JPH06500471A - Ｄｎａ増幅フィンガープリント法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ＤＮＡ増幅フィンガープリント法 本発明は核酸のサンプル中に存在する核酸配列の増幅方法、およびそれらの核酸 配列を検出することに関する。より詳細には、本発明は特徴的であるがしかし不 特定の配列を、与えられた核酸配列から最初に存在した量より多い量製造する方 法に関する。本発明の方法は、所望核酸配列の増幅を達成するために反復反応を 利用する。

ＤＮＡの「フィンガープリント法」としても知られているＤＮＡのプロフィール 分析は、ヒトゲノムの研究、リンケージ分析、遺伝疾患傾向の予知、親子関係の 決定、遺伝的相違の研究のための重要な手段となっており及び法医学や疫学のた めの強力な識別手段となっている。初期のＤＮＡフィンガープリントの技術にお いては、サンプルＤＮＡを何百万もの断片（反復セグメントを有する断片を含む ）に切断するために制限酵素が使用された。生じたフラグメントは、次にゲル電 気泳動で分離された。この技法を用いると、フラグメントの濃度が低すぎて、そ の同定にはクローン化した放射活性プローブを用いる必要があった。プローブは 唯一つの特定の核酸配列を同定するように設計されており、何百万ものうちのほ んの僅かのセグメントのみしか同定されない。オートラジオグラフを現像すると き、得られるバンドは、制限フラグメントの長さの多形性（ｒｅｓｔｒｉｃｔｉ ｏｎ　ｆｒａｇｍｅｎｔ　ｌｅｎｇｔｈ　ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ：ＲＦＬＰ ）を生じる。制限酵素で生じるフラグメントの長さに相違がある場合には、それ らのフラグメントは多形性（ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｏｕｓ）であると考えられる。

二つのサンプルが同じ生物に属するか否かを調べるためには、多形性フラグメン トおよび非多形性フラグメントが使用される。この技術は広く使用されているも のの、この技術は相当にＤＮＡの操作を要求し、フィンガープリント間の相違の 同定には、クローン化ＤＮＡプローブの入手可能性に左右される。

ポリメラーゼ・チェイン・リアクション（ＰＣＲ）は、分子生物学の研究の重要 な操作であり、ＤＮＡのフィンガープリント分析にも用いられている。ＰＣＲの 技術はｉｎ　ｖｉｔｒｏ法であり、ゲノム配列またはクローン化標的配列は、一 対の高度に特異的なオリゴヌクレオチドプライマーの司令を受けて、酵素的に増 幅される。増幅は反復反応により生じ、そこでは最初ＤＮＡサンプル中に存在し た量に比べて多量の標的配列ＤＮＡか製造される。ＰＣＲはストリンジェントな りＮＡハイブリダイゼーションおよび酵素反応条件並びにプライマーの絶対的特 異性に依存する。さらに、ＰＣＲ反応は、一本の標的配列の増幅のために、各々 典型的には長さか２０塩基対を超える二つの独特のプライマーを必要とする。

本発明の目的は、特定されないがしかし特徴的なりＮＡ配列を増幅する方法を提 供することである。本発明の目的は、この増幅をＲＦＬＰで要求されるＤＮＡの 操作を行うことなく、もしくはＰＣＲの特異性を必要とすることなく、可能にす ることである。本発明の別の目的は、生物のＤＮＡのプロフィールを知るための 比較的簡単な方法を提供することである。

本発明は、少なくとも一つの核酸または核酸の混合物を含む鋳型中の核酸配列を 増幅する方法を提供するものであり、ここで、各核酸は一つの３′末端と一つの ５゛末端を有する少なくとも一つの鎖からなる。該方法は、先ず鋳型を少なくと も一つのオリゴヌクレオチドブライマーで処理し、該プライマーは鋳型の少なく とも一つの核酸配列と実質的に相補的な核酸配列を有しており、該処理はプライ マーが実質的に該プライマーと相補的な鋳型のセグメントに結合してプライムさ れた核酸の鎖を生じるような条件で行われる。次に、プライムされた鎖は延長核 酸鎖を生じ、該延長鎖は該プライマーと５°から３′の向きに鋳型と実質的に相 補的である配列との組み合せである。該延長鎖は次に、プライマーで処理されて 増幅核酸鎖を生じる。この増幅鎖もさらなる増幅鎖を生産するために、プライマ ーによって処理される。プライマーによる増幅鎖の処理は、複数回繰り返して、 多数の増幅鎖を生じさせる。増幅鎖の核酸配列は、最初の鋳型の核酸配列と実質 的に同様である。したがって、核酸の増幅されたセグメントは、前記核酸サンプ ルを代表するものである。

本発明の方法はＲＦＬＰおよびＰＣＲ法のいずれとも容易に区別される。ＲＦＬ Ｐは制限ヌクレーアーゼ類を用いて何百万本ものバンドを生せしめるが、しかし これらのバンドは低濃度である。したがって何百万本ものバンドが核酸プロフィ ール決定に得られるが、得られた何百万本ものバンドのいずれを可視化するにも 特定のプローブの使用か必要である。実際の状況下では、バンドのうちの数本か 可視化されるだけである。ＰＣＲのプライマーの特異性は数本のバンドを増幅さ れた濃度で与える。したがって、製造されたバンドは全て容易に可視化できるが 、しかしながら、数本のバンドのみしかプロフィール分析に利用できない。ＲＦ ＬＰおよびＰＣＲとは対照的に、本発明の方法は多くのバンド（同士ないし何口 のバンド）を、容易に可視化できる増幅濃度で製造する。したかって、本発明の 方法は従来法の長所を維持しつつ、両従来方法の欠点をともなわない。

簡単に述べると、本発明は鋳型中の核酸配列の増幅方法を提供し、該鋳型は少な くとも一つの核酸または核酸の混合物を含んでおり、ここで、各核酸は一つの３ ′末端と一つの５゛末端を有する少なくとも一つの鎖からなり、該方法は下記の 工程をその順で行うことよりなる： （ａ）該鋳型を、該鋳型上の少なくとも一つの核酸配列と実質的に相補的な核酸 配列を有する少なくとも一つのオリゴヌクレオチドブライマーで、該プライマー が該鋳型上の該プライマーと実質的に相補的なセグメントに結合して、プライム された核酸配列を生じるような条件下で、処理する：（ｂ）該プライマーと該プ ライマーから５′から３°の向きへ該鋳型と実質的に相補的な核酸配列との組み 合せからなる核酸の延長鎖を製造し；（Ｃ）該延長鎖を該プライマーで処理して 、プライムされた核酸延長鎖を製造し：（ｄ）該プライマーと該プライマーから ５°から３°の向きへ該延長鎖と実質的に相補的な核酸配列との組み合せからな る核酸増幅鎖を製造し；（６）該増幅鎖を該プライマーで処理してプライムされ た増幅核酸鎖を製造し；（ｆ）該プライマーと該プライマーから５゛から３′の 向きへ該第−増幅鎖と実質的に相補的な核酸配列との組み合せからなるさらなる 増幅鎖を製造し；そして（ｇ）工程（ｅ）および（ｆ）をその順で複数回繰り返 して、前記該核酸または核酸混合物中の核酸配列と実質的に同様な増幅鎖を多数 製造する。

核酸のプロフィールを調べるためには、バンドの本数が多く存在することはバン ド数が少ないことに比べて、一般に異なるサンプルを区別する能力がより大きい ことを意味する。例えば、一つの核酸プロフィール中の３３本の独立に変化する バンドは、８０億Å以上の識別を可能にするが、独立に変化するバンドが１０本 しか存在しないと、約１０００人に１人を識別できるにすぎない。選択されるプ ライマーの種類および核酸鋳型のタイプに応じて、本発明の方法は典型的には約 ５０本以上のバンドを生じ、そしてしばしば約１００本以上の可視化バンドを生 じる。多くのバンドは個体間で独立に変化する。しかも追加的に異なるプライマ ーを一緒にまたは別々に用いると、他の独立変化バンドを生じる。したがって、 本発明の方法は全人口から一人の核酸材料の同定を可能にする。

本発明の方法は各核酸サンプルに対して一つの容器で行うことができる。核酸の サンプルと生じた増幅核酸鎖は加熱により繰り返し分離される。冷却により溶液 中でプライマー配列は相補的核酸配列に付着する。次にポリメラーゼが該核酸鎖 に沿ってプライマーから５′から３゛方向に向かって合成される相補的核酸鎖の 生成を行う。短時間の後、溶液の温度を再度上昇させて核酸鎖の型を変性させる 。この繰り返しサイクルは、サンプル中の元の核酸のセグメントと同じ多数の核 酸配列を与える。

生じた核酸鎖を大きさで分けるためにゲル電気泳動に付する。ゲルの長さに沿っ て分布する増幅セグメントは、核酸サンプルに独自の像を示す。

本発明で用いられるプライマーのサイズは５塩基対より大きい。５塩基対より小 さいプライマーは一般に核酸フィンガープリント分析のために認識可能なフラグ メントを生じない。本発明の技術で用いられるいずれのプライマーに対しても、 特異的な配列は要求されない。異なるＤＮＡサンプルを比較する時に同じ配列を 使用する限り、任意の核酸配列をプライマーとして使用できる。特定のプライマ ー配列により生じるフィンガープリントはその配列独特のものであり、そして本 発明の方法を用いて同じサンプルにつき二つの別の時間に行っても再現性がある 。

本発明は、特定の限られた反応条件を要求しないという付加的利点を有する。

本発明は広い温度条件において再現性のある識別回能なフィンガープリントを生 じるであろう。反応混合物は９８℃の高温に加熱し、そして室温までの低温に冷 やすこともできる。典型的反応は、９５℃１秒、３０”Ｃ１０秒、および７２℃ ３分のサイクルを３０−５０回含む。

本発明により調製されるフラグメントに加え、増幅フラグメントはさらに制限酵 素で処理してサブフラグメントとし、それを用いてさらに特定の核酸配列の同定 を行うこともできる。

本発明は、図面を参照しつつ、以下の発明の詳細な説明を読めばさらに十分理解 されるであろう。

図１は本発明の詳細な説明する工程図である。

図２は本発明のプロフィール分析能力を証明するために、５°−ＣＧＣＧＧＣＣ Ａ−３°の配列のプライマーを用いて行った、数種類の異なる種の核酸プロフィ ールを含む電気泳動ゲルである。

図３は、長さおよび配列の異なるいくつかのプライマーを用いて行った、大豆Ｇ ｌ　ｃｉｎｅ　ｍａｘ　ｃｖ、ＢｒａｇｇのＤＮＡプロフィールを含む電気泳動 ゲルである。

図１を参照すると、文献で知られた多くの技術の一つ（例えば、Ｒ，Ｈ，Ｃｈｅ ｓｎｅｙ、Ｊ、Ｒ，５ｃｏｔｔおよびり、Ｊ、Ｖａｐｎｅｋ、Ｊ、Ｍｏ１．ｂｉ ｏｌ、、ｖｏｌ、１３０．ｐｐ、１６１−１７３　（１９７９））によって単離 された、ＤＮＡの最初のサンプルに、本発明の方法を用いる。核酸の最初の鋳型 １０を変性させて二つの相補鎖１２および１４を形成させる。相補鎖１２および １４を、一般に５ないし２５ヌクレオチドからなるプライマー１６で処理する。

長さが５ヌクレオチドより短いプライマーは、一般にプロフィール分析のために 認識可能なフラグメントを生じない。約２５ヌクレオチドより長いプライマーは 、一般に特定のヌクレオチド配列を用いないかぎり不十分な数の増幅セグメント しか生じない。このヌクレオチドの配列は知られているが、しかし本発明にとっ て配列が鋳型核酸１０の特定の知られたセグメントに対して相補的であることは 重要ではない。プライマーは、相補鎖１２および１４にたいしてプライマー１６ を構成するヌクレオチドに相補的な部位で付着し、プライムされた相補鎖を形成 する。このプライムされた相補鎖は、核酸ポリメラーゼで処理されて、延長核酸 鎖１８ａ−１８ｉを生じる。延長鎖１８ａ−１８ｉは、プライマーセグメント１ ６と核酸１２および１４の相補鎖のセクションに実質的に相補的な核酸配列２゜ ａ−２０ｉとの組み合せからなる。各延長鎖１８ａ−１８ｉは、相補鎖１２また は１４に沿って、延長鎖１８ａ−１８ｉの５゛末端から３゛末端へ向かって延長 する。延長鎖１８ａ−１８ｉの有する長さは、最大限、それ自身のプライマー１ ６から３′方向の次のプライマー１６の直前の点２２ａ−２２ｇ迄の長さである 。次にＤＮＡを変性させ、延長鎖１８ａ−１８＋をさらなるプライマー１６で処 理してプライムされた延長鎖を形成させ、ここで、プライマー１６はプライマー １６と相補的な部位で延長鎖１８ａ−１８ｉに付着する。プライムされた延長鎖 を核酸ポリメラーゼで処理すると増幅された核酸鎖２４ａ−２４ｇを生じ、６鎖 ２４ａ−２４ｇは、プライマー１６と延長鎖１８ａ−１８ｉのセクションに実質 的に相補的な核酸配列２６ａ−２６ｇとの組み合せからなる。増幅鎖２４ａ−２ ４ｇはポリメラーゼにより該増幅鎖２４ａ−２４ｇの３゛末端側で生じ、延長鎖 １８ａ−１８ｉのどのセグメントでも５′末端２８ａ−２８ｅに向かって形成さ れるであろう。例えば、増幅鎖２４ａは延長鎖１８ｃの５゛末端へと形成される 。次いで核酸は変性されて遊離の増幅鎖２４ａ−２４ｇを生じる。増幅鎖２４ａ −２４ｇはプライマー１６で処理されてプライムされた増幅鎖を生じる。さらに 、このプライムされた増幅鎖を核酸ポリメラーゼで処理すると、さらなる増幅鎖 ３０ａ−３０ｄを生じ、各３０ａ−３０ｄ鎖は、プライマー１６と増幅鎖２４ａ −２４ｄと実質的に相補的な核酸配列３２ａ−３２ｄとの組み合せからなる。増 幅鎖２４ａは増幅鎖３０ａの相補体であり、増幅鎖２４ｂは増幅鎖３０ｂの相補 体であり、等々である。このようにして、核酸の特定のセグメントはさらなる再 生産に使用される。変性工程、プライマー１６による処理、およびポリメラーゼ による処理は反復される。各々のさらなる処理は増幅鎖２４ａ−２４ｄおよび３ ０ａ−３０ｄを倍加させ、分析に供される増幅鎖の数を対数的に増加させる。本 発明の実際の実施においては、変性、それに続くプライマー処理、それに続くポ リメラーゼ処理の反復反応は、最初の核酸サンプルを過剰量のプライマーおよび ヌクレオチドと混合し、そして反応容器を温度変化のサイクルに通して行われる 。

核酸フラグメントの増幅が完了したら、フラグメントをゲル電気泳動で分離して 、銀染色等で可視化する。図１は本発明の方法で増幅された二つの異なる鎖の生 産を示している。しかしながら、実施に際しては、図２および３に説明するよう に、多数の鎖を増幅し、分離し、可視化することができる。

プライマーの長さは５ヌクレオチドより大きい。好ましくは、プライマーの長さ は約１０ヌクレオチドである。５ヌクレオチドより小さいプライマーは、ＤＮＡ のプロフィール分析のために必要な増幅フラグメントを生じない。約２５ヌクレ オチドよりはるかに長いプライマーは、特定のヌクレオチド配列を用いるのでな い限り、不十分な増幅セグメントしか生じない。本発明の方法では特定のヌクレ オチド配列を用いることもできるが、本発明のプライマーとして特定のヌクレオ チド配列を用いることは必要ではない。しかしながら、異なるサンプルのポリモ ルフイズムを比較する場合には、同じプライマーを使用する必要がある。

本発明のより十分な理解を得るため、以下の実施例により、主として本発明のよ り具体的詳細を説明する。

実施例 核酸サンプルは確立した方法で調製した（例えば、Ｒ，Ｈ，Ｃｈｅｓｎｅｙ。

Ｊ、Ｒ，５ｃｏｔｔおよびり、Ｊ、Ｖａｐｎｅｋ、Ｊ、Ｍｏ１．Ｂｉｏｌ、、ｖ ｏｌ、１３０．ｐｐ、１６１−１７３　（１９７９）；Ｓ、Ｌ、Ｄｅｌｌａｐｏ ｒｔａ、Ｊ、ＷｏｏｄおよびＪ、Ｂ、Ｈｉｃｋｓ、Ｐｌａｎｔ　Ｍｏ１．Ｂｉｏ ｌ、Ｒｅｐｏｒｔｅｒ、ｖｏｌ、１．ｐｐ、１９−２１　（１９８３）およびＡ 、Ｊ、Ｊｅｆｆｒｅｙｓ、Ｖ、ｗｉ　ｌ５ｏｎおよびＳ、Ｌ、Ｔｈｅｉｎ、Ｎａ ｔｕｒｅ、ｖｏｌ、３１４．ｐｐ、６７−７３　（１９８５））ｏ増幅は全量１ ００μｌ中で、１０蛎トリス塩酸（ｐＨ８，３）　、５０ｒｒＭ　ＫＣｌ、２． 　５ｍＭ　ＭｇＣＩ２および０．０１％（Ｗ／　Ｖ）ゼラチン（シグマ製）から なる反応バッファー中のサンプル核酸１１０−２０ｐ、プライマー（５−９塩基 対のオリゴヌクレオチド）１μｇおよび核酸ポリメラーゼ（パーキン−エルマー ／シーラス製のＡｍｐ　ｌ　１Ｔａｑ　ＤＮＡポリメラーゼ）２．５単位を用い て行った。デオキシリボヌクレオシド三リン酸（ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ 、ｄＴＴＰ）も反応バッファーに各々２００μＭの濃度で添加した。反応混合物 を２滴のミネラルオイルで覆い、５分間９５℃にインキュベートし、冷却水浴に 接続した熱サイクル装置（Ｅｒｉｃｏｍｐ製）で、９５℃１秒、３０℃１０秒お よび７２℃３分のサイクルを３０−５０回反復して増幅を行った。熱サイクル装 置の加熱および冷却速度はそれぞれ２３°／分および１４°／分であった。サン プル温度は熱探知プローブで継続的に監視した。増幅フラグメントを、バイオ− ラッド製のＭｉｎｉ−ＰｒｏｔｅａｎＩＩを用いて、アクリルアミドとピペラジ ン・ジアクリルアミド（バイオーラッド）の比率を２０：１とした５％アクリル アミドおよび７Ｍ尿素（バイオ−ラッド）の０．４５ｍｍのスラブゲルによるポ リアクリルアミドゲル電気泳動で分離した。ゲルおよび泳動バッファーは、１１ ００ｏトリス塩酸、８３−ホウ酸および１ｍＭ　Ｎａ２ＥＤＴＡ、ｐＨ８，０の ＴＨＥバッファーで調製した。電気泳動は７０ｖで、色素先端（キシレン・シア ツール　ＦＦ）がゲルの底に達するまで行った。核酸フラグメントのバンドを、 Ｄ、Ｇｏ　ｌｄｍａｎおよびＣ，Ｒ，Ｍｅ　ｒｒｉ　Ｉ、Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏ ｒｅｓｉｋ、ｖｏｌ、３．ｐｐ、２４−２６　（１９８２）の方法にしたがって 銀染色して可視化した。

図２は５’−ＣＧＣＧＧＣＣＡ−３’の配列をもつ一つのプライマーを用いてい くつかの異なる種のＤＮＡプロフィールを調べたもので、その結果、同じプライ マーで処理された異なる生物の核酸が、種々のパターンを生じた。各生物は本発 明の方法による増幅の後、異なる一連バンドを生じた。例えば、実験すは白人の 核酸のパターンを示すが、これは明らかに図２の他のいずれのパターンとも異な る。しかしながら、実験ｄ、ｅおよびｆを比較すると、近縁関係の種でも区別さ れることが示されている。実験ｄ−ｆは大豆間のＤＮＡプロフィールを示す。

実験ｄおよびｅは旦上り車上ユ且　工且五種のモノで、実験ｆは旦ユＬ車上ユ旦 １立上且種のものである。ポリモルファスなバンドの数から、Ｇ、ｍａｘと旦、 王立上ｌとが関連種であることは明らかである。しかしながら、実験ｄおよびｅ の核酸の相互関係は実験ｆの核酸との関係に比べてより密接であることもまた明 らかである。実験ｄでは栽培品種Ｂｒａｇｇを用い、実験ｆでは栽培品種Ｐｅｋ ｉｎｇが用いられた。これら二種の栽培品種は多くのボリモルファスなバンドを 生じたが、しかしながら非ポリモルファスパントもまた生じた。このようにして 、同じ種の二つの栽培品種を区別することが可能である。

図２はまた、本発明の技術が広範な生物に適用できることも示している。実験す は哺乳類組織からのＤＮＡを使用し、実験ｃ−ｈは植物組織を使用し、そして実 験ｉはファージからのＤＮＡを使用している。表１は実験ａ−ｉの詳細を示す。

紅 怨　生抜　コメント ａ　ファージＸ１７４のＨａｅｌＩＩ消化物　サイズ標準品ｄ　車上ヱ旦土ユ見 　エエ基　ｃｖ、Ｂｒａｇｇ　ダイ：ｆ。

ｅ　立上ヱ車上ユ旦　工立入　ｃｖ、Ｐｅｋｉｎｇ　ダイｆ：ｆ　車上り車上ユ 且１立土且　ＰＩ　４６８．３９７　ダイズｇ　バミューダ草（ｂｅｒｍｕｄａ ｇｒａｓｓ）　−−ｈ　ムカデ草（ｃｅｎｔ　ｉｐｅｄｅｇｒａｓｓ）　−−１ ラムダファージ　ｃ１８５７ｓａｍ７　−−ｊ　プラスミドｐＢＲ３２２のＢｓ ｔ　Ｎｌ消化物　サイズ標準品図３は、大豆の一つの種、Ｇ、ｍａｘ　ｃｖ、Ｂ ｒａｇｇについて、長さおよび配列の異なるプライマーを用いて得られたプロフ ィールである。実験に−ｎは同じ栽培品種からの異なるサンプルに適用したとき の再現性を示す。四つのサンプルをプライマー〇ＧＣＧＧＣＣＡで処理したとき 、四つのプロフィールに相違が認められなかった。さらに、実験ｏ−ｑは実験に −ｎで使用したものと異なるプライマーによるプロフィールを示す。実験ｒおよ びＳは、４塩基プライマーは、本発明の核酸プロフィール分析のために必要なバ ンドを生じないことを示す。

図３のプロフィールの詳細を表ＩＩに示す。

表■ 実験　プライマー（５°−３°）　コメントｋ　ＣＧＣＧＧＣＣＡ　８塩基体 Ｉ　ＣＧＣＧＧＣＣＡ　８塩基体 ｍ　ＣＧＣＧＧＣＣＡ　８塩基体 ｎ　ＣＧＣＧＧＣＣＡ　８塩基体 ｏ　ＣＧＧＣＧＧＣＧＧ　９塩基体 ｐ　ＡＡＴＧＣＡＧＣ８塩基体 ｑ　ＣＣＴＧＴ　５塩基体 ｒ　ＡＣＧＴ　４塩基体 ｓ　ＧＣＧＣ４塩基体 ｔ　プラスミドｐＢＲ３２２のＢｓｔ　Ｎｌ消化物　サイズ標準品上記結果から 、本発明は不特定のしがし反復性のＤＮＡ配列の増幅のための方法を提供したこ とが理解されよう。さらに、本発明はＲＦＬＰ法で必要なりＮＡ操作やＰＣＲ法 の厳密性を必要とせずにそのような増幅を可能にする。さらに、本発明は生物の ＤＮＡプロフィールを調べる比較的簡単な方法を提供する。さらに、本発明は種 々のプライマーを用いて広範な生物に適用できる。

新規であると信じられる本発明の種々の態様を請求の範囲に記載する。

平成　５年　４月　工日

Claims (6)

【特許請求の範囲】
1. １．各々が一つの３′末端と一つの５′末端を持つ少なくとも一本の鎖からなる 少なくとも一つの核酸または核酸の混合物からなる鋳型中の核酸配列の増幅方法 において、以下の工程をその順に行うことからなる方法：（ａ）該鋳型を、該鋳 型上の少なくとも一つの核酸配列と実質的に相補的な核酸配列を有する少なくと も一つのオリゴヌクレオチドプライマーで、該プライマーが該鋳型上の該プライ マーと実質的に相補的なセグメントに結合して、プライムされた核酸配列を生じ るような条件下で、処理する；（ｂ）該プライマーと該プライマーから５′から ３′の向きへ該鋳型と実質的に相補的な核酸配列との組み合せからなる核酸の延 長鎖を製造し；（ｃ）該延長鎖を該プライマーで処理して、プライムされた核酸 延長鎖を製造し；（ｄ）該プライマーと該プライマーから５′から３′の向きへ 該延長鎖と実質的に相補的な核酸配列との組み合せからなる核酸増幅鎖を製造し ；（ｅ）該増幅鎖を該プライマーで処理してプライムされた増幅核酸鎖を製造し ；（ｆ）該プライマーと該プライマーから５′から３′の向きへ該第一増幅鎖と 実質的に相補的な核酸配列との組み合せからなるさらなる増幅鎖を製造し：そし て（ｇ）工程（ｅ）および（ｆ）をその順で複数回繰り返して、前記該核酸また は核酸混合物中の核酸配列と実質的に同様な増幅鎖を多数製造する。
2. ２．プライマーの核酸配列が鋳型の核酸配列のいずれとも実質的に相補的である ことが知られていないものである、請求項１記載の方法。
3. ３．プライマーが少なくとも約５ヌクレオチドを有するが、長さが約２５ヌクレ オチドより短い、請求項１記載の方法。
4. ４．プライマーの長さが、約５ないし約１０ヌクレオチドである、請求項３記載 の方法。
5. ５．ヌクレオチドプライマーが複数の異なる核酸配列からなる、請求項１記載の 方法。
6. ６．増幅した鎖を制限酵素で処理して、制限酵素消化された増幅核酸鎖を生じさ せる工程をさらに含む、請求項１記載の方法。