JPH06500562A - Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅおよびＮｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ由来トランスフェリン結合蛋白質 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 Ｎｅ１ｓｓｅｒｉａ　ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅおよびＮｅ１ｓｓｅｒｉａ　ｍｅ ｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ由来トランスフェリン結合蛋白質 本出願は、Ｎｅ１ｓｓｅｒｉａ　ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅおよびＮｅ１ｓｓｅｒ ｉａ　ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ由来のトランスフェリン結合蛋白質および免疫 学的交差反応性フラグメントおよびそれらのアナログに関するものである。さら に明細書は、そのような蛋白質に対して惹起される抗体、さらには、Ｎｏｇｏｎ ｏｒｒｈｏｅａｅおよびＮ、　ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓの検出におけるそのよ うな蛋白質および抗体の使用、およびＮ、　ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅおよびＮ、 　ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓにより引き起こされる疾病の処置に関するものであ る。組換えトランスフェリン結合蛋白質をコードするＤＮＡおよびそのようなり ＮＡを発現する細胞もまた、本発明に包含されるものである。

Ｎ、　ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅおよびＮ、　ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓは、遺伝 子的には類似しているが、病原性的には異なる二つのＮｅ１ｓｓｅｒｉａ属病原 体である。鉄は、多くの細菌同様、Ｎ、　ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａａおよびＮ、　 ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓの増殖における必須栄養素である。大部分の他のグラ ム陰性細菌とは異なり、Ｎ、　ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅおよびＮ、　ｍｅｎｉｎ ｇｉｔｉｄｉｓは小さな、シデロフォア（ｓｉｄｅｒｏｆｏｒｅ）と呼ばれる溶 解性の鉄−キレート化合物を産生・分泌しない。これらの他のグラム陰性細菌は 鉄−シゾロフォア複合体を取り込むことができるレセプターを有する。

一方、Ｎ、　ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅおよびＮ、　ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓは 、各々ヒトの外分泌物中および血清中に存在する鉄結合糖蛋白質であるラクトフ ェリンやトランスフェリンに結合する膜蛋白質を有すると考えられる。Ｎ、　ｇ ｏｎｏｒｒｈｏｅａｅおよびＮ、　ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓは、ヒト宿主にお いて、ラクトフェリンおよびトランスフェリンを、これらラクトフェリン−およ びトランスフェリン−結合膜蛋白質、すなわちレセプターへ結合させることによ り鉄を取り込むと考えられる。

Ｎ、　ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ由来のラクトフェリン結合蛋白質は１０５ｋ［ ｌの、鉄調節外層膜蛋白質であると考えられる（Ｓｃｈｒｙｖｅｒｓ　＃よびＭ ｏｒｒｉｓ、　Ｉｎｆｅｃｔ、　Ｉｍｍｕｎ、　５６゜１１４４−１１４９　（ １９８８）参照）　、　Ｎ、　ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓのうちの一つの細胞株 に由来するトランスフェリン結合蛋白質は７１ｋＤの鉄調節外層膜蛋白質である と報告されているが、その他の細胞株は分子量７５ｋＤ〜８８ｋ［］、８５ｋＤ および９５ｋＤのトランスフェリン結合蛋白質を有することが報告されている（ ＳｃｈｒｙｖｅｒｓおよびＭｏｒｒｉｓ、　Ｍｏ１Ｍ１ｃｒｏｂｉｏ＋、　２． ２８１−２８８（１９８Ｂ）参照）。これらの著者は、Ｎ、　ｍｅｎｉｎｇｉｔ ｉｄｉｓのトランスフェリン結合蛋白質の同定の様々な試験結果が互いに一致し ないことを認めている。事実、８５ｋＤおよび９５ｋＯの蛋白質はＮ、　ｍｅｎ ｉｎｇｉｔｉｄｉｓのトランスフェリンレセプター機能に必要でないことが示さ れた（Ｄｙｅｒら、　Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ　Ｐａｔｈｏｇｅｎｅｓｉｓ鉄欠失条 件下で増殖させた細胞由来の淋菌裏全体を用いたドツト結合アッセイ　（ｄｏｔ 　ｂｉｎｄｉｎｇ　ａｓｓａｙ）により、ラクトフェリンおよびトランスフェリ ンの各々のレセプターの存在が示唆された。結合蛋白質の分子量およびその他の 特性は淋菌および髄膜炎菌感染により引き起こされる疾病は広まり、しばしば重 篤なものとなる。そのような疾病である淋病、髄膜炎および敗血性ショックの予 防、検出および処置するための改善方法が必要とされている。

ヒト体内におけるＮ、　ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅおよびＮ、　ｍｅｎｉｎｇｉｔ ｉｄｉｓの増殖は、これらの細胞の鉄吸収能を低下させることにより阻害できる 。淋菌および髄膜炎菌細胞の血流中での鉄の同化能力は、トランスフェリンレセ プター機能をブロックすることにより低下させることが可能であろう。トランス フェリンレセプターは、例えば、レセプターに対する抗体によりブロックできる であろう。しかしながら、レセプターに対する抗体を惹起させるためには、レセ プターは単離できるように同定されなければならない。

したがって、１１０ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅおよびＮ、　ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄ ｉｓ由来のトランスフェリン結合蛋白質の同定、単離および精製を行う必要があ る。組換えトランスフェリン結合蛋白質を作製するためには、そのような蛋白質 をコードするＤＮＡ分子が必要である。トランスフェリンレセプター機能を阻害 するためには、トランスフェリン結合蛋白質に対する抗体が必要である。淋菌お よび髄膜炎菌感染を予防おおよび処置をするためには、ワクチンが必要である。

Ｎ、　ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ！よびＮ、　ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓを検出す るためには、抗体および核酸プローブが必要である。

本発明の目的は、淋菌および髄膜炎菌感染の検出、予防窓よび処理のためのその ような蛋白質、抗体、ＤＮＡ分子およびワクチンを提供することである。

発明の要旨 これら、およびその他の目的は、当業者にとって明らかであるように、Ｎｅ１ｓ ｓｅｒｉａ　ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅまたはＮｅ１ｓｓｅｒｉａ　ｍａｎｉｎｇ ｉｔｉｄｉｓ外層膜に見出され、（ａ）洗浄剤； （ｂ）ニトロセルロース／セルロースアセテート紙；および（ｃ）　Ｎｅ１ｓｓ ｅｒｉａ　ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａａおよびＮｅ１ｓｓｅｒｉａ　ｍｅｎｉｎｇｉ ｔｉｄｉｓ由来のその他の鉄調節蛋白質 を実質的に含有せず； トランスフェリンアフィニティーカラムにより単離され；Ｎｅ１ｓｓｅｒｉａ　 ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅに見出される分子量およそ１００ｋ［ｌの鉄調節外層膜 蛋白質に対して惹起される抗血清に特異的に結合し；Ｎｅ１ｓｓｅｒｉａ　ｇｏ ｎｏｒｒｈｏｅａｅまたはＮｅ１ｓｓｅｒｉａ　ｌｎｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓの トランスフェリンレセプター機能において重要である； 鉄調節蛋白質；およびそのような蛋白質の機能性アナログを提供することにより 達成される。

本発明は、さらに、宿主細胞中でトランスフェリン結合蛋白質およびそのアナロ グを発現するＤＮＡ分子を提供するものである。その結果帯られる組換え蛋白質 もまた本発明に包含される。

本発明はまた、本発明のトランスフェリン結合蛋白質に対する抗体をも包含する ものである。該抗体はＮ、　ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅおよび／またはＮｏｍｅｎ ｉｎｇｉｔｉｄｉｓの増殖を阻害し、これらの病原体の感染を調節するうえで有 用である。

本発明は、さらに、本発明のトランスフェリン結合蛋白質およびそのような蛋白 質のアナログを含有するワクチン組成物、さらにはそのようなワクチンを投与す ることにより淋病、髄膜炎および敗血性ショック等の淋病および髄膜炎菌性疾病 に対して宿主を免疫する方法を包含するものである。本発明の抗体は、淋菌およ び髄膜炎菌性疾病を処置するための受動免疫に用いてもよい。

図面の説明 第１図は、ｐＵＮｃｌＩ４０１およびｐＵＮｃｌ１４０２挿入部から得られる淋 菌株ＦＡ１９由来の１００ｋＤ蛋白質遺伝子の部分ＤＮＡヌクレオチド配列を示 す。実施例６ａおよび実施例７を参照のこと。

第２Ａ図は、ｐ［ＩＮｃ）１４０３挿入部における１００ｋＤ　）ランスフェリ ン結合蛋白質遺伝子フラグメントのヌクレオチド配列を示す。大文字は、クロー ンｆｌ［ＩＮｃＨ４０１およびｐ［ＩＮｃ）１４０２　（第１図）およびｐｔｌ ＮＣ）１４０３間テ（Ｄｅｌ［ｆｉ域ヲ示ｔ。１００ｋＯ淋菌トランスフエリン 結合蛋白質の提案される關示コドンは、６５９番目のヌクレオチドで生じる。オ ープンリーディングフレームの方向は、図で示される方向とは逆（すなわち、６ ５９番目から１番目のヌクレオチドに向かう方法）である。実施例８を参照のこ と。

第３図は、ｐＵＮｃｆ１４０３における１ｏｏｋＤ淋菌トランスフ工リン結合蛋 白質フグメントのトランスポゾン挿入部および各突然変異体の相当する表現型の 位置を示す。

トランスポゾン（ｍＴｎ３ｃＡＴ）はシャトル突然変異誘起によりＢ、ｃｏｌｉ に挿入された。

突然変異体を作製するために、ＰＡ１９においてクロラムフェニコール耐性形質 転換体を選択した。各トランスポゾン挿入部（逆三角形で示す。）の下に、２． ５ａＭヒトトランスフェリン（鉄で２５％が飽和されている。）上で増殖および ウェスタンプロットによりアッセイされる蛋白質の発現を＋または−で示す。波 線矢印で示されるオープンリーディングフレームは、右から左へ（第２Ａ図での 方向性と同じ。）読み取り、Ｍで示されるメチオニンで開始される。典型的な− １０ヌクレオチド配列が見出されたが（−１０）　、規範的な−３５ヌクレオチ ド配列は同定できなかった。野性型の増殖および蛋白質の発現は、右側にｒＮｏ Ｔｎ」の見出しの下に示す。

第４図は、髄膜炎菌９５ｋＤトランスフ工リン結合蛋白質遺伝子のクローニング 化計画を示すものである。１．３ｋｂのＨｉｎｃ　ＩＩ　／ＢｃｏＲＩフラグメ ントは、抗体プローブを用いて、λ−Ｚａｐｎライブラリーよりクローン化され た。第２工程で示される５、　０ｋｂおよび３．５ｋｂフラグメントは、プロー ブとして該１．３ｋｂフラグメントを用いて、ｐＨ３Ｓ６−ＧＣＬＩのＣ１ａ　 Ｉライブラリーの一部からクローン化された。第３工程の３．５ｋｂのｆｌｉｎ ｃＩＩフラグメントは、第２工程の３．５ｋｂのＥ！ｃｏＲＩ／Ｃ１ａ　Ｉフラ グメントをプローブとして用いて、λ−Ｚａｐ　ＩＩライブラリーからクローン 化された。第１〜３工程で得られたフラグメントは、ｒＦＡＭ２０染色体」と見 出しの付いたフラグメントで示されるように、共に適合する。

第５図は、第４図の第１工程で得られた１、　３ｋｂのＨｉｎｃＩＩ／ＥｃｏＲ Ｉフラグメントのヌクレオチド系列を示す。リポソーム結合部位には下線を引い である。ＡＴＧ開始コドンおよび転写方向は矢印で示す。実施例１ｏを参照のこ と。

第６図は、第４図の第１工程で得られた１、　３ｋｂのＨｉｎｃ　ＩＩ　／Ｅｃ ｏＲＩフラグメントを含むトランスポゾン突然変異誘起実験の結果を示す。実施 例１１を参照のこと。

トランスフェリン結合蛋白質は、Ｎ、　ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅまたはＮ、　ｍ ｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓの膜から調製される。この膜は当技術分野で公知の方法 により調製することができる。

５ｃｈｒｙｖｅｒｓおよびＭｏｒｒｉｓによりＩｎｆｅｃｔ、Ｉｍａ＋ｕｎ、　 ５６．１１４４−１１４９（１９８８）に記載されている方法が適当である。こ の方法はここに参考文献として挙げられる。

膜は鉄欠損培地で増殖した細胞から得られる。増殖培地は、Ｄｉｆｃｏ製のＧ［ ’培地基（淋菌用培地基）等の標準的な増殖培地でもよい。この培地は、エチレ ンジアミン四酢酸（ＢＤＴ＾）、エチレン−ジアミン−ジ−オルト−ヒドロキシ フェニル酢酸（ＢＤ口Ａ）　ｔたはデスフェラル（ｄｅｓｆｅｒａｌ）　（Ｃｉ ｂａ　Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ製）等の苓レート剤の添加により鉄欠損 化することができる。一方、増殖培地は、ＭｉｃｋｅｌｓｅｎおよびＳｐａｒｌ ｒｎｇ（Ｉｎｆ、　Ｉｍｍｕｎ、　３３．５５５−５６４（１９８１）　）によ り記載されている既知組成培地であってもよく、これはキレート剤であるケレッ クス（Ｃｈｅｌｅｘ）　−１００（Ｂｉｏ−Ｒａｄ製）で処理することにより鉄 欠損化されている培地である。

本発明では、正常なトランスフェリンレセプター機能を有する如何なる淋菌株お よび髄膜炎菌株も有用である。通常、そのような菌株は、Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ｔ ｙｐｅＣｕｌｔｕｒｅ　Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏｎ、　Ｂｅｔｈｅｓｄａ、　Ｍａｒ ｙｌａｎｄおよびＮｅ１ｓｓｅｉｒｉａ　Ｒｅｐｏｓｉｔｏｒｙ、@ＮＡＭＲＩ Ｉ。

Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ　ｏｆ　Ｃａ１ｉｆｏｒｎｉａ、　Ｂｅｒｋｌｅｙ等の医 学的およびその他の入手源から入手することができる。

例えば、ＭｃＫｅｎｎａら、Ｉｎｆｅｃｔ、Ｉｍｍｕｎ、　５６．７８５−７９ １（１９８８）に記載されている淋；　Ｗｅｓｔ＃よびＳｐａｒｌｉｎｇ、　Ｉ ｎｆｅｃｔ、　ａｎｄ　ｌ＋ｎａ＋ｕｎ、　４７．３８８−３９４（１９８５） に記載さｎているＰ６２が適当な淋菌トランスフェリン蛋白質源である。髄膜炎 菌株ＦＡＭ１８および炎菌トランスフェリン結合蛋白質源である。

トランスフェリンに結合する蛋白質は、当技術分野で公知であるアフィニティび Ｍｏｒｒｉｓの方法は、ここに参考文献として挙げられる。好ましくは、実施例 ２ａに記載されているこの操作の応用法が、淋菌および髄膜炎菌の膜蛋白質から トランスフェリン結合蛋白質を分離するために用いられる。

要約すれば、鉄凱餓化淋菌および髄膜炎菌細胞由来の膜を単離し、ビオチニル化 （ｂｉｏｔｉｎｙｌａｔｅｄ）　）ランスフェリンで処理する。得られた複合体 を、例えばアビジン−またはストレブタビジンーアガロースで処理することによ り固定化する。

アフィニティ樹脂ペレットを十分に洗浄し、緩衝液に懸濁する。トランスフェリ ンレセプターを、例えば加熱により固定化トランスフェリンから分離する。蛋白 質を、例えばＬａｅｍｍｌｉ、　Ｎａｔｕｒｅ　２２７．６８０−６８５（１９ ７０）の方法に従って５Ｏ３−ＰＡＧＥにより分離する。分子量がおよそ１００ ｋＤである蛋白質（以下、１００ｋＤ蛋白質という。）が淋菌から分離される。

分子量がおよそ９５〜９５ｋＤである蛋白質（以下、９５ｋＤ蛋白質という。） が髄膜炎菌から分離される。

蛋白質の同定 分子量は５ＯＳ−ＰＡＧＥ上の単一バンドを解析し、その位置を既知の標準物質 のバンドの位置と比較することによりめた。この方法は３〜５％の範囲内の誤差 であると、当業者には理解される。分子量は測定間でほとんどバラツキを見せな い。

淋菌由来の蛋白質の分子量は一定しており、再現性もよく、髄膜炎菌からの蛋白 質の分子量よりも大きくて９７〜１００ｋＤであった。

トランスフェリンレセプター活性が欠損している５つの異なる淋菌突然変異体質 がトランスフェリンレセプター機能に重要であることが確認された。ウサギにお いて惹起されるポリクローナル抗血清を用いて、ウェスタンプロットにより１０ ０ｋＤ　）ランスフェリン結合蛋白質の存在を各突然変異体においてテストした 。

各突然変異体において、１００ｋＤ外層膜蛋白質の量は、野性型溝菌株で観察さ れるよりも非常に少なかった。正常なトランスフェリンレセプター活性を有する その他の突然変異型淋菌株では、野性型レベルの１００ｋＤ蛋白質を膜に含有し ていた。

同様の実験により、髄膜炎菌由来の９５ｋＤ蛋白質がトランスフェリンレセプタ ー機能にとって重要であることが確認された。Ｎ、　ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ由 来の１００ｋＤ蛋白質に対して惹起される抗血清を用いて、ウェスタンプロット 分析を行ったところ、該蛋白質はＮ、　ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ由来の９５ｋ Ｄ蛋白質と交差反応することが判明した。

したがって、Ｎ、　ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅおよびＮ、　ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄ ｉｓにおいても、トランスフェリンレセプター活性の欠如は、それぞれ１００ｋ Ｄ蛋白質および９５ｋＤ蛋白質が存在しないことと相関する。

したがって、先行技術に基づく予想に反して、）１０ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅに 見出される鉄調節１００ｋＤ外層膜蛋白質はトランスフェリンレセプターである 。

マウス、ヤギ、サルおよびヒト等の哺乳動物において、Ｎ９ｇｏｎｏｒｒｈｏｅ ａｅ由来のトフェリンレセブターに対して惹起される抗血清は、Ｎ１ｇｏｎｏｒ ｒｈｏｅａｅ由来のトランスフェリンレセプターと交差反応する。モノクローナ ル抗体もまた、通常９５ｋ［］および１００ｋＤ蛋白質と交差反応する。

ここにおいて用いられるように、Ｎ、　ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅおよびＮ、　ｍ ｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ由来これらのトランスフェリンレセプターは蛋白質のク ラスを構築するものであると理解されるべきである。そのクラスには、例えば、 Ｎ、　ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅおよびＮ、　ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓの様々な 細菌株において自然に生じるアミノ酸配列が変化したものも含まれる。

本発明の蛋白質としては、さらに、Ｎ、　ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅまたはＮ、　 ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ由来のそれぞれ１００ｋＤまたは９５ｋｌｌ）ランス フェリンレセプターの機能性アナログも含まれる。蛋白質がそれ以外の蛋白質と 免疫学的に交差反応する場合および同様の機能を有する場合、該蛋白質は、以下 に記載するように、特異的機能の故に他の蛋白質の機能性アナログであると考え られる。アナログは、例えば、蛋白質の７ラグメントまたは蛋白質の置換、付加 または欠失突然変異体であってもよい。

本発明の蛋白質および機能性アナログは本質的には本精製されたものである。

本明細書では、本質的に精製されたものであるということは、蛋白質および機能 性アナログが、精製プロセス間に用いられる物質だけでなく、微量のその他のＮ 、　ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅおよびＮ、　ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ由来の鉄調 節蛋白質をも含まないことを意味する。Ｎ、　ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅおよびＮ 、　ｔｒＩｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ由来のその他の鉄調節蛋白質としては、その 他のトランスフェリン結合蛋白質が挙げられる。精製プロセスにおいて用いられ る物質としては、洗浄剤、アフィニティ結合剤および分離膜が挙げられる。洗浄 剤としては、ドデシル硫酸ナトリウムおよびサルコシンが挙げられる。Ｔフィニ ティ結合剤としては、アガロース、アビジン−アガロース、ストレブタビジンー アガロース、ビオチンおよびビオチニル化トランスフェリン等のビオチニル化蛋 白質が挙げられる。分離膜としては、ニトロセルロース紙およびニトロセルロー ス／セルロースアセテート紙が挙げられる。　−組換えＤＮＡ 蛋白質が単離・精製されると、そのＤＮＡの単離方法は公知である。多くのこれ らの方法が、Ｍａｎｉａｔｉｓら、”Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　： 　Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ、　−Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈ ａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｐｒｅｓｓ（１９Ｂ２）に記載されている 。免疫学的なスクリーニング法が好ましい。

例えば、上記のようなトランスフェリンに結合した鉄を利用できる淋菌または髄 膜炎菌株由来の染色体ＤＮＡは単離され、標準的方法により適当な長さのフラグ メントに切断される。適当なりＮＡ切断法としては、例えば、超音波処理法や制 限エンドヌクレアーゼのを用いる方法等が挙げられる。適当な平均フラグメント 長はおよそ０．５〜１ｏｋｂｐである。

フラグメントにリンカ−を添加し、得られたフラグメントを適当なベクターに連 結させる。該リンカ−はベクター中の制限部位と符号する。適当なリンカ−とし ては、例えば、巨、工および巨が挙げられる。適当なベクターとしてはλ−ｇｔ ｌｌが挙げられる。連結したＤＮＡは、Ｐｒｏｍｅｇａ製のキット等の市販のキ ットによりパッケージされてもよい。

得られたライブラリーからの蛋白質をクローン化し、適当な宿主、典型的には反 」匣■内で発現させる。クローン化は好ましくは以下の突然変異、すなわちｍｃ ｒＡ、　ｍｃｒＢ、　ｍｃｒＣＳｍｒｒ、　ｈｓｄＳ、　ｈｓｄＲおよびｈｓｄ Ｍを伴う影」迎■宿主内で行われる。いくつかの好ましい乳」迎■株としては、 Ｄ）１５αＭＣＲ（ＢＲＬ製）およびｒｓＵＲＢ、Ｊ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ製 ）が挙げられる。

得られるプラークを当技術分野で公知の方法により免疫学的に選別する。

Ｍａｎｉａｔｉｓの同着を参照されたい。適当な方法が下記の実施例６に記載さ れている。

スクリーニングは、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ（Ｌａ　Ｊｏｌｌａ、　ＣＡ）製のピ コブルー・イムノロジカル・スクリーニングキット（Ｐｉｃｏｂｌｕｅ　Ｉｍｍ ｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ　Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇにｉｔ）等の市販のスクリーニング キットを用い、添付のＳｔｒａｔａｇｅｎｅプロトコール（Ｓｔｒａｔａｇｅｎ ｅまたは本明細書のファイルヒストリーから得られる。）に従って行うことによ り簡便化してもよい。

トランスフェリン結合蛋白質特異性抗血清を結合するプラークを非反応性プラー クから選別し、精製する。Ｍａｎｉａｔｉｓの同着を参照されたい。精製された ファージ由来のＤＮＡを当技術分野で公知の方法により単離する。適当な方法と 己では、例えば、ポリエチレングリコール沈降法、ファージ溶菌法および陰イオ ン交換クロマトグラフィーが挙げられ、それらはΩｉａｇｅｎ（Ｓｔｕｄｉｏ　 ｃｉｔｙ、　ＣＡ）製のキットを使用することにより簡便化できる。

得られたＤＮＡは、当技術分野で公知の方法により増幅してもよい。一つの適当 な方法としては、Ｍｕｌｌｉｓらによる米国特許第４．６８３．１９５号および Ｓａａ＋ｂｒｏｏｋ。

Ｆｒ１ｔｃｈおよびＭａｎｉａｔｉｓ［によるＭｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉ ｎｇ、　Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ、第２版、　Ｃｏ１ｄ　Ｓｐ ｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｐｒｅｓｓ（１９８９）に記 載されているポリメラーゼ・チェーン・リアクション（ＰＣＲ）法が挙げられる 。それはλ−ｇｔｌｌ−特異性オリゴ７−　（Ｎｅｗ　［ｉｎｇｌａｎｄ　Ｂｉ ｏｌａｂｓより入手可能）を用いてλ−ｇｔｌｌベクター中でＤＮＡクローンを 増幅させるのに便利な方法である。

増幅されたクローンを適当なベクターに挿入し、当技術分野で公知の方法にした がってヌクレオチド配列を決定する。適当なヌクレオチド配列決定法としては、 ＳａｎｇｅｒらによるＰｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＬＩＳ Ａ　７４．５４６３−５４６７（１９７７）に記載されているジデオキシチェー ンターミネーティング法が挙げられる。

ヌクレオチド配列決定のための適当なベクターおよびポリメラーゼは公知である 。適当なベクターとしてはＳｔｒａｔａｇｅｎｅ製のブルースクリプト　（Ｂｌ ｕｅｓｃｒｉｐｔ）ベクターが挙げられる。適当なポリメラーゼとしてはシーケ ナーゼ（Ｓｅｑｕｅｎａｓｅ）（口ｎ１ｔａｄ　５ｔａｔｅｓ　Ｂｉｏｃｈｅｍ ｉｃａｌ　Ｃｏｒｐ、製、　Ｃ１ｅｖｅｌａｎｄ、　ＯＨ）が挙げられる。

通常、上記のイムノスクリーニング法では、トランスフェリン結合蛋白質特異性 抗血清を有するフラグメントを同定するために、多数のプラークを選別すること が必要である。例えば、ある実験では、淋菌（ＦＡ１９）染色体の７ラグメント からおよそ５００．０００プラークが得られた。Ｎ９ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ由 来の１００ｋＤ　）ランスフェリン結合蛋白質に対する抗血清を用いて二つのプ ラークが同定された。挿入部の長さが３２３ｂｐであるクローン（ｐＵＮｃＨ４ ０１）が一つのプラークから単離され、それ以外のプラークからは挿入部の長さ が４８３ｂｐであるクローン＜ｐｔｌＮｃ）１４０２）が単離された。これらの ＤＮＡ配列はＦＡ１９染色体の重複するフラグメントを表している。この二つの フラグメントの重複部も含む共通配列を第１図に示す。７５番目〜３２３番目の ヌクレオチドは重複配列を表している。１番目〜７４番目のヌクレオチドは３２ ３ｂｐフラグメントの非重複配列を表している。３２４番目〜５５８番目のヌク レオチドは４８３ｂＰフラグメントの非重複配列を表している。オープンリーデ ィングフレームのみが、第１図に示すものとは反対方向に（すなわち、５５８番 目のヌクレオチドから１番目のヌクレオチドに向かって）走っている。実施例６ ａを参照のこと。

上記のフラグメントまたはそれらのサブフラグメントは、トランスフェリン結合 蛋白質遺伝子の付加フラグメントを得るためのプローブとして用いられる。この 技術を用いることにより、Ｆ＾１９染色体の８ｋｂのＣ１ａ　Ｉフラグメントお よび３．２ｋｂのＨｉｎｃＩ［フラグメントが、３２３オよび４８３ｂｐフラグ メントとハイブリダイズする。

３、２ｋｂのＨｉｎｃｎフラグメントの制限酵素地図を第２Ｂ図に示す。得られ たフラグメントはヌクレオチド配列を決定することができる。実施例７および８ 並びに第２Ａ図を参照されたい。

フラグメントを適当に伸長することにより、遺伝子全体がヌクレオチド配列決定 される。コードする配列の限界は、挿入突然変異誘起等の当業界で公知の方法に より決定される。実施例９を参照されたい。９５ｋＤｆｉｉ膜炎菌トランスフ工 リン結合蛋白質のヌクレオチド配列を決定するために、同様の方法が用いられる 。実施例１０および１１並びに第４〜６図を参照されたい。

組換え蛋白質 本発明の蛋白質は組換えＤＮＡ技術により作製することもできる。分離されたＤ ＮＡから組換え蛋白質を作製するための適当な方法としては、Ｍａｎｉａｔｉｓ らの同著に記載されている。

要約すれば、本発明のトランスフェリン結合蛋白質をコードするＤＮＡコードは 、それらの蛋白質の機能性アナログをコードするＤＮＡ同様、広範囲にわたる様 々な宿主細胞および広範囲にわたる様々なベクターを用いて発現されてもよい。

宿主細胞は、原核細胞であっても真核細胞であってもよい。ＤＮＡは天然源から 得られてもよく、場合によっては修飾されていてもよい。ＤＮＡはまた、その全 体または部分的に合成されていてもよい。

ベクターは染色体ＤＮＡ配列、非染色体ＤＮＡ配列および合成りＮＡ配列のセグ メントを含んでいてもよい。いくつかの適当な原核性ベクターとしては、三田状 、６旦、匹翌蔓、叱競および団Ａ等の影」迎は由来のプラスミドが挙げられる。

原核性ベクターとしてはまた、４旦およびその他の糸状菌の一重鎖ＤＮＡファー ジ等のファージＤＮＡの誘導体も挙げられる。

酵母において有用なベクターが利用できる。適当な例としては２ｕプラスミドが 挙げられる。

哺乳動物細胞において使用する適当なベクターも公知である。そのようなベクタ ーとしては、十分公知である５Ｖ−４０アデノウイルスの誘導体、レトロウィル ス誘導ＤＮＡ配列およびプラスミドとファージＤＮＡの組合せから誘導されるベ クターが挙げられる。

さらに真核性発現ベクターも当技術分野で公知である（例えば、Ｐ２Ｊ、　５ｏ ｕｔｈｅｒｎおよびＰ、　Ｂｅｒｇ、　Ｊ、　Ｍｏｌ、　Ａｐｐｌ、　Ｇｅｎｅ ｔ、　！、　３２７−３４１（１９Ｂ２）　；ＳB Ｓｕｂｒａｍａｎｉ　ら、　Ｍｏ１．　Ｃｅ１１．　Ｂｉｏｌ、　！、　８５４ −８６４（１９８１）　；Ｒ，Ｊ、にａｕｆｍａｎｎおよびo４ ＾。　５ｈａｒｐ、’Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ　Ａｎｄ　Ｅｘｐｒｅｓｓｉ ｏｎ　Ｏｆ　５ｅｑｕｅｎｃｅｓ　Ｃｏｔｒａｎｓｆｅｃｔ■п@ｗｉｔｈ ＾　Ｍｏｄｕｌａｒ　Ｄｉｈｙｄｒｏｆｏｌａｔｅ　Ｒｅｄｕｃｔａｓｅ　Ｃｏ ｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ　ＤＮＡ　Ｇｅｎｅ、”　Ｊ、Ｍｏ戟AＲｉａｌ。

１５９、６０１−６２Ｈ１９８２）　；Ｒ，Ｊ、　ＫａｕｆｍａｎｎおよびＰ、 　Ａ、　５ｈａｒｐ、　Ｍｏ１．　Ｃｅ１ｌ、　Ｂｉｏｌ。

１５９、　６０１−６６４（１９８２）　；Ｓ、１．　５ｃａｈｉｌｌ　ら、” ８ｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　Ａｎｄ　Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａ狽奄盾■ Ｏｆ　Ｔｈｅ　Ｐｒｏｄｕｃｔ　Ｏｆ　Ａ　Ｈｕｍａｎ　Ｉｍｍｕｎｅ　Ｉｎｔ ｅｒｆｅｒｏｎ　ＤＮＡ　Ｇｅｎｅ　Ｉｎ　Ｃｈｉｎｅｓｅ@Ｈａｍｓｔｅｒ Ｑｖａｒｙ　Ｃｅ１ｌｓ、”Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ｌ ｌ５Ａ　８０．４６５４−４６５９（１９８３）　；　Ｇ、@Ｕｒｌａｕｂ およびり、　Ａ、　Ｃｈａｓｉｎ、　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓ ｃｉ、　ＬＩＳＡ　７７、４２１６−４２２０（１９８０）Q照の こと）。

有用な発現宿主としては、十分公知である原核性および真核性宿主が挙げられる 。いくつかの適当な原核性宿主としては、例えば、も」迎■５Ｇ−９３６、影ゴ 迎狂ｌｉｅ　１０１、Ｅ、　ｃｏｌｉ　１１３１１０、Ｅ、　ｃｏｌｉ　Ｘ１７ ７６、［！、　ｃｏｌｉ　Ｘ２２８２、Ｂ、　ｃｏｌｉ　Ｄｆｌ激Iヨヒ ８、　ｃｏｌｉ　ＭＲＣｌ等の８．　ｃｏｌｉ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ、　Ｂ ａｃｉｌｌｕｓ　５ｕｂｔｉｌｉｓ等のＢａｃｉｌｌｕｓ、■ よびＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓが挙げられる。適当な真核性細胞としては、酵母 およびその他の菌類、昆虫、ＣＯ３細胞およびＣｌｌ０細胞などの動物細胞、組 織培養のヒト細胞および植物細胞が挙げられる。

本発明で有用な発現ベクターは、操作上トランスフェリン結合蛋白質遺伝子また はそれらのフラグメントに連結する少なくとも一つの発現調節配列を含有する。

調節配列は、クローン化ＤＮＡ配列の発現を調節および制御するためにベクター に挿入される。有用な発現調節配列の例としては、連系、壁糸、連系、υ正系、 ファージλの主なオペレーターおよびプロモーター領域、ｆｄ被覆蛋ｉ質の調節 領域、３−ホスホグリセリン酸キナーゼのプロモーター等の酵母の解糖プロモー ター、Ｐｂｏ２等の酵母酸ホスファターゼのプロモーター、酵母の接合因子のプ ロモーターおよびポリオーマ、アデノウィルス、レトロウィルスおよび、初期お よび後期プロモーターまたはＳＶ４０等のサルウィルス由来のプロモーター、並 びに原核および真核細胞およびそれらのウィルスまたはそれらを組合せた遺伝子 の発現を調節するものとして知られるその他の配列が挙げられる。

１００ｋＤまたは９５ｋＯ蛋白質は当技術分野で公知の方法により精製すること ができる。例えば、トランスフェリン結合蛋白質の全体または一部を、適当な融 合パートナ−との融合蛋白質の形態で発現させてもよい。その融合パートナ−は 、好ましくは精製および同定を簡便化させるものである。いくつかの有用な融合 パートナ−としては、β−ガラクトシダーゼ（Ｇｒａｙら、　Ｐｒｏｃ、　Ｎａ ｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ７９、６５９８（１９Ｂ２））　；ｔｒ ｐ［！（Ｉｔａｋｕｒａら、　５ｃｉｅｎｃｅ　］、９８．１０５６（１９７７ ））およびプロティンＡ　（Ｕｈｌｅｎら、　Ｇｅｎｅ　２３．３６９（１９８ ３））が挙げられる。例えば、β−ガラクトシダーゼを含有する融合蛋白質は、 抗β−ガラクトシダーゼ抗体カラムを用いて、アフィニティクロマトグラフィー により精製してもよい（Ｕｌｌｎａｎ、　Ｇｅｎｅ、　２９．２７−３１（１９ ８４）　）。

所望により、融合蛋白質がトランスフェリン結合性蛋白質と融合パートナ−との 間に切断可能な部位を含有するような融合蛋白質をコードするＤＮＡを作製する 。化学的および酵素的切断可能部位は共に当技術分野で公知である。酵素的に切 断され得る部位の適当な例としては、コラゲナーゼにより特異的に認識され切断 される部位（Ｋｅｉｌら、　ＦＢＢＳ　Ｌａｔｔｅｒｓ　５６．２９２−２９６ （１９７５））　：エンテロキナーゼ（ｔ（ｏｐｐら、　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ｏｇｙ　６−、１２０４−１２１０（１９８８））　：ファクターｘａ　（ｌｉ ａｇａｉ　ら。

Ｍｅｔｈｏｄｓ　Ｂｎｚｙｍｏｌ、１５３．４６１−４８１（１９８７））　； 　）ｏンビン（Ｂａｔｏｎら、　Ｂｉｏｃｈｅ＋＋＋１ｓｔ窒■ ２５、５０５（１９８６））　；およびグルタチオンＳ−）ランスフェラーゼ（ Ｊｏｈｎｓｏｎ。

Ｎａｔｕｒｅ　３３８．５８５（１９８９）　；およびＶａｎ　Ｂｔｔｅｎら、 　Ｃｅ１ｌ　５８．６６９（１９８９））が挙げられる。コラゲナーゼは配列Ｐ ｒｏ−Ｘ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ　（配列中のＸは中性のアミノ酸である。）において プロリンとＸとの間を切断する。エンテロキナーゼは配列Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ａｓ ｐ−Ａｓｐ−Ｌｙｓにおいてリジンの後ろを切断する。ファクターＸａは配列１ １ｅ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ａｒｇにおいてアルギニンの後ろを切断する。トロンビ ンは配列Ａｒｇ−Ｇｌｙ−３ｅｒ−Ｐｒ。

においてアルギニンとグリシンの間を切断する。

特異的な化学的切断剤も公知である。例えば、臭化シアンは蛋白質においてメチ オニン残基で切断する。

一方、１００ｋＤおよび９５ｋＤ　）ランスフェリンレセプター蛋白質は誘導さ れるプロモーターの後ろで過剰に発現させ、特異的トランスフエＩＪンレセブタ ー抗体を用いたアフィニティクロマトグラフィーにより精製されてもよい。また 別の方法として、過剰発現した蛋白質は、当技術分野で公知の方法により、イオ ン交換、サイズ排除および疎水的相互作用クロマトグラフィーを組合せて精製し てもよい。

これら、およびその他の適当な方法は、ＭａｒｓｔｏｎによるＴｈｅ　Ｐｕｒｉ ｆｉｃａｔｉｏｎ　ｏｆＥ！ｕｋａｒｙｏｔｉｃ　Ｐｏ１ｙｐｅｐｔｉｄｅｓ　 ［！ｘｐｒｅｓｓｅｄ　ｉｎ　Ｂ、ｃｏｌｉ’（ＤＮＡ　Ｃｌｏｎｉｎｇ、　Ｄ 、ＭB Ｇｌｏｖｅｒ、　Ｅｄ、、　Ｖｏｌｕｍｅ　ｍ、　ＩＲＬ　Ｐｒｅｓｓ　Ｌｔｄ 、、　［ｉｎｇｌａｎｄ、　１９Ｂ？）に記載されている。

よびそれらの機能住アナログは、淋菌および髄膜炎菌感染により引き起こされる 疾病を検出および予防するうえで有用である。

例えば、蛋白質は、標識化して、淋病、敗血性ショック、あるいは髄膜炎の被検 患者の血清またはその他の体液等の試料中の蛋白質に対する抗体を検出するだめ の標準的イムノアッセイにおけるプローブとして用いてもよい。通常、請求の範 囲へによる蛋白質またはそのような蛋白質の機能性誘導体を、蛋白質の抗体を含 有すると思われる試料とインキュベートする。蛋白質は、インキュベーション前 、インキュベーション中またはインキュベーション後のいずれかにおいて標識化 する。試料中の抗体に結合した標識化蛋白質が検出されれば、抗体が存在するこ とになる。抗体は好ましくは固定化されている。

蛋白質を有する抗体を検出するための適当なアッセイとしては、当技術分野で公 知であり、例えばＲ，Ｈ，Ｋｅｎｎｅｔｈ、　”Ｅｎｚｙｍｅ−Ｌｉｎｋｅｄ　 Ａｎｔｉｂｏｄｙ　Ａｓ５ａｙ　ｗｉｔｈＣｅｌｌｓ　Ａｔｔａｃｈｅｄ　ｔｏ 　Ｐｏ１ｙｖｉｎｙｌ　Ｃｈｌｏｒｉｄｅ　Ｐｌａｔｅｓ”ｉｎ　Ｋｅｎｎｅｔ ｈ　ｅｔ　ａｌ。

Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ　Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ、　Ｐｌｅｎｕｍ　Ｐｒｅｓｓ、 　Ｎ、　Ｙ、、　３７６頁（１９８１）に記載されている標準ＢＬＩＳＡプロト コールが挙げられる。要約すれば、プレートを十分量の抗原性蛋白質で被覆し、 検出可能量の抗体を結合させる。咳プレートをポリペプチドとインキュベートし た後、適当なブロック剤、例えば１０％正常ヤギ血清等でブロックする。患者の 血清などの試料を添加して終結点を決定するために力価をめる。

正および負の調節を同時に加え、未知の試料中に存在する目的の抗体を定量する 。

続いてインキュベートし、試料を適当な酵素にコンジュゲートさせたヤギ抗ヒト Ｉｇでプローブする。試料中の抗蛋白質抗体の存在は酵素の存在により示される 。

イムノアッセイに使用するために、蛋白質は放射性または非放射性原子および分 子で標識化されていてもよい。それらの蛋白質とコンジュゲートさせるためのそ のような標識および方法は当技術分野では公知である。

有用な放射性標識のいくつかの例としては、３２ｐ、　＋２５１　、１３１■お よび３Ｈが挙げられる。放射性標識の使用については英国特許第２．０３４．３ ２３号、米国特許第４．３５８．５３５号、および同第４．３０２．２０４号に 記載されている。

非放射性標識のいくつかの例としては、酵素、発色団、電子顕微鏡で検出可能な 原子および分子および磁気特性により検出可能な金属イオンが挙げられる。

いくつかの有用な酵素標識としては、基質中で検出可能な変化を生じる酵素が挙 げられる。いくつかの有用な酵素およびその基質としては、例えば、西洋ワサビ のパーオキシダーゼ（ピロガロールおよび０−フェニレンジアミン）、β−ガラ クトシダーゼ（フルオレセイン　β−Ｄ−ガラクトピラノシド）およびアルカリ 性フォスファターゼ（５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリルフォスフェート ／ニトロブルーテトラゾリウム）が挙げられる。酵素標識の使用については、英 国特許第２９口１９．４０４号、欧州特許第６３．８７９号およびＲｏｔｍａｎ によるＰｒｏｃ、　Ｎａｔｌ。

Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、、　４７．１９８１−１９９１（１９６１）に記載されて いる。

有用な発色団としては、例えば、染料以外に、蛍光性、化学発光性および生物発 光性分子が挙げられる。本発明において有用ないくつかの具体的な発色団として は、例えばフルオレセイン、ローダミン、テキサスレッド、フィコエリスリン、 ウンベリフェロン、ルミノールが挙げられる。

標識は、当技術分野で公知の方法によりプローブにコンジュゲートしていてもよ い。標識は官能基を介して直接プローブに結合していてもよい。プローブはその ような官能基を含有しているか、あるいは含有させることができるものである。

適当な官能基のいくつかの例としては、例えば、アミノ基、カルボキシル基、ス ルフヒドリル基、マレイミド基、イソシアナート基、イソチオシアナート基が挙 げられる。

標識はまた、上記の方法によりプローブに結合しているリガントによりプローブ にコンジュゲートしていてもよいし、標識に結合しているリガントのレセプター によりプローブに結合していてもよい。いかなる公知のりガンドーレセブター結 合体も適当であるが、ビオチン−アビジン結合体が好ましい。

イムノアフセイに用いるために、蛋白質は１００ｋＤまたは９５ｋＤ蛋白質全体 であってもよいし、あるいはそれらの機能性アナログであってもよい。これらの 蛋白質の機能性アナログとしては、フラグメントおよび該蛋白質の抗体への結合 能力を損なわない置換、付加および欠失突然変異体が挙げられる。トランスフェ リン結合蛋白質に特異的な抗体を検出できる蛋白質ならば、本発明において有用 である。

Ｎ、　ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓの生体機能にとって重要であり、かつ外層膜に 見出されるものであるので、これらの蛋白質はＮｅ１ｓｓｅｒｉａ感染により引 き起こされる淋病、敗血性ショックおよび髄膜炎等の疾病の予防用ワクチンに有 用である。このためには、該蛋白質が中和抗体を産生ずることが必要である。中 和抗体とは、インビトロまたはインビボで著しく細菌細胞の増殖を阻害、かつ／ あるいは死滅させる抗体である。疾病に感染した哺乳動物の疾病の徴候を防ぐ、 または弱めるのに十分阻害された場合、細菌の増殖にインビボで著しく阻害され る。

抗原として１００ｋＤまたは９５ｋＤ蛋白質または機能性アナログを含有するワ クチンを、本発明に従って淋菌または髄膜炎菌の増殖を阻害または死滅させるの に用いてもよい。このための１００ｋＤまたは９５ｋＤ蛋白質の機能性アナログ としては、ヒト宿主などの哺乳動物宿主内で中和抗体を産生するフラグメントお よび置換、付加または欠失突然変異体が挙げられる。

本発明では、さらに、ヒトを含む哺乳動物をＮ、　ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅおよ びＮ、　ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓによる感染に対して免疫するためのワクチン 組成物を包含する。

該ワクチンは、Ｎ、　ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ由来の１００ｋＤ　）ランスフェ リンレセプターおよび／またはＮ、　ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ由来の９５ｋＤ 　）ランスフェリンレセプターおよび薬学的に許容されるアジュバントを含有す る。１００ｋＤおよび９５ｋＤ蛋白質の代わりに、上記のような機能性アナログ を代用してもよい。

ワクチンは適当なキャリア中の抗原を含有する。ワクチンはムラミルペプチドお よびインターフェロン、インターロイキン−１およびインターロイキン−６等の リンフ才力インなどのアジュバントを含んでいてもよい。抗原は、あるいは当技 術分野において公知であるように酸化アルミニウム粒子等の適当な粒子に吸着し ていてもよいし、リポソームに包まれていてもよい。

抗原はまた、Ｓ、　ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍのようなサルモネラ（Ｓａｌｆｆｌ ｏｎｅｌｌａ）の無発病性の細菌株から誘導されてもよい。そのようなワクチン は、当技術分野で公知であるように、サルモネラ菌株におけるトランスフェリン 結合蛋白質の活性蛋白質を含むクローン化ＤＮＡによって調製されてもよい（例 えば、Ｃｕｒｔｉｓｓら、　Ｖａｃｃｉｎｅ　Ｉｇ、　１５５−１６０（１９８ ８）およびＧａ１ａｎら、　Ｇｅｎｅ　９４．２９−３５（１９９０）参照のこ と）。

本発明は、さらにヒトを含む宿主哺乳動物を上記のワクチン組成物で免疫する方 法を包含するものである。該ワクチンは、当技術分野で公知の方法により哺乳動 物に投与してもよい。そのような方法としては、例えば、静脈内、腹腔内、皮下 または筋肉的投与が挙げられる。

ワクチン組成物は、１００ｋＤ蛋白質または９５ｋＤ蛋白質全体を含有していて もよいが、好ましくは１００ｋＤまたは９５ｋＤ蛋白質の非毒性フラグメントを 含有している。

例えば、抗原性蛋白質のフラグメントを作製し、抗原性部位を含有するそれらの ７ラグメントを決定することは十分公知である。抗原性があり非毒性であれば、 フラグメントの長さは特に限定されない。したがって、該フラグメントはエピト ープを決定するのに十分なアミノ酸残基を含有していなければならない。既知の 抗原性ポリペプチドから抗原性フラグメントを単離および同定する方法は、５ａ ｌｆｅｌｄらによるＪ、　Ｖｉｒｏｌ、　６３．７９８−８０８（１９８９）お よびｌ５ｏｌａらにょるＪ、Ｖｉｒｏｌ。

嬰、２３２５−２３３４（１９８９）に記載されている。

フラグメントが、エピトープは決定するが、短すぎて抗原性がない場合には、キ ャリア分子にコンジユゲートしてもよい。いくつかの適当なキャリア分子として は、キーホールリンペットヘモシアニン（ｋｅｙｈｏｌｅ　ｌｉｍｐｅｔ　ｈｅ ｏ＋ｏｃｙａｎｉｎ）およびウシ血清アノげミンが挙げられる。コンジュゲーシ ョンは当技術分野で公知の方法により行ってもよい。そのような方法の一つは、 フラグメントのシスティン残基をキャリア分子上のシスティン残基と結合するこ とである。

処置用抗体 さらに、本発明は、本発明の蛋白質および機能性アナログを特異的に認識し結合 する中和抗体の単離を包含するものである。該抗体はポリクローナルまたはモノ クローナルでもよい。中和抗体およびワクチンとのコンジユゲートに用いられる 機能性アナログの定＠（上記参照）は、さらに中和抗体の作製にも適用される。

ポリクローナル抗体は、当技術分野で公知の方法により蛋白質または機能性アナ ログが接種されだ哺乳動物から単離される。モノクローナル抗体は、当技術分野 で公知の方法により作製されてもよい。これらの方法としては、Ｋｏｈｌｅｒお よびＭｉ　１ｓｔｅｉｎのＮａｔｕｒｅ　２５６．４９５−４９７（１９７５） に記載の免疫学的方法およびＨｕｓｅらの５ｃｉｅｎｃｅ　２４６．１２７５− １２８Ｈ１９８９）に記載の組換えＤＮＡ法か挙げられる。

本発明はまた、Ｎ、　ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａａｔたはＮ、　ｍｅｎｉｎｇｉｔｉ ｄｉｓにより引き起こされる疾病に冒されている哺乳動物（ヒトを含む）を、本 発明の中和抗体をそのような哺乳動物に有効量投与することにより処置する方法 をも包含するものである。投与は、上記のようなワクチンの投与と同様の方法に より行ってもよい。

プローブとしての抗体 本発明のトランスフェリン結合蛋白質および機能性アナログはまた、試料中のＮ ｅ１ｓｓｅｒｉａ　ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅまたはＮｅ１ｓｓｅｒｉａ　ｍｅｎ ｉｎｇｉｔｉｄｉｓの存在の検出用プローブとして用いる抗体の作製に用いられ てもよい。該抗体はポリクローナルまたはモノクローナルであってもよい。この 目的のためには、機能性アナログは、試料中の１ｏＯｋＤまたは９５ｋＤ蛋白質 の存在が検出可能な抗体を産生ずるものであれば、１００ｋＤ蛋白質または９５ ｋＤ蛋白質のフラグメントおよび置換、付加および欠失突然変異体であってもよ い。該試料は、例えば、Ｎ、　ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅまたはＮ、　ｍｅｎｉｎ ｇｉｔｉｄｉｓに感染していると思われる哺乳動物（ヒトを含む）の体液であっ てもよい。

抗体で蛋白質の存在を検出するアッセイは、先に記載しており、続いて標準プロ ットおよび［！ＬＩＳＡフォーマット等の公知のフォーマットを行う。これらの フォーマットは、通常、抗体を９５ｋＤまたは１００ｋＤ蛋白質を含有すると思 われる試料とインキュベートし、抗体と蛋白質の複合体の存在を検出することで ある。抗体はインキュベーション工程前、インキュベーション工程中、あるいは インキュベーション工程後のいずれかの段階において標識化される。好ましくは 、蛋白質は検出前に固定化される。固定化は、蛋白質をマイクロタイターウェル 等の固相表面に直接結合させるか、あるいは蛋白質を固定化抗体に結合させるこ とにより達成されでもよい。

プローブとして用いた場合、抗体は通常、当技術分野で公知の方法により標識化 される。蛋白質に有用なＳ識（上記参照）と同様の標識もまた、抗体の標識とし て有用である。抗体を標識化する方法は、例えば、）ｌＵｎｔｅｒおよびＧｒｅ ｅｎｗｏｏｄによるＮａｔｕｒｅ　１４４．９４５（１９６２）およびＤａｖｉ ｄらにょるＢｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　１３．１０１４−１０２１（１９７４） に記載されている。それ以外の抗体を標識化する方法が米国特許第３、９４０． ４７５号および同第１６４５．０９０号に記載されている。

を有する１００ｋＤ蛋白質、９５ｋＤ蛋白質、あるいは１００ｋＤまたは９５ｋ Ｄ蛋白質のフラグメントをコード化する核酸分子を用いることができる。核酸分 子はＲＮＡでもＤＮＡでもよい。

核酸分子プローブが試料中の特定の核酸分子を認識するかどうかを決定する方法 は、当技術分野では公知である。通常、試料中に存在すると思われる核酸配列と 相補的な標識化プローブが調製される。好ましくは、目的とする核酸分子が固定 化される。目的の核酸分子にハイブリダイズしたプローブの存在は、試料中の核 酸分子の存在を示すものである。適当な方法の例が、Ｄａｌｌａｓらによる“Ｔ ｈｅＣｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ　ｏｆ　ａｎ　Ｂｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ 　Ｃｏ１１　Ｐｌａｓｍｉｄ　Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｎｔ　ｔｈａ煤@Ｅｎｃｏｄ ｅｓ ｆｏｒ　ｔｈｅ　Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ　ｏｆ　ａ　Ｈｅａｔ−１ａｂｉｌｅ　 Ｂｎｔｅｒｏｔｏｘｉｎ、　−（Ｋ、　Ｎ、　Ｔｉｍｍ１ｓ■謔■`。

Ｐｕｅｈｌｅｒ　ｌｊ４．　’Ｐｌａｓｍｉｄｓ　ｏｆ　Ｍｅｄｉｃａｌ、　Ｂ ｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ、　ａｎｄ　Ｃｏ＋ｎ＋ｎｅｒｃ奄≠■ Ｉｍｐｏｒｔａｎｃｅ、　Ｂ１５ｅｖｉｅｒ／Ｎｏｒｔｈ−Ｈｏｌｌａｎｄ　Ｐ ｕｂｌｉｓｈｉｎｇ　Ｃｏ、、＾ｍｓｔｅｒｄａｍ、　１１R−１２２頁 （１９７５）　；　ＧｒｕｎｓｔｅｉｎおよびＨｏｇｎｅｓｓにょるＰｒｏｃ、 　Ｎａｔｌ、＾ｃａｄ、Ｓｃｉ　ｔｌｓＡ　７２．３９６１−３９６５（１９７ ５）　ＨＰａ１ｖａらによる米国特許第４．７３１．３２５号（Ｏｒｉｏｎ−ｙ ｈｔｙｍａ、　Ｅｓｐｏｏ。

Ｆｉｎｌａｎｄに譲渡されている。）　ＨＭｕｌｌｉｓらによる米国特許第４． ６８３．１９５号（ＣｅｔｕｓＣｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、　［！ｍｅｒｙｖｉｌ ｌｅ、　Ｃａ１ｉｆｏｒｎｉａに譲渡されているｏ　）　；　５ｃｈｎｅｉｄｅ ｒらによる米国特許第４．８８２．２６９号（Ｐｒｉｎｃｅｔｏｎ　［Ｉｎ１ｖ ｅｒｓｉｔｙに譲渡されている。）；およびＳｅｇｅｖによるＰＣＴ出願Ｗ０９ ０１０１０６９号に記載されている。５ｃｈｎｅｉｄｅｒらの特許およびＳｅｇ ｅｖの出願は、共にｌｍＣ１ｏｎｅ　Ｓｙｓｔｅｍｓ　Ｉｎｃ、、　Ｎｅｗ　Ｙ ｏｒｋ　Ｃ１ｔｙのライセンスである。

上記のプローブは当技術分野で公知の方法により標識化される。オルゴヌクレオ チドのプローブを標識化する方法は、例えば、Ｌｅａｒｙら、　Ｐｒｏｃ、　Ｎ ａｔｌ、　Ａｃａｄ。

Ｓｃｉ、　ＵＳＡ（１９８３）８０　：　４０４５　；　ＲｅｎｚおよびＫｕｒ ｚ、　Ｎｕｃｌ、　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、（１９８４）　１Q　：　３４３５ ；　Ｒ７ｃｈａｒｄｓｏｎおよびＧｕｍｐｏｒｔ、　Ｎｕｃｌ、　Ａｃ＋ｄｓ　 Ｒｅｓ、（１９８３）　１１　：　６１６７　；　Ｓｍ１ｔ■轣B Ｎｕｃｌ、＾ｃｔｄｓ　Ｒｅｓ、（１９８５）１３　：　２３９９　；およびＭ ｅｉｎｋｏｔｈおよびＷａｈｌ、　Ａｎａｌ、　Ｂｉｏｃｈ■■ （１９８４）　１３８　：　２６７に記載されている。

淋菌株ＦＡ１９は、冷凍保存からＧＣＢ寒天に移し、１βのＧＣＢ肉汁を含有す るフラスコへの接種用として初濃度２０ＫＵ　（Ｋｌｅｔｔ　ｕｎｉｔｓ）とす る。培養は５％のＣＯ２を伴って３７℃で激しく攪拌しながら４０Ｋ１１の濃度 に達するまで行い、キレート剤、すなわちデスフェラル（ｄｅｓｆ　ｅｒａ　ｌ ）を最終濃度が５０％Ｍとなるように添加する。添加後、細胞を４時間保存する 。

髄膜炎菌株ＦＡＭ２０は、ＧＣＢおよびデスフェラルの代わりにケレックス（Ｃ ｈｅｌｅｘ）処理したＣＤＭを用いる以外は淋菌株ＦＡ１９と同様の方法により 調製する。

２ａ、淋菌トランスフェリン結合蛋白質のアフィニティ精製膜の調製法並びに淋 菌トランスフェリン結合蛋白質の単離および精製法は、５ｃｈｒｙｖｅｒｓおよ びＭｏｒｒｉｓ（Ｉｎｆｅｃｔ、　ａｎｄ　Ｉｍｍｕｎ、　５６．　１１４４− １１４９（１９８８））の髄膜炎菌ラクトフェリン結合蛋白質で用いた方法と同 様である。５ｃｈｒｙｖｅｒｓ　ｂよびＭｎｒｒｉｓの報告文に記載されている この方法は、ここに参考文献として挙げられる。

５ｃｈｒｙｖｅｒｓおよびＭｏｒｒｉｓの方法を以下のように修飾した。６２５ ｕｇのビオチニル化トランスフェリン（ビオチニレーション反応剤としてＰｉｅ ｒｃｅ製ビオチン−５−Ｓ−ＮＨＳを用いて５ｃｈｒｙｖｅｒｓの方法により調 製される。）を、２５ｍ１の１００ｍＭ　ＮａＣβ１５０ｍＭ　）　ＩＪス（ｐ Ｈ８，０）中で、２５ｍｇの淋菌株ＦＡ１９由来の総膜蛋白質と混合する。混合 物はゆっくり攪拌しながら室温で１時間インキュベートする。膜は１７．０ＯＯ Ｘ　ｇで１０分遠心分離してペレットにする。ベレットは２５ｍ１の１００ｍＭ 　ＮａＣβ１５０ｍＭ　）　’）ス（ｐｆ１８．０）に再懸濁し、続いてＮＡ２ 　ＥＤＴＡを最＃濃度が１０ｍＭとなるように、またＮ−ラウロイル−サルコシ ンを最＃濃度が０．７５％となるように添加する。膜は、室温で１０分間攪拌し て可溶化される。２．５ｍｌのストレブタビジンーアガロース（Ｓｉｇｍａ製） を添加し、室温で１時間結合させる。樹脂を３０００Ｘｇで５分間遠心分離し、 上清を除去し、樹脂を５ｍＭ［：ＤＴＡおよび０．５％Ｎ−ラウロイル−サルコ シンを添加したＬＭ　ＮａＣβ１５０ｍＭ　）リス（ｐＨ８，０）中で２度洗浄 した後、さらに何も添加されていないＩＭＮａＣβ１５０ｍＭ　）　！Ｊス（ｐ ｉ（８，０）中で２度洗浄する。蛋白質は、０．４５％Ｎ−ラウロイル−サルコ シンおよび１２５ｍＭβ−メルラブトエタノールを添加したＩＭＮａＣ！１５０ ｍＭ　）リス（ｐｔ（８，０）によりマトリックスから溶出する。

２ｂ、髄膜炎菌トランスフェリン結合蛋白質の了フィニティ精製淋菌株ＰＡ１９ の代わりに髄膜炎菌株ＲＡＭ２０を用いる以外は、実施例２ａと同様に操作を行 う。

３ａ、淋菌トランスフェリン結合蛋白質の単離アフィニテイ調製による溶出物（ 実施例２ａ）をアミコン・コンセントレータ−（Ａ＋ｎ１ｃｏｎ　ｃｏｎｃｅｎ ｔｒａｔｏｒ）　（３０，ＯＯＯＭＷ分画）を用いて濃縮する。得られた濃縮蛋 白質調製物を２０％グリセロール、４％ＳＯ３，１３０ｍＭ　）リス（ｐＨ８， ０）　、１０％ｇ／−ブロモフェノール・ブルーに可溶化し、Ｌａｅｍｍｌｉ　 （Ｎａｔｕｒｅ、　２２７．６８０−６８５（１９７０））の方法にしたがって ７．５％ＳＯ３−ポリアクリルアミドゲル上で分離する。

ゲルはクーマシー・ブリリアント・ブルー（Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ　Ｂｒ１ｌｌｉ ａｎｔ　Ｂｌｕｅ）で染色し、蛋白質が見えるようにする。この方法により２種 類の蛋白質が単一のバンドとして分離される。トランスフェリンの分子量はおよ そ８０ｋＤである。トランスフ、ｌＪン結合蛋白質の分子量はおよそ１００ｋ［ ］である。１００ｋＤ蛋白質のバンドは、切り出して凍結乾燥し、冷浸する。

３ｂ、髄膜炎菌トランスフ、ｌＪン結合蛋白質の単離実施例２ａの溶出物の代わ りに実施例２ｂの溶出物を用いる以外は、実施例３Ａと同様の操作を行う。

４、トランスフェリン結合蛋白質に対する抗血清実施例３ａおよび３ｂで得られ た微細粉末を別々に生理的食塩水に再懸濁し、同１ｆ７）フロイントのアジュバ ント　（初回注射用として完全アジュバン）；追加注射用としては不完全アジュ バント）と混合し、ニュー・イングランド・ホワイト（Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ 　Ｗｈｉｔｅ）種のメスのウサギに注射する。注射は２週間の間隔で行う。抗１ ００ｋＤ蛋白質抗体は、精製されたトランスフェリン結合蛋白質に対するウェス タンブロッティングにより、３回目の注射から２週間後に検出できる。

（１９９０）にしたがって単離され、標準的な操作（Ｍａｎｉａｔｉｓら＋’　 １９８２）により超音波ら、１９８２）。連結されたＤＮＡはＰｒｏｍｅｇａ製 キットを用いてパッケージされる。

−４６（１９９０）にしたがって単離され、制限エンドヌクレアーゼＨｉｎｃＩ Ｉで消化される。

ＥｃｏＲＩリンカ−を添加し、得られたＤＮＡ分子をＥｃｏＲＩで消化して、Ｂ ｃｏＲＩ消化λ−Ｚａｐ　（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ製）に連結させる。連結され たＤＮＡはＰｒｏｍｅｇａｉｉＩキットを用いてパッケージされる。

６ａ、発現ライブラリーの免疫学的スクリーニング実施例５ａおよび５ｂのライ ブラリーから得られたおよそ５００．０００のプラークを、ピコブルー・イムノ ロジカル・スクリーニング・キット（Ｐｉｃｏｂｌｕｅｌｎｍｕｎｏｌｏｇｉｃ ａｌ　Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ　Ｋｉｔ）に添付されているＳｔｒａｔａｇｅｎｅの プロトコールに記載されている免疫学的スクリーニング法により選別する。要約 すると、−吹拭血清をＳｔｒａｔａｇｅｎｅ製（Ｌａ　Ｊｏｌｌａ、　ＣＡ）よ り入手可能なＥ、　ｃｏｌｉ／ファージ溶解物に、添付のプロトコールにしたが って吸着される。およそ５　ｘｌＯ’　ｐｆｕ　（プラーク形成単位；　ｐｌａ ｑｕｅ　ｆｏｒｍｉｎｇ　ｕｎｉｔｓ）をＢ、　ｃｏｌｉ宿主菌株であるＹ１０ ９０にプレートする。ｌｏｍＭのイソロビルチオガラクトシド（ＩＰＴＧ）に浸 漬したニトロセルロースフィルターをプレートにのせ、続いて４２℃で３〜４時 間インキュベートする。そして、フィルターを除去した後でプレートを一晩イン キユベートし、トリス緩衝化生理食塩水および０．０５％ツイーン（Ｔｗｅｅｎ ）　−２０（ＴＢＳＴ）で洗浄して、トリス緩衝化生理食塩水および５％ウシ血 清アルブミンで１時間ブロックする。その後、１：２００に希釈した吸着−吹拭 体でフィルターを１時間インキュベートする。−吹拭体と共にインキュベートし た後、フィルターをＴＢＳＴで十分洗浄し、それから二次抗体（１：３０００に 希釈したアルカリ性フォスファターゼとコンジュゲートしたヤギ抗ウサギ抗体、 Ｂｉｏ−Ｒａｄより購入）で１時間インキュベートする。その後、フィルターを ＴＢＳＴで十分洗浄し、最後に０．３ｍｇ／−二トロブルーテトラゾリウム（Ｎ ＢＴ）　、０．１５＋ｎｇ／ｍｌ！　５−ブロモ−４−クロロ−３−インドイル フォスフェート（ＢＣＩＰ）　、１００ｍＭ　トＵス（ｐ）１９．８）　、１０ ０ｍＭ　ＮａＣＣ５ｍＭ　ＭｇＣｌ２テ十分ニ発色Ｈ関するまでインキュベート する。

トランスフェリン結合蛋白質特異的抗血清に結合しているプラークを採取し、そ の他の非反応プラークから純別する。精製プラーク由来のＤＮＡを単離し、陰イ オン交換クロマトグラフィー（Ｑｉａｇｅｎ、　５ｔｕｄｉｏ　Ｃ１ｔｙ、　Ｃ Ａより購入のカラム）を用いて精製する。

６ｂ、ＤＮＡプローブを用いた発現ライブラリーのスクリーニング実施例５ａお よび５ｂのライブラリーから得られたプラークもまた、標識化ＤＮＡプローブを 用いて選別される。オリゴマーＴｆＢＰ　１．２．３または５は、ジゴキシジェ ニン−１１−ｄｌｌＴＰおよびＤＮＡティリングキット　（共に、Ｂｏｅｈｒｉ ｎｇｅｒＭａｎｎｈｅｉｎ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ　（ＢＭＢ）製）を用い て非放射性的にｉａ識化される。オリゴマーの配列は以下のとおりである： ＴＦＢＰ　１　：　ＧＡＧ　ＣＣＣＣＣＣＡＡＴ　ＧＣＧ　ＣＣＧ　ＣＴＴＦＢ Ｐ２　：　ＡＧＣＧＧＣＧＣＡ　ＴＴＧ　ＧＣＧ　ＧＧＣＴＣＴＦＢＰ３　：　 ＧＧＧ　ＧＣＧ　ＣＡＴ　ＣＧＧ　ＣＧＧ　ＴＧＣＧＧＴＦＢＰ５　：＾ＡＡ　 ＡＣＡ　ＧＴＴ　ＧＧＡ　ＴＡＣＣＡＴ　ＡＣＤＮＡ標識化右よび検出のプロト コールはＢＭＢより遺伝子非放射性ＤＮＡｍ識°検出キット（Ｇｅｎｉｕｓ　ｎ ｏｎｒａｄｉｏａｃｔｉｖｅ　ＤＮＡｌａｂｅｌｉｎｇ　ａｎｄ　ｄｅｔｅｃｔ ｉｎｇ　ｋｉｔ）として入手可能である。一方、同様のオリゴマーは標準的な技 術によりα−３２Ｐ−ｄＣＴＰおよびＢＭＢのＤＮＡティリングキットを用いて 放射性に標識化される（Ｍａｎｉａｔｉｓら、１９８２）。

７、ＤＮＡの増幅および塩基配列決定 実施例５または６で得られたＤＮＡは、ＰＣＲ法（Ｓａｍｂｒｏｏｋら４ｉ、　 ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ　：　Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕ ａｌ、第２版、　Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｐｒｅｓｓ（１９８ X））に よりλ−ｇｔｌｌ特異性オリゴマーをアンプライマーとして用いて増幅される。

したがって、増幅される挿入部は、ブルースクリプトベクター（Ｂｌｕｅｓｃｒ ｉｐｔ　ｖｅｃｔｏｒ）（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ製）中で、標準的な技術（Ｍａ ｎｉａｔｉｓら、　１９８２）を用いてクローン化され、Ｓａｎｇｅｒら（Ｐｒ ｏｃ、Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ　ＵＳＡ　７４．５４６３−５４６７（ １９７７））のジデオキシ・チェーン・ターミネーテインク法によりシーケナー ゼ（０口１ｔｅｃｌ　ＳｔａｔｅｓＢｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏｒｐ、製、　 Ｃ１ｅｖｅｌａｎｄ、　０）りを用いて塩基配列が決定される。

実施例６および７の一般的な方法を用いて、およそ１．０ｋｂｐの染色体５ａｕ ３ＡＩフラグメントを同定する。このフラグメントをベクターｐＨ５Ｓ６−ＧＣ ＵのＢａｍＨＩ部位にクローン化する（已１ｋｉｎｓら、　Ｖ、Ｂａｃｔｅｒｉ ｏｌ、　１７３．３９１１−３９１３（１９９１））　（ＧＣｌｌとは、淋菌取 り込み配列（ｇｏｎｏｃｏｃｃａｌ　ｕｐｔａｋｅ　５ｅｑｕｅｎｃｅ）として 知られている１ｏｂｐのヌクレオチド配列がベクターに含有されていることを意 味する。）。このヌクレオチド配列は、淋菌への覆枠異的なりＮＡの取り込みを 仲介することが知られている（ＩＩｉＩｋｉｎｓら）。このクローニングのため の宿主菌株はＨＢＩＯＩであった。得られたクローンはｐＨＮｃＨ４０３である ことが知られている。

ｐＵＮｃＨ４０３の挿入部は、ＫｒａｆｔらによるＢｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ 　６−、５５４−５５６（１９８８）に記載される方法により、二本鎖鋳型を用 いてその全体が配列決定される。ヌクレオチド配列は、シーケナーゼ（Ｓａｑｕ ｅｎａｓｅ、登録商標）　（ｌｌｎｉｔｅｄ　５ｔａｔｅｓ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉ ｃａｌｓ製）を用いて、Ｓａｎｇｅｒのジデオキシ法により決定される。ｐ［Ｉ Ｎｃ８４０３中の５ａｕ３ＡＩフラグメントのヌクレオチド配列を第２Ａ図に示 す。第２Ａ図の１〜５５８番目のヌクレオチドノ配列は、ｐＵＮｃＨ４０１トｐ ＵＮｃ）１４０２　（第１図）およびｐＵＮ［：）１４０３　（第２Ａ図）の重 複部位を示している。ヌクレオチド６５９番目からヌクレオチド１番目に向かう 一つのオーブンリーディングフレームが存在する。したがって、メチオニン残基 をコード化するヌクレオチド６９番目（第２Ａ図に示されるものと相補的な鋼上 ）から始まるコドンは遺伝子の５“末端である。

９、１００ｋＤ）ランスフェリン結合蛋白質の構造および機能の証明１００ｋＤ 　）ランスフェリン結合蛋白質遺伝子の不活性化の効果を調べるために、５ｅｉ ｆｅｒｔらによるＧｅｎｅｔｉｃ　Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ、　Ｐｒ１ｎｃｉｐ ａｌｓ　ａｎｄ　ＭｅｔｈｏｄｓおよびＳｅｔｌｏｗB Ｊ、　Ｋ、およびＨｏ１ｌｅａｎｄｅｒ、　Ａ、編のＰｌｅｎｕｍ　Ｐｒｅｓｓ 、　Ｎ、　Ｙ、、第８巻、　１２３−１３４頁に記載のプロトコールにしたがっ て、トランスポゾン挿入部をｐＵＮｃＨ４０３の挿入部の長さに合わせて単離す る。ｍＴｎ３ＣＡＴ　）ランスポゾンをシャトル突然変異誘起によりＢ、　ｃｏ ｌｉに挿入し、それから突然変異体を作製するためにＦＡ１９においてクロラム フェニコール耐性形質転換体を選択する。ｍＴｎ３ｃＡＴ　）ランスポゾンにつ いては、５ｅｉｆｅｒｔらによりｍ−Ｔｎ３　（Ｃｍ）として述べられている。

その後、突然変異体を、唯一の鉄供給源としてのトランスフェリン上での増殖能 力およびウェスタンプロットによりアッセイされる１ｏｏｋＤ蛋白質の発現能力 により評価する。その実験の結果を第３図に示す。「Ｉ」の４４．３７および２ ４で示される位置にあるトランスポソン１００ｋＤ蛋白質の発現およびトランス フェリン上での増殖能力を共に失わせる。しかしながら、ｒＡＪ位置にあるトラ ンスポゾンはトランスフェリン上で幾分か増殖させ、いくつかの検出可能な元来 の長さのトランスフェリン結合蛋白質を発現させる。これらの結果より、６５９ 位（第２Ａ図参照）にある逆向きの挿入部は野生型の長さの蛋白質を発現させる ので、１００ｋＤ蛋白質をコード化している構造遺伝子はこの位置から始まる、 という仮定が確認される。発現が、突然変異体ｒＡＪ中の野生型レベルで検出さ れないという事実から、推定上の開始コドンの逆向きの領域が１００ｋＤ蛋白質 をコードする遺伝子の調節に重要であることがわかる。

１０、髄膜炎菌ゲノムライブラリーの構築および選別９５ｋＤ髄膜炎菌トランス フ工ｌＪン結合蛋白質遺伝子は３工程でクローン化された。

第１工程では、淋菌の抗血清を用いて、λ−Ｚａｐ　ｎライブラリー由来の１． ３ｋｂのＨｉｎｃＩＩ／ＢｃｏＲＩフラグメントを同定した（第４図参照）。こ のフラグメントのヌクレオチド配列を第５図に示す。推定上の開始コドンを矢印 で示すが、これはまた転写の方向を示すものでもある。先に述べたリポソーム結 合部位には下線を引いである。１．３ｋｂフラグメントには約５ｏｏｂｐの９５ ｋＤ蛋白質構造遺伝子が含まれている。このクローンは、髄膜炎菌株ＦＡＭ２０ 染色体の単一の５ｋｂＣ１ａＩフラグメントにハイブリダイズした。ベクターｐ ）ＩＳＳ６−ＣＣＵ　（実施例８に記載）における部分的な５ｋｂＣＩａＩライ ブラリーが構築され、プローブとして１．３ｋｂフラグメントを用いて５ｋｂ［ ：１ａＩフラグメントをクローン化した。このＣ１ａ　Ｉフラグメントの部分制 限地図により、このフラグメントは構造遺伝子船隊をコードしないことが示唆さ れた。したがって、第３工程において、３．５ｋｂのＣ１ａ　Ｉ　／ＥｃｏＲＩ フラグメント（第２工程で得られた５ｋｂのＣ１ａ　Ｉフラグメントから産生） をプローブとして用いたところ、λ−Ｘａｐ　ＩＩライブラリー（Ｓｔｒａｇａ ｇｅｎｅ！Ｉｔ！Ｉ）由来の隣接するＨｉｎｃＩＩフラグメントのクローニング が行われた。このＨｉｎｃｎフラグメントは約３．５ｋｂの長さであり、おそら ＜　９５ｋＤ蛋白質構造遺伝子の残部をコードするものである。

この３．５ｋｂ　ＨｉｎｃｌＩフラグメントは、Ｂ、　０ｚｋａｙｎａｋおよび Ｓ、　Ｄ、　ＰｕｔｎｅｙによるＢｉｏｔａｃｈｎｉｑｕｅｓ　’Ｆ４．７７０ （１９８７）に記載されているように、エクソヌクレアーゼ（Ｂｘｏｎｕｃｌｅ ａｓｅ）　ｍおよび■を用いて一定方向性の欠失を起こすことにより、ヌクレオ チド配列が決定された。

１１、９５ｋＤ）ランスフェリン結合蛋白質の構造および機能の証明髄膜炎菌の ９５ｋＤ蛋白質遺伝子を突然変異させるために、１．３ｋｂのＨｉｎｃＩＩ／Ｂ ｃｏＲＩフラグメントを用いた。ｍＴｎ３ＣＡＴ　）ランスポゾンの代わりに出 釦３ｅｒｍ　）ランスポゾンを１．３ｋｂクローンに導入した以外は、実施例９ に記載されているのと同様のシャトル突然変異操作を用いた。ｍＴｎ３ｅｒｍ　 ）ランスボゾンは、実施例９に記載のｍＴｎ３ＣＡＴ　）ランスポゾンを修飾し てエリスロマイシン耐性を付与することにより作製された。この修飾によりエリ スロマイシン耐住髄腹炎菌形質転換体が選択できるようになる。これらの形質転 換体は、実施例９で記載されたようなトランスフェリンプレート上での増殖能力 により選別された。この突然変異誘起実験の結果を第６図に詳細に示す。ｍＴｎ ３ｅｒｍ挿入部および２は、９５ｋＤ蛋白質の発現およびトランスフェリンプレ ート上でのクローンの増殖能力を完全に失わせたが、ｍＴｎ３ｅｒｍ挿入部３お よび４は、トランスフェリン上での増殖が幾分か見られ、ウェスタンプロット上 にいくらかの９５ｋＤ蛋白質を示した。ヌクレオチド配列決定および突然変異誘 起のデータから鑑みて、ｍＴｎ３ｅｒｍ挿入部」および２は、各々構造遺伝子お よびプロモーター領域中に存在することは明らかであるが、一方、挿入部３およ び４は、発現の正の調節領域に含まれるであろう逆向きの領域中に存在すると思 われる。

補足引用文献 請求の範囲に記載の発明は、明細書および容易に入手可能な引用文献および出発 物質にしたがって実施可能である。しかし、発明の実施および利用が容易になる ように、以下の細胞系を＾ｍｅｒｉｃａｎ　Ｔｙｐｅ　Ｃｕ１ｔｕｒｅ　Ｃｏ１ １ｅｃｔｉｏｎ、　Ｂｅｔｈｅｓｄａ。

Ｍａｒｙｌａｎｄに１９９０年７月１６日に寄託している：髄膜炎菌細胞系ＦＡ Ｍ１８　（取得番号ＡＣＴＴ　５５０７１）髄膜炎菌細胞系ＦＡＭ２０　（取得 番号ＡＣＴＴ　５５０７２）淋菌細胞系ＦＡ１９　（取得番号ＡＣＴＴ　５５０ ７３）。

さらに、有用なプロトコールおよび情報を含む以下のパンフレットが本明細書の ファイルヒストリーで利用できる。

“Ｐｒｅｄｉｇｅｓｔｅｄ　Ｌａｍｂｄａ　Ｘａｐ／Ｂｃｏ　ＲＩ　Ｃｌｏｎｉ ｎｇ　Ｋｉｔ　Ｉｎ５ｔｒｕｃｔｉｏｎ　Ｍａｎｕａｌ、”Ｓｔｒａｔａｇｅｎ ｅ、　Ｌａ　Ｊｏｌｌａ、　Ｃａ１ｉｆｏｒｎｉａ　（Ｎｏｖｅｍｂｅｒ　２０ ．１９８７）　；“Ｇｉｇａｐａｃｋ　Ｐｌｕｓ”　（ｆｏｒ　ｐａｃｋａｇｉ ｎｇ　ｒａｃｏｍｂｉｎａｎｔ　ｌａｍｂｄａ　ｐｈａｇｅ）、　Ｓｔｒａｔ≠ ■■獅■B しａ　Ｊｏｌｌａ、Ｃａ１ｉｆｏｒｎｉａ　（Ａｐｒｉｌ　２５．　１９８８） 　：’ｐｉｃｏＢｌｕｅ　Ｉｍｍｕｎｏｓｃｒｅｅｎｉｎｇ　Ｋｉｔ”　Ｉｎ５ ｔｒｕｃｔｉｏｎ　Ｍａｎｕａｌ、　’　ＳｔｒａｔａｇｅｎｅA　Ｌａ Ｊｏｌｌａ、　Ｃａ１ｉｆｏｒｎｉａ　（Ｍａｙ　１９．１９８９）　；および “Ｇｅｎ１ｕｓ　Ｎｏｎｒａｄｉｏａｃｔｉｖｅ　ＤＮＡ　Ｌａｂｅｌｉｎｇ　 ａｎｄ　Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ　Ｋｉｔ、　”　Ｂｏｅｈｒｉ獅■■■ Ｍａｎｎｈｅｉｍ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ、Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ、Ｉ ｎｄｉａｎａ　（Ｊａｎｕａｒｙ、１９８９）。

第１図 １　ＡＧＣＡＡＡＧＣＣＴ　ＣＣＧＣＡＣＣＧこＣＧ入ＴＧＣＧＣＣＣＣＧＣＣ ＡＧＣＧＣＧＡ　ＴＧＧＡＴＴＧＧＧ７５１　人ＡＧＣＣＣＣＣＧＧ　ＴＴＴＴ ＴＧＣＣＧＧ　ＡＡＴＡＧＧＣＧＧＴ　ＴｒＴＡＣＴＣＴＧＡ　ＡＴＧＣＣＣＣ ＡＣ？１０１　ＧＣ（ＴＧＣＣＴＴＣＣＣＣＧＡＴＡＡＣＡ　ＴＣＧＴＣＧＧＣ ＧＧ　ＴＴＴＴＧＧ７ＴＴＧ　Ａ入ＡＴＧＣＧＡＣＣ１５１ＧＡＧＣＣＣＧＣＣ Ａ　ＡＴＧＣＧＣＣＧＣＴ　ＧＣＣＴＴＧＴＴＣＧ　ＡＣＣＧＡＧＴＴＴＧ　Ａ ＧＣＣＴＴ丁０ＣＴ３０１　ＧＴＡＴＴＴＧＣＧＣＣＡＡＧＣＣＧＴＣＣＡＣＣ ＧＴＣＡＪＧＧ　ＡＧＡＣＧＣＧＧＴＴ　ゴ７ＴＧＴＣＣｋ７に３５１　ＣＣＧ ＣＧＴＡＴＣＧ　ＡＧＴＡＧＣＣＣＧＡ　ＧＣＴＴＧ（ＧＣＣＧ　ＣＧ：Ｃ（Ｃ ＴＧＴＴ　ＣＧＡＣＧＡＣＧＧＣ４０１ＧＡＴＧＣＣＧＧＧＧ　ＴＣＧＴＡＡＣ ＧＣＧ　ＴＣＡＧＧＴＣＧＣＧ　ＧＡＴＧＴＣＧＡＧＴ　ＡＣＣＴＧＴ？ＣＣＴ ４５１　ＴＧＣＴＧＧＡＧＧＧ　ＴＧＴＣＧＧＣＧＧＴ　ＴＴＴＧＡＣＣ入ＡＴ 　ＴＴＧＣＣＣＡＡＡＣＣＧＧＴ丁＾ＣＴＴＣ５０１ＧＴＴＡＴＣＧＣＧＧ　Ｃ ＧＧＧＴＴＴＴＣＴ　ＧＴＴＴＴＴｒＧＧＣＴＴｒＴ入ＣＣＴＧＴ　ＡＴＣ−Ｇ ＴＡＴＣＣＡ５５１　八ＣＴＧτττＴ 第２Ａ図 Ｉ　ＡＧＣＡＡＡＧＣＣＴ　ＣＣＧＣλＣＣＧＣＣＧＡＴＧＣＧＣＣＣＣＧＣＣ ＡＧＣＧＣＧＡ　ＴＧＧＡＴＴＧＧＧ丁５１　ＡＡＧＣＣＣＣＣＧＧ　ＴＴＴＴ ＴＧＣＣＧＧ　ＡＡＴＡＧＧＣＧＧＴ　ＴＴτ入ＣＴＣＴＧＡ　ＡＴＧＣＣＣＣ ＡＣＴｌｏｌ　ＧＣＣＴＧＣＣＴＴＣＣＣＣＧＡＴＡＡＣＡ　ＴＣＧＴＣＧＧＣ ＧＧ　ＴττＴＧＧＴＴτＧ　ＡＭＴＧＣＧ入ＣＣｌ３１　ＧＡＧＣＣＣＧＣＣ Ａ　ＡＴＧＣＧＣＣＧＣＴ　ＧＣＣＴＴＧＴＴＣＧ　ＡＣＣＧＡＧＴＴＴＧ　Ａ ＧＣＣＴＴＴＧＣＴ２０１　ＧＡＴＴＴＣＧ入ＣＡ　ＧＣＣＴＴＧＡＣＧＴ　Ｔ ＣＴＣＡＴＡＣＴＣＧＡＴＴＴＣＡＴＴＧ　ＡＴＴＧＣＧＣＣＧＣ２５１ＴＧＣ ＴＧＣＣＣＧＣＣＧＴＣＣＴＣＧＴＣＣＣＧＣＣＣＡＡＴＧ　ＣＣＧＣＣＴＧＣ ＧＣＧＴＧＴＡＧＧＡＣＴ３０１　ＧＴＡＴＴＴＧＣＧＣＣＡＡＧＣＣＧＴＣＣ ＡＣＣＧＴＣＡＪＧＧ　ＡＧＡＣＧＣＧＧＴＴ　ＴτＴＧＴＣＣＡＴ入３５１　 ＣＣＧＣＧＴＡＴＣＧ　ＡＧＴＡＧＣＣＣＧＡ　ＧＣＴＴＧＣＧＣＣＧ　ＣＧＣ ＣＣＣＴＧＴＴ　ＣＧＡＣＧ入ＣＧＧＣ４０１ＧＡＴＧＣＣＧＧＧＧ　ＴＣＧＴ ＡＡＣＧＣＧ　ＴＣＡＧＧＴＣＧＣＧ　ＧＡＴＧＴＣＧＡＧＴ　ＡＣＣＴＧＴＴ ＣＣＴ５５１　人ＣＴＣＴＴＴＴｔｃ　ｃセｇｔｇｃｔｔｇ、ｃｃｇｇｃｔｔｇ ｃａ　ｃａｔ、ｔｔｔｃｔｇｃ　ａｃａａｇｃｇｇｇｑ６０１　ａｇｅｇｃａｇ ｔｃａ　ｔｔａａａｇａｃａｇ　ｇｃａｔａａａａセａ　ｔｔｔａａｔｅｇｇａ 　ａｃａａａｔＢｔｇ６５１　ｃｔｇ℃ｔｇｃａｔａ　９ｔ−ｇｔｔｔｃｃｃｔ 　ａａｔｃｔｔｃｇｃｔ　ｔｔｃａｇａｃｇｇａ　ａｔｃｇｇａａｇｇａ７０１ 　ａｃｑａｅ９ｃｃ９ｔ　ｃｔｇａａｇｃｃｔｔ　ａｔｔｃｔｃｇａｔｔ　ｇｔ ｔｇｔｔｃｇｇｃ　ａｇｃｃｇｔｇｃｔｔ７５１　ａｔｔｔｃａｃａａｇ　ｃｔ ｔｔｔｇｇｅｇセ　ｔｔｃｇｃａｃｃｇａ　ａｔａｃｇａｃａｇｔ　ｔｇｅａｃ ｔｇｃｔｔ６０１　ｇｃｔｇａａｔｔｔｃ　ｃａセｔｇｃｃｇｇａ　ｔｔｃａａ ｃｔｇｔｔ　ｇｃａｔｔｔｔｔｃｇ　ｔｔｔｇｊｔｅａｔｔ８５１９ＣＣＣｇ９ ａｔａ９　ｇｃａａａｃｃａｃｃ　ｃｇｃｃｃａａｃｔｃ　ｔｔｃｇｇｃｇｔｔ ａ　ｇｇｃｃｃｇｃａａａ９０１　ａＪＬｃｅ９ｃｃｃＩ：９　ＣａＣＺｔＣｇ ｑ国際調査報告 １″＋ｍ＋ｎｍＭｌ＾−””’−’　”　ＰｒＴ、’ｌ’（０１’Ｉ’１Ａ１１ −４フロントページの続き （５１）　Ｉｎｔ、　Ｃ１，５識別記号　庁内整理番号Ｃｌ２Ｎ　１５／３１ Ｃ１２Ｐ　２１１０２　Ａ　８２１４−４ＢＣ８２１４−４Ｂ ＧＯＩＮ　３３１５６９　Ｆ　９０１５−２Ｊ３３１５７１　９０１５−２Ｊ ／／ＧＯＩＮ　３３１５３　Ｄ　８３１０−２Ｊ３３／９０　７０５５−２Ｊ （Ｃ１２Ｐ　２１１０２ Ｃ１２Ｒ１：１９） （Ｃ１２Ｐ　２１１０２ Ｃ１２Ｒ１：３６） Ｉ

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．（ａ）洗浄剤； （ｂ）ニトロセルロース／セルロースアセテート紙；および（ｃ）Ｎｅｉｓｓｅ ｒｉａ　ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅおよびＮｅｉｓｓｅｒｉａ　ｍｅｎｉｎｇｉｔ ｉｄｉｓ由来のその他の鉄調節蛋白質 を実質的に含有せず； トランスフェリンアフィニティーカラムにより単離され；Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ　 ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅに見出される分子量およそ１００ｋＤの鉄調節外層膜蛋 白質に対して惹起される抗血清と特異的に結合し；Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ　ｇｏｎ ｏｒｒｈｏｅａｅまたはＮｅｉｓｓｅｒｉａ　ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓにおけ るトランスフェリンレセプター機能において重要である、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ　 ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅまたはＮｅｉｓｓｅｒｉａ　ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ の外層膜に見出される鉄調節蛋白質、 およびそのような蛋白質の機能性アナログ。 ２．蛋白質がＮｅｉｓｓｅｒｉａ　ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅに見出され、かつ分 子量が１００ｋＤである、請求の範囲第１項記載の蛋白質。 ３．蛋白質がＮｅｉｓｓｅｒｉａ　ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓに見出され、かつ 分子量が９５ｋＤである、請求の範囲第１項記載の蛋白質。 ４．蛋白質がＮｅｉｓｓｅｒｉａ　ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅまたはＮｅｉｓｓｅ ｒｉａ　ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓのトランスフェリンレセプターである、請求 の範囲第１項記載の蛋白質。 ５．蛋白質が標識化されている、請求の範囲第１項記載の蛋白質。 ６．（ａ）洗浄剤； （ｂ）ニトロセルロース／セルロースアセテート紙；および（ｃ）Ｎｅｉｓｓｅ ｒｉａ　ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅおよびＮｅｉｓｓｅｒｉａ　ｍｅｎｉｎｇｉｔ ｉｄｉｓ由来のその他の鉄調節蛋白質 を実質的に含有せず； トランスフェリンアフィニティーカラムにより単離され；Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ　 ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅに見出される分子量およそ１００ｋＤの鉄調節外層膜蛋 白質に対して惹起される抗血清に特異的に結合し；Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ　ｇｏｎ ｏｒｒｈｏｅａｅまたはＮｅｉｓｓｅｒ　ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓのトランス フェリンレセプター機能において重要である、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ　ｇｏｎｏｒ ｒｈｏｅａｅまたはＮｅｉｓｓｅｒｉａ　ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓの外層膜に 見出される鉄調節蛋白質およびそのような蛋白質の機能性アナログに対して惹起 される単離抗体。 ７．抗体が試料中のＮｅｉｓｓｅｒｉａ　ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅまたはＮｅｉ ｓｓｅｒｉａ　ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓの存在の検出に適当である、請求の範 囲第６項に記載の抗体。 ８．抗体がＮ．ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅまたはＮ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓに 感染した哺乳動物の処置に適当である、請求の範囲第６項に記載の抗体。 ９．抗体の蛋白質への結合がＮｅｉｓｓｅｒｉａ　ｇｏｎｏｒｒｏｅａｅまたは Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ　ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓの増殖を阻害する、請求の範囲 第６項に記載の抗体。 １０．抗体の結合が蛋白質のトランスフェリンレセプター機能をブロックする、 請求の範囲第６項に記載の抗体。 １１．抗体がモノクローナルである、請求の範囲第６項に記載の抗体。 １２．（ａ）洗浄剤； （ｂ）ニトロセルロース／セルロースアセテート紙；および（ｃ）Ｎｅｉｓｓｅ ｒｉａ　ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅおよびＮｅｉｓｓｅｒｉａ　ｍｅｎｉｎｇｉｔ ｉｄｉｓ由来のその他の鉄調節蛋白質 を実質的に含有せず； トランスフェリンアフィニティーカラムにより単離され；Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ　 ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅに見出される分子量およそ１００ｋＤの鉄調節外層膜蛋 白質に対して惹起される抗血清に特異的に結合し；Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ　ｇｏｎ ｏｒｒｈｏｅａｅまたはＮｅｉｓｓｅｒｉａ　ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓのトラ ンスフェリンレセプター機能において重要である、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ　ｇｏｎ ｏｒｒｈｏｅａｅまたはＮｅｉｓｓｅｒｉａ　ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓの外層 膜に見出される鉄調節蛋白質およびそのような蛋白質の機能性アナログの有効量 および薬学的に許容されるキャリアを含有するワクチン組成物。 １３．蛋白質がＮｅｉｓｓｅｒｉａ　ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅに見出され、かつ 分子量が１００ｋＤである、請求の範囲第１２項記載のワクチン。 １４．蛋白質がＮｅｉｓｓｅｒｉａ　ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓに見出され、か つ分子量が９５ｋＤである、請求の範囲第１２項記載のワクチン。 １５．（ａ）洗浄剤； （ｂ）ニトロセルロース／セルロースアセテート紙；および（ｃ）Ｎｅｉｓｓｅ ｒｉａ　ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅおよびＮｅｉｓｓｅｒｉａ　ｍｅｎｉｎｇｉｔ ｉｄｉｓ由来のその他の鉄調節蛋白質 を実質的に含有せず； トランスフェリンアフィニティーカラムにより単離され；Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ　 ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅに見出される分子量およそ１００ｋＤの鉄調節外層膜蛋 白質に対して惹起される抗血清に特異的に結合し；Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ　ｇｏｎ ｏｒｒｈｏｅａｅまたはＮｅｉｓｓｅｒｉａ　ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓのトラ ンスフェリンレセプター機能において重要である、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ　ｇｏｎ ｏｒｒｈｏｅａｅまたはＮｅｉｓｓｅｒｉａ　ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓの外層 膜に見出される鉄調節蛋白質およびそのような蛋白質の機能性アナログの有効量 および薬学的に許容されるキャリアを含有するワクチン組成物を宿主に投与する 工程を含む、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ　ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅまたはＮｅｉｓｓｅ ｒｉａ　ｍｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓのにより引き起こされる疾病に対して哺乳動物 を免疫する方法。 １６．（ａ）洗浄剤； （ｂ）ニトロセルロース／セルロースアセテート紙；および（ｃ）Ｎｅｉｓｓｅ ｒｉａ　ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅおよびＮｅｉｓｓｅｒｉａ　ｍｅｎｉｎｇｉｔ ｉｄｉｓ由来のその他の鉄調節蛋白質 を実質的に含有せず； トランスフェリンアフィニティーカラムにより単離され；Ｎｅｏｓｓｅｒｏａ　 ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅに見出される分子量およそ１００ｋＤの鉄調節外層膜蛋 白質に対して惹起される抗血清に特異的に結合し；Ｎｅｉｓｓｒｉａ　ｇｏｎｏ ｒｒｈｏｅａまたはＮｅｉｓｓｅｒｉａ　ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓのトランス フェリンレセプター機能において重要である、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ　ｇｏｎｏｒ ｒｈｏｅａｅまたはＮｅｉｓｓｅｒｉａ　ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓの外層膜に 見出される鉄調節蛋白質およびそのような蛋白質の機能性アナログに対して惹起 される単離抗体を哺乳動物に有効量投与することを含むＮ．ｇｏｎｏｒｒｈｏｅ ａｅまたはＮ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓにより引き起こされる疾病に冒されて いる哺乳動物を処置する方法。 １７．（ａ）洗浄剤； （ｂ）ニトロセルロース／セルロースアセテート紙；および（ｃ）Ｎｅｉｓｓｅ ｒｉａ　ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅおよびＮｅｉｓｓｅｒｉａ　ｍｅｎｉｎｇｉｔ ｉｄｉｓ由来のその他の鉄調節蛋白質 を実質的に含有せず； トランスフェリンアフィニティーカラムにより単離され；Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ　 ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅに見出される分子量およそ１００ｋＤの鉄調節外層膜蛋 白質に対して惹起される抗血清に特異的に結合し；Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ　ｇｏｎ ｏｒｒｈｏｅａｅまたはＮｅｉｓｓｅｒｉａ　ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓのトラ ンスフェリンレセプター機能において重要である、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ　ｇｏｎ ｏｒｒｈｏｅａｅまたはＮｅｉｓｓｅｒｉａ　ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ外層膜 に見出される鉄調節蛋白質、そのような蛋白質の機能性アナログおよびそのよう な蛋白質の機能性誘導体をコードするヌクレオチド配列。 １８．（ａ）（１）洗浄剤； （２）ニトロセルロース／セルロースアセテート紙；および（３）Ｎｅｉｓｓｅ ｒｉａ　ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅおよびＮｅｉｓｓｅｒｉａ　ｍｅｎｉｎｇｉｔ ｉｄｉｓ由来のその他の鉄調節蛋白質 を実質的に含有せず； トランスフェリンアフィニティーカラムにより単離され；Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ　 ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅに見出される分子量およそ１００ｋＤの鉄調節外層膜蛋 白質に対して惹起された抗血清に特異的に結合し；Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ　ｇｏｎ ｏｒｒｈｏｅａｅまたはＮｅｉｓｓｅｒｉａ　ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓにおけ るトランスフェリンレセプター機能に重要である、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ　ｇｏｎ ｏｒｒｈｏｅａｅまたはＮｅｉｓｓｅｒｉａ　ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ外層膜 に見出される鉄調節蛋白質およびそのような蛋白質の機能性アナログに対する抗 体を含有していると思われる試料と共に、請求項第１項に記載の蛋白質をインキ ュベートすること；（ｂ）該蛋白質を工程（ａ）のインキュベーション前、イン キニベーション中またはインキュベーション後のいずれかに標識化すること；お よび（ｃ）試料中の抗体に結合する該標識化蛋白質を検出することの工程を含む 、試料中のＮ．ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅまたはＮ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ特 異性抗体の存在を検出する方法。 １９．（ａ）（１）洗浄剤； （２）ニトロセルロース／セルロースアセテート紙；および（３）Ｎｅｉｓｓｅ ｒｉａ　ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅおよびＮｅｉｓｓｅｒｉａ　ｍｅｎｉｎｇｉｔ ｉｄｉｓ由来のその他の鉄調節蛋白質 を実質的に含有せず； トランスフェリンアフィニティーカラムにより単離され；Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ　 ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅに見出される分子量およそ１００ｋＤの鉄調節外層膜蛋 白質に対して惹起される抗血清に特異的に結合し；Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ　ｇｏｎ ｏｒｒｈｏｅａｅまたはＮｅｉｓｓｅｒｉａ　ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓにおけ るトランスフェリンレセプター機能に重要である、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ　ｇｏｎ ｏｒｒｈｏｅａｅまたはＮｅｉｓｓｅｒｉａ　ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ外層膜 に見出される鉄調節蛋白質およびそのような蛋白質の機能性アナログに対して惹 起される抗体と共に、Ｎ．ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅおよびＮ．ｍｅｎｉｎｇｉｔ ｉｄｉｓを含有していると思われる試料をインキユベートすること； （ｂ）該抗体をインキュベーション前、インキユベーシヨン中またはインキニベ ーション後のいずれかに標識化すること；および（ｃ）蛋白質に結合した抗体の 存在を検出することの工程を含む、試料中のＮ．ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅまたは Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓの存在を検出する方法。