
15. １５．該免疫複合体の該検出が、該免疫複合体を抗ヒト免疫グロブリン抗体また は細菌性Ａ蛋白もしくはＧ蛋白から選択される標識された試薬と反応させ、該複 合体と該試薬との間に形成された複合体を検出することを特徴とする、請求項１ ４の方法。
16. １６．生物学的流体中の抗一ＳＩＶｃｐｚ−ａｎｔ、ＨＩＶ−１またはＨＩＶ− ２抗体の検出のためのキットであって、 −請求項３ないし６のいずれかに定義される組成物、または請求項７ないし１３ のいずれかに定義される抗原、及び、　−形成された免疫複合体を検出する手段 、からなるキット。
17. １７．該免疫複合体を検出する該手段が、抗−ヒト免疫グロブリンまたは蛋白Ａ 並びに検出される免疫複合体中に含まれる抗ＳＩＶｃｐｚ−ａｎｔ、抗ＨＩＶ− １、または抗ＨＩＶ−２抗体間に形成される複合体を検出する手段からなること を特徴とする、請求項１６に記載のキット。
18. １８．ＳＩＶｃｐｚ−ａｎｔレトロウイルスのエンベローブ糖蛋白、または糖蛋 白の一部を、ＳＩＶｃｐｚ−ａｎｔ、ＨＩＶ−１またはＨＩＶ−２に対して有効 なワクチンの構成のために好適な薬学上許容し得る媒質と組み合わせて含有する 、免疫原性組成物。
19. １９．請求項１２ないし１３のいずれかに定義されるエンベローブ蛋白またはそ の一部の蛋白バックボーンを含む糖蛋白の少なくとも一部を含有することを特徴 とする、請求項１８に記載の組成物。
20. ２０．請求項１０ないし１３のいずれかに定義される抗原の一つを特異的に認識 する能力を特徴とするモノクローナル抗体、特に、該抗原に対して特異的に作製 されたモノクローナル抗体。
21. ２１．請求項２０のモノクローナル抗体の分泌ハイブリドーマ。
22. ２２．所望により標識された、一部は少なくともＳＩＶｃｐｚ−ａｎｔレトロウ イルスまたはその変異体のＲＮＡから誘導される、核酸。
23. ２３．ＳＩＶｃｐｚ−ａｎｔレトロウイルスの総ゲノムＲＮＡに対応するｃＤＮ Ａの一部を少なくとも含むことを特徴とする、請求項２２に記載の核酸。
24. ２４．該ｃＤＮＡ、または該ｃＤＮＡの一部をその中に挿入させたベクター由来 の核酸を含む組み替え核酸が形成されることを特徴とする、請求項２２ないし２ ３のいずれかに記載の核酸。
25. ２５．標識されていることを特徴とする、請求項２４に記載の組み替え核酸。
26. ２６．緊縮ハイブリダイゼーション条件下において、生物学的液体または組織に 含まれる核酸を請求項２２ないし２５に記載の核酸を含有するプローブと接触さ せ、形成されたハイブリッドを該緊縮条件を保持する溶液で洗浄し、そして形成 されたハイブリッドを検出することを特徴とする、生物学的液体または組織中の ＳＩＶｃｐｚ−ａｎｔレトロウイルスまたはそのＲＮＡを検出する方法。
27. ２７．ヒトＴ４リンパ球、またはここから誘導されるＴ４表現型を有する永久セ ルラインを、前もってＳＩＶｃｐｚ−ａｎｔレトロウイルスの分離物に感染させ てあるリンパ球またはセルラインと共に培養し、培養基から該レトロウイルスを 回収し精製することを特徴とする、ＳＩＶｃｐｚ−ａｎｔレトロウイルスの産生 方法。
28. ２８．該レトロウイルスを溶菌し該抗原を含む溶菌液を回収することを特徴とす る、ＳＩＶｃｐｚ−ａｎｔレトロウイルスの抗原の産生方法。
29. ２９．対応する核酸配列を発現ベクターに挿入し、該ベクターによって宿主を形 質転換し、形質転換した宿主を培養し、そして発現された蛋白を回収及び精製す ることを特徴とする、前記に定義される蛋白または糖蛋白ｐ１６、ｐ２７、ｇｐ ４４−５０及びｇｐ１４０のいずれかを産生する方法。
30. ３０．ＤＮＡ配列、特に請求項２２ないし２５のいずれかに記載のＤＮＡ配列を インビボの組み替えによってクローニングベクターに挿入し、適当な細胞宿主中 で得られた修飾ベクターをクローニングし、そしてハイブリダイゼーションプロ ーブを回収することを特徴とする、ＳＩＶｃｐｚ−ａｎｔレトロウイルスのＲＮ Ａの検出のためのハイブリダイゼーションプローブの産生方法。
31. ３１．ＳＩＶｃｐｚ−ａｎｔに対して作製された免疫グロブリン分画で表面を被 覆し、分析されるべき体液または培養液を該免疫グロブリンと接触させ、そして 該免疫グロブリン及び抗原間に形成される複合体を検出することを特徴とする、 ＳＩＶｃｐｚの抗原を検出する方法。
32. ３２．ＳＩＶｃｐｚ−ａｎｔに持続的に感染した非ヒト霊長類を、人におけるＨ ＩＶ感染をシミュレートするためのモデルとして使用する試験系。
33. ３３．請求項３２の試験系を、可能性あるＨＩＶワクチンの評価に使用する方法 。
34. ３４．請求項３２の試験系を、抗ウイルス化学療法薬の有効性の評価に使用する 方法。