JPH06500463A - 磁性粒子を含有する乾式化学試薬を使用するフィブリノーゲン分析（すなわち、試料中の凝固し得るフィブリノーゲンの濃度測定）を正確に、迅速にかつ簡単に行うためのフィブリノーゲン分析方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 磁性粒子を含有する乾式化学試薬を使用するフィブリノーゲン分析（すなわち、 試料中の凝固し得るフィブリノーゲンの濃度測定）を正確に、迅速にかつ簡単に 行うための方法および分析システム。

技術分野 本発明は、フィブリノーゲン（繊維素原）分析を行うため力方法および分析シス テムに関する。

従来技術 臨床分析に使用される血液凝固反応は、一般に、フィブリン凝塊を形成するのに 要する時間を測定する。血液凝固分析は主に、抗凝血性治療を受けている患者の スクリーニング、診断、および監視のために使用される。゛多くのタイプの凝固 分析法が存在する。それらには、プロトロンビン時間（ＰＴ）；部分トロンボプ ラスチン時間（ＰＴＴ）；活性化部分トロンボプラスチン時間（ＡＰＴＴ）；フ ィブリノーゲン分析（すなわち、試料中の凝固し得るフィブリノーゲンの濃度の 測定）；トロンビン凝固時間（Ｔ　ＣＴ）としても知られている、トロンビン時 間；活性か凝固時間（ＡＣＴ）；等が挙げられる。それらの分析で最も頻繁に行 われるのはプロトロンビン時間である。

血漿中の凝固し得るフィブリノーゲンの濃度の定量は、患者の凝固防止の研究に 重要である。フィブリノーゲンの定量のために、免疫学的方法および凝固試験が 共に使用されている。免疫学的方法は、重大な診断的欠点を有しており、それ故 、実用されない。

凝固試験において、フィブリノーゲン含量は、凝塊の形成に要する時間によって 定量される。それらの方法で最も重要なのは、クラウス（Ｃ１ａｕｓｓ）の方法 （アクタ・ヘマト（＾ｃｔａ　ＩＩａｅｇ＋ａｔ）、（１９５７）　１７：２３ ７−２４６頁参照）である。

クラウスの方法において、希釈された血漿、すなわち、弱フィブリノーゲン溶液 は、トロンビンの量が血漿の約５５０ｔｌ＊Ｉ−’である濃縮トロンビン溶液と 混合される。較正曲線により、試料のフィブリノーゲン含量は凝塊が目に見える ようになるに要する時間と相互に関連付けられる。凝固の過程中の濁りの形成を 光度測定により記録する凝固試験もまた知られている。ラトゲ等（Ｒａｔｇｅ　 ｅｔ　ａｌ）、クリニカルケミストリー（ＣＩＩｎ、Ｃｈｅｓ、）　（１９８７ ）３３（３）：４２０頁参照。　最後に、形成すした凝塊を単離し、そのタンパ ク質含量を決定する定量方法もまた知られている。

このアプローチにおいては、試料をトロンビンと反応させ、形成された凝塊を単 離し、洗浄し、次いで乾燥する。次いで、凝塊のタンパク質含量またはその重量 が定量される。

ベラカー等（Ｂｅｃｋｅｒ　ｅｔ　ａｔ）　（米国特許第４８９２４０８号）は 、血漿中のフィブリノーゲンおよびフィブリノーゲン分解生成物の同時定量のた めの方法を開示する。

この方法は、トロンビン様活性を存するヘビ毒酵素を使用する。この方法におい て、フィブリノーゲン分裂生成物Ｆの量の尺度である。酵素の添加から濁りの形 成が開始する間の時間が測定される。試料中に存在するフィブリノーゲンの量を 定量するために、次いで、濁り形成の速度が測定される。

プロトロンビン時間試験および活性化部分トロンボプラスチン時間試験はそれぞ れ通常、患者の凝塊を形成する能力を定量するだめの臨床試験として使用される 。それらの試験、および上記した他の試験は、手術前の検査のため、および心臓 病患者に施す抗凝血性治療のために、病院、診療所および実験室で広く使用され ている。それらの試験は、それぞれ、時間の測定に基づいており、そして大部分 は、フィブリノーゲンが重合してフィブリンとなる時に生ずる、終点または凝固 時間と呼ばれるものを測定する。

それらのタイプの分析の多くは、反応を測定するために、試料の光度濃度の変化 を監視する。たとえば、ナテルソン等（Ｎａｔｅｌｓｏｎ　ｅｔ　ａｔ）（＾ｓ 、Ｊ、ｃ１１ｎ、Ｐａｔｈ、（１９７４）０１（６）：８２８−１１３３）　、 リブスコム（米国特許４，７２０．７８７号）、サイトウ等（Ｓａｌｔｏ　ａｔ 　ａｔ）　（米国特許４．２１７，１０７号）、バウマン等（Ｂａｕ−ｇｈａａ ｎ　ｅｔ　ａｌ）　（米国特許４．２８９，４９８号）、グロス等（Ｇｒｏｓｓ ｅｔ　ａｌ）　（米国特許３．４５８，２１１７号）、アイヒエルベルガー等（ 米国特許４．０４７．１１９０号）、ベラカー等（米国特許４，８９２，４０８ 号）、カラハン等（Ｃａｌｌａｈａｎ　ｅｔ　ａｌ）　ｒＰＴ凝固反応からの半 定量的フィブリノーゲンの定量Ｊ　（”５ｅｓｌｑｕａｎｔ［ｔａｔｌｖｅ　Ｆ ｌｂｒｌｎｏｇｅｎ　Ｄｅｔｅｒｌｌｎａｔｌｏｎ　Ｆｒｏｍ　ｔｈｅ　ＰＴ　 Ｃｌ盾狽狽奄■ ｇ　Ｒｅａｃｔｉｏｎ″Ｔｅｃｈ、Ｂｕｌｌｅｔｌｎ　Ｔｅｃｈ、ＴＨＲ８８０ ４、コピーライト１９８８、オルガノン・テクニカ（Ｏｒｇａｎｏｎ　Ｔｅｋｎ ｌｋａ）、ダーラム（Ｄｕｒｈａｓ）　、ノース・カロライナ、米国、およびキ ャロル等（Ｃａｒｒｏｌｌ　ｅｔ　ａｌ）　ｒ凝固試験における凝固サインおよ び新たな観点」（ゴｈｅ　Ｃ１ｏｔ　Ｓｉｇｎａｔｕｒｅ　ａｎｄ　Ｎｅｗ　Ａ ｓｐｅｃｔｓ　Ｉｎ　Ｃｏａｇｕｌａｔｉｏｎ　Ｔｅｓｔｌｎｇ−）U月、 １９８９、オルト・ダイアグノスティック・システムズ・インク（Ｏｒｔｈｏ　 ＤｌａｇｎｏｓｔｌｃＳｙｓｔｅｍｓ　Ｉｎｃ）　、ラリタン（Ｒａｒ口ａｎ） 、ニューシャーシー、米国参照。

上記したクラウス法のようなｌｉ集速度法によって分析されるがさらに、フィブ リノーゲンは、ベルミレン等（Ｖｅｒｍｙｌｅｎ　ｅｔ　ａｌ）（ＣＩＩｎ、Ｃ ｈｅｔＡｃｔａ（１９６３）８：４１８−４２４）によって修正されたクラウス 法における凝集速度により、ま六はランプリング等（Ｒａｇ＋ｐＨｎｇ　ｃｔ　 ａｌ）（ＣＩＩｎ、Ｃｈｃｇ＋、＾ｃｔａ（＋９７８）６７：４３）の亜硫酸析 出により、またはラソトノ７等（ＲａｔｎｏｒｒｅＬ　ａｌ）の総凝集可能フィ ブリノーゲン法（Ｊ、Ｌａｂ、ＣＩ　Ｉｎ、Ｍｃｄ、（＋９５１）３７：３１Ｂ −３２０）により、またはデュポン（Ｄｕ　Ｐｏｎｔ）により市販されているフ ィブリノーゲンがフィブリン重合体に転化する濁り速度測定に基づく分析法（デ ュポン・エイ力（Ｄｕ　Ｐｏｎｔ　Ａｃａ）　（商標）、デュポン・クリニカル ・システムズ、ウィルミントン、プラウエア、米国（Ｄｕ　Ｐｏｎｔ　Ｃｌ１ｎ ｌｃａｌ　Ｓｙｓｔｅｍｓ　Ｖｌｌｗｌｎｇｔ。

ｎ、Ｄｃｌａｗａｒｅ、ＬＩＳ＾））により分析することができる。ヴエルミレ ン等（Ｖｅｒｓｙｌｅｎ　ｅｔａｔ＞の方法は、終点としてのフィブリン・ウェ ブが出現するまで凝固混合物に連続的に出し入れするガラスかぎ針または白金耳 を使用する。

今日、米国では毎年７５０，０００件の急性心筋梗塞があり、さらに１００万よ り多くのケースは動脈塞栓症、肺動脈塞栓症（Ｐ　Ｅ）および深部動脈血栓症（ Ｄ　Ｖ　Ｔ）と結びついている。それらの約２５％〜３５％は血栓症治療の重要 な候補である。閉塞している血栓の溶解を促進するためのフィブリン溶解性薬剤 を動脈投与することから成るこの治療法は、多くの小規模の地域病院において適 用されるであろう。

現在、０．５％の割合の頭蓋内出血および１％〜２０％の割合の重大な頭蓋外の 出血が存ｌ［する。現在、患者に対処するのに有効で、信頼性がありかつ迅速な 診断装置は市販されていない。

今日、出現している要求は、有効性を最大にし、そして出血の問題の危険性を最 小に血栓崩壊治療を如何により良く制御するかということである。この要求に対 し、単一の診断分析が回答になり得るとは考えられないが、診断分析と他の指示 薬の組み合わせにより治療の改善ができるであろう。

フィブリノーゲンの測定は、枕元で正確にかつ便利になし遂げるのは困難である が、血栓症の治療、特に出血の危険性および一度起こったことがある出血の治療 管理を評価するために重要である。初期のフィブリノーゲンの低下の測定は、た とえそれが組み換え組織プラスミノーゲンアクチベータ（ｒｔ−ＰＡ）のような フィブリン選択性試薬と結び付いた場合でも、溶解過程が始まったことの確認に は有用であろう。これは、ストレプトキナーゼ、ウロキナーゼおよびアニストレ ブラーゼのような他のフィブリン選択性試薬について等しく重要である。何故な ら、それらの薬剤は全身性溶解効果によって作用するからである。。

フィブリノーゲンの定量についての存在する先行技術方法は、分析を行う前に血 液の遠心分離を必要とする。何故なら、血球は測定を妨害するからである。血球 の分離は時間がかかり、分析に必要とされる総時間を増加する。もし、フィブリ ノーゲンの分析が血液を集めてから直ちに行うことができれば、試験管内で、（ 血栓溶解薬の作用による）プラスミンの活性化により生ずる物質は、たとえある にしても、試験結果に殆ど影響しないであろう。

これらの物質は、フィブリノーゲンそれ自身を含む血液凝集物と結合した種々の タンパク質へのプラスミンの作用により生ずる。これは、血液試料を集めた後に 試験管中で生ずる。たとえ数分の遅れでも（現在、存在する方法では少なくとも １５分間）不正確な結果を生ずる。この問題の一つの解決法は、試験前に試料を 貯蔵するための血液採集管に添加剤としてプラスミンまたはプラスミノーゲンア クチベータの阻害剤を使用することである。しかしながら、阻害剤の使用は更な る費用を要し、さらに、試料について続いて行われるであろう機能的分析の範囲 を狭める。

上述したように、ストレプトキナーゼに関しては、トロンビン時間試験は、スト レプトキナーゼに対する抗体が溶解効果の一部を中和するＤＶＴおよびＰＨにお ける溶解効果の存在を確認するために使用されていた。−滴の血液を乾式化学試 験カードへ添加することにより行うことが可能な便利で、迅速でそして正確なフ ィブリノーゲン分析は、現在の診断能力の大きな改良であろうし、特殊な患者の ための血栓溶解治療の最適化への長い道のりを進めるであろう。さらに、そのよ うなシステムの診断能力は、現在開発中の、多くの新たに出現する血栓溶解薬の 臨床試験に役立つことができるであろう。それ故、そのような分析には明らかな 必要性がある。

発明の開示 したがって、本発明の目的は、上記した欠点を有さない、フィブリノーゲンスク リーニング試験を含む、フィブリノーゲン分析を行うための、簡単で正確な方法 、および分析システムを提供することにある。

本発明の他の目的は、試薬を含有する溶液の調製を必要としない、フィブリノー ゲンスクリーニング試験を含む、フィブリノーゲン分析を行、うための方法、お よび分析システムを提供することにある。

本発明の他の目的は、試薬の不安定さと結び付いた問題を最小にする、フィブリ ノーゲンのスクリーニング試験を含む、フィブリノーゲン分析を行うための方法 、および分析システムを提供することにある。

本発明の他の目的は、非常に少量の試料のみを必要とする、フィブリノーゲンス クリーニング試験を含む、フィブリノーゲン分析を行うための方法、および分析 システムを提供することにある。

本発明の他の目的は、血漿試料の予備分離を必要とせず、全血について行うこと ができる、フィブリノーゲンスクリーニング試験を含む、フィブリノーゲン分析 を行うための方法、および分析システムを提供することにある。

驚くべきことに、これらの目的の全て、並びに以下に述べられた発明の記載から 明らかになるであろう他の目的の全てが、本発明の方法、およびフィブリノーゲ ン分析を行う本分析システムにより達成されることを発見した。

第一の実施態様において、血液または血液由来試料中の凝固し得るフィブリノー ゲンレベルを定量するための動的方法（フィブリノーゲン分ＦＦｒ）が使用され る。

この方法は、その基本要素として、以下の工程から成る：（１）振動する磁場に 、試薬マトリックスに均一に分布した複数の磁性粒子が埋め込まれている乾式試 薬マトリックスを委ね、ここで、試薬はフィブリノーゲン分析試薬から成る群よ り選ばれた１つである；（１１）ある容量の全血または血液由来試料を試薬に添 加し、それを溶解させ、振動する磁場により誘起された振動パターン中で粒子が 自由に動くようにし；（ｉｌｉ）該反応容器を光学的に監視して、該粒子振動の 最大振幅Ａ、および該粒−ｒ振動の、それに続く残留、後ピークの最小振幅Ｂを 測定し；そして（１ｖ）少なくともＢを使用して、該試料中のフィブリノーゲン 濃度を測定する。

第二の実施！！様において、フィブリノーゲン分析を行うための終点法が使用さ れる。この方法は、その基本要素として、以下の工程から成る：（Ｉｏ）振動す る磁場に、試薬マトリックスに均一に分布した複数の磁性粒子が埋め込まれてい る乾式試薬マトリックスを委ね、ここで、試薬はフィブリノーゲン分析試薬から 成る群より選ばれた１つである；（１１°）ある容量の全血または血液由来試料 を試薬に添加し、それを溶解させ、−振動する磁場により誘起された振動パター ン中で粒子が自由に動くようにし；（ＩＩＩ’）粒子の振動を光学的に監視して 、磁場に対する粒子の動きの度合いの変化に対応するフィブリノーゲン分析のた めの開始時間および停止時間を測定し；そして （Ｉｖ’）開始時間および停止時間を使用して、試料中のフィブリノーゲン濃度 を８−１定する。

第二の実施態様の変形例において、フィブリノーゲン分析を行うための終点法が 使用される。第１図を７照して、この方法は、その基本要素として、以下の工程 から成る： （１“）振動する磁場に、図中に示された反応スライドの反応室２４のみに含ま れ、試料受け２２または溝２６には含まれていない乾式試薬マトリックスを委ね 、マトリックスにはそれを通して均一に分布した複数の磁性粒子が埋め込まれて おり、試薬はフィブリノーゲン分析試薬から成る群より選ばれた１つである；（ １１”）ある容量の全血または血液由来試料を反応スライドの試料受け２２に添 加し、ここで、試料の容量は、試料が反応スライドの１ｔｔｋ２６には供給され るが、反応室２４には入らないかまたは試薬と接触しないように選択され；（Ｉ ｌｌ”）ある容量の緩衝希釈剤を試料受け２２に添加し、緩衝剤の容量は全血ま たは血液由来試料を反応室２４に洗い出すに充分な量であり、処理中の試料を希 釈し、そして、希釈した試料を試薬と接触するように移動させ、試薬を溶解する ようにし、そして粒子を、振動する磁場により誘起された振動パターン中で自由 １こ動くようにし； （ＩＶ”）粒子の振動を光学的に監視して、磁場に対する粒子の動きの度合いの 変化に対応するフィブリノーゲン分析のための開始時間および停止時間を測定し ；そして （Ｖ“）開始時間および停止時間を使用して、試料中のフィブリノーゲン濃度を 測定する。

本発明において使用してもよい血液由来試料は、抗凝固化（すなわち、クエン酸 添加の）血液もしくは血漿試料、または緩衝剤希釈抗凝固化血液もしくは血漿試 料と定義される。

好ましい実施！！様において、米国特許第４．８４９．３４０号および１９８８ 年５月１０日に出願された米国特許出願節０７／１９２．６７２号においてオー バー凸ルト（Ｏｂｅｒｈａｒｄｔ）により記載された反応スライドが使用される 。これらの二つの文献は、ここに引例として導入される。

図面の簡単な説明 以下の詳細な説明を参照して、添付されている図面と共に考慮する場合、本発明 およびそれに付随する利点の多くは、容易により完全な理解できるであろう。

なお、幾つかの図面をとおして同一の番号は同一のまたは相当する部品を示して いる。

第１図は、血液または血液由来試料中の凝固し得るフィブリノーゲンレベルを測 定するための、本発明の終点または動的方法に使用する組み立て反応スライドの 分解図である。

第２図は、反応を測定するために磁性粒子を使用する装置および反応スライドの 長手方向垂直断面図である。

第３図は、フィブリノーゲン分析のための凝固曲線を示し、Ａが粒子振動の最大 振幅を示し、Ｂがそれに続く残留後ピークの粒子振動の最小振幅を示す。

第４図は、フィブリノーゲンを分析するための、特別な算術用パラメータとして 使用される可能性のある動的凝固波形の付加的な特徴を示す。

第５．６図および７図は、フィブリノーゲン分析についての特徴に基づく数的な 比較である。

発明を実施するための最良の彰態 血栓溶解治療の管理のために、改良された診断法を開発する必要性が高まってい る。迅速なブイプリノーゲン測定の開発は、患者に対する明確な利益をもたらす ことができる一つの領域である。さらに、フィブリノーゲンの簡単で、迅速で、 便利な分析は、丁術後の出血の管理；手術前の評ｉｉ；肝臓病の患者または肝１ １移植後の！！名、散在性脈管向凝固（Ｄ　Ｉ　Ｃ）患者、および患者の枕元で 出血を！ｆ綴する一般的な１段等の、血栓溶解治療領域以外の他の用途をも持つ ことができる。本発明は、そのような現在の分析システムに見出される欠点にね らいを定め、そして解消するものである。

本発明は、分析反応に導入された磁性粒子の動きを監視することによる新たなフ ィブリノーゲン分析を提供するものである。上記したように、本分析においては 、振動している磁場に、試薬マトリ９クスの中に均一に分布した、複数の磁気ｔ Ｄ、　Ｔが埋め込まれている乾式試薬マトリックスを委ねる。この振動する磁場 は、（１）静的振動磁石、または（２）移動永久磁石、または（３）振動磁石お よび静的永久磁石の組み合わせを使用することにより得ることができる。（米国 特許出願第０７７１９２．６７２号を詳細な検討のために膠照されたい。）次に 、全血または血液由来試料が、この試薬に加えられ、同時に溶解するようにし、 それにより、粒子を振動する磁場により誘起される振動パターン中を自由に動く ようにする。米国特許出願第０７／１９２．６７２号に詳細に議論したように、 磁場のＥ’ｌＦ下では、自由磁気粒子は円柱状構造またはスタックを形成し、そ れは、振動磁場の影響下で、それらの円柱状構造またはスタックの配向の変化に より明滅減少を生ずる。

粒子の振動は、粒子に入射光を投射反射（散乱）光を検出することにより、光学 的に監視される。試料を乾式試薬マトリックスに添加する前では、乾式試薬マト リックス中に捉えられた磁性粒子は振動され得ない。乾式試薬マトリックスに試 料を添加して磁性粒子が自由になった後には、第３図のＡとして示したように、 粒子に基づく円柱状構造またはスタックの最大数は、大きな度合いで振動させる ことにより速やかに観測することができ、最大振動振幅を与える。反応の進行に ｆ＋い、凝塊は、粒子に基づく円柱状構造またはスタックの増加する数の振動の 度合いを減縮するようになる。この明滅パターンにおけるゆっくりとした減少は 、第３図のＢとして示したように、残留後ビーク巖小振幅を生ずる。

本分析において、該振動磁場に対する粒子の動きの度合いを観察して、分析の開 始時間および停止時間を測定するか、あるいは、凝固時間以外の、−以上の特徴 の動的曲線を使用して試料中のフィブリノーゲン濃度を測定する。

記載された血液凝固監視システムにおいて、高フィブリノーゲンレベルは、より 濃密なフィブリン凝塊を生じ、それは粒子振動を大きな度合いで減縮し、ピーク シグナルの後に低い最小振動シグナルを生ずる。第４図がら理解されるように、 凝固曲線は複雑である。１で開始し、最初の粒子振動は明らかに示される。磁気 −粒子振動の大きさは明らかである。光学的に監視した磁気粒子振動の大きさは １の分析の開始から増加し、そして波の包絡線の上部および下部の２および２゛ の頂点にそれぞれ達する。

頂点における振動シグナル振幅はＡで示し、そして第４図には２および２゛の間 のシグナルの相違として示した。Ａが発生する時間ｔＡが凝固時間である。波形 包絡線の頂点に沿って追跡すると、振幅はｔＡの後に減少する。

３点ｍ１、ｍ２、およびｍ３を示す。点ｍ１およびｍ３は任意に選択されたが、 固定された時間である。点ｍ２は変曲点として選択される。ｍｌ、ｍ２またはｍ ３でとられる曲線の傾きはフィブリノーゲンの尺度として利用することができる 。

ｆ１１１故なら、それらの傾きは、最も高いフィブリノーゲンレベルで最も急峻 （最も負）であり、そしてフィブリノーゲンが減ると急峻ではなくなる。

ｍ３の後、振動シグナルの振幅は時間の経過と共に減少を続け、最後には漸近値 Ｂに近づく。フィブリノーゲン濃度は、Ａ／Ｂおよび（Ａ−Ｂ）／Ａに比例する 。フィブリノーゲン濃度はまたＢに反比例し、モしてＡ−Ｂに直接比例するが、 しｈ化、それらのパラメータのみではＡ／Ｂまたは（Ａ−Ｂ）／Ａよりも一般に １１値ではない。

フィブリノーゲン濃度の他の、より正確な尺度は、動的曲線の積算部分により得 られる領域である。たとえば、２および２゛の間の延長した直線の長さすなわち 左のＡの振幅；右の振幅Ｂｉここで、Ｂ′は時間ｔＢ−での曲線の振幅；そして ｔＢ−は一般的にはｔＡ後１０秒およびｔＢの９０％までの間の時間がとられる が、より一般的にはｔＢの６０％である）および波形包絡線の上部および下部に より定義される領域により囲まれる領域がαと表示され、試料中のフィブリノー ゲン濃度に反比例する。

βとして表示される他の領域も利用される。βは、辺Ａ及び対応する辺ｔＢ−か ら成る長方形から、αで表示される領域を差し引いた領域に等しい。βは第４図 において、上部のβ１および下部のβ２の二つの部分から成るものとして示され る。振幅Ｂ′を通り、点２および２′の直線に垂直な平行な線４および４′と交 差する線は、βの右の境界を定義する。βはフィブリノーゲン濃度に直接比例し 、かつ非常に正確である。

βおよびαは組み合わせて使用してもよく、すなわち、フィブリノーゲンレベル を示すために、比または差が採用される。さらに、αおよび／またはβは、たと えば、面積計算のために水弔の尺度としてｔＢを常に使用することにより、時間 とは独立に計算することができる（第４図参照）。

第５図は、凝固曲線の幾つかの動的パラメータが、乾式試薬スライド用フィブリ ノーゲンの濃度によってどのように変化するかを示している。乾式試薬スライド 用フィブリノーゲンは、レブチラーゼ並びに、フィブリノーゲン欠損血漿により 貯蔵正常血漿を種々の量に希釈したものから成るクエン酸加血漿試料を含む。

本発明は、かくして、磁性粒子乾式化学技術を使用するフィブリノーゲン測定法 を提供する。この方法を用いることにより、フィブリノーゲンは以下に記載した それぞれの方法により測定することが可能である。

米国特許第４，８４９．３４０号または米国特許出願第０７７１９２．６７２号 の何れかに記載された反応スライドのような、毛細管スライド配置は、適性にパ ターン化されたフォーマットの作成、試薬の収納、および試料の測定にはよく適 しているけれども、本発明の分析は、磁性粒子を含有する乾式試薬の予め測定さ れた量を何れかの固体表面（たとえば、ミクロタイター・プレート・ウェルまた はほぼ平坦な表面）にｆｌｔに添加することにより、非常に良好に機能するであ ろう。

乾式！Ａは、血液または血液由来試料を添加することにより速やかに溶解するよ うに調製することがｍ要である。表面上に、またはより好ましく、毛細管または 近し細管距離に近接して向かい合った二つの表面に凍結乾燥することが最もよ（ 機能する。これは、試料の迅速な浸透および溶解を可能にする低物質含量の塊を 生ずる。

凍結乾燥は乾式磁性粒子を含有する試薬の調製に優れた結果を与えるが、室温、 真空、乾燥剤、対流または他の型の乾燥も使用することが可能であり、良好な結 果を達成する。たとえば、試薬を反応スライドの基板上で室温乾燥しくスペーサ を介して）、次いでカバーを取り付けることが、自己計算性乾式試薬含有素子を 得るために使用することかできる。

好ましい実施態様において、第１図および第２図に示した反応スライドが使用さ れる。第１図は、スライドのカバー１０、オーバーレイ２０および基板３０成分 の相対的位置を示す分解図である。カバー１０は光透過性の薄いガラスまたはポ リマーシートから成り、それには試料受は開口部１４およびカバー１６の末端に 近接した長形開口部１２が形成されている。

オーバーレイ２０は、一般的には透明の、薄いガラスまたはポリマーシートから 成り、切り欠きが形成されており、その切り欠きは、図示したように、実質的に 試料受け２２、反応室２４並びに反応空間および試料受は開口部に連結する任意 の溝２６を形成するような幾何構造を有している。

このオーバーレイ２０の切り欠きは、試料受け２２および反応室２４がお互いに 連結したように形成される幾何構造、または図示したように、実質的に、試料受 け２２、反応室２４、および溝２６から成る幾何構造の何れかをとり得る。

反応室２４は、カバー、オーバーレイおよび基板により、反応空間が形成される 。Ｈ利には、テーバ状の壁２５が溝２６と、試料受け２２との間の、または溝２ ６を使用しない場合には、反応室２４との間の転移壁を形成する。オーバーレイ の末端は２９に示したように閉鎖されている。

基板３０はガラスまたはポリマー材料のシートから成り、一般的にはカバー１０ またはオーバーレイ２０の何れかよりも幾分厚い。

図面に示したように、カバー１０の長さく図面の左から右まで）はオーバーレイ ２０のそれとほぼ同じであり、カバー１０およびオーバーレイ２０の幅（図面の 上部から下部まで）はほぼ同じであり、一般に基板３０のそれよりは小さい。

カバー、オーバーレイおよび基板が組み立てられた場合、基板３０に面している 、カバー１０の底面は、毛細管作用により反応空間中に同時に、反応室の容積に 相当する試料の容積が引き寄せられるように、充分に小さい距離で、基板３０の 上面から一定の間隔を置かれている。この作用は、開口部１２の存在により可能 となる。使用に際しては、反応室２４には、乾式試薬中に均一に分散された磁気 粒子を含Ｈする乾式試薬が入れられる。

第２図は、分析を測定するための磁気粒子を使用している装置と一緒になった反 応スライドの長子方向垂直断面図である。この図において、反応スライド１が配 置されており、永久磁石１９５に非常に近接している。永久磁石１９５の下方に は電磁石１９６があり、それは所望の周波数でサイクル電圧をオンオフする０鯨 １９９により駆動される。本発明の実施においては、上記永久磁石を（電磁石な し、に）使用することが可能であり、反応スライドの面とほぼ平行な面に沿りて 後と前に永久磁石を動かすことにより、永久磁石で振動する磁場を作ることがで きる。他の実施！ｌ３ｔ−１では、上記電磁石を使用１．て振動する磁場を発生 させることができる。さらに他の実施９１７では、ｍ要を図示したように、それ ら磁石の両方が使用される。

赤外光を発するダ・イオードのような光源は、入射光を反応室に入れるに適当な ように位置しており、検出器は反応空間６６内の試料から反射される光を検出す るために位置している。光線１９８として示された、反射光は検出器４００で検 出される。検出器４００は反射（散乱）光を検出できれば、如何なる位置にも位 置できるが、９０＠と１０９の間の位置が好ましく、９０°と４５′″の間の位 置が好ましく、９０″″と７５″の間が最も好ましい。

凝塊形成速度論的アプローチ。本実施ｔｇ３様に使用される試薬は、公知のｐＨ 範囲（典や的には７．０〜７．４）を制御するに充分な緩衝液と共に、以下の物 質を含む、（ａ）最小Ｂｍ　（ＰＴ試験）で正常血漿の凝集を引き起こすに充分 な量で存在するトロンボプラスチン＋磁性粒子、典型的には８．３−ｇｌ−１で あるが、広い範囲で炙わり得る（米国特許出願第０７／１９２．８７２号参照） ；（ｂ）トロンビン＋磁性粒子を、機能的に定義した上記（ａ）と同様の量で二 または（Ｃ）ヘビ毒、たとえば、レブチラーゼ、カッパーヘッド毒酵素、または マラヤ・ビット・グサリヘビ毒酵素を（ａ）と同様の童で、毒＋磁性粒子につい て機能的に定義した上記（ａ）の量である。血液試料は、通常希釈を必要とせず 、乾式化学分析混合物に直接添加してもよい。しかしながら、ｌ：２（容積）以 内での、最も好ましくは１：４（容積）を超えない、幾分の希釈は、この実施態 様で可能であり、所望により希釈してもよい。

ある場合には、たとえば、非常に高いフィブリノーゲン１ノベルにおいては、１ ：１０（容積）程度の、または１：２０　（容積）での希釈も存利であり可能で ある。

種々のトロンビン調製法が存在する。実際の純度および活性度は原料に応じて異 なっている。ヒトトロンビンの他に、ウシトロンビンがしば、しば使用される。

原料および活性度の変動に加えて、ロフト間の変動もまた生ずる。ヘビ毒につい ても、このことは真実である。ここで、ロフト間活性度はかなり変動し得る。ト ロンボプラスチンもまた、原料：ウサギ脳、雄牛脳、ヒト脳、等に基づき、全く 異なる。さらに、同一原料からのトロンボプラスチンのロット間変動は、血液凝 集診断分野においてはよく知られている。

この理由のために、磁性粒子と共に使用される適当な乾式試薬を配合して使用さ れる種々の凝固試薬の正確な量は特定することができないが、むしろ、それらの 凝固試薬の量は、それぞれの実施態様において記載したように機能的に定められ る。緩衝液の８ｉ類および濃度は、ｐＨよりも重要ではない。血液凝集反応に通 常使用される緩衝液が一絞に使用される。それらの中には、オウレンス（Ｏνｒ ｅｎｓ）、１）じＰＥＳ　、およびトリス（Ｔｒｉｓ）がある。

ｐ　Ｈ７，３でのレブチラーゼ基試薬については、たとえば、２５ｍＭのＨＥＰ ＥＳが２５ｍＭ）リスよりもよりよい（より急峻な応答曲線を与える）。しかし ながら、後述する添加剤等の他の因子が機能に影響する。さらにまた、最適ｐＨ および緩衝液の選択は凝固試薬（フィブリノーゲン分析試薬）の種類に幾分依存 し、そして恐らくは選択した特別のロフトの試薬にも依存する。一般に７．０〜 ７．４の範囲のｐＨを使用することは有用であり、そしてそこから最適化される 。乾式試薬の溶解特性を改良するために、そして溶解による磁性粒子の分散をよ りよくするために、ある柵の添加剤を使用することは好都合である。試薬配合物 中にウシ血清アルブミンおよび／またはポリエチレングリコールを１ｉｉｉｉ％ 未満の量で加えるとよく機能する。正確な量は、凝固試薬の性質に依存し、そし てそれぞれの口・ノド番号によっても異なるであろう。

凝塊形成速度論を使用してフィブリノーゲンを測定するために、凝固時間は、好 ましくは使用されない。代わりに、凝固曲線（第３図および第４図に示した）に おける特徴を反映する速度論的パラメータが利用される。トロンボプラスチン基 試薬は、速度論的パラメータを使用する血液試料中のフィブリノーゲンを測定す るために利用されるかもしれないが、この種の試薬は、一般に、凝固時間（たと えば、クラウスＰＭ）法に使用するには適していないということにもまた注意す べきである。第３図において、Ａはピーク高さの最大ｖＬ（最大振動振幅）であ り、ＢはＡに達した後に観測される最小値（残留後ピーク最小値）である。

ＡおよびＢの（ｎｌれか、またはＢのみが、試料中のフィブリノーゲン濃度に比 例した因子を決定するために使用される。以下の尺度が使用される：（１）Ｂの み；（ｍＡ／Ｂ　（またはＢ／Ａ）　；　（Ｉｉｌ）　Ａ−Ｂ　、または（［ｖ ）　（Ａ−Ｂ）　＋ＡまたはＡ＋　（Ａ−Ｂ）。あるいは、〈ν）、１４図から 分かるように、ＡとＢの間の負の傾き（たとえば、変曲点またはその近傍）を利 用することができる。この領域は、ピーク（Ａ）、およびＡ後のある設定時間、 たとえば４５秒、における垂直軸により囲まれる。ここで、Ａは標準化され３、 そしてそれぞれの分析曲線に対し等価にされる。

凝固時間アプローチ（クラウス型）：使用される試薬は、ｐＨを制御するのに充 分な緩衝液と共に、以下の物質を含む、（ａ）トロ”／ビン＋磁性粒子、ここで ト１コ゛、ビシ澗度は、絶えず増加するトロンじン濃度で得られる絶対最小値よ りも幾分上のＢ値で７．正常血漿の凝集を引き起こすに充分なものであり、そし て磁性校了ａ度は典型的には８．３ｉＨｕｌ−’であるが、広い範囲で変わり得 る（米国特許出願第０７／１９２，８７２号参照）；または（ｂ）　＊質的に同 一の条件下で、そ（７て同一の機能的ａ１里を生Ｌ゛させるのに充分な置の、ト ロンビンの代わりにヘビ毒酵素（たとえば、１ノプチラーゼ（ボスロップス、ア Ｉ−ロツクス（Ｂｏｔｈｒｏｐｓ　ａｔ＋・０Ｋ））の毒から単離したト「フン ビン様酵嵩）、カッパー・＼ラド滲酵素、（アゲキストロトン・コン１＝ルトリ ツクス（＾ｇＫＩｓｔｒｏｄｏｎ　ｅｏｎｔｏｒｔｒｉｘ））またはマラヤ・ピ ント・クサリへじＪＪＩＩ？水（アゲキストロトン・ロー　トストーマ（＾ｇｋ ｌｓｔｒｏｄｏｎ　ｒｈｏｄｏｓｔｏｓａ））　（ベラカー′等（Ｂｅｅｋｅｒ 　ｅｔ　ａｔ）　、Ｔｈｒｏｓｈ、Ｒｅｓ、（１９１ｔ４）３５：４７５”４８ ４および米国特許第４，６９２．４０６　＃照）十磁性粒子を、上記（ａ）と同 様の量°Ｃ含有するものである。この実り態様において、分析されるべき血液試 料は、まず、緩衝液（典型的にはオウエンス（Ｏｖｅｎｓ）の緩衝液）で希釈さ れ、次いで、適当な分Ｆｒ器内の乾式化学分析混合物に添加される。次いで、凝 固時間が測定される。

クラウス型方法（凝固時間に基づく）には、ヴエルミ、レン等（Ｖｅｒｓｙｌｅ ｎ　ｅｔ　ａｔ）ＣＩＩｎ、Ｃｈｌｍ、＾ｅｔａ、　（１９８３）８：４１ｇ− ４２４で議論されているように、充分な動的範囲を達成するために、試料の希釈 が必要である。本分析系においては、これは試料の予備希釈により達成され、ま たは第１図の反応スライドの溝２６．中に一定の小容積の試料を置くことによっ ても好都合に達成される。

たとえば、１〜３マイクロリツトルの試料を注意深くピペットで、溝２６の開口 部近くの試料受け２２中に入れ、試料全部を溝２６中に伝播させる。実際には、 一度ピペットで試料受け２２の適当な領域に伝播させると、試料は自動的に毛細 管作用により溝２６に吸収される。この種の反応スライドにおいては、満２６中 に如何なる凝固試薬（トロンビン等）をも必要としない。乾式試薬は反応空間２ ４に密閉されていなければならない。これは、たとえば、開口領域を前方から充 す毒する等の、多くの方法で乾式化学反応スライドの製造において、容易に達成 されている。総容積（試料受けおよび開口領域を除く）が２５マイクロリツトル の第１図に示したような反応スライドには、３マイクロリツトルより多くの試料 を使用しないほうが好ましい、何故なら５．−れ以上では、次の工程で有効に希 ｆｉＲできないからである。１マイクロリツ！・ル未満の試料の使用は薦めらオ コない、何故なら、試料はこの実施態様（１，か（７、先に記載１．た動力学的 方法におい一〇ではない）において正確にピペットで測定されな１プればならな いからである。現在のピペット技術では、１マイクロリツトル未満の試ネ４を正 確１１：そしてｆｌｌ！　１４１に移動するのは困難である。

試料をＨけた後に、一定容量の緩衝液希釈剤を、′ａ２６＋反応室２４を満たす に必だとされる容量と等容ｑまたは好ま１．＜は過剰型で、試料受けに加える。

２５マイクロリツトル容量の反応スライドに＋、ｔ、　２５−５０マイクロリツ トルの緩衝液希釈剤が有効であり、３０〜４０マイクロリットルの８凰が好まし い。２５マイクロリットル未満では、特に、反応容積が充分に充填さねなかった 場合には、不十分な流動しか生ずることができない。５０マイクロリツトルを超 える希釈剤は、この太きさめ反応スライドの試料受けから溢れるであろう。

試料が反応空間へ洗い流され、そして工程中で希釈されるやいなや、乾式化学が 開始して溶解され、そして凝固反応が開始する。達成される希釈の範囲は、１寸 イクロリットルの試料についてｌに対し２５（容積で）で、３マイクロリツトル の試料については３に対し２５（容積で）である。この範囲を超えると、凝固試 薬の濃度および適当な希釈要素を選択することにより、凝固時間（ｔＡ）に対す るフィブリノーゲン濃度の対数一対数紙へのプロットが実質的に直線である良好 な標準曲線が得られる。

この曲線は、次いで、従来のクラウス分析において、凝固時間に基づいて未知の 試料を定量するために、対照として利用してもよい。ｔＡ以外の凝固終点を選択 することも可能である。たとえば、もし、０．９Ａなどの補正終点振幅を選択し た場合（ピーク振幅Ａに到達した後の）、凝固時間として０．９Ａに達した時間 を使用することにより、良好な結果が得られるであろう。同じことは０．８５Ａ についても言えるが、あまり離れすぎると良くない。さもなければ、低フィブリ ノーゲンレベルの感度、特に、検出することが望まれている最も低いレベルのフ ィブリノーゲンが、補正終点振幅と等価またはほぼ等価のＢ値を生ずると、低フ ィブリノーゲンレベルの感度が失われる。補正終点振幅を利用することの一つの 利点は、直線の対数フィブリノーゲン標準曲線の傾きをより急峻にできるであろ うことである。

磁性粒子−および緩衝液並びに１重量％未満のウシ血清アルブミンもしくはポリ エチレングリコール（ポリエチレングリコールの分子ｉｔ（Ｍｗ）が約３，４０ ０−１０．０００ダルトンの範囲のものが好結果で使用される）または両者の組 み合わせのような結合剤から成る乾式試薬を含有する反応スライドを調製するこ とも可能である。この反応スライドに対して、１〜３マイクロリツトルの試料が 、試料受け２２を経由して反応スライドの溝２６に添加される。この場合、希釈 したトロンビンまたはヘビ塩が、前記のように、試料を洗浄して、それを反応空 間２４への途中で希釈するのに使用される。乾式化学は、この場合、磁性粒子＋ 他の試薬であるが、溶解され、そして適正な凝固終点を与える。この方法論の変 形は、しかしながら、殆ど便利ではない。何故なら、使用者において試薬の調製 が必要であり、そして正確な開始点を与えないであろうがらである。

対数関係が、この方法で測定した凝固時間と試料中のフィブリノーゲン濃度の間 に存在する。この関係が、適当なフィブリノーゲン標準溶液と比較することによ り、血液試料（クエン酸加全血またはクエン酸加血漿）中のフィブリノーゲンの 未知濃度を分析するために使用される。

さらに他の可能な構成は、磁性粒子、緩衝液、および１重量％未満のウシ血清ア ルブミンまたはポリエチレングリコールのような結合剤と混合した凝固試薬（ト ロンビン、ヘビ塩、またはトロンボプラスチン）を含Ｈする反応スライドを調製 することであり、ここで、混合物は、乾燥形態であり、そして通常使用されるよ りもより高い濃度（４〜８倍）であるが、相対的により小さい容積に含有されて おり、その容積は、反応スライドの溝２６に適しており、そして反応スライドの 残りの部分は空である。非常に良好な結果が、この種の反応スライド構成で以下 のようにして得られる。まず、決められ量（２〜３マイクロ伝ツトル）の蒸留水 を、溝２６近くの試料受け２２に添加する。この水は、毛細管作用により、溝２ ６に速やかに吸収される。短時間のインキュベーション後に（使用する試薬の濃 度および種類によっても異なるが、一般的には５〜３０秒）、反応空間２４の残 りを充填するに充分な、ある容積の予め希釈された試料を、試料受け２２に供給 する。この試料（緩衝液で血漿または全血の何れかを一般的には１：１０　（容 量で）に希釈した）は溝２６内で反応溶液および磁性粒子と混合され、そして得 られた混合物は速やかに反応空間２４に入れられ、ここで信号を検出して、一連 の反応監反工程を開始する。次いで、フィブリノーゲン分析のために、Ｂのみ、 Ａｌ６もしくはその逆数、（Ａ−Ｂ）＋Ａもしくはその逆、負の傾き、正常化領 域、およびトロンビンまたはヘビ塩の場合には、凝固時間も測定される。

フィブリノーゲンスクリーニング試験（凝固時間に基づく）：緩衝液と共に、こ の実施Ｂ様で使用される試薬は、（ａ）トロンビン＋磁性粒子または（ｂ）ヘビ 塩（たとえば、レブチラーゼ力ッパーへラド毒酵素、またはマラヤ・ビット・ク サリヘビ毒酵Ｉｇ）十磁性粒子を含有する。血液試料は希釈されるへきではなく 、乾燥化学混合物に直接添加される。凝固時間が、次いで測定される。トロンビ ンを使用した場合には、結果はトロンビン時間（ＴＴ）またはトロンビン凝固時 間（ＴＣＴ）として報告される。レプチラーゼを使用した場合には、結果はレブ チラーゼ時間として報告される。これらのスクリーニング試験は、一般に、フィ ブリノーゲンが異常であるかどうかを決定するのに有用である。

第一（動力学的）の好ましい実施！！様において、血液または血液由来試料中の （フィブリノーゲン分析を行うための）凝固し得るフィブリノーゲンレベルを測 定するための本方法は、以下の（１）〜（Ｉｖ）の工程から成る。

（１）振動する磁場に、（１）液体試料を受けるための試料受けおよび（２）試 薬マトリックスに均一に分布した複数の磁性粒子が埋め込まれている乾式試薬マ トリックスを含何する反応室を有する反応スライドを委ねる。ここで、試薬は、 フィブリノーゲン分析試薬から成る群より選ばれた１つである。

（１１）全血または血液由来試料を該試料受けに添加し、それにより試料を同時 に反応室に導入し、試薬を溶解させζそして振動する磁場により誘起された振動 パターン中で粒子が自由に動くようにする。

（Ｉｉ＋）反応室を光学的に監視して、粒子振動の最大振幅、Ａ、およびそれに 続く、該粒子振動の、残留後ピークの最小振幅、ＢをＩＩ定する。

（１ｖ）少なくともＢまたはＡとＢの間の動的凝固曲線により定義される領域を 用いて、試料中のフィブリノーゲン濃度を測定する。

第一の好ましい実施態様において、乾式試薬マトリックスは、トロンボプラスチ ン、トロンビンまたはレプチラーゼから成る。

他の好ましい実施態様において、フィブリノーゲン分析は、トロンビンまたはレ ブチラーゼに基づく試薬を用いた凝固時間、および分析の開始および停止時間に 基づいていてもよい。

この第二（終点）の好ましい實施態様において、フィブリノーゲン分析を行う方 法は、以下の（１°）〜（ｊｖ’）から成っている。

（１゛）振動する磁場に、（１）液体試料を受けるための試料受けおよび（２） 試薬マトリックスに均一に分布した複数の磁性粒子が埋め込まれている乾式試薬 マトリックスを含有する反応室を有する反応スライドを委ねる。ここで、試薬は 、フィブリノーゲン分析試薬から成る群より選ばれた１つである。

試料受けおよび反応室は、試料受は中に置かれた反応室の容積に相当する容積の 液体分析試料が、試料受けから反応室へ同時に転送されるように、構造の転送ゾ ーンを介する流体の通路がある。

（Ｉｔ’）全血または血液由来試料（たとえばオウレンスの緩衝液で２〜２０倍 に希釈した）を試料受けに添加し、それにより試料を同時に反応室に導入し、試 薬を溶解させ、そして振動する磁場により誘起された振動パターン中で粒子が自 由に動くようにする。

（ＩＩＩ’）反応室を光学的に監視して、フィブリノーゲン分析の大めに、該磁 場に対する粒子の動きの度合いの変化に対応する開始時間および停止時間を測定 する。

（Ｉｖ、’）開始時間および停止時間を使用して、試料中のフィブリノーゲンの 濃度を測定する。

第５図は、５つの曲線を与えており、それぞれの曲線はレブチラーゼに基づく乾 式試薬による凝固曲線から得られた、異なる動的パラメータを表している。注は 、どの曲線がそれぞれのパラメータに対応するかを示している。第４図は、凝固 動力学に対するパラメータの関係を理解するための手助けとして使用できる。

表土において、縦座標は、パラメータの数値を示す。横軸は、パラメータを決定 する凝固動力学を得るために使用されたフィブリノーゲン欠損血漿で希釈された 貯蔵正常血漿（ＰＮＰ）のパーセントを示す。

第５図に示したデータから、種々のパラメータがフィブリノーゲンレベルに比例 することがわかる。

それらのパラメータを比較すると、Ａのみがフィブリノーゲンレベルの決定要素 としてはかなり劣っている。なぜなら、これは１００％〜２５％ＰＮＰで有意な 相違を示さないことによるものである。残りの４つの中で、（Ａ−Ｂ）／Ａおよ びＡｌ６は一般に最も正確なパラメータであり、Ａｌ６はこのシステムで測定可 能な最も低いフィブリノーゲン濃度で、より正確な値を示している。（Ａ−Ｂ） ／Ａは一般に高いフィブリノーゲンレベルにおいてより正確なパラメータである 。

（Ａ−Ｂ）／ＡはＩ−（Ｂ／Ａ）と導通であることが認められる。

第６図は、拡大した尺度でのＡｌ６および（Ａ−Ｂ）／Ａの曲線を示す。

第７図は、異なる一連の実験により得られたαおよびβの値を示す。αおよびβ の値はｔＢ”の間隔で積分して得られたものであり、ここで、ｔ　Ｂ　−−９０ 秒である。

レブチラーゼは一般に、動的凝固に基づくフィブリノーゲンの分析には、トロン ビンよりも好ましい。その理由は、それが、通常抗凝集系として使用されるヘパ リンに影響されないからである。好ましい乾式試薬製剤において、レブチラーゼ （緩衝液中）は、磁性粒子および分子ｊｌ　（Ｍｗ）が３４００〜１０，０００ のポリエチレングリコールと組み合わせられる。しかしながら、ポリエチレング リコールの分子量が３４００よりも幾分小さいものおよび１０，０００よりも大 きいもρも利用される。

乾式試薬混合物は水にポリエチレングリコールを溶解し、次いで、レブチラーゼ 試薬を添加して緩やかに混合して作成する。この溶液を、次いで、磁性粒子と混 合し、そして反応スライドに適用する。

他の好ましい乾式試薬マトリックスは、緩衝液化レブチラーゼ、磁性粒子および ウシ血清アルブミンから調製される。これは、水にウシ血清アルブミンを溶解し 、次いで、レプチラーゼ試薬を添加し緩やかに混合して作成する。この溶液を、 磁性粒子と混合し、そして反応スライドに適用する。

凝固形成動力学に基づく第一の実施態様は、一般に、凝固時間に基づく第二の実 施態様よりも、低い濃度の凝固形成試薬（トロンビンまたはヘビ毒）を利用する ことができたということを認識すべきである。使用する試薬の正確な濃度は、し かしながら、前述したように、試薬（たとえば、ウシ、ヒト、等）の種類と原料 および効力により変動するであろう。

第一の実施ａｎは、凝固形成試薬としてトロンボプラスチンをも利用することが できる。トロンボプラスチンは、第二の終点の実施態様には、凝固形成試薬とし て使用することができない。これは、この実施Ｊ様でのそれの使用が、フィブリ ノーゲンについて特異的な結果を与えないからである。

さらに他の実施態様は、第一の実施態様に匹敵する（トロンビンまたはヘビ毒の ）試薬濃度を利用することであるが、（第一の実施態様におけるような）凝固動 的パラメータの代わりに、未希釈試料の凝固時間を（第二の実施態様におけるよ うに）測定することである。このアプローチは、最も臨床的に有用な範囲のフィ ブリノーゲンレベル（低い正常値から正常値以下）に感度をａする定量的スクリ ーニング試験を提供し、未希釈全血または血漿試料からフィブリノーゲンの異常 性を、迅速に評価するのに有用である。トロンビンまたは適当なヘビ毒（たとえ ば、レプチラーゼ、カッパーヘッド毒またはマラヤビットクサリヘビ毒）の何れ も利用できる。この実施態様は、トロンビン時間、レブチラーゼ時間、もしくは 等価の試験または、判断のために標準曲線を使用した場合のフィブリノーゲン値 と同様の結果を与える。

本発明の数多くの修正および変形が、上記教示から可能であることは明らかであ る。それ故、添付した請求の範囲において、ここに具体的に記載した以外でも、 本発明は実施できるであろうことが理解される。

第１図 第２図 時間（秒） 第　３　図 第４図 ｏ　ａ／ｂ ＊　（ａ−ｂ）　Ｘｌ０−’ ａ　［（ａ−ｂ）／ａｌ　ＸＩＯ 第５図 第６図 第７図 国際調査報告

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．（ｉ）振動する磁場に、（１）液体試料を受けるための試料受けおよび（２ ）試薬マトリックスに均一に分布した複数の磁性粒子が埋め込まれている乾式試 薬マトリックスを含有する反応室を有する反応スライドを委ね、ここで、該試薬 は、フィブリノーゲンへ直接作用するか作用を促進し、そしてフィブリノーゲン の重合を誘起するプロテアーゼであり； 該試料受けおよび反応室は、該試料受け中に置かれた該反応室の容積に相当する 容積の液体分析試料が、該試料受けから該反応室へ同時に転送されるような転送 ゾーンを介する流体の通路があり； （ｉｉ）全血または血液由来試料を該試料受けに添加し、それにより該試料を同 時に反応室に導入し、該試薬を溶解させ、そして該振動する磁場により誘起され た振動パターン中で該粒子が自由に動くようにし；（ｉｉｉ）該反応室を光学的 に監視して、（ｉｉｉａ）該該振動する磁場に対する粒子の動きの度合いの変化 に対応する、該フィブリノーゲン分析のための開始時間および停止時間、もしく は（ｉｉｉｂ）該粒子振動の最大振幅、Ａ、およびそれに続く、該粒子振動の、 残留、後ピークの最小振幅、Ｂ、または（ｉｉｉｃ）該粒子振動曲線の傾きもし くはＡとＢの間の該曲線により定義される領域、の何れかを測定し；そして、 （ｉｖ）該開始時間および該停止時間、もしくは少なくともＢ、もしくは該傾き 、または該領域を使用して、該試料中の凝固し得るフィブリノーゲンの濃度を測 定することから成ることを特徴とするフィブリノーゲン分析方法。 ２．該試薬が、プロテアーゼの活性化およびそれに続く凝固カスケードを介して フィブリノーゲン重合を開始させることが可能なトロンボプラスチンであり、そ して少なくともＢ、または該曲線により定義される領域が、試料中の凝固可能な フィブリノーゲンの濃度を測定するために使用される請求の範囲第１項記載の方 法。３．該プロテアーゼが、ヒトトロンビン、ウシトロンビン、レプチラーゼ、 カッパー・ヘッド毒酵素、またはマラヤ・ピット・クサリヘビ毒酵素から成る群 より選ばれた１つである請求の範囲第１項記載の方法。 ４．（ｉ）振動する磁場に、（１）液体試料を受けるための試料受けおよび（２ ）試料マトリックスに均一に分布した複数の磁性粒子が埋め込まれている乾式試 薬マトリックスを含有する反応室を有する反応スライドを委ね、ここで、該試薬 は、フィブリノーゲン分析試薬から成る群より選ばれた１つであり；該試料受け および反応室は、該試料受け中に置かれた反応室の容積に相当する容積の液体分 析試料が、該試料受けから該反応室へ同時に転送されるような構造の転送ゾーン を介する流体の通路があり；（ｉｉ）全血または血液由来試料を該試料受けに添 加し、それにより該試料を同時に反応室に導入し、該試薬を溶解させ、そして該 振動する磁場により誘起された振動パターン中で該粒子が自由に動くようにし； （ｉｉｉ）該反応室を光学的に監視して、該振動する磁場に対する粒子の動きの 度合いの変化に対応する、該フィブリノーゲン分析のための開始時間および停止 時間を測定し；そして （ｉｖ）該開始時間および該停止時間を使用して、該試料中の凝固し得るフィブ リノーゲンの濃度を測定することから成ることを特徴とするフィブリノーゲン分 析方法。 ５．該乾式試薬が、トロンビンを含む請求の範囲第４項記載の方法。 ６．該乾式試薬が、レプチラーゼ、カッパーヘッド毒酵素、またはマラヤ・ピッ ト・クサリヘビ毒酵素を含む請求の範囲第４項記載の方法。 ７．（ｉ）振動する磁場に、（１）液体試料を受けるための試料受け、（２）反 応室、および（３）該試料受けおよび該反応室の間に配置され、そしてその間の 液体の伝達をする溝手段を有する反応スライドを委ね；該反応室は、試素マトリ ックスに均一に分布した複数の磁性粒子が埋め込まれている乾式試薬マトリック スを含有し、該試薬マトリックスは該試薬室のみに存在し、そして、該試薬は、 フィブリノーゲン分析試薬から成る群より選ばれた１つであり； （ｉｉ）ある容積の全血または血液由来試料を該試料受けに添加し、該試料の該 容積は、該反応室に入らずにまたは該乾式試薬マトリックスと接触させずに該溝 手段を実質的に満たすに充分な置であり；（ｉｉｉ）ある容積の緩衝液希釈剤を 該試料受けに加え、該緩衝液の該容積は、該反応室に該試料を洗い流すに充分な 量であり、それにより該試薬を溶解させ、そして該振動する磁場により誘起され た振動パターン中で該粒子が自由に動くようにし； （ｉｖ）該反応室を光学的に監視して、該振動する磁場に対する粒子の動きの度 合いの変化に対応する、該フィブリノーゲン分析のための開始時間および停止時 間を測定し；そして （ｖ）該開始時間および該停止時間を使用して、該試料中の凝固し得るフィブリ ノーゲンの濃度を測定することから成ることを特徴とするフィブリノーゲン分析 方法。 ８．（ｉ）振動する磁場に、（１）液体試料を受けるための試料受けおよび（２ ）試薬マトリックスに均一に分布した複数の磁性粒子が埋め込まれている乾式試 薬マトリックスを含有する反応室を有する反応スライドを委ね、ここで、該試薬 は、フィブリノーゲン分析試薬から成る群より選ぼれた１つであり；該試料受け および反応室は、該試料受け中に置かれた該反応室の容積に相当する容積の液体 分析試料が、該試料受けから該反応室へ同時に転送されるような構造の転送ゾー ンを介する流体の通路があり；（ｉｉ）全血または血液由来試料を該試料受けに 添加し、それにより該試料を同時に反応室に導入し、該試薬を溶解させ、そして 該振動する磁場により誘起された振動パターン中で該粒子が自由に動くようにし ；（ｉｉｉ）該反応室を光学的に監視して、該粒子振動の最大振幅、Ａ、および それに続く、該粒子振動の、残留、後ピークの最小振幅、Ｂを測定し；そして（ ｉｖ）少なくともＢを使用して、該試料中の凝固し得るフィブリノーゲンの濃度 を測定することから成ることを特徴とするフィブリノーゲン分析方法。 ９．Ｂを該試料中の該フィブリノーゲン濃度を測定するために使用する請求の範 囲第８項記載の方法。 １０．比Ａ／ＢまたはＢ／Ａを該試料中の該フィブリノーゲン濃度を測定するた めに使用する請求の範囲第８項記載の方法。 １１．Ａ−Ｂを該試料中の該フィブリノーゲン濃度を測定するために使用する請 求の範囲第８項記載の方法。 １２．（Ａ−Ｂ）＋ＡまたはＡ＋（Ａ−Ｂ）を該試料中の該フィブリノーゲン濃 度を測定するために使用する請求の範囲第８項記載の方法。 １３．Ａ／Ｂおよび（Ａ−Ｂ）＋Ａを該試料中の該フィブリノーゲン濃度を測定 するために使用する請求の範囲第８項記載の方法。 １４．ＡとＢの間の領域にある凝固曲線の傾きを該試料中のフィブリノーゲン濃 度を定量するために使用する請求の範囲第８項記載の方法。 １５．ＡとＢの間の領域またはその一部により定義される凝固曲線の上もしくは 下の領域を該試料中のフィブリノーゲン濃度を定量するために使用する請求の範 囲第８項記載の方法。 １６．該乾式試薬が、トロンボプラスチンを含む請求の範囲第８項記載の方法。 １７．該乾式試薬が、トロンビンを含む請求の範囲第８項記載の方法。 １８．該乾式試薬が、レプチラーゼ、カッパーヘッド毒酵素、またはマラヤ・ピ ット・クサリヘピ毒酵素を含む請求の範囲第８項記載の方法。 １９．（ｉ）振動する磁場に、（１）液体試料を受けるための試料受け、（２） 反応室、および（３）該試料受けおよび該反応室の間に配置され、そしてその間 の流体の伝達をする溝手段を有する反応スライドを委ね；該反応室は、試素マト リックスに均一に分布した複数の磁性粒子が埋め込まれている乾式試薬マトリッ クスを含有し、該試薬マトリックスは該試薬室のみに存在し、そして、該試薬は 、フィブリノーゲン分析試薬から成る群より選ばれた１つであり；（ｉｉ）全血 または血液由来試料を該試料受けに添加し、該試料の容積は、該溝手段を実質的 に満たし、そして該試薬と混合し該試薬を該反応室に洗い出すに充分な量であり 、それにより該磁性粒子を該振動する磁場により誘起される振動パターン中で自 由に動けるようにし； （ｉｖ）該反応室を光学的に監視して、（ｉｖａ）該振動する磁場に対する粒子 の動きの度合いの変化に対応する該フィブリノーゲン分析のための開始時間およ び停止時間、もしくは（ｉｖｂ）該粒子振動の最大振幅、Ａ、およびそれに続く 、該粒子振動の、残留、後ピークの最小振幅、Ｂ、または（ｉｖｃ）該粒子振動 曲線の傾きもしくはＡとＢの間の該曲線により定義される領域、の何れかを測定 し；そして（ｖ）該開始時間および該停止時間、もしくは少なくともＢ、もしく は該傾き、または該領域を使用して、該試料中の凝固し得るフィブリノーゲンの 濃度を測定することから成ることを特徴とするフィブリノーゲン分析方法。 ２（）．工程（ｉｉ）の前に、該血栓または該血液由来試料の添加に先立ち、あ る量の蒸留水を、該溝に毛細管作用を起こすに充分な量で添加し、それにより該 乾式試薬を溶解させ、かつ、該磁性粒子を自由にする請求の範囲第１９項記載の 方法。 ２１．（ｉ）全血または血液由来試料を反応スライドの試料受けに添加し、該反 応スライドは、（１）液体試料を受けるための該試料受け、（２）反応室、およ び（３）該試料受けおよび該反応室の間に配置され、そしてその間の流体の伝達 をする溝手段を有しており； 該溝手段は、試素マトリックスに均一に分布した複数の磁性粒子が埋め込まれて いる乾式試薬マトリックスを含有し、該試薬マトリックスは該溝のみに存在し、 そして、該試薬は、フィブリノーゲン分析試薬から成る群より選ばれた１つであ り； 該試料受けに添加される該全血または血液由来試料の容積は、該溝手段および該 反応室を実質的に溝たし、そして該試薬を該反応室に洗い出すに充分な量であり 、それにより該磁性粒子を自由にする；（ｉｉ）該反応スライドを振動する磁場 に、該全血または該血液由来試料を該試料受けに添加する時またはその少し後の 何れかに、委ね、該振動する磁場は、該自由磁性粒子を振動パターン中で運動を 起こさせ；そして（ｉｉｉ）該反応室を光学的に監視して、該試料中の凝固し得 るフィブリノーゲンの濃度を測定するために、（ｉｉｉａ）少なくとも該磁性粒 子の振動の後ピークの最小振幅、（Ｂ）、もしくは（ｉｉｉｂ）該粒子振動の振 幅の傾き、または（ｉｉｉｃ）該粒子振動の最大振幅、Ａと、Ｂの間の該振幅の 曲線により定義される領域、の何れかを測定することから成ることを特徴とする フィブリノーゲン分析方法。 ２２．磁性粒子および、直接フィブリノーゲンに作用するか作用を促進し、フィ ブリノーゲンの重合を誘起する、プロテアーゼまたは補助因子を含むことを特徴 とするフィブリノーゲン分析を行うための乾式試薬組成物。 ２３．該乾式試薬が、さらに緩衝液およびポリエチレングリコールまたはウシ血 清アルブミンを含む請求の範囲第２２項記載の乾式試薬組成物。