JPH06500689A - ハイブリッドα―アミラーゼプロモーター - Google Patents

Abstract

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Description

【発明の詳細な説明】 ２８、上記宿主細胞がＢ、サチリスである、請求項２７記載の宿主細胞。

２９、原核宿主中にタンパク質を発現する方法であって、以下の工程：（１）　 上記発現ベクターが上記ノ＼イブリッドプロモーターに機能可能に結合する所望 のコード化配列を提供する遺伝子を含み、上記宿主細胞が上記ノーイブリッドプ ロモーター上の上記標的モジュールにより、所望のエンハンサー遺伝子活性を特 徴する請求項１８記載の発現ベクターで上記宿主を形質転換すること：および （２）　上記タンパク質を発現することを含むことを特徴とする方法。

明細書 ハイブリッドα−アミラーゼプロモーター発明の分野 本発明は、バシラス・サチリスのアルカリプロテアーゼプロモーターのモジュー ルに機能可能に結合したα−アミラーゼプロモーターのモジュールを含むハイ− ブリッド細菌プロモーターに関する。本発明は、上記プロモーターに機能可能に 　−結合した組換えタンパク質の製造にもまた関する。

背景の技術の簡単な説明 バシラス株は、エシェリキア・コリと比較すると、クローン化遺伝子生成物の製 造において多（の有力な利点を提供する。第一に、桿菌類（Ｂａｃｉｌｌｕｓ） は病原菌ではなく、エンドトキシンを合成しない。第二に、多くの遺伝子化合物 を、成長培地へ分泌し、エシェリキア・コリとは対照的に、外層膜の存在のため に大部分のタンパク質を保有したままである。第三に、桿菌類は、大規模発酵方 法において工業用酵素の製造に広く使用されている。

しかしながら、Ｂ、サチリスにおける組換えタンパク質の発現に利用可能なベク ター系の数は限られている。更に、Ｂ、サチリスにおける転写調節制御因子は完 全に解明されていない。桿菌類により多量に分泌され、工業的製造法に使用する １つの重要な酵素は、Ｂ、アミロリフファシェンスからのα−アミラーゼである （イングル等、Ａｄｖ、　Ａｐｐｌ、　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、第２４巻、２５７ 〜２７８頁（１９８７年））。本酵素は、約５００００ダルトンのＭ、値を有し 、配列決定されている（タッキネン等、ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケ ミストリー、第２５８巻、１００７〜１０１３頁（１９８３年）：チャン等、バ イオケミカル・ジャーナル、第１８５巻、３８７〜・３９５頁（１９８０年）） 。Ｂ、サチリスにおける本酵素の発現は、報告されている。（「Ｂ、サチリスに おけるバシルス・アミロリフファシェンスα−アミラーゼ遺伝子の発現および調 節ＪＰ、カリオ、博士論文、ヘルシンキ大学、１９８７年） α−アミラーゼ−ベース分泌ベクターを用いてバシルスにおける外来遺伝子生酸 物の高濃度の発現を得ることは、技術的に複雑である。α−アミラーゼ遺伝子／ 細胞の１０〜２０個の複写があるとき、α−アミラーゼの生成は飽和されている （アプライド・マイクロバイオロジー・アンド・バイオテクノロジー、第２７巻 、６４〜７１頁、（１９８７年））。すなわち、α−アミラーゼの生成の反応速 度は、著しく低い複写数を有するプラスミド中にある場合より、ｐＫＴＨｌｏ（ 宿主の静止期での２００コピー数／セルに増幅する）のような多複写プラスミド 中では速くない。そのような多重写プラスミド中において、タンパク質生成物の 分泌は速度限界になり、この限界速度以上の遺伝子用量の増加は宿生細胞内に単 に前駆体の蓄積をもたらすだけである。。

すなわち、多複写プラスミドの使用は、桿菌類における大規模な工業的製造法に なじまない。桿菌類におけるプラスミドの使用においていくつかの難点があり、 最も大きなものは形賀転換体の不安定性である。プラスミドがそれらの宿主にお いて本質的に不安定であることに加えて、タンパク質を発現する能力がそれを分 泌する宿主の能力より実質的に高いときは、過発現はプラスミド系において構造 的不安定性をもたらす。

即ち、高い複写数の染色体外プラスミド系に代わる別法が工業的環境において桿 菌類からクローン化タンパク質の効果的な発現のために必要である。

桿菌類宿主の染色体へ所望の遺伝子を安定に組み込むことは可能である。しかし ながら、もし染色体の組込みが１０〜２０個の複写に増幅されるなら、反復ＤＮ Ａ配列のために、宿主の構造不安定が結果として生じる。即ち、宿主の安定性を 維持するために、単一コピー（または、染色体の異なる部位に最大２種のコピー ）だけが染色体へ組み込まれたとき、工業用発酵における最適な大規模製造を成 し遂げる。

従って、低い遺伝子コピー数を補い、組換え型タンパク質の最大量を合成するた めに、強力で十分に有効な桿菌類において機能するプロモーターを必要とする。

桿菌類において、桿菌遺伝子、特に、外酵素をコード化する遺伝子の転写頻度に 負または正の影響を与える多数の遺伝子が開示されている。そのような遺伝子は エンハンサ−遺伝子と称される。エンハンサ−遺伝子は直接的にまたは間接的に 外酵素遺伝子の転写速度に影響する。それらの遺伝子の具体例は、以下のものを 含む：Ｂ、サチリス由来の５ａｃＱ、（ジャーナル・オブ・バクテリオロジー、 第１１６巻、１１３頁、（１９８６年）　）　、Ｂ、アミロリフファシェンス由 来の５ａｃＱ、（ジャーナル・オブ・バクテリオロジー、第１１６巻、１１３頁 、（１９８６年））、Ｂ、リヘニフォルミス由来の５ａｃＱ、（ジャーナル・オ ブ・バクテリオロジー、第１６９巻、３２４頁、（１９８７年））、Ｂ、　ナツ トまたはＢ、サチリス由来のｐｒｔＲ，（ジャーナル・オブ・バクテリオロジー 、第１６６巻、２０頁、（１９８６年）　）　、Ｂ、サチリス由来の５ａｃＶ、 （ＦＥＭＳ・レター、第４４巻、３９頁、（１９８７年）　）　、Ｂ、ナツトま たはＢ、サチリス由来の５ｅｎＮ、Ｃジャーナル・オプ・ジェネラル・ミクロバ イオロジー、第１３４巻、３２６９頁、（１９８８年）　）、Ｂ、サチリス由来 の５ａｃＵ（ジャーナル・オブ・バクテリオロジー、第１７０巻、５０９３頁（ １９８８年）およびジャーナル・オブ・バクテリオロジー、第１７０巻、５１０ ２頁（１９８８年））およびＢ、ステアロサーモフィラス由来のｄｅｇＴ（ジャ ーナル・オブ・バクテリオロジー、第１７２巻、４１１〜４１８頁（１９９０年 ））・５ａｃＵｂ（クンスト等、ＷＯ３９１０９２６４）は、１９７０年代初年 代間示された染色体突然変異体であり、Ｂ、サチリスにおけるプロテアーゼおよ びレバンスクラーゼの産生を増強する。（肩文字りは、過剰な産生を示す。）外 酵素の産生は５ａｃＵ−突然変異体を減少させる。

上記のエンハンサ−遺伝子すべては、標的遺伝子の転写（おそらく開始速度）に 直接的および間接的に影響するタンパク質／ペプチドをコード化する。例えば、 野生型５ａｃＱおよびｐｒｔＲ遺伝子の生成物（短鎖ペプチド）が過発現すると き、それら遺伝子がハシラス中細胞外酵素産生（主に、プロテアーゼ）を増強す る。エンハンサ−タンパク質の過発現は、多重複写プラスミド中へエンハンサ− 遺伝子をクローン化して得られ得る。

エンハンサ−タンパク質または増大した増強機能の過発現は、エンハンサ−タン パク質の構造遺伝子またはエンハンサ−遺伝子のプロモーター領域のいずれかに 影響するエンハンサ−遺伝子における突然変異により行われ得る（マサデック等 、ジャーナル・オブ・バクチオロジー、１７２巻、８２４〜８３４頁（１９９０ 年）；ヤング等、ジャーナル・オブ・バクチオロジー、１６６巻、１１３〜１１ ６頁（１９８６年）；ビオヒミー、５６巻、１４８１頁（１９７４年））。

バクラスエンハンサー遺伝子の効果は、特に、プロテアーゼおよびレバンスクラ ーゼ遺伝子発現に関して明らかである。それらの場合に、酵素産生（および転写 の量）の増加は、野生型細胞と比較して１０〜１００倍である。他の細胞外酵素 、例えば、アミラーゼ、ホスファターゼ、およびリボヌクレアーゼを用いると、 増加は、通常わずか２〜３倍である。Ｂ、サチリスのアルカリプロテアーゼ（ａ ｐｒ）およびレバンスクラーゼ（ｌｖｓ）タンパク質は、最良の被験例である。

５ａｃＵ、５ａｃＱおよびｈｐｒ−突然変異の標的領域の存在は、それら遺伝子 の各々のプロモーターの上流域で確認されている。Ｂ、サチリスアルカリプロテ アーゼ（ａｐｒＥ）プロモーターにおいて、５ａｃＵ３２　（Ｈｙ）および５ａ ｃＱ３６　（Ｈｙ）の両方の標的領域は、転写開始部位の上流、−１４１と−１ ６４ヌクレオチド間領域で発見されている。しかしながら、ｈｐｒ−９７突然変 異によるａｐｒＥプロモーターの刺激は塩基−２００の下流領域であることを要 する（ヘンネル、Ｄ、Ｊ、等、ジャーナル・オブ・バクテリオロジー、１７０巻 、２９６〜３００頁、（１９８８年））。

更に、５ａｃＵおよび５ａｃＱ突然変異の提案されたａｐｒ標的部位は、レバン スクラーゼ−遺伝子の上流域中ＤＮＡ配列に非常によく似たＤＮＡ配列を含む（ ジャーナル・オブ・バクチオロジー、１７０巻、２９６〜３００頁、（１９８８ 年））。ａｐｒとｌｖｓ遺伝子間の上流配列の類似性をＦ　ｉ　ｇ、　１に、ａ ｐｒの完全上流配列をＦｉｇ、２に示す。

バクラスまたはグラム陰性菌とは異種であるタンパク質の産生時、宿主に存在す るプロテアーゼの濃度が関与する。エンハンサ−遺伝子は、実質的にプロテアー ゼの産生に影響する。即ち、培養上清中プロテアーゼ活性の増加量は、製造収率 を著しく減少させ得る。２種の主要な細胞外プロテアーゼ遺伝子（バララス中プ ロテアーゼ活性の９５％を占めるａｐｒおよびｎｐｒ）が除かれた場合にでさえ 、桿菌中異種タンパク質の産生株の大部分と同様に、５ａｃＵＨｙまたは５ａｃ Ｑ　（ｐＵＢｌｌｏ）エンハンサ−の存在は、数種の少数のプロテアーゼの活性 化により、野生型レベルのプロテアーゼ活性の量を増加する。即ち、ダラム陽性 菌、特に桿菌において大規模量のクローン化タンパク質の産生のための効果的な 系の存在が必要である。

エンハンサ−遺伝子活性の標的領域は、ａｐｒ遺伝遺伝最中最終的義されていな い。エンハンサ−タンパク質とＤＮＡまたはこのＤＮＡの境界間の相互作用は証 明されてはおらず、標的領域がその本来の環境外で機能するかどうか判明してい ない。プロモーターからある一定の距離、またはＤＮＡ鎖のある一定の側のいず れかに、ａｐｒプロモーター（−３５および一１０領域）に関する特異的部位が 必須かどうかは判明していない。更に、ある種のＤＮＡ環境、例えば、その領域 中ＤＮＡの特異的屈曲または構造が必須であるかどうかは判明していない。これ らの同じ因子が異種の環境で増幅機能に影響し得るかどうかもまた判明していな い。最後に、実際の標的領域中でなく、他のａｐｒ配列が標的部位とともに機能 するかどうか、またはそれらの配列の欠損が増幅効果を減少し得るかどうかは判 明していない。それらおよび他の関係事項は、ここで開示した本発明に到達する 独自の方法において解決されている。

発明の概要 エンハンサ−タンパク質が調節遺伝子発現において作用するということが非常に 重要であることを認識して、Ｂ、サチリスにおける使用のための非常に効果的な 組換え遺伝子発現機構での必要性を認識して、発明者は、キメラプロモーター構 築における桿菌エンハンサ−レセプターモジュールの使用を研究してきた。

これらの努力は、桿菌における組換遺伝子発現の十分に効果的なハイブリッドプ ロモーターの開発をもたらした。

本発明は、まず第１にＲＮＡポリメラーゼ結合および／または開始のための機能 的転写モジュールを供与するα−アミラーゼプロモーターの遺伝的因子を提供す る。

本発明は、エンハンサ−タンパク質標的モジュール、即ち、エンハンサ−タンパ ク質作用に必要な機能的転写モジュールを供与する原核プロモーターの遺伝的因 子もまた提供する。

本発明は、更に、標的モジュールがＲＮＡポリメラーゼ開始モジュールと異種で あるＲＮＡポリメラーゼ開始モジュールに機能可能に結合したエンハンサ−タン パク質標的モジュールを含む十分に効果的なハイブリッドプロモーターを提供す る。

本発明は、更に、そのようなハイブリッドプロモーターを供与する発現ベクター 、そのような発現ベクターで形質転換された宿主、およびそのような宿主を使用 する遺伝子工学的、すなわち組換タンパク質の製造法を提供する。

図面の説明 Ｆ　ｉ　ｇ、　ｌは、５ａｃＵ３２　（Ｈｙ）のための標的：およびｓ　ａ　ｃ Ｑ　（Ｈｙ）刺激を含むａｐｒＥおよび５ａｃＢ上流域の比較である。５ａｃＢ 配列は、ヘネル、Ｄ、Ｊ、等、ジャーナル・オブ・バクチオロジー、１７０巻、 ２９６頁（１９８８年）およびシモッ、Ｈ等、ジャーナル・オブ・バクチオロジ ー、１６８巻、３８０〜３８８頁（１９８６年）からのものである。

アスタリスクは、同一のヌクレオチドを示す。転写開始部位に関する位置を示す 。

Ｆｉｇ、２は、ａｐｒ遺伝子のプロモーター領域の配列（ヘネル、Ｄ、Ｊ、等、 ジャーナル・オブ・バクチオロジー、１７０巻、２９６頁（１９８８年）および シモツ、Ｈｌ等、ジャーナル・オブ・バクチオロジー、１６８巻、３８０〜３８ ８頁（１９８６年））を示す。転写の５′末端は「＋１」と記す。断片Ｂに下線 を引いた。

Ｆ　ｉ　ｇ、３は、Ｂ、サチリスα−アミラーゼ遺伝子のＮＨ！領域のＤＮＡお よびアミノ酸配列である。エキソアミラーゼのＮＨ，末端バリンをアミノ酸１と する。

シグナル配列とエキソアミラーゼ間の切断を垂直線で示す。シグナル配列（アミ ノ酸−１から−３１）に下線を引く。矢印は、野生型Ｃ１ａ１部位およびα−ア ミラーゼプロモーター構築物の５°末端を示す。その上流に、新規のＣｌａＩ部 位が付加されている。記号１６０１−３０２．１６０１−３０３、および１６０ １−３０４それぞれの間のＤＮＡ配列が構築物３０２．３０３および３０４から 除かれている。

そのような記号は、塩基番号ではない。構築物３０２で削除された塩基は、塩基 １−４４である。構築物３０３で削除した塩基は塩基１−６９である。構築物３ ０４で削除された塩基は塩基１−９８である。

好ましい具体例の簡単な説明 ■、定義 以下の記載において、組換ＤＮＡ　（ｒＤＮＡ）技術で使用された多くの用語は 広く用いられる。明細書および請求の範囲の明確で一貫した理解を与えるために 、そのような用語に与えられるべき範囲を含んで、以下の定義を与える。

ｆｆ１ｆｆｉ＋　ＲＮＡポリメラーゼの鋳型を含むＤＮＡ配列。遺伝子から転写 されたＲＮＡはタンパク質をコード化し得、またはし得ない。タンパク質をコー ド化するＲＮＡはメツセンジャーＲＮＡ　（ｍＲＮＡ）と称する。

相補性ｒＤＮＡＪ　、すなわち、ｒｃＤＮＡＪ遺伝子は、ｍＲＮＡの逆転写によ り合成され、そのうちから介在配列（イントロン）が除去されている組換遺伝子 発現または間接的に増大するタンパク質をコード化する遺伝子を示すものである 。

しくは、ＤＮＡ）を示すものである。

プロモーター　ここで使用する場合の「プロモーター」は、最小限で、ＲＮＡポ リメラーゼ作用の結合部位または開始部位を提供するモジュールまたはモジュー ル群を示す。プロモーターは、一般に「モジュール」とここで定義した多重の機 能可能に結合した遺伝子因子からなる。

プロモーターモジュール　「プロモーターモジュール」中の用語「モジュール」 は、機能可能に結合したコード化配列または他の機能可能に結合したモジュール の転写の制御の幾つかの規準を与える遺伝子転写制御因子を示す。

プロモーター中の各モジュールは、宿主細胞転写機構に制御情報の特異部分を担 持し得る。プロモーター中央なくとも１つのモジュールは、ＲＮＡ合成の開始部 位の位置を定める機能を果たす。他のプロモーターモジュールは、転写開始の頻 度を制御する。典型的には、転写開始の頻度を制御するモジュールは、転写開始 部位の上流（即ち、５°方向）に位置するが、そのようなモジュールが開始部位 の下流（即ち、３°方向）にあってもよい。

ここで使用する用語「標的モジュール」は、もしそうでなければそのようなエン ハンサ−遺伝子活性に対して反応しない、または効果的にほとんど反応しないプ ロモーターにエンハンサ−遺伝子活性に反応する能力を与える転写調節因子を示 す（即ち、エンハンサ−遺伝子によりコード化されたそのようなタンパク質また はペプチド）。

用語「開始モジュールＪは、ＲＮＡポリメラーゼと機能可能に結合した遺伝子の 転写開始のために必須であるプロモーターモジュールを示す。原核プロモーター において、開始モジュールは、転写の開始部位から約−１０および−３５のヌク レオチドに通常位置する。

「ハイブリッドプロモーター」は、開始モジュールが、プロモーター中で異種の 標的モジュールに機能可能に結合しているプロモーターを意味する。開始モジュ ールと異種である標的モジュールは、宿主細胞中に本来はこの開始モジュールに 機能可能に結合した状態で、発見されない標的モジュールである。

機能可能な結合　配列が、配列（または複数の配列）の機能を変化し得る方法で 、別の配列（または複数の配列）に連結する結合である。例えば、本発明のハイ ブリッドプロモーターに機能可能に結合するタンパクコード化配列は、制御配列 の影響または制御下、タンパク質コード化配列を発現する。もしプロモーター機 能の導入が配列ｍＲＮＡタンパク質コード化配列ｍＲＮＡの転写をもたらすなら 、そしてもし２種のＤＮＡ配列間の結合の性質が、（１）フレームシフト突然変 異の導入をもたらさないなら、（２）結合、ｍＲＮＡまたはタンパク質の発現を 導く、発現調節配列能力により妨害されないなら、２種のＤＮＡ配列（例えば、 タンパク質コード化配列およびコード化配列の５′末端に連結したプロモーター 領域配列）は、機能可能に結合されたと称する。即ち、もしプロモーターがその ＤＮＡ配列の転写に影響を及ぼし得るなら、プロモーター領域はＤＮＡ配列に機 能可能に結合され得た。

クローニング・ベクター　「クローニング・ベクターＪは宿主細胞中で独自に複 製され得るプラスミド、ファージＤＮＡまたは他のＤＮＡ配列であって、それは 、１個または少数個のエンドヌクレアーゼ認識部位を特徴とし、その部位で、Ｄ ＮＡ配列がベクターの必須生物学的機能の損失なしに決定可能な方法で切断され 得、その部位中へＤＮＡがその複製およびクローニングを引き起こすためにスプ ライシングされ得る。更に、クローニング・ベクターは、クローニング・ベクタ ーで形質転換された細胞の同定に使用するのに適当なマーカーを含み得る。マー カー、例えば、エリスロマイシンおよびカナマイシン耐性である。用語「ビヒク ル」を、ときどき「ベクター」に使用する。

発現ベクター　「発現ベクター」は、宿主への発現ベクターの形質転換後、発現 ベクターにクローン化された構造遺伝子を発現し得ることを除いてクローニング ベクターと同様のベクターである。発現ベクターにおいて、クローン化構造遺伝 子（幾つかの重要なコード化配列）を、特定の宿主にそのような遺伝子を発現さ せ得るある制御配列（即ち、機能可能に結合した）の制御下に置く。本発明の発 現ベクターにおいて、所望の構造遺伝子は、本発明のハイブリッドブロモータ− に機能可能に連結する。発現制御配列は様々であり、更に、末端配列のような転 写因子および／または開始および末端部位のような翻訳因子を更に含み得る。

本発明の発現ベクターは、本発明のハイブリッドプロモーターを提供するもの以 外の発現カセットにおいて、所望のエンハンサー遺伝子をコード化する配列を更 に提供し得る。好ましい具体例において、そのようなエンハンサー遺伝子が、ハ イブリッドプロモーターの標的モジュールを調節するタンノくり質をコード化す るエンハンサ−遺伝子であってもよい。

機能的誘導体　核酸またはタンパク質のようなモジュールの「機能的誘導体」は 、本来のモジュールに由来し、本来のモジュールと同じでないことを除いて、本 来のモジュールの生物学的活性と実質的に類似である生物学的活性（機能的また は構造的のどちらか）を有するモジュールである。タンパク質の機能的誘導体は 、特異的機能の達成のためのそのような修飾の必要性に依存して、例えば、共有 結合した炭水化物などの翻訳後修飾を含んでいてもよ（、または含んでいな（て もよい。用語「機能的誘導体」は、モジュールの「断片」　「変異株」または「 化学的誘導体」を含むものである。

ここに記載する場合は、通常分子の一部分でない付加的化学的部分（ｍｏｉｅｔ ｙ）を含む時、分子は別の分子の「化学的誘導体」と称する。そのような部分は 、分子の可溶性、吸収、生物学的半減期等を改良し得る。その他に、部分は、分 子の毒性を減じ、分子の幾つかの望ましくない副作用を排除または減少などを行 い得る。

そのような効果を媒介し得る分子は、レミントンズ・ファーマス−ティカル・サ イエンシイズ（１９８０年）に開示される。そのような部分を分子に力・ノブリ ングするための方法は、当分野において周知である。

断片　核酸またはタンパク質などの分子の「断片」は、本来の分子の完全配列の 一部分を含む分子をいうものとする。

たは断片と同じでないことを除いて、完全分子またはその断片のいずれかに構造 または生物学的活性において実質的に同様の分子をいうものとする。変異形は、 本来の分子それ自身から必ずしも由来しない。即ち、２種の分子は、類似の活性 を有するならば、ここでその用語を用いる場合は、たとえ組成物または分子の一 方の第２次、第３次、または第４次構造が他方に見られるものと同じでないとし ても、または核酸の配列（または、アミノ残基）が同じでないとしても、または 変異形の一方の合成が他方から誘導されないとしても、変異形とみなされる。

Ｉｌ、プロモーターモジュールの同定 本発明は、桿菌発現系に使用するための異種の調節プロモーターモジュールを供 給するハイブリッドプロモーターを提供する。本発明により提供されるモジュー ルの１つは、開始モジュールである。本発明により提供される２番目のモジニー ルは標的モジュール、即ち、エンハンサ−タンパク質作用の標的要素である。

もしそのような標的モジュールがエンハンサ−遺伝子のタンパク質の標的である なら、本発明の標的モジュールを含む本発明のハイブリッドプロモーターは、い ずれもエンハンサ−遺伝子作用感受性である。

種々のプロモーターモジュールが、本発明のハイブリッドプロモーターで使用さ れ得、種々のエンハンサ−遺伝子および／またはエンハンサ−遺伝子突然変異体 に標的を与える。好ましい具体例として、本発明の標的モジュールは、野生型ａ ｐｒプロモーター、特に、Ｂ、サチリス　ａｐｒ　プロモーターに機能可能に結 合し、その５゛末端（上流に）見られるものである。

本発明では、標的モジュールが、ＲＮＡポリメラーゼ開始部位を供与する異種開 始モジュールに機能可能に結合するとき、得られたプロモーターはエンハンサ− 遺伝子作用またはそのようなエンハンサ−遺伝子における突然変異に応じて、過 発現および分泌に対して反応性が高くなる。

本発明のハイブリッドプロモーターにおいて、種々のプロモーターから分離した モジュールを結合して、個々のモジュールが、機能可能に結合したコード化配列 の転写を活性化するように協力してまたは独立して機能するようにする。本発明 のハイブリッドプロモーター中に存在するモジュールは、突然変異またはモジュ ール間の境界で新規の配列連結部の形成により更に修飾され得る。そのような突 然変異は、遺伝子情報の削除、追加または複製であってもよい。本発明のハイブ リツドプロモ一ター中モジユール間の間隔は自由に変えることができ、唯一の制 限は、プロモーター機能を保護しなければならないことである。

本発明のハイブリッドプロモーター遺伝子工学的方法は、特異的転写プロモータ ーモジュールの提供が可能な遺伝子配列のクローン化によって容易になる。プロ モーターモジュールの提供可能な遺伝子配列は、ゲノムＤＮＡ、合成りＮＡ、ク ローン化ＤＮＡおよびそれらの組み合わせから得る。もしモジュールの機能が形 質転換宿主細胞中に維持されているなら、どんな資源でも用い得る。本発明のプ ロモーターモジュールの好ましい資源種は桿菌である。

本発明の好ましいハイブリッドプロモーターのおいて、Ｂ、サチリスアルカリプ ロテアーゼ遺伝子（ａ　ｐ　ｒ）からの標的モジュールは、Ｂ、アミノリクフ７ シエンス・α−アミラーゼ遺伝子の開始モジュールに機能可能に結合される。エ ンハンサ−活性を促進するための標的配列を提供するアルカリプロテアーゼ遺伝 子プロモーターはどのようなものでも使用され得る。特に、５ａｃＵ″、５ａｃ Ｑ。

またはｐｒｔＲエンハンサ−／突然変異の認識し得る幾つかのモジュールが好ま しい。

標的モジュールの同定は、そのような反応に通常反応性のない（または通常はと んど反応性のない）プロモーターへのエンハンサー遺伝子作用に対する感受性を 伝達する推定的なモジュール活性を試験して行われる。

本発明によれば、ハイブリッドプロモーターは、標的活性を示す何らかの方法で 、どのようなり、サチリスエンハンサ−タンパク質をも設計し得る。例えば、そ のような設計方法は、（１）発現をエンハンサータンパク質に応じて増大するタ ンパク質の確認、（２）そのようなタンパク質の５°転転写節領域のクローン化 、（３）当分野における公知の方法を使用して開始モジニールと推定的標的モジ ュールを機能可能に結合する構築物中にそのような５゛領域の断片のサブクロー ン化、および（４）エンハンサ−遺伝子またはその突然変異株を提供する宿主を 使用してレポータータンパク質の増強タンパク質発現を表すそれらのクローンの 選択を含み得る。エンハンサ−遺伝子５ａｃＱ（特に、Ｂ、サチリス、Ｂ、アミ ロリフファシェンス、またはＢ、リヘニフォルミスからの５ａＣＱ）、ｐｒｔＲ （特に、Ｂ、ナツト、またはＢ、サチリスからのｐｒｔＲ）　、５ａｃＶ　（特 に、Ｂ、サチリスからの５ＢｃＶ）　、５ｅｎＮ　（特に、Ｂ、ナツトまたはＢ 、サチリスからの５ｅｎＮ）　、５ａｃＵ　（特に、Ｂ、サチリスからの５ａｃ Ｕ）およびｄｅｇＴ（特に、Ｂ　ステアロサーモフィルスからのｄｅｇＴ）に対 応するハイブリッドプロモーターは、この方法で設計され得る。

本発明によると、標的モジュールを１個だけ含む、またはともに機能可能に結合 した１個以上の標的モジュールに含むハイブリッドプロモーターを設計し得る。

例えば、ａｐｒ遺伝子のＢ領域のようなより広いエンハンサ−標的領域は、数種 のエンハンサ−遺伝子生成物の標的モジュールを担持する。即ち、開始モジュー ルに各エンハンサ−の所望の標的モジュールを機能可能に結合して１個以上のエ ンハンサ−遺伝子に対応し得るハイブリッドプロモーターを設計し得る。

本発明のモジュールのクローニングは、モジュールは一般に、大きさがＰＣＲに より増幅され得る大きさ一致しているので、ポリメラーゼ鎮反応（ＰＣＲ）の使 用により容易になされる。所望の遺伝子の５°末端領域の配列が公知であれば、 ＰＣＲプライマー（当分野において周知の方法で化学的に合成されるか、または 市販されている）が、次のクローニングおよび上記の特徴付けのために５°領域 の特異的配列を増幅するのに使用され得る。

ＩＩｌ、タンパク賀コード化配列の遺伝子工学本発明のハイブリッドプロモータ ーの制御下発現するタンパク質コード化配列の遺伝子工学は、これらの配列のク ローニングにより容易になされる。

タンパク質コード化配列を含む原核ゲノムＤＮＡは、転写ユニット間にスペサー を含むが、イントロンを含まない。真核配列をコード化するタンパク質コード化 真核配列を含む真核ゲノムＤＮＡは、天然発生のイントロンを含み得るか、また は含み得ない。本発明の原核宿主中の発現のために、そのようなイントロンは、 クローニング前に除去されねばならない。もしそうでなければ、原核生物または 真核生物コード化配列のいずれかが、本発明の宿主中に発現され得る。更に、そ のようなゲノムＤＮＡは３′転写末端領域と結合して得られ得る。更に、そのよ うなゲノムＤＮＡは、所望のｍＲＮＡの５°非翻訳領域をコード化する遺伝子配 列、および／または３′非翻訳領域をコード化する遺伝子配列とともに得られ得 宿主細胞がｍＲＮＡおよびタンパク質の発現に関与する転写および／または翻訳 調節シグナルを認識し得る程度であって、そのようなシグナルが本発明のハイブ リッドプロモーターを妨害しない程度であるとき、本来の遺伝子の５′および／ または３°非転写領域、および／またはｍＲＮＡの５′および／または３゛非翻 訳領域は維持され、転写および翻訳調節のために使用され得る。

遺伝子が発現前に再配列されないタンパク質のコード化配列を得るために、ゲノ ムＤＮＡは、細胞がタンパク質を発現するか、またはしないのいずれであっても 、コード化配列を担持する宿主の細胞から抽出し、精製し得る。遺伝子が発現前 に再配列されているタンパク質のコード化配列を得るために、ゲノムＤＮＡは、 当該タンパク質を発現する細胞から抽出し、精製し得る。

ゲノムＤＮＡの抽出は当分野の周知の方法により行われ得る（例えば、ガイド・ トウ・モレキュラー・クローニング・テクニックス、Ｓ、Ｌ、ベルガー、ｅｄｓ 。

アカデミツク・プレス（１９８７年）参照）。

別法として、所望のタンパク質をコード化する核酸配列は、そのタンパク質に特 異的なｍＤＮＡをクローン化することにより得られ得る。ｍＲＮＡは当該タンパ ク質を本発明の宿主中に生成または発現する細胞から分離し得、当技術の周知の 方法によりｃＤＮＡを製造するのに使用され得る（例えば、ガイド・トウ・モレ キュラー・クローニング・テクニックス、Ｓ、　Ｌ、ベルガー、ｅｄｓ、アカデ ミツク・プレス（１９８７年）参照）。好ましくは、使用されるｍＲＮＡ調製物 は、当然に、多量のタンパク質を産生する細胞から分離するか、または、インビ トロで、スクロース勾配遠心分離のような特異的配列のｍＲＮＡ調製物の濃縮に 常用される技術のいずれか、または両方により、所望のタンパク質をコード化す るｍＲＮＡを濃縮する。

クローン化ベクターまたは発現ベクター中へクローン化のためのＤＮＡを製造す るために、適当なりＮＡ調製品（ゲノムＤＮＡまたはｃＤＮＡのいずれか）は、 それぞれ無作為に切断されるかまたは酵素で開裂される。ついで、そのようなり ＮＡは、適当なベクターへ連結され、組換え遺伝子（ゲノムまたはｃＤＮＡのい ずれか）ライブラリーを形成し得る。

当該タンパク質をコード化するＤＮＡ配列またはその機能的誘導体は、ライゲー ションのための鈍端またはジグザク末端、適当な末端を提供する制限酵素消化、 適当な付着末端の充填、望ましくない結合を避けるためのアルカルホスファター ゼ処理および適当なりガーゼでの結合を含む常用技術に従って、クローニングベ クターまたは発現ベクターへ挿入され得る。そのような操作法は、マニアニス、 Ｔ９等、モレキュラー・クローニング（ア・ラボラトリ−・マニュアル）、コー ルド・スプリング・ハーバ−・ラボラトリ−１１９８２年）により開示され、当 技術の熟練者に周知である。

所望のタンパク質または所望の転写調節因子をコード化するクローンを含むライ ブラリーは、スクリーニングされ得、所望のクローンは、当該ＤＮＡを特異的に 選択する方法により同定され得る。例えば、上記のように、もし所望の転写調節 因子へのクローンが所望されるなら、そのようなりローンは、クローン化配列で 形質転換された宿主細胞にそのような因子に特異的な機能を提供する所望の因子 の能力により同定され得る。同様の方法で、所望のタンパク質へのクローンが所 望されるなら、そのようなりローンは、例えば、ａ）このタンパク質のＤＮＡの 特異的配列を含む適当な核酸プローブでのハイブリッド化、またはｂ）当該クロ ーンにハイブリッドする本来のｍＲＮＡがインビトロで翻訳され、翻訳生成物が 更に特徴づけられるハイブリッド化−選択翻訳分析またはＣ）クローン化遺伝子 配列が独自にｍＲＮＡの発現可能なら、クローンを含む宿主により産生された翻 訳タンパク賃生成物の免疫沈降によることを含むそのようなタンパク質またはそ のようなタンパク質のｍＲＮＡを同定するの使用される方法により同定され得所 望のタンパク質に特異的な、または所望の転写調節因子に特異的なオリゴヌクレ オチドプローブは、所望のクローンを同定するのに使用され得る。そのようなプ ローブは、因子の核酸配列の知識または所望のタンパク質のアミノ酸配列から設 計され得る。ペプチド中アミノ酸残基の配列は、ここでは常用の３文字または１ 文字表示のどちらかを使用して表示している。３文字および１文字表示の配列表 は、バイオケミストリー、レニンガー、Ａ、ワース・パブリシャー、ニューヨー ク、ニューヨーク（１９７０年）のテキストにおいて見られる。アミノ酸配列を 横書きするとき、アミノ末端は左に、その反対でカルボキン末端は右に位置遺伝 子コードは変化するので、１個以上のコドンが特定のアミノ酸をコード化するの に使用し得る（ワトソン、Ｊ、Ｄ、：モレキュラー・バイオロジー・オブ・ザ・ ジーン、３版、Ｗ、Ａ、ベンジャミン、メン口・パーク、カルフォルニア（１９ ７７年）、３５６〜３５７頁）。ペプチド断片を分析し、低い程度の変化を有す るオリゴヌクレオチドによりコード化され得るアミノ酸の配列を同定する。これ は、好ましくは単一コドンだけによりコード化されたアミノ酸を含む配列を同定 することにより完了する。

アミノ酸配列は、場合により単一オリゴヌクレオチド配列だけによりコード化さ れ得るけれども、多くの場合、アミノ酸配列は、類似のオリゴヌクレオチドのセ ットによりコード化され得る。重要なことには、このセットの構成因子のすべて は、同じペプチド断片をコード化し得るオリゴヌクレオチド配列を含む、即ち、 ペプチド断片をコード化する遺伝子と同じオリゴヌクレオチド配列を潜在的に含 むが、セットのうちの唯一の構成因子は、この遺伝子の配列をコード化するエキ ソンと同じヌクレオチド配列を含むことである。この構成因子がセット内に存在 し、セットの他の構成因子の存在下でさえ、ＤＮＡにハイブリダイズするのが可 能であるために、ペプチドをコード化する遺伝子をクローン化するのに単一オリ ゴヌクレオチドを使用するのと同じ方法でオリゴヌクレオチドの未分画セットを 使用するのが可能である。

遺伝子コードを使用して（ワトソン、Ｊ、Ｄ、：モレキュラー・バイオロジー・ オブ・ザ・ジーン、第３版、Ｗ、　Ａ、ベンジャミン、Ｉｎｃ、、メン口・パー ク、カルフォルニア（１９７７年））、１個またはそれ以上の種々のオリゴヌク レオチドを、所望のタンパク質をコード化し得るアミノ酸配列の各々から同定し 得る。

実際に、特定オリゴヌクレオチドが当面のタンパク質コード化配列を構成するで あろう確率は、異常塩基対合および真核細胞における特定コドンを（特定アミノ 酸をコード化するのに）実際に使用された頻度を考慮して推定し得る。

そのような「コドン使用規則」は、プレス、Ｒ等、ジャーナル・オブ・モレキュ ラー・バイオロジー、１８３巻＝１〜１２頁（１９８５年）により開示されてい る。プレスのＵコドン使用規則」を用いて、ヒト分泌顆粒プロテオグリカン配列 のコード化し得る理論上「非常に確からしい」ヌクレオチド配列を含む、単一オ リゴヌクレオチド配列またはオリゴヌクレオチドのセットを同定する。

所望の遺伝子（またはオリゴヌクレオチド、またはオリゴヌクレオチドのセット に相補的である）の断片をコード化し得る適当なオリゴヌクレオチドまたはオリ ゴヌクレオチドのセットは当分野の公知の方法（例えば、シンセシス・アンド・ アプリケーション・オブ・ＤＮＡ・アンド・ＲＮＡ、Ｓ、Ａ、ナラジグ、ｅｄ、 、１９８７年、アカデミツク・プレス、サンディエゴ、カルフォルニア）により 合成し得、プローブとして使用し、当技術の周知の方法によりクローン化遺伝子 を同定し、分離される。核酸ハイブリッド化およびクローン同定の技術は、マニ アチス、Ｔ１等（モレキュラー・クローニング、ア・ラボラトリ−・マニュアル 、コールド・スプリング・ハーバ−・ラボラトリーズ、コルード・スプリング・ ハーバ−、ニューヨーク（１９８２年））、およびヘームス、Ｂ、　Ｄ、等にュ ークレック・アラシド・ハイブリダイゼーション、ア・プラティカル・アプロー チ、ＩＲＬ・プレス、ワシントン、ＤＣ（１９８５年）により開示され、これら の文献はここに引用して明細書の一部とする。そのようなハイブリダイゼーショ ンが可能であることが判明した上記の遺伝子ライブラリーのこれらの構成因子を ついで分析し、それらが含む配列の範囲および性質を決定する。

所望のコード化配列の検索を容易にするために、上記のＤＮＡプローブは検索可 能な基で標識し得る。そのような検索可能な基は、検索可能な物理的または化学 的な性質を有するいずれの物質であってもよい。そのような物質は、核酸ハイブ リダイゼーションの分野で十分開発されており、一般にそのような方法に有用な 多くの標識のいずれでも本発明に適用し得る。特に、放射能標識、例えば、３！ Ｐ％　３Ｈ，”ＣＳ”Ｓ％　””Ｉなどは、有用である。十分なシグナルを提供 し、十分な半減期を有するいずれかの放射能標識でも使用し得る。オリゴヌクレ オチドは、放射活性的に標識化、例えば、周知の方法による「ニックトランスレ ーション」により、例えば、リグビー、Ｐ、Ｊ、Ｗ、等、ジャーナル・オブ・モ レキュラー・バイオロジー、１１３巻＝２３７頁（１９７７年）に記載の方法に より、およびＴ４ＤＮＡポリメラーゼ置換合成法、例えば、ディーン、Ｋ、Ｃ， 等、アナリティカル・バイオケミストリー、１３５巻：４５６頁（１９８３年） に記載の方法により放射能標識化される。

別法として、ポリヌクレオチドは、非放射性マーカー、例えば、ビオチン、酵素 または、蛍光基で標識されるとき、核酸ハイブリッド化プローブとしても有効で ある。例えば、リアリー、Ｊ、Ｊ、等、プロシーディング・オブ・ナショナル・ アカデミ−・サイエンシイズ、ニーニスニー、８０巻、４０４５頁（１９８３年 ）；ラング、Ｍ等、二ニークレイツク・アシッド・リサーチ、１２巻、３４３５ 頁（１９８４年）：および、ラング、Ｍ、、Ｅｌ！ＢＯ・ジャーナル、６巻、８ １７頁（１９８３年）。

構造的α−アミラーゼ遺伝子をクローン化するために、Ｂ、サチリス、株ｌＨ６ ０６４を宿生として使用され得る。Ｂ、サチリス株ｌＨ６０６４は、セントラル ・パブリック・ヘルス・インスティチュート（ＣＰＨＩ）、ヘルシンキ、フィン ランドから入手できる。株ｒＨ６０６４は、株ＢＧＳＣ株ｌＡ４６　（ｒｅｃＥ ４、ｔｈｒ−５、ｔｒｐＣ２）から分離したＤＮＡでＢＧＳＣ株ｌＡ２８９　（ ａｒｏ１９０６、ｍｅｔＢ５．５ａｃＡ３２１．ａｍｙＥ）を形質転換して構築 された。ａｍｙＥは、アミラーゼ構造遺伝子の省略記号である。芳香族アミノ酸 （ａｒｏＩマーカー）無含有最小平板培地で成育できる形質転換体を選択して、 ついでα−アミラーゼ陽性表現型をスクリーニングする。ａｒｏｌおよびａｍｙ Ｅマーカーは連結マーカーであることが知られており、したがってａｒｏＩ選択 でいつも高収率のａｍｙ”形質転換体が得られる。この形質転換体は、株ｌＨ６ ０６４（ｍｅｔＢ５ｓａｃＡ３２．１）をもたらした。本発明で使用のα−アミ ラーゼ野生型配列を得るために、特定の株ｌＨ６０６４の使用は不必要であり、 いずれかの野生型Ｂ、サチリスのマールブルグ株（例えば、ＢＧＳＣから入手で きる株）も、同じ結果を与える。更に、本発明は、桿菌または他の原核生物から 当該他の配列が、ここに記載の技術と同様の方法、またはそうでなければ当技術 の周知の方法でクローン化され得るので、本発明はα−アミラーゼ発現に限るも のではない。

すなわち、要約すると、ペプチド配列の当該同定は、そのようなペプチドのコー ド化を可能にする、理論上「非常に確からしいＪ　ＤＮＡ配列、またはそのよう な配列のセットの同定を可能にする。この理論上の配列に相補的オリゴヌクレオ チドの構築により（または、「非常に確からしい」オリゴヌクレオチドのセット に相補的オリゴヌクレオチドのセットを構築することにより）、所望のタンパク 質またはＤＮＡ！１節因子を含むクローンの同定および分離のためのプローブと して機能し得るＤＮＡ分子（ＤＮＡ分子のセット）を得る。

したがって、上記に論議した方法で、所望の調節因子、タンパク質、または、そ のような調節因子またはタンパク質の断片をコード化し得る遺伝子配列を同定し 得る。タンパク質コード化遺伝子配列を更に特徴づけるために、特に、組み換え タンパク質を製造するために、それらの配列がコード化するタンパク質を発現す ることが望ましい。転写調節因子を更に特徴づけるために、所望の遺伝子の転写 を調節するための因子を利用することが望ましい。

そのような発現は、所望のタンパク質の特性を有するタンパク質を発現するか、 または所望の調節因子の特徴的方法でタンパク質の発現を調節するそれらのクロ ーンを同定する。タンパク質に対する独特な特性は、特に、そのようなタンパク 質に対する抗体を特異的に結合する能力、タンパク質に結合し得る抗体の産生を 誘発する能力および宿主細胞にタンパク賀特異的機能を供与する性質を含み得る 。

ＩＶ、本発明の発現ベクターを使用するタンパク質の発現所望のタンパク質を発 現するために、適当な宿主により認識され得る転写および翻訳シグナルが必要で ある。上記の方法で得たクローン化タンパク質コード化配列は、好ましくは二重 鎖形態において発現ベクター中の転写発現を制御する配列に機能可能に結合し得 、特に、本発明のハイブリッドプロモーターに機能可能に結合し得る。そのよう な配列は、宿生細胞に導入され得、組み換えタンパク質または機能的な誘導体を 製造する。

本発明によれば、所望のエンハンサ−遺伝子を提供し得、本発明のハイブリッド プロモーターがそのようなエンハンサ−遺伝子に反応し得る、いずれの原核宿主 も利用し得る。好ましい具体例において、グラム陰性菌、例えば、バクルスまた はクロストリジウム・ベルフリンゲヌス、またはＣ，テタヌスは宿主として使用 される。より所望の具体例において、バクルス種の１種は宿主として使用される 。そのような種属は、Ｂ、サチリス、Ｂ、リヘニフォルミス、Ｂ、アミロリフフ ァシェンス、Ｂ、ポリミクサ、Ｂ、ステアロサーモフィラス、Ｂ、スルモプロテ オリティクス、Ｂ、コアギユランス、Ｂ、スリンジエンシス、Ｂ、メガテリウム 、Ｂ、セレウス、Ｂ　ナツト、またはＢ、アシドカルダリウスを含む。特に好ま しい具体例では宿生細胞はＢ、サチリスである。

もし、転写ＴＡ節情報を含む発現制御配列を含み、そのような配列がポリペプチ ドをコード化するヌクレオチド配列に「機能可能に結合した」なら、核酸分子、 例えば、ＤＮＡはポリペプチドを発現し得たと称する。

遺伝子発現に必要である！１ｉ節領域の厳密な性質は、種または細胞型間で変更 し得るが、転写および翻訳のそれぞれの開始を含む５゛非転写及び５゛非翻訳（ 非コード化）配列を一般に必須として含むであろう。特に、５′非非転写制御列 は、機能可能に結合した遺伝子の転写Ｍ御のための本発明のハイブリッドプロモ ーターを含む領域を含むであろう。

原核宿主における組み換えタンパク質の発現は、そのような宿主、および好まし くは原核調節系において機能する調節領域の使用を必要とする。転写および翻訳 調節配列の広範囲の変形が、原核宿主の性質に依存して使用され得る。好ましく は、これらの調節シグナルは、宿主細胞における高水準の発現が可能である特定 の遺伝子と結合している。

所望により、所望のタンパク質の融合生成物を構築し得る。例えば、所望のタン パク質をコード化する配列は、宿生細胞からのタンパク質の分泌、および宿主細 胞におけるタンパク質の区画化を可能にするシグナル配列に結合し得る。そのよ うなシグナル配列は、特異的プロテアーゼ部位を用いて、または用いないで設計 され得、シグナルペプチド配列は、ついで排除する。別法として、タンパク質の 本来のシグナル配列、またはベクターと本来のシグナル配列の組合せを、使用し 得る。

本発明のハイブリッドプロモーターに機能可能に結合し得る転写開始調節シグナ ルが、選択され、これが抑制または賦活させるので、機能可能に結合した遺伝子 の発現は特定の方法で調整され得る。

本来の発現制御配列シグナルが所望の宿主細胞において十分に機能しない場合、 宿主細胞において機能する配列に置換し得る。

本発明のＤＮＡ構築物で宿主細胞を形質転換するために、多くのベクター系が利 用でき、宿主細胞染色体ＤＮＡへ遺伝子ＤＮＡ構成因子を挿入するか、または染 色体外形態で遺伝子ＤＮＡ構成因子を存在させ得るのが望ましいかどうかによっ て変わる。

遺伝的に安定な形質転換体は、ベクター系、または形質転換系を用いで構築され 得、その際、所望のタンパク質ＤＮＡを宿主染色体に組み込む。そのような組み 込みは、細胞内部で新しく生じ得、または非常に好ましい具体例において宿主染 色体へそれ自身を機能的に挿入するベクターで形質転換により補助され得た。

例えば、そのようなベクターは、染色体中ＤＮＡ配列の組み込みを促進するＤＮ Ａ配列因子を提供し得る。好亥しい具体例において、そのようなりＮＡ配列因子 は、宿主染色体に存在する配列と同−源である配列であるので、組み込みはゲノ ム配列の遺伝子座を目的とし、宿主染色体におけるその遺伝子座での組み込みを 目的とする。

それらの染色体に導入されたＤＮＡを安定に組み込んだ細胞を、宿主中に発現ベ クターを含む宿主細胞の選択を可能にする１またはそれ以上のマーカーもまた導 入することにより選択される。例えば、マーカーは有害物質耐性、例えば、抗生 物質耐性などを与え得る。選択可能なマーカー遺伝子は、発現されるべきＤＮＡ 遺伝子配列に直接結合し得るか、または共形賀転換により同じ細胞に導入し得る 。

形質転換された配列は、受容宿主中で自己複製可能なプラスミドまたは他のベク ターと組み合わせ得る。桿菌ためのベクターの広範囲の変形体のいずれも、この 目的のために使用し得る。組換え型タンパク質を分泌するより細胞質的に発現す ることを希望するとき、プラスミドベクターは特に有効である。

特定のベクターを選択する時の重要な因子には次のようなものが含まれる：ベク ターを含む受容細胞が認識し得る、およびベクターを含まない受容細胞から選択 され得る容易さ；特定の宿主において所望されるベクターの複写数；および異種 の宿主細胞間でベクターが「往復する」ことができることが望ましいかである。

構築物を含むベクターまたはＤＮＡ配列の発現用に調製されたとき、ＤＮＡ構築 物は多様な適当な修飾方法のいずれかにより適当な宿主細胞へ導入される。ベク ターの導入後、受容細胞は、ベクター含有細胞の成育を選択する選択培地中で成 育する。クローン化遺伝子配列の発現は、所望のタンパク質の産生をもたらす。

この発現は、形質転換細胞中で連続的方法または制御された方法で生じ得る。

発現タンパク質を常用条件、例えば、抽出、沈殿、クロマトグラフィー、アフィ ニティークロマトグラフィー、電気泳動などにより分離および精製する。

本発明のハイブリッドプロモーター、ベクターおよび方法は特異的エンハンサ− 遺伝子に反応するそれら遺伝子の同定およびそのような遺伝子における所望の突 然変異株の同定に有用である。本発明のハイブリッドプロモーター、ベクターお よび方法は、本発明のハイブリッドプロモーターに機能可能に結合する同種およ び異種遺伝子の発現にも有用である。そのようなタンパク質は、桿菌宿主中細絶 間または細胞外のいずれかで発現し得る。

以下の実施例は詳細に述べることが目的であり、発明の範囲を制限するものでな い。

実施例 実施例１ α−アミラーゼ組込みベクターの構築 バクラス・アミロリフファシェンスからα−アミラーゼ遺伝子をプラスミドｐＵ ＢＩＩＯ中クローン化し、プラスミドｐＫＴＨ１０（ジーン、１９巻、８１〜８ ７頁（１９８２年））を得る。プラスミドｐＵＢ１１０　（グリクザン、Ｔ、Ｊ 。

等、ジャーナル・オブ・バクチオロジー、１３４巻、３１８頁（１９７８年）） は、バンルス・ジェネティックス・ストック・センター（ＢＧＳＣ）　、オハイ オ・ステート・ユニバシティ、デパートメント・オブ・バイオケミストリー、４ ８４ウエスト・トゥエルブス・アベニュー、コロンブス、オハイ第４３２１０、 ニーニスニー（１８６株）から容易に入手し得、ＢＧＳＣのスティン・アンド・ データ・４版（１９８９年）の制限マツプを用いて完全に記載されている。ｐＫ ＴＨｌｏから、下流または上流の転写終末シグナルとともに、完全α−アミラー ゼ遺伝子をＣ１ａｌおよびＢａｍＨＩ消化で分離し、ｐＢＲ３２２の均等部位に 連結した。ハイブリッドプラスミドをエシェリキア・コリ　ＤＨ５α（ジャーナ ル・オブ・モレキュラー・バイオロジー、１６６巻、５５７頁（１９８３年）） 中形質転換し、形質転換体をＬ−１％ｗ／ｖ可溶性デンプンーアンピシリン（ａ 　ｐ。

２５μｇ／ｍｌ）プレートで平板培養した（ルリア寒天プレート、ミラー、Ｊ。

Ｈ９、エクスペリメント・イン・モレキュラー・バイオロジー、コールド・スプ リング・ハーバ−、ニューヨーク、１９７２年：デンプンは、シグマ社製である 。

）。α−アミラーゼプラスミドを含むコロニーを、プレート上エシェリキア・コ リコロニーを発現するα−アミラーゼの付近の「ハロ」から容易に検出された。

α−アミラーゼｐＢＲ３２２プラスミドに、α−アミラーゼ遺伝子の下流Ｂａｍ Ｈ１部位に、Ｂ、サチリスｌＨ６０６４の染色体ＤＮＡからの２ｋｂ断片を挿入 した（この断片は、Ｂ、サチリス中染色体組込み中の組換え部位に使用され得る ことが早くから特徴とされている）。組込みのために染色体断片番クローン化す るこのアプローチは、アプライド・マイクロバイオロジー・アンド・バイオテク ノロジー、２７巻、６４〜７１頁、（１９８７年）に詳細に記載されている。更 に、プラスミドｐｃ１９４　（ＢＧＳＣから１２１７株として入手できる）から クロラムフェニコール耐性遺伝子（ｃｍ）をｐ　ＢＨ３２２のｐｖｕＩＩに連結 した。

α−アミラーゼ、Ｂ、サチリスの染色体断片およびｐｃ１９４からのｃｍ−遺伝 子を含むハイブリッドｐＥＲ３２２プラスミドを、制限酵素分析により特徴づ１ 九ｒｐＫＴＨＡ１６０１Ｊを命名した。

次ぎの工程として、新規のＣ１ａｌクロ一ニング部位をα−アミラーゼプロモー ターの一３５領域の上流に構築した（新規なＣｌａ部位の下流、α−アミラーゼ 遺伝子のクローン化に使用した）。新規のＣｌａＩ部位（３１１所）を、本明細 書に記載のＰＣＲ断片を使用して組み込んだ。これらの断片の５′末端は一３５ 領域の上流所定位置のＣｌａｌ部位から成り、３′末端をα−アミラーゼ遺伝子 の構造部分内のＨｉｎｄ部位であった。５゛末端−切断Ｃ１ａｌ−ＨｉｎｄＩｌ ｌ−ａ−アミラーゼ断片はｐＫＴＨ１６０１の新規な野生型Ｃ１ａｌ−Ｈｉｎｄ ＩＩＩ断片と置換するのに使用した。新規の構築物をｒ３０２Ｊ　ｒ３０３Ｊお よびｒ３０４Ｊで表した。

構築物３０２のＰＣＲに使用されたプライマー配列は：５−ＴＴＣＴＡＴＣＧＡ ＴＣＡＴＣＡＧＡＣＡＧＧＧＴＡＴＴＴＴＴＴＡＴＧである。

構築物３０３のＰＣＲプライマーは： ５°−ＴＴＣＴＡＴＣＧＡＴＧＴＣＣＡＧＡＣＴＧＴＣＣＧＣＴＧＴＧＴＡであ る。

構築物３０４のＰＣＲプライマーは： ５′−ＴＴＣＴＡＴＣＧＡＴＧＧＡＡＴＡＡＡＧＧＧＧＧＧＴＴＧＴＴＡＴＴで ある。

構築物３０２．３０２および３０４の３゛末端のために、以下の３°プライマ５ °−ＣＡＣＧＧＡＴＴＧＡＴＴＡＡＡＧＣＴＴＧＴＴを使用した。

ｐＫＴＨ１６０１において、および構築物３０２．３０３、および３０４におい て、ＣｌａＩ部位の上流ＤＮＡ配列は同じである（ｐＢＲ３２２配列）。新規な Ｃｌａｌ部位の位置をＦｉｇ、３に示す。

実施例２ α−アミラーゼ組込みベクターの異なる位置で潜在的エンハンサ−受容体の付加 エンハンサ−受容体として潜在的に作用し得るＤＮＡ配列は、α−アミラーゼプ ロモーター中に挿入されるとき、Ｂ、サチリスのアルカリプロテアーゼ遺伝子（ ａｐｒ）から由来した。２種の配列を使用した。第１の配列は、４８−ｂｐ断片 （Ｆｉｇ、１）であり、５ａｃＱおよ５ａｃＵ受容体であることが示唆されてい る（ジャーナル・オブ・バクチオロジー、１７０巻、２９６〜３００頁（１９８ ８年））。これはオリゴヌクレオチド合成によりつくられ、Ｃｌａｌ部位に隣接 している。このオリゴヌクレオチドを「レセプターＡ」と称する。第２の配列は 、プロモーターの上流−３００ｂｐ領域からなる（Ｆｉｇ、２の下線部）。断片 はＢ、サチリスｌＨ６０６４の染色体からＰＣＲにより製造され、Ｃｌａｌ部位 に隣接し、「レセプターＢ」と称する。レセプターＡをｐＫＴＨＡ１６０１およ び構築物３０２．３０３、および３０４のＣｌａＩ部位中単−の複写断片として 挿入した。ハイブリッドベクターをエシェリキア・コリＤＨ５α中に形質転換し 、ハイブリッド化陽性クローンをＤＮＡ配列決定により特徴づけ、それぞれ［ｐ ＫＴＨＡ１９１０Ｊ　ｒ１９１１Ｊ　ｒ１９１２Ｊおよびｒ１９１３Ｊと命名し た。

レセプターＢを同様にプラスミドｐＫＴＨ１６０１および３０２のＣｌａＩ部位 に連結し、制限酵素分析およびＤＮＡ配列決定により特徴づけ、それぞれｒｐＫ ＴＨ１９７４Ｊ　ｒｐＫＴＨ１９７５Ｊとそれぞれ称する。

実施例３ Ｂ、サチリスｌＨ６０６４の染色体へ野生型および修飾α−アミラーゼ遺伝子の 組込み エンハンサ−の効果を試験するために、野生型Ｂ、サチリスα−アミラーゼ遺伝 子（ｐＫＴＨ１６０１）および修飾α−アミラーゼ（１９１０−１９１３および １９７４−５）遺伝子をＢ、サチリスの染色体中に組み込んだ。野生型Ｂ、アミ ロリクファシエンスα−アミラーゼ遺伝子の資源としてｐＫＴＨ１６０１を使用 する必要はな（、突然変異α−アミラーゼ遺伝子を含まないＢ、アミロリフファ シェンスのいずれかの株でも使用し得る。更に、α−アミラーゼの配列は周知で あり、この配列の所望の断片は、ＰＣＲのような当分野で周知の技術を使用して 構築され得る。

プラスミドをエシェリキア・コリから分離し、ｃｍ−選択（５μｇ／ｍｌ）で受 容能力のあるＢ、サチリス細胞中へ形質転換した。これは、単一の交差、単一の 複写、アミラーゼ陽性、染色体組み込み物をもたらす。α−アミラーゼ増幅が起 こらないことを確認するために、ｃｍ−選択を第１形質転換後に行わなかった。

ついで、組込み遺伝子を担持するＢ、サチリス株を、エンハンサ−クローンまた は突然変異株の付加に適切なものにシた。

実施例４ 組換えα−アミラーゼ遺伝子を担持するＢ、サチリス株へのエンハンサ−遺伝子 または突然変異株の付加 エンハンサ−５ａｃＵ、５ａｃＱ、およびｐｒｔＲを検討した。５ａｃＱおよび ｐｒｔＲ遺伝子を周知の配列および下記のプライマーによりＰＣＲによりＢ。

サチリスｌＨ６０６４の染色体から分離した。適当な制限酵素部位に隣接したＰ ＣＲ断片を、マルチリンカ−を担持するｐＵＢ１１０誘導体であるプラスミドｐ ＫＴＨ１７４３中にクローン化する。本発明の目的でｐＫＴＨ１７４３と一致す るプラスミドは、市販のｐＵＣ１８のマルチリンカ−領域でｐＵＢｌｌｏのｐｖ ｕＩＩ−ＥｃｏＲＩ断片を置換して構築し得る。クローン化５ａｃＱおよびｐｒ ｔＲ遺伝子に加えて、染色体突然変異株５ａｃＱ３６Ｈｙ　（ＢＧＳＣＩＡ５３ ）およびｓ　ａ　ｃＵＨｙ　（Ｂ、サチリスＹＹ８８からのｐａｐ−９）も使用 した。５ａｃＵＨｙ突然変異株を提供する宿主は、ＢＧＳＣからのものを利用し 得る（例えば、ＩＡ９５　（ｓ　ａｃＵ　（Ｈ）３２）　、ｌＡ１６５　（ｓ　 ａｃＵ　（Ｈ）３２）、ｌＡ１５９　（ｓａｃＵ　（Ｈ）２５）　、ｌＡ１９９ 　（ｓａｃＵ　（Ｈ）２００）およびｌＡ２００　（ｓａｃＵ　（Ｈ）１００） 株）。

５ａｃＵ−ＰＵＢＩＩＯおよびｐｒｔＲ−ＰＵＢＩＩＯクローンを、カナマイシ ン（ｋｍ）選択を組み込まれたα−アミラーゼ遺伝子を担持する適格なり、サチ リス株に直接的に形質転換した。５ａｃＱＨｙおよび５ａｃＵＨｙ突然変異株を 集めて組み込み株へ移入した（モレキュラー・バイオロジー・オブ・バクラス、 １巻、アカデミツク・プレス、１４７〜１７８頁）。ＤＮＡを上記の突然変異株 を担持するＢ、サチリス株から分離し、プラスミドｐＥ１９４　（ＢＧＳＣから １２１８株）と混合した。染色体ＤＮＡおよびｐＥ１９４ＤＮＡを許容温度（３ ２℃）でｐＥ１９４のエリスロマイシン耐性（ｅｍ）マーカーを選択して受容能 力のあるＢ、サチリス中ともに形質転換した。形質転換体を５ａｃＵＨｙまたは ５ａｃＱＨｙ変異株のいずれかの存在を示す、プロテアーゼ生成増加につきスキ ムミルクプレート上でスクリーニングした。上昇温度（３７℃）で望ましい形質 転換体を生長させ、担持プラスミドをｅｍ−マーカーの損失により観察しながら 損失させた。

実施例５ α−アミラーゼ特異的ｍＲＮＡおよび産生α−アミラーゼ活性の分析野生型Ｂ、 サチリス株中または種々のエンハンサ−遺伝子または変異を担持する株中のα− アミラーゼ発現についてエンハンサ−受容体の効果を試験するために、株を３７ ℃で回転振盪機中Ｌ−ブイヨンデンプン培地で生長させた（１０μｇ／ｍｌを適 宜使用する）。細胞濁度クレット（Ｋｌｅｔｔ）　＝　１００後６時間まで試料 を取り出した。

これらの試料から、α−アミラーゼ特異性ｍＲＮＡを、使用説明書に従ってゼタ ブローブナイロン膜を使用して、本質的にトーマスの方法（プロシーディング・ アカデミツク・オブ・サイエンンイズ、ニーニスニー、７７巻、５２０１−５２ ０５頁（１９８０年））により分析した。α−アミラーゼ活性を、説明書に従っ てファデパス（商品名）（ファルマシア社製）を使用して上清から測定した。

アミラーゼ特異的ＲＮＡの量およびα−アミラーゼ活性を第１表に示す。

ここに　記載した本発明のａｐｒ　Ｂ、　アミロリフファシェンスα−アミラー ゼ具体例は、本発明のプロモーター、ベクター、および方法の幾つかの重要な利 点を示す。第１に、α−アミラーゼプロモーターへのエンハンサ−受容体の付加 は、２０倍までクローン化タンパク質の製造を実買的に増大する。例えば、α− アミラーゼの製造は野性型細胞中にすでに存在しているα−アミラーゼと比べて ２０倍以上であった。上記のα−アミラーゼ転写における増加は野生型５ａｃＵ 遺伝子の作用のためである。付加的なプロテアーゼ活性が、誘発されない、即ち 、異種タンパク質の製造が影響されないため、これは構築に非常に有効である。

この標的モジュールが３０２構築物中と同じ位置にあるとき、レセプターＡと称 する標的モジュールを提供する構築物は、５ａｃＱ、５ａｃＱＨｙまたは５ａｃ ＵＨｙエンハンサ−遺伝子のいずれかを伴うレセプターＢと称する標的モジュー ルを提供する構築物と同じであった（第１表でｐＫＴＨＡ１９１１とｐＫＴＨ１ ９７５を比較する）。この均等性は、標的が１６０１構築物に位置したとき５ａ ｃＵＨＶエンハンサ−遺伝子についても判明した（ｐＫＴＨ１６０１およびｐＫ ＴＨ１９１０と比較、第１表の最後の欄）。

レセプターＡとして表示する標的モジュールを有するｍ￥に物は、エンハンサ− 遺伝子５ａｃＱおよび５ａｃＱＨｙについて、ｐＫＴＨ１６０１構築物中に位置 するとき、標的モジュールＢを有する構築物よりα５アミ−ラーゼの合成の促進 においてより効果的であった（第１表におけるｐＫＴＨ１９１０およびｐ　ＫＴ Ｈ１９７４と比較）。

第２に、Ｂ、アミロリフファシェンスの野生型α−アミラーゼプロモーター（Ｂ サチリスα−アミラーゼプロモーターと類似しない）の増強は、５ａｃＱ過発現 または修飾５ａｃＵタンパク質（ｓａｃＵＨｙ）を用いると非常に良好である。

過発現したｐｒｔＲに作用しない。５ａｃＵＨｙの５ａｃＱ　（ｐＵＢｌｌｏ） による野生型α−アミラーゼの発現は飽和水準に達する（多複写プラスミドｐＫ ＴＨＩＯによる生成物と比較）。しかしながら、α−アミラーゼ／レセプターＡ 構築物と結合した５ａｃＱ　（ｐＵＢｌｌｏ）を用いると、より高い生産（６０ 倍以上）さえ示し得た。

第３に、ｐｒｔＲ（ｐＵＢｌｌｏ）の使用は、エンハンサ−レセプターＢを月い ると所望の３倍の増大を示す。ｐｒｔＲを用いる同様の増大はａｐｒプロモータ ーを用いるときに示した（ジャーナル・オブ・バクチオロジー、１６９巻、３０ ４４〜３０５０頁（１９８７年））。

ここで引用したすべての参考文献は、引用により明細書の記載とする。本発甲を 、詳細に具体的な例に関連させて記載してきたが、様々な変化および修飾がオ発 明の趣旨および範囲からはずれないで行われるということは、当分野の熟練省に は明らかである。

ＧＣＣＣＣ［ｉ　Ｃ酩ＡＴＡ　ＣＧＡ　ＡＡＡ　ＧＡＣＴＧＧ　ＣＴ［ｉ轟酩Ａ 　ＴＴＧ＾ＧＣＣＴＴ　Ｔ晶ＣＧＧ　ＧＧＣＧＴ（ｉ　ＴＡＴ　ＧＣＴ　ＴＴＴ 　ＣＴＧ　ＡＣＣＧＡＣＴＴＴ　ＴＧＴ　ＭＣ丁ＣＧ　ＧＭ　ＡＣ丁Ｃｍ　Ｃｍ 　ＣＴ（Ｊ　ＧＴＡ　ＴＴＴ　丁ＴＡ　丁ＧＧ　ＭＣＡＧＡ　ＣＡＧ　ＴＡＧ　 ＴＣＴ　ＧＴＣＣＣＡ　ＴＭ議＾ＴＡ　ＣＧＡ　ＣＡＧ　ＧＴＣＴＧＡ　ＣＡＧ 　ＧＣＧ　ＡＣＡ　ＣＡＴ　ＴＴＴ　ＴＡＴ　ＴＣＣＴＴＡ　ＴＴＴＧＧＧ　Ｇ ＧＧ　ＴＴＧ　ＴＴＡ　ＴＴＡ　丁ＴＴ　ＴＡＣＴＧＡ　ＴＡＴ　ＧＴＡ　ＡＭ 　丁ＡＴ　ＭＴ　ＴＴ（ｉ　ＴＡＴＣＣＣＣＣＣＡＡＣＭＴ　ＭＴ　ＡＡＡ　Ａ ＴＧ＾ＣＴ　ＡＴＡ　ＣＡＴ　ＴＴＴ　ＡＴＡ　ＴＴＡ　ＭＣＡＴＡＴＴＣＴＴ Ｔ　ＴＡＣＴＣＴ　ＣＣＣＴＣＴ　ＣＣＴ　ＴＴＧ　ＴＡＣＴＭ　（ｉＴＴ　Ｔ ＴＴ　ＧＣＴ　ＴＴＣＧＣＣ１ｎｆＩ ９！ｉ（）乱Ｐ「：：’ｉ：　ｃ’：’ｉ’　：ｉ：　’ｉｃｃ工Ｌｅｕ　Ｌｅ ｕ　Ｐｈｅ　Ｖ；１証請 丁ＧＴ　ＣＭ　ＡＧＣＭＧ　ＴＣＴ　ＧＡＡ　ＣＡＣＧＡＡ　ＴＡＣＡＣ１１＋ 　ＴＧＣＧＡＣＭＴ　ＡＭ　ＣＡＧｔｏ　１５　２０ 葺葺蛋　２５　３０　１ｌ葺　３５ ４０　４５　葺葺基　５０ ＣＧＧ　ＣＡＧ　ＡＣＣＴＭ　ＧＧＡ　ＧＧＧ　Ｃ（ｉＴ　ＡＴＧ　Ｔｎ　Ｃ１ ｌ：Ｔ　ＡＡＣ丁ＣＧ　ＧＴＴ　ＡＧＧ　ＣＴＡＩＩＩ　５５　６０　６５ 国際調査報告　Ｄ、、ＴＩＣＴ　０１／ｎＭ１直ＰＣＴ／ＦＩ　９１１００２４ ４ フロントページの続き （５１）　Ｉｎｔ、　Ｃ１，’　識別記号　庁内整理番号Ｃ１２Ｒ１：０７） （Ｃ１２Ｎ　１／２１ Ｃ１２Ｒ１：１２５） （Ｃ１２Ｎ　９／２８ Ｃ１２Ｒ１：１２５） Ｉ

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．原核宿主における組換え遺伝子の発現のためのハイブリットプロモーターで あって、上記ハイブリッドプロモーターがＲＮＡポリメラーゼの開始モジュール に機能可能に結合したエンハンサーの遺伝子の標的モジュールを含み、上記標的 モジュールは上記開始モジュールとは由来が異なる（ｈｅｔｅｒｏＩｏｇｏｕｓ ）ことを特徴とするハイブリッドプロモーター。 ２．上記標的モジュールがａｐｒ遺伝子の５′調節領域中にみられる標的モジュ ールである、請求項１記載のハイブリッドプロモーター。 ３．上記ａｐｒ遺伝子がＢ．サチリスａｐｒ遺伝子である、請求項２記載のハイ ブリッドプロモーター。 ４．上記標的モジュールがエンハンサー遺伝子のタンパク質生成物の標的モジュ ールであり、上記エンハンサー遺伝子がｓａｃＱ、ｐｒｔＲ、ｓａｃＶ、ｓｅｎ Ｎ、ｓａｃＵ、およびｄｅｇＴからなる群から選択される、請求項１記載のハイ ブリッドプロモーター。 ５．上記標的モジュールがｓａｃＵエンハンサー遺伝子のための標的モジュール である、請求項４記載のハイブリッドプロモーター。 ６．上記ｓａｃＵエンハンサー遺伝子がＢ．サチリスｓａｃＵ遺伝子である、請 求項５記載のハイブリッドプロモーター。 ７．上記標的モジュールがｓａｃＱエンハンサー遺伝子のための標的モジュール である、請求項４記載のハイブリッドプロモーター。 ８．上記ｓａｃＱエンハンサーが、Ｂ．サチリス、Ｂ．アミロリクファシエンス およびＢ．リヘニフォルミスのｓａｃＱエンハンサーからなる群から選択される 、請求項７記載のハイブリッドプロモーター。 ９．上記標的モジュールがｐｒｔＲエンハンサー遺伝子のための標的モジュール である、請求項４記載のハイブリッドプロモーター。 １０．上記ｐｒｔＲエンハンサー遺伝子がＢ．ナットまたはＢ．サチリスｐｒｔ Ｒエンハンサー遺伝子である、請求項９記載のハイブリッドプロモーター。 １１．上記開始モジュールが原核生物細胞外酵素をコード化する遺伝子の開始モ ジュールである、請求項１記載のハイブリッドプロモーター。 １２．上記細胞外酵素がα−アミラーゼである、請求項１１記載のハイブリッド プロモーター。 １３．上記α−アミラーゼがＢ．アミロリクファシエンスα−アミラーゼである 、請求項１２記載のハイブリッドプロモーター。 １４．上記ハイブリッドプロモーターが細菌分泌シグナルに機能可能に精合する ものである、請求項１記載のハイブリッドプロモーター。 １５．上記細菌分泌シグナルが、バシラス分泌シグナルである、請求項１４記載 のハイブリッドプロモーター。 １６．上記分泌シグナルが、アミラーゼ分泌シグナルである、請求項１４記載の ハイブリッドプロモーター。 １７．上記分泌シグナルが、レバンスクラーゼの分泌シグナルである、請求項１ ４記載のハイブリッドプロモーター。 １８．原核生物宿主中組み換え遺伝子の発現のための発現ベクターであって、上 記発現ベクターは請求項１〜１７記載のいずれか１項のハイブリッドプロモータ ーを含むことを特徴とする発現ベクター。 １９．上記ベクターが、上記ハイブリッドプロモーターに機能可能に結合した構 造遺伝子を更に含む、請求項１８記載の発現ベクター。 ２０．上記構造遺伝子がα−アミラーゼである、請求項１９記載の発現ベクタ２ １．上記ベクターが、上記エンハンサー遺伝子をコード化する構造遺伝子を更に 含み、上記エンハンサー遺伝子が上記ハイブリッドプロモーターに機能可能に結 合せず、上記エンハンサー遺伝子をコード化する上記遺伝子が上記宿主細胞中に 発現可能である、請求項１８記載の発現ベクター。 ２２．上記発現ベクターが、上記宿主細胞のゲノム中へ上記ベクターの組み込み を促進する配列を更に含む、請求項１８記載の発現ベクター。 ２３．発現ベクターｐＫＴＨ１９１０。 ２４．発現ベクターｐＫＴＨ１９７５。 ２５．発現ベクターｐＫＴＨ１９１２。 ２６．請求項１８記載の発現ベクターで形質転換される宿主細胞。 ２７．上記宿主細胞がＢ．サチリス、Ｂ．リヘニフォルミス、Ｂ．アミロリクフ ァシエンス、Ｂ．ポリミクサ、Ｂ．ステアロサーモフィルス、Ｂ．セルモプロテ オリチクス、Ｂ．コアギュランス、Ｂ．スリンジエンシス、Ｂ．メガテリウム、 Ｂ．セレウス、Ｂ．ナット、Ｂ．アシドカルダリウス、クロストリジウム・バー フリンジェンス、およびＣ．テタヌスからなる群から選択される、請求項２６記 載の宿主細胞。 ２８．上記宿主細胞がＢ．サチリスである、請求項２７記載の宿主細胞。 ２９．原核宿主中にタンパク質を発現する方法であって、以下の工程：（１）上 記発現ベクターが上記ハイブリッドプロモーターに機能可能に結合する所望のコ ード比況列を提供する遺伝子を含み、上記宿主細胞が上記ハイブリッドプロモー ター上の上記標的モジュールにより、所望のエンハンサー遺伝子活性を提供する 、請求項１８記載の発現ベクターで上記宿主を形質転換することおよび （２）上記タンパク質を発現すること を含むことを特徴とする方法。