JPH06500795A - 選択的トロピズムを有する粒状物ベクター、その製造法及びその製薬学的組成物 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 選択的トロピズムを有する粒状物ベクター、その製造法及びその製薬学的組成物 技術分野 本発明は、低密度リポ蛋白質（又はＬＤＬ）をモデル化した生体類似構造をもつ 合成粒状物ベクターに関する。この種のベクターは３つの基本的な性質を有する ： １）それは活性原体（ｐｒｉｎｃｉｐｌｅ）の分子内輸送に対する系である、２ ）それはある種の細胞、特に腫瘍細胞又は大食細胞を標的にする能力を有する、 ３）それは身体中を拡散しつる全身的な粒状物ベクター系である。

背景の技術 薬剤の全身的投与中、その標的に実際的に到達する割合はしばしば低い。これは いくつかの因子が組合さったためである。

１）投与した生成物がしばしば身体への、特に血流への限られた溶解性しか有さ ない。それは斯（してその標的に到達する前に分解し又は蛋白質によって複合体 化し、所望の治療学的効果を失う。

２）それは必ずしも効果的に細胞膜を通ることができない。これは意図する活性 部位が細胞的に存在する場合に主たる欠点となる。その理由は、効果的な分子内 濃度を達成しつるために、非常に高い血漿濃度を長期間に渡って維持することが 必要となるからである。

３）その分子の作用の特異性は一般に低い。これもまた、治療学的活性が所望の 十分な量を作用部位に到達させるためには多量の薬剤を投与することの必要性を もたらす。問題はその身体における多数の部位で活性なことであり、逆の副作用 が現われる。

この理由のために、薬剤の身体への投与後にそれを保護する、またその分子を作 用せしめたい細胞内だけで作用を行使させる手段を提供することは特に有利であ る。斯くして薬理学的性質を有する生物学的に活性な分子特に抗寄生虫、抗微生 物、抗ウィルス、又は抗ガン薬剤の効率をかなり高めることが可能となろう。

細胞毒性薬剤によるガン細胞の標的化 人間の医薬における細胞毒性薬剤の使用は、それが正常細胞と腫瘍細胞を識別で きないことにより非常に制約を受ける。この無識別及びそのかなりの毒性は、悪 性腫瘍の病理学的処置において主たる問題となっている。斯くして腫瘍体に達す る活性原体の割合を増加させる手段は最も価値がある。これらの手段の中で、「 輸送担体」として働き且つ腫瘍細胞を標的にする能力のために選択される細胞静 止薬剤の巨大分子中への導入は言及することができる。

いくつかの励みとなる一部の結果にもかかわらず、今日までこれらのベクターの いずれもが人間の医薬において真の効果を示したようには見えず解決すべき多く の問題が残った。特に、−細胞内皮組織系（ＲＥＳ）による輸送担体の捕捉−活 性原体の標的での放出 一ベクターに関する免疫反応。

抗寄生虫、抗微生物又は抗ウイルス薬剤を用いる大食細胞の標的化。

病原体が潜伏状態において大食細胞中で細胞内的に増殖し又は生存すつこれらを 破壊する役割りである。しかしながら多（の微生物は大食細胞の機能系を無効に するような具合いに作用する：溶解酵素禁出剤の分泌遊離基禁止剤、分子内ｐＨ を変えることによる溶解酵素の禁止、酵素耐性の被膜の生合成など。これらの微 生物の細胞内局在化は、それらが循環している抗体によって中和されるのを回避 し且つ細胞内へ拡散しない薬剤の作用から保護されることを可能にする。これら の分子内病状の根絶は非常に困難であり、非常に長い且つむしろ効果のない処置 が行われ、また多くの再発の事例がある。

生物学的に活性な分子の細胞内輸送 非常に大きい作用の特異性を有するが、薬剤としての使用がその血漿環境での不 安定性により又はその細胞環境への拡散不能により制限されている多数の分子が ある。

これらの分子の潜在的な治療学的価値及びその作用の特異性は、試験管内モデル で容易に示され且つ明らかにされる。不幸なことにこの価値はここに上述した難 点の結果として生体内で確かめられていない。この範ちゅうには、非常に多くの 生成物、特に殺虫剤、蛋白質及びオリゴヌクレオチドが存在する。

輸送、供給及び標的化の機能のすべてを与えうる最も有利な候補の中で、低密度 リポ蛋白質（又はＬＤＬ）は一連の顕著な性質によって特徴づけられる。

ＬＤＬ、即ち血漿コレステロールの主な輸送担体はリポ蛋白質であり、これは外 因性コレステロールの細胞への供給において最大に利用される。

これらの、トリグリセリドの及びコレステロールエステルの無極性コアからなる 化合物は、周囲にリン脂質、遊離のコレステロール及びアポリポ蛋白質Ｂ（ｓｉ ｃ）の単層を含む。それらはその２０ｎｍの大きさのために、身体を通して全身 的に拡散してそれぞれ各細胞に到達しうる。

細胞は特に高い親和性特異性膜受容体を含む機作によってＬＤＬを取り込む。受 容体へ結合した後、細胞により自己抑制されたいくつかの機作に従って、内部に 組み込まれ且つ細胞に対して直接使用しうるコレステロールの遊離効果を有する ＬＤＬの、リソソーム酵素による分解が起こる。

ここにこの輸送系の使用は、勿論十分な量の薬剤をＬＤＬ内に導入することがで きるならば、活性原体の血漿環境における保護及びその細胞環境内への供給を行 うことを可能にする。

更に、実質的にすべての細胞がＬＤＬ受容体を表現するけれども、優先的な捕捉 又は優先的な放出により標的命中を行うことを成功させるためには、利用が可能 である、更にいくつかの場合には増巾が可能である表現の差異が存在する。問題 の表現の差異は負又は正のものであってよい。

たとえばＬＤＬ受容体の弱い表現を示す心臓組織及び腎臓組織がある。

これはこれらの組織の多くの薬剤に対する敏感性に関して非常に有利である。中 枢神経系の細胞はＬＤＬ受容体を有するけれど、ＬＤＬは血液−脳の障壁を横切 ることができない。従ってＬＤＬを用いるベクター化により、これらの３つの器 官の識別が可能となる。

ＬＤＬ受容体の表現の正の差異を示す組織には、生理学的観点から肝臓組織が、 また生理病理学的立場から腫瘍組織が言及しつる。

後者の場合、腫瘍細胞はその再生活性及びそのコレステロール制御系の変化の結 果として、その膜表面において対応する健康な細胞よりも多数のＬＤＬ受容体を 有し、従ってより多くのＬＤＬを捕捉することが示されている［参照、例えばバ イオへミカ・バイオフイジカ・アクタ（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａ　Ｂｉｏｐｈｙｓ ｉｃａ　Ａｃｔａ）　１００３　（１９８９）　３０１〜３０６］。

細胞毒性薬剤に対するベクターとしてＬＤＬを用いることに関する研究も刊行さ れている。そして単純なリポ蛋白質／細胞毒性活性原体の接触からアポＢへの共 有結合的グラフト化までの種々の導入技術が記述された。このようにして得られ る複合体は、高い親和性膜受容体によって特異的に認識される能力を保持し、マ ウスにおいて、元々のＬＤＬと同一の生体内代謝を示す。

更に、ＬＤＬは時にその識別を改変する酸化を受ける。酸化されたＬＤＬは細胞 のアポリボ蛋白質Ｂ　１００／Ｅ受容体によって最早や認識されないが、反対に 大食細胞上に位置する他の受容体によって特異的に認識される。斯くして酸化さ れたＬＤＬを用いることにより、大食細胞を特異的に標的にすることができる。

大食細胞の大食性は、活性原体をＲＥＳの食胞細胞へ向わせることが非常に困難 でないということを意味する。その理由は、静脈内に投与されたいずれかの粒子 は身体に対する異物として認識され、非常に迅速に食べられるからである。しか しながら粒子は効果的に食べられるためにかなり大きい大きさ［ラクナ（Ｌａｃ ｕｎａ）１００ｎｍ］でなければならず、またこれらの大きさは良好な全身的拡 散と適合しなければならない。

直径が１１００ｎより大きい粒子を用いれば、容易に近づけるＲＥＳの大食細胞 を標的にすることはできるが、組織の大食細胞は不可能である。全身的に拡散す る酸化されたＬＤＬの使用はすべての大食細胞を標的にすることを可能にする。

しかしながら生来のＬＤＬの使用はいくつかの制限があるニー　ＬＤＬのコアは 高度に無極性であり、結果としてそれは無極性の薬剤しか貯蔵できない。

一コアの貯蔵能力はＬＤＬの代謝に必須であるその構造的完全性を保持する必要 性によって制限される −　ＬＤＬは人間の血漿から単離しなければならず、また限られた保存性しかな い。

詳細な説明 斯くして本発明は、特別な細胞種に対して選択的なトロピズム及び細胞内供給系 を有し且つ −非液体の親水性コア ー共有結合によりコアに結合した脂質性の第１層又は殻−疎水性相互作用により 第１層に結合したリン脂質の第２層又は外側ラメラ 一標的にする細胞上に産する受容体に親水性を有する蛋白質、特にリン脂質の層 上にグラフトされたアポリボ蛋白質Ｂの分子を含有する合成粒状物ベクターに関 する。

この種の粒状物ベクターは、ＬＤＬと同一の特性、特にその大きさ及びその認識 され且つ細胞例えば有利には腫瘍細胞によって取り込まれる能力を有しつつ、活 性原体、特にいろいろな種類の細胞毒性薬剤を効果的にカプセル化しつる。

これらのベクターは特許願のＥＰ第３４４０４０号及びＦＲ第９１１０６７４３ 号の主題を形成する超分子バイオベクター（ＳＭＢＶ）の粒子から構成される。

これらのＳＭＢＶは大きさが１５〜２５ｎｍである。

非液体の親水性コアは本質的には親水性重合体、好ましくはデキストラン、殿粉 、セルロース及びこれらの誘導体から選択される生分解性多糖類であろう。

第１の脂質層は直径２０ｎｍの多糖類に結合する。この第１層は架橋した多糖類 のコアの周囲における脂肪酸の位置選択的アシル化によって拘束される。

第２層又は外側ラメラはＬＤＬ中に存在するものと同一のリン脂質からなる。

アポリボ蛋白質Ｂのグラフト化はこけらのベクターの合成における複雑な工程で ある。事実上、アポＢは共有ジスルフィド結合橋を介して容易に凝集しやすい疎 水性蛋白質である。この凝集は不可逆であり、蛋白質を完全に変性させる。この 時この蛋白質は特異的な受容体によって最早や認識されない。従って非常に穏和 で変性させない条件下にアポＢを単離し且つグラフトさせることが必要である。

本申請者は２つの方策を選択したニ ー洗剤の存在下におけるアポＢだけの単離：洗剤は変性させない条件下にアポＢ を水性溶液中に可溶化せしめ、そして蛋白質を洗剤の透析により洗剤環境からＳ ＭＢＶへ移行させる一アポＢの、そのリン脂質環境と一緒の単離：　ＬＤＬの部 分的又は完全なリン脂質ラメラを有するアポＢを、多かれ少かれリン脂質に富む ＳＭＢＶにグラフトさせる。

この種のベクターは他の細胞種の標的化に使用でき、僅かな改変に供しつる。

事実上アポＢの少しの改変はＬＤＬを認識しつる受容体種を変化させ、そしてベ クターの表面における改変されたアポＢのグラフト化は他の細胞種を特異的に標 的化しうる。

本発明は、上の定義に相当し且つアポリボ蛋白質Ｂの分子がアセチル化され、酸 化され及び／又はいずれかの種類の化学的改変を受けている粒状物ベクターにも 関する。この種のベクターは大食細胞に対する選択的なトロピズムを有する。そ れはこれらの細胞を含む病状：ウィルスの感染、寄生虫病、細胞内バクテリヤ病 において特に有利な用途が見出されよう。

本発明は上に定義した如き、また親水性コアが更に活性原体を含有することで特 徴づけられる粒状物ベクターにも関する。

事実上粒子の表面性の改変により細胞認識機作を妨害させないために、活性原体 を多糖類コア内に負荷する。

選択したベクターの種類に依存して、活性原体はより特別的に１つの細胞種へ向 うであろう。

斯（して本発明は、上に定義した如き且つ活性原体が好ましくは抗ガン剤、抗ガ ン剤に対する耐性を逆転させる薬剤、免疫調節剤、オリゴヌクレオチド、アンチ センス（ａｎｔｉｓｅｎｃｅ）メツセンジャーＲＮＡ、肝臓保護薬剤、及びＨＭ ＧＣｏＡリダクターゼ禁止剤を含んでなる群から選択される粒状物ベクターに関 する。

本発明の好適な観点の１つによれば、抗ガン活性原体は、アンスラシフリン群か ら、更に特にアクラルビシン（ａｃｌａｒｕｂｉｃｉｎ）　、エビルビシン（ｅ ｐｉｒｕｂｉｃｉｎ）　、ダウノルビシン（ｄａｕｎｏｒｕｂｉｃｉｎ）　、ド クソルビシン（ｄｏｘｏｒｕｂｉｃｉｎ）及びゾルビラン（ｚｏｒｕｂｉｃｉｎ ）から選択される挿入剤（ｉｎｔｅｒｃａｌａｔｉｎｇ　ａｇｅｎｔ）である。

また本発明は、上に定義した如き且つ活性原体が抗ウィルス、抗バクテリヤ、抗 菌、抗寄生虫、及び抗エイズ薬剤を含んでなる群から選択される粒状物ベクター にも関する。

後者の群に属する活性原体は好ましくは大食細胞に対するトロピズムを有するベ クター中にカプセル化されよう。これらのベクターはアセチル化された及び／又 は酸化されたアポリボ蛋白質を有する。

粒状物ベクターの構造は実質的にいずれの分子もカプセル化しうる。

本発明は、 ａ）親水性コア、脂質の第１層及びリン脂質の第２層を含むベクターを製造し、 ｂ）活性原体を親水性コア内にカプセル化し、ｃ）ＬＤＬから精製したアポリボ 蛋白質Ｂの分子をリン脂質層上にグラフトする、 ある細胞種に対する選択的トロピズムを有する合成粒状物ベクターの製造法にも 関する。

これによって得られるベクターの大きさは２０ｎｍ程度である。

工程Ｃ）は特にミセルの形で溶解したアポリボ蛋白質Ｂを出発物質とする洗剤透 析技術によって行われる。用いる洗剤は好ましくは透析しうる洗剤、ナトリウム デオキシコレート、オクチル−Ｂ、Ｄ−グルコピラノシド［ｓ　ｉ　ｃ］などの 群から選択される。

アポリボ蛋白質は実際はこれらのベクター上に存在し、これらのベクター上とＬ ＤＬにおいて同等の物理化学的性質を有する。

本発明による合成ベクターの代謝は、放射性ヨウ素で標識することにより、間接 的な免疫蚤光法により、及び透過型電子顕微鏡により監視した。

斯くしてアポＢが本発明に従って確かにベクター」二に固定されていること及び それがモデル細胞のアポＢ受容体により確かにそのままで認識されることを示す ことができた。

本発明は、選択的なトロビズムを有する合成粒状物ベクター及び投与に対して許 容しうる賦形剤を含有する製薬学的組成物にも関する。

以下の実施例は本発明の例示であって、いずれの具合にもその範囲を限定するも のではない。

これらの実施例では、次の図面が参照されよう：図１＝シアリー（Ｔｈｉｅｒｒ ｙ）反応による粒状物ベクター上のアポＢの電子顕微鏡での可視化 図２：モノクローナル抗体を用いる粒状物ベクター上のアポＢの検出図３＝本発 明による粒状物ベクターの代謝の可視化。

実施例１ニアミロペクチンからの架橋した多糖類コアの製造アミロペクチン５０ ０ｇを、水酸化ナトリウム捕集器を備えた５１の反応器において、２Ｎ水酸化ナ トリウム３１と混合した。溶液が均一になった時、エピクロルヒドリン１２ｍ／ を激しく撹拌しながら注入した。

この反応混合物を更に１時間撹拌し、次いて終夜放置した。

この結果弾性のもろいゲルを得た。このゲルを水ＩＯＮ中に懸濁させ、濃塩酸で 中和し、ら線形粉砕機［ウェアリング・ブレンター（Ｗａｒｉｎｇ　Ｂｌｅｎｄ ｅｒ）型］を用いて機械的に粉砕し、直径数１０ミクロンの粒子を得た。

次いで得られたゲルをブフナーでの濾過又は遠心分離により洗浄し、凍結乾燥に より乾燥した。

！、１１１２：酸性の架橋した多糖類コアの製造：コハク酸での官能基化上で得 た多糖類ゲル５００ｇを蒸留水５１に分散させ、ｐＨをＮａＯＨで８．５に調節 し、ｐＨ−スタット（ｓｔａｔ）を用いてこの値に維持した。温度を１０℃以下 に維持した。次いでコハク酸モノクロリド４２ｇを、ｐＨを８付近に及び温度を １０℃以下に維持するようにして連続的に添加した。すべてのクロリドを添加し た時、懸濁液を室温に戻しつつ更に１時間撹拌した。得られたゲルをブフナーで の濾過により又は遠心分離により洗浄し、次いで凍結乾燥により乾燥した。

滴定により決定して糖当り０．０５当量の置換度を有するゲル５００ｇを得た。

同様の符号の荷電間に存在する反撥の結果として、イオン性置換基はゲル物体内 に均一に分布した。

イオン性基の置換度はコハク酸モノクロリドの化学量論量を多糖類マトリックス に対して増加させることによって容易に調節しえた。

上で得たゲル５００ｇを蒸留水５１に分散させ、ラニー（Ｒａｎｎｉｅ）　１２ −５１Ｈ型ホモゲナイザーでホモゲナイズした。この時ホモゲナイズ圧は９００ バール及び流速は８０１／時であった。

この結果クールター（Ｃｏｕｌｔｅｒ）　Ｎ　４　ＭＤ型ナノナイザーで測定し た大きさが２０ｎｍ付近に中心のある酸性の架橋した多糖類のナノ粒子流体懸濁 液を得た。次いでこのナノ粒子をＮ　Ｈ４ＨＣＯｓ　５％の存在下にブヒ（Ｂｔ ！ｃｈｉ）　１９０型噴霧器により乾燥した。粒子の濃度は５％であり、乾燥空 気の温度は２００℃であった。

実施例４：脂質殻の調製 上で得た平均直径２００ｍの噴霧乾燥したナノ粒子１００ｇを無水ジクロルメタ ン５００ｍ／に懸濁させた。次いでバルミトイルクロリド５０ｇ及び乾燥炭酸ナ トリウム５０ｇを添加した。この混合物を還流下に激しく撹拌し続け、４８時間 湿気から保護した。

次いでジクロルメタンを蒸発させ、アシル化した粒子を最初に２％酢酸／メタノ ール（１０：９０）混合物で、次いでメタノールで２回洗浄した。各洗浄間では 粒子を遠心分離によって回収した。

最終的にメタノールを減圧下にロータリーエバポレーターにより蒸発させて、粒 子を乾燥状態で得た。脂肪酸の多糖類コアへのグラフト化度はローウニリーズ（ Ｌａｕｗｅｒｙｓ）法で決定して１０重量％であった。

実施例５：外側リン脂質ラメラの確立 上で得たアシル化したイオン性粒子（２０ｎｒｎ／グルコース単位当り０．０５ イオン性リガンド／１０％パルミチン酸）１ｇをエタノール５ｍｌに分散させた 。得られた懸濁液を注射器により、リン脂質［精製した卵黄レシチン−シグマ・ ケミカル社（Ｓｉｇｍａ　Ｃｈｅｎ＋１ｃａｌ　Ｃｏ、　）　］　１　ｇ及び蒸 留水１００ｍ１から調製した一枚膜リポソームの懸濁液中へ注入した。リポソー ムは丸底フラスコを用いる標準的な方法で調製し、次いで浴中において１時間超 音波処理することによって一枚膜リポソームとした。

実施例６：可溶性殿粉からの架橋した多糖類コアの製造可溶性殿粉［プロラボ（ Ｐｒｏｌａｂｏ）　１５００　ｇを、水酸化ナトリウム捕集器を備えた５１の反 応器において、２Ｎ水酸化ナトリウム２Ｉ！と混合した。溶液が均一になった時 、エピクロルヒドリン１２ｍ１を激しく撹拌しながら注入した。この反応混合物 を更に１時間撹拌し、次いで終夜放置した。

この結果弾性ゲルを得た。このゲルを水１０１中に懸濁させ、濃塩酸で中和した 。次いでこのゲルをら線形粉砕機［ウェアリング・ブレンダ−（Ｗａｒｉｎｇ　 Ｂｌｅｎｄｅｒ）型］を用いて機械的に粉砕し、直径数１０ミクロンの粒子を得 た。

次いで得られたゲルをブフナーでの濾過又は遠心分離により洗浄し、凍結乾燥に より乾燥した。

実施例７：燐酸での官能基化 実施例６に従って得た多糖類ゲル５００ｇを２Ｍ水酸化ナトリウム２１に懸濁さ せ、０℃まで冷却した。オキシ塩化燐（ＰＯＣＩｓ）２４０ｇ（１，，５５モル ）及びＩＯＭ　ＮａＯＨ５５０ｍ１を、２つの試剤を同時に添加するようにして 撹拌しながら徐々に添加した。温度を１０℃以下に保った。添加の完了後、混合 物を室温に戻しながら更に２時間撹拌した。次いで混合物を塩酸で中和し、ブフ ナーで濾過し、蒸留水で中性になるまで洗浄した。

凍結乾燥後、イオン性ゲル５５０ｇ　（収率９１％）を得た。グラフト化度を、 フェノールフタレンを指示薬とする０、ＩＮ水酸化ナトリウムでの滴定により決 定した。ゲル１ｇ当り１．５ミリ当量の負荷電が見出された。

実施例８：直径２０ｎｍのホスホリル化多塘類コアの製造実施例７に従って得た ケル５００ｇを蒸留水１０１に分散させ、う二−（Ｒａｎｎｉｅ）　１２−５１ 　Ｈ型ホモゲナイザーでホモゲナイズした。この時ホモゲナイズ圧は９００バー ル及び流速は８０１／時であった。

この結果クールター（Ｃｏｕｌｔｅｒ）　Ｎ　４　ＭＤ型ナノサイザーで測定し た大きさが２０ｎｍ付近に中心のある酸性の架橋した多糖類のナノ粒子流体懸濁 液を得た。次いでこのナノ粒子をＮＨ４ＨＣＯ３５０ｇ／ｌの存在下に凍結乾燥 により乾燥した。

実施例９：多段アシル化法による脂質膜の調製実施例８に従って得た２０ｎｍの 粒子１０ｇをジクロルメタン３０ｍ１に分散させた。バルミトイルクロリド１． ７ｇを添加した。炭酸カリウム保護管を備えた凝縮器を反応フラスコに取り付け 、反応混合物を終夜撹拌下に激しく攪拌した。次いでジクロルメタンをロータリ ーエバポレーターで蒸発させ、残渣をエタノールで数回洗浄し、次いで真空乾燥 した。アシル化された粒子１０．３ｇ（収率９８％）を得た。グラフトした脂肪 酸の含量は、粒子のけん化後に測定して５％であった。

得られたアシル化粒子１０ｇを激しく撹拌しながら水ｌｌ中で撹拌した。懸濁液 が均一になった時、粒子を炭酸水素アンモニウム５０　ｇ／ｌの存在下に凍結乾 燥した。

この粒子をジクロルメタン３０ｍ＋＋に分散させ、上述した手順に従って再アシ ル化した。洗浄後脂肪酸含量が６％の粒子９．５ｇ（収率９４％）を得た。

すべて上述した工程（水和、凍結乾燥、再アシル化を含んでなる３回目の反応サ イクルにより、脂肪酸含量６．５％のアシル化粒子９ｇ（全収率８８％）を得た 。

メラの確立 用いたリン脂質ラメラの組成はＬＤＬのそれと同様であり、次の通りであった： 　（ＬＤＬ型混合物） 一精製した卵黄レシチン［ｓ　ｉ　ｃｌ　（ＥＹＰＣ）５３％−スフィンゴミエ リン（ＳＭ）２０％ −ホスファチジルセリン（ＰＳ）４％ −リゾホスファチジルコリン（ＬＰＧ）３％−コレステロール２０％ （シグマ・ケミカル社） 脂質を乾燥状態で洗剤と混合しくＥＹＰＣ５３ｍｇ、ＳＭ　２０ｍｇ。

コレステロール２０ｍｇ、ＰＳ　４ｍｇ、ＬＰｏ　３ｍｇ、及びオクチル−Ｂ、 Ｄ−グルコピラノシド２９２ｍｇＬクロロホルム２ｍｌに可溶化させた。溶媒を ロータリーエバポレーターで除去し、均一な膜を得た。

次いで脂質及び洗剤を、磁気撹拌しなから１ｍＭ　ＥＤＴＡ溶液（ｐＨ７，２０ ｍ１）を用いて徐々に水和した。得られた懸濁液を不活性な雰囲気下に４５℃で １５分間浴中において超音波処理に供した。

実施例９に従って製造し且つオクチル−Ｂ、Ｄ−グルコピラノシド［ｓ　ｉ　ｃ ｌ　２ｍｉ！に分散させたアシル化したコア（１０ｍｇ）を超音波下に脂質（７ ，５ｍｇ／ｌ、５ｍ１）と混合し、次いで１ｍＭＥＤＴＡ（ｐＨ７）１６ｍｌ中 への注入によりＭＣＣ下に急速に希釈した。次いで１ｍＭＥＤＴＡ溶液（ｐＨ７ ）に対して４８時間透析することによって洗剤を除去した。

実施例１１；抗バクテリヤ剤ニブチロシンのＳＭＢＶ中への導入ブチロシンはア ミノグリコシド族の抗生物質である。これはグリコシド結合を介してアミノ糖に 結合したアミノシントールからなる分子である。またそれは水だけに可溶の高極 性及び塩基性生成物である。分子量は５５６である。

ａ）５糖当り１コハク酸に相当するイオン性グラフト化度で特徴づけられ且つ実 施例４［５ｉｃｌに従って製造した２０ｎｍのアシル化コアを先ず製造した。脂 質膜は多糖類に対して１０％の含量のバルミチン酸からなった。

アシル化したコア１ｇ及びブチロシン塩基［パーク・デービス（ＰａｒｋＤａｖ ｉｓ）　］　０．５　ｇを乾燥状態で混合した。次いで混合物を蒸留水の添加に よって徐々に水和した。この混合物を一定に且つ５０℃で撹拌し続けた。次いで 混合物を室温に戻しながら水１０ｍ１を添加した。

次いで懸濁液を凍結乾燥した。この乾燥残渣をエタノール５ｍｌに分散させ、一 枚膜リポソームの懸濁液（蒸留水５０ｍＡ’中精製卵黄レシチンＩｇ）に添加し た。洛中で１時間超音波処理した後、懸濁液を限外濾過し、限外濾過液中に存在 する遊離のブチロシンをＨＰＬＣにより評価した。この結果は限外濾過液中にブ チロシン２５ｍｇの存在することを示した。これは導入収率９５％及びアシル化 コアに対する導入率４７゜５重量％に相当した。

ｂ）第１工程において、酸性のアシル化した２Ｑｎｍのコアを実施例９に従って 製造した。次いてこのアシル化コア５０ｍｇを、蒸留水１ｍｌに希釈したブチロ シン塩基（パークーデービ↓［ｓｉｃ］）２５ｍｇと混合した。混合物を室温で 終夜撹拌しつづけた。

得られた懸濁液をオクチル−Ｂ、Ｄ−グルコピラノシド（ＯＧＰ）［フル力（Ｆ ｌｕｋａ）　］の存在下に最終モル濃度５０ｍＭまで分散させ、リン脂質の溶液 （５０ｍＭ　ＯＣＰ　１０ｍ１に分散させた精製卵黄レシチン／コレステロール （８０：　２０ｗ／ｗ　［ｓ　ｉ　ｃｌ　）の混合物５０ｍｇ）に添加した。浴 中で１０分間超音波処理した後、この溶液を超音波下に、ＯＧＰに関して５ｍＭ の濃度まで急速に希釈し、次いで限外濾過した（排除点：３０．０００ダルトン ）。次いで得られたＳＭＢＶを０．２２μｍの濾過で無菌にした。ナノサイザー （クールターＮ４ＳＤ型）を用いて行なった大きさの分析は、このＳＭＢＶの９ ９％が直径２０±２ｎｍであることを示した。

濾液中に存在する遊離のブチロシンを微生物学的に分析した。抗生物質の濃度は 枯草菌（ＡＴＣＣ６６３３）の生長禁止の面積を測定することによって決定した 。結果は限外濾過液中に遊離のブチロシン２，５ｍｇが存在することを示した。

これはブチロシンの導入収率９０％及びアシル化コアの重量に対するブチロシン の導入率４５重量％に相当した。

この結果得られたＳＭＢＶを０．２μｍでの濾過により無菌にした。

この濾過収率は９５％であった。大きさの分析をナノサイザー（クールターＮ４ ＳＤ型）を用いて行なったが、それは２０±３ｎｍに９５％の分布を示した。

実施例１２：抗ガン剤、ドクソルビシンのＳＭＢＶへの導入ドクソルビシン（ア ドリアマイシン＠）はアンスラシフリン族に属する抗ガン剤抗生物質である。こ れは特徴的な蛍光性を有する分子を賦与する多芳香族アグリコーンにより及びア ミノ糖、ダウノサミンにより特徴づけられる両親媒性生成物である。ドクソルビ シン塩酸塩の分子量は５８０である。

ａ）ナトリウム塩の形の、コハク酸でサクシニル化した且つ実施例４［５ｉｃｌ に従って製造したアシル化コアを使用した。

アシル化したコア１ｇ及びドクソルビシン塩酸塩（シグマ・ケミカル社）０．７ ｇを乾燥状態で混合した。次いでこの混合物を室温で撹拌しながら蒸留水１０ｍ ４で徐々に水和した。次いでこれを室温で２時間撹拌した。

得られた懸濁液を凍結乾燥した。乾燥した残渣をエタノール５ｍｌ中に分散させ 、一枚膜リポソーム（蒸留水５０ｍ／中精製卵黄レシチン３ｇ）の懸濁液に添加 した。水浴中で１時間超音波処理した後、懸濁液を限外濾過し、この限外濾過液 中に存在する遊離のドクソルビシンをＨＰＬＣにより分析した。結果は限外濾過 液中にドクソルビシン２８ｍｇの存在することを示した。これはカプセル化収率 ９６％及びアシル化コアに対するカプセル化度６７重量％に相当した。

ｂ）実施例９に記述したアシル化コアを用いた。

アシル化したコア０．５ｇをエタノール１０ｍ１に分散させた。水溶液中ドクソ ルビシン（シグマ・ケミカル社）０．２０ｇを撹拌しなからアシル化コアの懸濁 液に徐々に添加した。次いで得られた混合物を、室温下且つ光から保護して２時 間撹拌した。

このように導入したアシル化コアの懸濁液にエタノールを添加して、７５容量％ の含量を得た。次いでアシル化したコアを遠心分離（１０゜０００ｇ、１５分間 ）により回収し、乾燥した。遊離のドクソルビシンをＨＰＬＣにより分析し、結 果は上澄液中にドクソルビシン４ｍｇの存在することを示した。ドクソルビシン の、アシル化コア中への負荷率は３９％であり、ドクソルビシンの収率は９８％ であった。

乾燥残渣を、ＬＤＬ型リシリン脂質０７５ｇを含む５０ｍＭオクチル−Ｂ、Ｄ− グルコピラノシド［ｓ　ｉ　ｃ］　（ＯＧＰ−シグマ・ケミカル社）１７５ｍＩ ！に捕捉させ、超音波浴中で分散させた。次いで得られた懸濁液を超音波プロー ブ下に蒸留水７００ｍ／中に注入し、ＯＧＰの濃度をＣＭＣ下に１０ｍＭに減じ た。このように製造したドクソルビシンを負荷したＳＭＢＶを厳密に透析して洗 剤を除去した。次いでこれを０．２μｍでの濾過により無菌にした。

導入したドクソルビシンを、２Ｍ　ＮａＨｚＰＯ＊／エタノール（７０：３０） 溶液中に放出した後、ＨＰＬＣで分析した。この結果は、ＳＭＢＶへ導入された ドクソルビシン０．１７　ｇの存在を示し、且っ°アシル化コアに対する負荷率 ３４％及びドクソルビシンの収率８５％に相当した。

このように導入したドクソルビシンを含むＳＭＢＶを、ＴＳＫ　Ｇ６ｏ　ｏ　ｏ 　ｐｗカラムでのゲル・パーミェーションにより分析してその大きさを評価した 。これらのＳＭＢＶのクロマトグラフィーでの傾向は、その大きさがドクソルビ シンを含まないＳＭＢＶのそれと同一であり、２０±３ｎｍに９５％の分布を有 することを示した。

実施例１３：抗ウィルス剤、シトプシンのＳＭＢＶへの導入ジドブジ：ノ（Ｚｉ ｄｏｖｕｄｉｎｅ）又は３−アジドデオキシチミジン（Ａ　Ｚ　Ｔ）はそのチミ ジン理系により塩基性特性を有する。それはリバース・トランスクリプターゼ（ ｒｅｖｅｒｓｅ　ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ）禁止剤であり、特にエイズの処 置における抗ウィルス剤として使用される。分子量は２６７である。

ａ）実施例１１ａ）と同一のコアを使用した。

アシル化したコア１ｇ及びシトプシン（シグマ・ケミカル社）０．３３ｇを乾燥 状態で混合した。次いでこの混合物を室温で撹拌しながら蒸留水１０ｍ４で徐々 に水和した。次いでこれを室温で２時間撹拌した。

得られた懸濁液を凍結乾燥した。乾燥した残渣をエタノール５ｍｌ中に分散させ 、一枚膜リポソーム（蒸留水５０ｍ１中精製卵黄レシチン３ｇ）の懸濁液に添加 した。水浴中で１時間超音波処理した後、懸濁液を限外濾過し、この限外濾過液 中に存在する遊離のシトプシンをＨＰＬＣにより分析した。結果は限外濾過液中 にシトプシン３０ｍｇの存在することを示した。これはカプセル化収率９１％及 びアシル化コアに対するカプセル化度３０重量％に相当した。

ｂ）実施例９に記述したアシル化コアを用いた。

アシル化したコア０．５ｇをエタノール１０ｍ１！に分散させた。水溶液中シト プシン（シグマ・ケミカル社）０．２０ｇを撹拌しながらアシル化コアの懸濁液 に徐々に添加した。次いで得られた混合物を、室温下に２時間撹拌した。

このように導入したアシル化コアの懸濁液にエタノールを添加して、７５容量％ の含量を得た。次いでアシル化したコアを遠心分離（１０゜０００ｇ　［ｓ　ｉ 　ｃ］　、１５分間）により回収し、乾燥した。遊離のシトプシンをＨＰＬＣ［ ｓ　ｉ　ｃ］により分析し、結果は上澄液中に１５ｍｇの存在することを示した 。シトプシンの、アシル化コア中への負荷率は２７％であり、シトプシンの収率 は９５％であった。

乾燥残渣を、ＬＤＬ型リシリン脂質０７５ｇを含む５０ｍＭオクチル−Ｂ、Ｄ− グルコピラノシド［ｓ　ｉ　ｃ］　（ＯＧＰ−シグマ・ケミカル社）１７５ｒｒ ＋１に捕捉させ、超音波洛中で分散させた。次いで得られた懸濁液を超音波プロ ーブ下に蒸留水７００ｒｒ＋４中に注入し、ＯＧＰの濃度を１０ｍＭに減じた。

このように製造したシトプシンを負荷したＳＭＢＶを厳密に透析して洗剤を除去 した。次いでこれを無菌条件下に０．２μｍの膜で濾過した。

導入したシトプシンを、２　Ｍ　Ｎ　ａ　Ｈ２Ｐ　Ｏａ／　エタノール（７０： ３０）溶液中に放出した後、ＨＰＬＣで分析した。この結果は、ＳＭＢＶへ導入 されたシトプシン０．１２８ｇの存在を示し、且つアシル化コアに対する負荷率 ２６％及びシトプシンの収率８５％に相当した。

実施例１４：抗マイコバクテリヤ剤、イソニアシトのＳＭＢＶへの導入イソニア シト（ｌ５ｏｎｉａｚｉｄ）は塩基性特性を付与するイソニコチン酸のヒドラジ ド誘導体である。これは肺結核の処置に非常に有効である。

分子量は１３７である。

ａ）用いたコアは実施例１１ａ）に記述したものであった。

アシル化したコア１ｇ及びイソニアシト０．１７ｇを乾燥状態で混合した。次い で混合物を蒸留水４０ｍ１で４０℃下に徐々に水和し、この温度で１時間撹拌し た。混合物を１時間中撹拌しながら室温に戻した。

得られた懸濁液を凍結乾燥した。乾燥した残渣をエタノール中に分散させ、一枚 膜リポソーム（蒸留水５０ｍ１中精製卵黄レシチン３ｇ）の懸濁液に添加した。

水浴中で１時間超音波処理した後、懸濁液を限外濾過し、この限外濾過液中に存 在する遊離のイソニアシトをＨＰＬＣにより分析した。結果は限外濾過液中にイ ソニアシト１５ｍｇの存在することを示した。これはカプセル化収率９１％及び アシル化コアに対するカプセル化度１５．５重量％に相当した。

ｂ）用いたコアは実施例９に記述したものと同一であった。

アシル化したコア０．５ｇをエタノール１０ｍｊ’に分散させた。水溶液中イソ ニアシト（シグマ・ケミカル社）０．１０ｇを撹拌しなからアシル化コアの懸濁 液に徐々に添加した。次いで得られた混合物を、室温下に１時間撹拌した。

このように導入したアシル化コアの懸濁液にエタノールを添加して、７５容量％ の含量を得た。次いでアシル化したコアを遠心分離（１０゜０００ｇ、１５分間 ）により回収し、乾燥した。遊離のインニアシトをＨＰＬＣにより分析し、結果 は上澄液中に４ｍｇの存在することを示した。イソニアシトの、アシル化コア中 への負荷率は１９％であり、イソニアシトの収率は９６％であった。

乾燥残渣を、ＬＤＬ型リシリン脂質０３７５　ｇを含む５０ｍＭオクチル−Ｂ、 Ｄ−グルコピラノシド［ｓ　ｉ　ｃｌ　（ＯＧＰ−シグマ・ケミカル社）１７５ ｍｌに捕捉させ、超音波浴中で分散させた。次いで得られた懸濁液を超音波プロ ーブ下に蒸留水７００ｍＡ’中に注入し、ＯＧＰの濃度をＣＭＣ下に１０ｍＭに 減じた。このように製造したイソニアシトを負荷したＳＭＢＶを厳密に透析して 洗剤を除去した。

導入したイソニアシトを、２Ｍ　ＮａＨ２ＰＯ，／エタノール（７０：３０）溶 液中に放出した後、ＨＰＬＣで分析した。この結果は、ＳＭＢＶへ導入されたイ ソニアシト０．０８７　ｇの存在を示し、且つアシル化コアに対する負荷率１７ ％及びドクソルビシンの収率８７％に相当した。

実施例１５：洗剤透析法によるアポＢのＳＭＢＶへのグラフト用いたＬＤＬは、 健康な供給者の血漿から、ＫＢｒグラジェントの連続的超遠心により抽出した。

用いたＳＭＢＶは、実施例５に上述した手順に従って合成し、次の特性を有した ：グルツース単位当り０．０５イオン性リガンド、パルミチン酸１０％、完全な ＳＭＢＶに対してはシミリストイルホスファチジルコリン７５％及びスフィンゴ ミエリン２５％（重量％）＋コレステロール１０％（リン脂質の重量に対する％ ）から或いはリン脂質の欠けるＳＭＢＶに対しては卵黄レシチンからなるリン脂 質ラメラを含む酸性多糖類。ＳＭＢＶの大きさは２０％ｍであり、アシル化コア ／リン脂質の比は重量で１＝３であった。

ＬＤＬの量は濁度計で分析されるアポＢのｍｇ数で示される（アポＢの抗アポＢ 抗体での沈殿のために５００　ｎｍにおける光学密度が増加）。

これらのデータはアポＢのＳＭＢＶへのグラフト化の実施例すべてに対して有効 である。

予じめ緩衝液Ａ　（５０ｍＭ　Ｎ　ａ　ｚｃ　Ｏｓ、ｐＨ１０）に対して透析し たＬＤＬ　（３ｍｇ１０．５ｍ１）を、次の割合、即ち重量でアポＢの５５倍量 のナトリウムデオキシコレート（ＮａＤＣ）（１６５ｍｇ）で破壊し、最終容量 を調節して１８０ｍｇ／ｍｌの最終ＮａＤＣ濃度にした。

この溶液を１分間かき混ぜ、次いで室温で１時間穏やかに撹拌した。

ＮａＤＣは、ＬＤＬを完全に破壊し且つ変性させない条件下にアポＢを洗剤ミセ ルで可溶化させることを可能にした。

次いでＬＤＬの種々の成分をその分子量に応じてゲル濾過［ファーマシア（Ｐｈ ａｒｍａｃｉａ）　Ｅ　Ｐ　Ｌ　Ｃ系、スパーローズ（Ｓｕｐｅｒｏｓｅ）　６ 本カラム、１．５ｃｍｘ３０ｃｍ、移動相緩衝液Ｂ：緩衝液Ａ＋１０ｍＭ　Ｎａ ＤＣ１流速２５ｍ４／時］により分離し、１ｍｌずつ画分を集めた。アポＢは洗 剤の混合ミセルの形で生じ、このために見かけの分子量が増大した。

斯くしてそれはカラムのデッド・ボリューム（ｄｅａｄ　ｖｏｌｕｍｅ）で流出 した。アポＢを含む画分を蛋白質分析により決定し、集めた。アポＢの抽出収率 は９５〜１００％であった。

アポＢ及びＮａＤＣのミセルの溶液を、緩衝液Ａに対する透析に設定したＳＭＢ Ｖの懸濁液（１９，３ｍｇ／２ｍｌ、そのうちアシル化したコア４．５ｍｇ、Ｄ ＭＰＣ１３，５ｍｇ、スフィンゴミエリン（７５〜２５％）［ｓｉｃ］及びコレ ステロール０．９ｍｇ）に滴下した。次いで得られた懸濁液を緩衝液Ａに対して ４８時間透析してすべてのＮａＤＣを除去した。

得られた懸濁液を５０００ｇで１５分間遠心分離にかけた。アポＢ−ＳＭＢＶ　 （アポＢ２．６ｍｇ及びアシル化コア４．０ｍｇ）を上澄液で回収した。

ナトリウムデオキシコレートは池の透析しつる洗剤によって代替することができ た。

実施例１６：２工程での洗剤の除去によるアポＢのグラフト化本実施例は実施例 １［ｓｉｃ］の変形であり、それでは洗剤をゲル濾過によって大部分を除去し、 次いで透析した。用いたＳＭＢＶは前と同じものであった。

予じめ緩衝液Ａ　（５０ｍＭ　［ｓ　ｉ　ｃｌ　Ｎａ２ＣＯ，，５０ｍＭＮａＣ １％ｐ）１１０）に対して透析したＬＤＬ　（３ｍｇ１０．５ｍｌ　）を、次の 割合、即ち重量でアポＢの５５倍量のナトリウムデオキシコレート（ＮａＤＣ） １６５ｍｇ）で破壊し、最終容量を調節して１８０ｍｇ／ｍｌの最終ＮａＤＣ濃 度にした。この溶液を１分間かき混ぜ、次いで室温で１時間穏やかに撹拌した。

ＬＤＬの種々の成分を、その分子量に従ってゲル濾過（ファーマシア系、セファ ローズＣＬ−４Ｂカラム１．６ｃｍＸ６０ｃｍ、移動相緩衝液Ｂ）により分離し 、１ｍｌずつ画分を集めた。アポＢを含む画分を蛋白質分析により決定し、次い で集めた。次いで過剰なＮａＤＣを、１０ｍＭトリス−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ９） で平衡化させ且つ流出せしめるセファデックスＧ−７５カラム（１，６ｃｍｘ　 ３０　ｃｍ）でのゲル・パーミェーションによって除去し、アポＢを変性させな いようにして水性溶液中に溶解させるのに必要とされる最小量のＮａＤＣを含む アポＢを得た。

このアポＢの溶液をＳＭＢＶの懸濁液（１９，３ｍｇ／２ｍ１）に添加し、次い で洛中において３７℃下に１５分間超音波処理した。得られた懸濁液を緩衝液Ａ に対して４８時間透析してＮａＤＣを除去した。

得られた懸濁液を５０００ｇで１５分間遠心分離にかけた。アポＢ−ＳＭＢＶ　 （アポＢ２．８ｍｇ及びアシル化コア４．０ｍｇ）を上澄液中で回収した。

実施例１７：ＬＤＬの疎水性コアの有機抽出後におけるリン脂質環境を有するア ポＢのＳＭＢＶへのグラフト化予じめｐＨ８に調節した３ｍＭＥＤＴＡ溶液に対 して透析したＬＤＬ（アポＢ２ｍｇ／３ｍ１）をラクトース（１００ｍｇ）の存 在下に１８時間凍結乾燥した。ラクトースはＬＤＬの凝集とアポＢの変性を防止 した。

凍結乾燥物を磁気撹拌によりヘプタン中で粗く分散させ、次いで１０００ｇで１ ０分間遠心分離に供した。ＬＤの疎水性コアの脂質を含む上澄液を除去し、ペレ ットを同一の条件下に２回以上抽出した。ヘプタンはコレステロールエステル及 びトリグリセリドを、リン脂質の除去なしに選択的に抽出しえた。これによって ［欠文］、ＬＤＬのリン脂質ラメラに取り囲まれたアポＢを含む凍結乾燥物を、 窒素下に引き続き乾燥した。

エチルエーテルに懸濁させたＳＭＢＶのアシル化したコア（３ｍｇ／ｌ、５ｍ１ ）を凍結乾燥物に添加し、室温で１時間穏やかに撹拌した。

次いでエチルエーテルを窒素流下に、更に減圧下に乾固するまで蒸発させた。

このようにして得た粉末を３７℃で撹拌しながら１０ｍＭ）リス−グリシン緩衝 液（ｐＨ８）２ｍｌで再水和し、超音波浴中で３分間超音波処理した。斯（して アポＢを、リン脂質ラメラと同時にアシル化核上にグラフトさせた。得られた懸 濁液を４℃で１２時間磁気撹拌することによって均一にし、次いで緩衝液（１５ ０ｍＭＮａＣＩ、５０ｍＭトリス、４％ＥＤＴＡ、ｐＨ８）に対して透析してラ クトースを除去した。

得られた懸濁液を１５分間５０００ｇで遠心分離にかけた。アポＢ−ＳＭＢＶ　 （アポＢ１．６ｍｇ及びアシル化コア２゜５ｍｇ）を上澄液中に回収した。

本実施例で用いたラクトースは、スクロース、グルコース、又はいずれか他の糖 で代替することができた。ＬＤＬの疎水性核の脂質を可溶化するいずれの有機溶 媒例えばヘキサンなどもヘプタンの代りに適当であった。

実施例１．８：ＬＤＬの酵素による部分的な加水分解後の、リン脂質環境を有す るアポＢのＳＭＢＶへのグラフト化予じめ緩衝液１　（１００ｍＭ　Ｋ２ＨＰＯ ４−ＫＨ２ＰＯ４、ｐＨ７，４）に対して透析したＬＤＬ　（２ｍｇ）を、ステ ロールエステル・ヒドロラーゼ［ブシュ−トモナス・フルオレッセンス（Ｐｓｅ ｕｄｏｍｏｎａｓ　ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎＳ）からのＥＣ３，１，１，１３］　 （２単位）及び脱脂賞した牛の血清アルブミン（２〜１０ｍｇ）と接触させた。

この溶液を撹拌しながら３７℃で２時間培養した。酵素は、コレステロールエス テルを加水分解することにより、ＬＤＬを穏やかに破壊し、そしてアルブミンは この結果遊離された脂質を捕捉した。これらの条件下に、アポＢを、それを保護 するリン脂質環境を有して、変性させないように単離した。

このように単離したアポＢを、分子量に関して排除限界３００．０００の膜によ る限外濾過［アミコン（４ｍ１ｃｏｎ）系］によって緩衝剤Ｉ　（２０ｍｌ）で ３回洗浄しえ酵素及び脂質の負荷されたアルブミンを除去した。

得られたアポＢを超音波下に、リン脂質の２０％不足量で合成したＳＭＢＶの懸 濁液に添加し、３７℃で１５分間超音波処理した。得られた懸濁液を５０００ｇ で１５分間遠心分離した。アポＢ−ＳＭＢＶ　（アポＢ１．８ｍｇ及びアシル化 コア２．５ｍｇ）を上澄液に回収した。

実施例１９：アボＢ−８ＭＢＶＪ特性 次の分析の各に対しては、アポＢ−ＳＭＢＶがＬＤＬと同一の挙動をするという ことを証明するためにＬＤＬを用いて、また負の対照物としてＳＭＢＶを用いて 試験を行ったアポＢ−ＳＭＢＶ上のアポＢの検出−細胞化学法：多糖類のシアジ ー法による可視化アポＢ及びＳＭＢＶをシアリー反応によって検出した。この反 応は糖を明らかにする（糖の過ヨウ素酸酸化、チオカルボヒドラジドとの縮合、 及び銀プロティネートとの錯体化）。ここにアポＢはグリコジル化され、またＳ 　Ｍ　Ｂ　Ｖは多糖類コアを有している。透過型電子顕微鏡による観察はアポＢ 及び多糖類コアを可視化させえた（図１）。

ＬＤＬ又はアポＢ−ＳＭＢＶを金被覆した電子顕微鏡グリッド上に配置した。次 いでこのグリッドを、新しく調製した１％過ヨウ素酸１滴の上に４５分分間−た 。次いで蒸留水で１０分間３回にわたってゆすいだ後、グリッドを、暗所下の、 １０％酢酸中１％チオセミカルバジドを含む染色ブロック中に置いた。６６又は ７２時間後、グリッドを酢酸の連続浴、１０−５−２．５−１％、及び蒸留水の ３つの浴で洗浄した。次いで粒子を暗所下で３０分間水中１％銀プロティネート で染色し、最後に水で５分間３回ゆすいだ。次いでグリッドを透過型電子顕微鏡 で観察した。

一免疫細胞化学法 アポＢを山羊の抗アポＢポリクローナル抗体で検出した。生成した複合体を、大 きさ５ｎｍの金の粒子に結合する蛋白質Ｇで可視化した。透過型電子顕微鏡によ る観察はアポＢ　−Ｓ　Ｍ　Ｂ　Ｖ上のアポＢを明らかにした。この時ＳＭＢＶ だけは負の応答を与えた（図２）。

ＬＤＬ又はアポＢ−ＳＭＢＶをニッケル担体で被覆した電子顕微鏡のグリッド上 に付着させ、蒸留水で５分間３回洗浄した。次いで８ｍｇ／ｍｌの濃度の原料溶 液から’／２００まで希釈した山羊の抗アポＢポリクローナル抗体［テブ（Ｔｅ ｂｕ）　］の存在下に、グリッドを室温で１時間培養した。このグリッドをＰＢ Ｓ＋１％ＢＳＡｆｉ合物で５分間６回ゆすいだ。

結合した抗体を可視化させるために、大きさ５ｎｍの金の粒子を吸収する［ｓ　 ｉ　ｃ］蛋白質Ｇの１７２ｏに希釈したものを使用した［ジャンセン（Ｊａｎｓ ｓｅｎ）　］　Ｐ　Ｂ　Ｓ　＋　１％ＢＳＡ中、ＰＢＳ単独中、及び蒸留水中で ５分間３回洗浄後、粒子を電子顕微鏡で観察した。

−アポＢ−ＳＭＢＶの大きさの測定 透過型電子顕微鏡及び光散乱によるミクロン以下の粒子分析機（クールターのナ ノサイザーＮ４ＭＤ型）を用いる観察はアポＢ−ＳＭＢＶに対して２０ｎｍに９ ５％以上の粒子分布を示した。

−アポＢ−３ＭＢＶの電気泳動挙動 電気泳動を４％５ＤＳ−ポリアクリルアミドゲル上で行った。ＳＭＢＶ上にグラ フトされたアポＢ及びＬＤＬのアポＢは同一の電気泳動による移動を示した。後 者はアポＢの見かけの分子量の知識と一致した。凝集やアポＢの断片は見られな かった。

−アポＢ−ＳＭＢＶの密度の決定 アポＢ−ＳＭＢＶの密度を、ＫＢｒの不連続的グラジェントによる超遠心により 決定した。

密度を固体ＫＢｒで１．２１に調整したＬＤＬの又はアポＢ−ＳＭＢＶ　（Ｉｍ ｇ／１ｍｇ／ｌ、５ｍ／）の懸濁液を超遠心分離管の底部に入れ、次いでこれを 次の密度１．０６３−１．０４０−１．０１９−１．００６を有するＫＢｒ溶液 で覆った。次いで遠心管を５００００ｇで１８時間超遠心した。アポＢ−ＳＭＢ Ｖは密度１．０１９と１．０４０の間で浮遊した。この密度範囲はＬＤＬと同一 程度であった。アポＢに関する及び放射線活性（３）１で標識したアシル化コア ）に関するグラジェント画分の分析は、すべてのアポＢ−ＳＭＢＶが確かにこれ ら２つの密度の間で見出されることを示した。

一アポＢ−８ＭＢＶの細胞代謝の検討 この検討はモデル細胞、人間の皮膚の線維芽細胞で行った。

−アポＢの放射性標識による アポＢを５Ｉで放射性ｍｓした後、ブラウン（Ｂｒｏｗｎ）及びゴールドスタイ ン（Ｇｏｌｄｓｔｅｉｎ）の技術［Ｊ、パイオル・ケム（Ｂｉｏｌ。Ｃｈｅｗ、 　）　（１９７４）２４９．５１５３〜５１６２］に従ってアポＢ−ＳＭＢＶの 結合、取り込み及び分解を定量化した。

アポＢ−ＳＭＢＶ　（アポＢ１ｍｇ／１ｍ４）を、グリシン緩衝液（ｐＨ９，１ ）０．２５ｍ１と、及び＋２５７［アンマージャム（＾ｍｍｅｒｓｈａｍ）　［ ｓｉｃ］コ　１ｏａｌ　［ｓｉｃ］　と混合した。１．２５ｍＭ　ＩＣＩ　［ｓ 　ｉ　ｃｌ溶液３１μｉ　［ｓ　ｉ　ｅ］を添加し、次いで混合物を３分間穏や かに攪拌して、アポＢのチロシン残基を酸化した。種々の生成物を、０．９％Ｎ ａｃ１溶液で予じめ平衡化させたＰｄ　１０カラム（セファデックスＧ−２５、 ファーマシア）でのゲル・パーミェーションにより分離し、１ｍ／ずつ画分を集 めた。次いでこれらの画分を蛋白質に対して及び放射性に対して分析した。放射 性標識したアポＢ−ＳＭＢＶを含むものを集め、次いで再び分析した。特異的活 性は１７５ｃｐｍ／アポＢｎｇであった。

線維芽細胞（３０，０００細胞／ウエル）を、６つのウェル（ｗｅｌｌ）をもつ 細胞培養プレート［ヌンク（Ｎｕｎｃ）　、直径２５ｍｍ１により、胎生の血清 ［ギブコ（Ｇｉｂｃｏ）　］　１０％を含むＭＥＭ培地（ギブコ）中で４８時間 培養し、次いでリポ蛋白質を除いた血清を含むＭＥＭ培地（ＭＥＭ−ＬＰＤＳ） 中で２４時間調整した。各ウェルに対し、培地を、放射性標識したアポＢ−ＳＭ ＢＶ（７ポＢ５〜２５μｇ　［ｓ　ｆ　ｃ］　）　を増大する量で含有するＭＥ Ｍ−ＬＰＤＳ　１ｍｌで置きかえた。これと並行して、同一量のアポＢ　ＳＭＢ Ｖと４０倍量の放射性標識してないしＤＬを含む一連のウェルを準備し、アポＢ −ＳＭＢＶの線維芽細胞による結合、取り込み及び非特異的分解を決定した。次 いでＣｏ、５％を含む調節された雰囲気下に、細胞を３７℃で５時間培養した。

分解を培養培地中に遊離される１１２５ｉ］千ロジン／細胞の量（ｃｐｍ／蛋白 質蛋白質ｍ上って、結合を、アポＢ受容体のヘパリンとの結合の開裂後に遊離さ れる１０Ｉ／細胞の量（ｃｐｍ／蛋白質蛋白質ｍ上って、また取り込みを、細胞 の溶解後に遊離される＋２Ｊ／細胞の量（Ｃｐｍ／蛋白質蛋白質ｍ上って定量化 した。

これらの実験は、アポＢ−ＳＭＢＶが天然のＬＤＬと同一の細胞的運命を受け且 つ後者と同一の細胞親和性をもつことを示す。これらの結果は間接的な免疫蛍光 性実験及び電子顕微鏡を用いる超構造実験によって確かめられた。

一間接的免疫蛍光法 線維芽細胞をカバーグラス上において単一層で培養し、上述の如き培養ウェル中 に！き、そして結合の場合４℃で１時間及び取り込みの場合３７℃で１５〜３０ 分間同一量のアポＢ−ＳＭＢＶと培養した。

次いで細胞をＰＢＳで洗浄し、ＰＢＳ中４％パラホルムアルデヒドにより室温で １５分間固定化した。残りの遊離のアルデヒド基を水素化ホウ素ナトリウムで還 元した。細胞を室温下にＰＢＳ中０．０５又は１％の濃度のトリトン×１００で 透過性にし、次いでＰＢＳで１回及びＰＢＳ＋１％ＢＳＡで２回洗浄した。次い でこれを山羊の抗アポＢポリクローナル抗体［イミュノ・フランス（Ｉｍｎ＋ｕ ｎｏ　Ｆｒａｎｃｅ）　］の溶液１５０１［ｓｉｃ］の存在下に３７℃で１時間 培養し、尾まで希釈し、そしてＰＢＳ＋１％ＢＳＡで洗浄して結合してない抗体 を除去した。このように調製したアポＢ−抗体複合体を、細胞を尾まで希釈した ２次抗体の溶液と一緒に３７℃で３０分間培養することにより、蛍光イソチオシ アネート（ＲＡＧ−ＦＩＴＣ，テブ）に結合した２次抗ヤギＩｇＧ抗体で可視化 した。

次いで細胞を蛍光顕微鏡［オルトルシス（Ｏｒｔｈｏｌｕｘ）−ＩＩ、ライフ（ Ｌｅｉｔｚ）　］で観察した。取り込まれたアポＢ−ＳＭＢＶを細胞内で観察さ れる蛍光の面積によって明らかにした。

−透過型電子顕微鏡による 細胞受容体への結合及びアポＢ−ＳＭＢＶの取り込みを、細胞の樹脂中への内包 により或いは糖の前述したシアリー法での可視化により、透過型電子顕微鏡を用 いて観察した。この技術は代謝の異なる段階、アポＢ−ＳＭＢＶの受容体への結 合、被覆したウェルの形成、アポＢ−ＳＭＢＶのエンドソームへのエンドサイト シス、及び細胞内におけるリソソームによる分解を可視化した（参照、図３）。

０．１ＭＰＢＳでの洗浄後、細胞を０．１Ｍナトリウム力コジレート（ｃａｃｏ ｄｙｌａｔｅ）緩衝液（ｐＨ７，２）中３％グルタルアルデヒド溶液で０〜４℃ 下に１時間固定した。次いで単一層をナトリウム力コジレート緩衝液でゆすぎ、 次いで１％四酸化オスミウムで０〜４℃下に１時間、後処理固定を行った。細胞 をナトリウムカコジレート［ｓｉｃ］緩衝液で再び洗浄し、次いで濃度５０．７ ０．１００％の連続エタノール浴で脱水した。７０％エタノール中を通過した時 、細胞を引っかきにより穏やかに皿から剥離し、次いで１２０００ｒｐｍで３分 間遠心分離後に回収した。最後の２つのエタノール浴を細胞ベレットに適用した 。次いでこれらの試料を純粋なエポン（Ｅｐｏｎ）−エタノール混合物中に含浸 させた。樹脂の重合は６０℃で７２時間行った。次いで超ミクロトームを用いて 、ガラスナイフにより超薄膜断片を準備した。

銅グリッド上に置いたこの断片を、飽和酢酸ウラニル溶液でコントラストをつけ （室温で２０分間）、そして乾燥雰囲気下に蒸留水で、次いでクエン酸鉛で洗浄 した。水で数回洗浄後、細胞を電子顕微鏡で観察した。

顕微鏡写真は、ＬＤＬと同一であるアポＢ−ＳＭＢＶの細胞代謝の異なる工程を 示した。

実施例２０ニドクツルビシンを負荷したアポＢ−ＳＭＢＶの特性実施例１２ｂ） に従って製造したドクソルビシンを負荷したＳＭＢＶを使用した。アポＢのグラ フト化は実施例５に記述した洗剤析法に従って行った。

一ゲル・パーミェーション アポＢ−ＳＭＢＶをセファローズ６カラムを用いるＦＰＬＣでのゲル・パーミェ ーションにより分析した。この時、アポＢに対して２８０ｎｍ及びドクソルビシ ンに対して４９６ｎｍでの分光法を用いることにより二重の検出を行った。得ら れたクロマトグラフィーでの挙動は、アポＢとドクソルビシンがＬＤＬ及びＳＭ ＢＶに対応して同一の画分中に一緒に流出し、従ってそれらがＳＭＢＶと結合し ていることを示した。

−フロー細胞蛍光光度計 リボ蛋白質を除去した培地での４８時間の培養後、正常な人間の線維芽細胞を、 遊離形の或いはカプセル化したＳ　Ｍ　Ｂ　Ｖ又はアポＢ−ＳＭＢＶ中のドクソ ルビシンと培養した。０〜２時間培養後、これを洗浄し、３７℃で１分間０．０ ５％トリプシンと接触させ、培養培地中へ再懸濁させ、そしてバラホルムアルデ ヒドで固定化した。得られた細胞懸濁液をフロー細胞蛍光光度計［ベクトンーデ イキンソン（Ｂｅｃｔｏｎ−Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）ファクースキャン（Ｆａｃ− ｓｃａｎ）　］で分析し、デクソルビシンの細胞取り込み量を放射蛍光強度で測 定した。線維芽細胞は、ドクソルビシンを含まないＳＭＢＶ及びアポＢ−ＳＭＢ Ｖとの対照物の場合には、蛍光を示さなかった。

得られた結果を下表に示す。

放射蛍光強度 培養時間　ドクソルビシン　ドクソルビシン　ドクソルビシン（分）　遊離　Ｓ ＭＢＶ　７ボＢ−ＳＭＢＶ上記表に示す結果は、培養時間と無関係に、アポＢ− ＳＭＢＶにカプセル化されたドクソルビシンの取り込みが遊離のドクソルビシン 及びＳＭＢＶ中にカプセル化されたドクソルビシンよりも著しく大きいことを示 す。この結果はＬＤＬ−受容体経路によるアポＢ−ＳＭＢＶの活性取り込みの観 点を支持する。

−ＭＴＴ細胞毒性試験 ドクソルビシンの、遊離形成いはＳＭＢＶ又はアポＢ−ＶＭＢＳ［ｓｉｃ］中の 形での細胞毒性を、細胞活性を測定する試験、即ちＭＴＴ試験で評価した。後者 は生活している代謝活性の細胞にだけ存在するミトコンドリアのデヒドロゲナー ゼによるテトラゾリウム誘導体ＭＴＴのホルマザンへの還元における細胞の生活 活性に基づくものである。ホルマザンはＤＭＳＯ中で希釈後に５７０ｎｍでの比 色によって分析した。

細胞毒性試験は、機能性ＬＤＬ受容体を有する肺腺ガン腫瘍系Ａ３４９に基づい て行った。

２μＭの濃度の場合、生活細胞のパーセントはアポＢ−ＳＭＢＶの形のデクソル ビシンに対して１３％及びＳＭＢＶの形のデクソルビシンに対して２０％である ということが観察された。ＬＤＬの過剰量（アポＢに関して、アポＢ−ＳＭＢＶ よりも７５倍多い）をドクソルビシンと同時に、ＳＭＢＶ又ハアポＢ−３ＭＢＶ 中細胞懸濁液＋：２μＭ　［ｓ　ｉ　ｃｌの濃度で添加した時、生活細胞のパー セントはアポＢ−３ＭＢＶ中ドクソルビシンに対して２８％であり、一方ＳＭＢ Ｖ中ドクソルビシンに対して変化のないことが観察された。

並行に対照実験も行ったが、これはドクソルビシンがアポＢの有無下に確かに安 定にＳＭＢＶ内へカプセル化されること及びそれが細胞培養に用いられる媒体で の培養後に遊離されないことを明らかにした。アポＢの有無下においてＳＭＢＶ 単独が細胞毒性のないことも更に証明できた。

これらの結果は、アポＢ−８ＭＢＶ中へ導入されたドクソルビシンは、問題の細 胞系統に対して細胞毒性であるという能力を保持していることを示す。そのリソ ソームへの通過後、ドクソルビシンがアポＢ−受容体経路によってベクター化さ れているならば、決った分子内浸透経路でもドクソルビシンはりソソーマル酵素 によって破壊されない。ＬＤＬとの競争的実験は、アポＢ−ＳＭＢ　［ｓ　ｉ　 ｃｌがアポＢ受容体に対する天然のりガントによって追い出されること、斯くし てアポＢ−ＳＭＢＶ中に導入されたドクソルビシンがＳＭＢＶの表面にグラフト されたアポＢｉこよって確かに標的の方向へ運搬されることを明らかにした。

国際調査報告 フロントページの続き （５１）　Ｉｎｔ、　Ｃ１，５識別記号　庁内整理番号Ａ６１Ｋ　４７／４８　 Ｚ　７４３３−４Ｃ（７２）発明者　ファブル、ジル フランス国３１０００ドウルーズ・リュラガヌ（７２）発明者　ゲニン、フレブ リク ツランス国１７６４０ボシュ１ルメール・シュマントショーシャン１２ （７２）発明者　ペイ口、マリアンヌ フランス国４６１４０ドウエル・セザツク（番地なし） （７２）発明者　メルシエ、フィリップフランス国３１０００ドウルーズ・アベ ニューレオン　ブラン４６ Ｉ （７２）発明者　スーレ、ナデイヌ フランス国３１１００ドウルーズ・リュジルービエール１８ （７２）発明者　デイルソン、ロゼリーヌフランス国３１４００ドウルーズ・リ ュサントーマス　ダカン７ （７２）発明者　カゼ、シルビー フランス国３１１３０バルマ・リュルネアベルサン３３・レジダンスルゲドノン セス （７２）発明者　ド・ミゲル、イグナシオフランス国３１４００ドウルーズ・リ ュアンリドサユク２８ （７２）発明者　メニアリ、ジャオウアドフランス国３１４００ドウルーズ・シ ュマンドラサラド　ボンザン１３４

Claims (16)

【特許請求の範囲】
1. １．ある細胞種に対して選択的トロピズムを有し且つ−非液体の親水性コア、 −共有結合によりコアに結合した脂質性の第１層又は殻、−疎水性相互作用によ り第１層に結合したリン脂質の第２層又は外側ラメラ、 −リン脂質の層上にグラフトされたアポリポ蛋白質Ｂの分子、又は、細胞ＬＤＬ 受容体を特異的に認識できる蛋白もしくはペプチドリガンドの分子、 を含む合成粒状物ベクター。
2. ２．腫瘍細胞に対して選択的トロピズムを有する請求の範囲１の粒状物ベクター 。
3. ３．アポリポ蛋白質Ｂの分子が改変されている請求の範囲１の粒状物ベクター。
4. ４．大食細胞に対して選択的なトロピズムを有する請求の範囲３の粒状物ベクタ ー。
5. ５．親水性コアが架橋した多糖類からなる請求の範囲１〜４の１つの粒状物ベク ター。
6. ６．多糖類がデキストラン、殿粉及びセルロース並びにこれらの混合物を含んで なる群から選択される請求の範囲１〜５の１つの粒状物ベクター。
7. ７．脂質性の第１層が架橋した多糖類コアの周囲における脂肪酸の立体選択的ア シル化によつて束縛されている請求の範囲１〜６の１つの粒状物ベクター。
8. ８．親水性コアが更に活性原体を含有する請求の範囲１〜７の１つの粒状物ベク ター。
9. ９．活性原体が抗ガン剤、抗ガン剤に対する耐性を逆転させる薬剤、免疫調節剤 、オリゴヌクレオチド、アンチセンス（ａｎｔｉｓｅｎｃｅ）メッセンジヤーＲ ＮＡ、肝臓保護薬剤、ＨＭＧＣｏＡリダクターゼ禁止剤及び細胞調節ペプチドを 含んでなる群から選択される請求の範囲８の粒状物ベクター。
10. １０．活性原体が次の分子：アクラルビシン、エピルビシン、ダウノルビシン、 ドクソルビシン、ゾルビシンから選択される抗ガン剤である請求の範囲８の粒状 物ベクター。
11. １１．活性原体が抗ウイルス、抗バクテリヤ、抗菌、抗寄生虫、及び抗エイズ薬 剤を含んでなる群から選択される請求の範囲８の粒状物ベクター。
12. １２．大きさが凡そ２０ｎｍである請求の範囲１〜１１の１つの粒状物ベクター 。
13. １３．ａ）親水性コア、脂質の第１層及びリン脂質の第２層を含むベクターを製 造し、 ｂ）活性原体を親水性コア内にカプセル化し、ｃ）ＬＤＬから精製したアポリポ 蛋白質Ｂの或いは細胞ＬＤＬ受容体を特異的に認識しうる蛋白質又はペプチドリ ガンドの分子をリン脂質層にグラフトする、 請求の範囲１〜１２の１つの粒状物ベクターの製造法。
14. １４．工程ｃ）でのグラフト反応を、ミセルの形で溶解しているアポリポ蛋白質 Ｂを出発物質として、洗剤透析法で行う請求の範囲１３の方法。
15. １５．用いる洗剤が透析しうる洗剤から選択される請求の範囲１３及び１４の１ つの方法。
16. １６．請求の範囲１〜１２の１つの粒状物ベクター及び投与の許容しうる賦形剤 を含有する製薬学的組成物。