JPH06500695A - 微生物およびアントラニル酸の取得法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ９　微生物およびアントラニル酸の取得法ζ 之　本発明Ｉヨ、プラウ＞　’ｉ　：Ｌ　Ａ　、（ヶ（Ｂｒａｕｎｓｃｈｗｅ　 ｉ　ｇ）在　ドイツ微生物寄託局（Ｄｅｕｔｓｃｈｅｎ　Ｓａｍｍｌｕｎｇ　ｖ ｏｎ　Ｍｉｋｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｎ）に寄託番号ＤＳＭ６０１５で寄託さ４ 　れている、パシルス　スプチリス　ＡＴＣＣ６０５１１Ａの突然変異体、およ びＤＳＭ６０１５と同様にＬ−阪　トリプトファン含有栄養溶液中でアントラニ ル酸を生じるＤＳＭ６０１５の突然変異体に関する。

アントラニル酸（２−アミノ安息側１を発酵法で取得するために微生物を使用す ることは公知である。

しかしながら、この場合には、僅かな濃度のアントラニル酸のみが得られる（特 開昭４８−３９６９２号、特開昭５１−１２９９２号及びＡｇｒｔｃ、Ｂｉｏｌ 。

Ｃｈｅｍ、４９　（１９８５）１１５１）か、又は付加的になお副産物、例えば トリプトファン、インドール又はアントラニル酸誘導体を生じ（特開昭４８−３ ９６９２号及びＣｅ　ｌ　１．Ｍｏ　１．Ｂｆｏ　１．２６　（１９８０）６１ ５）、これらは、アントラニル酸の後処理及び単離を困難にする。

本発明は、アントラニル酸を、高い濃度でかつ障害性の副産物を伴わずに産生ず る微生物を得ることを課運としている。

相応して、先に定義された、バクルス　スプチリスＡＴＣＣ６０５１１）突然変 ｊｉ体Ｄ　３Ｍ６０１５　！発見した。

この突然変異体を、１９９０年６月１９日に、前記寄託局に寄託した。

更に、アントラニル酸を発酵法で製造する方法を発見し、これは、菌株バクルス 　スプチリス　ＡＴＣＣ８０５１Ａの突然ｆＪ１体ＤｓＭ　６０１５　をＬ−ト リプトファンの存在で培養することよりなる。

突然変異体ＤＳＭ　６０１５は、次のように系統的に記載できる。

１、ＩＯ２胞の形状（栄養ブイヨン中、３０℃、２５０ＵｐＭで液中培養し、観 察）： 寸法０．５−０．８ｘｌ−５μｍの桿菌、生長の経過時に著しく大きい不規則な 形が現われる２、運動性：　運動しない ３、胞子：　見られる ４、グラム−染色：　全ての生長相中で陽性５、最小培地＋１．１重量％グルコ ース上での生長＝２〜５日で陽性 最小培地の組成： 硫酸アンモニウム０．５１量％、燐酸二水素カリウム０．１５重量％、燐酸水素 二カリウム０．３６重量％、硫酸マグネシウム−７水和物０．０５重量％、硫酸 マンガン−工水和物０．００５重量％、少量元素溶液０．２重量％、寒天１．８ 重量％、Ｌ−トリプトファン０．００５重量％、ビオチン０．００００１重量％ 、＋７ミン０．０００１重量％ 少量元素溶液の組成（ＳＬ）： 蒸留水中の硫酸鉄（ＩＩ）−１水和物２００ｍｇ／ｌ、硫酸亜鉛（ＩＩ）−４水 和物１０　ｍ　ｇ　／　１　。

硫酸マンガン（ＩＩ）−１水和物３　ｍ　ｇ　／　Ｉ　、硼酸３０ｍｇ／ｌ、塩 化コバルト（１１）−６水和物２０　ｍ　ｇ　／　ｌ　、塩化＃ｌ（１１）１ｍ ｇ／ｌ、塩化ニッケル（’？Ｉ）−６水和物２　ｍ　ｇ　／　１　、モリブデン 酸ナトリウム−２水和物３ｍｇ／ｌ、ＥＤＴＡ　５５ｍｇ／１ ６、ビタミン要求：　無し ビオチン（ｌ１ｍｇ／ｌの添加によるグルコース−最小培地上の生長の刺激二　 強く現われる７、アミノ酸要求：　Ｌ−トリプトファン８、コロニー形態：　平 らで、光沢のある、白−ぺ−シュ色コロニー。

他の特徴的性質は、パシルス　スプチリスのそれに相応する（Ｂｅｒｇｅｙ’ｓ 　Ｍａｎｕａｌ　ｏｆ　Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ　Ｂａｃｔｅｒｉ。

１ｏｇｙ、Ｖｏｌ、２．　１９８６　、　１１３０頁参照）。

本発明によるパシルス　スブチリス　ＡＴＣＣ６０５１Ａの突然変異体は、出発 菌株と同様に、更なるものとして、後処理を困難にしない生成物アセトイン（３ −ヒドロキシ−２−ブタノン）を生じる。

この突然変異体ＤＳＭ　６０１５は、突然変異誘発物質例えば、Ｎ−メチル−Ｎ ′−ニトロ−Ｎ−ニトロソ−グアニジン（ＭＮＮＧ）を用いる複数の前後に実施 されて誘導された突然変異生成又はＵＶ−線照射により、かつそれぞれ、それに 引き統（選択により得られる。この場合、第一の工程で、抗代謝作用をする５− フルオロ−ＤＬ−トリプトファンの添加にもかかわらず、それがその固有の物質 代謝に必要であるよりも多いトリプトファンを生じる突然変異体を選択する。

引続き、第二の工程で、さらに、このトリプトファン−生成性の突然変異体を抗 代謝作用をするスルファグアニジンに対して抵抗するために突然変異させる０次 の突然変異で、トリプトファンの代わりにアントラニル酸を析出し、従って３６ ６ｎｍでの蛍光により検出できる突然変異体を選択した。

本発明の方法は、慣用の技術で、断続的に又は連続的に行うことができ、しかも ［）Ｈ６〜８有利に６．５〜７．５及び２５〜４０℃、有利に２８〜３７℃の温 度で、Ｌ−トリプトファン含有栄養液中で恒温保持することにより実施すること ができる０通例、アントラニル酸を２〜１５、有利に３〜ｌＯｇ／ｌの濃度まで 富化するために３６〜７２時間発酵させる。

この微生物の培養のための栄養培地の選択は、厳密ではない、これは、Ｌ−トリ プトファンと並んで、この微生物に常用の炭素−及び窒素源並びに他の生長に必 要な物質を含有する。

炭素源としては、例えば糖、有利にグルコース又は糖酸、例えばグルコン酸を使 用する。窒素源としては、無機及び有機の化合物、例えばアンモニウム塩、有利 に、硫酸アンモニウム、硝酸塩、コーンステイープリカー、酵母エキス又はペプ トンがこれに該当する。

通例、この栄養培地には、なお、マグネシウム、マンガン及びカリウムの硫酸塩 及び／又は燐酸塩、前記硼素、コバルト、銅、ニッケル瓦びモリブデン並びにビ タミン、例えばビオチン及び／又はチアミンを含有する。

発酵時に、Ｌ−トリプトファンを一般に５〜５００ｍｇ／ｌ、有利に１０〜５０ 　ｍ　ｇ　／　ｌの範囲で使用する。

他の前記の栄養物質の量比は、発酵の方式に依存し、個々の場合に、公知の方法 で決められる１例えば、本発明の方法の実施のために、５０〜２００ｇ／ｌの範 囲のグルコース濃度、有利に１００〜１５０ｇ／ｌの範囲の濃度が好適である。

窒素源として有利な硫酸アンモニウムは、５〜５０　ｇ　／　ｌ　、特にｌＯ〜 ３０ｇ／ｌの範囲で使用する。

同様に、窒素１として有利な酵母エキスの添加には、０．５〜５ｇ／ｌの範囲を 選択する。

硫酸マグネシウム−７水和物は、有利にマグネシウム源として役立ち、一般に、 ０．１〜５ｇ／ｌ殊に、０．５〜２ｇ／ｌの範囲で使用される。有利なマンガン 原としての硫酸マンガン−水和物は、０．０１〜１ｇ／ｌ、有利にＯ，１〜０． ５ｇ／ｌの範囲で使用される。有利なカリウム源は、燐酸二水素カリウムであり 、これを、ｌ〜ｌｏｇ／ｌ、有利に２〜５ｇ／ｌの濃度で栄養培地の成分として 添加すべきである。他のもう一つは、燐酸水素二カリウムであり、これを、１〜 １５ｇ／Ｉ、特に５〜Ｌｏｇ／ｌの濃度でこの栄養培地に添加する。

少量元素は、一般に、それぞれＯ，１〜１０００ｍｇ／１．特に１〜３００ｍｇ ／ｌの濃度範囲で、水溶液として、しかも有利に前記の組成中で使用する。

この栄養溶液には、予め全ての栄養物質が添加されていてよいが、栄養物質をそ の消費の程度に応じて配量することが推奨される。

培養液を、無１１Ｍ、例えば塩酸又は硫酸で１〜３、有利に１．５〜２．５のｐ Ｈ［まで酸性にし、次いで、有機溶剤、例えばエーテル、特に、メチル−ｔ−ブ チルエーテル又はエステル例えば酢酸エチルエステルを用いて公知方法で、例え ば向流抽出装置中で抽出することにより、一般に、培養液からアントラニル酸を 分離する。引続き、まず、溶剤を蒸留により除去するのが有利である。この場合 、アントラニル酸を塩の形に変えるために、混合物に、蒸留の前に、塩基、特に 苛性ソーダを添加するのが有利である。これにより、蒸留の間にアントラニル酸 と微生物から同様に得られるアセトインとの縮合反応が阻止される。蒸留の後に 、このアントラニル酸を、特に塩酸を用いる酸性化により再び電離させることが できる。次いで、アントラニル酸を、一般に、５〜１５℃の温度範囲での沈殿及 び濾過により単離することができ、この際、溶剤、例えばドルオール（この中に アントラニル酸は難溶性又は不溶性である）の添加による沈殿が支持される。副 産物　アセトインは、一般に蒸留により残留混合物から分離できる。

アントラニル酸は、多方面で、例えば、医薬品、化粧品及び一連の染料の製造時 に使用される中間体である。アセトインは、例えば、マーガリンの臭い矯正のた めの芳書物質として役立つ。

例１ 本発明に好適な突然変異体ＤＳＭ　６０１５の培養及び単離 ａ）出発菌株の突然変異生成 次の組成： 栄養培地■ニ ゲルコース　１１　ｇ／ｌ 硫酸アンモニウム　５　ｇ／ｌ 硫酸マグネシウム−７水和物　０．５ｇ／ｌ硫酸マンガンー水和物　０．０５ｇ ／ｌ燐酸二水素カリウム　１．５ｇ／ｌ 燐酸水票二カリウム　３．６　ｇ／ｌ 少量元素溶液　２　ｍ　ｌ　／　１ ビオチン　Ｏ，１ｍｇ／ｌ チアミン　ｌ　ｍ　ｇ　／　１ を有する滅菌水性栄養培地（以後これを栄養培地工と称する）２０ｍｌに、白金 耳を用いて、菌株　バクルス　スプチリス　ＡＴＣＣ６０５１Ａを接種し、３０ ℃及び２００ＵｐＭで振動装置中で恒温保持した。

１６時間の後に、４重量％Ｍ　Ｎ　Ｎ　Ｇ−水溶液１ｍｌを加えた０次いで、こ の培養液をｌＯ分間更に振動させた。その後、全培養液を遠心分離し、上澄を捨 てた。

遠心分離した細胞を、４℃に冷却された栄養培地２０ｍ１中に分散させ、改めて 遠心分離した。この分離工程を繰り返した。次いで、遠心分離された細胞をグリ セリン１０重量％及びラクトース５重量％を含有する水溶液２０ｍ１中に入れた 。この！Ｉ！濁液は、１ｍｌ当たり１０’個の生存可能な細胞を含有した。

ｂ）抗代謝物質５−フルオローＤＬ−トリプトファンによる選択 ａ）で得られた惣濁液各々Ｏ，１ｍｌを、次の培地を含有する寒天プレー８１０ ０枚上に分配した：栄養培地Ｉ、寒天１８ｇ／ｌ＆び５−フルオロ−ＤＬ−トリ プトファン５０ｍｇ／１．このうように調製されたプレートを３０℃で５日間培 養した。

Ｃ）選択された突然変異体の単離及び増殖それぞれ５個の大きいコロニー（サテ ライトコロニーをも形成した）を、個々に、栄養培地Ｉよりなり、付加的にグル コースｌ１ｇ／１．硫酸アンモニウム５ｇ／Ｉ及びソイトン（Ｓｏｙｔｏｎｅ； Ｄｉｆｃｏ社の榎準化大豆ペプトン）０．２ｇ／ｌを含有する栄養培地ＩＩそれ ぞれ２０ｍ１を含有する１００ｍ１−フラスコ中に接種し、３０℃、２００Ｕｐ Ｍで２日間振動させた。この時間の後に、ＨＰＬＣを用いて、各フラスコ中のト リプトファン濃度を測定し、この条件下で最大のＬ−）−リブトファン（０，２ ｇ／ｌ）を産生じた突然変異体Ｍ１を単離した。

ｄ）トリプトファン産生性の上昇 突然変異体Ｍｌをこの記載の方法と同様に突然変異生成させた。こうして得られ た懸濁液各０．１ｍｌを、付加的に寒天１８ｇ／ｌ及びスルファグアニジン２０ ０ｍｇ／ｌが添加されている栄養培地ＩＩを有するプレート５０枚上に載せた。

このように調製されたプレートを、次いで３０℃で５日間恒温保持した。スルフ ァグアニジンに対する抵抗で特徴的なコロニーを個々に、それぞれ栄養培地１１ ２０ｍ１を含有する１００ｍ１−フラスコに接種し、３０℃、２００ＵｐＭで２ 日間振動させた。この時間の後に、トリプトファン濃度を前記のように測定し、 最大り一トリプトファン（０，５ｇ／ｌ）を産生じた突然変異体Ｍ２を単離した 。

ｅ）アントラニル酸産生性の突然変異体を得るための突然変異生成及び選択 突然変異体Ｍ２を、ａ）に記載の方法で突然変異生成させた。この場合に得られ た！ｌ！濁液を、ｂ）に記載のように、３０℃で５日間培養したが、栄養培地は 抗代謝物賀を含有しないことで異なった。波長３６６ｎｍの光の照射により選択 を行った。この場合に青色の蛍光を発したコロニーを単離した。これらを、それ ぞれ、栄養培地ＩＩ　２０ｍ１及びＬ−トリプトファン１０ｍｇ／ｌを含有する １　００　ｍ　ｌ−フラスコ中に接種し、３０℃、２００ＵｐＭで２日間振動さ せた。この時間の後に、アントラニル酸濃度を測定し、最大アントラニル酸（０ ，２５ｇ／ｌ）を産生じた突然変異体Ｍ３を単離した。

ｆ）アントラニル酸産生性の上昇 ｅ）に記載の方法と同様にして、突然変異体Ｍ３を突然変異させ、選択した。こ の際、選択されたコロニーを、それぞれ栄養培地ＩＩ　２０ｍ１及びＬ−トリプ トファン５００ｍｇ／Ｉを含有する１　００　ｍ　ｌ−フラスコ中に接種し、３ ０℃、２００ＵｐＭで２日間振動させた。その後、アントラニル酸の濃度を測定 し、最大アントラニル酸（Ｉｇ／Ｉ）を産生じた突然変異体Ｍ４を単離した。

この突然変異体Ｍ４を栄養培地ＩＩ　２０ｍ１及びＬ−トリプトファン１０ｍｇ を有する１００ｍ１−振動フラスコ中で、３０℃、２００ＵｐＭで２日間振動さ せた。引続き、この際に得られた懸濁液各０．１ｎ１を、栄養培地ｒｒ、Ｌ−ト リプトファン５００ｍｇ／【および寒天１８ｇ／Ｉを含有する寒天プレー８１０ ０枚上に毅せた。このように調製したプレートを、次いで、３０℃で３日間培養 した。大きいコロニー２００を、それぞれ、栄養培地ＩＩ　２０ｍ１及びＬ−ト リプトファン１０ｍｇを含有するｌｏｏｍｌ−フラスコ中、３０℃、２００Ｕｐ Ｍで２日間振動させた。

これから、アントラニル酸１．５ｇ／ｌ及びアセトインＬｏｇ／ｌを産生じた突 然変異体Ｍ５を単離し、０３Ｍ６０１５なる名称で寄託した。

例２ 発酵器中でのアントラニル酸の製造 １４−１−発酵器に次の成分を含有する滅菌水性栄養液９．８１を装入したニ ゲルコース　１２００ｇ 硫酸アンモニウム　２００ｇ 燐酸二水素カリウム　３０ｇ 燐酸水素二カリウム　７２ｇ 酵母エキス　１０ｇ 硫酸マグネシウム−７水和物　ｌｏｇ 硫酸マンガン−水和物　１ｇ 少量元素溶液　４０ｍ１ Ｌ−トリプトファン　３２０ｍｇ 同じ栄養液の２００ｍ１から、突然変異体ＤＳＭ６０１５（例１参照）の接種に より前培養液を作った。

これを、３７℃、２００ＵｐＭで１６時間発酵させた。

１４−１−発酵器にこの前培養液を接種し、３７℃及び７５０ＵｐＭで操作し、 この際、反応器１容量及び１分当たり空気ｌ容量を導入した。この場合、ｐＨ値 を２０重量％ＮａＯＨ溶液を用いて自動的にｐＨ７に調節した。

６０時間の後に、硫酸を用いてｐＨ２まで酸性にすることによりこの発酵を中断 させた。生じた生成物の濃度を慣用の方法でＨＰＬＣを用いて測定した。この場 合、発酵ブイコン中のアントラニル酸の濃度は３゜５ｇ／ｌ、アセトインのそれ は、２５ｇ／Ｉであった。

この溶液を、室温で５メチル−ｔ−ブチルエーテル１００　ｍ　ｌで抽出した０ 次いで、この有機抽出物に、ＩＮ　ＮａＯＨ溶液３．１１を加え、引続き、常圧 で、このメチル−ｔ−ブチルエーテルを留去させた。その後、このアルカリ溶液 にドルオール３００ｍ１を加えた。引続き、この溶液を、１０℃で二倍希釈塩酸 を用いてｐＨ３まで酸性にし、この温度で、３時間撹拌した。沈殿したアントラ ニル酸を濾過し、冷ドルオール５００ｍ１で洗浄し、１ｍパール及び６０℃で溶 剤を除去した。融点１３３〜１３５℃（文献では１４６゜１’Ｃ１Ｃｈｅｍｉｋ ｅｒｋａｌｅｎｄｅｒ）及び９４％の純度を有するアントラニル！ｌ　（’Ｈ− ＮＭＲ−分光法及びＨＰＬＣで同定）２９ｇが生じた。

残分を蒸留させると、純度９０％（ＨＰＬＣ）のアセトイン１１５ｇが得られた 。

国際調査報告 フロントページの続き （５１）　Ｉｎｔ、Ｃ１，５識別記号　庁内整理番号Ｃ１２Ｒ１：１２５） （７２）発明者　オイラー、　クラウスドイツ連邦共和国　Ｄ　−６７００ルー トヴイッヒス　ハーフエン　マックスシュトラ−セロ５ Ｉ

Claims (2)

【特許請求の範囲】
1. １．ブラウンシュバイク在ドイツ微生物寄託局での寄託番号ＤＳＭ６０１５を有 する、バシルススブチリスＡＴＣＣ６０５１Ａの突然変異体、並びにＤＳＭ６０ １５と同様にＬ−トリプトファン含有栄養溶液中でアントラニル酸を生じるＤＳ Ｍ６０１５の突然変異体。
2. ２．請求の範囲１に記載の微生物ＤＳＭ６０１５又はその突然変異体をＬ−トリ プトファンの存在で培養することを特徴とする、アントラニル酸の発酵法による 製造法。