JPH06500358A - 磁気応答性ポリマー粒子の製造方法及びその用途 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 磁気応答性ポリマー粒子の製造方法及びその用途関連出願の相互参照 本出願は、今や放棄された係属中の出願である１９８７年１０月２６日出願の出 願番号１１３．２９４　、及び我々の先行の、１９９０年１０月２２日出願の出 願番号７／６０２．９１０．１９８９年５月３０日出願の７／３３７．５１３． １９８９年４月１３日出願の７／３３７．２４４及び１９８９年４月１３日出願 の７／３３７．２３４の一部係属出願である。

発明の分野 本発明は、磁気応答性ポリマー粒子の製造方法及びそれらのイムノアッセイ、生 物医学的及び産業的用途における使用に関する。

発明の背景 イムノアッセイ、アフィニティー精製等のような多くの生物学的技術が、遊離の 画分からの結合した画分の分離を必要とする。磁性粒子が、望ましい分離を効率 化するために使用されてきた。

磁性粒子は、種々の方法を用いて、種々の粒子性及び磁性の材料から形成され、 種々の特徴を有する。例えば、池田等の米国特許第４、５８２．６２２号は、ゼ ラチン、水溶性多糖類、リン酸ナトリウム及び強磁性体物質よりなる磁性粒子を 開示し、米国特許第４．６２８．０３７号及び４．５５４．０８８号はポリマー 性シランによって取り囲まれた磁性金属酸化物コアよりなる磁性粒子を開示し、 米国特許第４．４５２．７７３号性体鉄酸化物（ＦｅｚＯ４）のコアを育する離 散コロイド的サイズの粒子を開示し、そしてＭａｎｓｆｉｅｌｄの米国特許第４ ．２９７．３３７号は、粒子担体として磁性のガラス又は結晶含有材料を開示し ている。

発明の概要 本発明は、磁気応答性ポリマー粒子（以下「磁性粒子」という。

）を、形状及び組成にかかわりなく直径約１乃至ｌＯｏμｍの平均サイズを有す るポリマー性粒子から製造する新規の方法を提供する。本発明の磁性粒子は、先 ず平均サイズ約１μｍ以下の磁気応答性金属酸化物（以下「金属酸化物」という 。）を製造し、次いでポリマー性コア粒子を金属酸化物を含有するポリマー層で 被覆することによって製造できる。これらの磁性粒子の表面は、所望の表面特性 を与えるために、もう一層のポリマー又は官能基付きポリマー層で更に被覆する ことができる。

本発明によって製造される磁性粒子は、サイズにおいて単分散性で粗い表面を有 し、約５％乃至５０％、好ましくは１０％乃至２５％の磁性金属酸化物含量を有 する。これらの特徴を有する粒子は、イムノアッセイ及び広汎な各種の生物医学 的用途において有用であることが見出された。これらの磁性粒子は、抗原、抗体 、酵素又はＤＮＡ／ＲＮＡのような生物学的材料の受動的又は共有結合的な結合 のために使用でき、種々のタイプのイムノアッセイ、ＤＮＡ／ＲＮＡハイブリダ イゼーションプローブアッセイ、アフィニティー精製、細胞分離及び他の生物医 学的な用途のために固相として使用できる。該磁性粒子はまた、産業廃棄物の処 理のような産業的用途のためにも使用できる。

目的及び利点 本発明の目的は： 容易に入手できるポリマー粒子から容易に磁気応答性ポリマー粒子を製造する方 法を開発すること。

中等度の沈降性及び迅速な磁気的分離を備えた磁気応答性ポリマー粒子を製造す る方法を開発すること。

生物学的材料の受動的又は共有結合的な結合のための種々の表面電荷及び官能基 を有する磁気応答性ポリマー粒子を製造する方法を開発すること。

これらの磁気応答性ポリマー粒子を使用する医学的、生物学的、診断的及び産業 的用途を開発することである。

本発明の利点に含まれるのは： 約１乃至１００μｍのサイズを有する広汎な各種のポリマー性コア粒子を、容易 に磁気応答性粒子に変えることができること。

金属酸化物含量を用途に応じて変化させることができること。

、表面を、共有結合的な結合のための種々の官能基へと誘導体化できること。

得られるポリマーの種々の表面特性を与えるための最終被覆のために、広汎な各 種のモノマーが使用できること。

架橋を有し又は架橋を有しない磁気応答性ポリマー粒子の双方が製造できること 。

単分散性の磁気応答性ポリマー粒子が製造できること。

発明の詳細な説明 本発明の磁性粒子は、先ず約１μｍ以下の平均サイズを有する金属酸化物を製造 することによって調製できる。該金属酸化物は、２価及び３価の金属塩の混合物 、好ましくは硫酸（又は塩化）第−鉄及び第二鉄と水酸化ナトリウムとの混合物 を加熱しそして沈殿させることによって製造される。２価／３価の金属塩のモル 比は、金属酸化物の所望のサイズ及び磁気特性を得るために、０．５乃至２゜０ 、好ましくは０．　５乃至１．０の範囲で変化させることがてきる。２価／３価 の金属塩のモル比は、金属酸化物のサイズに影響する。すなわち、２価／３価の 金属塩のモル比が小さい程、金属酸化物のサイズは小さくなる。２価／３価の金 属塩のモル比はまた、得られる磁性粒子の色にも影響する。すなわち、モル比が 小さい程、得られる磁性粒子の茶色かかった色は明るくなる。強磁性体金属酸化 物も使用できるが、洗浄に際して磁気的分離の代わりに遠心か使用されるのなら 、好ましくは超常磁性体又は常磁性体のいずれかである。マンガン、マグネシウ ム、コバルト、ニッケル、亜鉛及び銅塩のような他の２価の遷移金属塩が、第一 鉄塩に置き換えられることができる。

強磁性体を沈殿させた後、上澄のｐＨが中性となるまで２５ｏ×ｇでの遠心によ り数回洗浄する。金属酸化物を脱イオン水に再懸濁させ、高速で機械的に攪拌し て金属酸化物結晶の凝集物を粉砕する。２５０Ｘｇでの更なる遠心は、金属酸化 物の全てをペレットにすることはないであろう。より小さいサイズの金属酸化物 結晶を含有する上澄を回収し、ペレットは脱イオン水に再懸濁する。この工程を 少なくとも３回、又は殆どの金属酸化物がもはや２５０Ｘｇではペレット化てき な（なるまで繰り返す。この方法で得られる金属酸化物は通常、２．０μｍ未満 のサイズを有する。一層大きい結晶を除去するための１１００Ｘでの低速遠心は 、サイズを０．８μｍ未満まで減少させるであろう。

図１に示したように電子顕微鏡法による試験において、上澄の金属酸化物結晶が 、激しく攪拌したにも拘わらず依然として部分的に凝集していることか明らかで ある。本発明により製造される金属酸化物の顕著な特徴は、最も小さい粒子は、 小さい結晶の房の形態へと、それらを結合している沈殿した無定形の物質と共に 集合しているということである。洗浄及び攪拌工程は該粒子を完全には解離させ ず、それらを無定形の物質によって一つに接着された、集合した小さい結晶の房 の形態のまま、解離することなく残す。このことは、最終の常磁性粒子の調製に おける被覆段階には決定的であるように思われる。なぜなら、均一に且つ完全に 分散された金属酸化物対照粒子は被覆できず、重大な凝集を引き起こす粒子架橋 に寄与するからである。

１．０μｍ以下の平均サイズを有する金属酸化物は、モノマーと混合され、そし て開始剤の存在下、ポリマー性コア粒子、好ましくは、１乃至１００μｍのサイ ズを有するポリスチレン粒子に被覆される。少量の乳化剤の添加は、粒子が凝集 するのを防止するのに役立ってあろう。水相からポリスチレン粒子の表面におい て重合を受けているモノマーの有機相へと、金属酸化物の房状の集合物の移動が 起こる。その結果は、該粒子の表面に同時に被覆されたポリマー中に埋め込まれ た金属酸化物の房状の集合物を含有する、顕著に不均一な、不均一に分布した層 である。この層は、図２ａ及び２ｂに示した断面操作型電子顕微鏡写真に見られ る。驚（ことに、実施例で実証するように、この形状の常磁性粒子は、常磁性層 を有しない同じサイズのポリスチレン粒子に比して、抗原結合に対する異常な能 力を有する。官能基を有する磁性粒子を所望する場合には、生物学的材料の共有 結合的な結合のためのカルボキシル基、アミノ基又はヒドロキシル基のような官 能基を与えるために、官能基を有するポリマーの更なる層で磁性粒子を更に被覆 することができる。図■１１は、本発明に従って調製した、６．８μｍの磁性粒 子の操作車電子顕微鏡写真を示す。図［［［ａは、１０００倍、図１１１ｂは５ ０００倍拡大である。

本発明において有用なポリマー性コア粒子は、小さい粒子の分散として得ること ができ且つモノマーを吸収できてそれによってコア粒子の表面上に金属酸化物と モノマーとの混合物の被覆を引き起こすことのできる、いかなるポリマーよりな るものでもよい。コア粒子はいかなるサイズ及び形状でもよく、好ましくはサイ ズで１′乃至１００μｍ、形状は球状である。単分散性コア粒子が使用された場 合には、得られる磁性粒子もまた、サイズにおいて単分散性であろう。コア粒子 は、乳化重合、懸濁重合又は、ジビニルベンゼンのような架橋剤を含む若しくは 含まない他の重合手段によって得ることができる。コア粒子を調製するために使 用できるモノマーのうちには、スチレン、メタクリル酸メチル、ビニルトルエン その他がある。モノマーの混合物もまた使用できる。磁性金属酸化物被覆又は保 護被覆のために使用されるモノマーは、コア粒子と同じでも同じでなくてもよい 。金属酸化物被覆に用いるモノマーのコア粒子に対する重量比は、所望の金属酸 化物／ポリマー層の厚みに依存して、０．１乃至１２、好ましくは０．２乃至６ であろう。第−鉄及び第二鉄塩の混合物から調製された金属酸化物を被覆に使用 する場合は、約０．１乃至０．５のモノマー／コア粒子の重量比を用いるのが好 ましい。しかしながら、マンガン（ＩＩ）と第二鉄塩との混合物から調製された 金属酸化物を被覆に使用する場合には、モノマーのコア粒子に対する重量比は０ ．１乃至１２であろう。結果として、慣用の存機溶媒に不活性である架橋磁性粒 子を望む場合には、マンガン（＋１）と第二鉄塩との混合物を、２乃至１０重量 ％、好ましくは３乃至１０重量％の架橋剤を含有するモノマーと共に、モノマー ／コア粒子重量比を３乃至１２、好ましくは４乃至６として使用するのが好まし い。金属酸化物／ポリマー被覆に際して一層低いモノマー／コア粒子重量比（す なわち、０．１乃至０．５）が用いられた場合には、磁性粒子の表面に金属酸化 物を更に接着させるために、得られた磁性粒子をポリマー被覆の保護層で保護被 覆するのが好ましい。しかしながら、一層高いモノマー／ポリマー比率（すなわ ち３乃至１２）が用いられた場合には、保護的ポリマー被覆の必要はない。重合 温度は、５０°Ｃ乃至９０°Ｃ１好ましくは５５°Ｃ乃至６５°Ｃであろう。重 合開始剤は、過硫酸カリウム等のように水溶性であっても、又は過酸化ベンゾイ ル等のように水不溶性であってもよい。

放射、イオン化等のような他の重合開始手段もまた使用できる。意外にも、マン ガン（ＩＩ）と第二鉄塩との混合物から調製される金属酸化物を被覆に使用する 場合には、いかなる乳化剤も用いることなく磁性粒子が製造できることが見出さ れている。しかしながら、第−鉄及び第二鉄塩の混合物から調製された金属酸化 物を被覆に用いる場合には、金属酸化物／ポリマーに際して粒子を過度の凝集を 防止するのに、ドデシル硫酸ナトリウム、Ａｅｒｏｓｏｌ　２２、Ｔｗｅｅｎ　 ２０又はＮｏｎ１ｄｅｔ　Ｐ−４０のような乳化剤の少量が、有用であることが 判明している。同じ能力を有する他の乳化剤もまた使用できる。磁性金属酸化物 含量は、金属酸化物／ポリマー被覆に際して異なる量の金属酸乃至２５９６の範 囲で変化させることができる。金属酸化物／ポリマーの多重被覆もまた、金属酸 化物含量を高めるために用いることができる。重合において慣用的に使用される 他の成分もまた、所望の特性を有する磁性粒子を得ることができる限り添加でき る。金属酸化物／ポリマー被覆のための成分は、金属酸化物／ポリマー被覆工程 の最初に一度に加えても、段階的に加えてもよい。第−鉄及び第二鉄塩の混合物 から調製された金属酸化物を使用する場合には、成分を段階的に加えるのが好ま しい。成分は、機械的攪拌、回転又は他の攪拌手段によって、減圧下又はアルゴ ンのような不活性ガス下において混合することかできる。官能基は、金属酸化物 ／ポリマー被覆に際してモノマーと官能基を有するモノマーとの混合物を使用す るか、又は磁性粒子を官能基を有するモノマーの薄層て最後に保護被覆すること により、磁性粒子の表面上に導入することができる。使用される官能基を有する モノマーは、次のうちの一つ又は混合物から選択できる：　メタクリル酸２−ヒ ドロキシエチル、メタクリル酸２−アミノエチル、トリメチルアンモニウムエチ ルメタクリレートメトサルフェート、メタクリル酸ジメチルアミノエチル、メタ クリル酸、ウンデシレン酸、メチルプロペンスルホン酸、ウンデシレンアルコー ル、オレイルアミン、メタクリル酸グリシジル、アクロレイン、グルタルアルデ ヒドその他。磁性粒子はまた、ポリマーの表面特性を取り込むために、金属酸化 物／ポリマー被覆又は保護被覆に使用したのとは異なるポリマーの層で被覆する こともできる。

磁性粒子の用途 蛍光イムノアッセイ、ラジオイムノアッセイ、エンザイムイムノアッセイ、細胞 分離、酵素固定化及びアフィニティー精製のような種々の用途のための固相とし ての広汎な種類の磁性粒子の用途は、以下の論文によって例示されるように文献 において評価されている：　Ｈｉｒｓｈｂｅｉｎ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｃｈｅｍｉ ｃａｌ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、　Ｍａｒｃｈ　１９８２．１７２−１７９　（ １９８２）＋　Ｐｏｕｒｆａｒｚａｎｅｈ、　Ｔｈｅ　Ｌｉｇａｎｄ　Ｑｕａｒ ｔｅｒｌｙ、　５（１）：４１−４７　（１９８２）：　Ｈａｉｌｉｎｇ　ａｎ ｄ　Ｄｕｎｎｉｌｌ、　Ｅｎｚｙｍｅ　Ｍｉｃｒｏｂｅ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ 、　２：２−１０（１９８０）：　Ｍｏ５ｂａｃｈ　ａｎｄ　Ａｎｄｅｒｓｏｎ 、　Ｎａｔｕｒｅ、　２７０：２５９−２６１　（１９７７）：　Ｇｕｅｓｄｏ ｎ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｊ、　Ａｌｌｅｒｇｙ　Ｃ１１ｎｉｃａｌ　Ｉｍｍｕｎｏ ｌｏｇｙ、　６１（１）、　２３−２７（１９７８）、幾つかの用途はまた、酵 素固定化に関して米国特許第４，１５２．２１０号及び４．３４３．９０１号に 、細胞分離に関して米国特許第３．９７０゜５１８号、４．２３０．６８５号及 び４．２６７、２３４号に、イムノアッセイに関して米国特許第４．５５４．０ ８８号、４．７２８．０３７号及び３．９３３．９９７号に開示されている。

磁性粒子によっては、ある用途に有用であるが、他の用途にはそうではない。例 えば、一般的にポリマー性シランによって包まれた超常磁性体金属酸化物コアよ りなる米国特許第４．５５４．０８８号及び４゜６２８、０３７号に開示されて いる磁性粒子は、広い表面積及び一層遅い沈降速度のために、イムノアッセイ及 びアフィニティー精製には有用であろうが、骨髄洗浄のような細胞分離用途には 適当でない。これら２つの特許に開示された磁性粒子の小さいサイズのために、 細胞懸濁液から全ての磁性粒子を効果的に除去するのは非常に困難である。更に 、小さい磁性粒子の正常細胞への非特異的結合は高いてあろう。骨髄洗浄のため の磁性粒子の使用においては、磁性粒子はヒツジ抗マウスＴｇＧのような抗体で 被覆されており、骨髄は、癌細胞表面抗原に対する数種のモノクローナル抗体の 混合物で処理される。磁性粒子は癌細胞にのみ結合し、強力な磁場を通すことに よって、それらを正常細胞から分離するであろう。洗浄された細胞は次いで患者 に戻される。

本発明の方法を使用することにより、磁性粒子は、広汎な各種の生物医学的用途 のために、サイズ、表面積、金属酸化物含量及び表面特性によって至適化される ことができる。本発明によって製造される磁性粒子は、エンザイムイムノアッセ イ、蛍光イムノアッセイ、ラジオイムノアッセイ、ＤＮＡ／ＲＮＡハイブリダイ ゼーションアッセイ、及び他の診断的用途のために固相として使用できる。イム ノアッセイは、当業者に自明の、サンドイッチアッセイ及び競合結合アッセイの ような種々の形態を用いることによって実施できる。ＤＮＡ／ＲＮＡハイブリダ イゼーションもまた、固相ハイブリダイゼーション又は液相ハイブリダイゼーシ ョンのような種々の形態を用いることによって実施できる。固相ハイブリダイゼ ーションの形態ににおいては、ＤＮＡ又はＲＮＡプローブ（キャッチャ−プロー ブ）は、磁性粒子に最初に固定化される。固定化されたキャッチャ−プローブは 、次いてサンプルからのＤＮＡの相補的鎖（サンプルＤＮＡ）とハイブリダイゼ ーションさせるために使用される。最後に、蛍光、放射性又は酵素トレーサーで 標識した、ＤＮＡの他の部分とハイブリダイゼーションできる他のプローブ（シ グナルプローブ）が、シグナル発生のために使用される。液相ハイブリダイゼー ションの形態においては、キャッチャ−プローブ及びシグナルプローブは、サン プルＤＮＡと液相において最初にハイブリダイゼーションさせられ、次いで磁性 粒子に固定化される。

代わりに、シグナルプローブは１つ又は数個のビオチン基で標識され、シグナル は、アッセイの感度を高めるために、アビジン標識した蛍光、放射性又は酵素ト レーサーとビオチン基の結合によって検出される。

イムノアッセイ及びＤＮＡ／ＲＮＡハイブリダイゼーションアッセイは、薬物、 ホルモン、抗体、ペプチド、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ヌクレオチド、ウィルス抗原及び 炭水化物のような、生物学的サンプル中の広汎な各種の化合物を測定するのに使 用することができる。

本発明によって製造される磁性粒子はまた、アフィニティー精製、細胞分離、酵 素固定化及び他の生物医学的用途のために使用することができる。細胞分離にお いては、磁性粒子は、免疫学的反応又は非免疫学的反応によって、望まない細胞 の除去（ネガティブ選択）又は所望の細胞リッチにする（ポジティブ選択）のい ずれにも使用される。この原理は、癌細胞を骨髄細胞から除去しく骨髄洗浄）、 細胞培養のためのポジティブ又はネガティブ選択によって細胞集団を精製し、及 び種々の細胞イムノアッセイを実施する等のために使用できる。アフィニティー 精製においては、磁性粒子は、ポリアクリルアミドゲル、セファロースゲル又は 他のセルロースビーズのような慣用の固相に代えて、抗体、抗原、酵素、阻害因 子、補因子、単鎖ＤＮＡ、結合蛋白質、ハブテン及び炭水化物のような広汎な種 類の生物学的材料の精製のために使用できる。アフィニティー精製に類似の他の 用途においては、磁性粒子は、抗血清又臨床サンプルから望まない蛋白質成分を 交差吸着して除去するために使用できる。酵素固定化においては、酵素は、酵素 活性を保持し固定化された酵素の再使用を許容するように結合する種々の手段に よって、磁性粒子上に固定化される。固定化された酵素を有する磁性粒子は、炭 水化物、アミノ酸及び蛋白質のような広汎な各種の材料を製造するための固定化 酵素システムにおいて慣用的に使用されている、ガラスピーズ、制御されたボア のガラス、シリカゲル及びセルロースビーズのような他の固相に代えて使用でき る。

本発明によって製造される磁性粒子は、産業材料から有害な化学物質、すなわち 有機又は無機の溶媒を除去するために、産業廃棄物の処理のような産業的用途に 使用できる。

これらの用途は、磁性粒子の殆とに共通の分離の容易さ、反応速度の速さ、及び 広い表面積によって能率化される。以下の実施例は、本発明の多能性及び利点を 更に説明するために提示される。その精神及び範囲から外れることなく種々の均 等物、変更及び修正がなし得、そのような均等の具体例はここに含まれることが 意図されているから、その詳細を限定とみなしてはならない。

機械的攪拌機、冷却機、温度計、滴下ロート及び加熱マントルを備えた三つ口丸 底フラスコに、４００ｍｌ！の脱イオン水中の０．３６１ｍｏ　ｌの硫酸第一鉄 と０．３６９ｍｏｌｎｏ硫酸第二鉄との混合物（Ｆｅ″“／Ｆｅ”“比＝１）を 加えた。混合物を攪拌しつつ８５乃至９０℃に加熱し、８５０ｍｌの６Ｎ水酸化 ナトリウムを９０分間かけて滴下した。混合物を８５乃至９０°Ｃにて更に１時 間攪拌し、室温まで冷却した。金属酸化物の沈殿を２５０Ｘｇで１０分間遠心し た。澄んだ上澄をデカンテーションし、機械的攪拌機を用いてペレットを９００ ｍｌの脱イオン水に再懸濁した。この洗浄工程を６回又は上澄が殆ど中性のｐＨ になるまで繰り返した。上澄をデカンテーションし、２００ｍｌの脱イオン水て 再懸濁した。２５０×ｇての更なる遠心は、金属酸化物の全てを沈殿させること はないであろう。一層小さいサイズの金属酸化物結晶を含有する上澄を集め、ベ レットは２００ｍｌの脱イオン水に再懸濁した。この工程を少なくとも３回又は 殆どの金属酸化物がもはや２５０Ｘｇではペレット化しなくなるまで繰り返した 。この方法で得られる金属酸化物は通常２．０μｍ未満のサイズを有する。合わ せた金属酸化物懸濁液を１１００Ｘで１０分間遠心した。上澄を集め８００ｍｌ の８゜６％Ｗ／Ｖの、０．８μｍ未満のサイズを有する磁性金属酸化物懸濁液を 得た。

実施例２ ４００ｍ！！の脱イオン水中の０．２３５ｍｏｌの硫酸第一鉄、０．２９７ｍｏ ｌの硫酸第二鉄（Ｆｅ”／Ｆｅ””　＝０．７９）及び４８０ｍｌ！の６Ｎ水酸 化ナトリウムを使用した以外は、実施例１に記載したのと同じ手順を行い、２０ ００ｍｌ！の２．８６％Ｗ／Ｖの磁性金属酸化物懸濁液を得た。

実施例３ ４００ｍｌの脱イオン水中の０．１７８ｍｏｌの硫酸第一鉄、０．２９８ｍｏｌ の硫酸第二鉄（Ｆｅ”／Ｆｅ””　＝０．５９）及び５２０ｍｌの６Ｎ水酸化ナ トリウムを使用した以外は、実施例１に記載したのと同じ手順を行い、１５００ ｍｌの２．９８％Ｗ／Ｖの磁性金属酸化物懸濁液を得た。

実施例４ ４００ｍＡ’の脱イオン水中の０．１５ｍｏｌの硫酸第一鉄、０゜２７６ｍｏ　 １の硫酸第二鉄（Ｆｅ”／Ｆｅ””　＝０．５４）及び５２０ｍｌの６Ｎ水酸化 ナトリウムを使用した以外は、実施例１に記載したのと同し手順を行い、７００ ｍ１の６，８８％Ｗ／Ｖの磁性金属酸化物懸濁液を得た。

実施例５ ２２５ｍｌの脱イオン水中の０．１１６ｍｏｌの硫酸マンガン、０．１４６ｍｏ ｌの硫酸第二鉄（Ｍｎ”／Ｆｅ””　＝０．７９）及び２４０ｒｙｌの６Ｎ水酸 化ナトリウムを使用した以外は、実施例１に記載したのと同じ手順を行い、１７ ００ｍＩ！の１．８％Ｗ／Ｖの磁性金属酸化物懸濁液を得た。

実施例６ ６００ｍｌの脱イオン水、６ｍｌのスチレン及び実施例１に記載したようにして 調製した８、６％Ｗ／Ｖの磁性金属酸化物の８０ｍ１を含む混合物を密封した瓶 に加えた。瓶を排気し、５５°Ｃのオーブン中にて約６Ｏｒｐｍで１時間回転し た。混合物に１２ｇの過硫酸カリウム及び８５０ｍＩ！の５％ｗ／ｖ、４．０μ ｍポリスチレン粒子を加えた。瓶を再密封し、排気し、１時間回転し、そして５ ０ｍ１の２％ドデシル硫酸ナトリウムを加えた。更に５時間の後、６ｍＩ！のス チレン及び１０ｇの過硫酸カリウムを混合物に加えた。混合物を更に１５時間回 転し、二層にしたチーズ布を通して濾過し、磁気的に分離し、脱イオン水で上澄 が澄明になるまで数回洗浄した。得られた磁性粒子を脱イオン水で１．６１７に 再懸濁し、約１１％の磁性金属酸化物含量と４．３μｍの平均サイズを有する２ 、５％ｗ／ｖの懸濁液を得た。

実施例７ 実施例６に記述したように調製した磁性粒子、２．５％Ｗ／Ｖの１．６１’を、 Ｉｇのドデシル硫酸ナトリウム、１ｏｇの過硫酸カリウム、及びメタノール４ｍ ｌ中に０．９８ｍｆのウンデシレン酸及び０．０２ｍｊ７のジビニルベンゼンを 含有する溶液を加えることによって、カルボキシル化した。混合物を密封した瓶 内に加え、排気し、５５℃のオーブン中において約６Ｏｒｐｍにて５時間回転し た。得られたカルボキシル化された磁性粒子を磁気的に分離し、脱イオン水で上 澄が澄明になるまで数回洗浄した。カルボキシル化された磁性粒子を脱イオン水 で６８０ｍｉ！に再懸濁し、１１％の磁性金属酸化物含量と４．３μｍの平均サ イズを有する５、８％Ｗ／Ｖの懸濁液を得た。

実施例８ ６００ｍｌの脱イオン水、６ｍｌのスチレン及び実施例１に記載したようにして 調製した８、６％Ｗ／Ｖの磁性金属酸化物の８０ｍ１を含む混合物を密封した瓶 に加えた。瓶を排気し、５５°Ｃのオーブン中にて約６Ｏｒｐｍで１時間回転し た。混合物に１２ｇの過硫酸カリウム及び８５０ｍｌ！の４．７８％ｗ／ｖ、６ ．１μｍポリスチレン粒子を加えた。瓶を再密封し、排気し、５時間回転し、そ し６ｍｌのスチレン及び１０ｇの過硫酸カリウムを混合物に加えた。

混合物を更に１５時間回転し、二層にしたチーズ布を通して濾過し、磁気的に分 離し、脱イオン水で上澄が澄明になるまで数回洗浄した。得られた磁性粒子を脱 イオン水で１．５ｆに再懸濁し、そしてＩｇのドデシル硫酸ナトリウム、１０ｇ の過硫酸カリウム、及び４ｍｌのメタノール中０．９８ｍＩ！のウンデシレン酸 、及び０．０２ｍ！のジビニルベンゼンを含有する溶液を加えることによってカ ルボキシル化した。混合物を密封した瓶内に加え、排気し、５５°Ｃのオーブン 中において約６　Ｏｒ　ｐｍにて５時間回転した。得られたカルボキシル化され た磁性粒子を磁気的に分離し、脱イオン水て上澄が澄明になるまで数回洗浄した 。カルボキシル化された磁性粒子を脱イオン水で８００ｍｆ！に再懸濁し、１１ ．６％の磁性金属酸化物含量と６．８μｍの平均サイズを有する４、３％Ｗ／Ｖ の懸濁液を得た。

実施例９ ６００ｍｌの脱イオン水、６ｍ！！のスチレン及び実施例１に記載したようにし て調製した８、６％Ｗ／Ｖの磁性金属酸化物の６０ｍ１を含む混合物を三つ日丸 底フラスコに加え、アルゴン下６７°Ｃにて１時間攪拌した。混合物に１２ｇの 過硫酸カリウム及び４７０ｍ１の５％ｗ／ｖ、２．７μｍポリスチレン粒子を加 えた。混合物を６７°Ｃにて１時間攪拌し、そして３０ｍｌの２％ドデシル硫酸 ナトリウムを加えた。アルゴン下６７°Ｃにて更に５時間攪拌の後、６ｍｌのス チレン及び６ｇの過硫酸カリウムを混合物に加えた。アルゴン下混合物を６７° Ｃにて更に１５時間回転し、二層にしたチーズ布を通して濾過し、磁気的に分離 し、脱イオン水で上澄が澄明になるまで数回洗浄した。得られた磁性粒子を脱イ オン水で９００ｍｌに再懸濁し、そして０．６ｇのドデシル硫酸ナトリウム、１ ０ｇの過硫酸カリウム、及び２．４ｍｌのメタノール中０．５９８ｍｊ７のウン デシレン酸、及び０．０１２ｍ１のジビニルベンゼンを含有する溶液を加えるこ とによってカルボキシル化した。混合物を密封した瓶内に加え、排気し、５５° Ｃのオーブン中において約６　Ｏｒ　ｐｍにて５時間回転した。得られたカルボ キシル化された磁性粒子を磁気的に分離し、脱イオン水で上澄が澄明になるまで 数回洗浄した。カルボキシル化された磁性粒子を脱イオン水で５００ｍｌに再懸 濁し、約１４％の磁性金属酸化物含量と４．０μｍの平均サイズを有する６、５ ％ｗ／ｖの懸濁液を得た。

実施例１０ ６００ｍｌの脱イオン水、６ｍｌのスチレン及び実施例１に記載したようにして 調製した８、６％Ｗ／Ｖの磁性金属酸化物の６０ｍ１を含む混合物を密封した瓶 に加えた。瓶を排気し、５５°Ｃのオーブン中にて約６０ｒｐｍで１時間回転し た。混合物に１２ｇの過硫酸カリウム及び４７０ｍＡの５％ｗ／ｖ、２．７μｍ ポリスチレン粒子を加えた。瓶を再密封し、排気し、１時間回転し、そして３０ ｍ１の２％ドデシル硫酸ナトリウムを加えた。更に５時間の後、６ｍｌのスチレ ン及びｌｏｇの過硫酸カリウムを混合物に加えた。混合物を更に１５時間回転し 、二層にしたチーズ布を通して濾過し、磁気的に分離し、脱イオン水て上澄が澄 明になるまで数回洗浄した。得られた磁性粒子を脱イオン水で５００ｍｆ！に再 懸濁して約１４％の磁性金属酸化物含量と４．０μｍの平均サイズを有する６、 ８％ｗ／ｖの懸濁液を得た。

実施例１１ １８０ｍｌの脱イオン水、２ｍｌのスチレン及び実施例１に記載したようにして 調製した８、６％Ｗ／Ｖの磁性金属酸化物の２０ｍ１を含む混合物を密封した瓶 に加えた。瓶を排気し、５５°Ｃのオーブン中にて約６０ｒｐｍで１時間回転し た。混合物に４ｇの過硫酸カリウム及び、実施例１０に記載したようにして調製 した１６０ｍ１の６．８％ｗ／ｖの磁性粒子（３，０μｍ１金属酸化物含量１４ ％）を加えた。瓶を再密封し、排気し、１時間回転し、そして１゜ｍｌの２％ド デシル硫酸ナトリウムを加えた。更に５時間の後、２ｍ１ｌのスチレン及び２ｇ の過硫酸カリウムを混合物に加えた。混合物を更に１５時間回転し、二層にした チーズ布を通して濾過し、磁気的に分離し、脱イオン水で上澄が澄明になるまで 数回洗浄した。

得られた磁性粒子を脱イオン水で１６０ｍｊ’に再懸濁して約１９％の金属酸化 物含量と４．２μｍの平均サイズを有する７、７８％Ｗ／Ｖの懸濁液を得た。

実施例１２ ９０ｍｊ７の脱イオン水、ｌｎｌのスチレン及び実施例１に記載したようにして 調製した８、６％Ｗ／Ｖの磁性金属酸化物の１０ｍＩ！を含む混合物を密封した 瓶に加えた。瓶を排気し、５５°Ｃのオーブン中にて約６０ｒｐｍで１時間回転 した。混合物にＩｇの過硫酸カリウム及び、実施例１１に記載したようにして調 製した８０ｍ１の７．７８％ｗ／ｖの磁性粒子（３，２μｍ、金属酸化物含量１ ９％）を加えた。瓶を再密封し、排気し、４時間回転し、そして５ｍｊ７の２％ ドデシル硫酸ナトリウムを加えた。更に５時間の後、１ｍ！！のスチレン及び１ ｇの過硫酸カリウムを混合物に加えた。混合物を更に１５時間回転し、二層にし たチーズ布を通して濾過し、磁気的に分離し、脱イオン水て上澄が澄明になるま で数回洗浄した。得られた磁性粒子を脱イオン水て１６０ｍｌに再懸濁して約２ ３％の金属酸化物含量と４．５μｍの平均サイズを有する４、５％Ｗ／Ｖの懸濁 液を得た。

実施例１３ ４００ｍｌの脱イオン水、１．９２ｍｊ７のスチレン、０．０８ｍ１のジビニル ベンゼン、４ｇの過硫酸カリウム、２０ｇの２００−４００メツシユの４％ジビ ニルベンゼン架橋ポリスチレンビーズ及び、実施例１に記載したようにして調製 した１　０ｍｊ７の８．６％Ｗ／Ｖ磁性金属酸化物を含有する混合物を、密封し た瓶内に加えた。

瓶を排気し、５５°Ｃのオーブン内にて約６Ｏｒｐｍにて１５時間回転した。混 合物を沈降させ、上澄をデカンテーションした。得られた磁性ビーズを脱イオン 水２００ｍｌ中に再懸濁し、再度沈降させた。上澄が澄明となるまでこの工程を 数回繰り返した。得られた磁性ビーズを脱イオン水２００ｍｌ中に再懸濁し、０ ．１ｇのドデシル硫酸ナトリウム、２．０ｇの過硫酸カリウム、０．４８ｍｊ！ のスチレン及び０．０２ｍＩ！のジビニルベンゼンを加えた。瓶を再密封し、排 気し、５５°Ｃのオーブン中にて約６Ｏｒｐｍで１時間回転し、そして、０．　 ４ｍｉ！のメタノール中０．０９８ｍ１７のウンデシレン酸と０．００２ｍ１７ のジビニルベンゼンを含有する溶液を加えた。混合物を更に４時間回転し、前述 のように重力にょる沈降によって澄明化させた。濾過により水を除き、カルボキ シル化されたビーズを乾燥して、２０ｇの２００−４００メツシユのカルボキシ ル化された磁性ビーズを得た。

実施例１４ １００ｍ１ｌの脱イオン水、０．５ｍｌのスチレン、２ｇの過硫酸カリウム、７ ５ｍｊ！の５％Ｗ／Ｖの４．　０μｍポリスチレン粒子及び、実施例４に記載し たと同様にして調製した１０ｍｆの６．８８％Ｗ／Ｖ磁性金属酸化物を、密封し た瓶内に加えた。瓶を排気し、５５°Ｃのオーブン内にて約６Ｏｒｐｍにて１５ 時間回転した。混合物を、二層にしたチーズ布を通して濾過し、磁気的に分離し 、脱イオン水て上澄が澄明になるまで数回洗浄した。得られた磁性粒子を脱イオ ン水て１５０ｒｎｌに再懸濁して、約１４％の金属酸化物含量と４．３μｍの平 均サイズを有する２　５％Ｗ／Ｖの懸濁液を得た実施例４に記載されたと同様に して調製された２　０ｍｉ？の６．８８％ＣＶ／Ｖの磁性金属酸化物を使用した 以外は実施例４に記載したと同し手順を行い、約１８％の金属酸化物含量と４３ μｍの平均サイズを有する２、５％ｗ／ｖの懸濁液１６０ｍｌを得た。

実施例１６ ２０００ｍｌの脱イオン水、１３ｍ１のスチｌノン及び実施例３に記載したよう にして調製した２、９８％Ｗ／Ｖの磁性金属酸化物の５５０ｍｌ！を含む混合物 を密封した瓶に加えた。瓶を排気し、５５°Ｃのオーブン中にて約６Ｏｒｐｍで １時間回転した。混合物に２０ｇの過硫酸カリウム及び９５０ｍｊ？のｉｏ％ｗ ／ｖ、３．０１ｔｍのポリスチレン粒子を加えた。瓶を再密封し、排気し、１時 間回転し、そして６０ｍ１）の２％ドデシル硫酸ナトリウムを加えた。更に５時 間の後、８ｍｆのスチレン及び１０ｇの過硫酸カリウムを混合物に加えた。混合 物を更に１５時間回転し、二層にしたチーズ布を通して濾過し、磁気的に分離し 、脱イオン水で上澄が澄明になるまで数回洗浄した。得られた磁性粒子を脱イオ ン水で３０００ｍＩ！に再懸濁して約１２％の磁性金属酸化物含量と３．２μｍ の平均サイズを有する３、３８％Ｗ／Ｖの懸濁液を得た。

実施例１７ 実施例１６に記載のようにして調製した１　５０ｍｌの磁性粒子（３，２μｍ、 ３．３８％ｗ／ｖ、磁性金属酸化物含量１２％）、２ｍｌの１％ＮＰ４０，０． ５ｍｊ７のメタクリル酸メチル又はスチレン、１ｇの過硫酸カリウム、及び２ｍ ｌの官能基を有するモノマーすなわちトリメチルアンモニウムエチルメタクリレ ートメトサルフェート（４０％水性溶液）を含有する混合物を、密封した瓶に加 えた。瓶を５５°Ｃのオーブン中にて約６Ｏｒｐｍで４時間回転した。

混合物を、二層にしたチーズ布を通して濾過し、磁気的に分離し、脱イオン水で 上澄が澄明になるまで数回洗浄した。得られた磁性粒子を脱イオン水２００ｍｌ ！で再懸濁して、トリメチルアンモニウム官能基を表面上に有する磁性粒子の２ ．５％Ｗ／Ｖの懸濁液を得た官能基を有するモノマーであるメタクリル酸２−ア ミノエチルの１ｍｌを使用した以外は実施例１７に記載したと同じ手順を行い、 アミノ基を表面上に有する磁性粒子の２．５％Ｗ／Ｖの懸濁液２゜ＯｍＩ！を得 た。

実施例１９ 官能基を有するモノマー、メタクリル酸２−ヒドロキシエチルの１ｍｌを使用し た以外は実施例１７に記載したと同じ手順を行い、ヒドロキシル基を表面上に有 する磁性粒子の２．５％Ｗ／Ｖの懸濁液２００ｍｌを得た。

実施例２０ モノマー、ｌ−ビニル−２−ピロリジノンの１ｍｆを使用した以外は実施例１７ に記載したと同じ手順を行い、ポリビニルピロリジノンを表面上に有する磁性粒 子の２．５％Ｗ／Ｖの懸濁液２００ｍ１を得た。

実施例２１ 官能基を有するモノマー、メチルプロペンスルホン酸のＩｇを使用した以外は実 施例１７に記載したと同じ手順を行い、スルホン酸ニーを表面上に有する磁性粒 子の２．５％Ｗ／Ｖの懸濁液２００ｒｎｊ）官能基を有するモノマー、メタクリ ル酸ジメチルアミノエチルの’、ｍｊ７を使用した以外は実施例１７に記載した と同じ手順を行い、ジメチルアミノ基を表面上に有する磁性粒子の２．５％Ｗ／ Ｖの懸濁液２００ｍＡを得た。

実施例２３ ２０ｍｊｌ’の７．０％ｗ／ｖ、２．１１μｍのポリスチレン粒子、実施例５に 記載したようにして調製した１、８％Ｗ／Ｖの金属酸化物の１００ｍ１ｌ、５０ ｍＡの脱イオン水及び、７．　５ｍＡのスチレン中に０．１５ｇの過酸化ベンゾ イルを含む溶液を含有する混合物を、密封した瓶内にいれた。瓶を排気し、５５ °Ｃのオーブン中にて約６０ｒｐｍで１５時間回転した。混合物を、二層にした チーズ布を通して濾過し、磁気的に分離し、脱イオン水で上澄か澄明になるまで 数回洗浄した。得られた磁性粒子を脱イオン水で２００ｍＡに再懸濁して約１６ ．８％の金属酸化物含量と３．６μｍの平均サイズを有する５、０％Ｗ／Ｖの懸 濁液を得た。

実施例２４ ２０ｍ１の７．０％ｗ／ｖ、２．１１μｍのポリスチレン粒子、実施例５に記載 したようにして調製した１、８％Ｗ／Ｖの金属酸化物の１００ｒｒｌ、５０ｍＡ の脱イオン水及び、６．７５ｍ１のスチレン中に０．１５ｇの過酸化ベンゾイル と０．７５ｍｊ’のジビニルベンゼンとを含む溶液を含有する混合物を、密封し た瓶内にいれた。瓶を排気し、５５°Ｃのオーブン中にて約６Ｏｒｐｍで１５時 間回転した。混合物を、二層にしたチーズ布を通して濾過し、磁気的に分離し、 脱イオン水で上澄が澄明になるまで数回洗浄した。得られた架橋された磁性粒子 を脱イオン水で２００ｍＡに再懸濁して約１６．８％の金属酸化物含量と３．６ μｍの平均サイズを有する５゜０％Ｗ／Ｖの懸濁液を得た。こうして調製された 架橋磁性粒子は、サイズが均一であり、アセトン、アセトニトリル及びジメチル ホルムアミドのような通常の有機溶媒に対して不活性であることが判明した。

実施例２５ ２０ｍＩ！の７，０％ｗ／ｖ、２．１１ａｍのポリスチレン粒子、実施例５に記 載したようにして調製した１、８％Ｗ／Ｖの金属酸化物の１５０ｍＡ、５０ｍＡ の脱イオン水及び、６．７５ｍＩ！のスチレン中に０．１５ｇの過酸化ベンゾイ ルと０．７５ｍ１７のジビニルベンゼンとを含む溶液を含有する混合物を、密封 した瓶内にいれた。瓶を排気し、５５℃のオーブン中にて約６Ｏｒｐｍで１５時 間回転した。混合物を、二層にしたチーズ布を通して濾過し、磁気的に分離し、 脱イオン水で上澄が澄明になるまで数回洗浄した。得られた架橋された磁性粒子 を脱イオン水で２００ｍＩ！に再懸濁して約２３％の金属酸化物含量と４．０μ ｍの平均サイズを有する５、４％Ｗ／Ｖの懸濁液を得た。こうして調製された架 橋磁性粒子は、サイズが均一であり、アセトン、アセトニトリル及びジメチルホ ルムアミドのような通常の有機溶媒に対して不活性であることが判明した実施例 ２６ １５ｍ１の９，１６％ｗ／ｖ、３．２μｍのポリスチレン粒子、実施例５に記載 したようにして調製した１、８％Ｗ／Ｖの金属酸化物の１００ｍＡ、５５ｍＡの 脱イオン水及び、６．７５ｍｆｆのスチレン中にＯ，１５ｇの過酸化ベンゾイル と０．　７５ｒｒｌのジビニルベンセンとを含む溶液を含有する混合物を、密封 した瓶内に加えた。瓶を排気し、５５°Ｃのオーブン中にて約６Ｏｒｐｍで１５ 時間回転した。混合物を、二層にしたチーズ布を通して濾過し、磁気的に分離し 、脱イオン水で上澄が澄明になるまで数回洗浄した。得られた架橋された磁性粒 子を脱イオン水で２００ｍＡに再懸濁して約１６．８％の金属酸化物含量と５． ５μｍの平均サイズを有する４゜７％Ｗ／Ｖの懸濁液を得た。こうして調製され た架橋磁性粒子は、サイズが均一であり、アセトン、アセトニトリル及びジメチ ルホルムアミドのような通常の有機溶媒に対して不活性であることが判明した。

実施例２７ ３０ｍ１の４．５％ｗ／ｖ、４．Ｌｕｍのポリスチレン粒子、実施例５に記載し たようにして調製した１、８％Ｗ／Ｖの金属酸化物の１００ｍＡ、４０ｍＩ！の 脱イオン水及び、６．７５ｍＩ！のスチレン中に０．１５ｇの過酸化ベンゾイル と０．７５ｍｊ７のジビニルベンセンとを含む溶液を含有する混合物を、密封し た瓶内に加えた。

瓶を排気し、５５°Ｃのオーブン中にて約６０ｒｐｍで１５時間回転した。混合 物を、二層にしたチーズ布を通して濾過し、磁気的に分離し、脱イオン水て上澄 が澄明になるまで数回洗浄した。得られた架橋された磁性粒子を脱イオン水で２ ００ｍｊ７に再懸濁して約１６．９％の金属酸化物含量と６．７μｍの平均サイ ズを育する４、５％Ｗ／Ｖの懸濁液を得た。こうして調製された架橋磁性粒子は 、サイズが均一であり、アセトン、アセトニトリル及びジメチルホルムアミドの ような通常の有機溶媒に対して不活性であることか判明した。

実施例２８ ２０ｍＡの７．０％ｗ／ｖ、２．１１μｍのポリスチレン粒子、実施例５に記載 したようにして調製した１、８％Ｗ／Ｖの金属酸化物の１００ｍ！！、５０ｍＡ の脱イオン水及び、６ｍＡのスチレン中にＯ，１５ｇの過酸化ベンゾイルと０゜ ７５ｍ１７のランデシレニルアルコールと０．７５ｍｆのジビニルベンゼンとを 含む溶液を含有する混合物を、密封した瓶内に加えた。瓶を排気し、５５°Ｃの オーブン中にて約６Ｏｒｐｍで１５時間回転した。混合物を、二層にしたチーズ 布を通して濾過し、磁気的に分離し、脱イオン水で上澄が澄明になるまで数回洗 浄した。得られた架橋された、ヒドロキシル基を有する磁性粒子を濾過し乾燥し て、１６．８％の金属酸化物含量と３．９μｍの平均サイズを有する９ｇの粉末 を得た。こうして調製された架橋された、ヒドロキシル基を有する磁性粒子は、 サイズが均一であり、アセトン、アセトニトリル及びジメチルホルムアミドのよ うな通常の有機溶媒に対して不活性であることが判明した８　０ｍＡの瓶に、実 施例７に記載したようにして調製した３０ｍ２の４．３μｍ、５．０％Ｗ／Ｖの カルボキシル磁性粒子を加えた。粒子を磁気的に分離し、５０ｍｆｆ１のリン酸 緩衝液（０，１Ｍ、ｐＨ５，５）に再懸濁した。懸濁液に、２０ｍｇのウシ血清 アルブミン及び１０９０ｍｇの１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル ）−カルボジイミド（ＥＣＤ）を加えた。混合物を端から端へと室温にて２時間 回転させそして磁気的に分離した。粒子を８０ｍ１のリン酸緩衝液で一回洗浄し 、リン酸緩衝食塩水（０，１Ｍ、　ｐＨ７，０）で７５ｍ１に再懸濁し、２．０ ％ｗ／ｖの懸濁液を得たウシ血清アルブミンを磁性粒子に受動的吸着によって結 合させるためには、ＥＤＣを使用しない以外は同じ手順を行った。

実施例３０ ４ｍ１のバイアルに、実施例７に記載したようにして調製した１ｍｊ７の４．３ μｍ、５．０％Ｗ／Ｖのカルボキシル磁性粒子を加えた。粒子を磁気的に分離し 、２ｍｌのリン酸緩衝液（０，１Ｍ、　ｐＨ５，５）で１回洗浄し、同じ緩衝液 で２ｍｌに再懸濁した。粒子懸濁液に、１４０ｍｌの１．４ｍｇ／ｍＩ！のヤギ （Ｇｔ）抗マウス（Ｍｓ）ＩｇＧ及び１０ｍｇの１−エチル−３−（３−ジメチ ルアミノプロピル）−力ルポジイミド（ＥＣＤ）を加えた。バイアルを端から端 へと室温にて２時間回転させた。粒子を磁気的に分離し、２ｍＩ！のリン酸緩衝 液で１回洗浄し、リン酸緩衝食塩水（０，１Ｍ、ｐＨ７，０）で２ｍｌに再懸濁 し、２，５％ｗ／ｖのヤギ抗マウスＩｇＧ被覆磁性粒子を得た。他の種類の、モ ノクローナルな又はポリクローナルな抗体もまた、同じ手順を用いてカルボキシ ル磁性粒子に結合させることかできよう。

ヤギ抗マウスＩｇＧ又は他の種類の抗体を磁性粒子に受動的吸着によって結合さ せるためはに、ＥＤＣを使用しない以外は同じ手順を行った。

実施例３１ ４ｍｊ７の瓶バイアルに、実施例２９に記載したようにして調製した２、５ｍｊ ７のウシ血清アルブミン被覆磁性粒子（４，３μｍ１２％Ｗ／Ｖ）を加えた。粒 子を磁気的に分離し、２ｍｌのリン酸緩衝液（０，１Ｍ、ｐＨ５，５）ｔ：再懸 濁した。混合物に、１０μｆ（７）マウス抗Ｂ赤血球表面抗原（２０ｍｇ／ｍｌ ）及び１ｍｇの１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）−カルボジイ ミドを加えた。混合物を端から端へと室温にて２時間回転させた。粒子を磁気的 に分離し、リン酸緩衝液で１回洗浄し、リン酸緩衝食塩水（０，１Ｍ、ｐＨ７， ０）で２ｍｌに再懸濁し、２．５％ｗ／ｖの懸濁液を得た。

実施例３２ ４０μ！のマウス抗Ａ赤血球表面抗原（５ｍｇ／ｍＡ’）を使用した以外は実施 例３１に記載した手順を行い、２ｍｉ！の２．５％Ｗ／Ｖの懸濁液を得た。

Ａと表示した５ｍｍｘ６５ｍｍの試験管に、実施例３２に記載したようにして調 製した２５μｌの２．５％Ｗ／Ｖのマウス抗Ａ被覆磁性粒子を加えた。Ｂと表示 した他の試験管に、実施例３１に記載したようにして調製した２５μ！の２．５ ％Ｗ／Ｖのマウス抗Ｂ被覆磁性粒子を加えた。双方の試験管に、パック赤血球を 等張緩面食塩水で１／１００に希釈することによって調製した５０μｌの１％の バック赤血球を加えた。指で軽くたたくことによって試験管を振り、磁石の上に 置いた。結果は以下に要約した。

血液型 Ａ　Ｂ　ＯＡＢ 試験管Ａ　＋−−＋ 試験管Ｂ　−＋−十 ここに、＋は陽性反応を表し、対応する抗体被覆磁性粒子によって赤血球が膠着 し、結果として磁気分離の後に試験管中の上澄か澄明になったことを意味する。

他方、陰性反応の上澄は、赤血球と抗体被覆磁性粒子との間の膠着がないため、 磁気分離の後も濁ったままである。

磁性粒子を使用したイムノアッセイ 実施例３４ ２ｍ１のミクロ遠心管内に１ｍｊ？の６％Ｗ／Ｖの３μｍカルボキシル磁性粒子 を加えた。粒子を１１０００Ｏｒｐで３分間遠心した。上澄を吸引し、粒子は酢 酸緩衝液中の５乃至１００μｌ／ｍｅの組換えＨＢｃＡｇの１ｍｌと攪拌するこ とにより再懸濁させた。管を室温にて２時間回転させ、前述のように遠心した。

上澄を吸引し、粒子は酢酸緩衝剤及び２乃至１０％の正常動物血清を含有する保 護被覆溶液の１ｍｆ中に再懸濁させた。管を室温にて２乃至１６時間回転させ、 前述のように遠心した。上澄を吸引し、粒子は、遠心及び再懸濁により１ｍＩ！ の等張緩面食塩水（ＩＢＳ）で３回洗浄した。最後に、粒子を１ｍｊ？のＩＢＳ に再懸濁させ、２乃至８°Ｃに貯蔵した。

実施例３５ ９６ウエルのミクロタイタープレートの最初の２列に、実施例３４に記載したよ うにして調製した０、２５％Ｗ／ＶのＢ型肝炎コア抗原（ＨＢｃＡｇ）被覆磁性 粒子２０μｌを加えた。サンプル調製は、ＨＢｃＡｂ陽性血清の陰性血漿中への 種々の希釈、次いで各サンプルの原本希釈緩衝液（ＳＤＢ）中へのｌ　：　１０ ０希釈より構成された。ＳＤＢは、リン酸緩衝液、蛋白質安定化剤、界面活性剤 及び抗菌剤を含んだ。粒子を含有するウェルに、５０μ！の各最終希釈サンプル を加えた。３７°Ｃにおける３０分間のインキュベーションの後、磁気分離機上 で粒子を２分間分離し、塩類及び界面活性剤を含有する２００μｌの洗浄緩衝液 で３回洗浄した。粒子を含有する各ウェルに、塩類、蛋白質安定化剤、グリセロ ール、界面活性剤及び抗菌剤を含有する希釈剤中のヤギ抗ヒトＩｇＧ−β−Ｄ− ガラクトシダーゼ接合体（０，５μｇ／ｍｌ）の５０μｌを加えた。３７°Ｃに て１５分間インキュベーションした後、上述のように粒子を分離して３回洗浄し 、そして３０μβのＩＢＳに再懸濁させた。粒子を黒色ミクロタイタープレー） 　（Ｄｙｎａｔｅｅｈ）の最初の２列に移し替えた。粒子を含有する各ウェルに 、４−メチルウンベリフェリル−β−ガラクトピラノシド（ＭＵＧ、　Ｓｉｇｍ ａ）を含有する溶液１００μｌを加えた。プレートを３７°Ｃにてインキュベー トし、３６５ｎｍの励起及び４５０ｎｍの放射フィルターを備えたＦｌｕｏｒｅ ｓｃｅｎｃｅ　Ｃａｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ　Ａｎａｌｙｚｅｒ　（ＦＣＡ、　 Ｐａｎｄｅｘ）を用い、５分間隔で１０倍利得に設定して、蛍光強度を測定した 。５分間隔ての蛍光強度の増大は任意蛍光単位（ＡＦＵ）で記録し、表１に示し た。

表１ 陽性標本の希釈　ＡＦＵ　（５分） ２個のウェルの平均 １：１００　２２６８７ １　：　１０００　５９３３ １：５０００　１５１６ １：８０００　８３５ １：１００００　６３９ １　：１５０００　４９５ １：２００００　４２７ １：２５０００　３０７ 実施例３６ −７ウス抗ＨＢｓＡｇのカルボキシル磁性粒子への結合実施例３０と同様であっ た。

９６ウエルの黒色ミクロタ・イタ−ブレー）　（Ｄｙｎａｔｅｃｈ）に、実施例 ３４に記載したようにして調製した０、２５％ｗ／ｖ、３．２μｍのマウス抗Ｈ Ｂ　ｓ　Ａ　ｇ被覆カルボキシル磁性粒子の２０μｌを２検体ずつ加えた。磁性 粒子を含有するウェルに、種々の量のＨＢｓＡｇを含有する血漿又はＨＢｓＡｇ 陰性血漿１００μｌをそのまま加えた。３７°Ｃにおける３０分間のインキュベ ーションの後、磁気分離機トて粒子を２分間分離し、塩類及び界面活性剤を含有 する１００μｌの洗浄緩衝液で１回洗浄した。粒子を含有する各ウェルに、塩類 、蛋白質安定化剤、グリセロール、界面活性剤及び抗菌剤を含有する希釈剤中の マウス抗ＨＢｓＡｇ−β−ガラクトシダーゼ接合体（０，５μｇ／ｍ１）の２０ 　μｍを加えた。３７°Ｃにて１５分間インキュベーションした後、上述のよう に粒子を分離して５回洗浄した。粒子を含有する各ウェルに、４−メチルウンベ リフェリル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド（ＭＵＧ、　Ｓｉｇｍａ）を含有する 溶液５０μｌを加えた。プレートを３７℃にてインキュベートし、３６５ｎｍの 励起及び４５０ｎｍの放射フィルターを備えたＦｌｕｏｒｅｓｅｅｎｃｅ　Ｃｏ ｎｅｅｎｔｒａｔｉｏｎ　Ａｎａｌｙｚｅｒ　（ＦＣＡ、　Ｐａｎｄｅｘ）を用 い、５分間隔で１０倍利得に設定して、蛍光強度を測定しｔ−０５５分間隔の蛍 光強度の増大は任意蛍光単位（ＡＦＵ）で記録し、表２に示した。

表２ ＨＢｓＡｇ濃度　ＡＦＵ　（５分） （ｎｇ）　２個のウェルの平均 １．０　１１４９ ０．５　４５５ ０．２５　２１８ ０．１２５　１１８ 陰性　１４ 実施例３７ ＨＴＬＶ−［１［Ｂ／Ｈ−９細胞（Ｇａｌｌｏ　５ｔｒａｉｎ）からのＨＩＶ− １抗原を、３．６μｍカルボキシル磁性粒子に実施例３４に記載したと類似の手 順により結合させた。

９６ウエルのミクロタイタープレートに、０．２５％ｗ／ｖのＨＩＶ被覆磁性粒 子の２０μｌを２検体ずつ加えた。粒子を含有するウェルに、リン酸緩衝剤、蛋 白質安定化剤、界面活性剤及び抗菌剤を含有する標本希釈緩衝液（ＳＤＢ）で１ ：１００に希釈した、陽性、ボーダーライン及び陰性の標本５０μｌを加えた。

３７°Ｃにおける３０分間のインキュベーションの後、磁気分離機上で粒子を２ 分間分離し、塩類及び界面活性剤を含有する１００μｌの洗浄緩衝液で３回洗浄 した。粒子を含有する各ウェルに、塩類、蛋白質安定化剤、グリセロール、界面 活性剤及び抗菌剤を含有する希釈剤中のヤギ抗ヒトβ−ガラクトシダーゼ（約０ ．５μｇ／ｍ　ｌ　）接合体の５０μ！を加えた。３７°Ｃにて１５分間インキ ュベーションした後、上述のように粒子を４回洗浄した。粒子を黒色のミクロタ イタープレート（Ｄｙｎａｔｅｃｈ）に移し替えた。粒子を含有する各ウェルに 、４−メチルウンベリフェリル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド（ＭｔｌＧ、Ｓｉ ｇｍａ）を含有する溶液１００μｌを加えた。プレートを３７°Ｃにてインキュ ベートし、３６５　ｎｍの励起及び４５０　ｎｍの放射フィルターを備えたＦｌ ｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ　Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ　Ａｎａｌｙｚｅｒ　（Ｆ ＣＡ、　Ｐａｎｄｅｘ）を用い、５分間隔て２５倍利得に設定して、蛍光強度を 測定した。５分間隔での蛍光強度の増大は任意蛍光単位（Ａ　Ｆ　Ｕ）で記録し 、表３に示した。

表３ 抗ＨＩＶ標本　ＡＦＵ　（５分） ２個のウェルの平均 陽性対照　９４６２ ボ一ダーライン標本　５２７ 陰性対照　８６ 実施例７に記述したようにして調製した４、３μｍのカルボキシル磁性粒子をリ ン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ、ｐＨ７，７）中で洗浄し超音波処理し、７０％エタノ ールで１０分間滅菌し、ＰＢＳで３回洗浄し、アフィニティー精製した０、５ｍ ｇ／ｍβそして３．３ｍｇ／ｌｏｏｍｇ粒子の比率のヒツジ抗マウスイムノグロ ブリン抗体（ＳＡＭ）と共に４°Ｃにてインキュベートした。使用前に、該抗体 被覆磁性粒子をＰＢＳで洗浄し、ＰＢＳに所望の濃度に再懸濁させた。

ヒト組織培養ｃＡＬＬａ陽性ＮＡＬＭ−１６白血病細胞を洗浄しＰＢＳに懸濁さ せた。一つの画分は抗体で処理しなかった（−ＭｏＡｂ）。他の両分は２つの抗 ＣＤｌ０及び１つのＣＤ９モノクローナル抗体で（＋ＭｏＡｂ）４°Ｃにて３０ 分間処理し、ＰＢＳ中で洗浄し、ＰＢＳで３．５ＸＩＯ’個／ｍＩ！に調整した 。、一方は抗体処理細胞を（＋ＭｏＡｂ）含み、他方は無処理細胞（−ＭｏＡｂ ）を含むものである２本の管に、ＳＡＭ被覆磁性粒子を、粒子の開始時細胞に対 する比率を４５として加えた。管を４°Ｃにて３０分間回転させた。

粒子を磁気分離機で分離した。上澄を収集し、残存細胞を収集するために遠心し た。ペレットを１００μｌのトリパンブルー中に再懸濁させ、層細胞数をカウン トした。結果を表４に示した。

表４ 粒子／　細胞　受取られた 細胞比　＋／−ＭｏＡｂ　細胞　％消費０　＋　７．６２ＸｌＯ’　Ｏ（対照） ４５　＋　２．８９ｘｌＯ’　９６．２４５　７．３３Ｘ１０’　４．６ 実施例３９ 本発明の常磁性粒子を市販の粒子と次の通りに比較した。

Ｐｆａｌｔｓ　＆　Ｂａｕｅｒ、第一鉄第二鉄酸化物懸濁液平均サイズ＝　２μ ｍ未満、ｐＨ７； Ｐｆａｌｔｓ　＆　Ｂａｕｅｒ、第一鉄第二鉄酸化物懸濁液平均サイズ、　２μ ｍ未満、ｐＨ１１；Ｆｅｒｒｏ　Ｆｌｕｉｄｅｓ、鉄酸化物懸濁液平均サイズ＝ 　１μｍ未満。

６４ｍｊ７の脱イオン水、３２ｍｆの３．０％ｗ／ｖ磁性金属酸化物、及び１． 　０ｍｊ！のスチレンを含有する混合物を、密封した瓶中に加えた。瓶を排気し 、６０°Ｃのオーブン中にて約６Ｏｒｐｍで１時間回転した。混合物に４７ｍ！ ！の１０％の４μｍポリスチレン粒子及び２．０ｇの過硫酸カリウムを加えた。

瓶を再密封し、排気しそして６０°Ｃのオーブン中で１時間回転し、その後、５ ．Ｏｍｌの２％ドデシル硫酸ナトリウムを加えた。更に５時間の後、１．　Ｏｍ ｌのスチレン及び１．０ｇの過硫酸カリウムを加えた。混合物を更に１５時間回 転し、二層にしたチーズ布を通して濾過し、そして穎微鏡下に検査した。

全ての場合において、粒子は、我々のアルカリ沈殿法に従って作られた磁性鉄酸 化物粒子を利用した対照に比し、コア粒子に貧弱に被覆していた。また市販粒子 の実質的な凝集もあった。この実験に従って調製された粒子の光学顕微鏡写真か 下に添付されている。図３ａ乃至３ｃは、上に挙げた３つのタイプの開始時の材 料（上から順にＡ乃至Ｃ）に対応している。

実施例４０ この実験においては、本工程の反応産物が、コア粒子の存在及び不存在において 比較された。コア粒子を一つの反応において省略した他は、実施例３９で用いた のと同じの手順を行った。

対照（コア粒子を備える）は、図４８のＩＩＩ微鏡耳鏡写真したように、卓越し た被覆粒子を与えた。コア粒子なしで作られたサンプルは、非常な凝集を示しく 図４ｂ）、スチレンが粒子相内に容易に移動することを示している。この結果は また、コア粒子への磁性鉄酸化物粒子の接着が、凝集が効果的に防止されるに十 分に速く起こるとい点において粒子の被覆が必須の一段階であることを示唆して いる。これらは、かなりな量の凝集の蓄積を伴った競合反応であることが通常予 想される。従って、９０％の磁性粒子が凝集することなく被覆していることは驚 くべきことである。

実施例４１ この実験においては、磁性粒子を作り出すために加えることのできるスチレン量 の除外限界を試験した。我々は約２．８μｍのコア粒子を約４μｍのものへと拡 大するために必要なスチレン量を計算した。

２７ｍｌの２．５％ｗ／ｖ金属酸化物、４　Ｏｍｌのｉｏ％の２゜８ａｍポリス チレン粒子、１０．８ｍＩ！のスチレン、０．９６ｇの過硫酸カリウム及び７４ ｍ１の脱イオン水を含有する混合物を、密封した瓶中に加えた。瓶を排気し６０ ″Ｃのオーブン中で６Ｏｒｐｍにて１６時間回転し、そして光学顕微鏡下に検査 した。

結果は、過剰のスチレンの使用は、１μｍ未満のサイズのポリスチレン粒子の乳 白色の懸濁液からの単一の大きい塊への大規模な凝集を引き起こし、重量比パラ メーターが、第一鉄第二鉄金属酸化物を用いて適当な被覆を得る上で重要である ことを示している。これらの結果はまた、コア粒子の使用が、磁性材料の均一な 沈着に必須であり、全部磁性材料から構成されているものまたは磁性材料が完全 に分散しているものに比べて、潜在的に低い密度を有する粒子が偶発的にしか産 生されないことを示している。

実施例４２ この実験においては、親油性の磁性鉄酸化物粒子か、先ず、アルカリ沈殿によっ て作られた我々の粒子及び商業的入手限より得た粒子の双方を利用して調製され た。標準的被覆手順が次いで、コア粒子の存在下に実施された。

１４ｍｌの２０％Ｗ／Ｖの水性オレイン酸カリウム溶液を、３゜４ｇの各鉄酸化 物粒子を含有する水３４ｍ１に加えた。得られた混合物を９０°Ｃにて３０分間 攪拌した。混合物を冷却の後、０．　５Ｎ塩酸でｐＨを６に調整した。集合した 粒子を磁気分離機上で分離することによって収集し、８０℃の水の各１　Ｏｍｌ で２回洗浄し、続いてエタノールの各１０ｍ１で２回洗浄し、減圧下に乾燥した 。

そのようにして調製された金属酸化物を使用して、０．９６ｇの親油性粒子を１ ｍｊ７のスチレン中に分散させた。この分散溶液に、６４ｍＡ’の脱イオン水を 加えた。分散を補助するため混合物を１０分間超音波処理し、そして瓶を密封し た。手順の残り部分は実施例３９と同しである。

アルカリ沈殿材料から誘導された該親油性粒子を使用して、少量の被覆か観察さ れた。しかしながら、コア粒子のかなりの凝集並びに相当量の凝集した磁性金属 酸化物粒子も見られた。親油性市販鉄酸化物粒子の場合には、金属酸化物の塊へ の凝集及びコア粒子の凝集か見られた。この結果は、磁性粒子が有機相モノマー と適合性にされたときには本方法が機能しないということを示している。

この実験は、ポリスチレン粒子、本方法によって作られた酸化鉄を含有する凸凹 のある外側層を有するポリスチレン粒子、及び本酸化鉄を含有する平滑な外側層 を有するポリスチレン粒子に対する、ペプチド抗原（アビジン）の受動的吸着の 量を比較する。粒子はいずれも同じ最終直径に作られた。

１　Ｏｍｌの２．５％ｗ／ｖの各タイプの粒子を２００Ｏｒｐｍ。

１０分間の遠心によってペレット化した。上澄を除去し、ペレットをｌ　Ｏｍｌ のＯ，１Ｍリン酸緩衝液、ｐＨ５，５に再懸濁させた。

粒子を再ペレット化し、そして上澄を除いた。

凍結乾燥したアビジンを、０．５ｍｇ／ｍＩ！の濃度＋：０．ＩＭのリン酸緩衝 液、ｐＨ５，５に懸濁させた。このペプチド溶液の４ｍｌを、次いで各粒子ペレ ットに移した。粒子をペプチド溶液中で再懸濁させ、室温にて１２時間転がした 。受動的に吸着されたアビジン被覆粒子を、次いで２００Ｏｒｐｍでペレット化 した。上澄を注意深く収集した。粒子を更に２回洗浄し、各上澄を最初の液に加 えた。次いて上澄を０．２ｎｍのフィルターで濾過し、光学密度を測定した。結 果は次の通りであった。

光学密度 素ポリスチレン粒子　０．６１０３ 平滑ポリスチレン粒子　０．４７１７ 凸凹ポリスチレン粒子　０．４３８０ ０．５％アビジン対照　０．７１０３ データは、コア粒子表面に重合した、無定形の鉄酸化物析出物によって一つに結 合された小さい結晶よりなる酸化鉄が埋め込まれているものであるポリスチレン の外層を含む凸凹及び平滑な表面のいずれの粒子も、同じサイズの素ポリスチレ ン粒子に比して高度のペプチド吸着を示した。

酸化鉄の完全な埋め込みを保証するために十分なモノマーによってなされた、粗 い粒子の被覆と実質的に同一の平滑な粒子の被覆は、この一層大きい能力か、主 として表面積又表面のトポロジーによるものではないことを示唆している。出願 人はこの現象については説明できない。

ＦＩＧ、　１ ＦＩＧ、　２Ａ ＦＩＧ、　２Ｂ フロントページの続き （５１）　Ｉｎｔ、　Ｃ１，５識別記号　庁内整理番号Ｃ０８Ｆ　２９１１００ 　ＭＰ　Ｚ　７１４２−４ＪＣ１２Ｑ　１／６８　Ａ　７８２３−４ＢＧ　ＯＩ 　Ｎ　３３１５５３　９０１５　２　Ｊ／／Ｃｌ２Ｎ　１１００　Ｚ　７２３６ −４Ｂ１１／１４　２１２１−４Ｂ Ｉ

Claims (6)

【特許請求の範囲】
1. １．常磁性微粒子であって、 直径１乃至１００μｍの内部のポリマー性のコア粒子、及び該コア粒子の表面に おいて重合した外側のポリマー性の層よりなり、該層が、無定形の金属酸化物析 出物によって約１．０μｍ以下の不均一なサイズの集団へと集合された金属酸化 物結晶を含有するものである、微粒子。
2. ２．前記ポリマー性のコア粒子及び外側のポリマー性の層がポリスチレンである 、請求項１に記載の微粒子。
3. ３．無定形金属酸化物析出物によって集合された金庫酸化物結晶よりなる前記集 団が、二価及び三価の遷移金属塩の、二価塩の三価に対するモル比０．５乃至２ ．０の混合物を含有する水性溶液を、アルカリ性条件下に加熱して沈殿を生成さ せ、該集団を洗浄し、金属酸化物結晶の凝集物を粉砕し、そして１μｍ未満の小 さい粒子を収集することによって製造されるものである、請求項１に記載の微粒 子。
4. ４．分析対象の存在又は濃度を決定するための方法であって、該分析対象に特異 的なリガンドで請求項１の微粒子を被覆し、該被覆された微粒子を該分析対象を 含有する水性溶液と接触させ該溶液をインキュベートし、 前記微粒子を該溶液から分離し、 前記分析対象に特異的な第２の標識されたリガンドを水性溶液中に含まれた該微 粒子に加えて該微粒子を懸濁させ、該溶液をインキュベートし、 前記微粒子を該溶液から分離し、 該微粒子に関連した標識されたリガンドの量を測定することよりなるものである 方法。
5. ５．核酸標的分子中の特異的核酸配列の存在又は濃度を決定するための方法であ って、 請求項１の微粒子に該標的分子の該核酸配列に相補的な核酸を取り付け、 該微粒子を該相補的核酸を含んだ液体標本と接触させて懸濁液を形成させ、 該懸濁液をハイブリダイゼーション条件下にハイブリダイゼーションを許容する に十分な時間インキュベートし、前記微粒子を該懸濁液から分離し、 該微粒子に取り付けられている核酸の配列とは異なる配列を有する、前記標的に 相補的な第２の標識された核酸を加え、該懸濁液をハイブリダイゼーシヨン条件 下にハイブリダイゼーシヨンを許容するに十分な時間インキュベートし、前記微 粒子を前記溶液から分離し、 該微粒子上の二量体の形成を前記標識を測定することによって検出することより なるものである方法。
6. ６．望まない生物物質を除去するための方法であって、該生物物質に特異的なリ ガンドを請求項１の微粒子に被覆し、該微粒子を該生物物質を含有する溶液と接 触させて懸濁液を形成させ、 該生物物質が前記リガンドと反応するまで該懸濁液をインキュベートし、そして 前記微粒子を該懸濁液から分離することよりなるものである方法。