JPH06501199A - 陽イオン帯電変性微多孔質膜 - Google Patents

Abstract

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Description

【発明の詳細な説明】 イ　ン４′−１ 〔技術分野〕 本発明は、親水性と単線水性との両方を有する新規な陽イオン帯電単線水性ポリ エーテルスルホン（Ｃ３ＨＰ）に間する。Ｃ５ＨＰ膜は、流体のＰ通、巨大分子 移動材、電気泳動、プロッティング（ｂｌｏｔｔｉｎｇ）法等に有用である。

これに関し、Ｃ３ＨＰ膜は、従来の親水性膜及び疎水性膜に比較して優れた性質 を有し、生物学的分子（ｂｉｏ−ｍｏｌｅｃｕｌｅ）の固定に対する感度、剥取 り（ｓｔｒｉｐｐｉｎｇ）による生物学的分子の損失が起きないようにすること 、及びハイブリッド形成・剥取り工程の反復回数に関して実質的に一層よいもの になっている。特に本発明は、医学、遺伝子、及び生化学の研究、及び食物、ワ イン、化粧品、バイオテクノロジー５医薬、及び電子工業で用いられている種想 の陽イオン帯電変性微多孔質（■１ｃｒｏｐｏｒｏｕｓ）膜媒体に関する。

〔背景技術〕

微多孔質膜は、通常狭い気孔孔径分布を有する開ロスボンジ状形態を有する肉薄 の構造体として定義されている。微多孔質膜の平均気孔孔径は、０．０１μｌ〜 １０Ａｔｌの範囲にあるのが典型的である。慣用的に微多孔質膜は液体及び基体 から塵及びバクテリアの如き微細な粒状物質を除去するのに用いられている。微 多孔質膜は種々の機構により浄化を達成することができる６例えば、膜の気孔孔 径より大きな全ての粒子を物理的に篩い分けることにより微多孔質膜により粒子 を保持することができる。この機構の場合、濾過効率は粒子と膜の気孔孔径との 相対的大きさにより支配される。

微多孔質膜が懸濁粒状物質を除去することができる別の機構は、動電学的捕捉機 構である。これは膜の外面及び内面に適当なζ電位を賦与することにより達成さ れる。

ζ電位は、固体表面の電荷により正又は負のいずれかになる。一般にＰ通により 除去される殆どの懸濁粒子は負のζ電位を有する。従って、そのような粒子は正 のζ電位を有する固体表面により容易に吸着又は吸引される。

このことに基づき、微多孔質膜の有効表面に正のζ電位を与えることにより、そ の膜の粒子捕捉能力を著しく改良することができる。このことは、粒子の大きさ が膜の気孔孔径よりも遥かに小さい粒状物の場合でも当て嵌まる。その結果、膜 を通る流体の流量をこの概念を用いることにより大きく維持することができ、然 も、その膜による粒子の捕捉を、膜の気孔孔径規格によって示されるものよりも 遥かに効率的に行うことができる。

陽イオン帯電膜を用いて流量を増大し、膜の寿命を長くするために、長い間種々 の方法がとられてきた。例えば、オストライヒエル（０ｓｔｒｅｉｃｈｅｒ　） その他による米国特許第４，００７，１１３号、第４，４７３，４７４号、第４ ，６７３，５０４号、及び第４．７０８．１１０３号明細書には、帯電変性フィ ルターを使用すること及びその製造方法が記載されている。バーンズ（Ｂａｒｎ ｅｓ　＞その他による米国特許第４．４１３．４７５号明細書にも、陽イオン帯 電微多孔質膜及びその使用方法が記載されている。ボール（Ｐａｉｌ）その他に よる米国特許第４．５２３．９９５号明細書及びチュー（Ｃｈｕ　＞その他によ る米国特許第４．６０４，２０８号明細書には、帯電変性微多孔質膜の別の例が 記載されている。

電流を適用することにより蛋白質を分離することができることは、約６０年前に 報告されている。これらの初期の実験は、液体Ｍ’ｌｌ系で完全に行われており 、蛋白質は分離性の悪い濃度勾配として現れていた。それ以来、種々の多孔質材 料（例えば、紙及びゲル）が蛋白質の電気泳動のために用いて成功を収めており 、解像力の著しい改良をもたらしてきた。これらの中で最も有名なものは、恐ら くポリアクリルアミド　ゲルの導入である。蛋白質変性剤として硫酸ドデシルナ トリウムと一緒に用いると、ポリアクリルアミドゲルを通る蛋白質の電気泳動に より、種々の分子量の蛋白質の高い解像度を与える。

ゲル中で電気泳動された生物学的分子（例えば、蛋白質、核酸、炭水化物）は、 種々の色素により染色することができる。既知の標準に対するゲル中のそれらの 位置により、生物学的分子の分子量及び等電点の如きそれら分子の成る特徴を確 定することができる。従って、生物学的分子についての物理化学的情報を与える ため、主に電気泳動が用いられている。

生物学的分子を微多孔質膜に転移させ、固定する方法は、与えられたプローブに 対する免疫学的又は配列に基づく反応性を基にして分子を同定することが必要に なったことにより開発されてきた。ゲル中の生物学的分子を免疫学的に検出する ための方法は存在しているが、微多孔質膜を使用することは次の利点を与える： １）　検定時間が短い一生物学的分子はゲル中で隔離されるのではなく環境に曝 されるので、プローブによるインキュベート時間及び洗浄時開が著しく減少する 。

２）　取り扱いの容易さ２微多孔質膜はゲル、特に寒天又はアガロースから作ら れたものよりも耐久性がある。

３）　試薬の減少−微多孔質膜の体積はゲルの体積より遥かに少さい。従って、 微多孔質膜と相互作用させるのに必要な試薬の体積は、ゲルの場合に必要になる 体積よりも遥かに少ない。

上で挙げた特許の各々では、濾過用に帯電変性膜を使用することに限定されてい る。しかし、そのような帯電変性微多孔質膜は、巨大分子転移用に用いることが できく例えば、ＤＮＡサザン法）、既にゲルショニ（ＧｅｒＳｈｏｎ　ｉ　）に よる米国特許第４，５１２４９６号及び第４，６０１，８２８号及びプルスカル （Ｐｌｕｓｋａｌ　）その他による欧州特許出願０３４７７５５で示唆されてい る。

「プロッティング」としても知られている転移法は、ここではゲルマトリックス から物理的に生物学的分子を微多孔質膜へ移動させ、その上にそれら分子を固定 することに含まれる工程としてここでは定義する。ゲルマトリックスには、寒天 、アガロース、ポリアクリルアミド、又はそれらの組合せが含まれる。簡単に述 べると、生物学的分子を含有するゲルを微多孔質膜と直接接触させて置く。電流 又は流体の流れによりゲルから膜の方へ分子を移動させる。流体の流れによる方 法による移動は受動的に（毛細管で）行われるか、又は強制圧力により行うこと ができる。流体は、加圧又は減圧（真空）により強制的に流すことができる。

ここで用いられる用語「巨大分子転移」とは、核酸及び蛋白質の如き生物学的巨 大分子を電気泳動ゲルから成る種の固定用マトリックスへ移動させる方法を指す 。特に重要なのはＤＮＡプロッティングの如き核酸プロッティングである。今ま で種々のＤＮＡプロッティング法が開発されている。それらの中で最も一般的な のは「サチン法」と呼ばれるものであり、その方法ではＤＮＡ断片をクロマトグ ラフ法により分離し、次にゲル中にまだ存在する間に変性する。ゲルを中和して 吸引紙上に置き、それらの吸引紙を緩衝液槽中に入れた緩衝液と接触させる。

次にプロッティング膜をゲルの上に置＜、Ｍ漬液がゲル中に流入するとＤＮＡが 溶離され、プロッティング膜に結合し、それによってＤＮＡ断片模様がプロッテ ィング膜へ転写される。断片模様は特異的結合断片と相補的なラベルした核酸を 用いてハイブリッド形成法により最終的に検出することができる。

現在入手できるＤＮＡプロッティング膜は、ニトロセルロース、帯電ナイロン、 帯電ポリニフッ化ビニリデン、及びジアゾ含有化合物を用いて誘導された活性化 紙に限定されている。商業的帯電プロッティング膜には二種類あり、一つは疎水 性であり、他方は親水性であるｌ初のものの倒は、欧州特許上Ｍ０．３４７，７ ５５に記載されているように、親水性又は疎水性ＰＶＤＦｉｌＫ基体上に簡単全 体上法により形成された疎水性帯電ＰＶＤＦ膜である。

第二のものの例は、米国特許第４，５１２．８９６号及び第４．６０１．８２８ 号明細書に記載されているように、親水性膜を電荷を有する重合体の溶液で適当 な条件下で処理することにより製造された親水性帯電膜である。例えば、その技 術では膜基体の主要な重合体マトリックス上に直接帯電重合体を被覆しており、 膜基体中に存在する添加物との反応により生ずる帯電とは何の関係ものない。

〔発明の開示〕

本発明は、上で示したように、親水性及び半疎水性を有する陽イオン帯電変性微 多孔質膜及びその製造方法に間する。そのような微多孔質膜は、夫々少なくとも 一種類の重合体添加物を含有する基体重合体からなる微多孔質膜基体を有する。

腹基体は、その膜の内側及び外側微多孔質表面に露出した高分子量重合体を含有 する第一帯電変性剤で後処理することにより陽イオンを帯電するように変性する 。露出した変性剤は膜基体に化学的にグラフトされ、従って、得られる膜は永久 的に帯電している。

例えば、本発明の代表的なＣ３ＨＰＩＩＩは、典型的にはハイブリッド形成・剥 取り工程を３回繰り返しした後でも、転移結合ＤＮＡの５５％を保持し、７回の ハイブリッド形成・剥取り工程繰り返し後、転移結合ＤＮＡの４４％を維持する ことができることをデーターは示している（第８図参照）０重合体添加物は、後 に記述するように、第一帯電グラフト化部位になると考えられる。

好ましい態様として、このような第一帯電変性微多孔質膜を、第二帯電変性剤と 反応させることにより更に帯電させる。

本発明は、Ｃ５ＨＰ膜に適用された試料基体（例えばゲル）を有するプロッティ ング組成物；生物学的分子を、例えば直接又はゲルから、第−帯電又は第−及び 第二帯電変性膜を有する固定用マトリックスに移動させる方法；マトリックスに 固定した分子をハイブリッド形成・剥取り工程の何回もの反復中維持する方法； 等にも関する。

図面の簡単な説明 第１図は、帯電ナイロン膜〔デュポン社のジェネスクリーン・プラス（Ｇｅｎｅ ｓｃｒｅｅｎ　Ｐｌｕｓ　）　（登録商標名）〕を帯電ポリエーテルスルホン膜 （後の例９に記載するようにして作られたＣ５ＨＰ膜）と、ＤＮＡプロッティン グで各層について最適の条件を用いて比較したオートラジオグラムである。

第２図は、帯電ナイロン膜（ジェネスクリーン・プラス）をＣ３ＨＰ膜と、サイ ン法による転写条件を用いて比較したオートラジオグラムである。

第３図は、帯電ナイロンＲ（ジェネスクリーン・プラス）をＣ３ＨＰ膜と、ＤＮ Ａハイブリッド形成／′再ブロービング（ｐｒｏｂｉｎｇ＞に適用して比較した オートラジオグラムである。

第４図は、エージングしてないＣ３ＨＰ膜とエージングしたＣ３ＨＰ膜とをサイ ン法による性能で比較したオートラジオグラムである。

第５図は、帯電親水性膜（ジェネスクリーン・プラス）、帯電疎水性膜〔ミリボ アー社（ｌｌｌｉｌｌｉｐｏｒｅ　Ｃａｒｐ、）のイモピロン（ｒｉｍｏｂｉｌ ｏｎ）　Ｎ　（登録商標名）〕、及びＣ３ＨＰ膜の夫々の性能を、夫々ＤＮＡの 毛細管（パネルＡ）及び真空（パネルＢ）による転移で比較したオートラジオグ ラムである。

第６図は、帯電親水性膜〔アメルシャム社（ＡｍｅｒｓｈａｍＣｏｒｐ、　）の ハイボンド（）ｌｙｂｏｎｄ　）　Ｎ　（登録商標名）〕、帯電疎水性膜（イモ ピロンＮ）、及びＣ３ＨＰｉによる夫々のＤＮＡ保持性を、５回のハイブリッド 形成・剥取り工程反復後に示すサイン法によるオートラジオグラムである。

第７図は、帯電親水性膜（ジェネスクリーン・プラス）、帯電疎水性膜（イモピ ロンＮ）−及びＣ３ＨＰＩＩ！の性能の、Ｅ、　ｃｏｌｉ蛋白質のウェスターン 法による転移及び固定及びその後の、ホースラディツシュペルオキシダーゼ／４ −クロロ用−ナフトール系を用いた免疫染色によるオートラジオグラムである。

第８図は、ハイブリッド形成・剥取り工程反復によるＣ５ＨＰ膜のＤＮＡ保持性 を示すグラフである６〔本発明の詳細な記述〕 本発明の陽イオン帯電基体は、微多孔質膜〔ここでは時々陽イオン性親水性・単 線水性徴多孔質膜、又は陽イオン性半疎水性ポリエーテルスルホン（ＣＳＨＰ） 微多孔質膜と呼ぶ〕からなり、それは正味の正電荷を有する固定された形式電荷 基により帯電変性されている。

これに関して、慣用的親水性及び疎水性膜のものに対して本発明の典型的な膜の 親水性膜及び疎水性膜は、平坦材料の濡れ及び毛細管現象による濡れ（水吸引分 析）法により決定された。イモピロンＮ（ミリボアー社）の如く現在「疎水性」 と呼ばれている帯電膜は、水（表面張力＝７２ダイン／ｃｍ）又は２３％のＮａ Ｃ１溶液（８１ダイン／ＣＩ）のいずれにも濡れない。ハイボンドＮ（アメルシ ャム社）及びジェネスクリーン・プラス（デュポン社）の如き「親水性」として 分類されている膜は両方の液体に濡れる。本発明の陽イオン帯電ポリエーテルス ルホン膜は水に濡れることができ、従って、親水性であると分類されているが、 ２３％のＮａＣｌでは濡れず、従って、半疎水性として分類されている（下の表 ＩＩ’照）。

本発明の膜の単線水性度は水吸引分析で一層明らかになる。試験で用いられた二 種類の親水性膜は、４〜５秒／１３ｉｕ＋の吸引速度を持つのに対し本発明の膜 は典型的な場合には２２分／Ｉ３ｘｗの吸引速度を有する。

表■　疎水性、親水性、及び単線水性膜の浸漬及び吸引濡れ性 膜　浸漬濡れ性（秒）　吸引濡れ性（分）±巴２３％ＮａＣｌ　Ｈ２０ 疎水性１　ｎｗ　ロＩＩ　Ｑ豐 親水性１’　＜１　１００　５ 親水性２°　〈１　１　４ 半疎水性’　＞　１　ｎｗ　２２ ｎｗ　濡れない ａ　イモピロンＮ（ミリボアー社） ｂ　ジェネスクリーン・プラス（デュポン／ＮＥＮ）ＣハイボンドＮ（アメルシ ャム社） ｄ　Ｃ５ＨＰ膜 転移／固定用に現在市販されている帯電膜は、エージングと共に感度及び再ブロ ービング性能が低下することを示している。その結果、殆どの製造業者は、その 膜を購入した日から１〜２年以内に使用するように奨めている。これに対し本発 明の陽イオン帯電ポリエーテルスルホン膜によるＤＮＡ結合実験は、時間と共に 性能の向上を示すのが典型的である（第４図）。本発明の新しく製造された膜の ゲル転移及び再ブロービング性能と比較することにより、それらの結果は、室温 で８ケ月、５０℃で６力月保持した同じ膜の性能が向上したことを示している。

ここで用いられる用語「微多孔質膜」とは、膜が供給水溶液からの溶解した蛋白 質又は塩を保持又は反発しないような気孔孔径範囲を有する膜を意味する。微多 孔質膜は、０．０５μ屑〜ｌＯμｌの範囲の平均気孔孔径及び１２０ｐｓｉより 低い水気泡流出点（ＷＢＰ）を有するのが好ましい。

本発明で記載する陽イオン帯電微多孔質腹の製造は、後処理法に基づいている。

後処理に適した膜基体は、少なくとも一種類の非浸出性重合体添加物（好丈しく は微多孔質膜中の主要マトリックス重合体に対し少なくとも２重量％）を含まな ければならない。その添加物は親水性を向上させ、エポキシ基く又はエポキシ基 の前駆物質）と潜在的に反応する官能基を有する。適当な基体膜の好ましい例は 、米国特許第４，９００．４４９号明細書に記載されている、次の式を有するポ リエーテルスルホンからなる膜である： （好ましくは式中、ｎは５０〜１５０の整数である）。この膜は非浸出性の固有 の湿潤剤として好ましい添加剤ポリビニルピロリドン及びポリエチレングリコー ルを含有する。

本発明の化学的原理は、膜基体中の重合体添加物（一種又は多種）に第一帯電変 性剤を化学的にグラフトすることに基づいている。第一帯電変性剤は、エポキシ 基及び（又は）エポキシ基の前駆物質、又はヒドロキシ及びアミン基及び他の直 接反応する基及び潜在的に反応性の官能基と化学的に反応することができる他の 官能性基を含まなければならず：エレクトロフィル（ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｉｌｅ ）含有化合物と化学的に反応し、正ｔ？ｔｉｉ’を与えることができるポリアミ ンを含まなければならない、５Ｃ−８６Ｘ（イリノイ州シカゴのモルトン・チオ コル（Ｍｏｒｔｏｎ−Ｔｈｉｏｋｏｌ　）の商標名〕として市販されているポリ エチレンイミン−エピクロルヒドリン変性樹脂は、好ましい第一帯電変性剤であ る。この樹脂は下に示す化学構造■を有する。

（式中、Ｒは独立に水素、又はポリアミン原の連続を表し、Ｒ′は−○Ｈ又は− ＣＩを表す）。本発明で用いられる好ましい第一帯電変性剤は、水中で適当な粘 度を有する水溶性重合体、一層好ましくは水中で１７％の濃度で約ｌθ〜１００ センチポアズの範囲の粘度を有する水溶性重合体である。好ましい第一帯電変性 剤と同様な化学的性質を有する他の重合体も用いることができる。

好ましい帯電変性剤中のプロトン化したアミノ基は固定された四級化アミン基で はなく、環境ｐＨの変動に敏感なので、第二帯電変性剤（第一帯電変性剤と化学 的に反応することができる固定された形式正電荷及び官能基を有する）は、好ま しい態様に従い帯電容量を増大し、最終的陽イオン帯電膜のｐＨ依存性を低下す るために添加することができる。好ましくは第二帯電変性剤は、ａ）適当な分子 量（例えば、５５，０００）のポリ塩化ビニルベンジルと、トリアルキル（又は トリアリール）ホスフィンとの反応により合成された部分的にホスフィン化され たポリ塩化ビニルベンジル、又はｂ）水中で適当な粘度を有する四級化ポリ（ジ メチルアミン−〇〇−エピクロルヒドリン）である。水中で３９％の濃度で４０ ｃｐｓの粘度を有する後者の化学物質は、ニューヨーク州オンタリオのサイエン ティフィック・ポリマー・プロダクツ社（Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ　Ｐｏｌｙｍｅ ｒ　Ｐｒｏｄｕｃｔｓ　Ｉｎｃ、）から市販されている。好ましい第二帯電変性 剤の化学構造■及び■は次の通りである； 〔式中、−１ｎ及びＲ“は、独立に低級アルキル基（好ましくはＣ１−４アルキ ル基）又はアリール基（好ましくはフェニル基）を表す〕、及び （式中、Ｒ′″′は重合体望の連続である）。

前述の第二帯電変性剤と同様な化学的挙動をする他の第二帯電変性剤も本発明で 用いることができる２例えば、固定された形式正電荷基を形成するアンモニウム 、スルホニューム、等の如き部分的にホスフィン化されたポリ塩化ビニルベンジ ル中のホスホニウムイオン以外のイオン物質も本発明に適している。

本発明は、他の好ましい態様として、記載した陽イオン４Ｉ！電変性徴多孔質膜 を製造するための方法で：Ａ、少なくとも一種類の非浸出性重合体添加物で、好 ましくはポリビニルピロリドン及びポリエチレングリコールから選択され、帯電 変性剤の反応性基と直接反応するか又は潜在的に反応する官能基を有し、親水性 を向上させる添加物を含む、好ましくはポリエーテルスルホンである微多孔質膜 基体を与え； Ｂ、前記膜基体を第一帯電変性剤、好ましくは構造式Ｉを有する変性剤と、加熱 （ｂａｋ　ｉｎｇ）を含む手段により反応させ、然も、前記変性剤は前記膜基体 に正電荷を与える量で反応し；そして Ｃ１得られた帯電変性膜を洗浄及び乾燥する、ことからなる製造方法に間する。

本発明は、他の好ましい態様として、工程Ａ及びＢを含み、第一帯電変性剤の官 能基と、その第一帯電変性剤と反応する官能性を有する第二帯電変性剤とを反応 させ、然も、前記第二変性剤は前に述べた如く加熱を含む手段により前記第一変 性剤し反応し、前記第二変性剤は、最終的な形式正電荷の大きさが前記第一変性 剤との反応によるものよりも大きくなるか、又は第一変性剤の環境ＰＨの変動に 対する敏感性が減少するような量で反応し、得られた帯電変性膜を洗浄及び乾燥 することからなる陽イオン帯電変性膜の製造方法からなる。

本発明の陽イオン帯電膜の製造方法は、典型的には、次の工程： １、微多孔質膜を水溶液（又は１０重量％〜３０重量％の比率のエタノール／水 の溶液）、好ましくは３重量％〜７重量％の第一帯電変性剤、０重量％〜６重量 ％の第二帯電変性剤、０．５重量％〜３重量％の水酸化カリウム（ｐＨ＝９〜１ １）、及び０重量％〜２重量％の臭化テトラブチルアンモニウムを含む水溶液中 に充分な時間、例えば数秒間、外囲温度で浸漬し、腹を完全に湿潤させ；２、前 記膜を処理溶液から取り出し、過剰の処理溶液を拭き取り、例えばワイパー棒を 用いて「絞り器」作用により拭き取り、後処理反応を完了させるのに充分な温度 及び時間で加熱しくそれによって、得られた膜が上述の如く単線水性になる）、 好ましくは１１０℃〜１４０℃で２０〜４０分間加熱し； ３、前記膜を好ましくは９０℃の脱イオン水で２０分間洗浄し、最後に好ましく は６０℃〜８０℃で１５〜２０分間乾燥する、 工程を含む。

上記後処理後の微多孔質膜は、元の未処理膜と比較して成る程度の親水性を失い 、単線水性腹として挙動するのが典型的である。

本発明の単線水性膜は加水分解に対し優れた安定性を示す０例えば、それらはエ タノール・ソックスレー抽出に３日間、１２０℃のオートクレーブに４０分間５ 或は脱イオン水中での沸騰に１時間かけた後でも、それらの帯電容量及び膜強度 を維持するのが典型的である。

好ましい膜基体及び好ましい第−及び第二帯電変性剤を用いた上述の好ましい後 処理法の反応機構は、次の如く提案することができるであろう。

最初に、上昇させた温度でアルカリ性条件で、膜基体中に存在する非浸出性ポリ ビニルピロリドンが開環加水分解反応を受け、遊離アミン及びカルボキシル基を 形成し、それらがその場で、エピクロルヒドリン部分から誘導された第一帯電変 性剤のエポキシ基と反応する。同時に、膜基体中に存在する非浸出性ポリエチレ ングリコールのヒドロキシ基も変性剤のエポキシ基と化学的に反応してエーテル 結合を形成する。これらの二つの反応が膜基体に帯電変性剤がグラフトされる結 果を与える。更にアルカリ性条件下での第一帯電変性剤自身の架橋を含む反応と 、第一帯電変性剤と第二帯電変性剤との反応も同時に起きることがある。その結 果、陽イオン帯電膜がこの複雑なグラフト／架橋過程により生成する。上で述べ たことはもっともらしいグラフト機構であるが、それは厳密に証明されているの ではなく、従って本発明はこの理論又は他の理論に限定されるものではない。

この機構により、膜基体中の主要重合体（即ち、ポリエーテルスルホン）はグラ フト反応では何の役割も果たさない。このことは、活性重合体添加物（ポリエチ レングリコール及びポリビニルピロリドン）を含まない重合体混合物から製造さ れた疎水性ポリエーテルスルホン膜を後処理過程で用いた対照実験により証明さ れている。

この結果は、後処理後の膜に検出可能な電荷は存在していないことを明確に示し ている。このことは、膜中に活性添加物が存在することが、本発明に記載した後 処理法を用いて陽イオン帯電膜を製造するのに必須であることを示している。

第二帯電変性剤として四級化ポリ（ジメチルアミン−ｃｏ−エピクロルヒドリン ）を用いた上記方法により製造された陽イオン帯電微多孔質膜は水で濡れる。し がし、部分的にホスフィン化されたポリ塩化ビニルベンジル（その転化反応で化 学量論的比率に基づき、ポリ塩化ビニルベンジルからホスフィン化ポリ塩化ビニ ルベンジルへの転化率を９０％と仮定する）を含有する処理溶液から製造された 帯電膜は、水溶液中に浸漬しても濡れない、従って、これらの後者の膜は（巨大 分子プロッティング用などに使用するような）使用前に、水性溶液又はそのまま でもよい水混和性有機溶媒中で湿潤されなければならない、水混和性溶媒は、ア ルコール（例えば、メタノール、エタノール、又はインプロパツール）の如きど のような適当な水混和性溶媒でもよい。

Ｋ１五羞 次に実施例で行なった試験について記述する。

股λ歴孟芸り 微多孔質膜のためのこの一般的試験は、膜中の最大気孔の測定である。それは空 気圧により水で濡らした膜から水を追い出すことからなる。気孔孔径及びその孔 から水を除去するのに必要な圧力は次の式により関係付けら（式中、Ｐは圧力で あり、θは膜材料と水との液体・固体接触角であり、γは液体・空気界面張力で あり、Ｄは気孔孔径であり、Ｂは定数である） 厳重１ 水流速は与えられた大きさの膜を通過する水の流速であり、一般に与えられた圧 力で水の１００ｚｌ当たりの秒で表される。

Ｌｌ玉１ 正のζ電位を有する層表面は負に帯電した有機色素を吸着する。これを用いて帯 電膜の帯電効率を半定量することができる。

瓜土Ｚ文盗崖１ イオン交換容量は滴定法により帯電膜１ｇ当たりのミリ当量（ｍｅｑ）として決 定される。

１里皿 抽出可能物質の量を、膜を水中で１時間沸騰し、重量減少を測定することにより 決定する。

−一ツクス ラテックス球状物保持性は、微多孔質膜の粒状物除去効率を測定したものである 。簡単に述べれば、充分特徴付けられた粒径を有するポリスチレンラテックスの 単分散懸濁物を真空下で膜によりＰ遇する。次にＰ液の部分を特別な波長でＵ　 Ｖ　−Ｖ　ｉｓ分光光度計により分析する。

±ＩＩＲ上 微多孔質膜の浸漬濡れ性を、外囲温度の液体の表面上に平らに４７ｚｚの膜円盤 を置くことにより決定した。データーは、円盤全体が同一の広がりを持って完全 に濡れるまでにかかった時間（秒）として表す０例えば、く１秒、又は〉１秒。

股監五Ｊ九１ 微多孔質膜の吸引濡れ性を、膜の帯を外囲温度の液体中に垂直に入れ、毛細管作 用により流体が膜を上昇する速度を測定することにより決定した。データーは、 水が１３ｚｇの距離を垂直に上昇するのに必要な時間（分）として表す。

次の実施例は本発明を詳細に例示するものである１次の実施例は本発明を例示す る為のものであるから、本発明をどのような仕方にしろ限定するものと考えては ならない。

〔実施例〕

１−０２　ｌボｉエー−ルスルホン　の　゛ポリエーテルスルホン〔ＩｃＩから 入手できるピクトレックス（Ｖｉｃｔｒｅｘ）　（登録商標名）　７Ｍ５２００ ）　、ジメチルホルムアミド、及びポリエチレングリコール４００を１３：１８ ：６９の比率で混合した。混合物を均一になるまで撹拌し、ガラス又はステンレ ス鋼上に１０〜１２ミルに注型した０次にその重合体溶液を６０〜７０％の相対 湿度の外囲空気に、それが不透明になるまで曝した。膜を水中に浸漬して凝集を 完了し、゛過剰の溶媒を２〜１２時間浸出除去し、最後に７０℃で乾燥した。

得られた膜は瞬間的に水に濡れ、１０’／ｃｚ２のＰｓｅｕｄｏ−ｍｏｎａｓ　 ｄｉｍｉｎｕｔａを処理すると、１００％のバクテリア保持性を示した。膜は次 の特性を持っていた：水泡立ち流出点　５６ｐｓｉ 水流速　１０ｐｓｉで２２秒／　９．６２ＣＪＩ２−１００ｚ１燃焼法により得 られた膜の元素分析は、膜中にジメチルホルムアミドは存在しないことを示して いた。溶解した膜の核磁気共鳴は、それが５重量％のポリエチレングリコール４ ００を含むことを示していた。エタノールを用いた２日間のソックスレー抽出後 、この膜はその親水性を失った。そのような溶解した膜の核磁気共鳴は、それが ２重量％のポリエチレングリコール４００を依然として含有していることを示し ていた。

２−０，２　ｌ　ボ１エー−ルスルホン　の　゛ポリエーテルスルホン、ジメチ ルホルムアミド、及び炭酸水素ナトリウムを１３．３　：　５３．４　：　３３ ｊの比率で混合した０次に例１に記載したのと同様な手順により膜を作った。し かし、そのようにして得られた膜は完全に疎水性であった。膜の特性は次の通り であった：水泡立ち流出点會　１６ｐｓｉ 水流速自　ｆＯｐｓｉで１２０秒／　９．６２ｃｚ”　−ｔ００ｚｌ會膜試料を 、水泡立ち流出点及び水流速試験の前に予めエタノールで濡らしな。

３−０．２　ｌの　に　のポリエー−ルスルホ乙１色１１ ポリエーテルスルホン、ポリビニルとロリドン（オハイオ州シンシナチのＧＡＦ コーポレーションから入手できる）、ポリエチレングリコール、ジメチルホルム アミドを１３・０．２　：　６６．１１　：　２０の比率で混合することにより 注型用溶液を調製した０例１に記載した如く膜を注型し、固化した。そのように して得られた膜は自然に水濡れ性であった。エタノールを用いた３日間のソック スレー抽出、３０分間の１００℃水沸騰、又は４５分間の１２１℃でのオートク レーブにかけた後でも、膜はその瞬間的水濡れ性及び性能を失わなかった。腹の 性能は次の通りであった：水泡立ち流出点　’Ｊｐｓｆ 水流速　１０ｐｓｉで２１秒／　９．６２ｃｍ２−１００ｉ１１０’／ｃｚ２の Ｐｓｅｕｄｏｒｍｏｎａｓ　ｄｉｍｉｎｕｔａを処理すると、膜は１００％のバ クテリア保持性を示した。そのような膜の元素分析は、それが１％のポリビニル ピロリドンを含むこことを示していた。

４−ａ、２１１の本　に　の　の　造 ポリエーテルスルホン、ポリビニルピロリドン、ポリエチレングリコール、及び ジメチルホルムアミドを１３：　２　二６５：　２０の比率で混合することによ り重合体注型用溶液を調製した１例１に記載した如く膜を注型し、固化した。そ のようにして得られた膜は瞬間的に水濡れ性であり、エタノールを用いた３日間 のソックスレー抽出後でも、その親水性及びその膜の性能は変化しながった。

膜の元素分析は、それが例３で製造した膜よりも約１％高い２％のポリビニルピ ロリドンを含むこことを示していた。

５−０．４５　ｌの　に　のポリエー−ルスル五Ｚ鳳Ｌ１１ 例３に記載した方法と本質的に同じ方法で親水性ポリエーテルスルホン膜を製造 した。但しポリニアチルスルホン、ポリビニルピロリドン、ポリエチレングリコ ール、ジメチルホルムアミドを１３　：　０．２　：　５ｇ、＋１　：　２ｇの 比率で用いて注型用溶液を調製した。そのようにして製造した膜は次の特性を持 っていた： 水泡立ち流出点　３３ｐｓｉ 水流速　１０ｐｓｉ″ｒｌ１秒／　９．６２ｃ肩’　−１００ｚｆ１００％のバ クテリア保持性を示した。

６−　にホスフィン　したボ１塩　ビニルベン区に皿に１１ 機械的撹拌器及び凝縮器を具えた＋０００ｚｉ＋丸底フラスコに、７６ｇのポリ 塩化ビニルベンジル樹脂（０，５当量）、１１８ｇのトリフェニルホスフィン（ ０，４５当量）、及び６００ｚｌのジメチルホルムアミドを入れた。この溶液を ７５℃で１６時間撹拌した。冷却後、溶液を激しく撹拌しながら多量のアセトン 中に注入し、得られた重合体を沈澱させた。単にＰ遇することにより粉末重合体 を分離し、アセトンで洗浄し、最後に真空中４０℃で２日間乾燥した。

得られた樹脂は水に溶解しなかった６しかし、それは純粋のメタノール又は１０ ％メタノール・水混合物中に容易に溶解した。

７−０２　肩　イ　ン　−の　造 例３で製造した膜を、４％のポリエチレンイミン−エピクロルヒドリン（モルト ン・チオコルから入手できる５Ｃ−８６Ｘ）、２％の水酸化カリウム、及び１％ の臭化テトラブチルアンモニウムを含有する水溶液中に数秒間入れ、次にその処 理溶液から取り出した。過剰の重合体溶液を絞り棒を用いて膜から拭き取った、 次にその膜を通風炉中で１４０°Ｃで２０分間加熱した。加熱後、膜を９０℃の 脱イオン（ＤＩ）水で２０分間洗浄し、最後に７０℃２０分間乾燥した。そのよ うにして製造した膜は、帯電した半疎水性ポリエーテルスルホン（Ｃ５ＨＰ）膜 であり、陽イオンの！Ｆ＠は陰イオン性色素吸着により証明された０色素吸着容 量、及び水泡立ち流出点及び水流速の如き腹の性質は、エタノール・ソックスレ ー抽出及びオートクレーブにかけた後でも変化しなかった。

８−０．２　Ｋ　イ　ン″−の　遣 例３で製造したポリエーテルスルホン膜を、２％のポリエチレンイミン−エピク ロルヒドリン（モルトン・チオコルから入手できる５Ｃ−８６Ｘ）、２％のポリ （ジメチルアミン−ｃｏ−エピクロルヒドリン）（サイエンティフィック・ポリ マー・プロダクツ社がら入手できる）、２％の水酸化カリウム、及び１％の臭化 テトラブチルアンモニウムを含有する水溶液中に数秒間浸漬し、膜を完全に濡ら し、次にその処理溶液から取り出した。過剰の樹脂溶液を拭き取り棒を用いて「 絞り器」作用により除去した１次にその膜を通風炉中で１４０℃で１５分間加熱 した。硬化後膜を９０℃の脱イオン水で２０分間洗浄し、最後に７０℃で１５分 間以上乾燥しな、そのようにして製造した帯電した半疎水性ポリエーテルスルホ ン（Ｃ８ＨＰ）膜は、陽イオン電荷が存在する有力な証拠を示していた。

そのように製造された陽イオン帯ｔＭの特性（水泡立ち流出点、水流速、色素吸 着、その他）は、エタノール・ソックスレー抽出、オートクレーブ処理、及び沸 騰処理の後でも変化せず、従って、膜は永久的に帯電していることを示していた 。

９−０．４５１　イ　ン”−の　゛６ 例８に記載したのと同じやり方で後処理法を行なった。

但し例５で製造した０、４５μｌのポリエーテルスルホン膜を膜基体として用い 、対応するＣ５ＨＰ膜を与えた。

１０−０．２　ｌ　イ　ン帯−の　゛表銅３で製造したポリエーテルスルホン膜 基体をこの例では用いた。更に、エタノール・水混合物（重量比２０：８０）を 、処理溶液を調製する溶媒として用いた。処理溶液は２％のポリエチレンイミン −エピクロルヒドリン、２％の部分的にホスフィン化したポリ塩化ビニルベンジ ル、２％の水酸化カリウム、及び１％の臭化テトラブチルアンモニウムからなっ ていた。実際の後処理工程は、例８に記載したのと同じやり方で行い、対応する Ｃ５ＨＰ膜を与えた。

１１−０．４５　ｌ　イ　ン　−　の　゛例１Ｏに記載したのと同じ条件で後処 理を行なった。但し例５で製造した０、４５μのポリエーテルスルホン膜を膜基 体として用い、対応するＣ５ＨＰ展を与えた。

Ｉ２−　イ　ン　１　るｔ・めに　に２゛１．Ｏを　える必　を　！　るための 対江肛Ｕ二Ａ １５％のポリビニルピロリドン及び２％の水酸化カリウムを含有する水溶液を先 ず４０分間沸騰させ、ポリビニルピロリドンの塩基加水分解を行なった。沸騰し た重合体溶液は僅かに褐色をしており、未沸騰重合体溶液よりも票著に大きな粘 度を示し、そのような処理によるポリビニルピロリドンの加水分解が起きなであ ろうことを示していた１次に沸騰した重合体をガラス板上に注型し、１４０℃で ３０分間硬化して褐色の透明膜を形成した。しがし、得られた膜は、元のポリビ ニルピロリドン膜と同様に水に容易に溶けた。この結果は、上記条件では加水分 解されたポリビニルピロリドン（又は元のポリビニルピロリドン）自体の架橋は 行われなかったことを証明して１０％のポリエチレンイミン−エピクロルヒドリ ン及び３％の水酸化ナトリウムを含む水溶液をガラス板上に注型し、次に１４０ ℃で３０分間硬化した。そのようにして形成された腹は、外囲温度の水に浸漬し た後、ばらばらな破片に完全に崩壊した。このことは、ポリエチレンイミン−エ ピクロルヒドリン自体が架橋したものは加水分解に対し安定ではないことを確認 させるものである。

江旦且二工 ８．８％のポリビニルピロリドン及び１％の水酸化カリウムを含有する水溶液を 先ず１時間沸騰させ、ポリビニルピロリドンの塩基加水分解を行なった。溶液を 外囲温度へ冷却した後、７％（最終溶液の全重量に基づく）のポリエチレンイミ ン−エピクロルヒドリンを穏やかに撹拌しながら添加した。最終的重合体溶液を 次にガラス板上に注型し、１４０℃で３０分間硬化して膜を形成した。対照１２ −Ａ及び対照１２−Ｂで得られた膜とは異なって、このようにして形成した膜は 、外囲温度の水に２４時間浸漬した後でもその一体性を維持していた。このこと はポリエチレンイミン−エピクロルヒドリンと加水分解されたポリビニルピロリ ドンとの間に反応が起き、得られた腹が加水分解に対し安定であることを示して いた。

対照１２−Ｄ 例１で製造したソックスレー抽出膜を、例８に記載したのと同様な条件で後処理 した。後処理後、膜は、エタノール・ソックスレーで２４時間抽出した後でも陽 イオン帯電特性を示していた。このことは膜基体中の非浸出性活性添加物（ポリ エチレングリコール４００）が、実際に処理溶液中の帯電剤と反応したことを示 している。

江且ユニ玉 例２で製造された疎水性膜を、例８に記載した如き後処理工程にかけた。但し膜 を予めエタノールで濡らした。

その結果、処理膜は依然として疎水性であり、陽イオン！背が存在する徴候は示 していなかった。

苑庶且二ヱ 例４で製造した膜を、例８に記載した手順に従い後処理した。しかし、そのよう にして製造されたＣ３ＨＰ膜は、例８で製造したＣ３ＨＰ膜よりも僅かに大きな 帯電容量を持っていた。このことは、ここに記載した方法を用いて陽イオン帯電 膜の製造に成功するか否かは、実際に膜基体中の活性添加物に左右されることを 更に確認させるものである。成る範囲では、陽イオン帯電膜の帯電容量は、膜基 体中の活性添加物の量の関数である。

１３−　の　イオン　、 色素吸着試験を、負に帯電したメタニル・イエロー（ｌｌｅｔａｎｉｌ　Ｙｅｌ ｌｏｗ）の希釈水溶液（Ｉｌｐｐｍ）を用いて行なった。溶液を試験試料（直径 ４７ｚｉ）に１０ｐｓｉで通してヂ通し、試験の終点を目で見て決定し、膜試料 を透過するＰ液が非常に明るい黄色になった時の色素溶液の体積によって表した 。この試験及び次の試験で用いた膜試料は、５．４ミル±０．６ミルの厚さを持 っていた。この色素吸着試験の精度は、色素溶液の±１５１１であった。膜試料 の色素吸着容量は下の表■に記載する。

膜試料の例番号　ｌｌｐｐｍメタニル・イエｌ！会　３００ ＋２−Ｄ　５５ １２−Ｅ命　Ｉ５ 艮ユ」」［１上 膜試料の例番号　ｌｌｐｐｍメタニル・イエ親水性膜 ジェネスクリーン・プラス　Ｉｔ（１ 疎水性膜 イモピロンＮ会　１５０ 親水性腰 ハイボンドＮ２５ 会　この膜は、色素吸着試験前に予めエタノールで濡らした。

１４−　の・ 親水性膜の抽出可能な物質の量を、乾燥膜試料を予め秤量し、次にそれを脱イオ ン水中で１時間沸騰させることにより決定した。完全に乾燥した後、膜の試料を 再び秤量した。膜の抽出可能な物質の量を、重量減少の％で表し、下の表■に示 す。

表１ ９　０．８ １５−　イオン　−　のイオン・　”量イオン交換容量を測定するために、４７ ｔｔ円盤の膜試料を１００ｚｊ！の０．ＩＭのＥ（ＣＩ中に５分間浸漬し、次に 水が約７のｐＨになるまで脱イオン水で浸出した。７０℃で２時間乾燥した後、 膜試料を、２ｍｌの５ＭのＮ　ａ　Ｎ　Ｏｓ溶液を添加した１００ｚＮの脱イオ ン水中にｌＯ分間入れた１次に５１友ｌのこの溶液を除去し、コロイド状塩化銀 沈澱物を安定化させるため、０．１％のジクロルフルオレセインの１０滴及びポ リエチレングリコール４００の３滴を含む指示薬溶液を用いて０．０１４ＭのＡ ｇＮ０．を用いて滴定した。この試験の終点を、黄緑色から桃色の変化が観測さ れることにより決定した。最後にイオン交換容量を、簡単な計算により決定し、 膜試料ＩＪ当たりのミリ当量として表し、下の表■に示す。

ｌｕ ９　０．５１ １６一種々の　の′れ　声の′ 微多孔質膜の浸漬濡れ性を測定するため、４７ｔｔ円盤の膜試料を、外囲温度の 液体表面（水又は２３％のＮａＣ１溶液）上に置き、夫々の金膜試料が完全に濡 れるまでに要した時間を記録した。膜の水吸引濡れ性を測定するため、膜の帯（ ２″×３７４″）を外囲温度の水中に垂直に入れ、１３ｘｘの長さの膜の帯を吸 い上がるのに必要な時間を記録した。データーを表Ｉに示す。

１７−　の−一ツ　ス 膜の粒状物除去効率を、０，１％のトリトン（Ｔｒｉｔｏｎ　）Ｘ　−１００を 含有する水溶液中に３（Ｊｌｌの単分散ラテックス球状物（３３ｊｐｐ■）を懸 濁したものを１Ｏｐｓｉで枦遇することにより決定した。夫々ｌ０ｚｌずつのＰ 液を収集し、２３８ｆｌｌでＵ　Ｖ　−Ｖ　ｉｓ分光光度計により吸光度につい て分析した。これらの試験結果を下の表Ｖに記載する。

五Ｎ 膜試料　球状物直径　ラテックス球状物保持性（％）８　０．０６５　１００　 １００　１００１８−　イオン”　の　ン゛ 例９で製造したＣ５ＨＰＭ及び匹敵する陽イオン帯電ナイロン膜（デュポンＮＥ Ｎから入手できるジェネスクリーン・プラスナイロン膜）についてサチン法分析 を行なった６例って製造した膜へのＤＮＡの転移はアルカリ性条件下で最も効果 的に行われたのに対し、その匹敵する膜ではＤＮＡの中性転移が最も効果的であ ることが判明した。従って、それらの膜は、夫々の膜について理想的な条件下で 比較しな。

アルカリ性転移を用いたサチン法の場合、１．０．０．１、及び０．０１ｔｔ　 ｔのラムダＤ　Ｎ　Ａ　、　Ｈ１ｎｄｌｌ［消化物（ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏ ｇｉｅｓ、　Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、　１ｌＤ）を、サムプルツク（Ｓａｇ ｂｒｏｏｋ）その他により記載された（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ。

Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｉ’１ａｒｂｏｒ　Ｐｒｅｓｓ、　１９１１９）ＴＡ ＥＩＩＥ衝系を用いて、０．８％のアガロースゲルで電気泳動した。　２５０ｍ ＭのＭＣＩで脱プリンさせた後、ＤＮＡを転移＊＊液として０．４ＮのＮａＯＨ を用いて毛細管作用により膜試料に移動させた。次にＤＮＡを８０℃で３０分間 加熱することにより膜試料に固定した。

中性転移の場合、１．０．０．１、及び０．ｕμｉのラムダＤＮ　Ａ　、　Ｈ１ ｎｄｌ［消化物を、上述の如＜、０−８％のアガロースゲルで電気泳動した。Ｄ ＮＡを脱プリンし、次に０．４ＮのＮａＯＨ１０，６ＭのＮａＣ１に３０分間、 そして１．５ＭのＮａＣｌ１０．５Ｍのトリス、ｐ）ｆ７．５に３０分間曝した 。膜試料へのＤＮＡの転移は、転移緩衝剤として１．５ＭのＮａＣｌ１０．１５ Ｍのクエン酸ナトリウムを用いて毛細管作用により行なった。

ラムダＤＮＡを、ランダム・プライマー・エクステンションキ・ソト〔ライフ・ チクノロシーズ（Ｌｉｆｅ丁ｅｃｈｎｏ−１ｏｇｉｅｓ）〕を用いてデオキシシ チジン５’　［ａ　３２ｐコトリホスフエート（イリノイ州アーリントンハイツ のアメルシャム社）でラベルすることによりプローブを調製した。ハイブリッド 形成を６５℃で一晩進行させた。ハイブリッド形成及び洗浄に用いた緩衝液は前 に記載しである〔チャーチ（Ｃｈｕｒｃｈ）＆ギルバート（Ｇｆｌｂｅｒｔ）、 ＰＮＡＳ、祖、　１９９１．１９８４））、サチン法吸着帯を、ライトニング・ プラス（Ｌｉｇｈｔｅｎｉｎｇ　Ｐｌｕ！ｉ）（登録商標名）増感紙を用いてコ ダックＸ−Ｏｍａ、ｔＡＲフィルムに一晩最終的に露出した。帯電膜性能の結果 を第１図に示す。典型的なこれらの結果は、Ｃ５ＨＰ膜が帯電ナイロン膜よりも 大きな怒度を持つことを示していた。

Ｉ９−　イ　ン”　−の　ン゛ 例９で製造しなＣ５ＨＰ膜と帯電ナイロン膜（ジェネスクリ−・プラス）を、帯 電ナイロン膜に対しては最適であるが、帯電ポリエーテルスルホン展については 最適ではない中性転移条件を用いて比較した。実験的に１．０μｌのラムダＤＮ Ａ、　Ｈｉｎｄｌｌ［消化物を、例１８に記載した如く、１．０％アガロースゲ ルで電気泳動した１次にそのＤＮＡを脱プリンし、中性緩衝系を用いて毛細管作 用により膜試料へ移動させた。中性転移、プローブ調製、ハイブリッド形成、及 びオートラジオグラフィーのための条件は、例１８に記載したものと同じであっ た。ＤＮＡプロッティングの結果は第２図に与えられている。これらの結果から 、Ｃ９ＨＰ膜についてはアルカリ性転移が好ましいにも拘わらず、両方の膜は中 性転移条件を用いた場合、満足できることが確認された。

２０−　ブロービン　に　イ　ン　の １豆 プローブ剥取り工程中にＤＮＡを保持する膜の能力は重要なので、例９で製造し たＣ５ＨＰ膜と帯電ナイロン膜（ジェネスクリ−・プラス）の「再ブロービング 性」をこの例で分析した。再ブロービング法は次のようにして行われた：（１） ラムダＤＮＡ、　Ｈｉｎｄｌ［［消化物（０，１Ｉｇ／レーン）を例１８に記載 したように０．８％アガロースゲルで電気泳動した。ＤＮＡは前に記載したよう に脱プリンし、真空プロッター〔カリフォルニア州すンフランシスコのヘーフエ ル・サイエンティフィック（ＨｏｅｆｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）のトランスバ ック（Ｔｒａｎｓｖａｃ）　）を用いて膜試料へ移動させた。プローブ調製、ハ イブリッド形成、洗浄及びオートラジオグラフィーのための方法は、例Ｉ８に記 載したものと同じであった；　（２）プローブの除去即ち「剥取り」をアルカリ 法により行なった。典型的な剥取り手順には、膜試料を０．４ＮのＮａＯＨ中で ４２℃で３０分間インキュベートすることを含んでいる。１４回の剥取り工程に 類似させるため、この試験で膜試料を０．４ＮのＮａＯＨ中で４２℃で７時間イ ンキュベートした。長い剥取り工程の後、膜試料をコダックＡＲフィルムに露出 してプローブの喪失を証明し、次に放射性標識プローブにより再びハイブリッド を形成し、膜試料に結合したままになっているＤＮＡを検出した。上述の検定か ら得られた結果を第３図に示すが、Ｃ３ＨＰ膜の性能は、剥取りによるプローブ の喪失及び剥取り工程反復効率に関して帯電ナイロン膜よりも優れていることを 示している。

２Ｉ−イオン”−ボ１エー−ル　のＤＮＡプロッーイング　に　るエージングの ′ この例では、例って製造したＣ３ＨＰ膜及び同じ膜を５６℃で６０日間加熱した ものを、サザン分析で用いてプロッティング性能を比較した。簡単に述べと、０ ．１ＩｇのラムダＤＮＡ、　Ｈｉｎｄｌｌｌ［消化物を、例１８に記載したのと 同じＴＡＥＩ衡系を用いて１％アガロースゲルで電気泳動した。次にＤＮＡを脱 プリンし、真空装置を用いてアルカリ性条件で膜試料へ転移した。プローブ調製 、ハイブリッド形成、洗浄及びオートラジオグラフィーの如き続く過程は、例１ ８に記載したものと同様であった。陽イオン帯電ポリエーテルスルホン膜へのＤ ＮＡプロッティングの結果は第４図に例示されており、エージングがサチン法性 能に有利な影響を与えることを示している。

２２−Ｃ３ＨＰ　へのＤＮＡゲル この例では、Ｃ５ＨＰ膜ヘアガロースゲルからＤＮＡを転移させ、次に放射性標 識プローブにより膜結合ＤＮＡのハイブリッド形成を行うことについて記述する 。

１　、１５Ｘ　１５ｃｚの大きさのサブマリン（ｓｕｂ＠ａｒｉｎｅ）ゲルを、 ＴＡＥ緩衝液中に溶解した１％アガロースを用いて調製した。３０＜ぼみコウム を用いた。

２、隣接するレーンに０．５．０．２５．０．１．０．０５．０．Ｏｌ、及び０ ．００１μｆのラムダＤＮＡ、　Ｈ４ｎｄＩｆｆ消化物を入れ、最終体積を５μ ｌにした。

３、装置にＴＡＥ緩衡液を満たし、７０ボルトで３時間電気泳動した。

４、ゲルを２５０■ＭのＨＣｌ中に１５分間浸漬するか、又はブロモフェノール ブルーの帯が黄色になるまで脱プリンした。

５、例９に記載したようにして製造したＣ５ＨＰ膜を、メタノールで予め濡らし 、次に０．４ＮのＮａＯＨ中で平衡させることにより調整した。

６、ゲル及び膜をサムプルツクその他により報告されているように（Ｉｌｌｏｌ ｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ、　１９８９．　Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇｌｌａ ｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｐｒｅｓｓ）毛細管現象による移動を行わせ るように配置した。簡単に述べと、１枚の吸取り紙（ゲルマン・サイエンシズ社 ）を０．４ＮのＮａＯＨで湿らせ、ガラス板上に置き、それをガラス皿中に乗せ た。吸取り紙の端をガラス板から垂らし、芯として働かせた。

脱プリンゲルを吸取り紙の上に乗せた。平衡になった膜をゲルの上に乗せた。吸 取り紙の積層体を膜の上に置いた１皿に０，４ＮのＮａＯＨの転移用緩衝液を満 たした。２５℃で一晩、移動を行わせた。

７　膜をゲルから取り出し、室温で乾燥した。

８、ＤＮＡを８０℃で３０〜６０分間加熱することにより膜に固定した。

９、Ｆ！１４を「シール・ア・ミール（ｓｅａｌ　ａ　ｍｅａｌ）　Ｊ袋中に入 れ、ＢＥＰＳ［漬液（０，５Ｍのホスフェート、１％のＢＳＡ、７％のＳＤＳ、 １■ＭのＥＤＴＡ、ｐＨ７゜２）中で１５分間６５℃でインキュベートすること により予めハイブリッド形成させた。その予備的ハイブリ・７ド形成工程は、緩 く結合したＤＮＡを洗浄除去することの外、次の工程で標識プローブの非特異的 結合を防止する働きをする。

１０、ＢＥＰＳ［漬液を傾瀉し、変性した放射性標識ラムダＤＮＡ、　Ｈｉｎｄ ｌ［［消化プローブを含む新しいＢＥＰＳｌ衝液を添漬液た。プローブは１．０ ０℃で１０分間インキュベートすることにより変性した。

６０ｎｇのラムダＤＮＡ、ＨｉｎｄＩＩｒ消化物をランダム・プライマー・エク ステンシゴンキット（Ｂ　ＲＬ、カタログ番号８１８７ＳＡ）を用いて３２’− ｄＣＴ　Ｐでラベルした０反応混合物をセファデックス（Ｓｅｐｈａｄｅｘ）　 Ｇ　−５０カラムに通すことにより結合アイソトープから遊離アイソトープを分 離した。

１１、６５℃の振盪水浴中で一晩ハイブリッド形成を行なった。

１２、洗浄溶液■（４０■Ｍのホスフェート、０．５％のＢＳＡ、５％のＳＤＳ 、１■ＭのＥＤＴＡ、ｐＨ７，２）で６５℃で１００ｉ＋４で３回（夫々２０分 ）膜を洗浄した。

１３、洗浄溶液■（２０■Ｍのホスフェート、１％ののＳＤＳ、１ｍＭのＥ　Ｄ 　ＴＡ、　ｐＨ７，２＞で６５℃で１００ｚ１で３回（夫々２０分）膜を洗浄し た。

＋４．サランラップに膜を包み、増感紙を用いてＸ−○層ａｔＡＲフィルム（コ ダック）に露出した。注：もし再びブロービングを行う場合には（例２３参照） 膜を乾燥させない、露出時間の長さは、プローブの活性度及び標識付けの効率に よって変化する。

結果を第５Ａ図に示す、真空転移を用いた同様な例が比較として第５Ｂ図に示さ れている。

２３−プローブ この例では、例９で製造したようなＣ３ＨＰ！Ｉに結合したＤＮＡでハイブリッ ド形成したプローブを除去することについて記述する。

１、振盪器上で湿潤膜を０．４ＮのＮａＯＨ中で３０〜６０分間４２℃でインキ ュベートした。

２、溶液を傾瀉し、０．４ＮのＮａＯＨで濯ぎ、残留プローブを除去した。

２４−Ｃ３ＨＰ　へのＲＮＡゲル この例では、ＲＮＡをＣ３ＨＰ膜へ転移し、固定した後、放射性標ｌＤＮＡプロ ーブでハイブリッド形成することについて記述する。

１．１０■Ｍの燐酸ナトリウム及び１０ｍＭのヨード酢酸ナトリウムを含有し、 ＰＨ７，０の１％水平アガロースゲルを、３０＜ぼみコウムを用いて１５Ｘ１５ ＣＩ注型皿中に注いだ。

２、殺菌したＤＥＰＣ処理マイクロフユージ（腸ｉｃｒｏ−ｆｕｇｅ）管中で次 のものを混合した：４０％グリオキサル　１　μｌ ＤＭＳ０　３　μ１ ５０ｖＭのホスフェート、ｐＨ７，０１，Ｉ　ＡｔｌＲＮＡ　（１０μｙまで） 　１　μｉ ５０℃で１時間インキュベートした。直ちに氷上で、使用するまで冷却した。

３．１μｌの６Ｘ負荷用色素を各試料に添加した０手短に遠心分離にかけた。

４、試料をゲル中に入れ、１０ｎＭの燐酸塩１！衝液、ｐＨ７，０中で６０〜７ ０Ｖで、ブロモフェノール色素が約６〜８ｅ１１移動するまで電気泳動した。

５、Ｃ５ＨＰ膜を予めメタノールで濡らし、７，５１ＭのＮａＯＨ中で平衡させ た。

６、ゲル、膜及び吸取り紙を、例２２に記載した如く、毛細管移動が行われるよ うに組立た。７，５■ＭのＮａＯＨを転移緩衝液として用い、室温で一晩、毛細 管現象による移動を行なった。

７、ゲルから膜を取り出し空気乾燥した。８０℃で３０〜６０分間加熱した。

８、膜をＢ　Ｅ　Ｐ　ＳＭａ液中で６５℃で１０分間予めハイブリッド形成した 。

９．１’衝液を傾瀉し、変性放射性標識ＤＮＡプローブを含有する新しいＢＥＰ ＳｌＩ液を添加した。６５℃で一晩インキユベートした。

１０、洗浄溶液Ｉ（４０■Ｍのホスフェート、０．５％のＢＳＡ、５％のＳＤＳ 、１ｍＭのＥＤＴＡ、ｐＨ７，２＞で６５℃で１００ｚｊ！で３回（夫々２０分 ）膜を洗浄した。

１１、洗浄溶液■（２０■Ｍのホスフェート、１％のＳＤＳ、１ｍＭのＥＤＴＡ 、ｐＨ７，２）で６５℃で１００ｉｔ’で３回（夫々２０分）膜を洗浄した。

１２、サランラップに膜を包み、増感紙を用いてＸ−ＯｍａｔＡＲフィルム（コ ダック）に露出しな、注：もし再びブロービングを行う場合には（例２３参照） 膜を乾燥させない、露出時間の長さは、プローブの活性度及び標識付けの効率に よって変化する。

２５−ＣＳＨＰ　への　の この例は、例９で製造したようなＣ５ＨＰ膜に蛋白質を転移及び固定することに ついて記述する。膜結合蛋白質の可視化は、ホースラディッシュベルオキシダー ゼ／４−クロロ−１−ナフトール系を用いた酵素イムノアッセイにより行なった 。

１゜３％の積層ゲルを用いて５〜２０％の傾斜ポリアクリルアミドゲル（１４Ｘ 　１６ｃｍ、ヘーフェル・サイエンティフィック）を調製した。

２．１．２５％のメルカプトエタノールを含有する５ＤＳ−ＰＡＧＥ試料緩衝液 中に１５μｉ当たりｉｏｏ、７５．５ｏ、２５、及び１０μｉの蛋白質を含有す るＲ、　ｃｏｌｉ抽出物を調製した。

それら調製物をゲルに加えた。

４、ゲルを装置から取り出し、トリス−グリシンＭ漬液２００ｚｉ’で２回（１ 回洗浄１５分）で平衡させた。

５、Ｃ５ＨＰ膜をメタノールで濡らし、トリス−グリシン緩衝液で１５分開平衡 させた。同じＭ漬液で吸取りパッドを濡らした。

６、半乾燥転移装置〔バイオトランス（ＢｉｏＴｒａｎｓ　）、ゲルマン・サイ エンシズ社〕を用いて蛋白質をゲルからＣ５ＨＰ膜へ０　、８　／　ｗａｓｐｓ 　／　ｃｍ　２で２時間移動させた。

７、Ｍを室温で完全に乾燥した。

８、膜をメタノールで予め濡らし、０．８５％のＮａＣｌ及び０．０５％のトウ ィーン（Ｔｗｅｅｎ）２０（Ｐ　Ｂ　Ｓ　−Ｔ　２０）を含有する２０■Ｍの燐 酸塩緩衝液で膜を濡らした。

９．２％の正常なりギ血清（ブロッキング溶液）を含有するＰＢＳ−Ｔ２Ｏ中で 膜を３７℃で１時間インキュベートした。

１０、ブロッキング溶液を煩瀉し、洗浄せずに、新しいブロッキング溶液中に１ ／２００の希釈率でウサギ抗−Ｌｃｏｌｉ抗血清を添加した。３７℃で１時間イ ンキュベートしな。

１１、膜をＰＢＳ−７２０で２００ｉ１１で３回洗浄した。

１２、ヤギ抗−ウサギＩｇＧ、ＨＲＰ複合体を新しいブロッキング溶液中に１１ ５００の希釈率で添加した。３７℃で１時間インキュベートした。

１３、ＰＢＳ−Ｔ２Ｏで２００ｚ１で３回、ＰＢＳで２００ｍ１で３回洗浄した 。

１４．４−クロロ−１−ナフトール基質溶液中で、吸着帯が最適インテンシテイ −になるまで膜をインキュベートした（一般に１〜２分）。

１５、空気乾燥し、写真をとった。

結果を第７図に示す。

上記例の幾つかは、ゲルからＣ５ＨＰ膜への生物学的分子（ＤＮＡ、ＲＮＡ及び 蛋白質）の転移に関連している。そのような例の各々で、研究する生物学的分子 により、転移を行わせるため通常異なった緩衝液が用いられている。記述或は例 示されていなくても、特定の生物学的分子をそれに適した転移緩衝液で希釈し、 ゲルから移動させるのではな（、Ｃ３ＨＰＷＸに直接ピペッタ−（ｐｉｐｅｔｔ ｏｒ）又は他の適用装置を用いて適用してもよいことに注意すべきである。従っ て、本発明は、生物学的分子のＣ５ＨＰ膜へのゲル転移及び直接の固定化の両方 を含むものである。

トリス　トリス（ヒドロキシメチル）アミノエタンＥＤＴＡ　エチレンジアミン 四酢酸 ＳＤＳ　硫酸ドデシルナトリウム ＢＳＡ　ボビン血清アルブミン ｄＣＴＰ　デオキシシチジン−三燐酸 ＣＡ、ＰＳ　（３−［シクロへキシルアミノ］−１−プロパンスルホン酸） ＤＭＳ○　ジメチルスルホキシド 負荷用色素　Ｃ６Ｘ原液：　ｌ０ｗ１の水中、２５１ｇのブロモフェノールブル ー、２５１ｇのキシレンシアツールＦＦ、１゜５ｇのフィコル（Ｐｉｃｏｌｌ） ４００）ＨＲＰ　ホースラディツシュベルオキシダーイトウィーン２０ポリエチ レン−ソルビタンモノラウレート Ｈｉｎｄｕ　旺倶帥」…ｆ　ｎ　ｆ　Ｉ　ｕ　ｅ　ｎ　ｚ　ａ　ｅからの制限酵 素Ｔ　Ａ　Ｅ　４０ｍＭのトリス、１騰ＭのＥＤＴＡ、２０μｉＭの酢酸、ｐＨ １１，０ ＤＥＰＣジエチルピロカルボネート 本発明を記述してきたが、独特の性質又は特権が請求される本発明の態様は請求 の範囲に定められている。

ＦＩＧ　−１ ｎｌ葎」 ＦＩＧ　−ま た。

ＦＩＧ　−３ ＦＩＧ　−４ ＾　Ｂ 帯電親水性膜、帯電疎水性膜、及びＣ８ＨＰＭの、ＤＮＡの毛細管（パネルＡ） 及び真空（パネルＢ）移動に対する性能、ラムダＤＮＡ、　Ｈｉｎｄｌ［［を、 ５００ｎｙ　（レーンａ）　、２５０ｎｇ（レーンｂ）　、１００ｎｙ　（レー ンＣ）　、５０ｎｙ　（レーンｄ）　、１０ｎｙ　（レーンｅ）、及び１　ｎｙ 　（レーンｆ）の濃度で１％アガロースゲル中で、７０Ｖで３．５時間電気泳動 した１Ｍは１■ラムダＤＮＡで一晩プローブし、洗浄し、１７時間フィルムに露 出した。

ＦＩＧ　−５ Ａ８ ５回ハイブリッド形成及び剥取り工程を繰り返した後の帯電親水性膜、帯電疎水 性膜、及びＣ５ＨＰＷＡによるＤＮＡの保持を示すサザン法プロット、簡単に述 べと、ラムダＤＮＡ、ＨｉｎｄＩ［［断片のＩｏｏｏｎｇ（レーンａ）　、１１ ００ｎ〈レーンｂ）　、１０ｎｌＦ（レーンｃ）５．１０ｇ（レーンｄ）、及び ０．１Ｍｇ（レーンｅ）を、前に記載した如く１％アガロースゲル中で電気泳動 した。ＤＮＡを毛細管作用により０．４ＮのＮａＯＨ中で膜に移動させた。膜を １回のハイブリッド形成／剥取り工程にかけ、フィルムに露出した（パネルＡ） その１工程は６５℃で１７時間のハイブリッド形成及び０．４Ｎ中で４２℃での ３０分の剥取りからなっていた。１ｉを更に４回の工程にかけ、最後の工程の後 、フィルムに露出した（パネルＢ）。各工程で新しく標識付けをしたプローブを 用いた。

ＦＩＧ　−６ 吻−ｍ−−噂−勤一 ・て ウェスターン法による帯電親水性膜帯電疎水性膜、及びＣ３ＨＰ膜の性能、簡単 に述べると、５〜２０％の直線的に傾瀉したポリアクリルアミドの垂直板上ゲル 中で５ＤＳ−ＰＡＧＥによりＥ、　ｃｏｌｉ蛋白質を、１００．ｕｙ（レーンａ ）　、７５μｔｔ　（レーンｂ）　、　５０ｇｇ　（レーンｃ）　、２５μｙ　 （レギ抗−Ｅ、　ｃｏｌｉでプローブし、次にホースラディツシュペルオキシダ ーゼ標識付はヤギ抗−ウサギエｇＧ複合体によりプローブした０Ｍは４−クロロ −１−ナフトールにより展開した。

°　ハイブリッド形成／剥取り工程回数反復ハイブリッド形成及び剥取り工程に よる陽イオン帯電単線水性ポリエーテルスルホン膜によるＤＮＡの保持。

ＦＩＧ　−８ 補正書の写しく翻訳文）提出書（特許ｍ１Ｋ１８４船７組組

Claims (47)

【特許請求の範囲】
1. １．親水性を向上させ、帯電変性剤の夫々の基と潜在的に反応する官能基を有す る少なくとも一種類の非浸出性重合体添加物を含む微多孔質膜基体、及びポリア ミンを含み、エレクトロフィル含有化合物と化学的に反応し、それによって正味 の正電荷を与えることができ、前記重合体添加物に化学的にグラフトする第一帯 電変性剤、 からなる陽イオン帯電変性微多孔質膜
2. ２．膜基体がポリエーテルスルホンからなる請求項１に記載の膜。
3. ３．重合体添加物がポリビニルピロリドン及びポリエチレングリコールから選択 される請求項１に記載の膜。
4. ４．ポリエーテルスルホンが式： ▲数式、化学式、表等があります▼ （式中、ｎは５０〜１５０の整数である）を有し、膜基体が、成形及び乾燥した 帯電変性膜を水濡れ性にするのに有効な量で添加物を含有する請求項２に記載の 膜。
5. ５．第一帯電変性剤が、式： ▲数式、化学式、表等があります▼ （式中、Ｒは独立に水素、又はポリアミン鎖の連続を表し、Ｒ′は−ＯＨ又は− Ｃｌを表す）を有するポリエチレンイミン−エピクロルヒドリン樹脂からなる請 求項１に記載の膜。
6. ６．親水性を向上させ、帯電変性剤の夫々の基と潜在的に反応する官能基を有す る少なくとも一種類の非浸出性重合体添加物を含む微多孔質膜基体、ポリアミン を含み、エレクトロフィル含有化合物と化学的に反応し、それによって正味の正 電荷を与えることができ、前記重合体添加物に化学的にグラフトする第一帯電変 性剤、及び 前記第一帯電変性剤と反応する官能性を有し、部分的的ホスフィン化ポリ塩化ビ ニルベンジル、そのアンモニウム及びスルホニウムアナローグ、及び四級化ポリ （ジメチルアミン−ＣＯ−エピクロルヒドリン）からなる群から選択された第二 帯電変性剤で、最終的形式正電荷の大きさが前記第一帯電変性剤との反応による ものよりも増大するか、又は環境ｐＨの変動に対する前記第一帯電変性剤の感度 が減少するような量で前記第一帯電変性剤と反応する第二帯電変性剤、 からなる隔イオン性帯電変性微多孔質膜。
7. ７．膜基体がポリエーテルスルホンからなる請求項６に記載の膜。
8. ８．膜添加物がポリビニルピロリドン及びポリエチレングリコールから選択され る請求項６に記載の膜。
9. ９．ポリエーテルスルホンが式： ▲数式、化学式、表等があります▼ （式中、ｎは５０〜１５０の整数である）を有し、媒体が、成形及び乾燥した帯 電変性膜を水濡れ性にするのに有効な量で添加物を含有する請求項７に記載の膜 。
10. １０．第一帯電変性剤が、式： ▲数式、化学式、表等があります▼Ｉ （式中、Ｒは独立に水素、又はポリアミン鎖の連続を表し、Ｒ′は−ＯＨ又は− Ｃｌを表す）を有するポリエチレンイミン−エピクロルヒドリン樹脂からなる請 求項６に記載の膜。
11. １１．第二帯電変性剤が、式： ▲数式、化学式、表等があります▼ＩＩ（式中、ｍ、ｎ及びＲ′′は、独立に低 級アルキル基又はアリール基；又はホスフィン化塩化ベンジルのアンモニウム又 はスルホニウムアナローグを表す）を有する部分的にホスフィン化されたポリ塩 化ビニルベンジルからなる請求項６に記載の膜。
12. １２．第二帯電変性剤が式： ▲数式、化学式、表等があります▼ＩＩＩ（式中、Ｒ′′′は重合体鎖の連続で ある）を有する四級化ポリ（ジメチルアミン−ＣＯ−エピクロルヒドリン）から なる請求項６に記載の膜。
13. １３．陽イオン帯電変性微多孔質膜の製造方法において、Ａ．親水性を向上させ 、帯電変性剤の夫々の基と潜在的に反応する官能基を有する少なくとも一種類の 非浸出性重合体添加物を含む微多孔質膜基体を与え、Ｂ．前記膜基体を第一帯電 変性剤と、加熱を含む手段により反応させ、然も、前記第一帯電変性剤は、前記 膜基体に、硬化した時、固定された形式正電荷を与える量で反応し、そして Ｃ、得られた帯電変性膜を洗浄及び乾燥する、ことからなる製造方法。
14. １４．膜基体がポリエーテルスルホン膜からなる請求項１３に記載の方法。
15. １５．重合体添加物がポリビニルピロリドン及びポリエチレングリコールから選 択される請求項１３に記載の方法。
16. １６．ポリエーテルスルホンが式： ▲数式、化学式、表等があります▼ （式中、ｎは５０〜１５０の整数である）を有し、膜基体が、成形及び乾燥した 帯電変性膜を水濡れ性にするのに有効な量で添加物を含有する請求項１４に記載 の方法。
17. １７．第一帯電変性剤が、式： ▲数式、化学式、表等があります▼Ｉ′（式中、Ｒは独立に水素、又はポリアミ ン鎖の連続を表し、Ｒ′は−ＯＨ又は−ＣＩを表す）を有するポリエチレンイミ ン−エピクロルヒドリン樹脂からなる請求項１３に記載の方法。
18. １８．陽イオン帯電変性膜の製造方法において、Ａ．親水性を与え、帯電変性剤 の夫々の基と潜在的に反応する官能基を有する少なくとも一種類の非浸出性重合 体添加物を含む微多孔質膜基体を与え、Ｂ．前記膜基体を、該膜基体に固定され た形式正電荷を与える量の第一帯電変性剤と反応させ、Ｃ．前記第一帯電変性剤 と、その第一帯電変性剤と反応する官能性を有する第二帯電変性剤で、部分的に ホスフィン化されたポリ塩化ビニルベンジル、そのホスフィン化塩化ベンジルの アンモニウム及びスルホニウムアナローグ、及び四級化ポリ（ジメチルアミン− ＣＯ−エピクロルヒドリン）からなる群から選択された第二帯電変性剤と反応さ せ、然も、前記第二帯電変性剤は、最終的形式正電荷の大きさが前記第一帯電変 性剤との反応によるものよりも増大するか、又は環境ｐＨの変動に対する前記第 一帯電変性剤の感度が減少するような量で前記第一帯電変性剤と反応し、そして Ｄ．得ちれた帯電変性膜を洗浄及び乾燥する、ことからなる製造方法。
19. １９．膜基体がポリエーテルスルホンからなる請求項１８に記載の方法。
20. ２０．膜添加物がポリビニルピロリドン及びポリエチレングリコールから選択さ れる請求項１８に記載の方法。
21. ２１．ポリエーテルスルホンが式： ▲数式、化学式、表等があります▼ （式中、ｎは５０〜１５０の整数である）を有し、媒体が、成形及び乾燥した帯 電変性膜を水濡れ性にするのに有効な量で添加物を含有する請求項１９に記載の 方法。
22. ２２．第一帯電変性剤が、式： ▲数式、化学式、表等があります▼Ｉ （式中、Ｒは独立に水素、又はポリアミン鎖の連続を表し、Ｒ′は−ＯＨ又は− Ｃｌを表す）を有するポリエチレンイミン−エピクロルヒドリン樹脂からなる請 求項１８に記載の方法。
23. ２３．第二帯電変性剤が、式： ▲数式、化学式、表等があります▼ＩＩ（式中、ｍ、ｎ及びＲ′′は、独立に低 級アルキル基又はアリール基；又はホスフィン化塩化ベンジルのアンモニウム又 はスルホニウムアナローグを表す）を有する請求項１８に記載の方法。
24. ２４．第二帯電変性剤が式： ▲数式、化学式、表等があります▼ＩＩＩ（式中、Ｒ′′′は重合体鎖の連続で ある）を有する四級化ポリ（ジメチルアミン−ＣＯ−エピクロルヒドリン）から なる請求項１８に記載の方法。
25. ２５．内側表面領域及び外側表面領域を有する請求項１に記載の半疏水性帯電変 性膜に適用された試料基体を有するブロッティング組成物において、前記膜の有 効表面が同じ広さに亙って帯電変性されているブロッティング組成物。
26. ２６．試料基体がゲルからなる請求項２５に記載のブロッティング組成物。
27. ２７．試料基体が、ＤＮＡ、ＲＮＡ、及び蛋白質からなる群から選択された巨大 分子を含むゲルからなる請求項２５に記載のブロッティング組成物。
28. ２８．試料基体が、電気泳動により一連の帯に分離される巨大分子を含むゲルか らなる請求項２５に記載ブロッティング組成物。
29. ２９．試料基体が、膜の固定された形式正電荷により結合することができる材料 からなる請求項２５に記載のブロッティング組成物る
30. ３０．材料がアミン含有物質からなる請求項２９に記載のブロッティング組成物 。
31. ３１．請求項１に記載の帯電変性膜に試料を適用することからなる、生物学的試 料を固定用マトリックスに転移させる方法。
32. ３２．生物学的試料を、ゲルと混合し、適用工程がゲルブロッティングを含む請 求項３１に記載の方法。
33. ３３．適用工程が、生物学的試料を膜にスポット湿潤させることを含む請求項３ １に記載の方法。
34. ３４．転移工程が生物学的試料を膜に電気的に移動させることを含む請求項３１ に記載の方法。
35. ３５．転移工程が生物学的試料を膜に毛細管作用により移動させることを含む請 求項３１に記載の方法。
36. ３６．膜がポリエーテルスルホンからなる請求項３１に記載の方法。
37. ３７．生物学的試料がバクテリアを含む請求項３１に記載の方法。
38. ３８．生物学的試料が、ＤＮＡ、ＲＮＡ、及び蛋白質からなる群から選択された 巨大分子を含む請求項３１に記載の方法。
39. ３９．巨大分子を含む生物学的試料を請求項１に記載の膜に適用し、前記巨大分 子を膜に転移し、前記巨大分子を検出することからなる巨大分子の同定法。
40. ４０．適用工程が、生物学的試料で膜をスポット状に濡らすことを含む請求項３ ９に記載の方法。
41. ４１．転移工程がゲルブロッティングを含む請求項３９に記載の方法。
42. ４２．巨大分子を毛細管作用により移動させる請求項３９に記載の方法。
43. ４３．巨大分子を電流を生物学的試料に適用することにより移動させる請求項３ ９に記載の方法。
44. ４４．検出工程がＥＬＩＳＡにより行われる請求項３９に記載の方法。
45. ４５．ＤＮＡ、ＲＮＡ、及び蛋白質からなる群から選択された巨大分子を含む生 物学的試料を請求項１に記載の膜に適用し、前記巨大分子を膜に転移することか らなるドット・ブロット法。
46. ４６．巨大分子を検出することを更に含む請求項４５に記載の方法。
47. ４７．バクテリアを含む生物学的試料を請求項１に記載の膜に適用し、前記バク テリアを膜に転移し、前記膜上のバクテリアを検出することからなるコロニーハ イブリッド形成法。