JPH06500556A - 連結分子を介する３’―尾分子付オリゴヌクレオチドの固体支持体合成 - Google Patents

Abstract

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Description

【発明の詳細な説明】 連結分子を介する３゛−尾分子付オリゴヌクレオチドの固体支持体合成（発明の 背景） 本発明は連結分子を介するオリゴヌクレオチド３゛位末端に結合した低分子量の 尾分子（ｔａｉｌ　ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ）を有するオリゴヌクレオチドの合成法 、３゛位末端に結合した低分子置屋分子を有するオリゴヌクレオチドおよびかか るオリゴヌクレオチド合成に利用される中間体に関する。

オリゴヌクレオチドはＤＮＡのポリメラーゼ連鎖反応の合成に関しプライマーと して作用することを含め、種々の用途を有する。オリゴデオキシヌクレオチド（ ＯＤＮ）はホスファイト−トリエステル合成法を用い、固相担体で都合よく合成 される。かかる合成の詳細はティ・アドキンスらの文献を参照［Ｔ、　Ａｔｋｉ ｎｓｏｎ。

Ｍ、　Ｓ　ｗｉｔｈ、　Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅａｔｉｄｅ　５ｙｎｔｈｅｓｉｓ 、　Ａ　ｐｒａｃｔｉｃａｌ　Ａｐｐｒｏａｃｈ、　Ｍ、　i　、　Ｇａ１ ｔ（ｅｄ、）、　Ｉ　ＲＬ　ｐｒｅｓｓ、ｐｐ３５〜８１（１９８４））　ｏこ の文献は、オリゴヌクレオチドの実際の合成につき工程条件による詳細な工程を 開示する。事実、この文献に記載された方法は、現在種々の製造業者から入手可 能な市販のオリゴヌクレオチド合成機において利用されている。

アセラインら（Ａｓｓｅｌｉｎ　ｅｅｔ、ａｌ（Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ 、Ｓｃｉ　旦１．３２９７〜３３０１（１９８４）））はある種のオリゴヌクレ オチドの合成を開示する。そこでは、インターカレーティング試薬をオリゴデオ キシヌクレオチドに共有結合的に結合させている。用いたインターカレーティン グ試薬は２−メトキシ−６−クロロ−９−アミノアクリジンである。アクリジン 分子はオリゴヌクレオチドに、オリゴデオキシヌクレオチドの３′−ホスフェー トを当該アクリジン分子の９−アミノ基に連結させる炭素数３〜６のメチレン鎖 を介して、共有結合的に結合されている。この研究の著者は、アクリジン修飾の オリゴヌクレオチドが相補的配列の存在下にインターカレーティング試薬（即ち 、アクリジン）によって大きな安定性を示すことを見出だしている。この著者は ある種の熱力学的パラメーターを測定し、これらのパラメーターを介して、アク リジン環の共有結合が合成オリゴヌクレオチドの相補的配列への結合を強力に安 定化させることを示している。結合したインターカレーティング試薬および相補 的な鎖を有するオリゴヌクレオチドの溶融温度（Ｔ＋ａ）は、インターカレーテ ィング試薬および相補釣鐘を有しない同様なオリゴヌクレオチドの溶融温度より もより高い。以上の結果は、インターカレーティング試薬の存在がオリゴヌクレ オチドとその相補釣鐘の間において形成された複合体（コンプレックス）を強力 に安定化させることを明確に示していると、かかる著者は結論している。

同様の研究で、レソトシンガーらは（Ｌｅｔｓｉｎｇｅｒ　ｅｔ、　ａｌ、　（ Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　ｓｃｉ、８６．６５５３〜６５５６（１ ９８９）））、ヌクレオチドの３゛位末端の間のホスフェート結合において共有 結合したコレステリル基を持った１群のオリゴヌクレオチドを製造している。種 々の長さのオリゴマーが合成されている。３゛位末端または３゛位と５′の両末 端のいずれかに隣接してコレステリル部分を持つオリゴマーを、そのように置換 しなかったオリゴマーと比較している。これらの化合物はＨＩＶ−複製に対する 抑制作用について試験された。２０個のオリゴヌクレオチドの３゛位末端に隣接 して１つのコレステリル基を固定すると、オリゴヌクレオチドの抗菌活性が実質 的に増大した。第２コレステリル基をオリゴヌクレオチドの５“末端に固定する と、モノコレステリル誘導体オリゴマーに比し、抗菌活性が減少した。

レットシンガーらの化合物は、まず、支持体結合・ジヌクレオシド水素ホスホネ ート誘導体を手作業で製造された。次いで、コレステリル基をヌクレオチド相互 間のリンに、酸化ホスホロアミド化により結合させる。オリゴヌクレオチドはホ スホロアミド化を用い、市販のＤＮＡ合成機により最初のジヌクレオシドから伸 張合成された。

市販のオリゴヌクレオチド合成用に制御された細孔付ガラスピーズは、入手可能 である〔ＣＰ　Ｇ、　Ｉ　ｎｃ、　、　Ｐ　１ｅｒｃｅ　Ｃｈｅｓｉｃａｌ　Ｃ ｏ、およびＳｉｇｍａ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏ、］。前記のごとく（アドキン スおよびスミス）、制御された細孔付ガラスピーズ（以下、ＣＰＧ）は、長鎖の アルキルアミン、たとえばその末端において利用可能な遊離のアミノ基を有し一 方ではＣＰＧに結合されているアルキルアミンを用い、製造業者により変性され る。その合成の間に成長するオリゴヌクレオチドへの結合のために、ＣＰＧ上の 長鎖のアルキルアミンの末端アミンとの種々なアミド結合が得られる。この合成 の改良はボンら（Ｐａｎ　ｅｔ、ａｌ、　ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ６　（８ ）。

７６８（１９８８））］によって報告された。この報告に、おいて、ボンらは長 鎖アルキルアミンＣＰＧ上の有り得る汚染側鎖を予めキャップし、ごく普通に用 いられる有毒な結合試薬ＤＣＣ（ジシクロへキシルカルボジイミド）に代えて、 ＤＥＣ（水溶性カルボジイミドである１−（３−ジメチルアミノプロピル）−３ −エチルカルボジイミドまたはＥＤＣ）の使用を導入している。

ネルソンら［Ｎｅ１ｓｏｎ　ｅｔ、ａｌ（Ｎｕｃ、Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅ５ｅａｒｃ ｈよヱ（１８）、７１８７〜７１９４（１９８９））：ｌは近年３′末端置換基 を組み込んだオリゴヌクレオチドの合成を報告する。３′位末端尾分子付オリゴ ヌクレオチドの製造ために、ネルソンらはＤＭＡＰ（ジメチルアミノピリジン） の存在下に無水コハク酸で処理して第二級ヒドロキシ基のＮ−Ｆｍｏｃ−０−Ｄ ＭＴ−アミノ−１，２−プロパンジオールを誘導し、その後、ＤＣＣ中ｐ−二ト ロフェノールで処理した。活性化した誘導体は次いで長鎖アルキルアミンＣＰＧ 担体に固定する。ジメトキシトリチル保護基を第一級アルコールのプロパンジオ ールからはずし、オリゴヌクレオチドをＣＰＧ担体に固定したまま第一級ヒドロ キシ基から段階的に合成する。合成ヌクレオチドを脱保護し、ＣＰＧ担体から分 離させた。しかし、この３゛−アミン修飾オリゴヌクレオチドの純度は証明され ていない。この合成のこの段階では、３゛位末端置換基が未だオリゴヌクレオチ ドと結合せねばならない。粗製のオリゴヌクレオチドをビオチン−ＸＸ−ＮＨＳ エステルでビオチニル化する。ビオチニル化ののち、セファデックスとＨＰＬＣ の両方による第２精製が必要である。

ネルソンらの上記方法は尾分子形成試薬で誘導、修飾可能な官能基を有するオリ ゴヌクレオチドを形成し、次いで再精製している。しかし、尾分子形成試薬での 誘導化は、オリゴヌクレオチド合成の完了後においてのみ行なわれるものである 。系統的に段階を経てヌクレオチドをヌクレオチドによって組み立てようやく完 成した貴重なオリゴヌクレオチドが、かがるオリゴヌクレオチドに対する誘導化 に起因する不完全な反応、副反応、誘導化後に必要な多数の精製操作で損失を被 るのである。加えて、この合成は、前記したボンらの改善を採用していない。

（発明の概説） オリゴヌクレオチドの有用性は、例えば、ＬｅｔｓｉｎｇｅｒらおよびＡｓ５ｅ ｌｉｎｅらの３−尾分子付コレスチロールおよび３′−尾分子付アクリジンオリ ゴヌクレオチドに関する上記の例のように３゛末端に低分子量の基を含むことに よって、向上させることができる。血清中の３′−尾分子付オリゴヌクレオチド の安定性もまた増大される。例えば、未修飾のＯＤＮは血清を含む媒体中では３ −オキソヌクレアーゼにより急速に分解される。３°−末端ホスホジエステルの ある種の化学修飾はこの分解を防ぐことができる。ショーら［５ｈｏｖ　ｅ　ｔ 、ａ　１．　（Ｎｕｃｌ。

Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、　１９（４）、７４７（１９９１））］は最後の二つのヌ クレオチド間のホスホジエステル結合をホスホロチオエート、ホスホロアミデー ト、または逆の結合に変換するとヌクレアーゼに対する安定性を著しく改善した 。ヌクレアーゼ安定性を改善することが明らかとなった他の結合にはα−デオキ シヌクレオチド誘導体およびメチルホスホネート誘導体がある。

本発明の第一の態様では、オリゴヌクレオチドの３゛末端に結合した低分子量の 尾分子をもつオリゴヌクレオチド合成の改良法を提供することが大きな目的であ る。さらに別の目的は連結分子を介してオリゴマーに結合した低分子量をもつオ リゴヌクレオチドの合成法を提供することである。本発明のもう一つの目的は３ ′末端につき、ホスホネートエステルおよびホスホネートエステルに結合した尾 分子で誘導化されたオリゴヌクレオチドを供給することである。さらに、当該目 的はオリゴヌクレオチドの製造に適当な連結分子および支持体を提供することで ある。さらに、オリゴヌクレオチドを組み立てることができるような適当な低分 子量分子をもつ連結分子を提供することも目的である。

本発明の第二の態様は、オリゴヌクレオチドの合成に使用可能な、保護アミン基 をもつ連結分子を開示する。本発明の第三の態様はアミノ基で修飾したオリゴヌ クレオチドに添加可能な挿入基（インターカレーティング基）をもつ尾分子付試 薬を提供する。

本発明の第四の態様はオリゴヌクレオチドの合成に使用可能な、保護アルカノー ル基をもつ連結分子を開示する。

これらの目的および本明細書の残りの部分から明らかとなるような目的は、連結 分子を介して３°末端に結合した低分子量分子をもつオリゴヌクレオチド合成法 で達成される。最初の態様の方法は、他の二つの官能基の反応性とは隔っていて 、異なるような各々の化学反応性を示した三つの独立した官能基をもつ分子を連 結分子として選択することからなる。連結分子の一番目の官能基を低分子量の尾 分子と反応させて、その尾分子を連結分子に結合する。連結分子の二番目の官能 基をコハク酸無水物で処理し、生成するカルボン酸残基を固相支持体と反応させ て、その固相支持体に結合した尾分子をもつ連結分子に結合または固定する。

本明細書の開示を通して、水酸基をもつ連結分子（例えばＲ−ＯＨ）の固相支持 体への結合は、上述のように、サクシネート結合を介して完成する。したがって 、“支持体−ＯＲ”式において、“支持体−〇”の表示にはこのようなサクシネ ート結合が包含される。

第１の３′−ホスホロアミダイトヌクレオチドを次いで連結分子の三番目の官能 基と反応させ、そのヌクレオチドを３′末端を介して連結分子に結合する。第１ のヌクレオチドを連結分子に結合すると、そのヌクレオチドは連結分子を経て尾 分子に結合し、かつ連結分子を経て固相支持体にも接続または固定する。さらに 、３°−ホスホロアミダイトヌクレオチドを引き続いて先行するのヌクレオチド の５゛末端と反応させ、そのオリゴヌクレオチドの３′末端で連結分子に結合し た合成オリゴヌクレオチドを生成する。第１のヌクレオチドについてと同じよう に、その合成ヌクレオチドが３°末端を経て連結分子に結合すると同時にそれは 尾分子および固相支持体に結合する。このように、生長するオリゴヌクレオチド はさらにオリゴヌクレオチドと反応する間に、固相支持体に結合される。連結分 子を介して３′末端に結合した尾分子をもつオリゴヌクレオチドは次いで連結分 子の二番目の官能基と固相支持体との間の連結を断つことによって固相支持体か ら切り離される。連結分子を介して３゛−末端に結合した尾分子をもつオリゴヌ クレオチドがそれから単離される。

本発明の第一の態様の好ましい実施例では、連結分子上の官能基は一級アルコー ル、二級アルコールおよびアミンを含む。尾分子をアミンと反応させ尾分子を連 結分子に結合し、その尾分子をもつ連結分子を固相支持体につなぐために固相支 持体をその二級アルコールと反応させ、それから第１のホスホロアミダイトヌク レオチドをその一級アルコールと反応させ、連結分子と結合する。

（２Ｓ、４Ｒ）−４−ヒドロキシ−２−ヒドロキシメチルピロリジン（４−ヒド ロキシ−２８−トランス）−２−ピロリジンメタノールまたはトランス−４−ヒ ドロキシ−し−プロリノールとも表示される）は連結分子として特に好ましい。

尾分子はレポーター基、インターカレーティング基、親油性基、および開裂基（ 切断基）を含め、数多くの注目の分子の任意の一つとして選別される。親油性基 として適当なのはコレステロールである。レポーター基として適当なのはビオチ ンおよびフルオロホアー、例えばアクリジン、フルオレセイン、ローダミン、リ ブサミンローダミンＢ１マラカイトグリーン、エリスロマイシン、テトラメチル ローダミン、エオシン、ピレン、アンスラセン、４−ジメチルアミノナフタレン 、２−ジメチルアミノナフタレン、７−シメチルアミノー４−メチルクマリン、 ７−シンチルアミノクマリン、７−ヒドロキシ−４−メチルクマリン、７−ヒド ロキシクマリン、７−メチルクマリン、７−アセトキシクマリン、７−ジエチル アミノ−３−フェニル−４−メチルクマリン、イソルミノール、ベンゾフェノン 、ダンシル、ダブシル、マンシル、スルホホダミン、４−アセチルアミド−４゛ −スチルベン−２，２゛−ジスルホン酸ジナトリウム塩および４−ベンツアミド −４°−スチルベン−２，２゛−ジスルホン酸ジナトリウム塩である。インター カレーティング基として適当なのはアクリジン、エリブチシン、メチジラム、エ チジウム、フェナン、フェナントロリン、スロリン、２−ヒドロキシエタンチオ レート−２，２°、２”−タービリジンーブラチナム（ＩＩ）およびキノキサリ ンであろう。

また、開裂基（ｃｌｅａｖｉｎｇ　ｇｒｏｕｐ）として適当なのは、鉄（Ｆｅ） を結合するためのＥＤＴＡリガンドまたはポルフィリンリガンド、および銅（Ｃ υ）を結合するためのフェナンスロリン（フェナントロリン）リガンドである。

連結分子のアミンとの反応に関し、尾分子が固有の接続基を含むように選択され るかまたは付加的な接続基（ｃｏｎｎｅｃｔｉｎｇ　ｇｒｏｕｐ）が適当な化学 合成を経て尾分子に取り付けられる。付加的な接続基を用いると、それは結合し たのちは、固有の接続基のように尾分子を連結分子に連結するのにつかわれる。

固有のまたは付加的な接続基のいづれを使用するにしろ、連結分子と反応して尾 分子を当該連結分子に連結させるようなものが接続基である。

尾分子を一番目の官能基を介して連結分子に結合した後であってその連結分子を 固相支持体に結合する前に、連結分子の三番目の官能基は選択的に保護される。

その保護された三番目の官能基をもつ連結分子が、それから二番目の官能基を介 して固相支持体に取り付けられる。次いで三番目の官能基は脱保護され、第１の ホスホロアミダイトヌクレオチドはその脱保護された官能基を介して連結分子に 結合される。

本発明の第一態様の目的は３°−末端水酸基（ヒドロキシ基）を有するオリゴヌ クレオチド誘導体でさらに達成される。ホスフェートエステルは３′−末端水酸 基上に位置し、式 ％式％ ｍおよびｍｏは独立して１１より小さい正の整数、ｎは０または１、Ｑは接続基 、Ｒはレポーター基、インターカレーティング基、親油性基および開裂基からな るグループから選ばれる）を有する。

この群のうち、特に好ましいのは構造式の化合物である。

特に好ましい３°−尾分子付オリゴヌクレオチドは、オリゴマーの３′末端に連 結分子を介して結合したコレステロールまたはアクリジンのいづれかをもつオリ ゴヌクレオチドを包含する。コレステロール基はカルバメート結合を利用して連 結分子に結合され、また、アクリジン基、好ましくは９−エチルアクリジンまた は別の９−アルキルアクリジンはアミド結合（実際には、９−エチルアクリジン のエチル基を仮定する場合にはアルキルアミン結合）を利用してオリゴヌクレオ チドに結合される。他の尾分子はウレア、チオウレアまたはスルホンアミド結合 を介して連結分子に結合される。

尾分子を連結分子に結合する際には、接続基Ｑは好ましくはアルキル、アルコキ ン、アルコキシアルキル、アルケニル、シクロアルキル、アリール、アリールオ キシ、アラルキル、ヘテロ環状、ヘテロアリール、置換アリール、置換アラルキ ルから成る群から選ばれる。

さらに本発明の第一の態様の目的は、構造式％式％ さい正の整数、ｎはＯまたは１、Ｑは接続基で、Ｒはレポーター基、インターカ レーティング（挿入）基、親油性基および開裂基からなるグループから選ばれ、 ＹはＨまたはジメトキシトリチルおよびＸは固相支持体である）の化合物を含む オリゴヌクレオチド合成のための化合物と支持体で達成される。有用な支持体と しては、長鎖アルキルアミンで誘導され制御された細孔のガラス支持体が含まれ る。

この群のうち、特に好ましいのは構造式の化合物である。

本発明の第一の態様の目的はさらに構造式ＯＨ ○ ０または１、Ｑは接続基で、Ｒはレポーター基、インターカレーティング基、親 油性基および開裂基からなるグループから選ばれ、ＹはＨまたはジメトキシトリ チルである）の化合物で達成される。

この群のうち、特に好ましいものは構造式上記の各構造式で、ｍおよびｍｏは１ １よりも小さい正の整数、すなわち、各々独立してに１．２．３．４．５．６． ７．８．９または１０である。特に好ましいのは、ｍおよびｍｏが６またはそれ 以下、すなわち、独立して１．２．３．４．　、ｉまたは６である化合物である 。

ニーに特許請求した発明の別な態様は通常のカルボン酸のテトラフルオロフェニ ル（ＴＦＰ）の合成のための改良された化合物および方法を提供することである 。

このような活性化エステル誘導体は有利には（１）アクリジン−ＣＰＧの合成に 使用され（これは、３°−尾分子付オリゴヌクレオチドの合成にも使用すること ができる）、（２）３’−アミン−尾分子付オリゴヌクレオチド合成後の修飾に 使用され、（３）内部アミン修飾オのリボヌクレオチドの修飾に使用することが できる。

本発明の態様は、さらに、３°−尾分子付オリゴヌクレオチドの合成に有利に用 いられるアミノヘキシル修飾・固相支持体およびヘキサノール修飾・固相支持体 を開示する。

（図面の簡単な説明） 図１は、アンチセンス０ＤＮ３９０マイクロンリジン注入後のパラメジウメ（Ｐ ａｒａｍｅｃｉｕｍ）の遊泳挙動の時間的経過を示す。

図２は、アンチセンス０ＤＮ３９の生物学的効果−ランダムまたはセンスＯＤＮ を示す。

図３は、パラメンラムの遊泳挙動のアッセイにおけるアンチセンス０ＤＮ３９の 投与応答凹線である。

（発明の詳細な説明） 、へ１．３゛−尾分子付オリゴヌクレオチドの直接合成のための３′−尾分子を 有する修飾固相支持体（方法Ａ） 本発明者らは、連結分子を用いて、オリゴヌクレオチドの３°末端に結合した低 分子１尾分子をもつオリゴヌクレオチドが合成できることを見出した。連結分子 は三個の化学的に明確に異なる官能基をもつように選ばれる。このような連結分 子が用いると、低分子量の尾分子がまず始めに連結分子に結合される。その低分 子１尾分子をもつ連結分子は次いで固相支持体に結合または固定される。それか らオリゴヌクレオチドが合成される。合成の間、オリゴヌクレオチドは連結分子 に固定され、その連結分子が次いで固相支持体系に固定される。オリゴヌクレオ チドは、手作業またはＤＮＡ合成機のいづれにしても、標準的なホスホルアミダ イト化学を駆使して合成される。オリゴヌクレオチドの合成が完成すると、連結 分子およびそれに結合した低分子１尾分子を有する合成オリゴヌクレオチドが、 面相支持体から切り離される。これは、オリゴヌクレオチドを固相系から遊離さ せる。オリゴヌクレオチドは連結分子を介して３°末端に結合した低分子１尾分 子をもつに至る。

上記の製造工程を用いれば、３゛末端に結合した低分子１尾分子をもつオリゴヌ クレオチドは、単一の精製二種に付す必要があるにすぎない。こうして、従来の 技術に比べて、３゛末端に結合した当該分子をもつオリゴヌクレオチドは容易に 、しかも迅速に製造される。

そこに結合した好適な低分子量をもつ連結分子は、オリゴヌクレオチド合成とは 無関係に合成される。結合した当該尾分子をもつ連結分子が、その連結分子の一 番目の官能基と尾分子を反応させることによって一旦製造されると、その連結分 子と尾分子の組合せ体は、各々に３゛末端に結合した低分子量分子をもつ多数の 異なるオリゴヌクレオチドの製造のために、ＤＮＡ合成機に用いるのにふされし い試薬として見なすことができる。これは、所望により連結分子と尾分子の組合 せ体の多量の合成および保存を可能にさせる。さらに、連結分子の種々の他の尾 分子との別な組合せ体も同じように作られる。これらは、ＤＮＡ合成機を用いる オリゴヌクレオチド合成の非有機化学者らによって使用することができる。この ように、合成有機伏字の学科に熟練していない人でも、３′末端に結合した選択 低分子置屋分子をもつヌクレオチドの合成のために、か−る自動ＤＮＡ合成機に おける最初の試薬としてその連結分子−尾分子の組合せの一部を容易につかうこ とができる。

さらに、多くのヌクレオチドについて共通の配列をもちかつオリゴヌクレオチド の残部については異なる配列を有するが問題となる同じ３′−尾分子を連結分子 を有するような多くのオリゴヌクレオチドは、単に、部分的に生成した″共通の “オリゴヌクレオチドを有する固体支持体を分割しこれを連結分子および関心の ある尾分子と結合させることによって製造することができる。オリゴヌクレオチ ドの異なる部分の合成は、オリゴヌクレオチドの共通部分をもつ固相支持体の個 々の部分をＤＮＡ合成機に充填することで遂行され、ヌクレオチドの所望の配列 を完成することができる。

化合物（２Ｓ、４Ｒ）−４−ヒドロキシ−２−ヒドロキシメチルピロリジン、工 程Ｉの化合物２、（４−ヒドロキシ−（２Ｓ−トランス）−２−ピロリジンメタ ノールまたはトランス−４−ヒドロキシ−し−プロリノールとも同一）はオリゴ ヌクレオチドの３°末端に関心の分子を結合するのに特に有用な連結分子として 役立つ。この化合物は容易に市販のＮ−ＣＢＺ−Ｌ−ヒドロキシプロリン（ｓｉ ｇｍａ　ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏ、）から製造される。スタンフィールドら［５ ｔａｎｆｉｅｌｄ　ｅｔ、　ａｌ、　（Ｊ　、　０ｒｇ、ｃｈｅｔ　４６．４７ ９９（１９８１））によって記述されたと同様の方法を利用するＮ−ＣＢＺ−Ｌ −ヒドロキシプロリンの還元は、ポラン−テトラヒドロフランコンプレックス（ Ａｌｄｒｉｅｈ　ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏ、　）を用いて達成される。この還元 は光学純度を保持しつ＼進行し、化合物１が得られる。化合物１のＣＢＺ保護基 は水素気流の下でパラジウム−炭素還元を用いて容易に除去される。この反応は 円滑に進行し、化合物２の定量的収量を与える。

化合物２は、オリゴヌクレオチドが合成される基礎物質として利用される一級水 酸基を含む。さらに、化合物２は固相支持体に結合するのに利用される二級アル コール基と関心の尾分子を結合するのに利用される二級アミンを含む。オリゴヌ クレオチドの合成が完成すると、関心の尾分子は連結分子を介してオリゴヌクレ オチドに結合したま＼で残る。連結分子を介し結合した関心の分子を含む完成オ リゴヌクレオチドを固相支持体から切断ののち、連結分子の二級水酸基は、本質 的に空間的に強固に保持され、連結分子を第１ヌクレオチドに結合させるホスフ ェート結合の付近から離れる。これは、連結分子とオリゴヌクレオチドの３′末 端ホスホネート基の間の結合の増大した安定性をもたらす。

さらに、化合物２は単一の光学異性体であって種々の立体異性体の混合物ではな いから、オリゴヌクレオチドの３′末端と連結分子の間の結合はまた単一の異性 体を生じ、物理的性質に影響するような立体異性体の混合物を生じない。これは 、インターカレーティング基または他の反応性基をオリゴヌクレオチドの３′末 端に結合する際に特に重要である。なぜなら、インターカレーティング剤の、二 本鎖ヌクレオチドおよび相補的ＤＮＡ部分との最適な結合には、立体形態に関す る正確で重要な必須条件があるためである。

Ｈ の化合物（式中、ｍおよびｍｏは１〜１０までの正の整数）である。これらの連 結分子はまた、構造中にアミノ基、−級水酸基、二級水酸基の官能基も有する。

このクラスの二つの特に有用な連結分子は３−アミノ−１，２−プロパンジオー ルおよび４−アミノ−１，３−ブタンジオール（１３Ｘ工程■参照）である。

関心の尾分子の連結分子への結合は、上述のオリゴヌクレオチド合成と完全に無 関係に行われる。関心の低分子量尾分子は有機化学技術や反応を駆使して連結分 子に結合される。連結分子の二級アミノ基は、関心の低分子量尾分子を当該連結 分子、例えば化合物２に、数多くの適当な接続基または例えばアミド結合、カル バメート結合、ウレア結合、チオウレア結合またはスルホンアミド結合のような 結合のいづれかを介して結合するのに利用される。この開示があれば、連結分子 、例えば化合物２の二級アミンと関心の化合物が適当な接続基または連結基との 間における他の適切な反応もまた、当業者に示唆されるであろう。

本明細書並びに添付の特許請求の範囲を明確にすべ（、前記“連結分子”なる語 と、尾分子をこの連結分子に結合するのに用いられるような“連結基”なる語の 間における混同を避けるために、“接続基”（Ｃｏｎｎｅｃｔｉｎｇ　ｇｒｏｕ ｐ”）なる語が用いて、接続する基または連結する基を示す。これらの基に与え られた名前に無関係に、これらの基は尾分子を連結分子に連結、接続または結合 する。

オリゴヌクレオチドの３′尾分子となる関心の分子が、かくして連結分子に接続 されると、その連結分子上の一級水酸基は好適には、例えばジメトキシトリチル 基のような基で保護される。これは、４−ジメチルアミノピリジン（ＤＭＡＰ） の存在下にピリジン中ジメトキシトリチルクロライド（ＤＭＴｒｃｌ）を用いて 都合よく達成される。これは、連結分子の一級アルコール基を選択的に保護する 。次いで、連結分子の二級アルコールを無水コハク酸を用いてコハク酸エステル に変換する。関心の低分子量化合物を有する連結分子のコハク酸エステルは、ア ドキンスら［Ａ　ｔｋｉｎｓｏｎ　ｅｔ、　ａｌ、　］の］ｐ−ニトロフェノー ルーＤＣＣ従来法前掲）または好ましくはＰｏｎら（前掲）の改良ＤＥＣ法のい ずれかを用い、制御された細孔のガラス支持体に連結される。ＤＥＣは、ＤＣＣ よりもより毒性が少ない限り、水溶性であってコハク酸エステルをｐ−ニトロフ ェノールで処理する必要性を排除する点で、それが現在のところ好ましい方法で ある。

ジメトキシトリチル基で保護した、関心の結合低分子量化合物を有する連結分子 は、次いで結合・長鎖状アルキルアミン基をもつ規制された細孔のガラス支持体 に標準の方法で連結または固定される。長鎖状アルキルアミンで誘導化され規制 された細孔のガラス支持体は入手可能である［Ｐｉｅｒｃｅ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ またはＳ　ｉｇｍａ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ］。これらは、ボンら（上記）の方法を 用いて、ジクロロ酢酸で予め活性化し、次いでカップリング試薬としてＤＥＣを 用い、関心の結合分子をもつジメトキシトリチル基で保護した連結分子とピリジ ン中で反応させて、連結分子を固相支持体に連結した後、支持体上の過剰の長鎖 状のアルキルアミノ基を無水酢酸でアセチル化することでキャップする。

ジメトキシトリチル基は、ジクロロエタン９３％ジクロロ酢酸で処理することに よって連結分子の一級アルコールから取り除かれる。連結分子を介し結合した低 分子量尾分子とともに脱保護された連結分子の一級水酸基をもつ、得られた規制 細孔ガラス支持体は、オリゴヌクレオチドの合成のために用意されるに至る。

連結分子および関心の分子を有する固相支持体をまた大量に製造し、次いで多数 のオリゴヌクレオチドの合成のために小分けするかまたは後で使えるように保存 することができる。いずれにせよ、オリゴヌクレオチド合成は、標準の方法で、 例えばＭｉｌｌｉｇｅｎ　Ｄ　Ｎ　Ａ合成機のようなりＮＡ合成機でホルホルア ミド化学を用いて、連結分子の一級水酸基から出発する。

一旦、オリゴヌクレオチドの合成が完成すると、そのオリゴヌクレオチドは、自 動ＤＮＡ合成機で合成したオリゴヌクレオチドの標準的な方法で脱保護される。

連結分子を介して３゛末端に結合した低分子量尾分子をもったオリゴヌクレオチ ドは、次いで常法にて室温で濃縮アンモニアを用いる自動ＤＮＡ合成の標準方法 により固相支持体から切り離される。

連結分子を介して３°末端に結合した低分子量尾分子を有するオリゴヌクレオチ ドを精製するには、−回のみの精製で足りる。これは、逆相高速液体（ＨＰＬＣ ）クロマトグラフィーを用いて都合よく行うことができる。オリゴヌクレオチド の３°末端に結合されるべき低分子量尾分子は生物学的関心のある多くの分子の 一つとすることができる。この群に包含されたものはレポーター基、インターカ レーティング（挿入）基、親油性基または親液性基および切断基とすることがで きる。親油性基につき、現在、特に好ましいのはコレステロールである。現在の ところレポーター基についで特に好ましいのはビオチンおよびプルオロホアーズ 、例えばアクリジン、フルオレセイン、ローダミン、リサミンローダミンＢ１マ ラカイトグリーン、エリスロシン、テトラメチルローダミン、エオシン、ピレン 、アントラセン、４−ジメチルアミノナフタレン、２−ジメチルアミノナフタレ ン、７−シメチルアミノー４−メチルクマリン、７−シンチルアミノクマリン、 ７−ヒドロキシ−４−メチルクマリン、７−ヒドロキシクマリン、７−メチルク マリン、７−アセトキシクマリン、７−ジエチルアミン−３−フェニル−４−メ チルクマリン、イソルミノール、ベンゾフェノン、ダンシル、ダブシル、マンシ ル、スルホ・ローダミン、４−アセトアミド−４゛−スチルベン−２，２“−ジ スルホン酸ジナトリウム塩、４−ベンツアミド−４゛−スチルベン−２，２′− ジスルホン酸ジナトリウム塩である。インターカレーティング基に対して現在と （に好ましいのはアクリジン、エリブチシン、メチジラム、エチジウム、フェナ ントロリン、２−ヒドロキシエタンチオレート−２，２’、２”−タービリジン ーブラチナム（ＩＩ）およびキノキサリンである。現在、切断基につき、特に好 ましいのは鉄を結合するためのＥＤＴＡリガンドまたはポルフィリンリガンドお よび銅を結合するためのフェナンスロリンリガンドである。

尾分子を連結分子のアミノ基に結合させるための固有の接続基を含まない当該尾 分子については、当該尾分子を適当な試薬と反応させ、連結分子のアミン置換基 と反応可能な付加的接続基を結合させる。したがって、尾分子が連結分子のアミ ンと反応可能な固有の接続基を有するか否か、または、付加的な接続基が結合し て連結分子のアミノ基と反応ねばならぬか否かにかかわりなく、尾分子を連結分 子のアミン基と反応させて当該尾分子を連結分子に結合させる。

以下の式： または Ｙ　Ｏ−（ＣＨｚ）ｍ　ＣＨ−（ＣＨｚ）ｍ’−ＮＨＺ　を介して尾分子Ｒを結 合ＣＨ で示される連結分子を介して尾分子Ｒを結合させるには、Ｚは以下の群から選ば れる。

ＯＯＯ ＩＩ　ＩＩ　ＩＩ −Ｃ−Ｑｎ−Ｒ，−Ｃ−０−Ｑｎ−Ｒ，−Ｃ−ＮＨ−Ｑｎ一式中、ｍおよびｍｏ は独立して１１よりも小さい正の整数として選択され、ｎはＯまたは１として選 択され、Ｑは接続基である。尾分子Ｒはレポーター基、インク−カレーティング 基、親油性基および切断基からなるグループから選別され、ＹはＨまたはジメト キシトリチルである。

例として、コレステロールクロロホーメートを連結分子と反応させて、カルバメ ート接続基を介して連結分子に当該コレステロール基を結合する。さらに例とし て、９−アクリジンプロピオン酸を連結分子と反応させるとアミド結合を介して ９−エチルアクリジンの結合した連結分子を生ずる（工程ＩＩ参照）。

上に述べたコレステロールクロロホルメートが尾分子の前駆体として用いられる なら、ｎは０１従ってＱはなく、Ｚは−Ｃ−○−コレステロールである。上述の ９−アクリジンプロピオン酸が尾分子の前駆体として用いられるなら、ｎは１、 従ってＱは存在し、アルキル残基、すなわち、エチルｎが１でＱが存在するとき 、アルキル、アルコキシ、アルコキンアルキル、アルケニル、シクロアルキル、 アリール、アリールオキシ、アラルキル、ヘテロ環状、ヘテロアリール、！換ア リールおよび置換アラルキル基が接続基Ｑとして用いるのに適当である。

○ Ｚが構造式−〇−０−Ｑｎ−Ｒのカルバメートである場合の上式の化合物の製造 に対する前駆体分子として有用なのはクロロホルメートである。２が構造式分子 として有用なのはイソシアネートである。Ｚが構造式−Ｃ−ＮＨ−Ｑｎ−Ｒのチ オウレアの場合の上式の化合物の製造に対しては、イソチオシアネートは前であ る場合の上式の化合物の製造に対しては、スルホニルハライドが前駆体分子とし て有用である。

種々のスルホニルハライド系前駆体尾分子がＭｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｐ　ｒｏｂｅ ｓ、Ｉ　ｎｃ、　、Ｅｕｇｅｎｅ、Ｏｒｅｇｏｎから入手可能である。このよう なスルホニルハライドは芳香族スルホニルハライドであって、ここに、スルホニ ルハライド部分は例えば、ローダミン、ナフタレン、ピレンまたはアントラセン 環のような関心の尾分子の環の一つに固有の接続基（部分）として存在する。こ のような例では上式でｎはＯで、従って接続基Ｑはない。一般に、ハライドイオ ンは塩素またはフッ素であるが、臭素およびヨウ素も有用であろう。

有用なスルホニルハライドはスルホローダミン（“Ｊ　ｅｘａｓ　Ｒｅｄ”の商 品名で、Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｐ　ｒｏｂｅｓ、Ｉ　ｎｃ、により売られている ）を含む。さらに、有用なのはりサミンローダミンＢスルホニルクロライド、リ サミンローダミンＢスルホニルフルオライド、５−ジメチルアミノナフタレン− １−スルホニルクロライド（ダンジルクロライド）、２−ジメチルアミノナフタ レン−５−スルホニルクロライド、２−ジメチルアミノナフタレン−６−スルホ ニルクロライド、６−（Ｎ−メチルアニリノ）−ナフタレン−２−スルホニルク ロライド（マンジルクロライド）、１−ピレンスルホニルクロライド、２−アン スラセンスルホニルクロライド、５−ジメチルアミノナフタレン−１−スルホニ ルフルオライド（ダンシルフルオライド）、および４−′）メチルアミノ−アゾ ベンゼン−４゛−スルホニルクロライド（ダンジクロライド）であろう。

種々のイソチオシアネート系前駆体尾分子は尾分子と連結分子の間のチオウレア 結合をつくるのに有用である。上記のスルホニルハライドと同じ様に、一般にイ ソチオンアネートは尾分子の芳香環上に固有の接続基として存在し、ここに、上 式ではｎはＯで、従ってＱは存在しない。このようなイソチオンアネートもまた Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｐ　ｒｏｂｅｓ、Ｉ　ｎｃ、から入手可能である。

連結分子と反応させるに適当なイソチオシアネートはフルオレセイン−５−イソ チオ／アネート、フルオレセイン−６−イソチオ／アネート、テトラメチルロー ダミン−５−（および−６−）−イソチオ７・アネート、ローダミンＸイソチオ ン了ネート、マラカイトグリーンイソチオシアネート、エオンンー５−イソチオ ノアネート、エリスロシン−５−イソチオシアネート、７−ジメチルアミノー３ −（４゛−イソチオンアネートフェニル）−４−メチルクマリン、ｐ−（５−ジ メチルアミノナフタレン−１−スルホニル）アミノフェニルインチオシアネート 、Ｎ−（４−（６−シメチルアミノー２−ベンゾフラニル）フェニルイソチオシ アネート塩酸塩、１−ピレンイソチオシアネート、２−アンスラセンインチオシ アネート、４−ジメチルアミノナフチル−１−イソチオシアネート、９−アクリ ジンイソチオシアネート、４−イソルミノールイソチオンアネート、４−ジメチ ルアミノフェニルアゾフェニル−４゛−イソチオンアネート、ベンゾフェノン− ４−イソチオシアネート、４，４°−ジイソチオシアネートスチルベン−２，２ ゛−ジスルホン酸ジナトリウム塩、４．４’−ジインチオシアネートジヒドロス チルベン−２，２’−ジスルホン酸ジナトリウム塩、４−アセチルアミド−４° −イソチオシアネートスチルベン−２，２°−ジスルホン酸ジナトリウム塩、お よび４−ベンツアミド−４°−イソチオシアネートスチルベン−２，２′−ジス ルホン酸ジナトリウム塩を含む。

ｎが１で、従って接続基Ｑが存在する場合の例を含め、尾分子の他の有用な前駆 体分子はテトラフルオロフェニル（ＴＦＰ）エステル、５−（および６−）カル ボキシフルオレセインジアセテートスクシニミジルエステル、７−シメチルアミ ノクマリンー４−酢酸、７−アミノ−４−メチルクマリン−３−酢酸、７−ジエ チルアミノクマリン−３−カルボン酸、７−ヒトロキシクマリンー４−酢酸、７ −ヒドロキシ−４−メチルクマリン−３−酢酸、７−ヒドロキシ−クマリンー３ −カルボン酸、７−メドキシクマリンー３−カルボン酸、７−カルポキシメトキ シー４−メチルクマリン、７−アセドキシクマリンー３−カルボン酸、アクリド ン−２−酢酸、アクリドン−１０−酢酸、９−アンスラセンプロピオン酸、１− ピレンブタン酸（ピレン酪酸）およびＮ−（５−ジメチルアミノナフタレン−１ −スルホニル）グリシン（ダンシルグリシン）を含む。

ＥＤＴＡ−Ｆｅ（ＩＩ）はオリゴヌクレオチドと共に切断基として用いられてき た。ＥＤＴＡ分子はウリシンヌクレオシドの塩基に結合される。カルボキシル基 を末端とした鎖がウラノル基から伸ばされ、それにＥＤＴＡが結合された。この 方法は、ＥＤＴＡ結合・ヌクレオシドが得られる一方、かかるヌクレオシドを組 み込んだオリゴヌクレオチドは、ＥＤＴＡが塩基上に存在するため、当該ＥＤＴ Ａ分子によって干渉され、その結果オリゴマーと相補的なりＮＡｆｉＪの間にお ける１次的塩基結合が妨害されつる。本発明の連結分子の使用によって、Ｅ　Ｄ 　Ｔ　Ａ基は、ヌクレオチド塩基から離れ、従って、Ｄ　Ｎ　Ａの相補釣鐘での 初めの塩基対のために、もっと干渉しない位置に、連結分子から延長される。

連結分子を、例えばエチルイソシアネートアセテートのようなアルキル、イソシ アネートと反応させ、次いでエチレンンアミンおよびＥＤＴＡ−トリエチルエス 千ルーＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステルで処理することはアミド結合を介 して、連結分子にＥ　Ｄ　Ｔ　Ａ基を結合するのに役立つことになろう。この場 合に、付加的な接続基はＥ　Ｄ　Ｔ　Ａ切断基の連結分子との結合を形成するた めに用いられる。切断反応の条件は、Ｄｒｅｙｅｒ（Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　 Ａｅａｄ、Ｓｃｉ、旦２．９６８〜９７２（１９８５））により示されているよ うな方法で、水溶液中、Ｆｅ（ＩＩ）およびジチオスレイトールのような適当な 酸化剤を添加することによって開始される。

さらに、切断基、フェナントロリン−Ｃｕ（Ｉ）錯体を結合する際には、１．１ ０−フェナントロリンが５または６位でアミノ化される。次いで、このアミンが スクシニル化される。得らオ］た末端カルボキルレートは、例えばＮ−ヒドロキ シスフノンイミドエステルに変換することによって活性化され、連結分子のアミ ンとの反応または連結分子に結合される付加的な接続基との反応に使用される。

この試薬での切断は、Ｆ　ｒａｎｅｏｉｓら（Ｂ　ｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　＠ ユ、２２７２−２２７６（１９８８））と同様の方法で硫酸銅とメルカプトプロ ピオン酸を添加することによって始められる。

同様に、エリブチシンの二級アミノ置換基はピリジン中、無水コハク酸で直接ス クシニル化され、次いで、連結分子への結合のためにテトラヒドロフラン（ＴＨ Ｆ）中ＤＣＣ（１，３−ジンクロヘキシルカルボシイミド）でＮ−ヒドロキシス フノンイミドエステル（ＮＨＳエステル）に活性化される。キノキサリンはスク シニル化および活性化に先立って、ペリフェナントロリンと同様の方法で、その 環のアミノ化を必要とする。

長鎖状のスペーサーを有するビチオンはスクシンイミジルエステルとして、Ｍｏ １ｅｃｕｌａｒ　Ｐ　ｒｏｂｅｓ　からも市販されている。この製品、６−（６ −ピオチノイルアミノ）ヘキサノイルアミノ）ヘキサン酸コハク酸イミドエステ ルはまた、ビオチン−ＸＸ−コハク酸イミドエステルとも呼ばれている。上記の フェナントロリンコハク酸イミドエステルと同じ方法で、それは連結分子のアミ ノ基と反応させ、ビオチン尾分子をその連結分子に結合する。

Ｄ　ｅｒｖａｎら（Ｊ、Ａｍ、Ｃｈｅｗ、Ｓｏｅ、１００．１９６８（１９７８ ））と同様の方法で、ｐ−カルポキンメチジウムがそのカルボキシル基を介して 連結分子と結合するために製造することができる。同様に、エチジウムも製造さ れる。

Ａ、２．アクリジンＴＦＰエステルの合成とアクリジンＣＰＧの改良製造法９− アクリジンアルカン酸を強＜ＤＮＡに結合させ（Ｓ、　Ｔａｈｅｎａｋａら、Ａ ｎａｌ。

Ｓｃｉ、４．４８１（１９８８））、種々の異なる鎖長で製造できる。アクリジ ンで修飾したＯＤＮはＤＮＡの二本鎖の塩基対の間においてアクリジン分子が効 率よく挿入するための厳密な幾何学的必要条件をもつが、しかし、これらの幾何 学的条件は予測するのが難しい。従って、容易に修正できる連結用の鎖長さをも つことが好ましい。加えて、種々の結合手の長さは結合強度に関し評価される。

オリゴヌクレオチド（ＯＤＮ）のその相補的核酸鎖に対する結合強度は容易に熱 変性（Ｔｍ）研究により決定される。

種々のアルキル鎖長をもったアクリジンアルカン酸は、）ｌ、Ｊｅｎｓｅおよび り。

Ｈｏｗｌａｎｄ（Ｊ、　Ａｍ、Ｃｈｅｍ、Ｓｏｃ、４８．　１９２６（１９８９ ））の変法を用いて、対応する脂肪族ジカルボン酸をジフェニルアミンおよび塩 化亜鉛と加熱することによって製造される。例えば、アジピン酸との縮合反応で は５−（９−アクリジニル）ペンタン酸の４５ｇ（１６％収率）が得られた。ア クリジン−ＣＰＧの製造のために用いた二つのアルキル鎖長は、他の３゛−アク リジン尾分子付０ＤＮ（Ｕ。

Ａｓ５ｅｉｎｅら、　Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、、へｃａｄ、　Ｓｃｉ、ＵＳＡ　８ １．　３２９７（１９８４））本発明のこの態様の一つの実施例はアクリジン− ＣＰＧの合成に対する改良法を提供する。この改良法は前駆体分子として、アク リンニルカルボン酸の活性エステル誘導体を使用する。

Ｈ５）エステルおよびｐ−ニトロフェニルエステルはカルボン酸をジンクロヘキ シルカルポジイミド（Ｄ　ＣＣ）で活性化し、次いで、Ｎ−ヒドロキシコハク酸 イミドまたはｐ−ニトロフェノールと反応することによって製造された。しかし ながら、これらの縮合反応は、出発のカルボン酸と副生成物のジシクロへキシル ウレア（ＤＣＵ）が双方とも、ＤＣＣ活性化に普通用いられる有機溶媒に不溶で あるために、実施が困難である。さらに、これらの反応は完結せず、所望のエス テルはその不安定性のためにシリカゲルカラムクロマトグラフィーで容易に精製 できなかった。

対照的に、ＴＦＰ（テトラフルオロフェニル）エステルはトランス−４−ヒドロ キシ−し−プロリノール　至の核性アミノ基と好適に反応性で、しかも、フラシ ュクロマトグラフィーにより精製できる程十分安定である。

カルボン酸をＴＦＰエステルに活性化するための代表的な方法を説明する。ＴＦ Ｐニスチル１９または２０は初めカルボン酸を２−フルオロメチルピリジニウム トンレート（ＦＭＰＴ）で活性化し、これにより、不安定な中間体を形成し、次 いで、この不安定中間体を２．３．５．６−チトラフルオロフエノールと反応さ せて安定な生成物を形成することによって製造される（工程ＩＶ、方法ａ参照） 。

この反応では不溶性のＤＣＵは生じないし、不溶性のアクリジニルカルボン酸は 反応が進行するにつれ可溶性となる。得られた均一混合物は溶媒を取り除いてか らフラッシュクロマトグラフイーにより精製された。ＦＭＰＴは極性の非プロト ン性有機溶媒（エーテル、ＴＨＦＳＤＭＦおよびアセトニトリルなど）に余り可 溶性でないカルボン酸にとって、特に好ましい活性化剤である。

本発明は、またＴＦＰエステルの製造のための改良試薬を開示する。要約すれば 、２．３．５．６−チトラフルオロフエノールを無水トリフルオロ酢酸で処理す るとＴＦＰトリフルオロアセテート１旦を得る。この改良試薬１旦を、工程ＩＶ 。

方法すに示したように、トリエチルアミンの存在下カルボン酸と反応させるとＴ ＦＰエステルを得る。例えば、９−アクリジニルプロパン酸を塩化メチレン中Ｔ ＦＰトリフルオロアセテート１８およびトリエチノげミンで処理すると所望のア クリジニルＴＦＰエステル１９を得る。

さらに、他のカルボン酸もＴＦＰトリフルオロアセテート上旦との反応に適当で ある。この点で、代表的なカルボン酸はＮ−ＣＢＺ−Ｌ−フェニルアラニルグリ ジン、プロトポルフィリンＩＸ、３−アミノ−９−エチルカルバゾールコハク酸 イミドなどを含む。開示した試薬１旦およびその使用方法の利点は、以下の利点 を含む。（１）ＴＦＰｈリフルオロアセテートは容易に安価な出発原料から製造 される。（２）この合成法を用い、ＴＦＰエステルを製造するために高価な縮合 試薬は必要とされない。（３）トリフルオロアセテートが開示の反応の唯一の副 産物であるから、ＴＦＰエステル生成物の精製が改善される。

特に、好ましい方法（実施例ＸＸＶＩ　Ｉ　Ｌ方法２）では、アクリジン−ＣＰ Ｇ支持体（１旦および旦）は、工程Ｖに示したように、トランス−４−ヒドロキ シ−Ｌ−プロリールｌおよび適当なアクリジニルプロピオン酸またはペンタン酸 たはス１の定量的収量を得る。この方法（方法２）は、中間体のＮ−メチルピリ ジニウムエステルを経てアクリジンカルボン酸から直接ジオールアミドユを製造 するときよりもより再現性のある結果を得る（実施例■、方法１、工程■参照） 。

ユまたは２１の一級水酸基は標準条件でＤＭ丁ｒエーテルとしで選択的に保護さ れ、旦または２２が良好な収率で得られる。残る二級水酸基をスクシニル化し、 得られたカルボン酸を長鎖アルキノげミンで制御の細孔ガラス支持体（ＬＣＡＡ −ＣＰＧ）に固定すると、所望のＡＣｒ−ＣＰＧ（１０，または２３）を得る。

これらのＣＰＧのＤＭＴｒ充填度は夫々１８．５　μｍｏｌ／ｇおよび２０．６ 　μｍｏｌ／ｇである。

３′−尾分子付オリゴノヌクレオチドは、３°−尾分子を共有結合した固相支持 体から直接合成される（方法Ａ、Ａ、１項および。へ、２項参照）。別法として 、３′−尾分子付ＯＤＮは、保護された核性のアミノ基またはチオール基を組み 込んだ特別の固相支持体を用いて合成される。次いで、脱保護されたＯＤＮの、 適当な親電子試薬とのポスト合成処理によって、コンジュゲート基をこのような ３゜−尾分子付ＯＤＮに導入される。この特許請求する発明の態様では、方法Ｂ によるポスト合成修飾が有利に使われ、方法Ａに要求された合成条件では残存で きない敏感な３°−尾分子を導入する。さらに、方法Ｂの利点は、相当する出発 原料に利用される多数の親電子性共役基に関係する。その上に、方法Ｂは少量の 修飾○ＤＮの製造に有利に用いられる。

本明細書に開示された３゛−尾分子付ＯＤＮ製造のための二つの方法（方法Ａお よび方法Ｂ）は、アクリジンＴＦＰエステルヨ旦および並の３°−アミン−尾分 子付ＯＤＮとの反応を検討することによって比較された。更に詳しくは、Ｂ型肝 炎の表面抗原蛋白質に対応するｍＲＮＡの開始コドン領域に相補的な配列を有す る３′−アミン−尾分子付１１単位のＯＤＮが製造された。改善した標的核酸結 合性をもつこのような３°−尾分子付ＯＤＮはアンチセンスオリゴヌクレオチド として有利に用いられよう。

Ｃ３゛−アミン−尾分子付ＯＤＮの合成のだめの修飾支持体本発明の態様は、さ らに工程ＩＶに示したように、３′−アミン−尾分子付ＯＤＮの合成のための改 良した固相支持体を提供する。この点で特に好ましい支持体は、６−アミノヘキ サン−１−オールを用い製造されたアクリジン修飾ＣＰＧ（、八Ｈ−ＣＰＧ）で ある。

現在は、ＯＤＮの３’−末端の修飾は市販の支持体（例えば、Ｃ１ｏｎｒｅｃｈ 　Ｌ　ａｂ。

ｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｉｎｃ、、Ｐａ１ｏ　Ａｌｔｏ、ＣＡによる“アミン−０Ｎ −ＣＰＧ”）を用いて行われる。しかし、上記のごと（、かかる支持体（前掲の Ｎｅ１ｓｏｎらによって開示された支持体に相当）は、ＰＡＧＥ分析によって少 なくとも二つの明確に異なる３′−尾分子付○ＤＮ生成物（約１＝１）の生成を 含め、重大な付加的不利益をもつ。

加えて、３°−アミン尾分子の種々の活性エステルとの誘導化はたえず低収量に 終わり、ＨＰＬＣ（高速液体クロマトグラフィー）分析では、出発の３゛−アミ ン−尾分子付ＯＤＮの５０％以下しか反応しないことを示す。

示唆された混合生成物は、 （１）市販の固相支持体でＯＤＮの合成の間の第１ヌクレオチドのホスフェート 部分の○→Ｎへの移動 （２）ＯＤＮ合成の間の尾分子のＦＭＯＣ部分の脱保護および無水酢酸による後 続のキャッピングおよび／または （３）ＯＤＮの付随する損失を伴う、尾分子の一級と二級水酸基の間の環状ホス フェートの形成の結果であろう。すべての場合に、得られる３°−尾分子付ＯＤ Ｎは、その後、活性エステルと反応せずに、ＰＡＧＥ分析によれば明確に異なる 種を形成しつる。

本明細書における修飾固相支持体は、ＯＤＮの３′末端の修飾用の市販固相支持 体に関係のあるこれらの欠点を特徴する特許請求する修飾面相支持体によって得 られるほかの有利な特徴は（１）ＣＰＧ結合部位としても働（独特なアミン保護 基および（２）ジメトキシトリチル保護した水酸基を含む。さらに、これらの修 飾支持体は市販のＤＮＡ合成機で用いられるすべての方法に適合できる。

３“−アミン−尾分子付ＯＤＮは好ましくはＤＮＡ合成機でＣＰＧ支持体から取 り除かれる。特許請求する支持体は、隣接するジオールをもたないので、３゜− アミン−尾分子付ＯＤＮを支持体から水酸化アンモニウムで脱離することはＯＤ Ｎの３゛末端のアミノヘキシル基の保存に適合する。反対に、アミン−０Ｎ−Ｃ ＰＧは隣接ジオールを含むので、この支持体から水酸化アンモニウムを用いてＯ ＤＮを脱離すると、ＯＤＮからの尾分子の重大な損失をもたらす。

Ｕ、　Ａｓ５ｅｌｉｎｅおよびＮ、　Ｔ、　Ｔｈｕｏｎｇ（Ｔｒｔ、Ｌｅｔｅ、 ３１．　８１〜８４（１９９０））は０ＩＩＩＪに３°−アミノヘキシル尾分子 を導入するための固相支持体を報告した。この固相支持体に関係する欠点は（１ ）支持体を作るための７エ程の合成法（本明細書に記載した４工程法を参照）、 （２）報告の方法によれば、非常に低い収量の固相支持体しか得られないことを 示唆するデータ分析、（３）この固相支持体の３°−尾分子付○ＤＮの理論的な 収量を得ることを示唆するデータの欠如を含む。

特許請求する固相支持体を作るために、好ましい６−アミノヘキサン−１−オー ル試薬に加えて、他のアミノアルカノールは市販であり、本発明による修飾ＣＰ Ｇの生産に適している。種々のアルキル鎖長のアミノアルカノールを６−アミノ ヘキサン−１−オールの代わりとすることによって色々な長さの３゛−アミン尾 分子を有するＯＤＮが本明細書に開示した方法によって合成される。これに対し 、種々の長さのアミノジオールは一般に市販されていないし、従って、ある範囲 のアルキル鎖長を持つ固相支持体はＮｅ１ｓｏｎらの方法によって容易に生産す ることができない。従って、種々の３゛−アミン尾分子を有するＯＤＮはアミン −０Ｎ−ＣＰＧまたはその変法を用いても容易に合成できない。さらに、他のス ペーサー基（すなわち、式中、Ｒがアルキル、アリール、アリールアルキル、ヘ テロアルキルまたはへテロアリール）は、特許請求する修飾固相支持体のアミン 基とＤＭＴｒで保護の水酸基の間に挿入される。好ましい実施例では、Ｒは（Ｃ Ｈ２）ｎでｎは１〜１０である。特に、好ましい実施例では、Ｒは（ＣＨ２）６ である。

３°−アミン尾分子を有するオリゴヌクレオチドは本発明の修飾固相支持体を用 いて効率よく合成することができる。このような３゛−アミン−尾分子付オリゴ ヌクレオチドは市販のアミン−０Ｎ−ＣＰＧ支持体を用いて製造された類似の３ ゛−尾分子付ＯＤＮと対比される。特許請求する発明の代表的な修飾固相支持体 は、ＨＰＬＣおよびＰ　Ａ　Ｇ　Ｅ双方によって単一生成物として３゛−アミン 尾分子付ＯＤＮの高収量を得た。特許請求する修飾固相支持体から作った３°− アミン−尾分子付ＯＤＮの後続の誘導化は急速に完結し、ＨＰＬＣ精製の必要な く、３′−修飾ＯＤＮの定量的収量を得た。

Ｄ、アクリジンＴＦＰエステルの分子内アミン修飾ＯＤＮとの反応本発明は多数 の内部インターカレーティング基をＯＤＮに導入する手段を提供する。このよう な多数の内部インターカレーティング基はＯＤＮの標的核酸鎖に対する増大した 結合を得られるが、効果的なインターカレーションにつき厳密な数学的必要条件 を有しうる。インターカレーティング基に起因する核酸の結合親和性における予 想される増加は、二本鎖の正常のワトソンークリックの塩基対を乱す立体効果に よって中和または縮減されつる。

特許請求する方法は、アクリジンＴＦＰエステルを用い、ＯＤＮと標的の間に形 成した最小の二本鎖の一つまたは二つの塩基対のいずれかをはさむ二重修飾のＯ ＤＮを製造することを含む。本発明によれば、インターカレーティング基と標的 の核酸鎖の間の相互作用を最適化する連結手を有する内部的に修飾したＯＤＮが 設計される。例えば、５−アミノプロピルーチオキシウリジン基はＯＤＮに選択 的に導入され、一つおよび二つの内部的アクリジン修飾のＴｍに及ぼす影響を実 験した。単一の内部アミン修飾に対しては、結合効率（Ｔｍ）に及ぼす鎖長の影 響を測定するためにＯＤＮをアクリジンＴＦＰエステル１９または２０と反応さ せた。５個の炭素長の結合手を有するアクリジン修飾のＯＤＮは未修飾コントロ ールと比べ、ＴＩ！を５．９℃だけ増大させたが、一方、３個の炭素長の結合手 は同じコントロールと比べ、１．１℃を増加したにすぎない。二つの内部的アク リジン修飾が実験した時、最適化した結合手長で、４５，５℃（未修飾○ＤＮ） 〜５６゜２℃（三方挿入０ＤＮ）のＴｍにおける増加が観察された。さらに、多 数の内部的アクリジン修飾はＯＤＮの細胞消費およびヌクレアーゼ消化に対する 安定性を改善することができる。

未修飾ＯＤＮは、血清含有媒体中３°−エキソヌクレアーゼによって急速に分解 される。３゛−末端ホスホジエステル結合のある種の化学修飾（すなわち、最後 の二つのヌクレアーゼ間ホスホジエステル結合のホスホロチオエート、ホスホロ アミデート、または逆結合体への変化）は、ＯＤＮのヌクレアーゼに対する安定 性を著しく改善する。他の化学結合がα−デオキシヌクレオチド誘導体（Ｃ，Ｃ ａＺｅｎａＶｅら　Ｎｕｃｌ、Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、１５．１０５０７（１９８ ７））およびメチルホスホネート誘導体のように、増大したヌクレアーゼ安定性 を得ることができる。

インターカレーティング基はかさ高い３°−置換基であるので、それはまた３′ −エキソヌクレアーゼから末端のホスホジエステル結合を保護することができる （Ｅ、　ＵｈｌｍａｎｎおよびＡ、　Ｐｙｍａｎ、ＣｈｅＩｌ、　Ｒｅｖ、９０ ．　５４３（１９９０））ｏ例えば、３°−コレステロール、３°−アクリジン −および３′−へキシルアミン−尾分子付ＯＤＮが細胞培養分析で検討され、未 修飾ＯＤＮと比較して増大した安定性を示した。

本発明の一つの実施例で、修飾固相支持体を用いて３°−エキソヌクレアーゼに よる分解を防ぐオリゴヌクレオチドを合成する方法が開示される。この修飾固相 支持体は他の３°−修飾を含まないＯＤＮおよびコレステロールまたはアクリジ ンのような他の３°−修飾の構造−活性相関のｉｎ　ｖｉｖｏ評価にとって有用 なＯＤＮを合成するのに有利に使用することができる。この方法で作った３′− 修飾ＯＤＮはハイブリッド形成を妨害しないので、本明細書に記載した修飾面相 支持体は、現在、ＯＤＮ合成に用いられている固定しＤＭＴｒで保護したヌクレ オシドに対して適当な代用品である。これらの固定したヌクレオシドに関係した 欠点は高価であることおよび利用される４つのタイプのＣＰＧをもつ必要性を含 む。

反対に、３′−末端ヌクレオシドがホスホロアミダイトとして加えられる特許請 求する方法の範囲内では、修飾固相支持体はＯＤＮ配列の製造にとっても普遍的 な試薬として用いることができる。さらに、固定したヌクレオシドのＤＭＴｒで 保護した５°−水酸基とは対照的に、固相支持体から突き出た結合手上のＤ　Ｍ 　Ｔ　ｒで保護した水酸基は阻害されていない。それ故、修飾面相支持体のＤＭ Ｔｒで保護した水酸基は、嵩高いホスホロアミダイト試薬への接近が増大し、Ｏ ＤＮ生成物の高収量を得ることができる。

本発明のこの態様の修飾固相支持体は、支持体とＤＭＴｒで保護した水酸基を接 続するＲ基（すなわち、アルキル、アリール、アリールアルキル、ヘテロアルキ ルまたはへテロアリール）を特徴づける。好ましい実施例では、Ｒは（ＣＨ２） ｎでｎは２〜１０である。特に、好ましい実施例では、Ｒは（ＣＨ２）６である 。代表的な修飾固相支持体、ヘキサノール−ＣＰＧの製造が工程ＶＩＩで示され る。ヘキサノール−ＣＰＧの合成における重要な中間体、０−（４，４’−ジメ トキシトリチル）−１，６−ヘキサンジオール旦ユは、Ｆ、５ｅｅｌａおよびに 、　Ｋａｉｓｅｒ（Ｎｕｃｌ、Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、１５．３１１３（１９８７ ））の変法を用いて、ヘキサンジオールをＤＭＴｒ−Ｃ１で処理することによっ て製造される。その中間体のスクシニル化、続いて、長鎖状アルキルアミンで制 御された細孔ガラス支持体（ＬＣＡＡ−ＣＰＧ）に固定化するとヘキサノール− ＣＰＧを得る。

３°−へキサノール−尾分子付“アンチセンス”オリゴデオキシヌクレオチドは 、生物学系のモデルで研究されたきた。これらのアンチセンスＯＤＮは、バラメ シウムテトラウレリア（Ｐａｒａｍｅｃｉｕｒ　ｔｅｔｒａｕｒｅｌｉａ）の遊 泳挙動に著しい作用を示した。野性株細胞およびランダムまたはセンスＯＤＮで 処理した細胞は何ら作用を示さなかった。

以下に記載する実施例は、工程■〜ＶＩＩＩの反応系列に対応するものである。

工程ＩおよびＩＩＩでは、同定“Ｃｈｏｌ“なる記号コレステリル基を表わす。

工程酸を説明し、工程ＶＩＩＩは３′−アクリンン尾分子の構造を示している。

ＣＢＺヒドロキシプロリン（４，７６ｇ、１８ｍｍｏ１．Ｓｉｇｍａ　Ｃｈｅｍ ｉｃａｌ　Ｃｏ、）の無水テトラヒドロフラン（２０ｍＬ）の水冷した溶液中に 、１Ｍボラン−テトラヒドロフランコンプレックスのテトラヒドロフラン溶液（ ４５ｍＬ、Ａｌｄｒｉｃｈ）を加えた。アルゴン下に０〜５０℃で１５分間次い で室温で４．５時間撹拌後、反応混合物にメタノール（５０ｍＬ）を加え反応を 止めた。３０分後、反応溶液を濃縮し、残留する無色シロップ状物質をメタノー ル−塩化メチレンによるグラジェント法（勾配溶離法）を用い、フラッシュクロ マトグラフィー（３，５Ｘ　２３ｃｍ、シリカ）により精製した。生成物を１０ ％メタノールで溶出した。純粋な生成物を含むフラクションから溶媒を除去する と前記（１）（２，１８ｇ、４６％収率）が無色シロップとして得られた。

ＴＬＣ（９５・５／塩化メチレン、メタノール）、Ｒｆ＝０．１６゜ＩＲ（ｎｅ ａｔ　（＝−ト））３６００−３１００（ｂｒ）、２９４０．１６８０．１４２ ０、および１３５５ｃｍ−’。

’Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣ１３）７．３６（ｓ、　５　Ｈ）、　５．１７（ｓ、　２ Ｈ）、　４．５０　（ｍ、　２　Ｈ）。

３．６７（ｍ、４Ｈ）、２．０９（ｍ、３Ｈ）。

分析（１１（Ｃ＋５ＨｕＮＯ＋　・０．３Ｈ２０（！：ｌ、て）計算値：Ｃ，６ ０，８３；Ｈ，６，９１；Ｎ、５．４６゜実測値：Ｃ，６０，８５；Ｈ，６，８ ８；Ｎ、５．３６゜ＣＢＺヒドロキシプロリノール（１）　（１，９２ｇ、　７ ．６關０１）のメタノール（５０ｍＬ）溶液を水素気球の下で１０％パラジウム −炭素（３２０ｍｇ）と撹拌した。

１６時間後、薄層クロマトグラフィー（９，１塩化メチレン・メタノール）によ り示したように、出発原料は残存しなかった。反応混合物をセライト（メタノー ルで洗浄）で濾過し、濾液を濃縮すると所望の生成物（２）が黄色シロップとし て定量的に得られた。このシロップをエタノールに溶かすと０．５Ｍ貯蔵溶液（ １５゜２ｍＬ）が得られた。

ＩＲ（−１−−ト）３６００−３１００（ｂｒ）、２９２０．１５３０および１ ４１　Ｑｃｌｎ−’。

’ＨＮＭＲ（Ｄ、○）４．４０（ｍ、ＩＨ）、３．６０（ｍ、３Ｈ）、３．０２ （ｄ、ｏｆ　ｄ、ＩＨ。

Ｊ＝１２．４，４．８Ｈｚ）、２．７７（ｄ　ｏｆ　ｔ、ＩＨ，Ｊ＝１２．４． １．８Ｈｚ）、１．８４（ｍ、ＬＨ）、１．６０（ｍ、ＩＨｏ）。

実施例■ （２Ｓ、　４　Ｒ）−Ｎ−コレステリルオキシカルボニル−４−ヒドロキシ−２ −ヒドロキシメチルピロリジン（３） ヒドロキシプロリノール（２）の０．５Ｍ貯蔵のエタノール溶液（７，６ｍＬ、 　３゜８ｍｍｏｌ）にコレステロールクロロホーメーｈ（１，４８ｇ、　３．３ ｍｍｏｌ）の塩化メチレン（８ｍＬ）溶液を加え、混合溶液を室温で１．５時間 撹拌した。濁った反応液を氷水（１００ＷＬ）に注ぎ、不均一混液を熱酢酸エチ ル（３Ｘ１５０ｍＬ）で抽出した。

集めた有機層を食塩水で洗浄、硫酸マグネシウムで乾燥してから濃縮した。固形 の残留物をメタノール−ヘキサン：酢酸エチル（１：ＩＸグラジェント）を用い 、フラッシュクロマトグラフィー（４ｘ１５ｃｍシリカ）により精製した。生成 物を１０％メタノールで溶出した。純粋な生成物を含むフラクションから溶媒を 除去すると（３０１，４２ｇ、８１％収率）が白色固体として得られた。

ＴＬＣ（９５：５／塩化メチレン、メタノール）、Ｒｆ＝０．１０゜１０％硫酸 −メタノールでスプレーし加熱すると生成物は黒色に着色した分析値（ＣｓｓＨ ｓｓＮＯ４として） 計算値：Ｃ，７４，８１：Ｈ，１０，４６，Ｎ、２．６４゜実測値Ｃ，７４，７ ４：Ｈ，１０，３３＋Ｎ、２．３０ジオール（３）　（１，４２ｇ、　２．６８ ｍｍｏｌ）の乾燥ピリジン（２７ｍＬ）溶液に、撹拌しながらトリエチルアミン ・（０，５２４ｍＬ）、４−ジメチルアミノピリジン（１６，５ｍｇ）、および ジメトキントリチルクロリド（１，１０ｇ、　３．２３ｍｍｏｌ）を加えた。

アルゴン気流下４，５時間撹拌の後、反応混合物から溶媒を除去し、残余のピリ ノンをトルエンと共に溜去した。残留物をエーテル（１００ｍＬ）−水（４０ｍ Ｌ）の間に分配した。水層をエーテル（８０ｍＬ）で抽出し、集めた有機層を食 塩水で洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥し、濃縮した。残留物を酢酸エチル−ヘキ サン（グラジェント）を用い、フラノツユクロマトグラフィー（４，５Ｘ　２　 Ｑｃｍシリカ）により精製した。黄色の不純物を得た直後に生成物を２・１／ヘ キサン・酢酸エチルで溶出した。純粋な生成物を含むフラクションから溶媒を除 去すると、（４）　（１゜３３ｇ、６０％収率）が淡黄色泡状固体として得られ た。

ＴＬＣ（９５：５／塩化メチレンメタノール）、　Ｒｆ＝　０．４９１０％硫酸 −メタノールでスプレーすると生成物は橙色に着色した。

’ＨＮＭＲ（ＣＤＣＩｓ）７．２６（ｍ、９Ｈ）、６．８１（ｄ、４Ｈｊ＝８． ８Ｈｚ）、５３０（ａ　ＩＨ）、４．５０（ｍ、２Ｈ’）、４．１５（ｍ、ＩＨ ）、３．７８（ｓ、６Ｈ）、３．７７−３０（，４Ｈ）、２．４−０．６（ｍ、 ４６）（）分析値（Ｃｓ　４８７３　Ｎ　Ｏａとして）計算値：Ｃ，７７，９４ ：Ｈ，８，８４：Ｎ、１．６８゜実測値・Ｃ，７７，２６；Ｈ，８，８２＋Ｎ、 １．５６実施例Ｖ （２Ｓ、　４　Ｒ）−Ｎ−コレステリルオキシカルボニル−４−スクシニルオキ シ−２−ジメトキノトリチルオキシメチルピロリジノン（５）アルコール（４） 　（１，２２ｇ、　１．４７ｍｏｏｌ）の乾燥ピリジン（１２ｍＬ）溶液に撹拌 下、無水コハク酸（４４３ｍｇ、　４．４３ｍｍｏｌ）およびジメチルアミノピ リジン（８９ｍｇ、　０．７３ｍｍｏｌ）を加え、反応混合物をアルゴンの下で ２６時間撹拌した。溶媒除去し、残余のピリジンをトルエンと共に留去した。残 留物をクロロホルム（４０ｍＬ）に溶かし、食塩水で洗浄し、硫酸ナトリウムで 乾燥し、濃縮すると生成物（５）をベージュ色の泡状固体として定量的に得られ た。

ＴＬＣ（９５：５／塩化メチレン・メタノール）、Ｒｆ＝０．３２゜１０％硫酸 −メタノールでスプレーすると生成物は橙色に着色した。

スクシニル化したコレステロール誘導体（５）を刊行物記載の方法（Ｒ，Ｔ、　 ＰＯｎらＢ　１ｏｔｅｃｈｎ、旦、７６８．（１９８８））で長鎖アルキルアミ ンで制御した細孔ガラス支持体（ＬＣＡＡ−ＣＰＧ、Ｓｉｇｍａ）に固定した。

ＬＣＡＡ−ＣＰＧ（５，０ｇ）を３％ジクロｏ酢酸−塩化メチレン（１００ｍＬ ）と３時間撹拌した。そのＣＰＧを３０ｍＬ容量の半融ガラス濾過器で濾過し、 クロロホルム（１５０ｍＬ）とエーテル（１５０ｍＬ）で洗浄した。得られた固 形物を減圧で乾燥し、２５０ａＬ丸底フラスコ中に乾燥ピリジン（５０ｍＬ）、 スクンニル化コレステロール誘導体（５）　（９３２ｍｇ、　１ｍｍｏｌ）、ト リエチルアミン（０，４ｍＬ）、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピ ル）カルボジイミド（１，９２ｇ、１０ｍｏｏｌ）および４−ジメチルアミノピ リジン（６０ｍｇ）と混合した。混合物をオービタルミキサーにかけ、１１００ ｒｐで３８時間撹拌した。そのＣＰＧを３０ｍ１容量の半融ガラスフィルターで 濾過し、ピリジン（５０ｍＬ）、メタノール（１００ｍＬ）、クロロホルム（５ ０ｍＬ）およびエーテル（５０ｍＬ）で洗浄し次いて減圧乾燥した。

ＣＰＧ上の残余のアミノ基を、乾燥ピリジン（１５ｍＬ）と無水酢酸（２，Ｑｍ Ｌ）中にその支持体を撹拌することによってキャップした。２時間后、そのＣＰ Ｇを濾過し、上記と同様に洗浄し、減圧乾燥すると生成物（６）　（５，０ｇ） が得られた。

このものは刊行物記載の方法（Ｔ、　ＡｔｋｉｎｓｏｎおよびＭ、　３Ｉｌｌｉ ｔ１１．ＱｌｉｇｏｎｕｃｌｃｏｔｉｄｅＳｙｎｔｈｅｓｉｓ、ａ　Ｐｒａｃｔ ｉｃａｌ　Ａｐｐｒｏａｃｈ、Ｍ、Ｊ、Ｇａ１ｔ、Ｍ、Ｊ、（ｅｄ、）、ＩＲＬ 　ｐｒｅｓｓ（１９８４）、ｐ４８）に従ってジメトキントリチル含量について 分析され、ＣＰＧ支持体が１７．６　；ｍｏｌ／Ｈの充填度をもつことが分かっ た。

ジメトキノトリチル含量（１ｍｉｃｒｏｍｏｌ）に相当する量のコレステロール −ＣＰＧを空のカラム（例えば、Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂ　ｉｏｓｙｓｔｅｗ　Ｉ　 ｎｃ、またはＣｒｕａｃｈｅｍカラム）に充填した。塩基配列ＣＴＣＣＡＴＧＴ ＴＣＧＴＣＡＣＡを有するオリゴヌクレオチドは標準のホスホルアミダイト化学 を駆使してＭｉｌｌｉｇｅｎＤ　Ｎ　Ａ合成機で製造した。５’−ＤＭＴｒ保護 基は残した。オリゴヌクレオチドをＣＰＧから切断し、濃アンモニア（２ｍＬ） と室温で３日間処理することによって脱保護した。上澄液を直接ＰＲＰ−１逆相 高速液体クロマトグラフィーカラム（２０〜１００％アセトニトリル−トリエチ ルアンモニウムアセテート（ｐＨ７，５）のグラジェントで溶出）に注入した。

生成物を一部分に集め、凍結乾燥すると、５”−ＤＭＴｒで保護した生成物が得 られた。ＤＭＴｒ基を８０％酢酸と室温に１６時間処理して除去し、ＨＰＬＣで 再精製した。集めた生成物をＵＶ２６０止で分析すると生成物の０．５４ｍｇを 含有することが分かった。本性を別に反復すると、ＤＭＴｒ基は合成機にある間 に３％Ｄ　ＣＡで除去され、オリゴヌクレオチドの収率を増大した。

！１−’３−（９−アクリジニル）−１−オキソプロピル］−５−ヒドロキシメ チル−（３Ｒ−４ランス）−３−ピロリジノール、工程■）塩化メチレン（１， ５ｍＬ）中の９−アクリジンプロピオン酸（１２３，５ｍｇ、　０．５ｍｍｏｌ ＸＨ，Ｊ　ｅｎｓｅｎおよびり、Ｊ、Ｈｏｖｌおよび、Ｊ、、Ａｍ、Ｃｈｅｍ、 Ｓｏｃ、４８．１９２６（１９８９））、エチルジイソプロピルアミン（０，１ ０４ａＬ、　０．６ｍｍｏｌ）ノス５リーに、撹拌下、２−フルオロ−１−メチ ルピリジニウムトンレート（ＦＭＰＴＸｏ、６ａｍ０１）を加えた。室温で１５ 時間後、その濁った茶色の溶液を水−食塩浴で冷却したヒドロキシプロリノール （２）　（０，５ｍｍｏｌ）のエタノール溶液に撹拌しながら加えた。室温で１ 時間撹拌を続げた後、反応混合物にメタノール（１０ｍＬ）を加え、反応を止め てがら、濃縮した。残留物をメタノール−塩化メチレン（グラジェント）を用い 、フラッシュクロマトグラフィー（１，５Ｘ２４Ｃｍシリカ）で精製した。純粋 な生成物を含んだフラクションがら溶媒を除去すると（７）　（１１２ｍｇ、　 ６４％収率）が黄色泡状固体として得られた。

ＴＬＣ（９０：１０／塩化メチレン：メタノール）、Ｒｆ＝０．５０生成物は青 色蛍光を発する黄色のスポットとして現われた。

ＩＲ（ＫＢｒ）３４００（ｂｒ）、１６２０．１４４０．１０７１０７Ｏ’。

’ＨＮＭＲ（ＣＤＣｌ２）８．３０（ｄ、４Ｈ，Ｊ＝９．４Ｈｚ）、７．８２（ ｔ、２Ｈ，Ｊ−６，６Ｈｚ）、７．６２（＋＋＋、２Ｈ）、４．３１（ｍ、２Ｈ ）、４．０５（ｔ、２Ｈ，Ｊ＝８．２Ｈｚ）。

３．７０（ｍ、ＩＨ）、３．５０（ｍ、２Ｈ）、３．２２（ｄ、２Ｈ，Ｊ＝１． ４Ｈｚ）、２．７８（ｍ。

２Ｈ）、　２．０３（ｍ、　Ｉ　Ｈ）、　１．６４（ａ＋、　Ｉ　Ｈ）。

分析値（Ｃ２１Ｈ２２Ｎ　２０　ｓ・０．５Ｈ２０として）計算値：Ｃ，７０， １８：Ｈ，６，４５：Ｎ、７．７９実測値：Ｃ，７０，４１；Ｈ，６，４５：Ｎ 、７．６８ジオール（７）　（１００ｍｇ、　０．２８５ｍｍｏｌ）のピリジン （２，，５ｖＬ）溶液に、撹拌しながら４−ジメチルアミノピリジン（６，４ｍ ｇ）、トリエチルアミン（０，１３ｉＬ）、およびジメトキシトリチルクロリド （１５４＋ｇ）を加えた。アルゴン気流下１６峙間撹拌したのち、混合物から溶 媒を除去し、残余のピリジンはなお塩化メチレンと共に留去した、残留物を塩化 メチレン（５ｉＬ）に溶かし、水（２Ｘ３ｍＬ）次いで食塩水（３ｉＬ）で洗浄 し、硫酸ナトリウムで乾燥してから溶媒を除去した。残留物をメタノール−１： １／ヘキサン：酢酸エチル（グラジェント）を用い、フラッシュクロマトグラフ ィーで精製した。純粋な生成物を含むフラクシヨンを集め溶媒を除去すると（８ ）　（１２３ｍｇ、　６６％収率）が黄色泡状固体として得られた。

ＴＬＣ（４５・４５：１０／ヘキサン：酢酸エチル：メタノール）、　Ｒｆ＝０ ．２６生成物は青色の蛍光を発する黄色のスポットとして現われ、１０％硫酸− メタノールでスプレーすると橙色に着色した。

ＩＲ（ＫＢｒ）３４００（ｂｒ）、１６２０．１４４０．１０７０ｃｍ−１゜’ ＨＮＭＲ（ＣＤＣＩｓ）８．１７（ｍ、　４　Ｈ）、　７．７５（ｔ、　２Ｈ， Ｊ　＝　７．０Ｈｚ）、　７゜５７−７、０９（ｍ、　９Ｈ）、　６．８２（ｄ 、　２Ｈ，Ｊ＝８．８Ｈｚ）、　６．６６（ｍ、　２Ｈ）、　４．５６（ｍ、２ Ｈ）、３．６．５−２．９０（ｍ、２Ｈ）、２．６９（ｍ、２Ｈ）、２．１５（ ｏ＋、ＬＨ）、１゜９５　（ｍ、　Ｌ　Ｈ）。

分析値（Ｃ４！Ｈ４゜Ｎ２Ｏ５・０．５Ｈ２０として）計算値：Ｃ，７６，２３ ：Ｈ，６，２４；Ｎ、４．２３゜実測値：Ｃ，７６，５３：Ｈ，６，６７：Ｎ、 ３．８０゜実施例Ｘ （２Ｓ、　４　Ｒ）−Ｎ−（９−アクリジンプロパンアミシル）−４−スクシニ ルオキシ−２−ジメトキシトリチルオキシメチルピロリジン（９）アルコール（ ８）（１２０ｍｇ、０．１８４ｍｍｏｌ）の乾燥ピリジ：’（１，５ｉＬ）の撹 拌溶液に４−ジメチルアミノピリジン（１１，２ｍｇ）を加えた。混合物をアル ゴン下で４０時間撹拌してから溶媒を除去した。残余のピリジンはトルエンと共 に留去し、取り除かねた。残留物をクロロホルム（３ｉＬ）に溶かし、食塩水で 洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥し、濃縮すると生成物（９）　（１２８ｍｇ、　 ９３％収率）が黄色泡状固体として得られた。

ＴＬＣ（９５：５／塩化メチレン：メタノール）、Ｒｆ＝０．１３゜生成物は青 色の蛍光を発する黄色のスポットとして現われ、１０％硫酸−メタノールでスプ レーすると橙色に着色した。

コレステロール−ＣＰＧ支持体（６）に対して上述した方法を用いて、スクシニ ル化したアクリジン誘導体（９）を長鎖アルキルアミンで制御した細孔ガラス支 持体に固体した。丸底フラスコ中に酸洗浄のＬＣＡＡ−ＣＰＧ（０，８５ｇ）を 乾燥ピリジン（８，５ｉＬ）、トリエチルアミン（０，０６８ｉＬ）、１−エチ ル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（３２５ｍｇ、　１． ７ｍｍｏｌ）、および４−ジメチルアミノピリジン（１０，２ｍｇ）と混合し、 混合物をアルゴン気流下に１９時間撹拌した。そのＣＰＧを濾過し、ピリジン、 メタノール、クロロホルムおよびエーテルで洗浄し、次いで減圧乾燥した。その ＣＰＧ上に残留するアミノ基を、乾燥ピリジン（２，５ｉＬ）および無水酢酸（ ０，３４ｉＬ）中支持体を撹拌することによって、キャップした。２時間後、そ のＣＰＧを濾過し、上述のように洗浄し、減圧乾燥すると生成物（１０）　（０ ，８５ｇ）が得られた。この物質はジメトキシトリチル含量について分析され、 ＣＰＧ支持体が１８．５μｍｏｌ／ｇの充填車をもっことジメトキシトリチル含 量（１ｍｉｃｒｏｍｏｌ）に相当する量のアクリジン−〇　Ｐ　Ｇ　（１０）を オリゴヌクレオチド合成カラムに充填した。塩基配列５’　−ＣＴＣＴＣＣＡＴ ＣＴ　Ｔ　ＣＧ　Ｔ　ＣＡ　ＣＡを有するオリゴヌクレオチドを標準のホスホル アミダイト化学を駆使して、ＭｉｌｌｉｇｅｎＤ　Ｎ　Ａ合成機で製造した。得 られたオリゴヌクレオチドをそのＣＰＧから切断し、濃縮アンモニア（２ｉＬ） で４０℃、２４時間処理して脱保護した。上澄液を直接ＰＲＰ−１逆相高速液体 クロマトグラフィーカラム（２０％〜１００％アセトニトリル−トリエチルアン モニウムアセテート（ｐＨ７５グラジエントで溶出）に注入した。生成物（１０ ’）を１つのフラクションに集め、凍結乾燥すると蛍光性のオリゴヌクレオチド 生成物（１０’Ｘ１．９９ｍｇＸＵＶ２６０ｎｍにより決定）が淡黄色固体とし て得られた。

実施例Ｘ■ ４−Ｎ−ベンシルオキシカルボニルー３−ヒドロキシ酪酸（１１）４−アミノ− ３−ヒドロキシ酪酸（１）、　ｏｇ、　４２．　Ｏｍｍｏｌ、　Ｓｉｇｍａ　Ｃ ｈｅｍｉｃａｌ　ＣＯ）を水酸化ナトリウム（３，７ｇ）の水（３５ｉＬ）溶液 に溶かし、この水冷溶液にＣＢＺクロリド（７，８８ｇ、　４６．２ｍｍｏｌ） を２０分間に滴加した。混合物を水中で２時間撹拌してからエーテル（５０ｉＬ ）で洗浄し、過剰のＣＢＺクロリドを除去した。水層を３ＮＨＣ１（２０ｉＬ） で酸性とし、酢酸エチル（４Ｘ　５０ｉＬ）で抽出した。抽出液を合わせ、硫酸 マグネシウムで乾燥し、溶媒を減圧留去すると無色シロップ状物質が得られ、す ぐに結晶化した。クロロホルムから再結晶化すると所望の生成物（１１）（４， ７０ｇ、　４４％収率）が白色結晶（融点９４〜９５℃）として得られた。

’ＨＮＭＲ（ＣＤＣＩｇ）７．３５（ｓ、５Ｈ）、６．７０（ｓ、２Ｈ）、５． ７０（ｓ、ＩＨ）。

５．１５（ｓ、２Ｈ）、４．３５−３．９５（ｍ、ＩＨ）、３．２５−３．００ （ｍ、２Ｈ）、２．５０（ｄ、２Ｈ，Ｊ　＝６．５Ｈｚ） 実施例ＸｒＶ １−Ｎ−ベンジルオキ７カルボニルー２．４−ブタンジオール（１２）酸（１１ ８４，５７ｇ、　１８．　Ｏｍｍｏｌ）の乾燥テトラヒドロフラン（１８ａ＋Ｌ ）溶液を水冷した１Ｍボラン−テトラヒドロフラン（、Ａ　１ｄｒｃｈ　ｅｈｅ ｍｉｃａｌ　Ｃｏ、　）のテトラヒドロフラン溶液にアルゴン雰囲気下撹拌しな がら滴加した。滴加え終了后、混合物を室温で３０分間撹拌を続は次いで１０％ 酢酸−メタノール（３６ｉＬ）を加え反応を止めた。減圧で溶媒を除去し、残留 物を酢酸エチル（８０ｉＬ）により、１５Ｎ塩酸、水および飽和炭酸水素ナトリ ウム水溶液で洗浄した。炭酸カリウム上で乾燥後減圧で溶媒留去すると白色固体 を得た。ベンゼン−ヘキサンから再結晶すると所望の生成物（１２０１，６９ｇ 、　３８％収率）が白色結晶（融点８０．５〜８２℃）として得られた。

’ＨＮＭＲ（ＣＤＣ１３）７．３５（Ｓ、　５Ｈ）、　５．５０（ｔ、　Ｉ　Ｈ ，Ｊ　＝６．０　Ｈｚ）、　５゜１０（ｓ、　２Ｈ）、　３．７５（ｔ、　２Ｈ Ｊ　＝６．０）、　４．１．０−２．６５（ｍ、　５Ｈ）、　１．６０（ｑ。

２Ｈ，Ｊ＝６．０Ｈｚ）。

酸化パラジウム−炭素（８００ｍｇ）、エタノール（１００１！Ｌ）、および１ ，４−シクロへキサジエン（２０ｉＬ）と混ぜ、混合物を１６時間加熱還流した 。薄層クロマトグラフィー（１０％メタノール−塩化メチレン）は出発原料の残 存を示さなかった。混合物を半融ガラスロート（エタノール洗浄）上セライトを 通して濾過し次いで溶媒を減圧留去すると所望の生成物（１３）（０，８４ｇ） が黄色シロップとして得られた。エタノールで７ｉＬに希釈するとアミノジオー ル（１３）の１Ｍ貯蔵溶液が得られた。

’　ＨＮ　ＭＲ（Ｄ　２０）４．８０（ｓ、４Ｈ）、３．８０（ｔ、２Ｈｊ＝６ ．０Ｈｚ）、４．００−３．６５（ｍ、ＩＨ）、３．４０−２．５０（ｍ、２Ｈ ）、１．９５−１．５５（ｍ、２Ｈ）。

アミノジオール（１３Ｘ６．０龍ｏ１）のエタノール（６，０ｉＬ）の水冷溶液 にコレステロールクロロホーメート（２，２５ｇ、　５．　ＯＯｍｍｏｌ）の塩 化メチレン（５ｉＬ）溶液を加えた。混合物を水浴からはずし、アルゴン気流下 １．５時間撹拌し、次いで氷水（１５０ｇ）中に注入した。混合物を酢酸エチル （２Ｘ１５０ｍＬ）で抽出し、抽出液を水（２Ｘ１００ｍＬ）、食塩水（ＩＸｌ ｏｏｍＬ）で洗浄し、硫酸マグネシウムで乾燥した後溶媒を留去した。固形残留 物をテトラヒドロフラン（１０ｉＬ）に溶かし、シリカゲルカラム（３，５ｘ１ ５ｃｍ、１：１ヘキサン：酢酸エチルで充填）でりロマトグラフィーにかけた。

１１ヘキサン酢酸エチル（３００ｍＬ）て溶出後４５：４５：１．０ヘキサン酢 酸エチルメタノールを用いると生成物を溶出した。

溶媒除去すると粘着性の白色固体（１４０２，０４ｇ、　７９％）が得られた。

’ＨＮＭＲ（ＣＤＣＩｓ）５．３８（ｃｌ、　Ｌ　Ｈ）、　５．１４（ｔ、　Ｉ Ｈ）、　４．５０（ｍ、　Ｉ　Ｈ）。

４．００−３．７０（ｍ、３Ｈ）、３．６０−３．００（ｍ、２Ｈ）、２．４０ −２゜２０　（ｍ、　２Ｈ）、　２．１０−０．６０（ｍ、　３Ｈ）ノオール（ １４０１，７４ｇ、　３．３５ｍｍｏｌ）の乾燥ピリジン（２３ｍＬ）の撹拌溶 液にンメトキシトリチルクロリド（１，３６ｇ、　４．０２ｍｍｏｌ）、トリエ チルアミン（０，６５，５ｗＬ）および４−ジメチルアミノピリジン（２０，５ ｍｇ）を加えた。反応混合物をアルゴン気流下１６時間撹拌した後、水（２５ｍ Ｌ）とエーテル（７５ｍＬ）の間に分配した。水層を別にエーテル（７５ｍＬ） で抽出し、抽出液を合わせ水、食塩水で洗浄し次いで硫酸ナトリウムで乾燦し、 溶媒を留去した。残留物をシリカゲルカラム（３，５Ｘ　１３ｃｍ、　４・１ヘ キサン：酢酸エチルで充填）でクロマトグラフィーにかけた。生成物（黄色の不 純物で汚染した）を含むフラクションをあっめ、溶媒を留去すると黄色泡状固体 （２，２２ｇ）が得られた。５％メタノール−塩化メチレンおよび４１ヘキサン ：酢酸エチルを用いて繰返しクロマトグラフィーにかけると純粋な生成物（１５ ）が淡黄色泡状固体として得られた。

’ＨＮＭＲ（ＣＤＣ１３）７，４５７．１０（ｒｒｌ、９Ｈ）、６．８０（ｄ、 ４Ｈｊ＝８．８Ｈｚ）、　５．３８（ｄ、ＩＨ）、５．０５（ｂｒ　ｔ、ＩＨ） 、４．５０（ｔＩＨ）、３．９０−３．８０（ｍ、　２Ｈ）、　３．８０（ｓ、 　６）ｉ）、　３．５０−２．９３（ｍ、　４Ｈ）、　２．３０（ｍ、　２Ｈ） 、　２１０−０．６０（ｍ、　４３Ｈ） 分析値（Ｃ３ｓＨｔｓＮＯａとして） 計算値：Ｃ，７７，６２：Ｈ，８，９７；Ｎ、１．１７実測値Ｃ，７７，４１； Ｈ，８，９７＋Ｎ、１．６０実施例Ｘ■ 】８−Ｎ−コレステリルオキシカルボニル−２−スタンニルオキシ−４−ジメト キントリチルオキシブタン（１６）アルコール（１５Ｘ４１５ＩＩ１ｇ、　０． ５０６ｍｍｏｌ）の乾燥ピリジン（２ｍＬ）の撹拌溶液に４−ジメチルアミノピ リジン（３０ｍｇ）および無水コ／Ｘり酸（４８ｍｇ、　０．４８ｍｍ。

１）を加え、混合物をアルゴン気流下に２４時間撹拌した。薄層クロマトグラフ ィー（５％メタノール−塩化メチレン）は未反応の出発原料の痕跡量を示した。

溶媒を除去し、残余のピリジンをトルエン（２Ｘ　Ｉ　ＱｍＬ）と共に溜去した 。残留の黄色泡状固体（１６）をｐ−ニトロフェニルエステルへの変換およびＣ ＰＧへの固定にスクシニル化したコレステロール誘導体（１６）をＡｔｋｉｎｓ ｏｎおよびＳＳｍ１ｔｈ（Ｏｌｉ。

ｎｕｃｌｃｏｔｉｄｅ　５ｙｎｔｈｅｓｉｓ、ａ　Ｐｒａｅｔｉｅａｌ　Ａｐｐ ｒｏａｃｈ、Ｍ、Ｊ、Ｇａ１ｔ、（ｅｄ、）ＩＲＬｐｒｅＳｓ、　ｐｐ　４７〜 ４９（１９８４））の方法を用いて、長鎖アルキルアミンで制御した細孔ガラス 支持体（ＬＣＡＡ−ＣＰＧ、Ｓｉｇｍａ）に固定した。粗製のスクシネート（１ ６０１０５ｍｇ）をｐ−ニトロフェノール（１６ｍｇ）および乾燥ピリジン（０ ，０５ｖＬ）と−緒に乾燥ジオキサン（１，ＯｍＬ）に溶解した。ジシクロへキ シルカルボジイミド（５２ｍｇ、　０．２５ｍｍｏｌ）を加え、混合物を室温で １５分間撹拌してから、冷蔵直に１６時間冷却した。粗製のｐ−ニトロフェニル エステル溶液を少量のセライトを通して濾過し、ＤＣＵを除去し、次いで濾液を 直接ジメチルホルムアミド（ＤＭＦＸｌ、５ｍＬ）中ＬＣＡＡ−ＣＰＧ（０，５ ０ｇ）に加えた。エチルジイソプロピルアミン（０，１ｍＬ）を加えてから、混 合物をアルゴン気流中で１８時間撹拌した。そのＣＰＧを半融ガラスロートで濾 過し、ジメチルホルムアミド（３×１０ｍＬ）、メタノール（３Ｘ　１　ＯｍＬ ）およびエーテル（３Ｘ　１　ＯｍＬ）で洗浄した。誘導化したＣＰＧを真空ポ ンプで乾燥し、次に乾燥ピリジン（１，５ｍＬ）と無水物酢酸（０，２ｍＬ）で 処理してキャップした。アルゴン下に３時間撹拌ビニ後、そのＣＰＧを濾過し、 メタノール（３Ｘ　１　ＯｍＬ）およびエーテル（３Ｘ　１　ＯｍＬ）で洗浄し 、真空ポンプで乾燥するとコレステロール−ｃＰＧ（１７）（０，４６ｇ）を得 た。このＣＰＧをＧａ１ｔの記述したプロトニールに従って、ＤＭＴｒ含量につ いて分析したところ、ＣＰＧ支持体の充填度が２４μｍｏｌ／ｇであることが分 かった。

オリゴヌクレオチド合成のためのコレステロール−ＣＰ　Ｇ　（１７）の安定性 を試験するために、単一なチミジン残基を固相支持体（４１、６ｍｇ、　１　ｍ ｉｃｒｏｍｏｌ）に加えた。

標準のホスホルアミダイトカップリング化学と共にＭｉｌｌｉｇｅｎＤ　Ｎ　、 Ａ合成機を駆使した。そのチミジン上の５゛−ジメトキシトリチル保護基は生成 物の単離や確認を助けるために、除去されなかった。そのＣＰＧをアセトニトリ ル（８ｏＬ）でよく洗浄し、痕跡量の未反応のＤ　Ｍ　Ｔ　ｒ−チミジンホスホ ルアミダイトおよび他の非共有結合的に結合した不純物を取り除いた。そのＣＰ Ｇを真空ポンプで乾燥し、上述のようにＤ　Ｍ　Ｔ　ｒ含量を分析した結果充填 度が２７ｍｉｃｒｏｍｏｌ／ｇであることが分かった。３°−コレステロール尾 分子付チミジンは支持体（２０ｍｇ）を５ｍＬ反応瓶（テフロンライナー）中に 濃縮アンモニア（１０ｍＬ）と４４℃で２４時間処理することによって切り離し た。上澄液（パスツールピペット）を除き、支持体をメタノール（３Ｘ２ｍＬ） で洗浄し、３°−コレステロール尾分子付チミジンを単離した。洗液を合わせ、 溶媒除去（ロータリーエバポレーター／真空ポンプ）し、７１１１１酢酸エチル アセトン・メタノール・木酢酸を用い、ノリカゲルプレート上薄層クロマトグラ フィーにより分析した。ＤＭＴｒを含む一つの主要なスポット（Ｒｆ＝０．６３ ）が１０％硫酸−メタノールでスプレーすると、橙色に着色した。はんの痕跡量 のＤＭＴｒ−チミジン（Ｒｆ＝０．８４）Ｌか検出されず、従って、このことは コレステロール結合の安定性を示した。２４時間アンモニア処理後のそのＣＰＧ 支持体は１．４μｍｏｌ／ｇのＤＭＴｒ含量を示した。

ＤＭＴｒ−チミジン誘導化コレステロール−ＣＰＧを４４℃で５時間アンモニア 処理すると２４時間処理と同様の薄層クロマトグラフィー結果を与えた。５時間 アンモニア処理後のＣＰＧ支持体は３．２μ１Ｉｏ１／ｇのＤＭＴｒ含量を示し た。

アクリジン３゛−尾分子をもつ、実施例Ｘ■から得られたオリゴヌクレオチド（ １０′）を相補的オリゴヌクレオチド鎖の存在においてその溶融温度の特性につ いて研究した。そのアクリジンインターカレーティング剤の存在は３′−尾分子 アクリジンをもたない同様のオリゴヌクレオチドと比較して、Ｔｌ１１（溶融温 度）を約４℃上昇した。

適当なオリゴヌクレオチドの３°尾分子に結合した適当なレポーター基は、オリ ゴヌクレオチドの存在を確認（同定）するのに有用である。このようなレポータ ー基の蛍光、化学発光、または他の性質はこれらのヌクレオチドを非放射能的に ラベルするのに役立つ。そこで、例えば生体試料のような問題とする試料の中の ヌクレオチドを蛍光または他の同様な性質の存在によって同定することができる 。

例えば、コレステロール尾分子付３′オリゴヌクレオチドのような親油性尾分子 基はオリゴヌクレオチドの細胞膜の透過性を助ける、このようにして、オリゴヌ クレオチドの細胞内濃度の増加または細胞膜の透過性の促進が達成される。オリ ゴヌクレオチドの３′末端の切断基は、オリゴヌクレオチドをこのような相補的 配列に結合して後オリゴヌクレオチドの相補的配列をもつＤＮＡの部位特異性の 切断を助けることができる。このような利用は遺伝子の同定や単離などに関係し つる。

他の尾分子またはコンジュゲート（抱合体）は他の生物的および物理的性質の双 方に基いて選ばれよう。このような他の生体尾分子は、適当にブロックした合成 ペプチド、ビューロマイシンやンゴキシゲニンなどを包含しつる。有用な物理的 性質を有する他の尾分子は、スピン−ラベルの化合物、ＤＴＰＡキレート化剤、 燐脂質、ジーおよびトリニトロフェニル基、架橋試薬、たとえばアルキル剤、ア ジドベンゼン、ソラーレン、ヨードアセトアミド、アジドプロフラビンおよびア ジドウラシルを含む。

２、３．５．６−チトラフルオロフエニルトリフルオロアセテート（１８）無水 トリフルオロ酢酸（２８＋＋Ｌ、　０．２＋ｏｌ）を、２．３．５．６−チトラ フルオロフエノール（２７，１ｇ、　０．１６３ｍｍｏｌ）に撹拌しながら滴加 した。三フッ化硼素エーテル付加物（０，２ｍ１）を加え、混合物を一晩中加熱 還流した。残留溶液を常圧で蒸留し、無水トリフルオロ酢酸およびトリフルオロ 酢酸を除去した。所望の生成物（１８）（３２，２ｇ、　７５％収率）は、４５ ℃（１８ｍｍ）にて無色液体として捕集した。

ｄ＝１．５２ｇ／ｍＬ ＩＲ（ＣＨＣＩｇ）３０１０，１８１５，１５２５．１４８５，１２３５．１１ ８０．１１１０．９５５ｃｍ−’。

分析値（Ｃｓ　ＨＯ２Ｆ　Ｔとして） 計算値：Ｃ，３６，６６：Ｈ，０，３８；Ｆ、５０．７４゜実測値二Ｃ，３６， ３１；Ｈ，０，４３；Ｆ、５０．９５゜方で臆：　３−（９−アクリジニル）プ ロピオン酸（４００ｍｇ、　１．５９關０１）およびト１，１エチルアミン（０ ，２２ｍＬ）の塩化メチレン（２０ｍＬ）溶液に２−フルオロメチルピリジニウ ムトシレート（ＦＭＰＴ）（４９６ｍｇ、　１．７５ｍｍｏｌ）を加え、混合物 を室温で１５分間撹拌した。２．３．５．６−チトラフルオロフエノール（３１ ７ｍｇ。

１　、９１　ｍｍｏ］、）およびトリエチルアミン（０，２２ｒａＬ）を加えて から混合物を１５分間撹拌した。その不均一混合物を溶媒除去し、残留物を１： １ヘキサン、酢酸エチルを用いて、フラッシュクロマトグラフィー（２Ｘ２９Ｃ ｍンリヵ）により精製した。

純粋な生成物を含むフラクションを合わせ、蒸発乾固すると所望の生成物（１９ ０２５０ｍｇ、　３９％収率）が淡黄色固体として得られた。

融点１８３−１８５℃； ＴＬＣ（１・１ヘキサン・酢酸エチル）、　Ｒｆ＝　０．７０゜長波長紫外線（ ＵＶ）の下で青色蛍光 Ｉ　Ｒ（ＫＢｒ）　３０７５．１７９０．１５２０および１０９５ｃｍ＋−’　 ；’ＨＮＭＲ（ＣＤＣＬり　８．２９（ｄ、　４　Ｈ，Ｊ　＝８．０Ｈｚ）、　 ７．８２（ｔ、　２Ｈ，Ｊ＝７．２Ｈｚ＞、　７．６４（ｔ、　２Ｈ，Ｊ　＝８ ．６Ｈｚ）、　７．０４（ｍ、　ＩＨ）、　４．１３（ｔ、　２Ｈ。

Ｊ　＝８．７Ｈｚ）、　３．１６（ｔ、　２Ｈ，Ｊ　＝８．７Ｈｚ）。

分析値（ＣｕＨ＋５ＮＯＪ＜として） 計算値：　Ｃ，６６，１７：　Ｈ，３，２８：　Ｎ、３．５１；　Ｆ、１９．０ ３実測値・Ｃ，６６，０１；　Ｈ，３，１１；　Ｎ、３．３３；　Ｆ、、１９． １３゜方法ｂ：　３−（９−アクリジニル）プロピオン酸（２５１ｍｇ、　ｌ　 ｍｍｏｌ）の塩化メチレン（１０＋Ｌ）の撹拌スラリーにトリエチルアミン（２ ００μＬ、　１．４ｍｍｏｌ）およびＴＦＰ）リフルオロアセテート１８（２０ ０μＬ）を加えた。アルゴン下に２日間撹拌した後、その不均一混合物をセライ トを通して濾過、濾液を蒸発乾固した。

残留物を１・１ヘキサン：酢酸エチルを用いてフラッシュクロマトグラフィー（ ２ｘ２５ｃｍシリカ）によって精製した。生成物を含むフラクションを集め、蒸 発乾固した。残留物を塩化メチレンを用いてフラッシュクロマトグラフィー（２ ×２５ｃｍシリカ）により再精製した。純粋な生成物は５％酢酸エチル−塩化メ チレンで黄色帯として溶出した。純粋な生成物を含むフラクションを合せ、蒸発 乾固す実施例ＸＸ■ ２、３．５．６−チトラフルオロフエニル５−（９−アクリジニル）ペンタノニ ーで得られた。

融点１２２〜１２４℃ ＴＬＣ（１：１ヘキサン・酢酸エチル）、　Ｒｆ＝０．６３゜長波長ＵＶで青色 蛍光。

ＩＲ（ＫＢｒ）３０７５．２９６０．１７９０．１５１５．１１０５．９５５　 および７５０ｃｍ”＋ ’ＨＮＭＲ（ＣＤＣＬｓ）　８．２６　（ｄ、　４　Ｈ，Ｊ　＝９．２Ｈｚ）、 　７．９２（ｔ、　２Ｈ，Ｊ＝６．８Ｈｚ）、７．５８（ｔ、２Ｈ，Ｊ＝８．８ Ｈｚ）、７．００（ｍ、ＩＨ）、３．７１（ｔ、２Ｈ。

Ｊ＝７．８Ｈｚ）、２．７８（ｔ、２Ｈｊ＝６．４Ｈｚ）、２．０５（ｍ、４Ｈ ）。

分析値（Ｃ２４ＨＩ７ＮＯ２Ｆ４として）計算値：　Ｃ，６７，４５；　Ｈ，４ ，０１：　Ｎ、３．２８；　Ｆ、　１７．７８実測値：　Ｃ，６７，１８；　Ｈ ，３，８７：　Ｎ、３．０２；　Ｆ、１７．６７゜実施例ＸＸＴＶ １−ｒａ−ｃ９−アクリジニル）−１−オキソプロピル］−５−ヒドロキシメチ ル−（３Ｒ−トランス）−３−ピロリジノール（７）二崖ｙ・　アクリジンＴＦ Ｐエステル１９（２０６ωｇ、　０　、５２　ｍｍｏｌ）の塩化メチレン（８ｍ Ｌ）溶液を、アミノジオールｆｉ（０，５７ｍｍｏｌ）およびトリエチルアミン （８６μＬ）のエタノール（１，１４ｍＬ）水冷溶液に滴加した。混合物を室温 で１８時間撹拌し、濃縮した。残留物を５％メタノール塩化メチレンを用い、フ ラッシュクロマトグラフィーで精製して、所望の生成物″７（１８１ｍｇ、　１ ００％収率）が黄色泡状固体として得られた。

ＴＬＣ（９：１塩化メチレン：メタノール）、　Ｒｆ＝０．５０゜長波長ＵＶで 青色蛍光を発する黄色スポットＩＲ（ＫＢｒ）３４００（ｂｒ）、１６２０．１ ４４０および１０７０ｃ＋ａ−’；’ＨＮＭＲ（ＣＤＣＩｓ）　８．３０（ｄ、 　４Ｈ，Ｊ　＝９．４Ｈｚ）、　７．８２（ｔ、　２Ｈ，Ｊ＝６．６Ｈｚ）、　 ７．６２（ｍ、　２Ｈ）、　４．３１（ｍ、　２Ｈ）、　４．０５（ｔ、　２Ｈ ，Ｊ＝８．２Ｈｚ）。

３．７０（ｍ、ＬＨ）、３．５０（ｍ、２Ｈ）、３．２２（ｄ、２Ｈ，Ｊ＝１． ４Ｈｚ）、２．７８（ｍ。

２Ｈ）、２．０３（ｍ、ＩＨ）、１．６４（ｍ、ＬＨ）。

分析値（ＣＨＨ２ｚＮ２０．・０．５Ｈ２０として）計算値：　Ｃ，７０，１８ ：　Ｈ，６，４５＋　Ｎ、７．７９実測値：　Ｃ，７０，４１；　Ｈ，６，４５ ＋　Ｎ、７．６８゜ＵＶ（ｐＨ７，２）　λｍａｘ＝２５２ｎｍ（ε１０１，０ ００）、２６０ｎｍ（ε６４００）。

３５６ｎｍ（ε６２００）。

蛍光（ｐＨ７，２）３５５止で励起、４６０止で発光実施例ＸＸｖ １−［５−（９−アクリジニル）−１−オキソペンチル〕−５−ヒドロキシンチ ル色泡状固体として得られた。

ＴＬＣ（４５：４５：１０ヘキサン：酢酸エチルメタノール）、Ｒｆ＝０．１４ 長波長ＵＶで青色蛍光を発する黄色スポット。

ＩＲ（ＣＨＣＩｓ）３３５０（ｂｒ）、３０１０．２９３０．１６１０および１ ４３５ｃｒ’； ’ＨＮＭＲ（ＣＤＣ１３）　８．２２（ｄ、　４Ｈ，Ｊ　＝９．０Ｈｚ）、　７ ．７７（ｔ、　２Ｈ，Ｊ　＝６、６Ｈｚ）、　７．５６（ｔ、　２Ｈ，Ｊ＝７． ８Ｈｚ）、　４．２７（ｍ、　２Ｈ）、　３．７−３．４（ｍ、　６Ｈ）、２． ３　１．６（ｍ、１０Ｈ）。

分析値（ＣｚｓＨｚｓＮ２０ｓ・０．７５Ｈ２０として）計算値・Ｃ，７０，４ ８：　Ｈ，７，０７＋　Ｎ、７．１５実測値：　Ｃ，７０，３３；　Ｈ，６，８ ９；　Ｎ、７．１５゜実施例ＸＸＶ１ １−［５−（９−アクリジニル）−１−オキソペンチルコ−５−［ビス（４−メ トキンフェニル）フェニルメトキシコメチル−（３Ｒ−トランス）−ピロリジノ ール（２３１５ｇ、　０．２７２ｍｍｏｌ）から２２（７８ｍｇ、　４２％収率 ）が淡黄色泡状固体として得られた。

ＴＬＣ（４５：４５：１０ヘキサン、酢酸エチル、メタノール）、Ｒｆ＝０．４ １青色蛍光を発する黄色スポットで、１０％硫酸／メタノールでスプレーすると 橙色に着色した。

ＩＲ（ＫＢｒ）３３５０（ｂｒ）、２９３０．１６１０．１５１０および１２５ ０ｃｍ−’：　’ＨＮＭＲ（ＣＤＣＩｓ）　８．２４（ｄ、　４Ｈ，Ｊ　＝８． ８Ｈｚ）、　７．７６（ｍ、　２Ｈ）。

７、５３（ｍ、　２Ｈ）、　７．３５−７．１０（ｍ、　９Ｈ）、　６．７９（ ｍ、　４Ｈ）、　４．７−４．３（ｍ。

２Ｈ）、　４．０８（ｍ、　ＩＨ）、　３．９−３．３（ｍ、　１１Ｈ）、　３ ．１０（ｍ、　２Ｈ）、　２．３３２−１７１（，６Ｈ）。

Ｄ　ＭＴｒ充填度が２０６μｍｏｌ／Ｈの２３が得られた。

実施例ＸＸ■ ＣＰＧ支持体６．１０および２３を用いる３゛−尾分子付オリゴヌクレオチド（ ２４〜２６）の直接合成 肝炎８表面抗原蛋白質（５°−ＴＣＣＡＴＧＴＴＣＧＴ）に対応するｍＲＮＡの 開始コドン領域に相補的な配列を有する３°−尾分子付オリゴヌクレオチドをＣ Ｐ−尾分子（ｔａｉｌｅｄ）ＯＤＮはアンチセンスオリゴヌクレオチドとして有 利に使用することができる。

配列５°−ＴＣＣＡＴＧＴＴＣＧＴを有する３°−尾分子付オリゴヌクレオチド ６−アミノヘキサンー１−オール（１１，７ｇ、　１０ｍｍｏｌ）および無水１ ．２．４−ベンゼントリカルボン酸（７，６８ｇ、　４ｍｍｏｌ）の混合物を１ ５分間または水蒸気の発生が止むまで１７５〜２２５℃に加熱した。溶融物を水 にあけると白色結晶性固体を与えた。この固体を減圧濾過して捕集し、−夜真空 （減圧）乾燥すると分析純度１７）２ヱ（９，１ｇ、　７８％）が得られた。

融点１２７〜１３５℃ ’ＨＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄｓ）：　６８．３４４（ＩＨ，ｄ、Ｈ−７［６］）： 　８．２０８（ＬＨ，ｓ、Ｈ−４）＋　７．９６７（ＩＨ，ｄ、Ｈ−６［７］） ；　３．５７８（２Ｈ，ｔ、Ｈ−１’［６°］；　３．３６５（２Ｈ，ｔ、Ｈ− ６°［１’］）：　１．７　１．２（８Ｈ１ｍ、Ｈ−２°、３°、　４’、　５ ′）。

分析値（Ｃ＋　ｓ　Ｈ１７Ｎ　＋　Ｏｓとして）計算値：　Ｃ，６１，８５：　 Ｈ，５，８８；　Ｎ、４．８１：実測値：　Ｃ，６１，５６；　Ｈ，６，１２： 　Ｎ、４．９８゜スヱ（２，９１ｇ、　１０ｍｍｏｌ）をピリジン＜５０ｍＬ） およびトリエチルアミン（１９ｍＬ）に溶かした溶液にジメトキントリチルクロ リド（７，１１ｇ、　２０ｍｍｏｌ）および４−ジメチルアミノピリジン（６３ １１ｇ）を加えた。混合溶液を一夜撹拌した後蒸発乾固した。残留物を塩化メチ レン（１００ｍＬ）に溶かし、得られた溶液を水冷した１Ｍクエン酸（１００ｍ Ｌ）次いで水（１０ＱｍＬ）で洗浄してから硫酸ナトリウムで乾燥し、溶媒を留 去した。得られた硬質のシロップ呈ユを再度精製することなく使用した。

を氷水浴で冷却後、ｐ−ニトロフェニルクロロホルメートを加え、４℃で５時間 撹拌した。４−ジメチルアミノピリジンを冷却溶液に加えて後、その溶液を室温 で上昇させた。室温で一夜撹拌後、溶液を繰返し飽和炭酸水素ナトリウム液（５ ｘ　１０ａ＋Ｌ）次いで水冷１Ｍクエン酸で１回抽出した。有機層を硫酸ナトリ ウムで乾燥し、蒸発乾固した。残留物を、溶出剤としてトルエン−酢酸エチル（ ５：１）を用い、シリカゲルカラム（２９Ｘ１５０ｍ＋ａ）でフラッシュクロマ トグラフィーにかけた。純粋な物質を含むフラクションを溜め、蒸発乾固すると 分析純度の旦（１，７ｇ、６０％）が得られた。

分析値（Ｃ４□ＨｓａＮ２０．として）計算値：　Ｃ，７０５８；　Ｈ，５，３ ６；　Ｎ、３．９２；実測値・Ｃ，７０，５７；　Ｈ，５，２２：　Ｎ、３．８ ４゜ｄ、３′−アミンＣＰＧ支持体（ＡＨ−ＣＰＧＸ３０）長鎖アルキルアミン ＣＰＧを３％ジクロロ酢酸−塩化メチレンで活性化した。

その活性ＣＰＧ（Ｉｇ）を２９（１４３＋ｏｇ、　０．２ｍｍｏｌ）をピリジン （１０ＩＩＬ）とトリエチルアミン（１ｍＬ）の溶液で処理し、反応混合物をゆ るやかに２４時間かきまぜた。残存するアミンを無水酢酸（０，５ｍＬ）を処理 し、ゆるやかに２４時間かきまぜることによってキャップした。そのＣＰＧを濾 過し、ピリジン（ＩＸ５ｍＬ）次いでアセトニトリル（３Ｘ５ｍＬ）で洗浄して から風乾した。得られたＡＨ−ＣＰＧ３０を室温で２日間真空乾燥した。過塩素 酸との処理によるＡＨ−ＣＰＧの分析は充填度２０１１　ｍｍｏｌ／ｇを示した 。そのＡＨ−ＣＰＧ支持体（５０ｍｇ、１μｍｏｌ）を標準の１μｍｏ１合成機 カラムに充填した。

実施例ＸＸＸ アミン−修飾オリゴヌクレオチド（３２，３３）の合成○ＤＮは、標準のβ−シ ンアノエチルホスホルアミダイトカップリング化学Ａｔｋｉｎｓｏｎ　＆　Ｓ　 ｗｉｔｈ、上記）を駆使し、１マイクロモル規模で、二つの異なるＣＰＧ支持体 から製造した。実施例ＸＸ■で上述したように製造したＡＨ−ＣＰＧ３旦は３２ を合成するのに用いた。Ｃ１ｏｎ　Ｔｅｃｈ　Ｌａｂ、　Ｉｎｃ（ｐａｌｏ　Ａ ｌｔｏ、　ＣＡ）旦は製造業者により供給したプロトコールと共にＭｉｌｌｉｇ ｅｎ　７５００またはＡ　ｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ　Ｍｏｄｅｌ　 ３８０Ｂのいずれかを用いて製造した。アンモニアによる脱保護後、トリチル化 したＯＤＮを、そのアンモニア溶液をＨａｍｉｌｔｏｎＰＲＰ−１カラム（３０ ５Ｘ　７．０ｉｎ）に直接注入によりＨＰＬＣ精製し、アミン修飾ＯＤＮ生成物 旦または３３を２０〜４５％アセトニトリル−０，１Ｍ　ＴＥＡＡ（ｐＨ７，５ ）（−次グラジエント）を用いて２０分（流出速度＝４＋ａＬ／分）で溶出した 。適当なフラクションを合わせ、５ａｖａｎｔ　５ｐｅｅｄ−ｖａｃ、で濃縮乾 固した。

残留物を８０％酢酸（５００μＬ、２８℃、７０分）で脱トリチル化し、３Ｍ酢 酸ナトリウム（１００μＬ）と１−ブタノール（４ｍＬ）で沈澱し、遠心分離し 、エタノール（１＋＊Ｌ）で洗浄し、遠心分離し、蒸発乾固し、滅菌蒸留水（１ ｍＬ）で再構成した。○ＤＮ３２または１旦の濃度は２６０ｎｍのＵＶ吸収から 決定した。すべての○ＤＮ濃度はｐＨ７，２ＰＢＳ（９，２ｍＭ燐酸ジナトリウ ム、０．８ｍＭ燐酸モノナトリウム、０．１３１Ｍ食塩）中で測定した。各ＯＤ Ｎの吸光係数は最も近いモデル（Ｃ，Ｒ，Ｃａｎｔｏｒら、Ｂ　ｉｏｐｏｌｙｍ ｅｒｓ　旦、１０５９（１９７０））を用いて決定され、ＡＮＯの理論的濃度（ μｇ／ａＬ）比を計算するのに用いられた。精製した○ＤＮ３２または旦は５〜 ４５％アセトニトリル−ＴＥＡＡ（−次グラジエント）を用いてＤｙａｍａｘ　 Ｃ−１８カラムでＨＰＬＣ（流出速度＝１ｍＬ／分）１；より分析した。ＯＤＮ 純度は変性ＰＡＧＥ分析によって確かめられた。

実施例ＸＸＸｌ ３−アクリジン−尾分子付０ＤＮ（３２ａ）の合成分析用Ｃ−１８ＨＰＬＣによ り分析した３゛−アミン−尾分子付○ＤＮ３２１ｔ１本のピークを示し、ＰＡＧ Ｅは唯一本の帯を示した。単離した３′−アミン−修飾ＯＤＮ　３２　［１００ μｇ（２９μｍｏ１）］を水（１００μＬ）および１．０Ｍ硼酸塩緩衝液（５０ ａＭ、ｐＨ８，３）に溶かした。新しく製造したアクリジンＴＦＰエステル１９ の１．１　Ｍ−ピロール：アセトニトリルの５．０ｍｇ／ｍＬ溶液（２２０，ｃ ｚＬ。

１、１ｍｇ、　３．０μ＋１１０１）を加え、その不均一混合物を室温で振とう した。反応の進行をＨＰＬＣでモニターした。アミン−尾分子付○ＤＮ３２とア クリジンＴＦＰエステル１９との反応は１時間以内に完結した。１旦分の生成物 を１４分の不純物からより容易に分離するために、粗製の反応混合物を、水（１ ，５ｍＬ）を加え、３０００ＭＷで切断の限外濾過膜（Ｃｅｎｔｒｉｃｏｎ　− ３ミクロ濃縮機：、八ｍ１ｃｏｎ）を通して量終容量〜１００μＬまで遠心分離 することによって予め精製した。この溶液を、５％〜４５％アセトニトリル−０ ，１Ｍ　ＴＥＡＡ（−次グラジエント）を用し＼、２０分（流出速度＝１ｍＬ／ 分）間にＤｙａｎａｍａｘ　Ｃ−１８カラム（０，７５Ｘ　２５ｃｍ）でＨＰＬ Ｃにかけて精製した。生成物を一つのフラクションに集めＳ　ｐｅｅｄ　−Ｖ　 ａｃで濃縮した。残留物に無菌蒸留水（１００μＬ）を加え、再生して力）らア ク１ノジンー修飾０ＤＮ３２ａの濃度をＡ２６゜測定からめた。２９μｍｏｌに 対する理言自収量（ま１０８μｇで、実際の収量は３９μｇであった。そのＯＤ Ｎ生成物３２ａの純度１まＨＰＬＣおよびＰ　Ａ　Ｇ　Ｅによって定量した。

精製を５ｅｐｈａｄｅｘ　（商標名）Ｇ−２５（ＮＡＰ−２５カラム、　ｐｈａ ｒＩＩｌａｃｉａ、　Ｐ　１ｓｃａｔａｖａｙ、　Ｎ　Ｊ　）含有の予め充填し たカラムを通し、ゲル濾過によって達成した。水（２５ｍＬ）でカラムを平衡に 戻してから、粗製混合物を適用し、アクリジン−修飾○ＤＮを水（０，５ｍＬフ ラクション）で溶出した。純粋な生成物（Ｃ−１８ＨＰＬＣによって明らかなよ うに）を含むフラクションを合わせ、Ｓ　ｐｅｅｄ　−Ｖ　ａｃで濃縮した。淡 黄色固体残漬３λＡを水（２００μＬ）で再生し、２６０止のＵＶ光で分析した 。濃度は１０８μｇ／　２００μＬと測定した。理論収Ｉは１０８μｇである。

実施例ＸＸＸ［で上に記載したと同じ反応条件を用い、ＨＰＬＣ精製の３°−ア ミン−尾分子付○ＤＮ３３をｐＨ８，３硼酸緩衝液中アクリジンＴＦＰエステル （１９または２０）で処理した。数時間振とう後に、ＨＰＬＣ分析は、約７０％ の３゜−アミン尾分子付０ＤＮ３３が未反応で残存していることを示した。粗製 反応混合物のＰＡＧＡ分析はもっとも可動性の低い帯だけが完全に反応したこと を示した。１９をさらに硼酸緩衝液で処理しても反応の程度は増さなかった。２ ２時間後の混合物を濃縮し、低分子量の不純物を３．ＯＯＯＭＷカットオフ限外 濾過膜を通して、遠心分離によって除去した。貯留物をＣ−１８ＨＰＬＣで精製 し、濃縮すると０ＤＮ３３ａまたは３３ｂがＣ−１８ＨＰＬＣ＋ニーよれば単一 ピークとして、ＰＡＧＥによれば単一バンドとして得られた。

表１は修飾および未修飾のオリゴヌクレオチド５゛−丁ＣＣＡＴＧＴＴＣＧＴの 性質を示す。

表１．オリゴデオキシヌクレオチドの性質０ＤＮ（ａ）　ＭＷ　、Ａｚａｏ＝１ （ｂ）　収率％（ｃ）ＨＰＬＣ，ＰＡＧＥ、Ｔｍ（Ｄ８２０単位０ＤＮ（標的） （’１配列ハ５′−Ｇ　Ｔ　Ｇ　Ａ　ＣＧ　Ａ　Ａ　ＣＡＴ　Ｇ　Ｇ　Ａ　Ｇ　 ＡＡＣＡＴ、１１単位○ＤＮ（コントロール）は５’−ＴＣＣＡＴＧＴＴＣＧＴ ０ ｂ２６０ｎｍで１．００吸収単位が得られるＯＤＮの濃度の計算値ＣＣＰＧ１μ ｍｏ１から単離のＯＤＮの％収率、３２ａ、３３ａおよび３１士の収率は出発ア ミン尾分子付ＯＤＮのμｍｏｌに基づく。

ｄ　Ｃ−１８８ＰＬＣにより精製　ｅゲル濾過により精製ｆ溶出時間；　Ｆ　ｉ ｇ　１に記載のＨＰＬＣ系ｇ３５〜８０％アでトニトリル（３０分）のグラジェ ントを用し）たｋｌＲｍはブロモフェノールブルーに対する移動距離の相対比ｌ 主生成物のＲｍを掲載 ｊＴｗはＡ２６１１対温度の最大勾配の中点の温度工程■は０ＤＮ２５．２６． ３２ａ、　３３ａ、　３３ｂに組み入れられる３′−アク１ノジン尾分子の構造 を示す。ＡＨ−ＣＰＧはアミン−〇ＮＣＰＧで得られた収率（二比し、３°−ア クリジン−尾分子付○ＤＮの改善した収率を得られた。

内部的アミン修飾は、Ｋ、　Ｊ　、　Ｇ　１ｂｓｏｎおよびＳ　、　Ｊ　、　Ｂ 　ｅｎｋｏｖｉｃ、　（Ｎ　ｕｃｌ、Ａｃ１ｄ。

Ｒｅｓ、１５．６４５５（１９８７））によッテ記載したように、５−フタルイ ミドプロピル−２゛−チオキシウリジンの５’−ＤＭＴｒ−３’−０−シアノエ チルジイソブロピルホスホルアミダイト誘導体と共に、実施例ＸＸＸ＋二記述し ｔニプロトコールによって導入した。要約すれば、０ＤＮ５−ＴＣＣＡＴＧＴＴ ＣＧＴを、以下に示したように、ａ、　ｂ、およびまたはＣで内部的に修飾した 。

位置ａ　（３４）　、位置ａ十ｂ（３：＋’）または位置ａ−＋ｃ　（３６）　 ｌこおし）でアミン修飾によって三つの異なるＯＤＮを製造した。

実施例ＸＸＸｒＶ 内部的修飾アクリジン０ＤＮ（３４ａ、３４ｂ、３５ａ、３５ｂ、３６ａ、３６ ｂ）の合成内部的にアミン−修飾の０ＤＮ３４．３５．３６を、実施例ＸＸ′Ａ １に記載した方法に従って、アクリジンＴＦＰエステル１旦と反応させて夫々Ｏ ＤＮ生成物３まａ、３５ａおよび３βＡを竺成し、またはアクリジンＴＦＰエス テル旦旦と反応させて夫々ＯＤＮ生成物３４ｂ、３５ｂおよび３６ｂを生成した 。

３゛−尾分子の結合親和性への影響をしらべるために、上記の種々の３′−修飾 ○ＤＮを用い、Ｔｍ実験を行った。熱解離曲線は選択した３゛−尾分子付ＯＤＮ と適当な相補的な未修飾２０単位○ＤＮ標的（５”−ＧＴＧＡＣＧＡＡＣＡＴＧ ＧＡＧ　Ａ　Ａ　ＣＡ　Ｔ　）の等モル量を含む水溶液のＡ２６゜の変化を追跡 することによって得られる。２ＯＪ位ＯＤＮ標的はヌクレオチドの突出部分を与 え、これがＯＤ　Ｎの３°−修飾との相互作用に影響しつる。かかる相互作用は 、実際の生体標的において同様に重要となろう。これらの実験に対しては、標的 はＤＮＡであって、類似の生体標的であるＲＮ、Ａではなかった。アクリジンを 、標釣鐘でのハイブリッド形成によるミニ二本鎖の塩基対の間においてここで効 率的に挿入するならば、アクリジン−修飾のＯＤＮ標的２本鎖のＴｍを増大させ ることができる。未修飾の１１単位ＯＤＮを各Ｔｍ研究にコントロールとして使 用した。

ＯＤＮをｐＨ７，２ＰＢＳの２ｕＭ溶液として製造した。Ｇ１１ｆｏｒｄ２５２ ７サーモプログラマーを備えたＧ１１ｆｏｒｄ　Ｓｙｓｔｅｍ２６００ＵＶ−Ｖ ＩＳ分光光度計を使用した。温度制御クヴニット（ｃｕｖｅｔｔｅ）を用い、０ ．５℃／分の温度上昇をはかりながら、試料を１５℃から８５℃まで加熱した。

Ｔｍは極限の誘導体を用いて測定した。複製実験では０５℃以内てＴαＳを与え た。一つの代表的な実験データを実施例ｘｘｘｎ中の表Ｉに掲げられている。

未修飾ＯＤＮと比べて、３゛−コレステロール−尾分子付０ＤＮ２４−の溶融温 度に著しい増大を観察したが、これは先に報告（Ｒ，Ｌ、　Ｌｅｔｓｉｎｇｅｎ らＰｒｏｃ、　Ｎａｔｌ。

、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ　８旦、６５．５３（１９８９））した３′−コレ ステロール−尾分子付ＯＤＮの類似研究とは著しく違っていた。本明細書に記載 のＴｍ研究では、相補的標的の突出部分は、標的核酸と親油性尾分子との相互作 用同様に、Ｔｍに影響を及ぼしつる。

はんの小さな増大を生じたに過ぎなかった。これらのデータは、結合手の強さ、 立体化学の信頼性、および／または配列に依存のインターカレーション効果がＴ ｍに影響を及ぼしうることを示唆する。

表■　内部的修飾のアクリジン−ＯＤＮのＴｍデータ標的配列＋３’　−ＴＡＣ ＡＡＧ　ＡＧＧ　ＴＡＣＡＡＧ　ＣＡＧ　ＴＧ　−５’Ｕの位置　ａ　ｂｃ ７ンｎノス１ｌｌＡ位：　５°−ＴＣＣＡＵＧ　ＴＪＵＣＧＴ　−３’Ｕ＝５− アミノプロピル−２゛−チオキシウリジン表■は、未修飾のＯＤＮと内部的修飾 ０ＤＮ（１および２個所の双方の内部的修飾）で得られたＴｍデータを提供する 。未修飾および内部的修飾のＯＤＮの丁ｍをめ、未修飾ＯＤＮＴｍと各内部的修 飾のＯＤＮに対するＴｌ１１の間の差を計算した（ΔＴｍ（℃））。計算したＴ ｍの差は−２，１℃〜＋１０，７℃に及んだ。５−炭素の結合手の長さは大きな Ｔｍ増大を生じた（すなわち、３４ｂ、３５ｂ、３６±）が、かかる大きなＴｍ の増加は容易には予測しがたい。二番目のインターカレーティングアクリジン基 の包含はＴｍ増大に付加的効果を生じた。これらのデータは、結合手の長さ、配 列に依存するインターカレーション効果および／またはアミド結合の水素結合（ アクリジンＴＦＰエステルとのアミン修飾反応を通じて生じたもの）がＴｍに影 響を及ぼしうることが示された。

ＤＭＴｒ−ｃｌ（３，３８ｇ、　１０ｍｍｏｌ）およびジインプロピルエチルア ミン（３，４５ｍＬ、　２０ｍｍｏｌ）の乾燥ピリジン（５０ｍＬ）中の溶液に １．６−ヘキサンジオール（５゜９１　ｇ、　５０ｍｍｏｌ）を加えた。４時間 撹拌後、５％炭酸水素ナトリウム（８，５ｍＬ）を加え反応を止め、混合物を塩 化メチレン（２Ｘ１００ｍＬ）で抽出した。有機層を水（２Ｘ１００ｍＬ）、次 いで食塩水（１００ｍＬ）で洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥、濾過し、濃縮した 。残留物を塩化メチレンを用いて、フラッシニクロマトグラフィ−（３，５Ｘ　 １７ｃｓシリカ）により精製した。純粋な生成物を含むフラクションを合わせ、 濃縮すると３７（１，４０ｇ）が黄色シロップとして得られた。

ＴＬＣ（９５：５塩化メチレン：メタノール）、　Ｒｆ＝０．４０゜黄色スポッ ト：これは１０％硫酸−メタノールでスプレーすると橙色に変化した。

’ＨＮＭＲ（ＣＤＣＩｓ）　７．５−７．１（ｍ、　９Ｈ）、　６．８１（ｍ、 　４Ｈ）、　３．８０（ｓ。

３Ｈ）、　３．７７（ｓ、　３Ｈ）、　３．６４（ｑ、　２Ｈ１Ｊ　＝６．６Ｈ ｚ）、　３．０２（ｑ、　２Ｈ，Ｊ＝６゜０Ｈｚ）、　１．７−１．２（ｍ、　 ８Ｈ）。

分析値（Ｃ２ｙＨｓｚ○４・０．７Ｈ２０として）計算値：　Ｃ，７４，８７； 　Ｈ，７，７７実測値：　Ｃ，７４，６１：　Ｈ，７，３６゜液に無水コハク酸 （３８０ｍｇ、　３．８０ｍｍｏｌ）およびＤＭＡＰ（７６ｍｇ）を加えた。混 合物をアルゴン下に２３時間撹拌し、蒸発乾固した。残余のピリジンをトルエン で共沸蒸留した。残留物をクロロホルム（３０ｍＬ）に溶かし、食塩水で洗浄し 、硫酸ナトリウムで乾燥し、濃縮すると、定量的収量のコハク酸エステルが黄色 泡状固体として得られた。

ＴＬＣ（９，５：５塩化メチレン：メタノール）、Ｒｆ＝０．１９゜生成物は黄 色スポットとして現れ、１０％硫酸−メタノールでスプレーすると橙色に着色し た。

粗製のスクンニル化誘導体（１０４＋＋＋ｇ、　０．２００ｍｍｏｌ）に酸洗浄 したＬＣＡＡ−ＣＰＧ（１，０ｇ）、乾燥ピリジン（１０＋ａＬ）、トリエチル アミン（０，０８０ｍＬ）、ＥＤＣ（３８０ｍｇ、　２．０ｍｍｏｌ）およびＤ Ｍ、ＡＰ（１２ｍｇ）を加え、混合物とアルゴン下に４６時間撹拌した。そのＣ ＰＧを濾過し、ピリジン、メタノール、クロロホルムおよびエーテルで洗浄し、 次いで真空乾燥した。ＣＰＧ上の残余のアミン基を、その支持体を乾燥ピリジン （３，５ｍＬ）と無水酢酸（０，４６ｍＬ）中で撹拌することによってキャップ した。３時間後、そのＣＰＧを濾過し、メタノール、クロロホルムおよびエーテ ルで洗浄し、次いで真空乾燥すると生成物３８（１，０ｇ）が得られた。このＣ ＰＧは、ＤＭＴｒ含量について分析したところ、２６．２μｍｏｌ／ｇの充填度 をもつことが分かった。

ＤＮ合成カラム（Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ｂ１５ｎｅｔｅｃｓ、Ｉｎｃ、）に充填し た。ノでラメシウム（Ｐａｒａｍｅｃｉｕｍ）のカルモジュリンｍＲＮＡの開始 コドン領域（−１２〜＋１２）に相補的な配列を有する２４単位（５’ＴＡＡＴ ＴＡＴＴＣＡＧＣＣＡＴＴＴＡＴＴＡＧＴＴ）を、ヘキサノール−ＣＰＧ３８、 標虐のホスホルアミダイト化学を駆使したＡＢ１３８０ＢＤＮＡ合成機、および 製造業者によって供給しこプロトコールを用いて製造した。５’−ＤＭＴｒ保護 基は除去しなかった。ＯＤＮを支持体から切り離し、次いで３０％アンモニア水 （２ｍｌ）で４０〜４４℃にて２４時間処理して脱保護した。その上澄液を直接 、ＰＲＰ−１逆相ＨＰＬＣカラム（３０５Ｘ　７．０ｍｍ）に注入し、２０〜４ ５％アセトニトリル１０．ＬＭ　ＴＥ、Ａ、Ａ（ｐＨ７，５８−次グラジエント ）を用い２０分間流出速度１ｍＬ／分で溶出した。生成物を１つのフラクション に集め、５ｐｅｅｄ−Ｖａｃで濃縮すると５’−ＤＭＴｒで保護した生成物を得 た。ＤＭＴｒ基を８０％酢酸（３００μＬ）で２８℃にて８０分処理して除去し 、２．４Ｍ塩化ナトリウム（１００μＬ）と１−ブタノール（４ｍＬ）で３°− へキサノール−尾分子付ＯＤＮを析出させた。混合物を遠心分離し、エタノール （１ｍＬ）で洗浄し、さらに遠心分離し、蒸発乾固した。残留する白色固体を無 菌蒸留水（１ｍＬ）で再生し、０．２μｍフィルターで濾過した。０ＤＮ３９の 濃度は、２６０止のＵＶ吸収から定量したように、３．７５ｍｇ／ｍＬであった 。１μｍｏｌに対する理論収量は７．４９ｍｇである。精製した０ＤＮ３９を、 ５〜４５％アセトニトリル／ＴＥＡＡ（−次グラジエント）を用い、２０分間（ 流出速度＝１ｍＬ／ｗｉｎ）溶出しながら、ＤｙｎａｍａｘＣ−１８カラム（０ ，７５ｘ　２５ｃｍ）でＨＰＬＣにかけ分析した。一本の主要なピークは９．９ 分（９５％以上の純度）で溶出した。

０ＤＮ３９純度はＰＡＧＥ変性分析によって確認した（１バンド）。

実施例ＸＸＸ■ ヘキサノール−尾分子付０ＤＮ３９の生物学的作用バラメジウム・テトラウリア （ｐａｒａ＋ｎｅｃｉｕｍ　ｔｅｔｒａｕｒｅｌｉａ）の遊泳挙動が、注入した ０ＤＮ３９のアンチセンス効果を研究するための生物学的モデル系として使われ て来た。バラメジウム・テトラウリア（ｐａｒａｍｅｃｉｕｍ　ｔｅｔｒａｕｒ ｅｌｉａ）の遊泳挙動は、細胞膜の中の一連のイオンチャンネル（電圧依存性の Ｃａ２＋およびに＋チャンネル並びにＣａ”十依存性のＮａ＋およびに十チャン ネル）の作用によって制御される。これらのイオンチャンネルは連動して働き、 繊毛運動が逆転をもたらす活動電位を生ずる。かかる逆転はバラメジウム・テト ラウリアのうしろ向きの遊泳をひきおこす。調節蛋白質、カルモジュリンはバラ メジウム・テトラウリアにおける膜電位と遊泳挙動の制御に中枢的な役割を演じ ている。

３゛−へキサノール−尾分子アンチセンス○ＤＮ３９はバラメジウム・テトラウ リアにおけるカルモジュリン遺伝子の発現を抑制するのに用いられた。このアン チセンス０ＤＮ３９を細胞質（細胞の原形質）にマイクロシリンジで注入し、細 胞の挙動を時間を追ってモニターした。Ｎａ十チャンネルの機能を試験する溶液 中にインキュベートすることによってその注入した細胞を分析した。野性株の細 胞はかかる溶液中では約１５秒間後方遊泳する；　アンチセンス０ＤＮ３９を注 入した個々の細胞は、非常に低下した挙動の応答を示した。１５〜２０時間後、 注入した細胞の後方遊泳時間は約２秒間の極小値に低下したく図１）。時間０で ０ＤＮ３９をミクロ注入した細胞にその後、１５時間の後カルモジュリンを注入 した時に、正ＩＥな後方遊泳挙動が回復した。ランダムまたはセンスのいずれか の配列を示した２４４１位−３°−へキサノール−尾分子付ＯＤＮを注入すると 後方遊泳に何ら変化を生じなかった（図２）。

３゛−へモサノールー尾分子カルモジュリンアンチセンス○ＤＮ３９は０４２ｍ ｇ／ｍＬ（５６μＭ）程度の低い濃度でも有効であった（図３）。反対に、３゛ −修飾をもたないカルモンユリンアンチセンスＯＤＮは６．１ｍｇ１０ＩＬ（８ ３５ｇＭ）の高い濃度でも効果を示さなかった。このように、３゛−尾分子アン チセンスＯＤＮ旦は、類似の未修飾ＯＤＮよりも少なくとも１５倍も大きい効力 （力価）を示した。この効力の増大は３゛−エキソヌクレアーゼ分解に対し３′ −尾分子付ｏＤＮの改善した安定性に起因する。注入容積１０ｐＬおよびバラメ ジウム・テトラウリア容積２００ｐＬと仮定すれば、観察し得る生物学的効果に 対する○ＤＮ３９の最小細胞質濃度は２８μＭと算出された。

以上、発明の好ましい実施例について説明したが、これは説明の目的のみで記載 したもので、他の具体例、変形例、改良例などは当業者には明白である。本発明 は、好ましい実施例に限定されるものでなく、以下の請求の範囲に示されるもの である。

工程　エ 方正」二 工程■ 工程Ｖ 工程　ＶＩ　（ａ）　溶融、　１７５−２２５　℃；　（ｂ）　ピリジン、Ｅｔ ３Ｎ。

ＤＭＴｒＣｌ；　（Ｃ）　１：　ｐ−ニトロフェニルクロロホーメート、Ｅｔ３ Ｎ、ＣＨ２Ｃｌ２．　２：　ＤＭＡＰ；　（ｅ）　ｌ：　ピリジン、　Ｅｔ３Ｎ ；　２：Ａｃ２０゜ 工程　■：　へキサノール−ＣＰＧの合成工程■：　３′修飾体の構造 注入後の経過時間　（時） −４−＋　ＣａＭ　−＊−−ＣａＭ　−６−コントロールＦ／Ｇ、ｌ 注入後の経過時間　（時） ロアンチτンスク２センス　区３ランダムＦＩＧ、２゜ アンチセンス　オリゴヌクレオチド ［オリゴヌクレオチド］　ｍｇ／ｍ１ ＦＩＧ、３゜ 閑ＴＨ！ｌ査報告 ｈ＋ａ＋−−Ａｍａｋｅｓ　ＩＩｓ、Ｋ丁／ＬＩＳ９１１０６１４３フロントペ ージの続き （８１）指定国　ＥＰ（ＡＴ、ＢＥ、ＣＨ，ＤＥ。

ＤＫ、ＥＳ、ＦＲ，ＧＢ、ＧＲ，ＩＴ、ＬＵ、ＮＬ、ＳＥ）、ＪＰ （７２）発明者　メイヤー、リッチ・ビイ・ジュニアアメリカ合衆国、９８０７ ２ワシントン州、ウッドインヴイル、エヌイー・ワンハンドレッドアンドセブン ティシックスス・ブレイス、１５４１１番 （７２）発明者　ピートリー、チャールズ・アールアメリカ合衆国、９８０７２ ワシントン州、ウッドインヴイル、エヌイー・ワンハンドレッドアンドナインテ ィシックスス・ブレイス、１８４５９番 （７２）発明者　ターポン、ジョン・シーアメリカ合衆国、９８０１１ワシント ン州、ボゼル、エヌイー・ワンハンドレッドアンドシックスティシックスス・ブ レイス、 １２１１７番

Claims (13)

【特許請求の範囲】
1. １．連結分子を介してその３′末端に連結した低分子量の尾を有するオリゴヌク レオチドを合成するにあたり、 （ａ）連結分子として、３つの独立した官能基（ただし、１つの官能基の化学的 反応性は他の２つの官能基の反応性とは異なる。）を有する連結分子を選択し、 （ｂ）連結分子の第１官能基を低分子量の尾分子と反応させて、当該連結分子と 当該尾分子を結合させ、 （ｃ）結合尾分子を有する上記連結分子の第２官能基を固相支持体と反応させて 、当該連結分子と当該固相支持体を結合させ、（ｄ）第１の３′ホスホロアミダ イト・ヌクレオチドの３′末端を上記連結分子の第３官能基と反応させて、当該 第１ヌクレオチドをその３′末端を介して当該連結分子に結合させ（かかる第１ ヌクレオチドの連結分子への結合は、当該第１ヌクレオチドを当該連結分子を介 して尾分子に連結させるとともに、当該第１ヌクレオチドを当該連結分子を介し て固相支持体に連結させるものである。）、（ｅ）さらに、付加的な３′ホスホ ロアミダイト・ヌクレオチドを、先行するヌクレオチドの５′末端と連続的に反 応させて、オリゴヌクレオチドの３′末端において連結分子に結合した合成オリ ゴヌクレオチドを形成し（かかる合成オリゴヌクレオチドのその３′末端におけ る連結分子への結合は、当該オリゴヌクレオチドを当該連結分子を介して当該オ リゴヌクレオチド３′末端における尾分子に連結させるとともに、当該オリゴヌ クレオチドを固相支持体に、当該付加的なヌクレオチドの連続反応の間に連結さ せるものである。）、（ｆ）連結分子を介してその３′末端に連結した尾分子を 有するオリゴヌクレオチドを固相支持体から、当該連結分子の第２官能基と当該 固相支持体の間の連結の開裂によって分離させ、次いで （ｇ）連結分子を介してその３′末端に連結した尾分子を有するオリゴヌクレオ チドを単離する ことを特徴とする方法。
2. ２．連結分子の官能基が第一級アルコール、第二級アルコールおよびアミンであ る請求項１記載の方法。
3. ３．尾分子をアミンと反応させて、当該尾分子を連結分子に結合させ、固相支持 体を第二級アルコールと反応させて、連結尾分子を有する当該連結分子を当該固 相支持体に結合させ、第１ホスホロアミダイト・ヌクレオチドを第一級アルコー ルと反応させて、当該第１ヌクレオチドを当該連結分子に結合させる請求項２記 載の方法。
4. ４．３′末端を有するオリゴヌクレオチドからなる誘導体オリゴヌクレオチドで あって、 当該３′末端に位置するホスフェートエステルが式：▲数式、化学式、表等があ ります▼または▲数式、化学式、表等があります▼ 〔式中、Ｚは、▲数式、化学式、表等があります▼、▲数式、化学式、表等があ ります▼、▲数式、化学式、表等があります▼、▲数式、化学式、表等がありま す▼、または▲数式、化学式、表等があります▼、ｍおよびｍ′は各々独立して １１よりも小さな正の整数、ｎは０または１、Ｑは接続基、およびＲはレポータ ー基、インターカレーター基および親液性基および開裂基からなる群から選ばれ るものである。〕で示されるオリゴヌクレオチド。
5. ５．式： ▲数式、化学式、表等があります▼または▲数式、化学式、表等があります▼ 〔式中、Ｚは、▲数式、化学式、表等があります▼、▲数式、化学式、表等があ ります▼、▲数式、化学式、表等があります▼、▲数式、化学式、表等がありま す▼、または▲数式、化学式、表等があります▼ｍおよびｍ′は各々独立して１ １よりも小さな正の整数、ｎは０または１、Ｑは接続基、およびＲはレポーター 基、インターカレーター基および親液性基または新油性基および開裂基からなる 群から選ばれるもの、Ｙは水素またはジメトキシトリチル、およびＸは固相支持 体である。〕で示されるオリゴヌクレオチド合成用の化合物または支持体。
6. ６．式： ▲数式、化学式、表等があります▼または▲数式、化学式、表等があります▼ 〔式中、Ｚは ▲数式、化学式、表等があります▼、▲数式、化学式、表等があります▼、▲数 式、化学式、表等があります▼、▲数式、化学式、表等があります▼、または▲ 数式、化学式、表等があります▼ｍおよびｍ′は各々独立して１１よりも小さな 正の整数、ｎは０または１、Ｑは接続基、およびＲはレポーター基、インターカ レーター基および親液性基および開裂基からなる群から選ばれるもの、Ｙは水素 またはジメトキシトリチルである。〕で示される化合物。
7. ７．インターカレーター薬剤をオリゴヌクレオチドの内部に導入するにあたり、 内部アミン修飾を有するオリゴヌクレオチドを式：▲数式、化学式、表等があり ます▼インターカレーター薬剤〔式中、ｎは１〜１０、Ｒはアミンと反応してア ミドを形成可能な活性エステル〕で示される化合物と反応させ、次いで 内部にインターカレーター薬剤を有するオリゴヌクレオチドを単離することを特 徴とする方法。
8. ８．式： ▲数式、化学式、表等があります▼ 〔式中、Ｒはアルキル、アリール、アリールアルキル、ヘテロアルキルまたはヘ テロアリールである。〕 で示されるオリゴヌクレオチド合成用の固体支持体。
9. ９．その３′末端に連結したアミン・尾分子を有するオリゴヌクレオチドを合成 するにあたり、 （ａ）請求項８記載の固体支持体であるヒドロキシ誘導体を、第１の３′ホスホ ロアミダイト・ヌクレオチドと反応させ、（ｂ）付加的な３′ホスホロアミダイ ト・ヌクレオチドを、先行するヌクレオチドの５′末端と連続的に反応させて、 その３′末端において当該化合物に結合した合成オリゴヌクレオチドを形成し、 （ｃ）固定化合成オリゴヌクレオチドを水性アンモニアでインキュベートして、 ３′−アミン末端を有する合成オリゴヌクレオチドを分離・放出させ、次いで（ ｄ）３′−アミン・テールを有するオリゴヌクレオチドを単離することを特徴と する方法。
10. １０．単離したのち、３′−アミン・テールを有するオリゴヌクレオチドを親電 子性尾形成用薬剤と反応させて、その３′末端に結合した官能基を有するオリゴ ヌクレオチドを形成し、次いで その３′末端に結合した官能基を有するオリゴヌクレオチドを単離することから なる請求項９記載の方法。
11. １１．ヌクレアーゼ耐性のオリゴヌクレオチドを合成するにあたり、式：Ｘ−Ｏ −Ｒ−Ｏ−Ｙ〔Ｘは固体支持体、Ｒはアルキル、アリール、アリールアルキル、 ヘテロアルキルまたはヘテロアリール、Ｙは水素またはジメトキシトリチルであ る。〕で表わされる修飾固体支持体を用い、修飾固体支持体のヒドロキシ誘導体 を第１の３′ホスホロアミダイト・ヌクレオチドの３′末端と反応させ、 付加的な３′ホスホロアミダイト・ヌクレオチドを先行するヌクレオチドの５′ 末端と反応させて、その３′末端で当該化合物に結合する固定化・合成ヌクレオ チドを形成し、 固定化・合成オリゴヌクレオチドを水性アンモニアでインキュベートして３′− アミン・テールを有する合成オリゴヌクレオチドを分離・放出させ、次いで３′ −アミン・テールを有するオリゴヌクレオチドを単離することを特徴とする方法 。
12. １２．テトラフルオロフェニルトリフルオロアセテートからなるカルボン酸のＴ ＦＰエステル製造用の化合物。
13. １３．カルボン酸含有インターカレーター薬剤のテトラフルオロフェニル・エス テルからなる化合物。