JPH06501099A - 被覆された毛管 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 被覆された毛管 発明の分野 本発明は、一般に溶液の成分の分光分析に有用なデバイスに関するものである。

より詳細には本発明は、分光計に取り付けることができ、かつ溶液中の成分の検 出、同定および濃度測定のために管に導入された溶液の成分の分光分析に用いら れる試薬を含む組成物で被覆された内装を有する、容器または管に関するもので ある。また本発明は、それらの被覆された管の製法およびそれらの被覆された管 の使用法に関するものである。本発明は、特に比較的少量の個々の化合物を迅速 かつ定量的に検出および同定するのに有用であるが、これに限定されない。

発明の背景 分光学は、溶液中の化合物により吸収または放出される電磁線の波長および強度 を同定および測定することにより溶液の組成を判定するために、多様な分野で利 用されている。バイオポリマー、たとえばＤＮＡ％ＲＮＡ、蛋白質および炭水化 物を含めた生物学的に重要な高分子の多くは電磁スペクトルのＵ、　Ｖ、または 可視部のスペクトルの少なくとも１領域においてエネルギーを吸収するので、分 光学は特にスペクトルの紫外（Ｕ、Ｖ）部または可視部において吸光する化合物 を同定、解明および定量するために有用である。適切な条件下で、分光学を利用 して溶液中のこれらの化合物を検出、同定および濃度測定することができる。

溶液中の化合物の２種類の許容状態間の差に適合するエネルギーをもつ波長を含 む入射光で溶液を照射すると、特定の波長の光子が吸収され、従って透過光の成 分波長が入射光のものと異なる。吸収ののち、化合物中の電子は衝突または他の 発熱性相互作用へのエネルギーの損失により、基底状態に反転する。しかしある 種の化合物、特に共役電子を有するものについては、基底状態への反転がより緩 慢であり、光子の放出を含む。励起状態の性質に応じて、この放出の結果蛍光を 生じる場合がある。蛍光発光は吸収された入射光より低いエネルギー水準を有す るものであり、入射光が発光光線を妨害しない限り光検出器によって高感度で検 出しうる。一般に蛍光分光計においては、光検出器は入射光に対して角度をなし て、通常は直角に配置される。吸光または発光がスペクトルのＵ、　Ｖ、および 可視領域においてなされる場合、このような透過は吸光分光測光法および蛍光分 光測光法を含めた測光法による測定に特に好適である。実際には、バイオポリマ ーなどの化合物を含有する溶液の試料をキュベツト、すなわち当該化合物により 吸光される波長に対して透明である容器に導入し、このキュベツトを分光計、た とえば分光光度計または分光蛍光計に装入する。吸光分光測光法および蛍光分光 法（分光蛍光法）は、電磁線の吸収または放出による化合物の電子的転移を測定 するものであり、溶液中のそれらの化合物を検出、解明および定量することがで きる。吸光が起こるエネルギーは、溶液中の化合物の電子、振動および回転のエ ネルギー水準の関数である。

特定の化合物の吸光特性もしくは発光特性を増強もしくは変更するためには、ま たは溶液もしくは化合物混合物の特定の成分を検出するためには、当該化学物質 または化合物と特異的に相互作用する適宜な試薬を分析前に溶液に添加すること が時には必要である。この試薬は当該化学物質または化合物と特異的に相互作用 して、その化合物または試薬単独の場合と異なる吸光特性または発光特性を有す るコンプレックスまたは他の生成物を形成する。この試薬は、溶液中に存在する 特定の化合物または化合物前駆物質と結合して、試薬の不在下でのその化合物と 比較して増強された吸光特性または発光特性を有する、吸光分光光度計、蛍光分 光計もしくは他の光度計測器により、または肉眼によってすら検出しうるコンプ レックスを形成すべく選ばれる。たとえば蛍光性の高い化合物は比較的まれであ り、非蛍光化合物または蛍光性の弱い化合物の標識用試薬として利用することが できる。蛍光化合物を非蛍光化合物と結合させ、または他の様式でコンプレック ス形成させ、これによりそれらの非蛍光化合物を検出、同定および定量するため の手段を提供することができる。

吸光度は濃度に正比例し、従って特定の化合物の濃度を吸光度測定により判定す ることができる。蛍光は希溶液中においてのみ、濃度に正比例する。それは一般 に入射強度および用いる個々の計測器を含めた数種類の変数のＭｅｉである。蛍 光化合物の濃度は、標準曲線を作成することにより蛍光分光測定法によって測定 しうる。

特に体液、またはＤＮＡ、ＲＮＡ、蛋白質および炭水化物を含有するバイオポリ マー溶液の試料を研究する際には、溶液中の特定の化合物と反応してその化合物 による電磁線の吸収または放出を変化または増強させる試薬、たとえば色素また は蛍光化合物と溶液をまず接触させることにより、その化合物の検出、濃度定量 が改善される。

高分子に関する一般的な分光測光法および蛍光分光法ならびに他の測光法による アッセイを実施するためには、当該化合物を含有する試料溶液に特異的試薬を添 加する。この試薬はこれらの高分子と相互作用して、特徴的な吸光または蛍光プ ロフィルにより直接的または間接的に検出しうるコンプレックスを形成する。

この試薬は、試料溶液中の当該化合物の検出、同定、濃度定量に利用しうる特異 的または特定の波長の電磁線を吸収、放出または生成するコンプレックスまたは 他の生成物を形成する。これらの試薬にはたとえば下記の色素が含まれる：ヘキ スト色素、（２−（２−（４−ヒドロキシフェノール）−６−ベンゾイミダゾー ル−６（１−メチル−４−ピペラジル）ベンゾイミダゾール）、これはＤＮＡと 相互作用して、増強された蛍光を示すコンプレックスを形成する；および各種の 色素、たとえばクマシー・ブルー、これは蛋白質に結合して、スペクトルの可視 部において強く吸光する有色生成物を生じる。高分子、たとえばＤＮＡまたは蛋 白質の濃度は、選ばれた吸光または蛍光の極大における吸光または発光を測定す ることにより判定しうる。

個々の化合物の検出にはその化合物の修飾を必要とするので、試料は測定を行っ たのち廃棄される可能性がある。研究に使用しうる試料の量は著しく制限される 場合が多いので、分光分析には可能な限り少量の試料を使用することが望ましい 。

しかし試料の使用量はそのシステムの検出限界により拘束される。一般にキュベ ツトのサイズが小さくなるほど試料の量は少なくなり、これに伴って分光光度計 により放出される光線で試料を照射した際に生じる信号の大きさが低下し、これ により測定の感度および精度が低下する。約１２．５ｍｍＸ１２．５ｍｍの標準 的キュベツトに試料を導入しく精確な測定のためにはこれは完全に満たされてい なければならない）、測定の限界が１−１０μｇ／ｍｌの範囲である場合、得ら れる試料の実質的部分が分光分析により使い果たされる可能性がある。

米国特許第４，９９１．９５８号明細書および米国特許出願第０７／４３３゜７ ５２号明細書（ガーナ−）（これらの全体をここに参考として引用する）には、 それぞれ分光光度計および蛍光分光計のアダプターに取り付けたマイクロピペッ ト内に保持された試料上に適切に光を集束させるべく設計された、分光分析用ア ダプターが記載されている。この設計により、アダプターは少量の試料を分光分 析により測定するための手段を提供する。各アダプターは、分光計の光源からの 光をマイクロピペットの軸に沿って集束させ、かつピペットから、またはピペッ トを通って放出された光を再集束させて、これにより光を検出器に受容させるべ く設計されている。しかし米国特許第４．９９１．９５８号明細書および米国特 許出願第０７／４３３．７５２号明細書（ガーナ−）には、アダプター内に用い るマイクロピペットの最適な設計に関してはほとんど指示されていない。

さらに、高分子に関する多くの分光分析が高分子を検出可能にするための試薬の 添加に依存しているので、検出可能な生成物を形成するためには試薬を試料溶液 と予備混合しなければならない。このような試薬と試料の予備混合は、他の技術 的問題を生じる。これには、分析者が身体に有害な化学物質、たとえばエチジウ ムプロミドに被爆されることが含まれる。また一般に試薬はキュベツト内に添加 され、ここで混合される。キュベツトは特定の範囲の波長に対して透明である石 英もしくはガラスまたは他の適切な材料のものであり、またそれらは分光計の光 学部品であるので、それらはかなり厳密な明細のものに加工されなければならな い。従ってキュベツトは一般に使い捨てではない。このような再使用牛ユベγト その他の容器は汚染される可能性があり、従って後続使用には不適切である。

さらにこのような再使用のため試料が汚染される可能性がある。

従って分光計内での分析のために比較的少量の試料を保持しうる受け器を提供す ることが要望されている。さらに、分光分析を容易にするために、試薬をマイク ロピペット内に保持された比較的少量の試料と容易にかつ安全に混合しつる手段 を提供すること、および試料中に比較的低い濃度で、比較的少量存在する特定の 化合物を精確に検出し、カリ濃度定量するための手段を提供することが要望され ている。

従って本発明の目的は、比較的少量の液体試料を分光計内に保持すべく設計され たマイクロピペットを提供することである。

本発明の他の目的は、分光光度計に取り付けうるマイクロピペットであって、分 光計内に液体試料を保持し、試薬と試料溶液を安全かつ容易に混合するための手 段を含むものを提供することである。

本発明の他の目的は、分光計内に液体試料を保持するためのマイクロピペットで あって、その中で再現性のある標準化された処理法により試薬を溶液中の化合物 と予備混合しうるものを提供することである。

本発明の他の目的は、分光計内に試料溶液を保持するための使い捨てマイクロピ ペットを提供することである。他の目的は、分光計内に液体試料を保持するため のマイクロピペットであって、マイクロピペット内に保持された液体の汚染の可 能性を少なくするものを提供することである。他の目的は、分光計内に試料溶液 を保持するためのマイクロピペットであって、比較的使いやすく、カリ製造原価 が比較的低いものを提供することである。

発明の概要 高分子、バイオポリマーおよび他の化合物と検出可能なコンプレックスを形成す る少なくとも１種の試薬を含有する組成物で均一に被覆された内腔を備えた中空 容器、たとえば毛管またはマイクロピペットが提供される。この容器は、外壁お よび容器の内腔を定める内壁を備えている。容器の壁面は円形または非円形、た とえば方形の断面をもっことができ、電磁スペクトルの少なくとも一部に対して 透明でなければならない。容器が分光光度計に取り付けうる管である形態の場合 、分光計の光学部品として使用すべき管の内径、外径および壁厚はその長手に沿 って（縦方向に）、半径または円形方向に（方位方向に、ａｚｉｍｕｔｈａｌｌ ｙ）均一でなければならず、かつ管間で均一でなければならない。

被膜組成物は管または容器の内壁に沿って均一に付与されなければならない。

被膜組成物は、試薬と相互作用する化合物または化合物類を含有する溶液を導入 した際に、溶液中の化合物を少なくとも検出することができ、また溶液中の化合 物の定量が可能となりつるのに十分な試薬が、管に導入される溶液に溶解する濃 度で試薬を含有する。

好ましい形態においては、容器は管、特に毛管またはマイクロピペットであり、 これは約１／２　ｃ、５）ｍｍの内径を有する。従って管の内腔は比較的小さな 容積をもち、試料溶液中の成分化合物を分光分析するために少量の試料溶液で満 たすことができる。

管の内腔は、試料溶液中の化合物と相互作用して、検出可能なコンプレックスま たは他の検出可能な化合物を生じる試薬を含有する被膜組成物で被覆される。

試薬は、それが溶液中の化合物と結合し、増強された発光特性または吸光特性を 有する溶液を形成し、これにより化合物を分光分析によって検出および定量する ことができる能力に基づいて選ばれる。より詳細には、溶液は個々の種類の化合 物および試薬に適した分光分析法により分析しうる。たとえばマイクロピペット 内で試薬と溶液中の化合物により形成された溶液を、分光光度計または蛍光分光 計内に管を取り付けることにより分析しうる。次いで、それぞれ溶液の吸光特性 または発光特性を測定することができる。あるいは試薬は、マイクロピペット内 の試料溶液中の化合物と着色溶液を形成しうる色素であってもよい。溶液の色を 視覚的に観察することにより溶液中の化合物を同定することも可能である。また 赤外またはレーザー波形分析法を利用して溶液を分析してもよい。

好ましい形態においては被膜組成物は、溶液が管に導入された際に被膜中の試薬 が試料溶液に溶解する速度を低下させるのに役立つ結合剤または接着剤を含有す る。結合剤または接着剤は、選ばれた試薬または試薬類および試料溶液に対して 不活性である１種または２種以上の単糖類、多糖類、ゼラチンまたは他の粘稠な 物質を混合することにより調製される粘稠な混合物である。結合剤または接着剤 は、試料溶液が管に導入された際に被膜組成物の一部である試薬が直ちに溶解す るのを遅延させるのに役立つその能力に基づいて選ばれる。結合剤または接着剤 を被膜組成物に含有させることにより、試薬を均一に試料溶液中に分布させる手 段が提供される。

被膜は当業者に既知のいかなる手段によっても表面に付与することができる。

組成物を付着させるために採用される個々の方法は、一部は個々の試薬の特性に より指示される。たとえばエチジウムプロミドおよびヘキスト色素などの試薬は 、水と混合して試薬溶液を調製することができる。次いでこの試薬溶液をマイク ロピペットの内腔に導入し、蒸発させて、試薬をマイクロピペットの内壁に乾燥 残渣の形で析出させることができ、これがマイクロピペットの内壁に付着する。

あるいは試薬をこの場合も液状溶液の形で、マイクロピペットの内腔に挿入しう る針様の噴霧器具からマイクロピペットの内壁に吹き付けることができる。

好ましい形態においては、被膜組成物を被覆用混合物または溶液として管に導入 し、これを蒸発させて被膜組成物を形成させる。被膜中の試薬は可逆的に管壁に 結合しており、従って試薬がそれと反応する化合物を含有する溶液を導入した際 に、試薬は管内で溶液または懸濁液を形成する。管の内壁を被覆するために、結 合剤または接着剤、および当該試料中の化合物と相互作用する試薬１種または２ １１１以上を含有する組成物を、管の内腔の内壁に実質的に均一に析出させる。

所望により、試料中の他の化合物と相互作用する他の試薬を含有する第２組成物 を内壁の予め定められた部分に析出させることができる。第２試薬の濃度は第１ 試薬のものと異なってもよい。これらの目的のために、マイクロピペットの内壁 において試料溶液中の化合物と別個に反応する環状の′バッビ中に第１および第 ２試藁を析出させることができる。さらに、試料中のさらに他の化合物と反応さ せるために、内壁においてさらに他の“バγド″中にさらに他の試薬を含有する さらに他の組成物を析出させてもよい。あるいは複数の試薬を含有する単一の被 膜組成物を調製し、管の内壁を均一に被覆してもよい。

複数の試薬を壁面において環状パッド中に析出させる形態の場合、試薬は壁面に 不可逆的または実質的に不可逆的に結合し、試料溶液が内腔２６に導入された際 に溶解しないものであってもよい。この形態においては、溶液中の化合物が壁面 に付着した試薬に結合して、壁面に沿って識別可能なリングを形成する。

他の形態においては、接着剤または結合剤の層をまずマイクロピペットの内壁に 析出させる。次いで乾燥粉末状または粘稠な液体状の試薬を内腔に導入すると、 試薬は接着剤層に粘着する。あるいは好ましい形態においては、接着剤層を被覆 用試薬と予備混合し、次いでこの混合物を管の内装に均一に析出させる。

図面の簡単な説明 図１は、被覆されたマイクロピペットの透視図であり、分光針に対し分解された 関係で示される： 図２Ａは、図１の線２−２に沿って見た、空の被覆マイクロピペットの断面図で ある： 図２Ｂは、図１の線２−２に沿って見た、アッセイすべき試料溶液で満たされた 被覆マイクロピペットの断面図である：図２Ｃは、図１の線２−２に沿って見た 、別形態の空の被覆マイクロピペットの断面図であり、試薬が複数であることが 示される：図３は、図１の線３−３に沿って見た被覆マイクロピペットの断面図 である一部４は、図１の１１３−３に沿って見た、別形態の被覆マイクロピペッ トの断面図である： 図５は、被覆マイクロピペット内に試薬を析出させる１方法のブロック図である ： 図６は、被覆マイクロピペット内に試薬を析出させる他の方法の模式図であり、 明確にするためにマイクロピペットが断面で示される；および図７は、ｌ／ｙＪ １の線２−２に沿って見た、別形態の被覆マイクロピペットの断面図である。

発明の詳細な説明 定義 特に指示しない限りここで用いる技術用語および科学用語はすべて、当業者に一 般に理解されているものと同じ意味を有する。ここに述べた刊行物はすべて参考 として引用される。ここに述べた米国特許明細書はすべて、それらの全体を参考 として引用する。

ここで用いる光度計は、光の出力または発光を測定する計測器である。

ここで用いる分光測定法は、電磁線の放出を観察および測定する方法である。

電磁線の放出を測定するための計測器が光度計である。分光光度計は、物質また は溶液を透過する特定波長の光の強度を測定するための計測器であり、これによ り溶液中の化合物の濃度が定量的に測定される。分光蛍光測定法は、蛍光の強度 および質を測定する方法を表わす。分光蛍光計は、蛍光を測定するために設計さ れた分光計である。

ここで用いる分光分析法とは、分光計（電磁エネルギーの吸収を測定する）、分 光光度計（可視またはＵ−Ｖ−エネルギーの吸収を測定する）、蛍光分光計（放 出される電磁エネルギーを測定する）、および電磁エネルギーの吸収または放出 を測定するのに適した、当業者に既知の他の光度計または装置を用いて行われる 分析を意味する。これらの装置はいかなる種類の電磁エネルギーの吸収または放 出をも検出すべく設計することができ、Ｕ、　Ｖ、　または可視波長の吸収また は放出を検出するものに限定されない。好ましい形態においては、Ｕ、　Ｖ、お よび可視頭載においてそれぞれ吸収および放出される電磁エネルギーを測定する 分光光度計および蛍光分光計が用いられる。

ここで用いる毛管とは、ガラス、石英その他の適切な材料から加工された管であ って、比較的少ない容量を保持し、毛管に導入される溶液中の化合物による光の 吸収または放出を測定しうる吸光分光光度計、蛍光分光計または他の装置内に取 り付けるのに適したものを意味する。毛管は分光計またはこれに類する他の装置 の構成部品として用いることを意図したものであるため、毛管の光学特性は管内 の溶液中の成分の光学特性を精確に、かつ信頼性をもって検出および定量しうる のに十分なほど均一でなければならない。たとえば、管を作成する材料は当該波 長に対して透明でなければならず（たとえばＵ、Ｖ、の吸収または放出には石英 ）、かつ管は均一な内径および外径をもたなければならない。さらに管は、必要 な光学的測定を実施するのに適した円形、方形その他のいかなる形状にも加工す ることができる。

ここで用いる毛管とは、必ずしも管が毛管作用により充填されなければならない ことを意味するわけではな（、小さな断面積を表すために用いられる。当業者の いずれかがこの種のデバイスを意味すると認識する他のいずれかの用語、たとえ ばマイクロピペットを、毛管と互換性をもって用いることができる。好ましい形 態においては、毛管は約１／２　（，５）ｍｍの内径（内腔直径）を有するマイ クロピペットである。

ここで用いる、可逆的に結合するとは、試薬が管の内壁に結合する好ましい様式 を意味する。試薬を選択し、そして試料が管に導入された際に実質的な試薬が壁 面に付着した状態を維持することなく溶液中に溶解または懸濁する様式で、管の 内壁に析出させる。しかしある形態においては、試薬は環状′パッド′中におい て管に結合し、試料溶液の導入に際して試薬の実質的な部分が溶解せず、または 壁面から離脱しない。

ここで用いる、化合物または化合物類を定量的に結合するとは、試料中の化合物 または化合物類を実質的にすべて結合し、これにより化合物の量または濃度を測 定しうろことを意味する。

ここで用いる結合剤とは、当該化合物を検出するための試薬と混合して分光分析 に用いる毛管の内壁に付与された場合に、溶液中への被膜中の試薬の溶解を遅延 させるいずれの化合物または化合物混合物をも意味する。この遅延は、被膜中の 試薬が試料溶液中に均一に溶解しうるのに十分なものであり、好ましくは試料溶 液を管に導入したのち約５−１５秒である。

ここで用いる溶液とは、真の溶液であるか、または懸濁したいずれの粒子から生 じる光の散乱も吸収または放出される電磁線の検出を妨害しない限り、懸濁液で ある混合物を包含する。

被覆された管の物理的特性および分光計へのこれらの管の装入被覆される管は、 分光計への入射光に対して、および管を通過するか、または管内の試料溶液中の コンプレックスにより放出されて生じる光に対して、透明な材料で作成されなけ ればならない。たとえばＵ、　Ｖ、領域において入射または放出される光を含む 測定のためには、管を石英で作成することができる。

管は、管の内容物の分析に用いられる分光計その他の計測器内に取り付けるのに 適したいかなる直径または形状のものであってもよい。好ましい形態においては 、管は米国特許第４．９９Ｌ　９５８号明細書（ガーナ−）に記載される形状お よびサイズであり、かつアダプターと共に用いるのに特に適したマイクロピペッ トまたは毛管である。管内の溶液を分析する分光計その他の計測器の光学部品と して管を使用しうるためには、内径、外径および壁厚は毛管の長手に沿って（縦 方向に）、および半径方向に（方位方向に）均一でなければならず、かつ毛管間 で均一でなければならない。管は信頼性のある精確な測定値を得るのに十分なほ ど、各次元間で均一でなければならない。

好ましい形態を図面に示す。図４には、中空のマイクロピペットまたは毛管（一 般的に１０と表示する）がアダプター１２に対して分解された関係で示され、こ れを光源１６および光検出器１８を含む分光計内に配置することができる。光源 １６および光検出器１８は図１においてボックスとして示されるが、光源１６お よび光検出器１８はそれぞれ、当業者に既知の分光計その他の計測器内に用いる のに適した周知の光放出装置および光検出装置であると解すべきである。図示さ るように、マイクロピペット１０をアダプター１２のスロット２０に挿入するこ とができる。こうしてアダプター１２は、マイクロピペット１０の内腔内の試料 溶液（図１には示されていない）の分光分析のために、マイクロピペット１０を 光源１６と光検出器１８の間のスロット２０内に保持することができる。光源１ ６および光検出器１８を含む分光計は、マイクロピペット１０内の試料溶液中の 化合物の発光特性または吸光特性をそれぞれ分析するために、図１に示すように 分光光度計であってもよく、または蛍光分光計（図示されていない）を形成すべ く再構成されてもよい。

マイクロピペット１０の詳細は図２Ａおよび３に示される。マイクロピペット１ ０を示す図２Ａおよび３は、円筒形の外壁２２および円筒形の内壁２４を有する 長い中空の透明な毛管マイクロピペットであることが好ましい。内壁２４および 外壁２２は円筒形の形状であるが、内壁２４もしくは外壁２２または両方が他の 適切な形状を備えていてもよいと解すべきである。たとえば図４に示すように、 マイクロピペット１０が正方形の断面を備え、壁２４および壁２２が長い平行六 面体として造形されてもよい。

マイクロピペット１０のいずれの形態においても、すなわち正方形および円形の 断面の両方について、内壁２４は内腔２６を定め、この中へ試料溶液２８（図２ Ｂに示される）を分析のために保持しうる。マイクロピペット１０は開放端３０ ．３２を備えた状態でも形成され、マイクロピペット１０はいがなる適切な毛管 であってもよいが、好ましい形態においてはマイクロピペット１ｏは約５５／１ ００ｍｍ　（，５５ｍｍ）の内径３４および約７０／１００ｍｍ　（，７ｍｍ） の外径３６を有する毛管である。

図２Ａは、マイクロピペット１０の内壁２４が被膜組成物３８で被覆されている ことをも示し、これは好ましくは約５−５０μの厚さを有する。被膜組成物３８ は試料溶液中に存在する化合物と反応する試薬１種または２種以上を含有する。

１！１２Ｂには、試料溶液２８を充填したのちのマイクロピペット１ｏが示され る。

試料溶液を導入すると、被膜組成物３８中の試薬はすべてまたは一部が溶液に溶 解する。従って図２Ｂは、試薬が試料溶液に溶解したことを示す。より詳細には 、試薬（図２Ａに示す）が試料溶液２８（図２Ｂに示す）中の化合物と結合して 、特定の光相互作用性、すなわち特定の吸光特性または発光特性を有する溶液を 形成する。

従って選ばれる試薬は予想される試料溶液２８の関数であることが当業者には認 識されるであろう。たとえば試料溶液２８がデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）分子を 検出またはその濃度測定のために分析される場合、試薬はＤＮＡの検出を高める もの、たとえばへ牛スト色素またはエチジウムプロミドであるべきである。エチ ジウムプロミドおよびヘキスト色素は周知のとおり溶液中のＤＮＡ分子と相互作 用して、既知の蛍光性を有するコンプレックスを形成する。あるいは試薬は試料 溶液２８中の化合物と反応して特定の吸光特性を有する溶液を形成する物質であ っでもよい。いずれの場合も、発光特性または吸光特性は、試料溶液２８中の化 合物を検出、同定または濃度測定するための周知の原理に従って分光計１４を用 いて適宜測定することができる。場合により、溶液中の化合物を検出または同定 し、溶液中のその濃度を推定するために、試料溶液の色の変化の視覚的観察によ ることも可能である。

最後に図２０は、内壁２４の予め定められた部分に複数の試薬を析出させうろこ とを示す。より詳細には、異なる試薬３８ａ、３８ｂ、３８ｃを含有する被膜の パッドを内壁２４の予め定められた部分２４ａ、２４ｂ、２４ｃに後記のいずれ かの方法で析出させ、試料溶液中に存在する数種の化合物とそれぞれ反応させる ことができる。試薬″パッド’　３８ａ、３８ｂ、３８ｃが′ケムスティックス （ｃｈｅｍｓ　ｔ　ｉｘ）″バッドであって、これらを内腔２６内へ導入して内 壁２４の部分２４ａ、２４ｂ、２４ｃにそれぞれ付着させてもよい。

被膜組成物の調製 被膜組成物は、試料溶液中の化合物を分光学的に検出するための試薬を適切な溶 剤、たとえば水と混合して被覆用混合物を形成することにより調製され、これを 壁面に析出させ、蒸発させると、被膜組成物が形成される。組成物中の試薬の濃 度は、試料溶液中のそれが特異的である特定の化合物のすべてに定量的に結合し 、かつ管を縦方同および方位方向に均一に被覆するのに十分でなければならない 。さらに試薬の濃度は、それが試料溶液に溶解したのち均一でなければならない 。被膜は溶液が管を充填するのに時間を要するため、溶液と接触した際に直ちに 溶解することはできない。

好ましい形態においては、管、試薬を含有する被膜組成物は、試薬が壁面に可逆 的に結合する様式で管の内装に析出しうる成分から選ばれる。複数の試薬を環状 ′バッド″に析出させる後記の形態においては、管、被膜組成物および試薬は、 試薬または試薬類が壁面に不可逆的または実質的に不可逆的に結合する成分およ び材料から選ばれる。

試薬は分光学的アッセイに用いるものとして当業者に既知のいかなる化合物であ ってもよい。これらの試薬には下記のものが含まれるが、これらに限定されない ：ローリー試薬、これは蛋白質に結合して７００−７５０ｎｍにおいて吸光すて ５４０ｎｍにおいて吸光するコンプレックスを生成する（ゴラル（Ｇｏｒｒａｌ ｌ）ら（１９４９）Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、１エアニア５１）；色素、たとえ ばクマシー・ブリリアント・ブルー６２５０、これは酸溶液中で蛋白質に結合ノ ール）−６−ベンゾイミダゾール−６（１−メチル−４−ピペラシル）ベンゾイ ミダゾール）、これはＤＮＡと相互作用して、その蛍光を増強する（ラバルカ（ Ｌａｂａｒｃａ）ら（１９７９）Ａｎａｌ、Ｂｉｏｃｈｅｍ、１匹し３４４）： フルオレスカミン（ｆ　ｌｕｏｒｅｓｃａｍｉｎｅ）　、これは第１アミンと反 応して蛍光性生成物を形成する複素環式ジオンである（ユーデンフリード（Ｕｄ ｅｎｆｒｉｅｄ）ら（１９７２）Ｓｃｉｅｎｃｅ　１ヱ旦：８７１）；！チジウ ムブロミドおよびエチジウムホモダイマー、これらはＤＮＡまたはＲＮＡの存在 下発光、生物発光、または分光学的に検出しうる生成物を生成する他の試薬、た とえば酵素、たとえば細菌ルシフェラーゼおよびホタルルシフェラーゼ、これは 試料溶液中の基質と反応して生物発光を生じる。ホタルルシフェラーゼはＡＴＰ の測定に用いられ、細菌ルシフェラーゼはＮＡＤＰＨの測定に用いられる。

被膜組成物中の試薬の濃度は、試料溶液中のそれが特異的である分子のすべてと 反応するのに十分なものであるが、大過剰には添加されない。それは低い信号対 ノイズ比をもたらす。好ましくは試料溶液中に望まれる試薬濃度の約２０倍を被 膜組成物に添加する。たとえば約１０−１００μｇのＤＮＡを定量的に検出する のに十分な色素、たとえばヘキスト色素の最終濃度を得るためには、毛管の長さ のセンチメートル当たり約２０ｎｇの色素を被膜組成物に添加する。

試料溶液中に試薬が直ちに溶解するのを遅延（ｄｅｌａｙ、ｒｅｔａｒｄ）させ るために、結合剤もしくは接着剤を被膜組成物に含有させるか、または被膜組成 物を析出させる前に管の表面に被覆する。結合剤は、試料溶液中に試薬が直ちに 溶解するのを遅延させ、認めうるほどには、または実質的には試料溶液と相互作 用しない化合物または代合物混合物、たとえば蔗糖、多糖類、ポリアクリルアミ ド、アガロースおよび他のゲルである。結合剤は試薬が直ちに溶解するのを少な くとも約５−１５秒遅延させることにより、被覆試薬に対する持続放出剤として 作用する。結合剤は好ましくは混合単糖類、多糖類またはゼラチンである。好ま しい結合剤は、蔗糖を水に混合することにより調製しうる。結合剤は管を予備被 覆するために用いるか、または被膜組成物の試薬および他のいずれかの成分を結 合剤と混合し、次いで管壁に被覆することができる。

結合剤を調製するためには、候補成分、たとえば蔗糖、ゼラチンおよび多糖類を 約０−１６００ｇ／ｌの種々の濃度で混合し、選ばれた試薬と混合し、そして管 に導入する。次いで選ばれた試薬が水または他の適宜な溶剤中での被膜の溶解を 遅延させるか否かを調べるために試験する。溶解を少なくとも約５−１５秒遅延 させる濃度および組成物を選択する。一般に被膜組成物中においてゼラチン約５ ｇ／ｌ、蔗糖１６００ｇ／ｌのオーダーの結合剤濃度、または種々の濃度の蔗糖 およびゼラチンの混合物が有効である。当業者は個々の試薬および試料の種類に 関して用いるのに最適な組成物を確認するために、他の適切な結合剤混合物およ び他の濃度を容易に試験することができる。

毛管の内側の被膜は正常な毛管作用を妨害し、または変化させるので、試料溶液 を管に導入するためには一般に毛管作用以外の手段を用いる必要がある。

管の内壁上への被膜組成物の析出 好ましい形態においては、被覆用混合物を管壁に析出させて、試薬が壁面に可逆 的に結合した均一な被膜を得る。

好ましい形態においては、細い針、たとえば注射針を用いて、たとえば注射器ま たは精密ポンプにより付与される圧力下に、被覆用混合物を管に導入する。被覆 用混合物を管に導入する際には、流体−空気界面が管内を一定の速度で移動する のが保証されるように注意を払うべきである。

被覆溶液を管に導入したのち、それを取り出す。それは吸引により、または加圧 により取り出すことができる。たとえば注射器により付与される吸引を採用する 場合は、毛管から流体を取り出す前に針に流体を充填しておくべきである。

他の形態を図面に示す。図５．６および７は、試薬３８を含有する被覆溶液をマ イクロピペット１０の内壁２４上に析出させるための、限定ではない別法を示す 。

図５は、１方法をブロック図で示す。この場合、試薬を適切な溶剤、たとえば水 と混合して、液状の被覆用混合物を形成する。この工程はブロック４０に示され る。次いでブロック４２に示されるように、マイクロピペット１０の反対便開放 端に部分真空を付与することにより、組成物をマイクロピペットに吹き込むこと により、またはマイクロピペット１０の毛管作用により、マイクロピペット１０ の開放端３０．３２のいずれかに被覆用混合物を引き込む。マイクロピペット１ ０の内腔２６を液状の被覆用混合物で充填することができる。

次いでマイクロピペット１０を乾燥または蒸発条件下に置く。これには、真空乾 燥、または液状の試薬溶液を蒸発させるために（ブロック４６に示される）十分 な温度（一般に室温から、最高で約３７−３８℃）に加熱すること（ブロック４ ４に示される）が含まれるが、これらに限定されない。析出した溶液が室温で蒸 発する場合、加熱または真空は必要ない。試薬溶液を含有する被覆用混合物が開 放端３０および３２から蒸発するのに伴って、試薬３８を含有する被膜組成物が 残漬として内壁２４上に析出し、その際、複数の環状′バッド′に析出させるこ とを意図する場合以外は試薬または試薬類が内壁に可逆的に結合する。

図６は、試薬３８を含有する被膜組成物を、あるいは吹き付けによりマイクロピ ペット５０の内壁４８上に析出させうろことを示す。より詳細には、試薬３８を 含有する被覆用混合物が吹き付はホース５６のノズル５４の孔５２を通して吹き 付けられる。このために、ホース５６の直径５８はマイクロピペット５０の直径 ６０より小さい。従って、被覆用混合物を内壁４８上に吹き付けるために、ノズ ル５４、およびホース５６の一部をマイクロピペット５０の内側に配置すること ができる。これらの目的のために、装ｆｔ５６は中空であり、装置５６の内腔は 試薬３８を含有する被覆用混合物の供給源６２と流体連絡している。供給源６２ は空気により加圧しうる密閉式層めであってもよい（図示されていない）、ある いは供給源６２をポンプ５１（図６に模式的に示される）により作動させて、試 薬３８を含有する被覆用混合物をホース５６およびノズル５４の孔５２から押し 出すことができる。内壁４８上に吹き付けられた試薬３８を含有する被覆用混合 物が蒸発するのに伴って、均一な被膜組成物の層が内壁４８上に析出する。マイ クロピペット５０の内径６０がマイクロピペット５０内に注入された液体を保持 するのに必要な毛管作用を確立するのには大きすぎる場合、または被覆用混合物 が毛管作用を生じるのには粘稠すぎる場合は特に、図６に示す方法は有用である 。

最後に図７は、マイクロピペット６６の内壁６４を接着剤液１１１６８で被覆し うろことを示す。接着剤液’Ｍ６８をマイクロピペット６６に注入して内壁６４ に付着させるか、または内壁６４に吹き付けることができる。次いで、試薬３８ を含有する乾燥粉末状、顆粒状または液状の被覆用混合物をいずれか適切な手段 でマイクロピペット６６の内腔７０に導入することができる。試薬３８を含有す る被覆用混合物の一部が被ｌＸ６８に付着するであろう。次いで被膜６８に付着 していない過剰分を内腔７０から吹き出し、抜き出し、または蒸発させることが できる。

重要なことは、好ましくは被膜６８が、分析のためにマイクロピペット６６に導 入される試料溶液と分析の目的に関して相互作用しない不活性材料であることで ある。

最後に図２Ｃは、複数の試薬“パッド”　３８ａ、３８ｂ、３８ｃを内壁２４上 に析出させて、試料溶液２８中の数種の化合物とそれぞれ反応させうろことを示 す。試薬−物質２８のコンプレックスそれぞれを前記の方法で分析して、溶液中 に試薬が溶解した試料溶液２８の組成を判定することができる。

被覆された管への試料溶液の導入および試料溶液の分光分析のためのその使用マ イクロピペット１０の使用法を述べる際には、図１．２Ａおよび２Ｂを参照する 。ｌｍ２Ａに示すように、マイクロピペット１０の内壁２４をまず試薬３８で被 覆する。次いで試料溶液２８をマイクロピペット１０の内腔２６に導入する。

被膜組成物中の試薬の少なくとも一部が試料溶液に溶解し、化学的または物理的 相互作用を含めた何らかの様式で溶液２８中の化合物と相互作用して、結合して いない試薬および化合物と異なる特定の吸光特性または発光特性を有するコンプ レックスを形成する。ここに示す目的のために、被膜組成物中の試薬３８により 溶液２８中の選ばれた化合物とコンプレックスを形成し、得られる溶液の電磁的 相互作用特性を分析してその試薬が結合する溶液中の化合物を検出、同定または 定量すると解される。たとえば試薬が色素である場合、透明なマイクロピペット １０を視覚的に観察し、溶液２８中の特定の化合物が内腔２６内の試薬と相互作 用して結合した際に、溶液２８がどの色を変化させるかを判定することができる 。

観察された色の変化を周知の原理に従って試料溶液２８中の化合物の濃度と相関 させることができる。

他方、マイクロピペットの単なる視覚的検査ではなく分光測定法を採用して、試 料２８の組成をより精確に測定することができる。試料溶液２８中の化合物の濃 度を比較的精確に測定することが望ましい場合、マイクロピペット１０に試料溶 液２８を充填し、次いで光源１６からの光の通路にあるアダプター１２内に装入 する。試薬が蛍光性であるか、またはそれが試料溶液２８中の化合物と結合した 際に蛍光性溶液を生じる特定の用途については、光源１６および検出器１８を含 む分光計は蛍光分光計である。試料溶液は光源１６からの光が溶液の分子と相互 作用するのに伴って蛍光を発する。この蛍光が検出器１８により受容され、次い で周知の分光学の原理により試料溶液２８中の特定の化合物の濃度との相関関係 がめられる。あるいは、試料溶液２８中のある化合物が特定の試薬と相互作用し て、特別な吸光特性を有するコンプレックスまたは他の生成物を生成し、従って 分光測光法を採用してより適切に分析することができる。これらの場合、マイク ロピペット１０を吸光分光光度計に装入し、周知の分光測光法の原理により試料 溶液を分析する。

以下の実施例は説明のために示したにすぎず、本発明の範囲を限定するためのも のではない。

実施例 ２５ｍ１の水および４０ｇの蔗糖を混合することにより、毛管の被覆に用いる組 成物を調製した。Ｈ３３２５８と表示されるヘキスト色素を、この混合物に添加 して、最終濃度的１００μｇ／ｍｌとなした。毛管を保持リグに装入し、上記組 成物を毛管に導入した。注射器を用いて、毛管の１端約４ｍｍを空で残した状態 で管を充填した。被覆溶液を予め充填した皮下注射針を備えた第２の注射器の近 くに、管の空の端を配置した。針を管に挿入して管内の空の空間を充填し、注射 器を真空システムに接続した。約−５０から約−１００ｍｍＨｇの負圧を付与し て管から過剰の被覆溶液を取り出した。次いで約１分間、管から空気を抜き出し て被膜を毛管の内面上で乾燥させた。

被膜が乾燥したのち、毛管を将来使用するために保存し、または分光分析のため にＤＮＡもしくはＲＮＡを含有する試料溶液を導入することができる。試料溶液 がいずれか適切な手段で被覆毛管に導入され、ＤＮＡまたはＲＮＡの濃度を定量 的に測定するのに十分な量が５−１５秒の遅延ののち試料溶液に溶解する。

ここに示し、詳述した特定の被膜は十分に前記の目的を達成し、利点を与えるこ とができるが、これは現在好ましい形態の例示にすぎず、請求の範囲の記載以外 はここに示した詳細な構造または設計に限定されるものではない。

当業者には変更をなしうろことが自明であり、本発明は請求の範囲のみによって 限定されるものとする。

国際調査報告 フロントページの続き （７２）発明者　ペラニッチ、ラリ−・スティーヴンアメリカ合衆国カリフォル ニア州９２１３１゜サン・ディエゴ、う・コリナ・ロード

Claims (20)

【特許請求の範囲】
1. １．容器に導入された試料溶液中の化合物または化合物類の存在を検出し、また は量を定量するのに特に適した容器において、電磁スペクトルの少なくとも一部 に対して透明である中空管；および該管の内壁上に析出した被膜組成物 を含み、 該被膜が試薬１種または２種以上および結合剤を含有し；該結合剤が、管に試料 溶液を充填するのに十分な期間、管に導入された試料溶液中への試薬の溶解を遅 延させる化合物または化合物混合物であり；該試薬（類）が壁面に可逆的に結合 し、溶液中の化合物とコンプレックスを形成し、これにより管壁を透過した電磁 線で照射された際にコンプレックスが電磁線を吸収または放出するものであり； そして被膜中の試薬の量が、溶液中の化合物に定量的に結合するのに、またはそ れらの化合物を検出しうるのに十分なものである、容器。
2. ２．分光計に取り付けるのに特に適しており、容器に導入された試料溶液中の化 合物または化合物類の存在を検出し、または量を定量するために用いられる容器 において、 分光計により放出および検出される電磁スペクトルの少なくとも一部に対して透 明であり、かつ分光計に取り付けることができ、これにより光が管壁を透過する 中空管；および 該管の内壁上に析出した被膜組成物 を含み、 該被膜が試薬１種または２種以上および結合剤を含有し；該結合剤が、管に試料 溶液を充填するのに十分な期間、試料溶液中への試薬の溶解を遅延させる化合物 または化合物混合物であり；核試薬（類）が壁面に可逆的に結合し、試料溶液中 の１種または２種以上の化合物と特異的に相互作用してコンプレックスを形成し 、これにより分光計によって放出される管壁を透過した電磁線で照射された際に コンブレックスが電磁線を吸収または放出するものであり；そして被膜が分光計 により化合物を検出しうるのに十分な量の試薬を被膜中に含有する、容器。
3. ３．管がマイクロピペットまたは毛管である、請求の範囲第１項または第２項に 記載の容器。
4. ４．被膜中の試薬が、ローリー試薬、ビウレットＣＵ２＋、クマシー・ブリリア ント・ブルー、ヘキスト色素、エチジウムホモダイマー、エチジウムプロミド、 フルオレスカミンおよびルシフェラーゼよりなる群から選ばれる１種または２種 以上の試薬である、請求の範囲第１項または第２項に記載の容器。 ４．結合剤が、蔗糖、多糖類、ゼラチン、ポリアクリルアミドおよびアガロース よりなる群から選ばれる１種または２種以上の成分を含有する、請求の範囲第１ 項または第２項に記載の容器。
5. ５．結合剤が、蔗糖、ゼラチン、または蔗糖とゼラチンの混合物である、請求の 範囲第１項または第２項に記載の容器。
6. ６．分光計が分光光度計または分光蛍光計である、請求の範囲第１項または第２ 項に記載の容器。
7. ７．試料溶液中の化合物または化合物類がバイオポリマーよりなる群から選ばれ る、請求の範囲第１項または第２項に記載の容器。
8. ８．バイオポリマーがＤＮＡ、ＲＮＡ、複合炭水化物または蛋白質である、請求 の範囲第１項または第２項に記載の容器。
9. ９．結合剤が壁面上において壁面と試薬の間に析出した、請求の範囲第１項また は第２項に記載の容器。
10. １０．結合剤および試薬が壁面上に析出させる前に混合された、請求の範囲第１ 項または第２項に記載の容器。
11. １１．容器に導入された試料溶液中の複数の化合物の存在を検出し、または量を 定量するのに特に適した容器的おいて、電磁スペクトルの少なくとも一部に対し て透明である中空管；および該管の内壁上に析出した被膜組成物 を含み、 該被膜が複数の試薬を含有し、これらが試料溶液中の１種または２種以上の化合 物と特異的に相互作用して、電磁線を吸収または放出するコンプレックスを形成 するものであり； 各試薬が壁面上の別個の離れた位置に析出しており、かつ試料溶液の導入に際し て壁面に結合した状態を維持する、容器。
12. １２．請求の範囲第１項、第２項または第１１項に記載の容器の被覆法において 、 １種または２種以上の試薬を含有する被覆用混合物を容器に導入し；そして容器 を蒸発条件下に置き、これにより被覆用混合物が容器の内壁上に被膜組成物を形 成する ことを含む方法。
13. １３．被覆用混合物が、被覆用混合物を容器の内壁に吹き付けることにより、ま たは容器に充填することにより導入される、請求の範囲第１２項に記載の方法。
14. １４．被覆用混合物を導入する前に、容器の内壁に結合剤が付与される、請求の 範囲第１２項に記載の方法。
15. １５．被覆用混合物が結合剤を含有する、請求の範囲第１２項に記載の方法。
16. １６．被覆用混合物が吹き付けにより容器に導入される固相混合物である、請求 の範囲第１４項に記載の方法。
17. １７．蒸発条件が、容器を熱処理すること、または容器を減圧下に置くことを含 む、請求の範囲第１４項に記載の方法。
18. １８．試料溶液の分析法において、 請求の範囲第１項、第２項または第１２項に記載の容器に組成物を導入し；入射 電磁線を容器内へ向け；そして 容器からの、または容器を透過した電磁線を検出し、その際容器は入射電磁線お よび透過電磁線の双方に対して透明であることを含む方法。
19. １９．試薬が色素である、請求の範囲第１８項に記載の方法。
20. ２０．容器が分光計に取り付けられた毛管またはマイクロピペットである、請求 の範囲第１９項に記載の方法。