JPH06500319A

JPH06500319A - 藍藻類からの生物活性化合物

Info

Publication number: JPH06500319A
Application number: JP3514144A
Authority: JP
Inventors: コエン，フランク; クロス，スー　エス．; ロングレイ，ロス　イー．
Original assignee: リサーチ　コーポレーション　テクノロジーズ，インコーポレイテッド
Priority date: 1990-08-08
Filing date: 1991-08-05
Publication date: 1994-01-13
Also published as: EP0542891B1; ES2067948T3; DE69106877D1; DK0542891T3; EP0542891A1; GR3015824T3; ATE117318T1; CA2086918C; US5091368A; WO1992002541A1; CA2086918A1; DE69106877T2

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】発明の名称藍藻類からの生物活性化合物発明の背景かなりの研究と資源が腫瘍学と化学療法を含めた抗膿瘍方法に対して費やされてきた。腫瘍は、種々の形態の癌、及び哺乳類が腫瘍にかかることに伴う苦痛の症状をさしている用語であるところの、癌によって生し・る癌の悪液質を含めて、種々の病気や症状に哺乳類及び人をかからせる。そのような症状は体重の減少などによって証拠づけられろかかった哺乳類の状態を弱くさせることを含む、ｆ！Ａがひどい病気であることは、人の死の主要な原因であることから良く知られている。１１１１の成長を阻止し、緩和し又は抑制することを助けるある種の方法及び化学組成物が開発されているが、斬たな方法及び抗腫瘍化学組成物が必要とされている。

ウィルス病も人、植物、昆虫及び動物を病気にかからせる。ウィルス病の防止及び抑制は、重要な９ｍ康及び経済上の意味を有している。ウィルス病はかぜ、庖疹、後天的免疫不全症候群（エイズ）及び癌を含め、人を病スにかからせることに寄与し・ているので、それらの抑制が重要であることは明らかである。また、経済的及びその他の理由の為に動物のウィルス病を抑制することも重要である。

例えは、人のウィルス病を伝播させることを促進するウィルスの貯蔵所又はキャリヤーにそのような動物かなりうるからである。ウィルスによる植物の病気は、果物の木、タバコ、及び積りの植物の栽培に対し破滅させる効果を有することが知られている。昆虫のウィルス病も昆虫がウィルス病を人に移す能力がある為に興味がある。

ウィルス病を予防及び抑制することは、従って人にとって一番重要であり、そし・てかなりの研究が抗ウイルス方法になされてきた。ある種の方法及び化学組成物が開発され、それらはウィルスを抑制し、阻止し、殺すことを助けるが、追加的な方法及び抗ウィルス組成物が必要とされる。

幾つかの天然の生成物及び生物が非常な多様性の有用な生物活性を有する化学分子に対する給源となる可能性があることが見出された。海洋生物は種々の生物活性を有する化合物の発見に対する給源となってきた。そのような発明に対し、発行されている米国特許の幾つかは次のものである。抗ウィルス活性を有するジデムニンに対する米国特許第４．５４８，８１４は海洋被嚢類から単離された。

米国特許第４．７２９．９９６は海の海綿であるテイチャキシネラ　モラ子エラ（Ｔｅｉｃｈａｘｉｎｅｌｌａ　ｍｏｒｃｈｅｌｌａ）及びプチロ力つリス　ワルベルシ（Ｐｔｉｌｏｃａｕｌｉｓ　ｗａｌｐｅｒｓｉ）から単離された抗腫瘍性を有する化合物を開示している。米国特許４，８０８，５９０は抗ウィルス、抗腫瘍及び抗真菌微性を有しており、海洋の４０のテオネラ属の種（Ｔｈｅｏｎｅ　ｌ　Ｉａ）から単離されている化合物を開示している。そして米国特許４，７３７．５１０はカリピア海の海綿のアシエラス　コニフェリン（Ａｇｅ！ａｓ　ｃｏｎｉｆｅｒｉｎ）から単離された抗ウィルス、及び抗細菌性を有し・ている化合物を開示している。明らかにＷ１綿は生物に由来する化合物の源であることが証明され、そして海綿に由来する有機化合物を開示する幾つかの刊行物が発行されており、これらにはシャウワーＰ。

３９編、マリンナチュラルブロダクツケミカルアントバイオロシカルパスペクティブス（Ｍａｒｉｎｅ　Ｎａｔｕｒａｌ　Ｐｒｏｄｕｃｔｓ、　ＣｈｅｍＩｃａｌ　ａｎｄ　Ｂｉｏｌｏｇｉｃａ！　Ｐｅｒｓｐｅｃｔｉｖｅｓ）、アカデミツクプレス、ニューヨーク、＋９７８−１９８３、第■〜Ｖ巻；フォークナー　Ｄ、　Ｊ、、　（１９８４）　Ｎａｔｕｒａｌ　Ｐｒｏｄｕｃｔｓ　Ｒｅｐ。

ｒｔｓ　（ナチュラルプロダクツレポート）　］　：５５１−５９８；　Ｎａｔｕｒａｌ　Ｐｒｏｄｕｃｔｓ　Ｒｅｐｏｒｔ　（ナチュラルプロダクツレポート）（＋９８６）　３：１３３：　Ｎａｔ、ｕｒａｌ　Ｐｒｏｄｕｃｔｓ　Ｒｅｐｏｒｔ　（ナチュラルプロダクツレポート）　（＋９８７）　４：５３９−５７６：　Ｎａｔｕｒａｌ　Ｐｒｏｄｕｃｔｓ　Ｒｅｐｏｒｔ　（ナチュラルプロダクツレポート）　（＋９８８）５：６１３−６６３：　Ｊ、　Ａｍ、　Ｃｈｅｗ、　Ｓｏｃ、　（１９８５）　＋０７：４７９６−４７９８が含まれる。

４綿に加えて、多くの他の種類の海洋生物が、生物活性化合物を得るために調査されてきた。次の刊行物も海洋生物から得られた化合物を記載している。

カステロ、　Ｄ、、　ｆ、、チムハＳ、デ　ロサ、Ｂ、デ　ステフアン及びＧ、ソダノ（１９８０）　ｒ　ｉ　認類ベルトドリスアトロマキュラタ（Ｐｅｌｔｏｄｏｒｉｓ　ａｔｒｏｍａｃｕｌａｔｅ）及び海綿ノベトロシアフィシフォルミス（Ｐｅｔｒｏｓｉａ　ｆｉｃｉｆｏｒｓｉｓ）からの高分子量ポリアセチレン類」テトラへドロンレタース　（Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ　Ｌｅｔｔｅｒｓ）　２１：５０４７−５０５０＊米国特許４．５４８．８１４海洋の被嚢類からのジデムニン及びモーア　Ｒ，Ｅ、及び門、ペントゼロス（＋９８８）　ｒリングビヤ　マジュスキュラ（Ｌｙｎｇｂｙａ　ｍａｊｕｓｃｕｌａ）からの２つの細胞毒素であるマジュスキュラミド　Ｄ　（ＭａｊｕｓｃｕｌａｍｉｄｅＤ）及びデオキシマジュスキュラミド　Ｄ　（ｄｅｏｘｙｍａｊｕｓｃｕｌａｓｉｄｅ　Ｄ）Ｊ　Ｐｈｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　２７（１０）：３１０１−３１０３゜発明の簡単なまとめ本発明は藍藻類からの新規な生ｖｌＪ活性ペプチドに間する。これらの化合物はミクロコリンＡ及びミクロコリンＢとして知られる。ミクロコリン　（Ｍｉｃｒｏｃｏｌ　ｔｎ）類及びそれらの類似体は抗ウイルス性、細胞毒性及び免疫調整性質を有している。これらの化合物を含む製剤組成物は人及び動物のウィルス性の、免疫性の又は癌関連の病気の処置に使用出来得る。

ミクロコリン類の構造は以下に示される。

Ｒ＝ＯＨ（ミクロコリン　Ａ）Ｒ＝Ｈ（ミクロコリン　Ｂ）発明の詳細な記載本発明は、藍藻類から単離された新規な化合物に関する。これらの化合物は抗ウイルス性、細胞毒性及び免疫調整性質を有することが示されている０本発明は化合物自体並びにこれらの化合物を含む製剤組成物に間する。

また、新規な組成物を投与する方法も開示され、特許請求されている。種々のこれらの化合物の誘導体は、知れれた手順で製造できる。

興味がもたれている化合物は以下に記載されるように、藍藻から単離できる。

藍藻ｔ１！物は水中呼吸装置を用いて・＼ネズエララブランキラ　Ｐｔａ　、ボボス（Ｐｔａ、　Ｂｏｂｏｓ、　Ｌａ　Ｂｌａｎｑｕｉｌｌａ、　′ｖｅｎｅｚｌｅｌａ）における前Ｆｍ　（ｆｏｒｅ　ｒｅｅｆ）スロープ上４０〜９０’から集められた（北緯１１”　４９分４０秒、西経６４６３８分６３秒）。分類学的な試料である証拠物件標本がＨＨＢＩ）ｌ／ＩＲｃＺＭヘリバリウム　（Ｈｅｒｂａｒｉｕｍ）の中に、アクセツション番号ＨＢＦＨ６２０５で寄託されている。この試料はリングビヤ　ブレクトネマ　ペルミジウム　（Ｌｙｎｇｂｙａ　ｐｌｅｃｔｏｎｅ＊ａ　ｐｅｒ＊１ｄｉｕ＋＋）　ＬＰＰグループＡ又はミクロコレウス　１ノングビヤセウス　（Ｍｉｃｒｏｃｏｌｅｕｓ　ｌｙｎｇｂｙａｃｅｕｓ）として同定されて（為る（ハム　ＬＪ、及びＳ、Ｒ，ウイツクス　１９８０．　Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉ。

ｎ　ａｎｄ　Ｇｕｉｄｅ　ｔｏ　ｔｈｅ　Ｍａｒｌｎｅ　Ｂｌｕｅ−ｇｒｅｅｎ　Ａｌｇａｅ、ジョンアンド　サンズ、ニューヨーク　＋９４頁を参照）。

ミクロコリンズＡ及びＢの単離と同定。／！結した　Ｈｌｌｙｎｇｂｙａｃｅｕｓ　（湿潤重量１４６ｇ）を−夜凍結乾燥し、６０　、９ｇの乾燥生物を得た。

乾燥材料をワーリングプレングー中で１００％エタノールと共にホモジナイズし、３０分間放置し濾過した。この手順を残りの固体に対して繰返し生しる抽出物を一緒にし、減圧下で蒸発し、３．５４ｇの抽出物を得た（粗生成ｖ！Ｊ）、この粗製材料をＣ）１２Ｃ１２：メタノール：Ｈ２Ｏ（３：２　：　１　）の間に分配し、６２０ｇと２．６８ｇの非極性及び極性のフラクションをそれぞれ得た。非極性材料を１０１のＥｔＯＡｃ中に溶解し、３ｇのシリカゲノしくメルり６０）と混合し、シリカゲル３０ｇのカラム上ζこかζすた。このカラムを段階的にＥｔＯＡｃ／ヘキサン混合物の１００％ＥｔＯＡｃまて極性が増加するものによって段階的に溶離した（ＶＬＣ）。活性フラクションを一緒にし・蒸発させ、５８Ｃ、ｅシＩＪカゲル（アミコン）のカラムにかけ、７５％アセトニドＩＪル：水て溶離しくνして、）、残留する色素を除ｌＩ）た。溶離したフラクションを蒸発させ、）ｌ　Ｐ　１．Ｃてクロマトグラフィζこかけ（逆相Ｃ１８ヴイダ ’７り　（ｖｙｄａｃ）、１０ミクロン、７０〜７５％アセトニトリル／水）　１０．６ｍｇのミクロコ１ノンＡ及び６．３ＢのミクロコリンＢを得た。ミクロコ１ノンＡとミクロコリンＢの構造をマススペクトル、イヒ学分析、及び−次元及び二へ元ＮＭＲスペクトルで明らめ）ζこした。以下はミクロコリン化合物のスペクトルデータである。

ｉｌ、９’７四しビし知入−門り哄１舌咳す一並ザシ、　８７．２３．　ＩＨ，ｄｄ、　ｊ：６．１．２．０　１．９８．３Ｈ，ｓ６．９９．　ＩＨ，ｄ、　Ｊ＝８．９　１．８４．　ＩＬ　ｄｄｄ６．０５．　ＩＬ　ｄｄ、　ｊ＝６．１．１．７　＋、７０．１Ｈ，ｄｄｄ５．６２．　ＩＨ，ｄｄ、　Ｊ＝７．７．２．２　＋、５４．　ｌ）１．　ｄｄｄ５．２４．ＩＨ，ｄｄ、Ｊ＝１０．２，５．６　＋、４３，３Ｈ，ｄ、ｊ＝６．７５．２２．　ＩＬ　ｄｄ、　Ｃ６，５，２，９１，３７，ＩＨ，ｒｈ４．９８．　ＩＨ，ｄ、　Ｊｌｌ、ｌ　１．２３．８）１．　ｂｍ４．９２．１Ｈ，ｄｄ、　、ｌ＝８．９．２．９　＋、１２．３）１．　ｄ、　ｊ＝６．５４．７９．　ＩＬ　Ｑｔ、　Ｊ＝６．７．１．７　＋、０９．３Ｈ，ｄ、　Ｊ＝６．８４．３４．　ＩＨ，ｂｍ　１．０５．　ＩＨ，ｍ３．８０．２Ｎ、　ｍ　Ｏ，９５，３Ｈ，ｄ、　Ｊ＝６．５３．０６．３Ｈ，ｓ　Ｏ，９１，３Ｎ、　ｄ、　Ｊ＝６．６２．９３．３Ｈ，ｓ　Ｏ，８５，３Ｈ，ｔ、　ｊ：６．６２．８０．　ＩＨ，ｍ　Ｏ，８３，３Ｍ、　ｄ、　ｊ＝６．７２．４５．　ｉｌｌ、　ｄｄｄ　Ｏ，８２，３Ｎ、　ｄ、　、ｌ＝６．６２．２１．１Ｈ，ｄｄｄ　０．７８．３Ｈ，ｄ、　Ｊ＝６．６表２．　ミクロコリン　Ａ　、　１３ＣＮＭＲ，ＣＤＣｌ３．９０ＭＨｚδ　（ｍ）　δ　（−）１７７．９　ｓ　３５・８ｔ１７４．６　ｓ　３３．８　ｄ１７１．３　ｓ　３０．７　ｑ１６９．８　ｓ　３０．３　ｑ１６９．８　ｓ　３０．３　ｄ１６９．７　ｓ　２９．１　ｔ１６８．９　ｓ　２７．１　ｄ１５４．１　ｓ　２４．８　ｄ１２５．３　ｄ　２３．３　ｑ７１．８　ｄ　２２．９　ｔ６８．４　ｄ　２１．５　１５９．２　ｄ　２１．ＯＱ５８．６　ｄ　１９．５　ｑ５８．１　ｄ　１８・８ｑ５６．９　ｄ　１８．４　ｑ５３．７　ｄ　１８．２　ｑ５１．８　ｄ　ｌ？、４　虻１４１．９　ｔ　１６．９　１３７、Ｌ　ｔ　１４．１　ｑ３６．６　ｔ３、ミクロコリン　１３　、　ＣＤＣｌ３．　ＩＨＮＭＲ，３６０ＭＨｚδ　り駁Ｄ　８　−むユＤ７．２２．ＩＨ，ｄｄ、Ｊ：８．０．１．９　＋、８５．１Ｈ，ｍ６．９５．１）１．ｄ、Ｊ：９．２　１．８０．ＩＨ，ｍ６．０３．ＩＨ，ｄｄ、Ｊ：６．０．１．７　＋、７０．１Ｈ，ｍ５．４５．ＩＨ，ｄｄ、Ｊ＝８．４．５．２　１．５６．ＩＨ，ｍ５．２５．ＩＨ，ｄｄＪ＝６．０．ＩＯ＋、４４．３Ｈ，ｄ、Ｊ＝６．８５．２４．ＩＨ，ｄｄ、Ｊ＝７．０，２　１．４０．ＩＨ，ｍ５．０２．ＩＨ，ｄ、ｃｌｌ、０　１．３０．ＩＨ，ｇ＋４．９５．ＩＨ，ｄｄ、Ｊ：＋８．９．３．７　１．３０．６Ｈ，ｂ＋＊４．７４．ＩＨ，ｑｔｌ＝６．９，１．７　１．１３，３Ｈ，ｄ、ｊ＝６゜５３．７４，２Ｈ，ｄ■　１．１１．３Ｈ，ｄ、Ｊ＝６．８３．１５．３）１．ｓ　１．ＩＯ，ｌＨ，ｓ＋２．９１．３Ｈ，ｓ　０．９７．３Ｈ，ｄ、Ｊ＝６．５２．８２．ＩＨ，ｍ　０．９２．３）１．ｄ、、ｌ＝６．５２．４０．ＩＨ，＊　０．８６．３Ｈ，ｔ、Ｊ”６．５２．２５．ＩＮ、清　０．８４．３）１．ｄ、Ｊ＝６．５１．９７．３Ｈ，ｓ　０．８２．３Ｈ，ｄ、Ｊ＝６．５２．０．ｌＬｍ　０．７８．３Ｈ，ｄ、ｊ＝６．５１．９３．ＩＨ，ｍＲ」ユニー１３ＣＮＭＲ三辷欠」Ｌジ思二乙−影二ゴ１Ｌに」１１１＃　δ　！　＃　δ　− １１７７，９ｓ　２１　３０．８　ｄ２　１７２、Ｏｓ　２２　３０．５　Ｑ３　１７１．３　ｓ　２３　３０．４　ｑ４　１６９．７　ｓ　２４　２９．１　ｔ５　１６９．７　ｓ　２５　２８゜９ｔ６　１６９．８　ｓ　２６　２７．３　６７　１６８．３　ｓ　２７　２４．９　ｄ８　１５３．７　ｄ　２８　２４．６　ｔ９　１２５．５　ｄ　２９　２３．３　ｑｌｏ　６８．９　ｄ　３０　２２．９　ｔＩｔ　ｅａ、ｏ　ｄ　３１　２１．６　ｑ１２　５９．３　ｄ　３２　２１．Ｏｑ１３　５８．０　ｄ　３３　１９．６　ｑ１４　５３．８　ｄ　３４　１８．９　４１５　５２．０　ｄ　３５　１８．４　ｑ１６　４８、Ｏｔ　３６　１８．２　ｑ＋７　４１．９　ｔ　３７　１７．２　ｑ＋８　３７．Ｏｔ　３８　１７．２　ｑ１９　３５．９　ｔ　３９　１４．１　ｑ２０３３．８ｄミクロコリンＢに対し・では次の情報も得られた：ＨＲＥ　ＩＭＳ−測定値ｍ／ｚ　７３１．４７９７、Ｃ３９Ｈ６５０ｅＮ５に対する計算値、Δ２．４ｍｍｕ。

賽光度［α］　Ｄ２３＝　−１７４’　（Ｃ＝　０．００５エタノール）ミクロコリンに対する生物検定。ミクロコリンの免疫調整性、抗ウイルス性及び細胞毒性を測定する為にミクロコリンを検定した。実施された検定は以下に記載される。

■、混混合リンパ球心２、ねずみの稗細抱す濁液をＢＡＬＢ／ｃ及びＣ５７ＢＬ／６Ｊマウスから別々に調製した。稗臓を無菌的に除去し、１０％の胎児牛血清、２％の１−クルクミン、！５１１＋Ｍ　ＨＥＰＥＳ、１％抗生物貿−抗真薗性物賀の溶液及び２５μ ｇ／ｗ　Ｉゲンタマイシン（ＧＩＢＣＯ）を補充したＲＰ旧−１６４０絹織培養培地（ＴＣＭ）中でホモジナイズした。細胞濃度を２．５Ｘ　１０’細胞／１に調節した。各細ｌＩ＠個体群のアリコートを別々の試験管に取除き、残っている二つの細胞懸濁液を一つの試験管に一緒にし・た。

２、粗抽出物の一連のｌＱｇ＋ｏ希釈液、又は純粋な化合物の一連の二倍希釈物を簾水エタノール中で造り、各希釈の１０μｍをミクロ滴定試験プレートのウェルに加え、乾燥させた。

３、−緒にし・た稗細胞懸濁液の０．２１の容量を３重の試験ウェルに加えた。

陽性の対照のウェルは試験抽出物／化合物の非存在下で、−緒にし・た牌纏胞の懸？ｉ液を受けた。陰性の対照のウェルは試験化合物の非存在下において培養された。別々のく混合されていない）牌細胞懸ｉＩ！液からなっていた。

４、プレートを３７℃で８６時間、５％　ＣＯ２中で培養した。

５、各ウェルに０．０５＋ａｌ容量の３Ｈ−チミジンク２０μＣ１／１）を加え、プレートを３７℃で更に５時間、５％　ＣＯ２中で培養した。

６゜ミクロ滴定プレートの各ウェルの内容物をガラス１Ｍ維のフィルターの片上に収穫し、生じるフィルターのディスクを螢光測定用バイヤル中に置き、これに２．−１の螢光流体を加えた。

７、取込まれた３Ｈ−チミジンの量を液体シンチレーションカウンター中でバイヤルを計数することによって測定した。

８．３１の計数値を平均し、データを陽性対照の％として報告し・た。対応するＬＣＶｌｄｉが〉７０％を有している陽性対照ＭＬＲの１０％未満の値は、抽出＊／化合物の最適な免疫抑制効果を示唆している。

１１、リンパ球生存検定１、抽出物及び化合物をＭＬＲと平行して同様に試験し、リンパ球生存検定（Ｌ（ニジ）を用いるリンパ節細胞に対する毒性効果を測定した。

２、一連の粗抽出物のｌｏｇｌ。希釈物又は、一連の純粋な化合物の２倍希釈物を無水エタノール中で造り、１０μｍの各希釈をミクロ滴定試験プレートのウェルに加え、乾燥させた。

３、ねずみの弊細胞懸濁液を８ＡＬＢ／ｃマウスから製造した。ｐＩ−臓を無菌的に取除き、１０％の胎児牛血清、２％の１−グルタミン、１５ｗ＋Ｍ　ＨＥＰＥＳ、１％抗生物質−抗真菌物質溶液及び２５μｇ／ｍｌゲンタマイシン（ＧＩＢＣＯ）を補充したＲＰ旧−１６４０朝織培養基培地（ＴＣＭ）中でホモジナイズした。　ＩＩ！ｔｆｉｌｌ＆ヲ２．５ｘ　ｌ０ＪＩＩｔ！！／ｍｌニｌ１節Ｌ／　タ。

４、牌細胞懸濁液の０．２１容量を加えて、試験ウェルをｆＪｌ製させた。陽性対照は試験抽出物／化合物の非存在下において牌細胞懸濁液を受けた。

５、プレートを３７℃で８６時間培養させた。培養期間の終りにＭＴＴの２．０ｍｇ／ｍｌ溶液の７５μｍの容量を各ウェルに加え、プレートを更に５時間インキュヘーターに戻した。

６、各ミクロウェルからの上澄みを除去し、イソプロパツール２００μｍの容量を加え、内容物を混合した。

？、ｌａは試験化合物を含有しているウェルの光学密度（５７０及び６５０ｎｍで測定）を細胞と培地のみ（陽性対照）を含有し・ているウェルの光学密度と比較することによって得た。結果は陽性対照の％とじて表現する。

８、複製計数を平均し・、データは陽性対照の％として報告した。陽性対照の６０％未満のＬＣＶｌ＋Ｉはリンパ節細胞に対する試験抽出物／化合物の細胞毒性を示している。

抗ウイルス検定単純庖疹ウィルス１型（Ｈ５Ｖ−１）に対する抗ウイルス検定は、プラーク抑制検定である。　ＣＶ−を細胞（プライマリ−アフリカングリーンモンキー細胞に由来する繊維芽細胞様の細胞培養基）にＨ５Ｖ−１０Ｋｏｓ菌株を感染させた。

ウィルスの細胞病効果（ＣＰＥ）はメチルセルロース培地によって迅速な広がりが防止される。！＠染した細胞のはっきりした区域即ちプラークは、培養基を生きている細胞によって取上げられる染料であるニュートラルレッドで培養基を染色することによって、生きているＣＶ−１細胞の周りの区域と区別される。このウィルスの適量は、プラークの数を数えることによって定量化できる。抗ウィルス活性を有する化合物は、Ｈｓｖ−ｔウィルス対照に対する薬物で処理された細胞におけるプラークの数を比較することによって同定することができる。

検定プロトコル１、細胞−ＣＶ−１２、ウィルス−Ｋ　ｏｓＷ株３、培地成育培地イーグルスハランスト塩溶液中のイーグルス最小必須培地（ＥＭＥＭ）ｌＯ％胎児牛血清１％非必須アミノ酸（ＮＥＡＡ）２％ｌ−グルタミン（２００ｍＭ）１％ビルヒン酸ナトリウム５０μｇ／ｍｌゲンタマイシン維持培地最初の層：蒸留水中の４０００センチボイズメチノしセルロースの２％溶液と、５％胎児牛血清を有し、フェノールレットを有さない２Ｘ成育培地との等し０容璽二番目の［：蒸留水中の１５センチボイスのメチノしセルロースの４％溶液と、Ｏ，１ｍｇ／ａ＋１のニュートラルし・ソトの染料を１ｘ溶液に対し含有して０る、５％胎児牛血清を有しフェノールレットを有しな１．）２　Ｘ　Ｉｌｉ育土音地との等しい容量トリプシン溶液ＣａＣｌ２及びＭｇＣ＋２−６８２０を有さなし）ダルベ−７コ（Ｄｕｌｌ）ｅｃｃｏ）のホスフェート緩衝化食塩水中の０．５ｍｇ／ｉｆのト１ノブシンと０．２ｍ）（／ｍ１ＥＤＴＡ・ｌａ　（ＰＢＳ）４、ＣＶ−１細胞の成育（’：Ｖ−１細胞のコンフルエント培養基をＰＢＳて２回濯ぎ、そし・て４．Ｏｍｌのトリプン溶液を１５０ＣＩ１１２組織を音養フラスコに加えた。細胞を分散させ、４０ｍ１のａｉｙｔ音地中のＩＯＸ＋ｏ８ｃＯｍｌ細抱を斬しい１５０ｃｍ２フラスコここ加えた。細胞培養フラスコに加えた細胞の数は面積と比例する。細胞ｔｇ養基は抗ウイルス検定に使用するためＬこ５〜７日でコンフルエント化する。

５、抗ウイルス検定２４個のウェルのプレート（ウェル当り１６■の直径）に０．５１成育培地中のウェル当り２　Ｘ　１ｏ５Ｉｌ胞を植え付け、そして５％Ｃ０２とともに３７℃ で培養した。プレートを２４〜７２時間内に使用した。各ウェルに少なくとも２５であるが、８０を越えないプラーク形成単位（ＰＦＵ）のウィルスを感染させた。プレートを３７℃で０．２１のウィルスとともに１．０時間培養した。培養期間の終りにウィルス接種物を含有している流体をプレートから除去し、０．５＋ｎｌの最初の層の培地を加えた。抽出物と純粋な化合物の抗ウイルス試験に対しては、試料をろ紙の円盤（６ｗｍ直径）に加え、溶媒を蒸発させた。円盤を細胞、ウィルス及びオーバレーの培地を含有しているウェル中に置いた。プレートを３７℃で４８時間培養し、第二のオーバレイの培地をウェル当り０．５１で加え、そして２４４時間追加の培養時間の後、プレートの読みを行った。

抗ウィルス活性抗ウィルス活性は、二つのパラメーターから観測した。

一つはプラークの数の実際の減少であり、第二はプラーク直径における減少である。

薬物の細胞毒性プレートのウェルは直径が１６１１１！ＩＩであり、ディスクは直径が６ｍ１ＩＩである。

６ｍ＠よりも大きな細胞毒性の帯域を偶数のみを使用して８から１６に等綴付けした。

Ｏ＝肉眼又は顕微鏡下の毒性なし＋８＝　１００％細胞破壊８．１０．１２．１４＝　６■■の円盤の直径を含めた毒性帯域の直径抗ウィルス活性＋＋＋＝プラーク形成の完全な抑制＋＋＝部分的な抑制＋２部分的な抑制＋／−＝わずかな抑制一＝保護なし５０％最小抑制御度（ＭＩＣｓｏ）を実験薬物試験中のプラークの数を計数し、そしてその値をウィルス対照ウェルと比較するか、又はプラーク減少値を対照と比較して［＋＋＋＝　１００減少、＋＋ニア５％、＋＝５０％、＋／−＝　２５％そして一二ブラーク数の減少なし・コの抑制値から評価することにより決定する。

抗糟瘍方法粗抽出物及び純粋化合物をねずみのＰ３８８白血病細胞に対する毒性について試験し・た。、１．メイヨ、ナショナルキャンサーインスチチ］−ト、ミツトラント州ヘセスダから得られたＰ３８８細胞を１０％馬血清を補充したローズウエルパークメモリアルインスチチコート培地＋６４０　（ＲＰＭＩ−１６４０）中で保った。全ての細胞系統は、プラスチック組織培養基フラスコ中で培養し、５％ｃｏ２を含有している湿潤化空気中の３７℃におけるインキュベーター中で保たれた。抗生物質のないＰ３８８細胞の原培養基を２〜３日の間隔で新たな成育培地中の希釈によってｔＯＳ細胞／１にサブカルチャー（二次培養基）にした。− 次培養基の平均世代時間は、１４〜１７時間である。

Ｐ３８８ＡＩ胞に対する試薬の抗増殖効果を評価する為に、２００μｍの培養基（９６ウエル鞘織培養基プレート、ヌンク、デンマーク）を薬物を含まない培地中で又は種々の濃度で化合物ｌ又は２のｌ：５００の最終希釈に於ける粗抽出物を含有している培地中でｌＸ１０６細ｒ！／■１を確立させた。

全ての希釈物に対する溶媒はメタノールであり、これは真空下でプレートから除去した。全ての実験培養基はゲンタマイシンサルフェートを含有している培地中で開始した（　５０ｍｇ／■１：シェリングコーポレーション、ニューシャーシー州、ケニルヮース）、４８時間暴露したのち、Ｐ３８８！Ｉ胞を３−［４，５ −ジメチルチアゾール−２−イル］　−２，５−ジフェニルテトラゾリウムブロマイド（ＭＴＴ）を使用して以下に記載されるように数えた（アレー、　Ｍ、　Ｃ，等　［１９８８コ　Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ、４８：５８９）　。

細胞増殖に対する効果を定量するために、５ｍｇ／ｍ１ＭＴＴを含有している７５μｍの温かい成育培地を各々のウェルに加え、そして培養基を９０分間インキュベーターに戻した。還元されたホルマザンの形成を分光光度計て定量するためにプレートを遠心し、　（９００ｘｇ、５分間）、培ｉ液を吸引で除去し、２００μｍの酸性化イソプロパツール（２ｍ１ｍｌ　）ＩＣ！／　１　ｌイソプロパツール）をウェル当りに加えた。

生しる溶液の吸光度を５７０ｎｍでプレートリーダーで測定した（　ＭＲ７００ミクロプレートリーダー、ダイナチックラボラトリーズ、バージニア州、チャンティリー）。試験ウェルの吸光度を、薬物なしのウェルの吸光度で割り、未処理培養基の５０％吸光度を生しる試薬の濃度をロジット変換データの線形回帰によって測定した（フィニー。

Ｄ、　Ｊ、　５ｔａｔｉｓｔ、１ｃａｌ　Ｍｅｔｈｏｄ　ｉｎ　Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ　Ａｓ５ａｙ、第３編、３１６〜３４８頁、チャールスグリフィンカンパニー、ロンドン、１９７８）。Ｐ３８８細胞数とホルマザン生産の線形の関係がこれらの実験で観測される細胞密度の範囲にわたって見られた。

以下は本発明を実施する最良の形りを含めた手順を説明する実施例である。これらの実施例は限定するものと解釈されるへきてはない。他に記載されない限り全ての％は重量により、全ての溶媒混合物割合は容量による。

ｘｊ！！ＪＴ４１　粗」−出物の抗挿瘍活憔ねずみＰ３８８白血病″ｍ抱二二対する粗抽出物の毒性を上に記載したように検定した。粗抽出物は０．３５μｇ／ｍｌのＩｃ５１：。

を有することがわかった。２０μｇ／ｍｌの濃度において９８％の抑制が観測された。

実施例２　粗抽出物の抗ウィルス活性幾つかの種類のウィルスに対する粗抽出物の抗ウィルス活性を上に記載したように検定した。これらの検定の結果を以下の表５に示す。

表５．粗抽出物の抗ウィルス活性ウィルス　希釈なし　１０倍希釈　１００倍希釈Ｈ５Ｖ−１０＋＋／＋　０＋＋　Ｏ＋実施例３　粗抽出物の免疫調整自粗抽出物を上に記載した様に免疫調整及び細胞毒性活性について検定した。これらの検定の結果を以下の表６に示す。

表６．粗抽出物の免疫調整及び細胞毒性活性０．０（対照’）　＜ｌ　８３１０／細胞毒性０．１　＜１　２６　１Ｄ／細胞毒性０．０１　＜＋　５６　１０／細胞毒性０．００１　１４２　１１９１陽性対照の％（薬剤なし）　ＭＬＲ応答２ＬＣＶ応答の陽性対照（薬物なし）の％３１Ｄ／細抱毒性＝免疫抑制性であるが関連する細胞毒性あり（ＬＣν値＜７０％陽性対照（薬物なし）実施例４　純粋な化合物の抗ウイルス活性純粋なミクロコリンＡ及びミクロコリンＢをＨ５Ｖ−１に対する活性について検定した。

これらの検定の結果を以下の表７に示す。

表７．ミクロコリンＡ及びＢの抗Ｈ５Ｖ−１活性ミクロコリン　Ａ　４８０　２．５　１９２ミクロコリン　Ｂ　＋１８５　１４６．０　８実施例５　純粋な化合物の免疫調整活性純粋なミクロコリンＡと純粋なミクロコリンＢの免疫調整活性を上に記載したように検定した。これらの検定の結果を表８及び９に以下に示す。

表８．ミクロコリンＡの免疫調整活性０．０（対照＞　ｔｏｏ　ｔｏ。

２．５　＜１　７８　３１０５．０　＜１　７１　Ｉｎ１０．０　＜＋　８０　１０２０．０　（Ｉ　８２　１Ｄ４０．０　＜＋　６０８０　、０　＜　１　５９１６０．０　（１５９１２５０，０（１３１２５００，０＜ｌ　１８５０００．０　（＋　３ ’ＭＬＲ応答の陽性対照（薬剤なし）の％２ＬＣＶ応答の陽性対照（薬物なし）の％３１Ｄ＝免疫抑制性（対応する＋、ＣＶ値は対照（薬物なし）の７０％以上でなけれはならない）表９．ミクロコリンＢの免疫調製活性濃度（ｎｇ／ｍｌ）　ＭＬＲ’に’　ＬＣＶ’！２ミクロコリン　Ｂ　対照　対照０．０（ｃｏｎｔｒｏｌ）　＋００　１００１０．０　８０　１０７２０．０　３９　１０５　３１０４０．０　１　９７　１Ｄ８０．０　＜＋　１１４　１Ｄ１６０．０　＜＋　９９　１０３１２．５　＜１　１１０　１Ｄ６２５．０　＜＋　８８　ｌ０１２５０．０　＜ｌ　７５　１Ｄ２５００．０　（Ｉ　５１５０００．０　＜１　２９ＩＭＬＲ応答の陽性対照（薬剤なし・）の％２ＬＣＶ応答の陽性対照（薬物なし）の％３１Ｄ＝免疫抑制性（対応するＬＣＶ値は対照（薬物なし）の７０％以上でなければならない）実施例６　純粋な化合物の抗腫瘍活性純粋なミクロコリンＡ及びＢを上記の様にねずみＰ３８８白血病細胞に対する毒性について検定した。ミクロコリンＡのＩＣ５゜は０．０００９μｍ／１であることがわかったが・一方ミクロコリンＢはｌｆ：５ｏ　Ｏ，０９６μｍ／１を有することがわかった。

実施例７　構造の類仰体これらの化合物の種々の誘導体及び類似体を既知の手順で製造できる。誘導体及び類似体の例を以下に示す。

式中Ｒ、＝　ＯＨ−Ｎ　Ｈ２，０−フルキル、Ｎ−アルキルＲ２＝Ｈ，ＯＨ，＝Ｏ，Ｏ−アルキル、０−アシル、＝ＮＨＯＨ，：ＮＮＨＲ，＝ＮＮＨＣＯＮＨ２，又は＝ＮＯ−アルキ／Ｌ；Ｒ３＝ＯＨ，＝Ｏ，Ｏ−７／Ｌキ／Ｉ、、＝ＮＮＨＲ，＝ＮＮＨＣＯＮＨ２，０−アシル、＝ＮＯＨ。

又は＝ＮＯ−アルキル；Ｒ＝アリル又はアルキルミクロコリンＡ及びＢの有用な類似体の幾つかをつくることができる。修飾されたＲ１及びＲ２基を有する化合物が温和な塩基性のアルコール中でのミクロコリンＡ又はＢのいずれかの開裂によって製造できる。これらの化合物はさらに適当なアルコール（メタノール、エタノール、プロパツール等）との反応によって、又は適当な条件下での均等なアミンとの反応によりさらに誘導化することができ、Ｒ１がＯ−アルキルであるエステル、又はＲ１がＮＦ２又はＮ−アルキルであるアミンを生しる。親化合物又は修飾された化合物は種々の塩化アシルと反応させられ、Ｒ２がＯ−アシルである誘導体を生じる。Ｒ２が＝０である化合物は、当業者に知られた幾つかの酸化手順の一つを使用してミクロコリンＡ又は上記のその誘導体から製造できる。これらには限定するものではないが無水酢酸、ジメチルスルホキシド及び酸触媒での反応、即ちモファット手順又は有機溶媒中のピリジニウムジクロメートとの反応が含まれる。ミクロコリンＡの生じるケトン誘導体は次に適当に置換されたヒドロキシルアミンとの反応によってＲ２が＝ＮＯＨ又は＝ＮＯ−アルキルであるオキシム誘導体を与える為に使用される。ヒドラゾン及びセミカルバゾン等の他のカルボニル誘導体を、適当に置換されたヒドラジン類、又はセミ方ルバジト類との反応によって製造出来る。

Ｒ７がＢである化合物は、パラジウム又は炭素上のパラジウムなどの触媒の存在下で、エタノール等の適当な溶媒中で高圧の水素ガスとの反応によって、ミクロコリンＡ又はミクロコリンＢのいずれかから製造できる。他の金属触媒も同じ櫟に使用できろ。Ｒ３がＯＨ又はＯ−アシルである化合物は上に記載したものから可溶媒分解に続いて種々の塩化アシルとの反応によって製造することができる。

実施例８　処友支旦Ｊ本発明の化合物は種々の非治療及び治療目的のために有用である。試験によって本発明の化合物は免疫調整、抗ウィルス活性及び腫瘍成長の抑制に対し、有効であることが明らかである。これらの化合物はウィルス実験室の仕事区域において望まれないウィルス成育を抑制するのに使用できる。また化合物類は紫外線を効果的に吸収するのでプラスチック工業において、紫外線スクリーナーとして使用できる。ここに開示されるようにこれらは腫瘍を処置する為に治療的に使用でき、又は動物及び人において免疫調整又は抗ウィルス剤として使用できる。

新規化合物及びこれらを含有し・ている組成物の治療的な応用は、当業者に現在知られた、又は知られることが見込まれている汗會の適当な治療方法及び技術によって達成されることが考えられうる。さらに本発明の化合物は他の有用な化合物及び組成物の製造のための出発材料又は中間体としての用途を有している。

上に示されたものの宿主に対する適量は感染の同定、関与する宿主の種類、その年齢、体重、ｇａＩ！！状態、もしあるならば、同時になされる処置の種類処置の頻度及び治療比率に依存する。

本発明の化合物は製薬上有用な組成物を製造するための知られた方法に従って処方できる。処方物は良く知られ容易に人手できる多数の源において、多数の書物に詳細に記載されている０例えばＥ、　Ｗ、マーチンによるＲｅ＊ｅｎｔｏｎ’ ｓ　Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ　５ｃｉｅｎｃｅは本発明と関連して使用できる処方を記載している。一般に本発明の組成物は生物活性化合物の有効量が、組成物の効果的な投与を促進する為に適当な担体と朝会せられるように処方される。

そのような本発明で使用される担体の例には、エタノール、ジメチルスルホキシド、グリセロール、シリカ、アルミナ、澱粉及び同等の担体及び希釈剤が含まれる。

有効量は変化しうるが、そのような組成物が使用される条件は変化するので抗ウィルス活性に要する最小投与量は一般に２５〜８０プラ一ク形成単位のウィルスに対し、父マイクログラムと２００マイクログラムの間である。望まれる治療的な処置のためのそのような適量の投与を与える為に、本発明の新規な製剤組成物は、有利には、担体又は希釈剤を含めた全組成物の重量に基づいて、新規化合物の１又はそれ以上の合計の重量が約０．１％と４５％の問、特に１％と１５％の間からなっている。例えζズ投与される活性成分の投与水準は静脈内０．０１〜約２０ａ＋ｇ／動物体重ｋｇ−Ｉｌｌ　腔内０．０１〜約１００ｍｇ／動物体重ｋｇ、皮下０．Ｏ１〜１〜約１００／動物体重Ｊ、筋肉内０．０１〜約１００ａ＋ｇ／動物体重ｋｇ、経口０．Ｏ１〜約２００信ｇ／動物体１ｋｇ、及び好ましくは約１〜１１００Ｉａ／動物体重ｋｇ、鼻内点滴ｏ、０１〜約２０Ｂ／動物体重ｋｇ、エコゾル０．０１〜約２０Ｂ／動物体重ｋｇ、である。

本発明の化合物は抗ウィルス又は抗腫瘍治療を必要とする患者に対し、非経口、経口又は局所的に投与できる。

活性化合物は食塩水又はバランスされた塩溶液なとの生理学的に受け入れられる流体と混合されうる。また固体処方、例えば錠剤又はカプセルを作ることが出来る。

木明繕書に記載した実施例及び具体例は、説明目的のみのものであって、これにてらして種々の変更または修飾が当業者に示唆され、この出願及び添付の特許請求の範囲の精神と範囲内に含まれるへきであることが理解されるへきである。

国際調査報告国際調査報告ミミミミミジョヨミ工ミニ＝ニー巨貿ｒ＝−一フロントページの続き（７２）発明者　クロス、スー　ニス。

アメリカ合衆国　３４９４９　フロリダ州　フォートピアス　ジャカランダ　ドライブ（７２）発明者　ロングレイ、ロス　イー。

アメリカ合衆国　３２９６２　フロリダ州　ベロビーチ　２２エヌデイー　アベニュー

Claims

【特許請求の範囲】

１．次の構造を有する化合物 ▲数式、化学式、表等があります▼ 〔式中Ｒ１はＯＨ、ＮＨ２、Ｏ−アルキル、Ｎ−アルキル▲数式、化学式、表等があります▼ であり、Ｒ２はＨ，ＯＨ，＝Ｏ，Ｏ−アルキル，Ｏ−アシル，＝ＮＨＯＨ，＝ＮＮＨＣＯＮＨ２，＝ＮＮＨＲ，又は＝ＮＯ−アルキルであり、Ｒ３はＯＨ，＝Ｏ，Ｏ−アシル，Ｏ−アルキル，＝ＮＯＨ，又は＝ＮＯ−アルキルであり、そしてＲはアリール又はアルキルである〕。
２．Ｒ１がＡ、Ｒ２かＨ、Ｒ３がＯＡｃである請求項１に記載の化合物。
３．Ｒ１がＡ、Ｒ２かＯＨ、そしてＲ３がＯＡｃである請求項１に記載の化合物。
４．腫瘍細胞そ宿している人文は動物に次の構造▲数式、化学式、表等があります▼ 〔式中Ｒ１はＯＨ、ＮＨ２、Ｏ−アルキル、Ｎ−アルキル▲数式、化学式、表等があります▼ であり、Ｒ２はＨ，ＯＨ，＝Ｏ，Ｏ−アルキル，Ｏ−アシル，＝ＮＨＯＨ，＝ＮＮＨＣＯＮＨ２，＝ＮＮＨＲ，又は＝ＮＯ−アルキルであり、Ｒ３はＯＨ，＝Ｏ，Ｏ−アシル，Ｏ−アルキル，＝ＮＯＨ，又は＝ＮＯ−アルキルであり、そしてＲはアリール又はアルキルである。〕を有する化合物の腫瘍細胞抑制有効量を投与することからなる腫瘍細胞を宿す人、又は動物を処置する方法。
５．該化合物に対し、Ｒ１がＡであり、Ｒ２がＨであり、Ｒ３がＯＡｃである請求項４に記載の方法。
６．該化合物に対し、Ｒ１がＡ、Ｒ２がＯＨ、Ｒ３がＯＡｃである請求項４に記載の方法。
７．次の構造式 ▲数式、化学式、表等があります▼〔式中Ｒ１はＯＨ、ＮＨ２、Ｏ−アルキル、Ｎ−アルキル▲数式、化学式、表等があります▼又は▲数式、化学式、表等があります▼であり、Ｒ２はＨ，ＯＨ，＝Ｏ，Ｏ−アルキル，Ｏ−アシル，＝ＮＨＯＨ，＝ＮＮＨＣＯＮＨ２，＝ＮＮＨＲ，又は＝ＮＯ−アルキルであり、Ｒ３はＯＨ，＝Ｏ，Ｏ−アシル，Ｏ−アルキル，＝ＮＯＨ，又は＝ＮＯ−アルキルであり、Ｒはアリール又はアルキルである。〕を有する化合物を適用することからなるウイルスを抑制又は殺す方法。
８．上記化合物に対しＲ１がＡであり、Ｒ２がＨであり、Ｒ３かＯＡｃである請求項７に記載の方法。
９．上記化合物に対しＲ１がＡ、Ｒ２がＯＨ、Ｒ３がＯＡｃである請求項７に記載の方法。
１０．免疫調整が必要な動物に対し、つぎの構造式▲数式、化学式、表等があります▼ 〔式中Ｒ１はＯＨ、ＮＨ２、Ｏ−アルキル、Ｎ−アルキル▲数式、化学式、表等があります▼又は▲数式、化学式、表等があります▼であり、Ｒ２はＨ，ＯＨ，＝Ｏ，Ｏ−アルキル，Ｏ−アシル，＝ＮＨＯＨ，＝ＮＮＨＣＯＮＨ２，＝ＮＮＨＲ，又は＝ＮＯ−アルキルであり、Ｒ３はＯＨ，＝Ｏ，Ｏ−アシル，Ｏ−アルキル，＝ＮＯＨ，又は＝ＮＯ−アルキルであり、Ｒはアリール又はアルキルである。〕を有する化合物の免疫調整有効量を投与することからなる免疫調整を必要とする人又は動物を処置する方法。
１１．該化合物に対しＲ１がＡであり、Ｒ２がＨであり、Ｒ３がＯＡｃである請求項１０に記載の方法。
１２．該化合物に対しＲ１がＡ、Ｒ２がＯＨ、Ｒ３がＯＡｃである請求項１０に記載の方法。