JPH06500563A - 調節された浄化時間を有する修飾抗体 - Google Patents

Abstract

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Description

【発明の詳細な説明】 調節された浄化時間を有する修飾抗体 光朋り背景 光■の分野 本発明は修飾抗体に関する。詳しくは、本発明は、ヘテロ２官能価試薬による化 学的接合によって修飾された抗体、並びにガンおよび他の哺乳動物疾患の診断お よび治療におけるこれら修飾ＭＡｂの使用に関する。

従米技術少説明 抗イ札特にモノクローナル抗体（ｒＭＡｂＪ）の使用は、ガンの診断および処置 における非常に価値のあるアプローチへの可能性を有している。ＭＡｂの重要な 性質は、単一の抗原に対するその特異性である。

これまでに、腫瘍細胞抗原に特異的なＭＡｂが製造されてきている。またＭＡｂ は、放射性核種のような補助剤と効率的に結合し得ることも示されている。この 種の放射性標識ＭＡｂは、γカメラ画像形成または放射性免疫画像形成としても 知られる免疫シントグラフィ（ｉｎｕｕｎｏｓｃｉｎｔｏｇｒａｐｈｙ）による 腫瘍画像形成のような臨床データを提供するのに有用である。免疫シントグラフ ィでは、ＭＡｂにより認識される抗原を有する特異的組織または腫瘍の種類に対 してＭＡｂを結合させる。その後適切な技術の使用により、例えばゲルマニウム カメラの使用によって放射性核種を視覚化する。腫瘍および他の種類の組織の免 疫シントグラフィにおけるその応用を可能とするのは、ＭＡｂの独特の特異性で ある。

しかしながら、免疫シントグラフィにおけるＭＡｂの使用は、高いバックグラウ ンドレベルやその抗原に対するＮ１Ａｂの低い結合能力のために制限されていｔ ム実験的検討は、放射性標識ＭＡｂの生物分布は、抗体の特異性および浄化時間 を含む多くの因子に依存することを示唆している。免疫シントグラフィによる腫 瘍の有効な診断のためには、腫瘍細胞表面上で濃密かつ均一な抗原に結合する抗 体を選択することか必要である。また、免疫シントグラフィによる有効な診断に は、選択した抗体か暉瘍抗原に有効に結合すべきことも必要である。しかしなが ら、多くの場合適切な抗原に結合するＭＡｂは、要求される高い結合親和力を持 たない。更に、他のＭＡｂと比較して高い親和力で結合するようなＭＡｂを使用 したとしても、高いレベルの非特異的結合がなお生成し得て、この結果免疫シン トグラフィで使用した場合に高いバックグラウンドレベルとなる。したがって、 診断の道具としての免疫シントグラフィを改良するためには、ＭＡｂの結合の有 効性を改良する方法が必要となる。

更に、ＭＡｂの細胞毒性効果は、放射性核種、薬物または毒素との結合によって 顕著に増加させることができる。ＭＡｂの独特の特異性は、免疫治療の発展に希 望を与えるものである。免疫治療では、ＭＡｂを使用して生物学的に活性な薬品 を腫瘍細胞のような特定の望ましくない種類の細胞に配送し、これにより対象の 他の細胞に効果を与えることなく、望ましくない種類の細胞に効果を与える。

しかしながら、健全な組織に効果を与えることを回避するため、免疫治療では極 めて高い特異性の抗体が必要である。よって、ＭＡｂの特異性を増加させる方法 は、安全で有効な免疫治療の目標に到漣するために非常に有益である。

多くのＭＡｂは、対象への導入の後数日間、循環系に残存する。これは少なくと も２つの理由から望ましくない。１つの理由は、循環するＭＡｂにより免疫シン トグラフィにおいて高いバックグラウンドレベルが生成するというものである。

第２の理由は、放射性核種または他の潜在的に細胞毒性の薬品に結合した循環す るＭＡｂにより、長い路程の後には対象中に望ましくな（１詐用が生成し得ると いうものである。そこで、ＭＡｂの浄化時間を減少させる方法が必要となる。勿 論、減少かあまりに大きければ、結果的にＭＡｂがなし得るあるゆる有効な使用 の前に、ＭＡｂか除去されることとなる。よって、腫瘍または他の標的組織によ るＭＡｂの取込みに実質的に影響を与えることなく、ＭＡｂの浄化時間を減少さ せる方法が必要となる。

抗体の特異性および浄化時間の両者を決定するのに重要な１つの因子は抗体の形 態である。ここで使用するように、「無傷（ｉｎｔａｃｔ）　Ｊの抗体分子は、 ２つの重鎮および２つの軽鎖から構成される未修飾抗体分子を指すものとする。

無傷の全体の抗体分子は、図１の化学式の反応物側に認められる。図１から分る ように、無傷の分子はＦｃおよびＦ。ドメインに分割される。Ｆ。、断片の２価 形態であるＦ（ａｈ’）２は、プロテアーゼによるＦｅドメインの消化により製 造することかできる。

２つの重鎮（図１ではｒＨＪとして示す）は、１つ以上のジスルフィド結合によ って互いに保持される。無傷の分子では、これらのジスルフィド架橋は通常は還 元剤から保護されている。しか１７ながら、Ｆ０ドメインを除去することにより 、ジスルフィド架橋の容易な還元が可能であることが突き止められた。よって、 １価形態であるＦ　（ａｂ’　）は、穏やかな還元剤の作用によりＦ　（ａｂ’ 　）２から製造することかできる。パルハム・ビー、　ｒＢＡＬＢ／ｃマウス由 来のモノクローナルＩｇＧＬ　ＩｇＧ２ａおよびＩｇＧ２ｂの断片化に当って」 、Ｊ。

Ｉｍｍｕｎｏ！、１３１：　２８９５　（１９８３）（この開示を参考によりこ こに取入れる）には、Ｆ（ａｂ’）およびＦ（ａｂ’）２の製造方法が記載され ている。

この方法で生起すると考えられる変化を表示すると、図１に示す化学式のように なる。

ＦＣは、抗体分子の非特異的結合の多くに関与することが認められている。また 、断片の分子量は糸球体によるろ過の閾値より小さく、このため断片の迅速な除 去が可能であるとも考えられている。したがって、放射性画像形成における使用 のために抗体の浄化時間を増加させる１つのアプローチは、無傷の抗体を種々の 断片、例えばＦａｂおよびその２価形態、Ｆ（ａｂ’）２に分解することであっ た。

予期されるように、これらの断片は体から非常に迅速に浄化されるため、その有 用性は低減される。更に、これらの断片は、結果的に、無傷の抗体と比較して、 腫瘍または他の標的組織による低減された取込みをすると考えられる。よって、 免疫シントグラフィにおけるこれらの断片の使用は、無傷のＭＡｂを用いる場合 と比較し、より良好な浄化およびバックグラウンド比率に関してより高い標的組 織を与え得るにも拘らず、ＭＡｂか結合し得る抗原を含む標的組織中のＭＡｂの 絶対濃度が、いずれの断片を用いた場合も無傷のＭＡｂを用いるより、多くとも せいぜい３倍以上までであることが認められた。

更に、両者の種類の断片は血液流から非常に迅速に除去される。よって、これら の断片を使用する診断または治療技術については、有効性の時間は非常に短い。

ヘテロ２官能価試薬は、異なる反応に参与することのできる２つの基を有する試 薬である。例えば、スクシニミジル３−（２−ピリジルジチオ）プロピオネート （ＳＰＤＰ）は、そのＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステル基がアミノ基と反 応し、２−ピリジルジスルフィド構造が脂肪族チオールと反応するという点でヘ テロ２官能性である。

オルランディら、［２−ピリジルジスルフィド基の導入後の抗腫瘍モノクローナ ル抗体の結合反応性の変イｔｌＪＸＨｙｂｒｉｄｏｍａ　５：１−８（１９８６ ）には、ヒト卵巣カルシノーマに対して高められたＭＡｂの試験管内結合の増加 を、ヘテロ２官能価試薬、５ＰＤＰとの化学的接合の後に得ることができたこと が報告されている。

オルランディらにより使用された接合されたＭＡｂは、平均して１分子当り１１ のＦＤＰ基を有していた。オルランディらは、修飾されたＭＡｂは、未修飾ＭＡ ｂによっては検出されない分子を検出できる程度に、その試験管内結合活性を増 加させることを認めた。これらの研究者は、生体内での接合したＭＡｂの使用の 検討は報告していない。更に、これらの研究者は、非常に少数の抗原性部位を有 する分子が、接合されたＭＡｂによって検出されると考えていた。よって、ＰＤ Ｐ修飾ＭＡｂは、未修飾対応物と比較し、大きく低減された標的細胞特異性を有 するものであった。

したがって、前記の進展にも拘らず、腫瘍中に蓄積する抗体のより大きい絶対濃 度を可能とすると共に、血液プールがらの相対的に迅速な浄化時間を有しくただ し治療または診断の有効性を低減する程は迅速ではない）、腫瘍抗原に対するよ り大きい特異的活性を示す修飾抗体断片がなお必要とされている。

図面の簡単な説明 図１は、Ｆ　（ａｂ’　）およびＦ（ａｂ’）２断片を製造する方法で起こると 考えられる変化の図による表示を示す。

図２は、胸腺欠損ヌードマウスにおける放射性標識ＭＡｂＬｙｍ−１の異なる調 製物の全体保持量を示す。

図３は、注射後７日目のヒトリンパ腫担持ヌードマウスにおけるＭＡｂＬｙｍ図 ４は、注射後７日目のヒトリンパ腫担持ヌードマウスにおけるＭＡ　ｂ　Ｌ　ｙ 　ｍ−１および修飾Ｌｙｍ−１の腫瘍／器官比率の生体内分布を示す。

図５は、注射後５日目のヒトリンパ腫担持ヌードマウスにおけるＭＡ　ｂ　Ｌ　 ｙ　ｍ−ＩＦ　（ａｂ′）　、、および修飾Ｌｙｍ−１の注射投与量／グラムを ％として、その生体内分布を示す。

図６は、注射後５日のヒトリンパ腫担持ヌードマウスにおけるＭＡｂＬｙｍ＝Ｉ Ｆ（ａｂ’）、および修飾Ｌｙｍ−１の腫瘍／器官比率として、生体内分布を示 す。　図７は、ｌ−１３１標識無傷Ｌｙｍ−１の注射後７日目に得られた画像を 示す。　図８は、ｌ−１３１標識修飾Ｌｙｍ−１の注射後７日目に得られた画像 を示す。　図９は、ｌ−１３１標識修飾Ｌｙｍ−１の注射後７日目に得られた画 像を示す。　図１０は、ｌ−１３１標識修飾Ｌｙｍ−１の注射後５日目に得られ た画像を示す。　図１１は、胸腺欠損ヌードマウスにおける放射性標識モノクロ ーナル抗体８７２．３の異なる調製物の全体保持量を示す。

図１２は、注射後４日目のＬＳ１７４Ｔ結腸カルシノーマ担持ヌードマウスにお けるＭＡｂＢ７２．３および修飾８７２．３の注射投与１グラムを％として、そ の生体内分布を示す。

図１３は、注射後４日のＬＳ１７４Ｔ結腸カルシノーマ担持ヌードマウスにおけ るＭＡｂＢ７２．３および修飾８７２．３の腫瘍／器官比率として生体内分布を 示す。

図１４は、ｌ−１３１標識修飾８７２．３の注射後１日目に得られた画像を示す 。

図１５は、ｌ−１３１標品修飾Ｂ７２．３の注射後４日目に得られた画像を示す 。

図１６は、胸腺欠損ヌードマウスにおける放射性標識ＭＡｂＴＮＴ−１の異なる 調製物の全体保持量を示す。

光照Ｑ要旨 本発明は、Ｆ　（ａｂ’　）＝断片の浄化速度と同じ種類の無傷の抗体との間の 生体内浄化速度を有する、ヘテロ２官能価試薬により化学的に修飾された抗体を 提供するものである。好適な態様では、ヘテロ２官能価試薬を５ＰＤＰとし、モ ノクローナル抗体、ヒト抗体、遺伝子操作による抗体、キメラ抗体、合成抗体お よびポリクローナル抗体よりなる群がら抗体を選択する。

また本発明は、哺乳動物中の特異的組織の画像を形成する方法も提供するもので あり、これは特異的組織に対する抗体を取得し、ヘテロ２官能価試薬との接合に よりこの抗体を修飾し、さらにこの抗体に標識を導入し、それを哺乳動物に導入 して、前記抗体上の標識を明らかにする画像を生成することからなる。好適な態 様では、抗体は、平均して抗体１分子当り約１つのＦＤＰ基を用いる接合によっ て修飾さべγ線を放射する放射性核種を用いて標識する。

更に本発明は、哺乳動物中の疾患状態を処置する方法を提供するものであり、こ れは哺乳動物の疾患組織に対して特異的な抗体を取得し、ヘテロ２官能価試薬お よび生物学的に活性な分子との化学的接合によりその抗体を修飾し、それを哺乳 動物に投与することからなる。好適な態様では、平均して抗体分子当り１つのＦ ＤＰ基を用いる化学的接合によって抗体を修飾し、植物毒素、薬物、放射性核種 およびキレートよりなる群がら生物学的に活性な分子を選択する。

また本発明は、本発明の方法と共に使用する薬学的組成物も提供するものである 。この組成物は、薬学的に許容し得るキャリヤ（担体）、賦形剤または基剤中に 修飾抗体を含む。

元型Ｑ詳細な説明 本発明者は、５ＰＤＰのようなヘテロ２官能価試薬を用いる接合によるＭＡｂ。

ヒト抗体、遺伝子操作による抗体、キメラ抗体、合成抗体およびポリクローナル 抗体を含む抗体の修飾が、抗体が結合し得る抗原を含む標的細胞中で、修飾抗体 の驚くべき増強された蓄積をもたらすことを見い出した。スルホスクシニミジル ２−（ｐ−アジドサリチルアミド）エチル−１，３′　−ジチオプロピオネート （ＳＡＳＤ）、スルホスクシニミジル２−（ｍ−アジド−０−ニトロベンズアミ ド）−エチル−１，３′−ジチオプロピオネート（ＳＡＮＤ）、スルホスクシニ ミジル（４−アジドフェニル−ジチオ）プロピオネート（スルホ５ＡＤＰ）およ び２−アミノチオランＨＣＩ（トラウドの試薬）　（Ｔｒａｕｔ’ｓ　ｒｅａｇ ｅｎｔ）等を含む他の＾、テロ２官能価試薬も、本発明によって抗体と接合レニ 場合、５ＰＤＰを用いる抗体の接合によりここに示すのと同様の結果を与えると 考えられる。

修飾抗体の増強された蓄積は、増幅された特異的結合能力によると考えられる。

本発明者は、平均して抗体〕１分子当り唯１つのＰＤＰ基を接合することにより 、未修飾抗体と比較し、その標的細胞に対する分子の特異性の劇的な増加か起こ ることを見い出した。

本発明者はまた、１つ以上のＦＤＰ基の接合によるＩｇＧの修飾は、正常組織か らの浄化も有利に増強することも見い出した。この効果の如何なる特定の説明に も拘束されることを意図するものではないが、これは５ＰＤＰを用いる修飾が糸 球体ろ過の閾値より小さい分子量を有する形態への抗体の断片化を導き、これに より断片の迅速な除去が可能となるためと考えられる。抗体の１価形態への抗体 の断片化が起こることは可能である。結果的に得られる断片の正確な形態が如何 なるものであわ、これらの断片の除去は、有利なことに修飾抗体の診断または治 療的有効性を低減する程には迅速ではない。

本発明の修飾抗体は、Ｆ　（ａｂ’　）またはＦ（ａｂ’）２のような抗体の断 片と比較し、有利なことに驚くべき増強された診断および冶療仲効性を有する。

以下の実施例は、平均して１つのＦＤＰ基をモノクローナル抗体へ導入する例示 的な方法を示すものである。

実施例ｌ ５ＰＤＰによ４Ｌ１コニ１Ω修飾 ニブスティン・ニー・エルら、「ヒトＢ−リンパ球および誘導された腫瘍と反応 性で免疫診断および免疫反応性の潜在能力を有する２つの新しいモノクローナル 抗体、Ｌｙｍ−１およびＬｙｍ−２Ｊ、Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ、４７：８３０− ８４０　（１９８７）　（その開示を参考によりここに取入れる）における方法 で、Ｌ　ｙｍ　１　（Ｉ　ｇＧ２−）、Ｂ細胞リンパ腫に対するモノクローナル 抗体を取得した。カールソン・ジエイら、「蛋白質チオール化および可逆的蛋白 質−蛋白質接合二Ｎ−スクシニミジル３−（２−ピリジルジチオ）プロピオネー ト、新しいヘテロ２官能価試薬」、Ｂｉｏｃｈｅｍ、Ｊ、１７３ニア２３−７３ ７　（１９７３）（その開示を参考によりここに取入れる）における方法で、５ ＰＤＰ、抗体上の遊離のアミノ基と反応するヘテロ２官能価試薬を使用してＬｙ ｍ−ＩＭＡｂを官能化しｒ、Ｌｙ＋ｎ−１を１０ｍｇ／ｒｎＬ含むＰＢＳ　（ｐ Ｈ７，３）１ｍＬを入れた５ｍＬの試験管に、１ｍＬエタノールおよび４０μＬ のＮ、Ｎ−ジメチルホルム”−ｒ＝ニドに３ｍｇの５ＰＤＰを含む溶液２０μ■ 、を添加した。通常の速度に設定した軌道振盪機装置を使用する連続混合により 、この混合物を室温で１５分間インキュベートし７た。インキュベートの後、Ｐ ＢＳで平衡化したＰ　Ｄ　−１，０カラムを通過させることにより、官能化した Ｌｙｍ−１溶液を精製した。

グラセッチ・ディ・アールとムライ・ジェイ・エフ、ｒ２．　２’　−または４ ．４′−ジチオジピリジンを用いるスルホヒドリル基の決定Ｊ、Ａｒｃｈ。

Ｂｉｏｃｈｅｍ　Ｂｉｏｐｈｙｓ、１１９：４ｌ−４９（１９６７）　（その開 示を参考によりここに取入れる）における方法で、ｐＨ７，２のリン酸緩衝塩類 溶液（ＰＢＳ）中でモル過剰の７ｍｇジチオエリスリトールを用いてＬｙｍ−１ 溶液の画分を還元した後、３４３ｎｍでピリジン−２−千オンの放出を測定する ことにより、５ＰＤＰによるＬｙｍ−１の官能化の程度を、平均して１分子当り １つのＦＤＰ基であると決定した。

抗体が実質的に無傷で残留することを示すため、実施例１で得られた修飾抗体を 高速蛋白質液体クロマトグラフィ（ＦＰＬＣ）によって分析した。この分析を実 施例２に示す。

実施例ノ 高速蛋白質液体クロマトグラフィ（Ｆ　Ｐ　Ｌ　Ｃ）による修飾Ｌｙｍ−１の分 析２８０ｎｍに設定した固定波長ＵＶ分光光度計を備えた高速蛋白質液体クロマ トグラフィ　（Ｆ　Ｐ　Ｌ　Ｃ）を用いて実施例１で得られた修飾抗体の分析を 行った。

溶媒系としてＰＢＳ、ｐＨ７，２を用い、１ｍＬ／分の流速で溶出させ、スーパ ロース（ｓｕｐｅｒｏｓｅ）−１２カラム（ファルマシア）による寸法排除（ｓ ｉｚｅｅｘｃｌｕｓｉｏｎ）クロマトグラフィを行った。修飾Ｌｙｍ−１は６９ ０秒の保持時間に現ね、未標識の無傷Ｌｙｍ−１の保持時間と同一であった。

つまり実施例２では、５ＰＤＰ修飾抗体はＦＰＬＣにおいて未修飾抗体と実質的 に同一の挙動であったことが示されている。このデータは、修飾によっては無傷 の分子の試験管内での分解は起こり得ないことを示す。

生体内試験について修飾ＭＡｂを更に検討するため、修飾ＭＡｂの放射性標識化 を行った。放射性標識化を実施例３に示す。

実施例旦 Ｌ　ｍ−１の官　・　・　ヨウ ミルス・ニス・エルら、「試験管内手順のためのモノクローナル抗体の１２３１ 放射性標識イロ、Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ　５：２６５−２７５　（１９８６）（そ の開示を参考によりここに取入れる）の改変クロラミンＴ法を使用し、１バツチ のＰＤＰ修飾Ｌｙｍ−１および無傷のＬｙｍ−１を＋２５■によりヨウ素化し、 もう一方のバッチを１３１■により標識した。簡単に説明すれば、先ず１００μ ＬのＰＢＳ中に１００μｇのモノクローナル抗体を含む溶液を５ｍＬの試験管に 人へバッチに応じて適切なヨウ素アイソトープ、１２５■または＋２１　Ｉ、お よび１０μｍのクロラミンＴの４３ｍＭ水溶液を添加し、さらに３分後に、２０ μＬのメタ重亜硫酸ナトリウムの１２０ｍＭ溶液を加え、反応を静めた。その後 セファデックスＧ−２５カラムを使用し、放射性標識した抗体を精製した。この カラムは、端部に綿を詰めた血清学用プラスチックピペット（８ｍｍＸ２００ｍ ｍ）（Ｖｉ！＝４．５ｍＬ、Ｖｔ＝１２ｍＬ）よりなるものとし、それぞれの反 応混合物をそのカラムにかけ、ＰＢＳＳｐＨ７，２を用いて溶出させｔ：ａ　１ ｍＬ画分を含む個々のチューブをカウントし、チューブ６に、放射性標識した抗 体を８５〜９０％の収率で回収した。これらの放射性標識抗体を冷蔵庫に保存し 、標識化の４時間以内にマウスに投与した。

標識したＭＡｂの純度を決定するため、実施例３からの放射性標識ＭＡｂを瞬間 薄層クロマトグラフィ　（ＩＴＬＣ）に供した。この分析を実施例４に示す。

実施例Ａ 瞬間薄層２三Ｚ上グ乏２ヱユ上工上ぷＬ≦よｊ放射性標識Ｕ声修姉貝ヱｍ　二上 例分析シリカゲルを含浸したガラス繊維よりなる分析用ＩＴＬＣ装置を使用し、 実施例３のクロラミンＴ法により１３１１で放射性標識した修飾Ｌｙｍ−１およ び１２５■で放射性標識した修飾Ｌｙｍ−１を分析した。使用の前に１１０−１ ／２℃で１５分間加熱することにより供試片（２ｘ２０ｃｍ）を活性化し、１μ ｌのサンプルをスポットし、風乾し、ＭｅＯＨ／Ｈ２０（８０：　２０）を用い て約１２ｃｍ溶出させ、再度風乾し、半分に切断してカウントし、蛋白質結合お よび非蛋白質結合放射性活性を決定した。放射性標識Ｌｙｍ−１抗体は、両者と もＯのＲ２値を有し、≧９９％の放射性化学純度を示した。実施例３と同様に標 識した無傷のＬｙｍ−１の分析により、同じ純度であることが確認された。

つまり実施例４では、高い純度の放射性標識抗体が得られたことを示している。

ラージ（Ｒａｊｉ）細胞に結合するその能力により、これらの放射性標識ＭＡｂ の免疫反応性を試験した。その分析を実施例５に示す。

実施例５ 免疫反応　；　による　・　−上１ｍ：１Ω分析ニブスティン・ニー・エルらの 前記の方法による従来の１０８ラージ細胞／チユーブ生体検定により、放射性標 識した修飾Ｌｙｍ−１および無傷Ｉ−ｙｍ−１の試験管内免疫反応性を評価した 。簡単に説明すると、１００μＬの１％ウシ血清アルブミンＰＢＳ溶液中に再懸 濁させたラージ細胞を、二連の試験管にピペットで注入した。１００μＬの標識 したＬｙｍ−１を各試験管に添加しく１００゜１１００ｃｐ／チューブ）、軌道 振盪機を使用する連続混合により室温で３０分間インキュベートした。インキュ ベートの後、チューブを１１０００ｒｐで５分間回転させ、上澄をデカントし、 細胞を２００μＬのＰＢＳに再懸濁することにより、１％ウシ血清ＰＢＳ溶液を 用いて細胞を３回洗浄した。洗浄の完了後、ガンマカウンタを使用して細胞に結 合した放射性活性を潴淀することにより、結合したＬｙｍ−１を検出した。結果 は、修飾Ｌｙｍ−１の結合活性か８７％であったのに対し、標準対照である無傷 Ｌｙｍ−１は８０％の結合活性を有していたことを示した。

よって実施例５により、修飾Ｌｙｍ−１は、試験管内で未修飾Ｌｙｍ−１より免 疫反応性であったことが示される。生体内における修飾抗体の活性の安定性の予 備的確認を得るため、実施例６に示すよう１ミ血清中でのその安定性について修 飾ＭＡｂを分析した。

実施例β ′　による　・　−蜂旦ヱｍ二１Ω分析修飾Ｌｙｍ−１およびｌ−１２５で直接 標識した無傷Ｌｙｍ−１のモノクローナル抗体を、新鮮なマウス血清が入った幾 つかの三速の試験管の各々に添加し、１００μｍｚ　７ｍ　Ｌの最終＋１７１度 とした。空気を５％ＣＯ２に維持した湿潤したインキュベータ内で試験管を３７ −１／２℃でインキュベートした。０〜８日の間に、１．００μｌの両分に対し て９００μＬの１００％トリクロロ酢酸（ＴＣＡ）を添加することにより蛋白質 結合活性を決定し、ｆ：ｏ室温での５分間のインキュベートの後、蛋白質沈殿物 を遠心分離により沈降させ、各試験管から５００μＬの上澄を抜取り、ガンマカ ウンタ内で放射性活性についてカウントした。データを、沈殿物の平均パーセン トカウントから対照試験管のそれを引いたものとして示し總結果は、インキュベ ート後のそれぞれの時点で、修飾１２５Ｉ−Ｌｙｍ−１は、標準対照である＋２ ５１標識無傷Ｌｙｍ−１と同程度安定であったことを示した。更に、結果は、３ ７−４／２℃での８日間インキュベート後に修飾Ｌｙｍ−１中に存在する≧９２ ％の放射性活性物かＴＣＡ沈殿性であったことを示した。

このように実施例６により、修飾抗体の活性の安定性は、血清中で少なくとも８ 日間維持されたことか示されｆ：、修飾ＭＡｂは血清中でのインキュベート後に 無傷のまま止まるか否かを評価するため、実施例７に示すように、インキュベー ト後の修飾Ｌｙｍ−１のＨＰＬＣ分析を行った。

実施例１ 旦ヱ土工≦よ不信１ｌＺＵＷ二わへ分析溶出溶媒として０．１〜１の中性リン酸 緩衝液を用い、流速を１ｍ１／分とし、寸法排除カラム（ＳＷ３００）を備えた ウォーターズの装置によりＨＰＬＣ分析を行った。放射性アイソトープ検出器を 用いて溶出物を検出した。実施例６で標識した修飾Ｌｙｍ−１生成混合物では、 ７５０秒の溶出時間の低分子量化学種の１つの主要なピーク、加えて６９０秒の 少量のものが明らかとなり九無傷のＬｙｍ−１では、６９０秒の保持時間の単一 ピークが現れｔ島つまり、実施例７では、血清インキュベートした修飾Ｌｙｍ− １サンプルは、ＨＰ　Ｌ　Ｃ分析において、無傷のＬｙｍ−１のものより低い見 かけの分子量を有することが示され九これに対して、実施例２では、インキュベ ートしていない修飾Ｌｙｍ−１は無傷の■、ｙｍ−１と同一の保持時間を有する ことか示されている。

つまり、修飾Ｌｙｍ−１は、血清中でのインキュベートに際してＦＰＬＣ分析に おいて、見かけ上分子量の喪失を示したことになる。

血清中でのインキュベートの際の修飾Ｌｙｍ−１の分子量の見かけ上の喪失を更 に確認するため、実施例８に示すように、サンプルのポリアクリルアミドゲル電 気泳動を行った。

実施側温 ＳＤＳポリアクリルアミドゲル　゛　５ＤＳ−ＰＡＧＥ　による・　−た　Ｌ　 ｍ−１の 実施例６の各インキュベート血清混合物と同じ画分を、非還元５ＤＳ−ＰＡＧＥ によって連続的に調べた。この検討のため、ラエミリ・ニー・ケー、　「バクテ リオファージＴ４の頭部の会合の際の構造蛋白質の開裂」、Ｎａｔｕｒｅ２２７ ：６８０−６８５　（１９７９）（その開示を参考によりここに取入れる）にお けるように、１０％アクリルアミドゲル上でサンプルを流し、注意深く乾燥させ 、通常の方法で写真フィルムに露呈した。この分析により、無傷の＋２５ｉ　Ｌ ｙｍ−１はＭｒ２００，０００で明白であったのに対し、修飾した”　Ｉ　−Ｌ 　ｙｍ−１は約Ｍｒ１１６，０００で、より小さい分子量に対応する９購のバン ドに認められたことか明らかとなった。よって、本実施例により、血清中での修 飾抗体のインキュベートは、結果的にアクリルアミドゲル上で修飾されたみかけ の分子量を与えることが示さね、ＨＰＬＣ分析の結果力覗された。

案施倒巴 血　にお番る　−したＬ　ｍ−１の　ヨウ　についてのまた実施例６と同じサン プルを８日間にわたって調べ放射性標識したＬｙｍ−１からの放射性活性の何ら かの喪失があったか否かを見た（この種の喪失は血清中における脱ヨウ素化の証 拠であると解釈することができる）。データは、この期間に渡って放射性活性の 喪失は実質的にないことを示し、これらの免疫接合体では非常に安定なヨウ素の 付着が得られていることが確認された。

よって実施例７〜９により、修飾抗体は、血清中でのインキュベート後も実質的 に完全な活性を保持しつつ、見かけ分子量１１６，０００の分子に分解されると 認められた。前述したように、分子量のこの喪失は、抗体がその１価値形態へと 分解するとこによって起こっているという可能性かある。いずれにしろ、見かけ の分子量の喪失は、修飾抗体がその断片へと分解することによるものと考えられ る。

前述（７たような、血清中でインキュベート（７た場合の修飾抗体の見かけの分 子量の前記した予期しない変化を突き止めた後、修飾〜１．Ａ、ｂの生体内での 安定性を試験した。全体浄化時間を決定するためにこれらの生体内試験を行っｔ ：ｏこれらの試験の例を実施例１０に示す。

実施例１９ 全体浄化 ３群の胸腺欠損ヌードマウス（ｎ＝５）に対（７、クロラミン′Ｆ法を使用して ｌ−１３１により標鴻ニーたＬｙｍ−１の（ａ）無傷抗体、　（ｂ）Ｆ　（ａｂ ’　）２断片及び（ｅ）修飾抗体を、各々腹腔内−１スる実験を行った。注射の 時点及びその後経時的に、全体ｕ二を線量計を用いて測定した。この検討により 、放射性活性の全体浄化は、抗体調製物により変動することが示されｔ−ｏ結果 を図２に示す。

図２に示す通り、修飾Ｌｙｍ−１は、２０時間の生物学的半減期（ｔ＋２）で無 傷のＬ３’　ｍ　１　（ｔ　ｌ、２＝　５日）より速く全体から浄化されｔ′− シかしながら、Ｆ　（ａｂ’　）、断片の浄化は１０時間の生物学的半減期で、 修飾■、ｙｍ−１より２倍速かった。データは、迅速に浄化されるＦ（ａｂ’） 、断片と遅く浄化される無傷抗体との間の中間の速度で修飾Ｌｙｍ−１が浄化さ れることを示している。

よって、実施例】０のデータから、修飾抗体は比較的高度に持続性の無傷抗体よ り迅速に体から浄化されるか、Ｆ（ａｂ’）２断片程は迅速ではないことが理解 できる。

免疫治療のための理想的な薬品は、所望する毒性効果を与えるのに十分長い期間 は血液流中で持続するが、意図しない毒性副作用を生起する程までは長くないも のであろう。実施例１０のデータは、修飾抗体は、免疫治療で使用した場合に潜 在的に理想的な持続時間を示すことを示唆している。

前述したように、免疫治療のための薬品は、その標的細胞に対して高度に特異的 であるものでもあろう。よって、以下の実施例では、無傷ＭＡｂおよびＦ　（ａ ｂ’　）、断片の両者と相対して修飾ＭＡｂの特異性を試験した。実施例１１は 、後述する生体内分布の検討会てに使用した方法を示すものである。

実施例ユニ 生体続Ｅ図汐１鮭」 ２つの群の６週齢ヌードマウスに対し、ラージ細胞（１０７）を腿領域に皮下注 射し７′島直径１ｃｍより大きくなるまで腫瘍を３週間生育させた。各群のマウ スを使用し、以下に記載するように対標識による検討を行った。第１の群（ｎ＝ ６）では、各マウスに対し、１２μＣｉ／μｇ（１２０μＣｉ／マウス）のｌ− １３１により標識した１０μｇの修飾ｉ−ｙｍ−１、及び２，５μｃｉ／μｇ　 （２５μＣｉ／マウス）の１−１２５により標識した１０μｇの無傷Ｌｙｍ−１ を含む０．２ｍＬの接種物を腹腔内（ｉ、ｐ　）に注射した。第２の群（ｎ＝４ ）では、マウスは、１２μＣｉ／μｇ（１２ｏμＣｉ／マウス）の１−１３１に より標識した：ｔｏμｇの修飾１−ｙｍ−１、および２．５μＣｉ／μｇ　（２ ５μＣｉ／７ウス）のｌ−１２５により標識した〕、０μｇのＦ　（ａｂ’　） 　２断片を含む０．２ｍＬの接種物を受容するものとした。全ての天験において 、注射後予備選択した時間に頚部脱臼によりマウスを犠牲にし、種々の器官、血 液および腫瘍を除去し、分析用天秤で秤量した。その後ガンマカウンタ内でサン プルをカウントし、１３１１および１２５■活性を測定した。１２５１カウント は、１７％の１３１■チヤンネルカウントを差引くことにより、＋３１　Ｉチャ ンネルからの重複について調整した（１２８２コンビニガンマ・ガンマカウンタ （ＬＫＢ）を使用して実験的に決定された式）。動物を犠牲にした日にしたがっ て１３１１アイソトープの放射性崩壊についてもデータを補正した。それぞれの マウスについて、ダラム腫瘍当りのｃｐｍ／グラム器官当りのｃｐｍ、％投与１ グラムおよび％投与量／器官としてデータを示した。これらのデータから、それ ぞれの群について平均および標準偏差を計算した。

実施例１２は、実施例１１の方法を使用し、修飾ＭＡｂの生体内分布を無傷ＭＡ ｂと比較するものである。

実施例１ノ Ｌｍ−１＝Ｌｍ−１の　の゛・ ここでは、実施例１１の方法で無傷Ｌｙｍ−１抗体を修飾Ｌｙｍ−１抗体と比較 した。表Ｉに示すように、無傷Ｌｙｍ−１では、注射後７日目には、血液活性は ０．６４％ＩＤ／ｇであった。同じく注射後７日目には、腫瘍は３．９２％ＩＤ ／ｇの活性を有していた。

表１に示すように、無傷Ｌｙｍ−１と比較し、修飾Ｌｙｍ−１は血液からより速 く浄化さね、７日目には、血液活性は０．１４％ＩＤ／ｇであった。同じく注射 後７日目には、腫瘍は７．７％の活性を有していたが、これは無傷Ｌｙｍ−１の 対応する活性より有意に高い傾向であった。

幾つかの器官における実施例１２で得られた抗体反応性の結果を表Ｉに示し、図 ３（％投与Ｆグラム）および図４（腫瘍／器官比率）にグラフにより示す。

（本頁以下余白） 表■ １鑑り８目のラージ腫瘍担持ヌードマウス（Ｎ＝６）におけるよび無傷モノクロ ーナル抗体ＬＹＭ−１の生体内分布修飾Ｌｙｍ−１ 無傷Ｌｙｍ−１（対利 ＊平均（標準偏差） 図３から、修飾抗体は、腫瘍中で無傷抗体より高いシグナルを生成したことかわ かる。更（へ腎臓を除く試験したあらゆる器官で、修飾抗体は無傷ＭＡｂより弱 く反応した。より高いシグナルが腎臓に認められることは予期できないことでは ない。というのは、抗体はこの器官を介して浄化されると予期されるからである 。実施例１０で無傷ＭＡｂと比較して修飾ＭＡｂはより迅速な浄化速度を有する ことが認められているので、腎臓中により高い量の修飾ＭＡｂが存在することを 予期し得る。

図３と同じデータを異なる形式で示した図４を参照すると、修飾ＭＡｂは、腎臓 を除く試験したあらゆる器官で、無傷ＭＡｂより有意に高い腫瘍／器官比率を与 えることが理解できる。よって、修飾抗体は、免疫シントグラフィで使用する場 合、有意に低いパックグラウンドを与えることを予期し得る。更に、修飾抗体は 、免疫治療で使用する場合、腫瘍に対するその高い親和力および非標的組織に対 する低い親和力の両者により、より有効であることを予期し得る。よって免疫治 療で使用する場合、修飾抗体は腫瘍に対してより毒性が高く、非標的組織に対し てより毒性が低いことを予期し得る。本発明の修飾抗体の免疫治療への使用は、 後に更に詳細に説明する。

次に、修飾ＭＡｂの生体内分布を他の未修飾抗体のＦ　（ａｂ’　）２断片と比 較した。実施例１３はこれらの実験を示すものである。

実施例ユｊ 修飾Ｌｍ−ＩＪＬｍ−１のＦ　ａｂ′　片（７）　（７）討ここでは、Ｆ（ａｂ ’）２断片を修飾Ｌｙｍ−ＩＭＡｂと比較しｔ、：ｏ実験は、実施例１１と同様 に行った。結果を表■に示し、図４および図５にグラフにより示す。

（本頁以下余白） 表■ 修飾Ｌｙｍ−１ Ｆ（ａｂ’）２断片（対照） 表■から、修飾Ｌｙｍ−１は、Ｆ（ａｂ’）２断片より遅く血液がら浄化された ことかわかる。修飾Ｌｙｍ−１では、注射後５日目には、断片（０，０５％）よ り高い０．０９％ＩＤ／ｇの血液活性を有した。図５は、修飾Ｌｙｍ−１の腫瘍 活性が、Ｆ（ａｂ’）、断片の対応する活性より約２５倍高いことをホしている 。

修飾１−　ｙ　ｍ　−１の活性は、腎ｉｉｉを含む試験１．た全ての種々の器官 についてＦ（ａｂ’）、断片より高かつｆ、’−ａ　これはより迅速に浄化され る抗体は腎臓中に蓄積するという理論と一貫するものである。

更に、図６は、修飾Ｌｙｒｉ−１についての腫瘍対組織比率は、試験した全ての 器官に関ｊヅＣＦ　（ａｂ’　）　、、断片のものより高いことを示（２ている 。すなわち、実施例１２および１３の実験結果により、本発明の修飾抗体は、無 傷ＭＡｂまたはＦ　（ａｂ’　）２断片のいずれよりもその標的腫瘍に対して高 い活性を有することか確認さイする。更（′−これらの実験の腫瘍対絹廠のデー タは、修飾抗体は無傷ＭＡ＋）またはＦ　（ａｂ’　）２断片のいずれよりも腫 瘍に対する高い特異性を有することを示し、ている。

そこで、本発明の修飾ＭＡｂが有する免疫シントゲラフイによい結果を与える能 力を試験した。これらの試験の例を実施例１４に示す。

実施例−し峡 ムＬｍ：ユ厚画像形成Ｑ検討 ピンホールコリメータおよびスペクトル９１ガンマカメラ（ライセオン）を使用 し、腫瘍担持ヌードマウスの画像形成を行つｔ：ｏこれらの動物の画像分析１こ より、注射後の腫瘍／全体の抗体分布の評価が与えられ九注射後７日目に、２ｍ ｇケタミンＨＣＩおよび０．４ｍｇｍクキジンを０．２ｍＬ皮下（ｓ、ｃ、）接 種により投与してマウスを麻酔した。その後、記録１０，０００カウント（二予 備設定したカメラを用い、固定したマウスを背部位置で画像形成に供した。）く ・ソクグラウントの差引きは行わなかった。ポラロイドのタイプ３３０ノく・ツ クフィルムを使用して写真画像を得へそれぞれの画像で２つの領域（（ａ）領域 １：全体、（ｂ）領域２：腫瘍）を特定し縮図６〜８は、これらの実験により得 られたシントゲラフ（シントゲラムとしても知られる）の例を示すものである。

無傷Ｌｙｍ−１を用いる免疫シントグラフイ画像形成を注射後７日に試みた力く 、図６に認められるように満足し得るものではなかつ縮図６は、腫瘍は視覚化さ れたものの、動物の残部も視覚化されたことを示している。図７および図８は、 注射後の同じ時間における、標識した修飾Ｌｙｍ−１を用いて注射した２つの異 なるラージ腫瘍担持動物の画像を示す。図７および図８の両者は、図６に認めら れる無傷Ｌｙｍ−１により生成された腫瘍の位置のものと比較し、遥かに高いレ ベルで腫瘍の位置の標識した修飾Ｌｙｍ−１の濃度を示している。更に重要なこ とに、修飾Ｌｙｍ−１により生成されたマウス全体のバックグラウンドに対する 腫瘍の位置の標識の比率は、無傷Ｌｙｍ−１の場合より数倍高かった。よって図 ７および図８により腫瘍の明確な画定が示さヘパツクグラウンド放射性活性は殆 どまたは全（ない。

更に、修飾Ｌｙｍ−１を使用した場合、注射後５日目に腫瘍の満足し得る視覚化 かできた。図１０は、図９（７日目の画像）に示すのと同じ動物を５日目にとっ た画像を示す。理解し得るように、図１０に示す５日目の画像は、７日目に無傷 Ｌｙｍ−１により生成した画像（図７）より有意に優れていた。試験した全ての 動物について結果は同様であった。

この検討は、修飾抗体断片の使用は腫瘍抗原に対してより大きい比活性を示し、 より高い絶対濃度の抗体の腫瘍中での蓄積を可能とすることを示唆するものであ る。このことは、修飾Ｌｙｍ−１断片の絶対濃度は、注射後７日目で無傷Ｌｙｍ −１濃度の約２倍、５日目でＦ（ａｂ’）２断片の約２，５倍であることを示す 今回の結果によって確認されている。

修飾Ｌｙｍ−１断片の遥かに速い浄化により、高い腫瘍対バックグラウンド比率 に到達するのに必要な時間も有意に減少し、よってこの結果、無傷抗体より少な い時間でより良好な画像が得られる。

抗体の特異性および活性の改良における本発明の修飾の一般的有用性を示すため に、更に別のＭＡｂを修飾した。これらの種々の修飾ＭＡｂの試験を実施例１５ 〜１８に示す。

実施例１５ モノクローナル　Ｂ７２　３（７；２浄化速度コルチェル・ディら、　「ヒト乳 腫瘍細胞と反応性のモノクローナル抗体のスペクトル」、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、 Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、７８：３１９９−３２０３（１９８１）（その開示を参考に よりここに取入れる）における方法で、結腸カルシノーマに対するモノクローナ ル抗体である８７２．３　（ＩｇＧ１）を取得した。

実施例１の方法に従い、平均して１分子当り１っのＰＤＰ基を用いて８７２．３ ＭＡｂを官能化した。

実施例３の方法によって修飾Ｂ’７２．３ＭＡｂを放射性標識した。実施例１０ と同様に全体浄化時間を測定した。図１１は、これらの全体浄化実験の結果を示 すものである。修飾抗体の全体浄化半減期は減少を示し、無傷ＭＡｂで約６日の ものが修飾抗体については約２．５日となった。Ｆ（ａｂ’）２断片の浄化半減 期は、Ｌｙｍ−１断片についてと同様に修飾抗体より速く、約１２時間の半減期 を有していた。よって結果は、修飾Ｂ７２．３は、Ｆ（ａｂ′）２断片と無傷抗 体の間の中間の浄化半減期を有する点で、修飾Ｌｙｍ−１と同様の挙動であった ことを示した。

実ｍ旦 β１」し−入の」」四予市 ヒトＬＳＩ７４Ｔ結腸カルシノーマを担持する胸腺欠損メートマウス、各々５匹 づつの２群を用いて、対標識生体内分布の検討を行った。一方の群には無傷ｌ− １２５標識８７２．３を注射し、また他方には修飾１−１３１標識Ｂ７２．３を 注射した。実験では、同様に腫瘍、血液および種々の器官における生体内分布を 比較した。用いた方法は実施例１１〜１３と同様とした。データを表■に示し、 図１１および１２にグラフを示す。

（本頁以下余白） 表■ １”型盟２晶４３晶「ツ町斗掘謬すづ、−届籟癲＝５）修飾Ｂ７２．３ 表■に示したようζミ無傷Ｂ７２．３抗体では注射後４日目で１．３４％ＩＤ／ ｇの血液活性、および表■に示すように腫瘍において４．０４％の活性を有して いた。無傷Ｂ７２．３と比較し、修飾８７２．３では４日目で低い血液活性（１ ，１％ＩＤ／ｇ）および高い腫瘍活性（６，０２％ＩＤ／ｇ）を有していｔ島国 １３かられかるように、より迅速に浄化される抗体について予期される通り、全 ての種々の器官の活性は、腎臓を除いて修飾Ｂ７２．３に関して高かった。よっ て、図１４に示すように、修飾Ｂ７２．３についての腫瘍対器官比率は、無傷８ ７２．３についての対応する比率より有意に高かった。腫瘍部位での修飾抗体の より高い活性のため、腫瘍対器官比率は腎臓に関してさえも改良されていた。

実施例１ユ 日、マウス１こお番　Ｂ７２３の　ヅ 修飾８７２．３を注射したＬＳ１７４Ｔ腫瘍担持マウスの画像分析により、注射 後の腫瘍／全体抗体分布の評価が与えられｔ島国１４は、注射後１日目の免疫シ ントゲラフを示すものである。画像は明確な腫瘍の画定を示し、バックグラウン ド放射活性を殆ど有していない。図１５は、注射後４日目の免疫シントゲラフを 示すものである。４日目で腫瘍は明確に認めらへ動物の血液プールに残留する放 射性活性は殆どなかった。全ての動物について結果は同様であった。

よって、修飾８７２．３は、８７２．３と反応性の腫瘍に注射後短時間以内に高 品質の免疫シントゲラフを得るのに非常に有用であると認められた。

ＴＮＴ−１は、ヒトガンに対するその選択的結合のための標的として壊死性腫瘍 を利用するＩｇＧ２．モノクローナル抗体である。実施例１と同様に平均して１ 分子当り１つのＰＤＰ基を用いてこの抗体を修飾し、実施例１８に示すように全 体保持時間を分析した。

実施例１溢 モノクローナル　ＴＮＴ−１の ニブスティンら、　「ヒトガンにおける壊死性病巣の検出のための新しい方法」 、Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ、４８：５８４２−５８４８（１９８８）（その開示を 参考によりここに取入れる）における方法で、ＴＮＴ−１を取得した。実施例３ の方法によってＴＮＴ−ＩＭＡｂを放射性標識した。実施例１０と同様にして全 体浄化時間を測定した。図１６は、これらの全体浄化実験の結果を示すものであ る。

修飾ＴＮＴ−ＩＭＡｂは、無傷ＴＮＴ−１と比較して全体浄化半減期の減少、お よびＴＮＴ−１のＦ（ａｂ’）２断片と比較して全体浄化半減期の増加を示しｆ ：。

よって、修飾ＴＮＴ−１は他の修飾抗体と同様の挙動であった。したがって、修 飾ＴＮＴ−ＩＭＡｂの有用性は、試験した他の修飾抗体と同等であると期待され る。

よって、本発明の方法を使用するあらゆる抗体の修飾は、腫瘍の画像形成を改良 できると考えられる。本発明の方法を使用してあらゆる所望の種類の組織の画像 を生成するためには、その種類の組織に対する抗体を最初に取得しなければなら ない。ポリクローナル抗体は、当業者に公知たり得る従来の技術で得ることがで きる。また、モノクローナル抗体は、同様に当業者に公知たり得るものとして、 これらの抗体により与えられる増加した特異性を得るために調製することができ る。その後抗体をヘテロ２官能価試薬と化学的に接合させる。接合の後、適切な 標識を修飾抗体に適用する。

前記の実施例は、γ線放射の放射性核種からなる標識の画像形成を活用するもの であるが、多くの他の種類の標識および画像形成装置を、本発明の範囲内に企図 する。例えＣＩ、従来のＸ線を使用し、バリウム、セシウムまたはヨウ素のよう な放射性不透明の材料を画像形成することができる。ＭＲＩ画像形成技術を使用 し、常磁性または起磁性粒子を標識として使用して抗体の位置の画像を生成する ことができる。更に、テクニシウム（ｔｅｃｈｎｉｃｉｕｍ）を標識として使用 することができる。これらの代替的な標識は、従来の方法を用いて修飾抗体に接 合させることかできる。

標識した抗体は、薬学的に許容し得る賦形剤にキャリヤまたは基剤とともに、対 象に標識を投与するための薬学的組成物に含有させることができる。適切な賦形 剤にキャリヤまたは基剤には、塩類溶液、リン酸緩衝塩類溶液、グリセリン、炭 酸カルシウム等が包含される。その後これらの組成物を、局所注射、静脈注射、 または低減したシグナル強度が要求される場合や、口腔内での組織の画像形成が 望まれる場合は、経口投与のようなあらゆる種類の手段を用いて導入する。しか しながら、好ましくは、抗体に対する標的組織の露呈を最大にするために投与は 全身性注射によるものとする。

本発明により１つ以上のＰＤＰ基の付加によって抗体を修飾し、これらの修飾抗 体を免疫治療薬品に組込んだ場合、有意に改良された結果が与えられると考えら れる。この種の治療薬品は、一般に１以上の生物学的に活性な分子と組合わさっ た腫瘍または他の疾患組織に対して特異的な抗体を含む。この種の薬品中で機能 する適切な生物学的に活性な分子には、毒素、例えばジフテリア毒素（リシン） Ａ鎖、または当業者により公知のあらゆる種類の植物毒素、放射性核種、例えば イツトリウムの放射活性アイソトープ、ヨウ素、リン、および他の一般に使用さ れる放射性治療薬品、薬物、例えばメトトレキセート、５−フルオロウラシルま たはアドリアマイシン、キレート（ＥＤＴＡおよびＥＧＴＡを含む）、ｃｉｓ− プラチナおよび他の毒性有機金属薬品、及びあらゆる他の治療薬品か挙げられる 。

従来、有効な免疫治療は未だ十分に実現されていなかった。本発明の修飾抗体の 増加した活性および特異性により、その標的組織に対する十分な活性および特異 性を有する免疫治療薬品が提供さね、従来の免疫治療薬品の欠陥を克服できると 考えられる。よって、対象に対して適切な免疫治療薬品を注射した場合、対象の 健全な組織に有意に影響を与えることなく、標的疾患組織を殺傷することができ る。

これらの免疫治療薬品の使用では、特定の望ましくない種類の組織に特異的な抗 体を最初に取得しなければならない。所望の抗体が利用可能でない場合、当業者 に公知たり得るように、抗原を生物に注射し、哺乳動物から血清を取得すること により、適切な生物中で抗体を生成することができる。あるいは、また好ましく は、当業者に公知の方法でモノクローナル抗体を生成することができる。その後 抗体をヘテロ２官能価試薬と化学的に接合する。接合の後、前記した治療薬品の ような生物学的に活性な薬品との接合により、得られた修飾抗体を更に修飾する 。次に、抗体と、薬学的に許容し得るキャリヤ、賦形剤または基剤を含有する薬 学的組成物とを組合せる。この種の薬学的に許容し得るキャリヤ、賦形剤または 基剤としては、全身性注射のための通常の塩類溶液、グリセリン、炭酸カルシウ ムが包含される。こうして組成物は、哺乳動物のような患者へ導入できるものと なる。

その後あらゆる公知の投与経路を介して抗体を対象に導入する。例えば、組成物 を、全身性注射、患部組織への局所注射により導入することができ、外部の患部 組織に局所塗布することができ、また低減したシグナル強度が要求される場合、 や口腔内の組織の治療が所望される場合は経口的に摂取することができる。

ている。しかしながら、代表的な投与量は、一般に体重１ｋｇ当たり１μｇ〜１ ｍｇの範囲とすることができ、大半の用途で、投与量は好ましくは５〜２００μ ｇ／ｋｇとし得る。

以下の実施例は、マウス中のラージ腫瘍に対して有効な免疫治療を示すものであ る。

太糸［旦 マウス　のラージ　の　１ ＰＤＰ修飾Ｌｙｍ−１を実施例１のように取得する。その後、修飾した抗体を処 理して平均して抗体１分子当り１つのりシンＡ鎖に導入する。無傷Ｌｙｍ”−１ およびＦ（ａｂ’）２断片を同様に毒素と組合せる。

２５匹のマウスを５つの群に分割する。群Ｉは、８週間の間、週に１回りシンー ＦＤＰ−修飾Ｌｙｍ−１のリン酸緩衝塩類溶液（Ｐ　Ｂ　Ｓ）溶液の腹腔内注射 （１０μｇ／ｋｇ全体重）を受けるものとする。群■は、等量のりシン−無傷Ｌ ｙｍ−１の注射を受けるものとする。群■は、等量のりシン−Ｌｙｍ−１のＦ（ ａｂ’）２断片の注射を受けるものとする。群■は、等量の未接合リシンの注射 を受容けるものとする。群Ｖは、ＰＢＳ単独の注射を受けるものとする。

８週間後、実施例１４の方法を使用して全ての生存マウスの免疫シントグラフィ を行う。群Ｉのマウスでは、他の群のいずれと比較しても低減した腫瘍の様子が 視覚化されて示される。生存する群■および群■のマウスは幾分かの改良を示す が、群Ｉのマウス程劇的ではない。群■のマウスは病気が重くなるか死亡する。

すなわち、実施例１９は、本発明の修飾抗体を使用した腫瘍の１つの特定の処置 を示している。実施例１９は、本発明のＦＤＰ修飾抗体を使用する場合に達成さ れる優れた結果を示す。また、マウスあるいは他の哺乳動物（例えばヒト）の他 の腫瘍または疾患組織に特異的な他の抗体の使用に置き換えた場合も、これらの 特異的腫瘍または疾患組織を処置する際に、同様に有効な結果が得られると考え られる。更に、他の公知の毒素に置き換えても同様の有効な結果が与えられると 考えられる。実施例２０は、ヒトの膵臓ガンに対して有効な類似する治療を使用 した例を示すものである。

実施例又ρ 旦±＆召ヅ処置 ヒト膵臓腫瘍に認められる抗原に特異的なモノクローナル抗体を取得する。実施 例１と同様に、平均して抗体１分子当り１つのＰＤＰ基の接合によりこの抗体を 修飾する。実施例１９でリシンについて記載したように、その後メトトレキセー トをこれらの修飾抗体に接合させる。

２つの群の１０人の膵臓ガン患者を治療する。第１の群は、従来の治療と組合せ て週間基準で２０μｇ／ｋｇ全体重の薬物−Ｐ　Ｄ　Ｐ　−ＭＡ　ｂの静脈注射 を受けるものとする。第２の群は、対照として従来の治療と組合せてＰＢＳの注 射を受けるものとする。１０週間後、生存する患者の免疫シントグラフィを行う 。

免疫シントグラフィによると、第１の群で画像化された腫瘍の平均的大きさは、 対照群と比較して低減していた。

よって前記した実施例は、ヒトにおける免疫治療での修飾抗体の有用性を示すも のである。

前記したように、本発明の１つの好適な形態では、修飾抗体を薬学的組成物に処 方する。よって、免疫治療のための薬物と接合したＰＤＰ−修飾抗体を、細胞毒 性的に有効な量の本発明の修飾抗体−毒素接合体を有する注射組成物に混和する ことができる。以下は、ヒトのＢ細胞リンパ腫に対して有効な、細胞毒性的に有 効な組成物の例である。

実施例１ユ 逼」ヱリモ前　Ｉ　ンパ　に・して　な　・実施例１８の修飾放射性標識Ｌｙｍ −１：　１０ｍｇ／ｍｌリン酸緩衝塩類溶液（０，９％）　：　残部更に、放射 性標識修飾ＭＡｂを、免疫ンントグラフィにおけるその特異的抗原を視覚化する のに有効な組成物に処方することができる。以下はこの種の組成物の１つの例で ある。

実施例又ノ ８カルシノーマの　シント　ラフ　な　８・実施例１５の修飾放射性標識Ｂ７２ ．３　：　１０ｍｇ／ｍ＋リン酸緩衝塩類溶液（０，９％）　：　残部ある種の 機械的または化学的変形は、当業者に対してそれを示唆し得ることが理解されよ う。前記した実施例および詳細な説明は例示として与えたものとして明確に理解 すべきであり、この発明の精神および範囲は添付する請求の範囲によってのみ限 定される。

％注射投与量 ％注射投与ｉ／グラム 腫瘍／器官比率 腫瘍／器官比率 ？６注射投与１／グラム ＦＩＧ、　７ Ｉ−１３１１話無傷Ｌｙｍ−１の注射後７日に得られた画像領域トマウス全体、 領域２−ラージ腫瘍ＦＩＧ、　８ Ｔ、−１３１標識修飾Ｌｙｍ−１の注射後７日に得られた画像領域１　マウス全 体、領域２・ラージ腫瘍ＦＩＧ、９ Ｉ−１３１凛え修飾Ｌ　ｙ　ｍ　−ｉのま射後７日に得られた画像領域１７′内 ス全体、領域２　ラージ腫瘍ＦＩＧ、１０ Ｉ−１３１凛識修飾Ｌｙｍ−１の注射後５日に得られた画像領域１　マウス全体 、領域２　ラージ腫瘍″６注射投手量 仔看（ｔ　ｌ　！Ｌ１１！　−＃　Ｌｌ−巾％注射投与量２／グラム 膿場／／器■比率 ＦＩＧ、　１４ ＦＩＧ。１５ Ｉ−１３１標識修飾Ｂ７２３の注射後４日に得ろｉ′した画像領域］　マウス全 体、頭！４２　：　Ｌ　Ｓ　１７４　ＴＢｆｌ’を幀〒会＾評π弄坦中當ｌ牌五 辻竺ＩＲＡ息のｇ）％注射投与量 補正口のＲ広又ジと山号（行＾士７ムクμ０唱オＨｖ）Ｑ）】１．抗体の活性お よび特異性を改良し、これに対して増強された生体内浄化を与える方法であって 、順序か任意な次の工程：第１の付着部位に所定の種類の少なくとも１つのへテ ロ２官能価試薬を前記抗体のそれぞれに化学的に接合させ、 第２の付着部位で生物学的に活性な分子を前記抗体に付着させる（前記第２の付 着部位は、前記抗体上で前記第１の付着部位とは異る部位であり、前記第２の付 着部位は、前記所定の種類の付着したヘテロ２官能価試薬を有しない）を含む方 法。

１２、抗体】分子当り平均して１つのへテロ２官能価試薬を付着させる請求の範 囲第１１項記載の方法。

１３、前記所定の種類のへテロ２官能価試薬かピリジルジチオプロピオネート（ ＰＤＰ）を含む請求の範囲第１１項または第】７２項記載の方法。

１４゜哺乳動物中の特異的組織の画像を形成するに際し、請求の範囲第６項記載 の抗体を前記哺乳動物に導入し、前記抗体に付着した標識を明らかにする画像を 生成することを含む画像形成方法。

１５、標識かガンマ線を放射する請求の範囲第１４項記載の方法。

１６　免疫シントグラフィの前に哺乳動物に投与する薬学的組成物の製造のため の、請求の範囲第１項〜第１０項のいずれか１項に記載の抗体の使用。

１７、抗体か、ガンマ放射放射性核種である放射性核種を含む請求の範囲第１６ 項記載の使用。

１８　請求の範囲第１項〜第１０項のいずれか１項に記載の有効な特異的組繊細 胞毒性量の抗体の、哺乳動物の免疫治療のための薬剤の製造における使用。

１９、前記抗体に付着した生物学的に活性な分子がりシンＡ鎖を含む請求の範囲 第１８項記載の使用。

２ｏ、Ｈｉｊ記抗体に付着した生物学的に活性な分子が、次の薬物：メトトレキ セート、５−フルオロウランル、Ｃ１５−プラチナおよびアドリアマイシンの１ つを含む請求の範囲第１８項記載の使用。

２１、前記抗体が、前記哺乳動物中の疾患組織に特異的である請求の範囲第１８ 項記載の使用。

２２、前記疾患組織かガンである請求の範囲第２１項記載の使用。

２３、前記抗体が、平均して抗体１分子当り１つのピリジルジチオプロピオネー ト（ＦＤＰ）基により化学的に接合される請求の範囲第１８項記載の使用。

国際調査報告 １□、ｌ、１．１１い耐＾、−１＋＋−ｍ、ＰＣＴ／ＵＳ　９１１０６１６４

Claims (24)

【特許請求の範囲】
1. １．ヘテロ２官能価試薬により化学的に修飾された抗体であって、Ｆ（ａｂ′） ２断片の浄化速度と同じ種類の無傷の抗体との間の生体内浄化速度を有する化学 的に修飾された抗体。
2. ２．前記ヘテロ２官能価試薬が、ＳＡＳＤ、ＳＡＮＤ、スルホＳＡＤＰおよびト ラウトの試薬よりなる群から選択される請求の範囲第１項記載の抗体。
3. ３．前記ヘテロ２官能価試薬がＳＰＤＰである請求の範囲第１項記載の抗体。
4. ４．前記抗体が、モノクローナル抗体、ヒト抗体、遺伝子操作による抗体キメラ 抗体、合成抗体およびポリクローナル抗体よりなる群から選択される請求の範囲 第１項記載の抗体。
5. ５．ＳＰＤＰとの化学的接合により修飾されたモノクローナル抗体Ｌｙｍ−１。
6. ６．ＳＰＤＰとの化学的接合により修飾されたモノクローナル抗体ＴＮＴ−１。
7. ７．ＳＰＤＰとの化学的接合により修飾されたモノクローナル抗体Ｂ７２．３。
8. ８．平均して抗体１分子当り１つのＰＤＰ基を化学的に接合することからなる、 抗体の活性および特異性の改良方法。
9. ９．哺乳動物中の特異的組織の画像を形成するに際し、前記特異的組織に特異的 な抗体を取得し、ヘテロ２官能価試薬との接合により前記抗体を修飾し、前記抗 体に標識を導入し、 前記抗体を前記哺乳動物に導入し、 前記抗体上の前記標識を明らかにする画像を生成することを含む画像形成方法。
10. １０．前記抗体を修飾する工程が、ＳＰＤＰとの接合により前記抗体を修飾する ことを含む請求の範囲第９項記載の方法。
11. １１．前記抗体を修飾する工程が、平均して抗体１分子当り約１つのＰＤＰ基と の接合により前記抗体を修飾することからなる請求の範囲第１０項記載の方法。
12. １２．標識を導入する工程が、ガンマ線を放射する放射性核種により前記抗体を 標識することからなる請求の範囲第９項記載の方法。
13. １３．免疫シントグラフィの前に哺乳動物に投与する薬学的組成物の製造のため の、ヘテロ２官能価試薬により接合した標識抗体の使用。
14. １４．前記ヘテロ２官能価試薬がＳＰＤＰからなる請求の範囲第１３項記載の使 用。
15. １５．前記標識抗体が放射性核種により標識された抗体である請求の範囲第１３ 項記載の使用。
16. １６．前記放射性核種がガンマ放射放射性核種からなる請求の範囲第１５項記載 の使用。
17. １７．ヘテロ２官能価試薬および生物学的に活性な分子と接合された有効な特異 的組織細胞毒性量のモノクローナル抗体の、哺乳動物の免疫治療のための薬剤の 製造における使用。
18. １８．前記生物学的に活性な分子が、植物毒素、薬物、放射性核種またはキレー トである請求の範囲第１７項記載の使用。
19. １９．前記生物学的に活性な分子がリシンＡ鎖を含む請求の範囲第１７項記載の 使用。
20. ２０．前記生物学的に活性な分子が、メトトレキセート、５−フルオロウラシル 、ｃｉｓ−プラチナおよびアドリアマイシンよりなる群から選択される薬物から なる請求の範囲第１８項記載の使用。
21. ２１．前記抗体が、前記哺乳動物中の疾患組織に特異的である請求の範囲第１７ 項記載の使用。
22. ２２．前記疾患組織がガンである請求の範囲第２０項記載の使用。
23. ２３．前記ヘテロ２官能価試薬がＳＰＤＰからなる請求の範囲第１６項記載使用 。
24. ２４．前記抗体が、平均して抗体分子当り１つのＰＤＰ基により化学的に接合さ れる請求の範囲第２２項記載の使用。