JPH06501009A - ナチュラルキラー刺激因子 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 １４　＠乳類または細菌細胞を含む請求項１３記載の細胞。

１５、ガンマインターフェロン誘導分析において蛋白１ｍｇ当たりｌＸｌ０’希 釈単位より大な特異的活性を持つ均質ＮＫＳＦ０１６　薬理学的に有効な溶媒中 にＮＫＳＦまたはそのユニットを治療上有効な量で含む医薬組成物。

１７、さらに治療的に有効な量の付加的サイトカイン、ヘマトポエチン、または 成長因子を含む請求項１６記載の組成物。

１８、上記サイトカインがＩＬ−１、ＩＬ−２、およびＩＬ−６からなる群から 選択される請求項１６記載の組成物。

１９、請求項１２記載のＤＮＡ配列を含むプラスミド。

２０　ベクターがｐＮＫ４０−４である、請求項１９記載のベクター。

２１　ベクターがｐ３５ｎｋｓｆ１４−１−１である、請求項１９記載のベクタ ー。

２２　患者に有効量のＮＫＳＤまたはそのサブユニー／ｈを投与することからな る癌の処置法。

２３６更に同時にまたは連続して上記ＮＫＳＦに加えて、ヘマトボエチン、サイ トカイン、成長因子またはＮＫ細胞のＦｃ領域に結合できる抗体の少なくとも１ 種を有効量投与することを含む、請求項２２記載の方法。

２４、上記へマトポエチンがＩＬ−１、ＩＬ−２またはＩＬ−６である、請求項 ２３記載の方法。

２５　轡１者に有効量のＮＫＳＤまたはそのサブユニットを投与することからな る感染処置法。

２６　上記感染がウィルスまたは細菌感染である、請求項２５記載の方法。

２７　上記感染が無応答ウィルス感染である、請求項２６記載の方法。

２８、上記感染がＡＩＤＳである、請求項２６記載の方法。

２９、見かけの分子量が約４０ｋＤであり表１記載のアミノ酸配列と同じまたは 実質的に同じ配列をもつ篤１のサブユニットを、見かけの分子量が約３０ｋＤで あり表２記載のアミノ酸配列と同じまたは実質的に同じ配列をもつ篤２のサブユ ニットと一緒に含む、実質的に他の蛋白性物質を随伴しないナチュラルキラー細 胞刺激因子蛋白。

３０、患者に有効量のＮＫＳＦまたはそのサブユニットとＩＬ−２を投与するこ とを含み、ＮＫＳＦとＩＬ−２の間の相乗作用が見られる、感染処置法。

明細書 ナチュラルキラー刺激因子 これは１９８８年１１月１０日出願の米国特許出願番号第０７／２６９９４５号 の一部継続出願である、１９８９年２月７日出願の係属中の米国特許出願番号第 ０７／３０７８１７号の一部継続出願である。

本発明はナチュラルキラー細胞および免疫系のその他の細胞の機能を刺激する新 規なサイトカイン、並びに均質な形態での因子の獲得、および組み換え遺伝子工 学の技法によるそれの産生に関する。

本発明の背景 ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞は免疫系において活性なリンパ球のサブセットで あり、ヒト末梢血では単核細胞の平均１５％になる［Ｇ、トリンチェリおよびＢ 、ベルシア、ラボラトリ−・インベスティゲーンヨン５０巻４８９頁（１９８４ 年）］。表面マーカーの中でヒ）ＮＫ細胞の同定に用いられるものの中には、低 い親和性でＩｇＧ抗体のＦｃ断片に結合する受容体、例えばＦｃ−ガンマ−受容 体■またはＣＤ１６抗原がある［Ｂ、ペルンアら、ジャーナル・オン・イムノロ ジ−１３３巻１８０頁（１９８４年）］。ＮＫ細胞は、腫瘍防御、腫瘍転移、ウ ィルス感染に対するにおいてイン・ビトロで重要な役割を果たし、正常および悪 性の造血を制御することが示されている。

免疫系の細胞間で信号を送る制御タンパクの増大しつつある群が同定されている 。これらの制御分子はサイトカインとして知られている。多くのサイトカインは 、造血および免疫系の細胞の成長、発展および生物学的活性を調節することが見 出されている。これらの制御分子には、全てのコロニー刺激因子（ＧＭ−Ｃ５Ｆ 、Ｇ−Ｃ３ＦＳＭ−Ｃ５ＦおよびマルチＣ８Ｆまたはインターロイキン−３）、 インターロイキン（ＩＬ−１〜ＩＬ−１１）、インターフェロン（アルファ、ベ ータおよびガンマ−）、腫瘍壊死因子（アルファおよびベータ）および白血病阻 止因子（Ｌ　Ｉ　Ｆ）がある。

これらのサイトカインは、骨髄、末梢血、飴児肝臓、およびその他のリンパ様ま たは造血器官の標的細胞と、広範な生物学的活性を呈する。Ｇ、ウォングおよび Ｓ、クラーク、イムノロジー・トウディ９巻５号１３７頁（１９８８年）を参照 されたい。

特定のサイトカインの生化学的および生物学的同定および特性化は、天然の供給 源、例えば血液および尿から入り得る少量の天然発生の因子により妨害された。

多くのサイトカインは最近、分子的にクローン化され、異種発現され、均質にな るまで精製されている。［Ｄ、メットカルフ、「ザ・モレキュラー・バイオロジ ー・アンド・ファンクションズ・オン・ザ・グラニュロサイトーマクロファージ ・コロニー・スティミュレーティング・ファクターズ」ブラッド６７巻２号２５ ７−２６７頁（１９８６年）。］これらのササイトカイにはガンマ−・インター フェロン、ヒトおよびネズミＧＭ−Ｃ５Ｆ、ヒトＧ−Ｃ５Ｆ、ヒトＣ３Ｆ−１並 びにヒトおよびネズミＩＬ−３がある。これらの精製因子のなかには造血および 免疫系にイン・ビボで制御効果を示すことが見出されているものもあり、これら にはＧＭ−Ｃ３ＦＳＧ−Ｃ５Ｆ、ＩＬ−３およびＩＬ−２がある。

当業界では、免疫応答を刺激または増強でき、医薬的用途に適した、天然の供給 源から精製するか、そうでなければ均質な形態で産生じたさらなるタンパクの必 要性が残っている。

本発明の簡単な要約 本発明は１つの様相において、実質的にその他の哺乳動物タンパクを含まない、 ＮＫＳＦと称する新規なヒトナチュラルキラー刺激因子を提供する。活性なＮＫ ＳＦの見かけの分子量は約７０〜８０キロダルトンである。

ＮＫＳＦの純粋な調製物は約４０キロダルトンおよび３０キロダルトンのサブユ ニットである２つのポリペプチドが存在することを示し、これらが会合した場合 に活性ＮＫＳＦを生じる。現在では、ＮＫＳＦは大きいサブユニットと小さいサ ブユニットの両方が１個またはそれ以上のジスルフィド結合を介して会合するこ とにより形成されるヘテロダイマーであると推測される。この見かけのへテロダ イマー構造は、２個の別個のサブユニットの会合により生じることができる。

活性で約７０〜８０キロダルトンのＮＫＳＦは、さらに、以下の表１および／ま たは２のアミノ酸配列の全部または一部を含有するという特徴がある。さらに、 ９配列のアミノ酸の１個またはそれ以上が、大きいまたは小さいＮＫＳＦのサブ ユニットの一次配列に存在する。これらの９個のアミノ酸断片は以下に一覧表に して詳細に論じる。

ＮＫＳＦの大きいサブユニットポリペプチドは、見かけの分子量が４０キロダル トンであるという特徴がある。このサブユニットはさらに、表１に記載したアミ ノ酸配列と同じかまたは実質的に同じであるという特徴があり、Ｎ−末端配列： 工１ａ−Ｔｒｐ−Ｇｌｕ−Ｌａｕ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ａｓｐ−Ｖａ　１−Ｔｙｒ −Ｖａ　１−Ｖａ　ｌ−Ｇ　１ｕ−Ｌｅｕ−Ａｓｐ−Ｔｒｐ−Ｔｙｒ−Ｐｒｏ− Ａｓｐ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｇ　ｌｙ＜ｌｕ−Ｍｅｔ。

を有する。このＮ末端アミノ酸配列は、表１のアミノ酸＃２３〜４５に相当する 。このポリペプチドはさらに９個のアミノ酸の断片を６個含有するという特徴が ある。

ＮＫＳＦの小さいポリペプチドサブユニットの見かけの分子量は約３０〜３５キ ロダルトンであるという特徴がある。２つのｃＤＮＡ配列が小さい方のサブユニ ットについて同定されていた。２つの配列の短い方は、表２に示すプラスミドｐ ３５ｎｋｓｆ１４−１−１の長い配列内薯こ実賀的番二含まれる。小さいサブユ ニットはさらに表２に記載するのと同じかまたは実質的に同じアミノ酸配列を有 するという特徴があり、以下のＮ−末端配列を含有する： Ａｒｑ−人５ｎ−Ｌｅｕ−Ｐｒｏ−Ｖａｌ−Ａｌａ−Ｔｈｒ−Ｐｒｏ−Ａｓｐ− Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−この断片はｐ３５ｎｋｓｆ１４−１−１クローンの下線を付し たアミノ酸＃５７〜７０に相当する。

この小さいポリペプチドはさらに表２の下線を付して区別した９個のアミノ酸断 片を３個含有するという特徴がある。

ＮＫＳＦはイン・ビトロでヒト末梢血リンパ球（ＰＢＬｓ）のガンマ−インター フェロンの産生を誘起する生物学的活性を示す。ＮＫＳＦは、等質な形態では、 ガンマ−インターフェロン誘導検定において、特異活性がミリグラムあたり１× １０７希釈単位以上であるという特徴があるが、詳細は以下に記載する。

ＰＢＬｓにおけるガンマ−インターフェロンの誘導に加えて、ＮＫＳＦは以下の 生物学的活性を示す： （１）顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−Ｃ３Ｆ）誘導検定におけ るＰＢＬｓとの生物学的活性；（２）白血病および腫瘍由来の細胞を殺すナチュ ラルキラー（ＮＫ）細胞の活性化における生物学的活性： （３）腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）誘起検定におけるフィトヘマグルチニン（ＰＨＡ ）−活性化Ｔリンパ球との生物学的活性；（４）末梢血Ｔリンパ球との共ミトゲ ン活性：および（５）ＰＢＬｓでのγＴＦＮ誘導およびＰＢＬ増殖の維持におけ るＩＬ−２との相乗作用。

本発明の別の様相には、ヒトＮＫＳＦポリペプチド、ヒトＮＫＳＦの大きいサブ ユニットポリペプチド、およびヒトＮＫＳＦの小さいサブユニットポリペプチド の発現をコードするｃＤＮＡ配列を含むＤＮＡ配列がある。

このような配列は上記のサブユニットおよびペプチド配列を１個またはそれ以上 をコードするヌクレオチド配列を含む。

本発明はまた発現調節配列と機能可能に結合したＮＫＳＦまたはＮＫＳＦサブユ ニットをコードするＤＮＡ配列を含有するベクターをも提供する。

本発明はまた組み換えＮＫＳＦまたはそれの組み換えサブユニットの産生に使用 されるこのようなベクターで形質転換した宿生細胞をも提供する。

本発明のさらなる様相として、組み換えＮＫＳＦタンパクを提供する。

このタンパクはその他の哺乳動物のタンパク質性物質を含まず、上記物理学的、 生化学的または生物学的活性または特性を１つまたはそれ以上含む上記サブユニ ットまたはペプチド断片を１個またはそれ以上をコードするＤＮＡ配列が存在す るという特徴がある。

本発明の別の様相では、均質なもしくは組み換えＮＫＳＦを治療的に有効量、ま たはＮＫＳＦのサブユニットを１つまたは両方またはそれのペプチド断片を１つ またはそれ以上を有効量含有する医薬組成物を提供する。

これらの医薬組成物は癌、ウィルス感染、例えばエイズ、細菌感染、およびガン マ−インターフェロンの増加またはＧＭ−Ｃ５Ｆ産生に反応するその他の疾病状 態の処置方法において用いることができる。従って、一般的にこの因子は免疫機 能を刺激するのが有益であろうと考えられる疾病の処置に用いることができる。

従って、本発明のさらなる様相は、患者にＮＫＳＦまたはそれのサブユニットを １つもしくは両方、またはそれのペプチド断片を治療的に有効量、適切な医薬用 担体中で投与することにより、ナチュラルキラー細胞機能を増強すると有効であ る癌および／またはその他の病理学的状態を処置する方法である。これらの治療 法にはＮＫＳＦまたはそれのサブユニットもしくはペプチド断片を１つもしくは それ以上と共に、少なくとも１つのその他のサイトカイン、造血素、インターロ イキン、成長因子または抗体の有効量を同時にまたは逐次的に投与することが含 まれる。具体的には、ＮＫＳＦまたはそれのサブユニットの１つまたはそれ以上 をＩＬ−２と共に投与すると相乗効果があることが示されている。イン・ビトロ でＩＬ−２と相乗効果があるために、このインターロイキンはとりわけＮＫＳＦ と組み合わせると効果的であると考えられる。

本発明のさらなる様相は、ＮＫＳＦまたはそのサブユニットをその他のタンパク およびポリペプチドと混合して産生ずるヒトセルラインから、等質なＮＫＳＦま たはそれのサブユニットを産生ずる方法である。本発明が提供するこの産生方法 には、ＮＫＳＦｌそのサブユニットまたはそれのペプチド断片の産生能力のある 選別した細胞を培養してならし培地を得、５段階の１次精製段階を通してならし 培地を精製することが含まれる。

本発明のベクターおよび形質転換細胞は、本発明の別の様相、すなわち、組み換 えヒトＮＫＳＦタンパク、それのサブユニットまたはそれのペプチド断片を産生 ずるための新規な方法に用いられる。この方法では、発現調節配列と機能可能に 結合した、ＮＫＳＦタンパク、それのサブユニットまたはそれのペプチド断片の 発現をコードするＤＮＡ配列で形質転換したセルラインを培養する。この特許請 求した方法ではポリペプチドを発現させるための宿主細胞として多（の既知の細 胞を用いることができる。現在のところ好ましいセルライは哺乳動物セルライン および細菌細胞である。

本発明のその他の様相および優越性は、それの好ましい態様に関する以下の詳細 な説明を考慮すると明白になろう。

発明の詳細な説明 本発明が提供する新規なヒトナチュラルキラー細胞刺激因子、ＮＫＳＦは、実質 的にその他の哺乳動物のタンパク質性物質が関与しない等質なタンパクまたはタ ンパク質性組成物である。

ナチュラルキラー刺激因子は、非還元条件下、ドデシル硫酸ナトリウムポリアク リルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）により決定すると、見かけの分子 量が約７０〜８０キロダルトンである。この７０〜８０キロダルトンのペプチド はガンマ−インターフェロン誘導検定において活性である。

５ＤＳ−ＰＡＧＥでは、７０〜８０キロダルトンのバンドが、還元条件下見かけ の分子量約４０キロダルトン（大きい方のサブユニット）および約３０〜３５キ ロダルトン（小さい方のサブユニット）の２つの小さなサブユニットを生じる。

両方のサブユニットは別個に、同一のガンマ−インターフェロン誘導検定におい て生物学的活性が、元来の７０〜８０キロダルトンの種と比較すると実質的に喪 失されている。上記で同定されたアミン末端配列はＮＫＳＦへテロダイマーのサ ブユニットであると考えられている４０キロダルトンの還元種および３０〜３５ キロダルトンの還元種から元来決定された。現在ＮＫＳＦは大きいおよび小さい サブユニットのジスルフィド−結合ヘテロダイマーであると考えられている。し かしながら、これらのサブユニットの１つまたは両方は、単独で存在する場合、 生物学的活性を有することも可能である。

ＮＫＳＦは、少なくとも部分的に陰イオン糖タンパクである。等電点電気泳動で は、ＮＫＳＦの２種は等電点が４．３および４．８であることが観察される。現 在では、２種はグリコジル化パターンで異なることが推測されている。

ＮＫＳＦは、以下の実施例８で詳細に記載するガンマ−インターフェロン誘導検 定における生物学的活性により王に特性化される。ＮＫＳＦのその他の生物学的 活性には、ヒト末梢血リンパ球によるＧＭ−Ｃ３Ｆ産生を誘起する能力もある。

［例えば、ＧＭ−Ｃ３Ｆのさらなる情報に関する発行ＰＣＴ出願ＷＯ３６１００ ６３９を参照されたい。１ＮＫＳＦはまた、末梢血Ｔリンパ球における種々ミト ゲン、例えばレクチンおよびフォルボールジエステルのミトゲン活性に及ぼす増 強効果をも有し、活性化ヒト扁桃腺Ｂセルに及ぼす成長促進効果をも有する。Ｎ ＫＳＦはまたイン・ビトロで自然性細胞毒性検定および抗体依存性細胞毒性（Ａ ＤＣＣ）検定を用いると、白血病および腫瘍由来細胞を殺すＮＫ細胞機能を増強 することも観察されている。

自発性細胞毒性検定では、ヒト末梢血リンパ球または精製ＮＫ細胞をＮＫＳＦの 存在下、８〜１８時間恒温培養する。次いで標準５１（ｒ放出検定でリンパ球お よびＮＫ細胞の、標的細胞、例えば白血病セルライン、腫瘍由来のセルラインま たはウィルス感染した線維芽細胞を融解する能力を検定する。ＮＫＳＦは、ＮＫ ｍ胞の、このような標的細胞を融解する能力をインターフェロンアルファおよび ＩＬ−２といった周知のＮＫ細胞細胞毒性活性の活性化剤に匹敵する水準で、劇 的に高める［例えばＧ、）リンチェりら、ジャーナル・オン・エクスベリメンタ ル・タデ４３２１４フ巻１３１４頁（１９７８年）およびＧ、）リンチェリら、 ジャーナル・オン・エクスペリメンタル・メチイス２１６０巻１１４６頁（１９ ８４年）を参照されたい］。

ＡＤＣＣ検定では、標的癌細胞はＮＫ細胞のＦＣ受容体に結合能力のある抗体例 えばＩｇＧ、、、ＩｇＧ、等で被覆する。予備検定では、ＮＫＳＦの存在が、Ａ ＤＣＣにおける被覆腫瘍細胞に対するＮＫ細胞の殺活性を増強するようである。

［例えばり、　Ｍ、ワイナーら、キャンサー・リサーチ４８巻２５６８〜２５７ ３頁（１９８８年）、Ｐ、ハーセイら、キャンサー・リサーチ４６巻６０８３〜 ６０９０頁（１９８８年）：およびＣ，Ｊ、ノ１ンシクら、プロシーディング・ オン・ナショナル・アカデミ−・オン・サイエンス・オン・ジ・ユナイテッド・ ステーツ・オン・アメリカ８３巻７８９３〜７８９７頁（１９８６年）のＡＤＣ Ｃに関するさらなる情報を参照されたい、］ ビーズに結合したヤギ抗ヒトＩｇＭ抗体（アンチ−μ）で刺激した正常ヒトＢセ ルを用いるＢセル成長因子検定でのＮＫＳＦの予備分析により、ＮＫＳＦがＢセ ル成長因子活性によっても特性化できるとことが示される。

この検定ではＢセル表面上の１ｇＭイムノグロブリンに抗する抗体がＢセルを活 性化し、Ｂセル成長因子に反応するようにさせる。［Ｃ−ＴＫ、　ツエンダら、 ジャーナル・オン・イムノロジ−１４０巻２３０５−２３１１頁（１９８８年） を参照されたい］。このような抗体は市販で入手できる。

ＮＫＳＦは元来、リンフ才力インの混合物を産生ずる市販で入手可能なセルライ ン［ユニバージティー・オン・ペンシルバニア・セル・センター］であるヒトセ ルライン、ＲＰＭＩ８８６６のならし培地で検出された。この因子はその他のエ プスタイン・バール・ウィルス形質転換リンフオブラストイドセルラインにより 、またはその他のヒトセルラインからも産生できる。ＲＰＭＩ８８６６セルライ ンは自発的に因子を産生ずるが、産生レベルはセルラインをフォルボールエステ ル類、例えばフォルボール・ジブチレートで処理することにより増強できる。血 清を除去した細胞は、４８時間でも依然、ＮＫＳＦをその他のリンフ才力インと 共に産生ずる。ＲＰＭ１８８６６または別のＮＫＳＦの供給源の細胞の培養方法 （実施例１参照）は、当業者には周知である。

天然にＮＫＳＦを産生ずる細胞からＮＫＳＦを得る場合に用いる精製技術では以 下の段階を用いる。これらの段階には、イオン交換カラム例えばＱＡＥゼータ予 備カートリッジ［ＬＫＢファルマンア］を通す精製、があり、これはＮＫＳＦタ ンパクが陰イオン性であることを示している。２番めの精製段階はレンチル・レ クチン・カラムであり、これはＮＫＳＦが少なくとも部分的に糖タンパクである ことを示している。レンチル・レクチン・カラムからの溶出液はヒドロキシルア バタイト力ラムを通してさらに精製し、続いてヘパリンセファロースカラムおよ び高速タンパク液体クロマトグラフィー（ＦＰＬＣ）モノーＱカラムを通して精 製する。ＲＰＭＩ８８６６からのＮＫＳＦは、後者の３ｍのカラムの各々で単一 のピークとして溶出された。残存する約３７キロダルトンのタンパク夾雑物を、 ゲル濾過クロマトグラフィー単独で、または逆相ＨＰＬＣおよびゲル濾過クロマ トグラフィーで除去する。結果的に得られた精製した等質ＮＫＳＦは実施例８の ガンマ−インターフェロン誘導検定で生物学的活性を検定し、ミリグラムあたり Ｉ　Ｘ　１０’希釈単位以上の特異活性が示された。

従って、均質なＮＫＳＦは上記の精製法に適用して得ることができ、このことは 実施例２でＲＰＭＩ８８６６またはその他のヒトＮＫＳＦ供給源のならし培地に 関して詳細に記載する。

ＮＫＳＦ、そのサブユニットの１つもしくは両方、またはそれのペプチド断片も または組み換え技術により、例えば適当な条件下、それを発現させることができ る制御調節配列を有効に関与させた、大きいおよび／または小さいサブユニット をコードするＤＮＡ配列で形質転換した宿主細胞を培養することにより産生でき る。

クローン化ＮＫＳＦおよびそのサブユニットのＤＮＡ配列は、等質なポリペプチ ドをトリプシン消化させることにより本来単離された。例えば、本来ＮＫＳＦに 見出される９個のトリプン処理断片は以下のように同定断片３：　工１ａ−Ｔｒ ｐ−Ｇｌｕ−Ｌａｕ−Ｌｙｓ断片８：　Ｔｈｒ−Ｐｈａ−Ｌａｕ−Ａｒｇ断片９ ：　Ａｓｐ−工１ｅ−工１ａ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ａｓｐ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｌｙ ｓ。

断片４．５および６は小さい方、すなわち３０キロダルトンのサブユニット内に 位置することが確認されている。これらの配列は表２に説明するｐ３５ｎｋｓｆ １４−１−１クローンの下線を付したアミノ酸＃１７９−ｉ８４．２４６−２５ ２および８１−８６の各々ｌこ相当する。断片１−３および７−９は、大きい方 の４０キロダルトンのＮＫＳＦサブユニット内に位置することが確認されている 。断片１（アミノ酸＃７５−７９）：断片２（アミノ酸３２１９−２２４）；断 片３（アミノ酸＃２３−２７）：断片７（アミノ酸３３０３−３０８）；断片８ （アミノ酸＃１２７−１３０）；および断片９（アミノ酸＃２３１−２３９）に 相当するアミノ酸配列は、表１で下線を付しである。さらに、ＮＫＳＦの大きい および小さいサブユニットのアミノ末端配列は以下の実施例５に記載するように 同定し、各々表１（＃２３−４５）および表２　（＃５７−７０）で下線を付し である。

オリゴヌクレオチドプローブは、ＮＫＳＦのこれらのトリプシン消化産生物のア ミノ酸配列をコードする全ての可能な配列を予想するための遺伝子コードを用い て合成した。同一の方法を行って、上記で同定されたＮＫＳＦの２つのサブユニ ットのアミノ末端配列からプローブを構築することができる。ＮＫＳＦサブユニ ット遺伝子はこれらのプローブを用いて同定でき、ヒトゲノムライブラリーをふ るい分けできる。また別に、ＲＰ　Ｍ　１８８６６または別のＮＫＳＦの細胞供 給源からのｍＲＮＡを用いてＮＫＳＦの大きいおよび小さいサブユニットのポリ ペプチドをコードするｃＤＮＡを同定するプローブでふるい分けできるｃＤＮＡ ライブラリを作ることができる。一度ｃＤＮＡを同定すると、これらを発現ベク ターに導入し、ＮＫＳＦ、またはそれのサブユニットの１つもしくは両方の発現 系を作った。

このように組み換え技術を用いることにより、ＮＫＳＦの大きいおよび小さいサ ブユニットのポリペプチドをコードするＤＮＡ配列を得たが、これはトリプシン 処理断片または上記で同定されたアミノ末端配列をコードするＤＮＡ配列を含有 する。

ｐＮＫ４０−４と称する１つのＮＫＳＦクローンは以下の表１に示すＤＮＡおよ びアミノ酸配列を有し、大きいＮＫＳＦサブユニットの全てまたは一部をコード する・ 表１ ｐＮＫ４０−４ ｃＤＮＡヌクレオチドおよびアミノ酸配列、４０キロダルトンのＮＫＳＦのサブ ユニットＣＴＣＴＡＣＡＡＡＡ　ＡＡＡＡＴＩＴＡＡＡ　ＡＴＴＡＧＣＣＡＧＧ 　ＣＧＴＧＧＴＧＧＣＴ　１７７９ＣＡＴＧＣＴＴＧＴＧ　ＧＴＣＣＣＡＧＣＴ Ｇ　？ＴＣＡＧＧＡＧＧＡ　ＴＧＡＧＧＣＡＧＧＡ　１８４９ＡＡ講ＪＪすし〜 （入Ａ　ＡＡＡＡＡＡＣＴＣＴ　ＡＧＡ　２３６２プラスミドｐＮＫ４０−４の このクローン化配列はアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション、１２３ ０１バークローン・ドライブ、ロックビル、メリーランドに１９９０年７月３１ 日に受け入れ番号４０８５４で寄託した。おおよそヌクレオチド＃８８８までを 含有する配列を通ってＮ末端非コード化部域を含有する、この大きい断片の先の 部分的クローンをｐＮＫ−６と称し、１９８９年２月３日にＡＴＣＣＮｏ、４０ ５４苧、でＡＴＣＣに寄託した。大きいサブユニットの別の部分的クローンであ るｐＮＫを含有する。このクローンはりェネティックス・インスティテユート有 限会社の研究室で保存されている。

ＮＫＳＦの小さい（３０〜３５キロダルトン）サブユニットの配列をコードする ２個の別個のｃＤＮＡクローンを同定した。長いクローン（ｐ３５ｎｋｓｆ　１ ４−１−１と称する）を表２に示す。短いクロ’／　（ｐ３５ｎｋｓｆ９−１− １と称する）は表２および寄託配列のヌクレオチド＃１３３（＊で示す）で始ま り、ヌクレオチド８１３３５　（＊で示す）で終わる。これらの２つのヌクレオ チドの間では、小さいクローンは、３°非コ一ド化部域での５ヌクレオチドの変 化以外は表２の配列と同一である。従ってこの短いクローンは表２のＭｅｔ　（ アミノ酸＃３５）で始まるコード化配列を有する。ｐ３５ｎｋｓｆ１４−１−１ の５゛末端における付加的な配列は、ｐ３５ｎｋｓｆ９−１−１での有効な開始 コドンのフレーム内開始コドン（ＡＴＧ）３４残基５′をコードする。

□ これらのクローンの両方は、精製ＮＫＳＦのトリプシン消化で同定されたペプチ ド配列の全ておよび精製３０キロダルトンサブユニツトのアミノ末端配列をコー ドするが、これらは４０キロダルトンのサブユニットタンパクでは見出されなか った。これらの配列は表２で下線を付している。クローンは翻訳が表２のＭｅｔ ＃１またはＭｅｔ＃３５で開始されるかどうかに依って、ＮＫＳＦの３０〜３５ キロダルトンのサブユニットの２つの可能な翻訳物をコードする配列を含有する 。

しかしながら、ＮＫＳＦの３０〜３５キロダルトンのタンパクサブユニットはＡ ｌａ（アミノ酸＃５６）に続く開裂により生じると考えられるので、両方の配列 は同じ成熟タンパクを産生するはずである。ｐ３５ｎｋｓｆ１４−１　１の配列 は、１９９０年９月１１日に受け入れ番号４０８８６でＡＴＣＣに寄託した。

表２ ＧＴＣＣＴＧＣＣＧＣＧＣＣＴＣＧＧＧＡＣＡＡＴＴＡＴＡＡＡＡ　１００獣→ ｌノ　−ｒノ〜１ゝ」肌ｔソノより　−ｒｌＬぬ番Ｊ斧−−ｒＩＬエクリ、肚ｔ 〜−〇　テヒ一ド化配列を含有する。成熟タンパク（両方のｃＤＮＡによりコー ドされる）のＭｅｔ（アミノ酸＃３５）からＮ末端までの配列は、信号ペプチド に似た配列をコードし、サブユニットの適切な折りたたみおよび／または分泌を 指示できる。従って、長い３０〜３５キロダルトンのサブユニットの配列が、短 いものよりも効果的にＣｏｓ細胞により発現および分泌されることが可能である 。これはまた異なって折りたたまれ、それによりＮＫＳＦの活性が４０キロダル トンのサブユニットの存在とは独立して付与される。

表２は寄託クローンのポリリンカー配列、並びにこのサブユニットの大きいおよ び小さい翻訳物の最初と最後のヌクレオチドの配置を示す。また発現した小さい サブユニットの配列および下線を付したトリプシン処理断片の配列を得るための ５”ＰｓｔＩ部位をも示す。

ペプチド配列および上記の大きいおよび小さいサブユニットをコードするＤＮＡ 配列のアレル化したものおよびそれのアナログまたは誘導体もまた本発明に含従 って、本発明はまたその他の霊長類タンパクをコードするＤＮＡ配列を随伴せず 、それの大きいおよび小さいサブユニットを含むＮＫＳＦポリペプチドの発現を コードするこれらの新規ＤＮＡ配列を包含する。これらのＤＮＡ配列には上記で 同定したＤＮＡおよびペプチド配列、並びにストリンジエントハイプリダイゼー ンヨン条件下〔Ｔ　マニアナイスら、モレキュラー・クローニング（アラポラト リー・マニュアル）、コールド・スプリング・ハーバ−・ラボラトリ−（１９８ ２年）３８７〜３８９頁を参照されたい〕でＤＮＡ配列にハイブリダイズするこ れらの配列の１つまたはそれ以上を含有するものを含む。このようなストリンジ ェント・ハイブリダイゼーション条件の例としては、６５℃で４ＸＳＳＣでハイ ブリダイゼーションし、続いて６５℃で０．ｌＸ５ＳＣで１時間洗浄する。

また別に、典型的なストリンジェント・ハイブリダイゼーション条件は５０％ホ ルムアミド中４２℃で４ｘＳＳＣである。

緩和なハイブリダイゼーション条件下、ＮＫＳＦまたはそのサブユニットの配列 にハイブリダイズし、ＮＫＳＦ生物学的特性を有するＮＫＳＦペプチドの発現を コードするＤＮＡ配列もまた新規なＮＫＳＦポリペプチドをコードする。このよ うな非ストリンジェント・ハイブリダイゼーション条件の例としては、５０℃で ４ｘＳＳＣかまたは、４２℃で３０〜４０％ホルムアミドでのハイブリダイズが ある。例えば、グリコジル化またはジスルフィド架橋といった重要な等質性の部 域をＮＫＳＦ配列と共有し、ＮＫＳＦの生物学的特性を１つまたはそれ以上有す るタンパクをコードするＤＮＡ配列は、このようなりＮＡ配列がたとえストリン ジェント的にＮＫＳＦ配列にハイブリダイズしなくても、明らかにＮＫＳＦポリ ペプチドをコードする。

同様に、ＮＫＳＦの配列によりコードされるＮＫＳＦポリペプチドをコードする が、遺伝子コードが縮重またはアレル変化する（種の集合体において天然に発生 する塩基の変化で、結果的にアミノ酸変化をもたらす場合ももたらさない場合も ある）ためにコドン配列が異なるＤＮＡ配列もまた、本発明に包含する。点突然 変異により、または活性、半減期またはそれによりコードされるポリペプチドの 産生を増強するように改変させることにより引き起こされるＮＫＳＦのＤＮＡ配 列の変化もまた本発明に包含される。

ＮＫＳＦポリペプチドはまた、既知の通常の化学合成によっても産生できる。

本発明のポリペプチドを合成手段により構築する方法は当業者に周知である。１ 次、２次または３次構造および配置特性をＮＫＳＦポリペプチドと共有すること により、合成的に構築したＮＫＳＦポリペプチド配列は、それと共通したＮＫＳ Ｆ生物学的特性を有することができる。従って、これらは治療的および免疫学的 方法において天然精製ＮＫＳＦポリペプチドの、生物学的活性また免疫学的代替 物として用いることができる。

本明細書で提供するＮＫＳＦポリペプチドはまた、精製した等質な組み換えＮＫ ＳＦタンパクまたはサブユニットポリペプチドであるが、改変が自然に行われる か、故意に操作されたものの配列に類似した配列でコードされる因子をも含むペ プチドまたはＤＮＡ配列における改変は、当業者間で周知の技術を用いて行うこ とができる。ＮＫＳＦ配列中の重要な改変には、コード化配列中の選別されたア ミノ酸残基の置換、挿入または削除がある。このような置換、挿入または削除の ための突然変異誘発技術は当業者に周知である〔例えば米国特許第４５１８５８ ４号を参照されたい。〕 本明細書に記載したＮＫＳＦポリペプチドまたはサブユニットポリペプチドの配 列のその他の特異的な突然変異には、グリコジル化部位の改変がある。任意のア スパラギン連結グリコジル化認識部位で、または〇一連結炭水化物の添加により 改変される分子の任意の部位でのアミノ酸置換または削除の結果、グリコジル化 しなかったり、部分的にしかグリコジル化しなかったりする。アスパラギン連結 グリコジル化認識部位には、適当な細胞性グリコジル化酵素により特異的に認識 されるトリペプチド配列を含む。これらのトリペプチド配列は、アスパラギン− Ｘ−スレオニンかまたはアスパラギン−Ｘ−セリン（ここでＸは通常任意のアミ ノ酸である）のどちらかである。グリコジル化認識部位の１番めのまたは３番め のアミノ酸の位置の１つかまたは両方での、種々のアミノ酸置換または削除（お よび／または２番めの位置でのアミノ酸の削除）の結果、改変されたトリペプチ ド配列で非グリコリル化される。

このように変化したヌクレオチド配列の発現により、その部位でグリコジル化さ れない変種が産生される。

ＮＫＳＦ活性が全体的にまたは部分的に保持されているであろうと考えられるＮ ＫＳＦまたはそのサブユニットの配列のその他のアナログおよび誘導体もまた、 本明細書に示された当業者により容易に作ることができる。そのような改変の１ つは、ポリエチレングリコールの存在するりジン残基への付着または通常の技法 による付着を可能にするためのりジン残基の配列への挿入である。このような改 変は本発明に包含されると考えられる。

本発明はまたＮＫＳＦポリペプチドを産生ずる方法をも提供する。本発明の方法 には、既知の制御配列の調節を受けながら、ＮＫＳＦポリペプチドまたはサブユ ニットの発現をコードするＤＮＡ配列で形質転換した適当な細胞またはセルライ ンを培養することを含む。両方のサブユニットの好ましいＤＮＡ配列は宿主細胞 に形質転換する。

適当な細胞またはセルラインは、哺乳動物細胞、例えばチャイニーズ・ノ＼ムス ター卵巣細胞（ＣＨＯ）または３Ｔ３細胞である。適当な哺乳動物宿主細胞の選 別および形質転換、培養、増幅、ふるい分は並びに産生物の産生および精製の方 法は当業界で周知である。例えばゲテイングおよびサンブルーフ、ネイチャー２ ９３巻６２０〜６２５頁（１９８１年）、別法としてカラマンら、モル、セル、 ビオール、５巻７号１７５０〜１７５９頁（１９８５年）もしくはノ１ウレイら 、米国特許第４４１９４４６号を参照されたい。ＣＨＯ細胞における２種の異な るＤＮＡの同時発現については、例えば発行ＰＣＴ国際出願ＷＯ３８１０８０３ ５に記載されている。その他の適当な哺乳動物セルラインはサルＣ０８−１セル ラインおよび元来ウィスター・インスティテユート、フイラデルヒイア、ペンシ ルベニア州で開発されたＣＶ−１セルラインである。

同様に本発明に適した宿主細胞として有用であるのは、細菌細胞である。例えば 、エンエリキア・コリ（例えばＨＢＩＯＩ、ＭＣ１０６１および以下の実施例で 用いた菌株）の種々の菌株は、バイオテクノロジーの分野で宿主細胞として周知 である。Ｂ　サブチリス、ブセウドモナス、その他の桿菌等の種々の菌株をもこ の方法に用いることができる。

当業者に周知の酵母細胞の多くの株もまた本発明のポリペプチドの発現のための 宿主細胞として利用できる。さらに、望まれる場合、昆虫細胞を本発明の方法に おいて宿主細胞として利用できる。例えばミラーら、ジエネテイツク・エンジニ アリング８巻２７７〜２９８頁（ブレナム・プレス１９８６年）およびそこで引 用されている参考文献を参照されたい。

本発明はまた新規ＮＫＳＦポリペプチドの発現方法において使用されるベクター をも提供する。これらのベクターは本発明のサブユニットポリペプチドを含むＮ 　Ｋ　Ｓ　Ｆポリペプチドをコードする新規ＮＫＳＦＤＮＡ配列を含有する。ま た別に、上記で記載したような改変した配列を組み込んだベクターもまた本発明 の態様であり、ＮＫＳＦポリペプチド産生に有用である。この方法で用いるベク ターもまた本発明のＤＮＡコード化配列と有効に関与し、選択した宿主細胞中で それの複製および発現を指示できる選択された制御配列を含有する。

従って、細胞供給源から等質になるまで精製した、または組み換えもしくは合成 により産生したＮＫＳＦは、医薬組成物すなわち増強されたＮＫ細胞活性または イン・ビボでのガンマ−インターフェロンもしくはＧＭ−Ｃ３Ｆの産生増加に反 応する癌またはその他の疾病状態を処置するための製剤に用いることができる。

このような病理学的状態は、疾病、放射線または薬物の暴露、例えば白血病、細 菌およびウィルス感染、貧血、骨髄移植後の免疫細胞または造血細胞不全を含む ＢセルまたはＴセル不全の結果起こる。これらのＮＫＳＦポリペプチド組成物で の癌またはその他の疾病の治療的処置によると、現在使用できる薬物での処置に より引き起こされる望ましくない副作用を避けることができる。本発明によるＮ ＫＳＦポリペプチド組成物は、後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）およびその他 のウィルス感染、とりわけ非反応性ウィルス感染および細菌感染の処！にも用い ることができる。

このような医薬用製剤において、ＮＫＳＦのサブユニットポリペプチドもしくは それのペプチド断片の１つまたは両方を用いることも可能である。

本発明のポリペプチドはまた、単独でまたはその他のサイトカイン、造血素、イ ンターロイキン、成長因子もしくは抗体と組み合わせて、癌またはその他の疾病 状態の処置に用いることもできる。例えばＮＫＳＦポリペプチドをＩＬ−２と連 結させて投与した場合、相乗効果があることが示されている。これは感染、とり わけウィルス感染および癌の処！に有用であると考えられる。これらの新規ポリ ペプチドのその他の用途は、標準方法により診断または治療用に発生させたモノ クローナルおよびポリクローナル抗体の開発である。

従って、本発明のまた別の様相は、上記で言及した状態の処１のための方法およ び治療用組成物である。このような組成物には、本発明のＮＫＳＦタンパクもし くはサブユニットポリベブチドまたは治療的に有効なそれの断片の治療的に有効 量を医薬的に許容されうる担体と混合したものを含む。この組成物は非経口的に 全身的に投与できる。また別に、この組成物は静脈内投与できる。望まれる場合 は、この組成物は静脈内投与できる。全身的に投与する場合、本発明で用いられ る治療用組成物は、発熱物質不含の非経口的に許容され得る水性溶液の形態であ る。このような医薬的に許容され得るタンパク溶液の調製物は、ｐＨ，等調性、 安定性等を十分に考慮して、当業界の技術の範躊である。

上記の状態を処置する方法において用いられる投与計画は、薬物の作用を変化さ せる種々の因子、例えば患者の病状、体重、性別および食事、感染の重篤度、投 与回数並びにその他の臨床因子を考慮して担当の内科医により決定されるであろ う。一般に、１日の投与計画はＮＫＳＦタンパクもしくはそれのサブユニット１ 〜１１００Ｏｘまたは体重１ｋｇあたりタンパク５０〜５０００単位（すなわち 、１単位／■１はガンマ−インターフェロン誘導検定において最大刺激の半分ま で刺激するタンパク濃度である）の範囲内にすべきである。

本発明の治療方法および組成物には、その他のヒト因子との併用投与も含まれる 。このような用途のための典型的なサイトカインまたは造血素には、既知の因子 、とりわけｌ−１、ＩＬ−２およびＩＬ−６がある。〔例えばＰＣＴ公開ＷＯ３ ５１０５１２４、およびＷＯ３８１００２０６：並びにヨーロッパ特許出願第０ １８８８６４号を参照されたい。〕その他のＮＫＳＦ治療への参入の強力な候補 には、ＩＬ−４、Ｇ−Ｃ３Ｆ、Ｃ３Ｆ−１、ＧＭ−Ｃ３Ｆ、ＩＬ−３、ＩＬ−１ １またはエリトロポエチンも含まれ得る。Ｂ細胞成長因子のような成長因子、Ｂ セル分化因子または好エオンン分化因子もまたＮＫＳＦと併用投与するのが有用 であることが解明できている。

同様に、ＮＫＳＦもしくはサブユニットまたはそれの断片を、ＮＫ細胞のＦｃ受 容体に結合する能力のある抗体と一緒に、またはこれに先んじて投与すると、腫 瘍に抗することを目的としたＡＤＣＣ治療を増強できる。上記で列挙した投与量 は、治療用組成物中のこのような付加的な成分のために補整されよう。処置した 患者の改善は、通常の方法で監視する。

以下の実施例は、本発明の均賀なヒトＮＫＳＦの精製および特性並びにその他の 方法および産生物を説明するために記載する。これらの実施例は説明のためのも のであり、本発明の範囲を限定するものではない。

実施例１．血漿兼含有ＲＰＭＩ８８６６細胞順化培地の製造リッジＥスパイラル ーウンド、Ｓｌ、アミコン、ダンノく−ス、ＭＡＩを使用して加圧下５０倍に濃 縮した。

から相同ＮＫＳＦタンパク質を得るために使用されている。

ａ、アニオン交換カートリッジクロマトグラフィー緩衝液（ｐＨ６，８）中０， ５Ｍ　ＮａＣ１１，５す・ソトルで洗浄し、画分３ＱＱｍｌを補集した。ＮＫＳ Ｆ活性をＱ、５Ｍ　ＮａＣ１含有洗浄液で溶出した。

２０１１Ｍトリス−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７，２）で平衡化されているレンチル− レクチンセファロース４Ｂ［ファルマシア］のカラム（２，５Ｘ　１５ｃ＋ｉ） に直接適用した。カラムの５倍容量の平衡化緩衝液で洗浄後、カラムをカラムの ３倍容量の０．２Ｍα−メチル−Ｄ−マンノピラノシド［シグマ〕および０．５ Ｍ　ＮａＣ１含有２０ＩＩＭトリス−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７，２）で溶出した。

ＮＫＳＦの約半分の活性がカラムにより結合し、α−メチルＤ−マンノピラノシ ドで溶出した画分中に回収した。

Ｃ，ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィーレンチル−レクチンセファロー スカラムに結合したＮＫＳＦ活性のプールから濃縮した試料を０．１ｍＭＣａＣ Ｌ２および０．１５Ｍ　ＮａＣ１を含むｌａＭリン酸カジカリウム緩衝液Ｈ６， ８）で透析し、０．１５ＭＣａＣ１１を含む１ｍＭリン酸カリウム緩衝液で前辺 て平衡化したバイオゲルＨＴ［バイオラッド］カラム（２Ｘ５Ｃ１１）に適用し た。カラムを平衡化したカラムの５倍容量の緩衝液で洗浄し、０．１５ＭＮａＣ ｌを含むＩＩＩＭ〜４００■Ｍリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６，８）の直線勾配 置００１１で溶出した。両分４ｍｌを捕集し、ＮＫＳＦ活性を試験した。活性の 単一ピークが約２００ａＭ〜３００ａＭリン酸カリウム間でカラムから現れた。

ｄ、ヘパリンセファ０−スクロマトグラフイーバイオゲルＨＴカラムから溶出し たＮＫＳＦ−含有画分を溜め、２０ｒｓＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７，２ ）で透析し、ヘパリンセファロース［ピアース、ロックファード、ＩＬｌカラム （ＩＸｌｏｃｍ）に適用した。カラムを’ｌＱｔａＭリン酸ナトリウム緩衝液（ ｐＨ７，２）の５倍容量で洗浄し、ＩＭＮａＣｌを含む同じ緩衝液で溶出した。

画分３＋ｅｌを捕集し、ＮＫＳＦ活性を測定した。本質上活性すべてをヘパリン カラムにより結合し、ＬＭ　Ｎａ１ｌ洗浄液中に回収した。

ｅ、モノＱクロマトグラフィー ヘパリンセファロールカラムから溜めた両分を１％エチレングリコールおよび縮 した。試料をモノＱ　（５１５）カラム［ファルマシアーＦＰＬＣ装置コに適用 し、緩衝液Ａ（ｐＨ６，８）中直線勾配ＯＭ　〜ＬＭ　ＮａＣ１で溶出した。両 分０．５ｍ１を捕集し、ＮＫＳＦ活性を試験した。活性は約２２０ｍＭ　〜２７ ０ｍＭ　ＮａＣ１の単一ピークとしてカラムから現れた。

ｆ、ゲル濾過クロマトグラフィー モノＱカラムからＮＫＳＦ活性を含む溜めた画分をスピードバック濃縮機［サバ ント、ファルミングデール、ＮＹ］により１００マイクロリツトルに濃縮し、Ｆ ＰＬＣスパローズ１２カラムに適用した。クロマトグラフィーを０．１５Ｍ　Ｎ ａｃｌ、１％エチレングリコールおよび０．１ｉＭ　ＰＭＳＦを含む５ＱｉＭリ ン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７，２）で行った。流速は０．６＋１／分であり、 画分Ｑ、５＋１を捕集した。ＮＫＳＦタンパク質を約３７ｋＤタンパク質混合物 から分離した。

別法として、溜めたモノ−０画分を上記の工程（ｆ）より前に逆相ＨＰＬＣ（Ｃ ８カラム）に入れ、活性７０ｋＤタンパク質からタンパク質を分離することがで きる。

実施例３．ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法５ＤＳ −ＰＡＧＥを１０％アクリルアミドスラップゲル（厚さ０．７５ｕ＋）でラエミ リの方法［ラエミリ、Ｕ、Ｋ、　ネイチャー、策２２７巻、６８０〜６８５頁（ １９７０年）］により行った。電気泳動後、ゲルを銀染色剤［バイオラッド］を 使用して硝酸銀法で染色するか、２韻薄片にし、４時間２４℃でＱ、５ｍｌのＲ ＰＭｒ培地で溶出し、ＮＫＳＦ活性を分析した。見掛は分子量をタンパク質標準 、ホスホリパーゼｂ　（９４ｋＤ）　、ウソ血清アルブミン（６７ｋＤ）、オバ ルビン（４３ｋＤ）　、カルボニックアンヒドラーゼ（３０ｋＤ）、大豆トリプ シン阻害剤（２０ｋＤ）、およびラクトアルブミン（１４，４ｋＤ）で測定した 。

ＮＫＳＦ活性前に溶出する数種の画分て始め、ついで活性画分を通して適当に行 い、ＮＫＳＦ活性ピーク後に溶出する両分で終わるモノＱカラム画分（実施例２ 、工程（ｅ））ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析（非還元状態）は、２種のタンパク質（７ ０ｋＤおよび３７ｋＤ）の存在が種々のモノ０画分中ＮＫＳＦ活性の存在と関係 することを示した。活性画分を第２の非還元ゲルに再度移し、タンパク質を７０ ｋＤおよび３７ｋＤバンドに対応する領域から溶出し、ＮＫＳＦ活性を試験した 。

活性すべては、７０ｋＤ種と関連し、このタンパク質がＮＫＳＦであることを示 した。

７０ｋＤ種をゲルから溶出し、クロラミンＴ［シグマ、セント・ルイス、ＭＯ］ を使用してヨウ素化し、還元剤β−メルカプトエタノール（１０％）の存在下２ 分間煮沸後、ｊ！！２ＳＤＳゲル上で再度行った。

それらの条件下、７０ｋＤ種を分子量４０ｋＤおよび３０ｋＤの２種の別のサブ ユニットに分解し、未変性ＮＫＳＦはそれらサブユニットボリベブチドのジスル フィド結合へテロダイマーであり得ることを示している。あるいは、ＮＫＳＦは より大きいまたはより小さいサブユニットの多璽化により生成したダイマーであ り得る。未変性７０ｋＤ　ＮＫＳＦの還元はその活性のすべてを破壊し、ガンマ インターフェロンの末梢血リンパ球製造を誘発すると思われた。

実施例４．タンパク質の回収 ＲＰＭ１８８６６細胞無含有順化培地の５００リーツトルで開始し、モノＱカラ ムから最後に溜めた活性画分は、同じゲルで同時に分析した対照タンパク質で銀 染色の強さにより評価したところタンパク質約１０μｇを含んでいた。これの約 ６μｇは７０ｋＤ　ＮＫＳＦタンパク質に相当した。７０ｋＤ　ＮＫＳＦの推定 特異的活性はＩ　Ｘ　１０７ｕ／ｍｇである。生成物におけるＮＫＳＦ活性の全 回収率は２％であった。

実施例５．ＮＫＳＦタンパク質組成物 相同ＮＫＳＦを上記の５ＤＳ−ＰＡＧＥ実施例と同様に還元し、トリプシンで分 解した。別法として、非還元ＮＫＳＦを逆相ＨＰＬＣカラムから得、トリプシン で消化し得る。以下のアミノ酸配列を含む９種のトリプシン断片を分離する：断 片１−Ｌｅｕ−Ｔｈｒ−工１ａ−Ｇｉｎ−Ｖａｌ断片２−　Ｌｙｓ−Ｔｙｒ−Ｇ ｌｕ−Ａｓｎ　−Ｔｙｒ−Ｔｈｒ断片３−工１ｅ−Ｔｒｐ−Ｇｌｕ−Ｌａｕ−Ｌ ｙｓ断片４−　Ｌａｕ−Ｍｅｔ−Ａｓｐ−Ｐｒｏ−Ｌｙｓ断片５−　Ｖａｌ−Ｍ ｅｔ−５ｅｒ−Ｔｙｒ−Ｌａｕ−Ａｓｎ−Ａｌａ断片５−　Ａｌａ−Ｖａｌ−５ ｅｒ−Ａｓｎ−Ｍｅｔ−Ｌｅｕ−Ｇｉｎ−Ｌｙｓ断片７−　Ａｓｎ−Ａｌａ−５ ａｒ−工１ｅ−５ａｒ−Ｖａｌ断片８−　Ｔｈｒ−Ｐｈａ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ断片 ９−　Ａｓｐ−ｌＬａ−工１ａ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ａｓｐ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｌ ｙｓ。

更に、ＮＫＳＦの各ユニットのアミノ酸末端のアミノ酸配列を、実施例３に記載 と同様に、還元後、ＮＫＳＦの分離した４ＱｋＤおよび３０ｋＤ種から決定した 。４０ｋＤサブユニツトからのアミノ酸末端配列は、以下のとおりであった：工 １ｅ−Ｔｒｐ−Ｇｌ　ｕ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ａｓｐ−Ｖａｌ−Ｔｙｒ− Ｖａ　ｌ　−Ｖａ　１−Ｇｌｕ−Ｌａｕ−Ａｓｐ−Ｔｒｐ　−Ｔｙｒ−Ｐｒｏ− Ａｓｐ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ−Ｍｅｔ。

上記アミノ酸末端配列および断片１〜３および７〜９が、上記の第１表に示した より大きいサブユニットのクローンのアミノ酸配列から由来することが判明した 。

３０ｋＤより小さいサブユニットからのアミノ酸末端配列は以下のとおりであっ た；　Ａｒｇ−Ａｓｎ−Ｌｅｕ−Ｐｒｏ−Ｖａｌ−Ａｌａ−Ｔｈｒ−Ｐｒｏ−Ａ ｓｐ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｍａｔ−Ｐｈｅ−Ｐｒｏ。

断片４．５および６は上記の第２表に記したより低いサブユニットのクローンの アミノ酸配列から由来することが判明した。

オリゴヌクレオチドのプールまたは独特のオリゴヌクレオチドからなるプローブ は、Ｒ，ラス、ジャーナル・オン・モレキュラー・バイオロジー、１８３（１） 巻＝１〜１２　（１９８５年）の方法で設計する。オリゴヌクレオチドプローブ を自動ＤＮＡ合成機で合成する。

遺伝子コードが縮重しでいるため（１個以上のコドンは同じアミノ酸をコードし 得る）、トリプシン断片のアミノ酸配列をコード化するすべての可能なヌクレオ チド配列を含むオリゴヌクレオチドの混合物を合成しなければならない。幾つか のコドンが真核性遺伝子にほとんど使用されないために、および真核性コード化 配列におけるジヌクレオチドＣｐＧが相対的にまれである［Ｊ、トール等、不− チャー、第３１２巻、３４２〜３４７頁（１９８４ｆＥ）コために、コドン使用 を基礎とするプローブ混合物におけるオリゴヌクレオチドの数を減少することは 可能であり得る。プローブ設計に使用したアミノ酸配列の領域をもし可能なら高 度に縮重したコドンを避けて選択する。オリゴヌクレオチドを自動ＤＮＡ合成機 で合成し、ついでプローブをポリヌクレオチドキナーゼおよび３２Ｐ−ＡＴＰで 放射能標識化する。

ＮＫＳＦの小さいサブユニットをコード化するｃＤＮＡを、定着している技術（ 上記で引用のトール等参照）を使用してＰｄＢｕ誘発８８６６細胞（ユニバーシ ティ・ペンシルバニア・セル・センター）からのポリアデニル化ＲＮＡから作っ たｃＤＮＡラリブラリ−（ラムダＺａｐで製造、ストラタジークローニングシス テム、う・ジオウ、ＣＡ）をスクリーニングして同定した。スクリーニングを、 プローブとして４０ｋＤタンパク質をコード化する以前クローン化されたｃＤＮ Ａ中に含まれないそれらトリプンンペプチドにより予測された配列を有するオリ ゴヌクレオチドを使用して行った。このライブラリーからの組換え型をプレート に置き、プレートでつくられたニトロセルロースを複製する。オリゴヌクレオチ ドを３２ｐガンマＡＴＰで切断し、複製をハイブリダイズする。

特に、オリゴヌクレオチドの２種のプールをペプチドＶａ　］　−Ｍｅ　ｔ−３ ｅ　ｒ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−Ａｓｎ−Ａｌａに基づいて合成した。１７量体の１種 のプールの配列はペプチドＭｅｔ−９ｅｒ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−Ａｓｎ−Ａｌａか ら、第２のものはＶａｌ−Ｍｅｔ−３ｅｒ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−Ａｓｎから誘導し た。オリゴヌクレオチドの第１のプールにハイブリッドしたクローンを第２プー ルで／＼イブリントした。３ＭＴＭＡＣを含む緩衝液中４８℃でノ＼イブツリド した。フィルターを連続して３Ｍ　ＴＭＡＣ，５０ｍＭトリスｐＨ８，５０℃で 洗浄した。［Ｋ、Ａ、ジャコブ等、ニュークレイツク・アンッズ・リサーチ、第 １６巻＝４６３７〜４６５０頁（１９８８年）、参照］複製共に陽性のものをプ ラーク精製した。

両方のプール、上記のｐ３５ｎｋｓｆ９−１−１およびｐ３５ｎｋｓｆ１４　１ −１にハイブリダイズした２種のクローンを同定した。

配列およびコンピューターによる翻訳を第２表に示す。４０ｋＤサブユニットタ ンパク質中に発見されなかった精製ＮＫＳＦのトリプシン消化物において同定し たすべてのペプチド配列（下線部）および精製３０ｋＤサブユニツトのアミノ酸 末端配列（下線部）を含む。

ＮＫＳＦ４０ｋＤサブユニットの完全な長さのｃＤＮＡを得るために、８８６６ ポリアデニル化ＲＮＡから先に製造したｃＤＮＡを上記と同様にλＺＡＰヘクロ ーン化した。このライブラリーから２０００００個の組み換え型をプレートし、 複製ニトロセルロースフィルターを製造し、ｐＮＫ−６内に存在する配列である ランダムにプライムされた”Ｐｍ１ｌ化ＤＮＡ断片をスクリーニングした。プロ ーブ実験を標準的ストリンジェントハイブリダイゼーションおよび洗浄条件を使 用しておこなった。プラークを再プレートし、上記のプローブおよび条件を使用 して再プローブし、プラークをクローン分離した。ついで３種の分離物を３２ｐ 末端標識化オリゴｄＴプローブ（ｐｄ　（Ｔ）　＋２−＋ａ、ファルマンア）で プローブ化した。

このハイブリダイゼーションを６ＸＳＳＣ，５Ｘデンハルズ溶液、およびキャリ ヤーＤＮＡプラス標識プローブ実験温で行った。３種の分離物中の１種のｐＮＫ １６２はオリゴｄＴプローブにハイブリダイズし、配列決定した。

標準制限消化およびサブクローン化技術を使用して、ＮＫＳＦクローンｐＮＫ− ６およびｐＫＮ１６２を転写および翻訳のフレーム内で共にサブクローン化し、 ＣＯ８発現のｐＸＭ発現ベクターへ結合した。生じたクローンであるｐＮＫ４０ −４（第１表）は、４０ｋＤ　ＮＫＳＦサブユニットの完全な長さのｃＤＮＡを 含むと思われる。

実施例６０組み換え型ヒトＮＫＳＦの発現ＮＫＳＦを製造するために、そのサブ ユニットをコード化するＤＮＡを、標準分子生物学技術により、多くのタイプが 哺乳類、昆虫、酵母、真菌、および細菌の発現について公知である適当な発現ベ クターに移送する。哺乳類細胞のそのようなベクターの１種は、ｐｘＭ［Ｙ、Ｃ ，ヤン等、セル、４７：３−１０頁（１９８６年）］である。このベクターは、 哺乳類の細胞中で所望のｃＤＮＡの高濃度発現をもたらすに適当な関係で、５Ｎ ４０複製開始点およびニンハンサー、アデノウィルス主遅滞プロモーター、アデ ノウィルストリパルタイトリーダー配列のｃＤＮＡコピー、小ハイブリッド介在 配列、ＳＶ４０ポリアデニル化シグナルおよびアデノウィルスＶＡＩ遺伝子を含 む［参照、例えば、コツマン、プロシーディング・ナショナル・アカデミ−・オ ン・サイエンシーズ・ユエスエー、８２巻：６８９〜６９３頁（１９８５年）］ 。ｐＸＭベクターをエンドヌクレアーゼ酵素Ｘｈｏｌで直線化し、ついでＮＫＳ Ｆの各サブユニットの発現用構築物を生成すためにＸｈｏｌ相補的末端を生成す る合成オリゴヌクレオチド［コラボラティブ・リサーチ、レキシントン、ＭＡ］ を加えて前もって修飾したＮＫＳＦサブユニットをコード化するｃＤＮＡに別々 に当量を結合する。

畷乳類発現用のもう１つのベクターｐＥＭＣ３（１）を下記のようにｐＥＭＣ２ Ｂｌベクターの単純な修飾により生成し得る。ｐＥＭＣ３（１）は、ポリリンカ ー領域中の３種の制御ｌ！部位Ｓｍａｌ、５ａｉＩＳＸｂａｌによりｐＥＭＣ２ ＢＩと異なる。ｐＥＭＣ３（１）を生成するために、これら３種の制ｗｉ部位を 常法によりｐＥＭＣ２Ｂ１のＰｓｔｌとＥｃｏＲＩ制限部位の間に挿入した。

ｐＥＭＣ２Ｂ１は、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（ＡＴＣＣ ）、ロックビル、メリーランド（アメリカ合衆国）に、受託番号ＡＴＣＣ４０３ ４８で寄託されているｐＭＣＴ２ｐｃから誘導し得る。ＤＮＡはＰｓｔｌによる 消化ｌこより、直線化される。ＤＮＡはそれから７４ＤＮＡポリメラーゼを用い て鈍端ｉ：ｔル。オリゴヌクレオｆ　ト、　５　’　ＴＧＣＡＧＧＣＧＡＧＣＣ ＴＧＡＡ’ｌ’ＴＣＣＴＣＧＡ　３　’を、次にＤＮＡ中にライゲートして、５ ′末端にＰｓｔｌＮ位を再生し、ＥｃｏＲ１部位およびＸｈｏｌＩ部位をＤＨＦ ＲｃＤＮＡのＡＴＧの前に加える。このプラスミドはｐＭＴ２１と呼ばれる。ｐ ＭＴ２１は、ＥｃｏＲＩおよびＸｈｏｌ　Ｉで切断し、これはプラスミドを２カ 所の隣接クローニング部位で開裂する。５０８塩基対のＥＭＣＶ断片が制限酵素 ＥｃｏＲＩおよびＴａｑαＩによりｐＭＴ、ＥＣ，ＡＴ、から切断された（ニス ・ケー・ジョングら、ジャーナル・オン・ピロロジー、６３巻、１６５１−１６ ６０頁（１９８９年））。６８ヌクレオチドの長さのオリゴヌクレオチド一対は ＥＭＣＶ配列をＡＴＧまで複製することにより合成される。ＡＴＧはＡＴＴへ変 え、Ｃを加え、３′末端にＸｈｏ１部位を作る。Ｔａｑα１部位は５°末端に位 置させる。このオリゴヌクレオチドの配列はｍ：５’　ＣＧＡＧＧＴＴＡＡＡＡ ＡＡＣにＴＣＴＡＧＧＣＣＣＣＣＣＧＡＡＣＣＡＣＧＧＧＧＡＣＧＴＧＧＴ？ｒ ＴＣＣ？Ｉテおよびその相補鎖である。

ｐＭＴ２１　ＥｃｏＲＩからＸｈｏｌ断片の、ＥＭＣＶ　ＥｃｏＲＩからＴａｑ ａｌ断片へおよびＴａｑαＩ／ＸｈｏＩオリゴヌクレオチドへのライゲーション はベクターｐＥＭｃ２Ｂ１を生成する。このベクターはＳＶ４０の複製開始点お よびエンハンサ−、アデノウィルス主要遅延プロモーター、アデノウィルス３分 節リーダー配列の大部分のｃＤＮ、Ａコピー、小ハイブリッド介在配列、ＳＶ４ ０ポリアデニル化言号およびアデノウィルスＶ、Ａ　Ｉ遺伝子、ＤＨＦＲおよび β−ラクタマーゼマーカー窟およびＥＭＣ配列を唾乳頂細胞の目的ｃＤＮＡの高 レベルの発現の指令に適当な関係で含む。

これら２つの異なったｃＤＮＡ類は同時に同じ宿主に、または独立して別の宿主 に発現する。後者の場合、サブユニットが別々に精製され、最終活性ＮＫＳＦは 個々のサブユニットの再生により組立てられる。

ａ、哺乳類細胞発現 下記の測定に使用するためのＮＫＳＦ蛋白の発現を得るために、４０ｋＤおよび ３０ｋＤ　（小形種）サブユニット類のためのｃＤＮＡ類を含む構築物を哺乳類 発現ベクターｐＥＭＣ３（１）に別々にクローニングし、ＣＯ８細胞にリン酸カ ルシウム共沈および形質導入により一緒に挿入する。約８０ｋＤ　（非還元）お よび４０ｋＤおよび３０ｋＤ　（還元）３５Ｓメチオニン標識蛋白（４時間パル ス、形質導入後２日）がＣＯ８Ｏ８共同形質導入化順化培地ＡＧＥゲルに存在す るが、陰性対照形賞導入物には存在しない。ＣＯ８同時形賞導入物から形質導入 後４８時間で回収した調整培地は、ガンマインターフェロン（ＩＦＮγ）分析測 定で活性である（実施例７ａ参照）。

活性が８８６６Ｅｍ整培地から精製されたものと全く同一であるという更なる証 拠は、ＩＦＮγ導入分析においてＩＬ２と相乗作用すること、ＮＫＳＦ重鎮に対 するポリクローナルウサギ抗血清（１：１００希釈）が共同形質導入体中および ＲＰＭＩ８８６１調整培地での活性を阻害することの観察からきている。抗血清 はＮＫＳＦ重鎖ｃＤＮＡで形質導入（ｐＥＭＣ３（１）中にクローニング）した ＣＯ８細胞からの調整培地から精製されたＮＫＳＦ重鎮で免疫したウサギで産生 ずる。

ｐＮＫ４０−４プラスミドを別々にＣｏＳ細胞に形質導入した場合、上清を回収 し測定し、それから細胞を１５５システインで短時間標識した。標識蛋白は標準 還元および非還元条件下１１％アクリルアミドゲル上を流した。ｐＮＫ４０−４ でのこの形質転換からの非標識上清は、実施例８記載の通り行ったガンマインタ ーフェロン導入分析および殺細胞活性分析に対して不活性であった。

本明細書に記載の哺乳類細胞発現ベクターは当分野の技術者に既知の技術で合成 し得る。ベクターの要素、例えばレプリコン、選択遺伝子、エンハンサ−、プロ モーター、およびその他は既知の方法で天然源または合成により得られる。カラ フマンら、ジャーナル・オン・モレキュラー・バイオロジー、１５９巻、５１１ −５２１頁（１９８２年）、およびカウフマン、プロシーディンゲス・オン・ナ ショナル・アカデミ−・オン・サイエンシーズ・ニーニスニー、８２巻、６８９ −６９３頁（１９８５年）参照。代表的な哺乳類宿主細胞は、特に形質転換細胞 系を含む霊長子細胞系および醤書類細胞系である。通常のディプロイド細胞、初 期組織のイン・ビトロ培養由来の細胞株および初期体外移植片もまた適当である 。候補細胞は、分泌遺伝子が優性に作用する限り分泌遺伝子の遺伝子量的欠損を 必要としない。両方とも既知の方法によるベクターＤＮＡ類安定な統合、および 統合ベクターＤＮＡ［のその後の増幅のためにＣＨＯ細胞が用いられ得る。ある いは、ベクターＤＮＡはウシ乳頭腫ウィルスゲノムの全部または一部を含み得（ ルスキーら、セル、３６巻、３９１−４０１頁（１９８４年））、安定エピゾー ム因子としてＣ１２７マウス細胞のような細胞系に導入される。他の適当な哺乳 類細胞系はＨｅＬａ、ＣＯ５−１サル細胞、マウスＬ−９２９細胞、スイス人由 来３Ｔ３系、Ｂａ１ｂ−ｃまたはＮＩＨ７ウス、ＢＨＫまたはＨａＫハムスター 細胞系が含まれるが限定はされない。

２個のサブユニットが哺乳類での同時発現を必要とする場合、２種のｃＤＮＡを 異なった選択遺伝子またはマーカーを用いて細胞内へ導入し得る。下の実施例７ に記載のように、これはジヒドロ菓酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）遺伝子を１つの マーカーとして、アデノシンデアミナーゼ（ＡＤＡ）を他のマーカーとして使用 してＣＨＯ細胞中へ容易に行われる。独立して哺乳類細胞系に選択される２つの 遺伝子のいかなる組み合わせも本方法に使用できる。例えば、ＣＨ○細胞系を独 立してＡＤＡ選択下１つのサブユニットの発現のために開発し、異なった細胞系 をＤＨＦＲ選択下他のサブユニット発現のために開発する。細胞系は２種の選択 下ポリエチレングリコール中で融合し、両方のサブユニットを発現する安定系を 産生ずる。あるいは、ＤＮＡ類を同時にまたは連続的に同じ細胞へ導入し、それ により活性ＮＫＳＦを発現する系を産生ずる。

単一の選択可能マーカーで両方のサブユニットをコードする多シストロンベクタ ーが、両方のサブユニットが１個の選択薬で同時増幅される細胞を産生じ得るこ ともまた可能である。加えて、この効果は細胞への別個のベクターの同時の単純 なコトランスフェクションによりなしとげ得る。

安定な形質導入体は、次に標準免疫学的、生物学的または酵素分析により発現産 物についてスクリーニングする。ＮＫＳＦポリポプチドをコードするＤＮＡおよ び鳳ＲＮＡの存在は、サザン・プロット法およびＲＮＡプロット法などの標準的 な方法で検出し得る。ポリペプチドをコードするＤＮＡのＣＯ３−１サル細胞の ような適当な宿主細胞への発現ベクターＤＮＡの導入後数日間の一過性の発現は 培養培地中の蛋白の活性または免疫学的測定の選択なしに測定し得る。

当分野の技術者はｐＥＭＣ３（１）ベクターに相当する他の哺乳類発現ベクター 類を、例えばそれぞれのプラスミドからのＮＫＳＦサブユニットＤＮＡ配列を適 当な酵素で挿入して、および周知の組み替え遺伝子工学技術、および他のｐＸＭ 、ｐＪＬ３およびｐＪＬ４（ゴーホら、エンボ・ジャーナル、４巻、６４５−６ ５３頁（１９８５年））　およびｐＭＴ２　（ｐＭＴ２−ＶＷＦＴＭ始Ｌ、ＡＴ ＣＣ＃６７１２２　：　ＰＣＴ出願第ＰＣＴ／ＵＳ　８７１０００３３号参照） のような既知ベクターを用いて構築し得る。両方のＮＫＳＦサブユニット（別々 のベクターまたは同一のベクターいずれも）をもつこれらのベクターの適当な宿 主細胞への形質導入は、ＮＫＳＦポリペプチド発現をもたらす。

ｂ、細菌発現系 同様に、当分野の技術者はＮＫＳＦサブユニットをコードする配列を、コード配 列に隣接する哺乳類調節配列がある場合これを除去しおよび細菌調節配列を挿入 して、本発明のＮＫＳＦサブユニットの細菌細胞による細胞内または細胞外発現 のための細菌ベクターを作ることにより操作できる。ＮＫＳＦ蛋白をコードする ＤＮＡは当分野で既知のように、さらに細菌の発現を能率よくするために異なっ たコドンを含むように修飾し得る。好ましくは、成熟ＮＫＳＦサブユニットをコ ードする配列はまた当分野で既知の方法で、成熟ＮＫＳＦポリペプチドの細菌発 現、分泌および加工を可能にする分泌性リーダーポリペプチドをコードするヌク レオチド配列に機能可能に枠内で連結する。このような分泌系を用いたエシェリ キア・コリでの両方のＮＫＳＦサブユニットの同時発現は活性へテロダイマーの 分泌をもたらす。この方法は活性キメラ抗体断片を産生ずる（例えばビターら、 サイエンス、２４０巻、１０４１−１０４３頁（１９８８年）参照）。

あるいは、既知の方法で細胞内発現の為のベクターを使用して個々のサブユニッ トをエシェリキア・コリの２つの異なったｃＤＮＡから別々に成熟形として発現 させ、サブユニットを別々に単離し、混合し、再び折りたたむ。例えば米国特許 第４５１２９２２号参照。いずれの経路で細菌宿主細胞内に発現された組成物も 次に、すべて既知の方法で、回収し、精製しおよび／または物理学的、生物学的 および／または臨床パラメーターにより確認される。

Ｃ１昆虫または酵母細胞発現 昆虫細胞でＮＫＳＦポリペプチドを発現する昆虫ベクターの構築物についても同 様の操作が可能である（例えばヨーロッパ特許出願第１５５４７６号公報に記載 の方法参照）。もしＮＫＳＦサブユニットが１個のｃＤＮＡ由来であれば、この ｃＤＮＡは昆虫細胞で発現するであろう。あるいは、もしＮＫＳＦサブユニット が２個の異なったｃＤＮＡ類由来の場合、それぞれのサブユニットを別々に昆虫 細胞ベクターに挿入し、辱られた２個のベクターを生物学的に活性なＮＫＳＦを 発現するために昆虫細胞へ挿入する。

同様に酵母ベクターは酵母調整配列を用いてそれぞれ個々のＮＫＳＦを同時に、 またはもし蛋白が１個の前駆体由来であれば、その前駆体をコードするｃＤＮＡ を、酵母細胞−で発現するように構築して細胞外分泌活性ＮＫＳＦへテロダイマ ーを産生ずる。あるいは個々のサブユニットを酵母において細胞内発現し、個々 のポリペプチドを単離し、最後に折りたたみ活性ＮＫＳＤを産生させ得る。（例 えばＰＣＴ出願第ＷＯ３６１００６３９号およびヨーロッパ特許出願第ＥＰ１２ ３２８９号を照。） 実施例７．ＮＫＳＦを高レベルで産生ずるＣＨＯ細胞系の構築補乳類細胞から高 レベルの本発明のＮＫＳＦ蛋白を産生ずる１つの方法は個々のＮＫＳＦサブユニ ットをコードする２個のｃＤＮＡの多（のコピーを含む細胞の構築に関する。

２つのＮＫＳＦポリペプチドがそれぞれ別の＋ｇＲＮＡ類に由来するため、それ ぞれの対応するｃＤＮＡは同時にＣＨＯ細胞に発現しなければならない。２つの 異なった選択マーカー、例えばＤＨＦＲおよびＡＤＡが用いられ得る。ｃＤＮＡ のうち一方は例えばベクターｐＥＭＣ３（１）を用いてＤＨＦＲ系を使用して発 現しくカウフマンおよびシャープ、ジャーナル・オン・モレキュラー・ノくイオ ロジー、（１９８２年）前掲）、第１のＮＫＳＦサブユニットおよびＤＨＦＲを 発現する。第２のサブユニットは第２のベクター、例えばｐＭＴ３ＳＶ２ＡＤＡ 　（アール・ジエー・カウルマン、メソッズ・オン・エンザイムノロジー、１８ ５巻、５３７−５６６頁（１９９０年））を用いて発現する。プラスミドｐＭＴ ３Ｓｖ２ＡＤＡはまた哺乳類細胞でＡＤＡの発現を司る。１つのサブユニットを 含む第１のベクター構築物はＤＨＦＲ−欠損ＣＨＯＤＵＫＸ−ＢＩ　Ｉ細胞に形 質転換する。

第２のサブユニットを含む第２のベクター構築物は第２のＣＨＯ細胞系に形質転 換する。形質転換細胞はＤＨＦＲマーカーとして約５ｎＭで開始し適当な段階で １００μＭまでメトトレキセートの濃度を増加させるか、または２゛−デオキシ コフォマイシン（ｄＣＦ）をＡＤＡマーカーとして１１００ｎから適当な段階で １０μＭまで増加させたときの成育で選択する。個々のｃＤＮＡの発現（第１の 細胞系でＤＨＦＲ選択下第１のサブユニットおよび第２目の細胞系でＡＤＡ選択 下第２のサブユニット）は転写の試験のためにｍＲＮＡプロットおよび蛋白産生 の試験のために免疫測定を組み合わせて測定する。ＡＤＡ選択下のサブユニツト を発現する細胞およびＤＨＦＲＨＦ下の他方サブユニットを発現する細胞は、当 分野で確立された方法によりポリエチレングリコール中で、ｄＣＦおよびＭＴＸ の両方に耐性で、両方のサブユニットを産生じて生物学的に活性なＮＫＳＦを産 生ずる１つの細胞系を産生ずるために融合する。

池の存在する好ましい発現の方法は両方のサブユニットを発現する１つの細胞系 の開発を基礎とする。例えば上記の最初のベクターの様な１つのサブユニ・ノト を含む最初のベクターは選択ＣＨＯ細胞系に形質導入され、サブユニットの発現 は上記の薬選択下に増幅する。その後、他のサブユニットを含む第２のベクター を既に増幅された第１のベクターを含む細胞系に形質導入する。他のサブユニッ トを発現するｃＤＮＡ、例えば上記の第２のベクターは第２の薬選択下で導入し 得る。第２のベクターは次に同様の方法で増幅し、両方のサブユニットを同時に 発現する細胞系が得られる。（例えば、ＤＨＦＲ遺伝子に結合した箪１の遺伝子 およびＡＤＡ遺伝子に結合した第２の遺伝子を個々に増幅する代表的記載例はＰ ＣＴ国際出願第ＷＯ３８１０８０３５号参照。）他の方法では、２つのベクター 構築物、例えば第１のサブユニットおよびＤ）（ＦＲ遺伝子を含む第１のｐＥＭ Ｃ３（１）および第２のサブユニットおよびＤＨＦＲ遺伝子を含む第２のｐＥＭ Ｃ３（１）構築物を設計し得る。両方のＮＫＳＦサブユニットを発現する２つの ｐＥＭＣ３（１）構築物を混合しそして混合物をＣＨＯ細胞へ形質導入し得る。

細胞は次にＭＴＸ中で上記のように増幅し、両方のサブユニットを産生ずる細胞 系を得る。あるいは、２つの薬選択マーカーがこの方法で用いられ、両方の薬の 結合選択分泌が使用され得、形質転換体のＮＫＳＦ活性が直接試験され、ヘテロ ダイマーを発現する細胞系が得られる。

更に別の方法では、両サブユニットおよび１つの薬選択マーカーをコードする他 のシストロンベクターの開発である。このベクターの形質導入およびその増幅が さらに急速に高発現細胞系を作る可能性がある。

上記のいずれの発現系も、得られた細胞系は更に適当な薬遺択により増幅でき、 得られた細胞系は再びクローニングし得、発現の評価は本明細書で述べたガンマ インターフェロン分析により行うことができる。

実施例８．ヒトＮＫＳＦの生物学的活性以下の測定は実施例２記載の均質ＮＫＳ Ｆまたは部分精製変形ＮＫＳＦのいずれかを使用して行った。分子の組み合え変 形はＮＫＳＦ生物学的特性を、これらの同じ測定または別の測定で示すと予期さ れる。

新鮮ヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）またはフィトヘマグルチニン（ＰＨＡ）− 誘導芽細胞をＮＫＳＦと共に培養した場合、上清に有意なガンマインターフェロ ンの量を検出する。更に、ＮＫＳＦはＩＬ−２、ジブタン酸フォルボール（Ｐｄ Ｂｕ）およびＰＨＡと、ガンマインターフェロン誘導において相乗作用がある。

ノーザンブッロト測定は、ＮＫＳＦ単独または他の因子との組合せでガンマイン ターフェロンｍＲＮＡの蓄積を増加させることを示す。ガンマインターフェロン メツセージは精製ＴおよびＮＫ集団の両方で発見された。蛋白合成阻害剤、シク ロへキシミド（ＣＨＸ）との予備インキュベーションはＮＫＳＦによる刺激の後 ガンマインターフェロンｔｍＲＮＡの超誘導を導く。ＨＬＡ−ＤＲ（＋）補助細 胞はＴおよびＮＫ細胞がガンマインターフェロンを産生ずるのに必要である。ガ ンマインターフェロンｍＲＮＡの誘導はＰＨＡ芽細胞のＮＫＳＦで処理後１時間 の早さですでに検出できる。測定の詳細は以下に述べる。

ａ、ガンマインターフェロン誘導測定 ＮＫＳＦ活性はヒト末梢血リンパ球（ＰＢＬｓ）のガンマインターフェロン（ガ ンマ−ＩＦＮ）発現の誘導により測定された。測定では、１０％熱不活性ＦＣ５ を加えたＲＰＭ１１６４０培養培地に懸濁した１００μｌのヒトＰＢＬｓ（１０ ’細胞／ｇｌ）を１００μｍの試験をするサンプルにマイクロタイタープレート （Ｕ底、９８−ウェル、コスタ−、ケンブリッジ、エムニー）中で加え、１８時 間３７℃、５％Ｃ○２でインキュベーションする。試験するサンプルは純粋ＮＫ ＳＦ。

フォルボールジエステル４８時間刺激ＲＰＭ１８８６６細胞の透析した細胞非存 在上清および組換えＩＬ−２（ジエネティクス・インスティテユート・インコー ホレイテッド、ＰＣＴ出願第ＷＯ３５１０５１２４号）を含む。インキュベーシ ョンの後、１００μｌの細胞非存在上清をそれぞれのウェルから回収し、ガンマ −ＩＦＮ産生レベルを放射免疫測定で測定した（プントコール・ガンマ・インタ ーフェロン・ラジオイムノアッセイ、セントコール、マルベルン、ビーニー）。

１社当たりのＮＫＳＦの単位は、ＮＫＳＦの最適濃度の存在下の最大ガンマ−Ｉ ＦＮ産主の半分を産生ずるのに必要な濃度である。

それぞれのウェルのガンマ−ＩＦＮ産生量と培養液のＮＫＳＦ量の間には明確な 直線関係がある。

ガンマ−ＩＦＮに加えて、ＮＫＳＦはＴおよびＮＫ細胞をＧＭ−Ｃ８Ｆおよび腫 瘍壊死因子を産生ずるために誘導する。これらのサイトカイン類の測定は、上記 のように行い、上清は特異的生物学的測定または放射免疫測定によりサイトカイ ン類の存在を測定する（クラリら、ジャーナル・オン・エクスベリメンタル・メ ディスン、１６５巻、１５８１−１５９４頁（１９８７年））。あるいはサイト カイン遺伝子の誘導はＮＫＳＦで処理したリンパ球中の３種のサイトカイン類の ｍＲＮＡ転写の蓄積の評価により測定する。リンパ球はＮＫＳＦと共に４から１ ８時間培養し、ＲＮＡは確立した方法で抽出し、アガロースゲル電気泳動により 画分化し、ニトロセルロースで吸着し、ＩＦＮ−ガンマ、ＧＭ−Ｃ５Ｆ、または 腫瘍壊死因子遺伝子用”ＰＩ［！１ｃＤＮＡプローブでハイブリダイズする（ノ ーザン・プロッティング）。ハイブリッド形成の程度はオートラジオグラフィー およびデンシトメトリー測定する。

ＮＫＳＦは精製ヒトＮＫ細胞由来のＩＦＮ−ガンマおよびＴＮＦの産生を誘導す る。上記工程（ａ）のガンマインターフェロン誘導下に記載のように測定した場 合、ＮＫ細胞は種々の標的細胞を２つの機構で融解することができる。１つの機 構は特異的刺激不存在下の、リンパ血病および固形癌由来細胞系、ウィルス感染 細胞、および、ある場合には、正常細胞系を含む種々の標的細胞の自然融解であ る。第２の機構はＡＤＣＣである。予備的証拠は、ＮＫＳＦが、ＮＫ細胞のＦｃ 受容体に結合可能なＦｃ部分をもつＩｇＧ抗体で覆われた標的細胞を更に効果的 に融解するＮＫ細胞の能力を増加させ得ることを示す。

ｂ、ＮＫ分析 ＮＫ細胞のＮＫＳＦによる自然殺細胞活性の増加を測定するために、ＰＢＬｓま たは精製ＮＫ細胞（５Ｘ１０’細胞／ｍ１）を１８時間ＲＰＭ１１６４０．１０ ％熱不活性ＦＣ５中で、種々の希釈ＮＫＳＦの存在下インキュベーションする。

ＰＢＬｓは次に洗浄し、ＰＢＬ−標的細胞比１：１から１００　：　１で、１０ ４Ｈ（ｒ−標識標的細胞にＵ底マイクロタイタープレート中で加える（最終量２ ０Ｏμｍ）。４時間後、プレートを這心し、細胞非存在上清を回収し、標的細胞 の融解は細胞からの５１（：ｒ標識遊離により評価する。ＮＫＳＦは以下の標的 細胞に対して測定した場合、ＮＫ細胞の細胞毒性を数倍上昇させた：悪性造血細 胞系（即ち、Ｋ２Ｏ２、ダウン、Ｕ９３７、ＨＬ−６０、ＭＬ３、モルト４、ジ ューカット、ＴＨＰ−１）　、固型腫瘍由来細胞系（横絞筋肉腫、メラノーマ） および正常包皮由来繊維芽ｍ＃！系。ＮＫＳＦによるＮＫ細胞媒介細胞毒性の増 加はＮＫＳＦで処理したＰＢＬにより産生されるＴＮＦ−ガンマ、腫瘍壊死因子 、またはＩＬ−２産生による２時的なものではない。細胞毒性測定、ＮＫ細胞精 製およびサイトカイン類によるＮＫ細胞媒介促進の上昇の定量的評価の方法はジ ー・トリンンエリら、ジャーナル・オン・エクスベリメンタル・メディスン、１ ４７巻、１３１４頁（１９７８年）；ジー・トリンシェリら、ジャーナル・オン ・エクスベリメンタル・メディスン、１６０巻、１１４７頁（１９８４年）；お よびビー・ベルジャら、ナチュラル・イムニティー・アンド・セル・グロース・ レギユレーション、６巻、１７１−１８８頁（１９８７年）に詳細に記載されて いる。

ｃ、ＡＤＣＣ測定 標準抗体依存細胞媒介細胞毒性測定において、予備的結果は、本発明の部分精製 ＮＫＳＦがＮＫ細胞の抗体で包まれた腫瘍標的細胞の殺傷を用量依存的に増加さ せることを示す。ＮＫ細胞のＦｃ受容体に結合する抗体の能力のため、ＮＫ細胞 のＡＤＣＣ反応はＮＫＳＦを添加することにより増加した。

ｄ、ＮＫＳＦの共同マイトジェン効果 ＰＢＬｓ　（０，５Ｘ１０’／ｍｌ）を２００μｍの１０％熱不活性ヒトＡＢ血 清を加えたＲＰＭ１１６４０培地で培養する。３および６日後、ＰＢＬｓは３Ｈ −チミジンでパルスし、ＤＮＡ合成（増殖）はスカルトロン細胞回収機を使用し て細胞をグラスフィルター上に回収し、細胞関連３Ｈ−チミジンをバラカード・ トリカーブ・ベータ測定器を使用した液体シンチレーションで測定し、細胞内の ｚＨ−チミジン取込みにより評価する。ＮＫＳＦはＰＢＬ増殖にはそれ自身殆ど 影響しないが、フィトヘマグルチニン（ＰＨＡ−Ｍ　ウェルカム、１：１００） と−緒に培養６日で、およびフォルボールジエステル（ＴＰＡまたはＰＩ）Ｅｌ ｕ、それぞれ１０−８または１０−７）と−緒に３日および６日で強い共同マイ トジェン効果を示す。細胞周期分析はフローサイトメトリー（サイトフルオログ ラフ　５０Ｈ、オルトダイアゴニスティクス）でロンドンら、ジャーナル・オン ・イムノロジー、１３７巻、３８４５頁（１９８６年）に従ってＤＮＡ染色と免 疫蛍光染色を組み合わせて行った。この分析はＮＫＳＦの共同マイトジェン効果 に影響を受けるＰＢＬｓがＣＤ４またはＣＤ８のいずれかが陽性のＴ細胞である ことを示す。

ｅ、ＧＭ−Ｃ５Ｆ誘導測定 ヒトＰＢＬｓの培養液中でのＧＭ−ＣＳＦ発現誘導を測定した。この測定では、 １０％熱不活性ＦＣ５添加ＲＰＭ１１６４０培養培地に懸濁した１００μｍのヒ ）１’ＢＬｓ（１０’細胞／腸１）をマイクロプレート（Ｕ−底、９６ウエル、 コスタ−、ケンブリッジ、エムニー）中の試験サンプル１００μｌに添加し、１ ８時間３７℃、５％Ｃｏｔでインキュベージタンした。インキュベーションの後 、１００μｌの細胞非存在上清をそれぞれのウェルから回収し、ＧＭ−Ｃ３Ｆ産 生のレベルを酵素結合免疫吸着測定（ＥＬＩＳＡ）で、異なるエピトープを認識 するヒ）ＧＭ−Ｃ５Ｆに対する２種のマウスモノクローナル抗体（３／８．２０ ．５および２／３１、ジェネティクス・インスティテユート・インコーホレイテ ッド販売）を使用して行った。組換えヒトＧＭ−Ｃ８Ｆ　（ジエネティクス・イ ンスティテユート・インコーホレイテッド）を標準として用いた場合、本測定の 測定限界は５０ｐｇ／ｍｌであった。

本発明の実行に際し多数の修飾および変形がこの分野の技術者によって行われる ことが期待される。

国際調査報告 ＋１ｃｎ＊　ＰｅＴＭＩＩ　＋ｍ　ｍ　ｍｌ　−ＰＫｊｆｌ　１１６１１１フロ ントページの続き （５１）　Ｉｎｔ、　Ｃ１，’　識別記Ｊｔ　庁内！理番号Ａ６１Ｋ　３７／２ ４　ＡＤＹ　８３１４−４Ｃ３９／３９５　Ｄ　９２８４−４Ｃ Ｎ　９２８４−４Ｃ Ｃ１２Ｎ　５／１０ Ｃ１２Ｐ　２１１０２　ＺＮＡ　Ｋ　８２１４−４Ｂ／／（Ｃ１２Ｐ　２１１０ ２ Ｃ１２Ｒ１：９１） （７２）発明者　トリンチェリ、ジョルジオアメリカ合衆国１９１０４　ペンシ ルベニア、ウィンウッド、ウィスター・ロード　３５５番 （７２）発明者　ペルシア、バイス アメリカ合衆国１９１４６　ペンシルベニア、フィラデルフィア、ウニバリー・ ストリート　２３０２番 （７２）発明者　小林　踏子 アメリカ合衆国０２１４６　マサチューセッツ、プルツクリン、アパートメント 　４０４、フリーマン・ストリート１７５番 Ｉ （７２）発明者　クラーク、ステイーブン・シーアメリカ合衆国０１８９０　マ サチューセッツ、（７２）発明者　ウォング、ゴートン・ジ−アメリカ合衆国０ ２１３０　マサチューセッツ、ジャマイカ・プレイン、アパートメント１０、ジ ャマイカ・ウェイ　４０番 （７２）発明者　ヒユーウィック、ロッドニーアメリカ合衆国０２１７３　マサ チューセッツ、レキシントン、ウッドクリフ・ロード　１６番

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．ヒト末梢血白血球でのガンマインターフェロンのインビトロ産生を誘導する 能力があり、実質的に他の蛋白性物質が存在しないナチュラルキラー細胞刺激因 子蛋白。 ２．見かけ上の分子量約４０ｋＤであり表１と同じまたは本質的に同じアミノ酸 配列をもつサブユニットを含む請求項１記載の蛋白。 ３．見かけ上の分子量約３０−３５ｋＤであり表２と同じまたは本質的に同じア ミノ酸配列をもつサブユニットを含む請求項１記載の蛋白。 ４．ガンマインターフェロン誘導測定で特異的活性が１×１０７希釈単位／ｍｌ より大であることにより生物学的に特徴付けられる請求項１記載の蛋白。 ５．以下の特徴を１個またはそれ以上持つ請求項１記載の蛋白：（１）ＳＤＳＰ ＡＧＥで非還元条件下で見かけ上分子量が約７０−８０ｋＤ；（２）サブユニッ トがＳＤＳＰＡＧＥで非還元条件下で見かけ上分子量が約４ＯｋＤ； （３）サブユニットがＳＤＳＰＡＧＥで非還元条件下で見かけ上分子量が約３０ −３５ｋＤ； （４）等電点電気泳動ゲルで等電点が４．３；（５）等電点電気泳動ゲルで等電 点が４．８；（６）ヒドロキシルアバタイトカラムから単一ピークとして溶出； （７）ヘパリン−セルロースカラムから単一ピークとして溶出；（８）ＦＰＬＣ 　Ｍｏｎｏ−Ｑカラムから単一ピークとして溶出；（９）ＰＢＬｓとのガンマＩ ＦＮ誘導分析で生物学的活性（１０）ＰＢＬｓとのＧＭ−ＣＳＦ誘導分析で生物 学的活性（１１）白血病および腫瘍誘導細胞を殺すＮＫ細胞の活性化で生物学的 活性（１２）ＰＨＡ活性化Ｔリンパ球を使用した腫瘍壊死因子誘導測定で生物学 的活性； （１３）末梢血Ｔリンパ球において共同マイトジェン作用。 ６．ＲＰＭＩ８８６６由来順化培地をＱＡＥゼータブレブカートリツジ、レンズ 豆（ヒラマメ）レクチンカラム、ヒドロキシアパタイトカラム、ヘパリンセファ ロースカラムおよび高速蛋白液体クロマトグラフィ−Ｍｏｎｏ−Ｑカラムにより 連続精製に付することを含み、ＮＫＳＦは後者のカラムから単一ピークとして溶 出する、均質ＮＫＳＦの製造方法。 ７．さらにＭｏｎｏ−Ｑカラム溶出物をゲル濾過クロマトグラフィーに付すこと を含む請求項６記載の方法。 ８．所望により逆相ＨＰＬＣ精製を上記ゲル濾過クロマトグラフィー前に行って もよい請求項６記載の方法。 ９．発現制御配列と機能的に結合するＮＫＳＦまたはそのサブユニット発現コー ド化ＤＮＡ配列で形質転換した細胞系を培養することを含むＮＫＳＦまたはその サブユニットを製造する方法。 １０．上記ＤＮＡ配列が表１と同じまたは実質的に同じ配列、またはその断片を 含む請求項９記載の方法。 １１．上記ＤＮＡ配列が表２と同じまたは実質的に同じ配列、またはその断片を 含む請求項９記載の方法。 １２．配列が （ａ）表１の配列； （ｂ）表２の配列： （ｃ）それらの断片； （ｄ）それらとハイブリダイズできる配列からなる群から選択された配列と同じ または実質的に同じヌクレオチド塩基の配列を含むＮＫＳＦまたはそのサブユニ ットをコードするＤＮＡ配列。 １３．発現制御配列と機能的に結合する請求項１２記載のＤＮＡ配列で形質転換 した細胞。 １４．哺乳類または細菌細胞を含む請求項１３記載の細胞。 １５．ガンマインターフェロン誘導分析において蛋白１ｍｇ当たり１×１０７希 釈単位より大な特異的活性を持つ均質ＮＫＳＦ。 １６．薬理学的に有効な溶媒中にＮＫＳＦまたはそのユニットを治療上有効な量 で含む医薬組成物。 １７．さらに治療的に有効な量の付加的サイトカイン、ヘマトポエチン、または 成長因子を含む請求項１６記載の組成物。 １８．上記サイトカインがＩＬ−１、ＩＬ−２、およびＩＬ−６からなる群から 選択される請求項１６記載の組成物。 １９．請求項１２記載のＤＮＡ配列を含むプラスミド。 ２０．ベクターがｐＮＫ４０−４である、請求項１９記載のベクター。 ２１．ベクターがｐ３５ｎｋｓｆ１４−１−１である、請求項１９記載のベクタ ー。 ２２．患者に有効量のＮＫＳＤまたはそのサブユニットを投与することからなる 癌の処置法。 ２３．更に同時にまたは連続して上記ＮＫＳＦに加えて、ヘマトポエチン、サイ トカイン、成長因子またはＮＫ細胞のＦｃ領域に結合できる抗体の少なくとも１ 種を有効量投与することを含む、請求項２２記載の方法。 ２４．上記ヘマトポエチンがＩＬ−１、ＩＬ−２またはＩＬ−６である、請求項 ２３記載の方法。 ２５．患者に有効量のＮＫＳＤまたはそのサブユニットを投与することからなる 感染処置法。 ２６．上記感染がウィルスまたは細菌感染である、請求項２５記載の方法。 ２７．上記感染が無応答ウィルス感染である、請求項２６記載の方法。 ２８．上記感染がＡＩＤＳである、請求項２６記載の方法。 ２９．見かけの分子量が約４０ｋＤであり表１記載のアミノ酸配列と同じまたは 実質的に同じ配列をもつ第１のサブユニットを、見かけの分子量が約３０ｋＤで あり表２記載のアミノ酸配列と同じまたは実質的に同じ配列をもつ第２のサブユ ニットと一緒に含む、実質的に他の蛋白性物質を随伴しないナチユラルキラー細 胞刺激因子蛋白。 ３０．患者に有効量のＮＫＳＦまたはそのサブユニットとＩＬ−２を投与するこ とを含み、ＮＫＳＦとＩＬ−２の間の相乗作用が見られる、感染処置法。