JPH06501381A - ヒトマクロファージ炎症性タンパク質２α - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】

ヒトマクロファージ炎症性タンパク質２〆発明の背景 マクロファージ炎症性タンパク質（ＭＩＰｓ）は、微細なバクテリア脂質多糖類 の侵入に反応する過程で、ある種の細胞（たとえば、マク０）７−ジまたはリン パ細胞）によって生産されるタンパク質の一種であることを示すものである。 したがって、それらは、その細胞（ホスト生体）のその種の刺激に対する反応の 重要な参加者となることもある。そのため、これらの分子は、伝染病、癌、骨髄 生成機能障害および自己免疫疾、虫の処置の中で治療の可能性を持つこともある 。 ＭＩＰの異なる２つの形は、マクロファージ種瘍細胞の栽培の過程でマウスＶＩ Ｐ−１およびマウスＭ［Ｐ−２から発見された。 ネズミ科ＶＩＰ−１ 不ズミ椅（ｍ、）’ｖｔｌＰ−１は、脂質多糖類（Ｌ　Ｐ　Ｓ）から抽出される 主要を羽しタンパク質てあり、ＲＡＷ２６４．７ａｌｌ胞てシ１激された（ネズ ミ科マクロファージ儂瘍細胞線）である。これは浄化されているとともに、２つ の関連タンパク質、ｍ〜ｆＩＰ−１：およびｍＭ　ｒ　Ｐ　−１：：　’Ｗｏｉ ｓｔ、！＋　ｒｉ、、＋９８７．　’＋、Ｅ＋ｐ、’１ｉｅｕ。 １６τ　ｉｈ＋：＋７．　！Ｉ　１１．、；９３３．　１．　Ｅｘ）、Ｍ！ａ、 ｉ５ａ：　２１１）によって構成されていることが発見されている。 ｍＭＩＦ−４ａとｍＭＩＰ−１βの両方のｃＤＮＡは、分枝されて、順番に配列 されている０＋ｖｚ＋ｉ：ｉｔ、ｕ　ｒｌ、、！９３８．　ｉ　ミより、　！ｈ ａ、ｊ６７：　１９３１３ｈｒ：：ｙ。 ！ｉ　１１．、ｉｌ、：、ｉ″；。 ｍ’ｖ（ＩＰ−１ａとｒｒ＋ＭＩＰ−１βに対応するｃＤＮＡｓの分校と配列は 、ブラウン他によって報告されており　ｉ９Ｈ，１，１ｚｌｌｌｕｎｏｉ、、： ｌ：、　５７９）　、り１＞、ワイズ＝７’）］’８９．　１”＋ｅ、ｈ＋：、 　Ａ３１Ｃ，Ｓｋｌ：ＳＡ、（６：　１９６３）およびブラウン他によって、そ れぞれ報告されて′、＼る。 ｃ　Ｄ　Ｎ　Ａライブラリから分離された＋ｎＭｒＰ−Ｌα二ｍＭＩＰ−１β・ の相同の両グループ：よ、コンコナヴ７リンへで処置することによって活性化さ れた不ズミ叫ヘルパーＴｉ胞のＲＮＡから作成されている。これらの結果は、Ｍ Ｕ’−１αとＭＩＰ−１βがＴｉ胞活動の中で役割を果たすことがあることを示 唆している。 ヒトＭ［Ｐ〜１十モロジー 分校されたいくつかのグループは、ｍＭＩＰ−４αとｍＭ［Ｐ−Ｌβのヒトホモ ロノーであることもある。すべてのケースで、ｃＤＮＡｓは、活性化された人間 ＴＵＢ胞からＲＮＡに基つくライブラリと分離されている。したがって、オバル 他（１４８５，１，ＢｉｏＣＰ、＋１１．、９９：　ａ８５）およびンソベル他 １９０．１．　１ｍｕｎｎｏ１．、　１４２ｉｚＪ２）は、ｍＭＴＰ−１α（７ ６％）に対して高い相同性を持つタンパク質を予測するｃ　Ｄ　Ｎ　Ａの分校を ともに報告している。同様に、ブラウン、　ｏｐ、ｃ目。 ジッペル、）９．　ｃｉ＋、、リソプス＋９ａ８．　Ｐ：ｏｃ呵ａｌ、Ａｓ１ａ 、Ｓｅｉ、ＵＳＡ、８５：　７９０４）およびミラー１９０．　１．　ｌｎａ＋ ＋＋ｕ１．、１４３２９１１７）他が、ｍＭＩＰ−１β（７５％）に対して高い 相同性を持つタンパク質を予測する人間ｃＤＮＡｓの分校と配列を報告している 。ＭＩＰ−１αとＭＩＰ−４３は、免疫調展活動を持つ関連タンパク質の新説族 に寓している（その見直しについてはノニリー池ｏｐＣｉ＋を膠照のネズＥＭＭ ＩＰ−２（ｍＭｒ　Ｐ−２）！ｔｔた、ＬＰＳ刺激ｒ：ヨルＲＡＷ２６４７細胞 （つ矛ルベ他、１９８９．　Ｐ：ｑｃ、　Ｎ＋＋１．　Ａｅ＋ａ、Ｓ＋＋、ＵＳ Ａ、ｇ５．３ｊ２１）の条件付き媒体から浄化された導出タンパク質でもある。 ネズミ科ＭＩＰ−２を符号化しているｃＤＮＡが、分校され配列されている。 ｍＭＩＰ−２はまた、相同の多重遺伝子族のメンバーでもある。この族のメンバ ーには、ｇｒｏ／ＭＧＳＡ、血小板要因４、血小板基礎タンパク質、ペプチドＣ ＣＴＡＰ−ＤＩ）とＢ−トロンボグロブリンを活性化している結合組織の前身、 タンパク質導出性のがンマ・インターフ；ロン、ＩＰ−１０、およびインターロ イキンＩＩＭＩＬ−８）ｒ、ｔ：どが含まれており、さらに３−１０Ｃ，ＭＤＮ Ｃｆ”。 Ｎ　Ａ　Ｐ　−１およびＮＡＦも知られている。タンパク質の配列の中でもっと も高い相同性を持つこの挨のメンバー（通富分技されたｃＤＮＡから予測する） は、ＭＧＳＡ”：ＫＣ’＝含んでい６゜ＭＧＳＡ　（’Ｊ　ソチモ／ド他、１９ ８Ｌ　ＥＭＢＯｉ−４）２５）は、人間の黒色旧抱種によって隠された有余遺伝 子活動を持つ目生頭髪成長要因であり、人間ｇｒｏ遺伝子（＾＋＋＋＋ｏｗｉｃ ：、ｕ　＋１．、　１９８７．　９：ｏｃ′４！ｔ１人ｃｉｄ、　Ｓｃｉ、ＵＳ Ａ、　８４：　７１ａ８）から産出されたものである。ＭＧＳＡは、ネズミ科Ｖ ＩＰ−２に対してアミノ酸配列中で５７．９％の独自性を持っており、ＭＧＳＡ 　（ｉ　ｂ　ｉ　ｄ、）の推定ハムスター相同の予測されたタンパク質配列は、 ｍＭＩＰ−２に対して６８．３％の独自性を持っている。ネズミ科ＫＣ遺伝子の 産出物（ＯｑＩＩｅｎａｏ、Ｎ　！＋、、＋９８９．１．　Ｒｉａｌ、　Ｃｂｅ ｍ、、　２５４：　４２３３）は、血小板導出の成長要因（ＰＤＧＦ）によって 誘発され、人間ＭＧＳＡ／ｇｒｏ遺伝子（ｍＭＮ’−２に対して６３．０％のア ミノ酸独自性）のネズミ科相同であると考えられている。 ＶＩＰの組替え発現 ＭＩＰ−２遺伝子族のメンバーはもちろんのこと、関連するＭＩＰ−１遺伝子族 が発現されていても、組替え子ＭＩＰ−２または人間ＭＴ　Ｐ−２αおよびＭＴ Ｐ−２βの発現に関する先行技術は存在しない。ネズミ科ＶＩＰ−２または人間 Ｍ［Ｐ−２の式に対するこれらの結果の適切さは疑問があり、外来系における発 現に特育の性質を与えられている。それでもこの文献では、その要点を述べるこ ととする。 ｍＭｒＰ−１ａとｍＭＩＰ−１βは、ｃｏｓｓａ抱（Ｇｒｘｈ＋ｍ、ｅｔ　ｚｌ 、、１９９０゜！ｌｔ＋ｕｎ、３４Ｌ　４４２）中に独立して表されている。ネ ズミ科ＭＩＰ〜１αのｂト相同であるかのようなタンパク質をコードするＬＤ７ ８ｃＤＮＡ　（Ｏｂｉ＋ｕ、ｅｔ　！（、。 ｏｐＣｉｔ、）は、ＣｏＳ細胞（Ｙｚ＋ｕ＋ｓａ：ｔ　ｔ＋　ｚｌ、、１９８９ ．　Ｉ、　Ｃｌ１ｎ、Ｉｎｔｅｔ＋、、８４：１７ｆ１７）と同様に、ヒトイン ターロイキン２に対するカルボキシル基末端七してＥ、ｃｏｌｉ中に表されてい る。 ＭｒＰ−１族タンパク賀のメンバー上槽同性を持つンバク質をコードするｃＤＮ Ａであるヒトｌ−３０９は、分泌されたタンパク質（Ｍｉｌｌｅｒ、　ｅｔ　ｚ ：、。 ｏｐｃｉｔ、）をコードすることを確認するためにｃｏｓ−ｔＩＢ胞中に表され ている。 Ｌｉｐｅ＋、　ｒ＋　＋１．　：ａｐＣ日）が、Ａｃｔ−２ｃＤＮＡのバキュロ ウィルス発現（ネズミ科ＶＩＰ−１：の人間の相同に１き直されたタンパク質が 分泌されたということを示し、そして成熟したＮ−ｔｅｒｍｉｎａｌな配列を確 認するために）を記述した。ＪＥ（ＭＩＰ−１αおよびＭＡＰ〜１３に相同であ るタンパク質をコードするネズミｃＤＮＡは、およそＬ２ｋＤａ　（Ｒｏｌｌｉ ｎｔ　ｕ　＋１．、　１９８１ＰＴＯ（′ｌｚ＋ｌ、Ａｃｚａ、Ｓｅｉ、ＵＳＡ 、８５：　３７３ｇ）のポリペプチド芯をコードしていると確証するためにＣＯ ３−１１１１胞の中で発現された。 ＫＣ（ｍＭ［Ｐ−２に相同のタンパク質をコードするネズミＨｃＤＮＡ）はそれ が分泌されたタンパク質’０ｑｕｅ＋＋４ｏ、ｅｔ　１１．、　ｏｐ、ｅ口、） を符号化するということを示すためにＣＯ３−１細胞の中で発現された。結合組 織活性化ペプチド−■（ＣＴＡＰ、　Ｍｕｌｌｅ＋＋ｂｚｃｈ、　ｅｔ　！１． ．　１９ｇ６．　Ｉ、８ｉｏｌ　Ｃｂｃ＋ｅ、、　２６１：　７１９１およびｒ Ｐ撃潤B Ｌｕ＋ｎ＋、そしてＲｒｕｔｃｈ　（ｉＢ７．　１．　Ｅ！９．１１ｃｊ１５６ ｉ：　ＬＧ８４１　ＭＩＰ−２遺伝子族の両方のメンバーは、イースト中でα− 因子融合物として、モしてＥ、ｃｏｌｉ中それぞれ発現された。ＭｚＩｏｎｅ　 （ａｔ　Ｊｌ）　！＋９９０５ｃｉｅｎｃｅ、　２４７：　７７）が、大関の血 小板要因４、Ｅ、ｃｏｌｉ中のＭＩＰ−２族Ｅ、ｃｏｌｉＢ−グルクロニダーゼ の３５アミノ酸ペプチドフラグメントに融合したペプチドとして発現した。溶解 しない溶解タンパク質は、生物活性材料を生成するためにシアン臭化物によって 開裂される。 Ｌｉｌ１ｄｌ＋７　！ｅ口１１１９８ｇ、Ｐ−ｏｃ′（ｉｌ、Ａｃｔ６．　Ｓｃ １．　ＵＳＡ　ａ５）は、ＮＡＦ（ＭＡＰ−２な家族のメンバーＥ、ｃｏｌｉの 中で）（ＩＬ−８）を発現した。 精製および再生の後、この組替え体タンパク質は、それが生来の分子のために確 認した同じ生物活性を持つことがわかった。 Ｆａ：ｎｔｚ　’ｅ目１］　′１９８９．　Ｊ、Ｂｉａｃｈｕ、、１０６：　４ ３６）は、また、ＩＬ−８（Ｅ。 ｃｏｌｉの中のＭＤＮＣＦ）を発現した。 最後に、Ｇｉｍｂ＋ｏａｅ　！、ｅ目１１１１ｇｇ９５ｃｉｅｎｃｅ、　２４６ ：　ＬＨＩ）は、人間の２９３！胞の中でエンドテリアル′ｃ口ｃｏｔｂｅｌｉ ｚｌ）な

【Ｌ−８を発現して、そしてその組替え体および自然の材料が同じ生物 活性を持つということを示した。 ＭｒＰの生理活性 ＭＩＰ−１及びＭＩＰ−２の研究は、進歩しており、天然マウスＭ［Ｐ−１とＭ Ｕ’−２、及びごく最近組換え型マウｘ　（ｒｍ）ＭｒＰ−４ａ、ｒｍＭＩＰ− １３及びｒｍＭＩＦ−２が利用されてきた。これらの生理活性の中で、組換え型 および天然ｍＭＩＦ’−１及びＭ［Ｐ−２の両方のために、コロニー刺激因子並 びに炎症において機能を果す役割が規定されている。 Ｉ−ツカネてミＭＩＰ−２は、Ｃ３Ｈｉ′ＨｅＪハツカネズミの足蔗の皮下に注 入された時、局所的な：ＳＳ慢性反応誘発し、人間の多形Ｉ！！核白面白血球Ｍ Ｎ）のための育力な細胞遊走活性を有し、かつβグルクロニダーセ′Ｗｏ　ｌ　 Ｑ　ｅ、など、ｆｉｄ９年）ではなく、リソチームのＰＭＮ脱顆粒を引起すとい うことがわかった。 さらに、ｍ〜（ＴＰ−２はＣＦＵ−ＧＭ　（Ｂ＋ｕｍｅ７ｅ：、など、１９８９ 年、１．　Ｅ！９．　１ｊｅａ１７０、１５８３）　ｆ　ｏ　ｒ？＠造血機能を 増大する活性を持っていることが分かった。これらの因子の種々の生物学的活性 を与えられた状況では、それらのヒト同族体を分離することが望ましい。生理活 性の定義を追求する数量の精製された因子の必要、および細胞培養体液からこれ らの因子を分離する費用のために、これらの材料を組換え型デオキシリボ核酸配 列を用いて、製造するのが望ましい。 発明の要約 ｍＭ［−２のヒト対照物を識別する試みは、予期されないことてはあったが、１ つでなく２つの候補配列を示す結果になった。これらの２つの配列はそれぞれｈ ｕ−ＭｒＰ−２αおよびｈｕ−ＭＩＰ−２βとな定義された。上記２つの相同物 のうちより豊富なのはｈｕ−ＭＩＰ−２αである。 人間の他のタンパク質から本質的冒されていないヒトＭＩＰ−２α（ｈｕ−ＭＩ Ｐ−２α）ポリペプチドを提供すること、ｈｕ−ＭｒＰ−２αのための核酸コー ティング配列を提供することが、本発明の目的である。 ｈｕ−ＭＴＰ−２αに対して反応性を持つ抗体のための診断方法を提供すること もまた本発明の別の目的である。 ｈｕ−ＭＩＰ−２の検波に、あるいはｈｕ−ＭＩＰ−２ａのための核酸コーディ ング配列の診断の方法を提供することも、また本発明の別の目的である。 これら、および他の目的は、本文の記載から明白になるが、本発明の１つの局面 によれば次のようなタンパク質組成が得られる。すなわち、この組成はｈｕ−Ｍ ＩＰ−２αポリペプ千ドを含んでおり、人間の組織を本質的に含んでおらず、ま た、人間の他のタンパク質を好適には実質的に含まない。 別の局面において、この発明は、ｈｕ−ＭｒＰ−２αポリペプチドをコード化す る他種族から領域を含む、デオキシリボ核酸配列を提供する。 また別の局面において、本発明は、ｈｕ−ＭｒＰ−２αポリペプチドをコード化 するＲＮＨ域を含む、デオキシリボ核酸配列で変換された細胞からなる組換え型 プロダクション・システムを提供する。 この発明は、さらにｈｕ−ＭＩＰ−２αポリペプチドに対して反応性を持つ抗体 を提供する。さらに、発明の別の局面においては、組織または体液中のｈｕ−Ｍ 　ｔ　ｐ　−２’ｊ’４決定するための免疫検定法、および生体試料中のｈｕ− ＭＩＰ−２αのためのポリヌクレオチド配列コーディングを検出するための核酸 プローブ方法に関する。 発明の別の局面としては、ｈｕ−ＶＩＰ−２αレセプタと相互に作用し、反発的 活性あるいは相反する活性を宵するポリペプチド、および小さな有機分子を提供 する。 また、発明の別の局面としては、同族の多重遺伝子ファミリーのメンバーのうち のいかなるものへの、反発的活性を示す、ｈｕ−ＭＩＦ’−２αポリペプチドを 提供する。 さらに、発明は、効果的量のｈｕ−ＭＩＦ’−２αポリペプチドを投与すること によって、傷を治癒する方法、骨髄造血を調節する方法および補助薬活性を引起 す方法を提供することを目的とする。 この発明は、さらに、悪性腫瘍、自己免疫的疾病および炎症性疾病を治療する方 法を提供する。この場合、炎症性疾病は、乾癖を含む病的好中性漫眉、リウマチ 状関節炎、および肺の病気などを含むものである。治療は、同族多重遺伝子ファ ミリーのメンバーに対して相反する活性をもつ適量のｈｕ−ＭｒＰ−２αまたは ｈｕ−ＶＩＰ−２αポリペプチドを投与することによって行なう。本発明によっ て提供されるデオキシリボ核酸配列および組換え型システムを利用する二とによ って次のことが可能になる。すなわち、組換えシステムにおいてただ一つのヒト タンパク質が表現されているので、他のヒトタンパク質を実質的に含まないｍＭ ＩＰ−２のヒト同族体のうちの一方を大量に製造することが可能である。このよ うな組成物は、自然物から精製することによって得ることは困難である。 図面の簡単な説明 図１．ハッカ不ズミのＭＩＰ−２のヌクレオチド配列および予測タフバク質配列 を示す。 図２．ｈｕ−ＭｒＰ−２αの、ヌクレオチド配列および予測されたタンパク質配 列を示す。 図３．ｈｕ−ＭＩＰ−２βのヌクレオチド配列および予測されたタンパク質配列 を示す。 図４．ＶＩＰ−２同族体のヌクレオチド配列同族関係を示す。相補ＤＮＡ（Ａ） 、コーディング領域（Ｂ）および未翻訳領域（Ｃ）における、ｍＭ［Ｐ−２、と ｈｕ−ＶＩＰ−２ａ、ｈｕ−ＭＩＦ’−２β、ｈｕ−ｇｒｏ／ＭＧＳＡ、および ハツカネズミのＫＣ間のヌクレオチド配列一致の確率を示す。 図５．ＶＩＰ−２同族体とヒトＩＬ−８との、アミノ酸同族関係、および配列を 示す。（Ａ）ヒトｒＬ−８並びに同様にＶＩＰ−２同族体の予測アミノ酸配列間 の一致確率を示す。ＣＢ）　ｉｌ！携したアミノ酸配列を示す。 図６．ＢａｍＨ１，’Ｂ’　、ＥｃｏＲＩ、’Ｅ’あるいはＥｃｏＲＶ、’Ｒ’ で消化された、ハツカネズミおよび人間のＭ［Ｐ−２相補ＤＮＡを持つゲノミッ クデオキシリボ核酸のサザン分析を示す。（八）ｍＭＩＰ−２相補ＤＮＡで雑種 形成されたハッカネズミデオキシリボ核酸を示す。制限されたヒトデオキシリボ 核酸のブＣットは、まず、標識されたｈｕ−ＭＩＰ−２β相補ＤＮＡ、（Ｃ）に よって雑種形成され、次いでフィルタが標識されたｈｕ−ＭｒＰ−２α相補ＤＮ Ａ（Ｂ）でストリップされ再ＮＮ形成された。 詳細な説明 もし他に示されていない限り、本発明の実施は、従来の分子生物学、！１１１園 学、そして従来の技術の＠−にある組換え型デオキシリボ核酸技術を使用する。 このような技術は、以下の文鞍に完全に説明されている。たとえばマニアティス 、フリソンユ、サムプルツク（’Ｊａｎ目【ｉ＋、Ｆ！１ｌｓｃｈ　４　Ｓ！ｍ ｂ＋ａｏｋ）　ＩＦ　ｒ分子クローン化ニラボラトリーマニュアル、」「デオキ シリボ核酸クローン化：実質的なアプローチ」巻１．　Ｉｌ、（Ｄ、Ｎ　グラバ −ＨＡ、１９８５年。）「オリゴヌクレオチド合成Ｊ　（１１，ｊ　ゲイト編、 １９８４年。）：「核酸ハイブリッド形成法Ｊ　（ｌ　［１ヘイムズ＆Ｓ、Ｉ　 ヒギンズＨＡ、１９ｇ５年）「転写と翻訳Ｊ　（Ｂ、　Ｄ　ヘイムズ＆Ｓ、１ヒ ギンズ編、１９８４年）［動物細胞培養（＋１．　１　フレソンユニイ編、１９ ８６年〕「固定化細胞および酵素”・Ｉ　ＲＬプレス、１９８６年１．３　バー パル「分子クローン化への実際的手引き”　（１９８４年）を膠照せよ。 本発明を説明するさいに、以下の技術用語は下記に示す定義に従って使用される 。 「レプリコン」は、生体内でのデオキシリボ核酸復製の自律単位として機能する 、つまり、それ自身の統制の下で復製が可能な遺伝子因子の要素（たとえばプラ スミド、染色体、ウィルス）である。 「ベクター」はプラスミド、ファージあるいはコスミドなどのレプリコンであり 、これに別のデオキシリボ核酸断片が付けられ、その付けられた断片の復製を引 起すようにしてもよいようなレプリコンである。 「二重鎖のデオキシリボ核酸分子」は、その正常、二重鎖の耳輪でのデオキシリ ボヌクレオチド（アデニン、グアニン、チミンあるいはントシン）のポリマー形 を言及している。この技術用語は分子の第一次および第二次の構造を言及してい るだけであり、特別な第三次形に限定していない。したがって、この用語は、と りわけ、線形デオキシリボ核酸分子（たとえば制限フラグメント）、ウィルス、 プラスミドおよび染色体の中にみられる二重鎖のデオキシリボ核酸を含んでいる 。 特別の二重鎖のデオキシリポ核酸分子の構造を述べるさいに、連鎖は、デオキシ リボ核酸の非転写ストランド（つまりメツセンジャＲＮＡへの配列相同を有する ストランド）にそって５′末端から３′末端の方向にだけ配列する通常の規定に 従って本文で記述説明されてもよい。 デオキシリボ核酸「コーディング配列」は適切な調節範囲配列統制の下に！かれ た時、生体内ポリペプチドに転記され翻訳される、デオキシリボ核酸配列である 。コーディング配列の境界は５′　（アミン）末端でスタートコードンにより、 また３′（カルボキシ）末端で翻訳ストップコードンにより決定される。コーデ ィング連鎖は、原核連鎖、真核性メツセンジャＲＮＡからの相ｌｌＤＮＡ、真核 性（たとえばは乳類〕デオキシリボ核酸からのゲノミックデオキシリボ核酸連鎖 、および合成デオキシリボ核酸配列を含んでもよいが、これに限定されない。ポ リアデニシーショノ信号および転写終結配列は、コーディング配列の３′末端に 通常位置する。 「プロモータ配列」は細胞内のりボ核酸ポリメラーゼを結合することができ、下 流（３′　末端の方向）コーディング配列の転写を開始することかできる、デオ キシリボ核酸２面領域である。本発明を定義する目的で、プロモータ配列は、３ ′末端でコーディング配列の翻訳スタートコードンにより限定され、上流５′末 端方向に広がり、バックグラウッド上方で検出可能なレベルで転写を開始するの に必要な最低限の数の塩基か元素を含んでいる。プロモータ配列内で、リボ核酸 ポリメラーゼの結合の原因となるタンパク質結合定！Ｉ領域（コンセンサス配列 ）と共に、転写開始サイト（ヌクレアー七Ｓ１と並へることにより便利に定義さ れた）が見られる。Ｘ＄ｆ性プロモータは、宮にてはないがしばしばｒＴＡＴＡ Ｊ硝、およびｒｃＡＴＪ箱を含有している。東面性プロモータは、−１０および −３５のコンセンサス配ダ１に加えてンヤインーデルガルノ配列を含有している 。 プロモーター配列を結合するリボ核酸ポｌ／メラー七が、コーディング配列をメ ツセンツヤＲＮＡに転写して、そのメツセンジャＲＮ　Ａをコーディング配列に よってコード化されたタノバク質に順番に翻訳するとき、コーディング配列は、 細胞内のプロモータ配列の「統制の下」にあるという。 外因性デオキシリボ核酸か細胞壁内に導入されたとき、細胞はそのような外因性 デオキシリボ核酸によって「転換された」。外因性デオキシリボ核酸は、細胞の ゲノムをつくっている染色体デオキシリボ核酸に組み込ませられるかもしれない し組み込ませられないかもしれない（連係された共有結合〕。たとえば、原核生 物とイーストで、外因性デオキシリボ核酸は、プラスミドのようなニビソーム元 素上に維持されるかもしれない。真核性細胞に関して、安定して転換された０抱 ：よ、外因性デオキシリボ核酸か、それが染色体復製を介して娘細胞によって遺 伝するように、染色体に組み込まれたような細胞である。この安定度は、外因性 デオキシリボ核酸を含有している娘細胞の集団で構成された、細胞系あるいはク ローンを株化する真核性！［ｌ抱の能力によって実証される。「クローン」は、 宵糸咳分裂による単−細胞あるいは共通の先祖から引き出された細胞の集団であ る。 ″細胞系２は、多くの世代にわたって試験管内で安定した成長ができる一次細胞 クローンである。 ヌクレオ羊ドの少なくとも約８５？ｆｉ（好ましくは少なくとも約９００ｆｉ、 最も望まＬ＜ｊよ約９５０も）が、デオキシリボ核酸配列の定義された長さとマ ンチするとき、２つのデオキシリボ核酸配列は「実質的に相同である」。実質的 に相同である配列は、例えば特にそのシステムに定義されるような厳格な条件の もとでの南のハイブリッド形成法莫験て識別することができる。適切なｌ＼イブ リフト形成法条件を定義することは、従来の技術内にある。たとえばマニアティ スなど、上記、デオキシリボ核酸クローン化、巻Ｉおよび■上記、核酸ハイブリ ッド形成法、上記。 デオキシリボ核酸構成子の「異種」領域あるいはドメインは、実在するより大規 模な分子と関連しては見られない、より大規模なデオキシリボ核酸分子内で見分 けられるデオキシリボ核酸の断片である。したがって、異種領域がは乳類の遺伝 子をコード化した場合、遺伝子は、源有機体のゲノム内ではは乳類ゲノミックデ オキシリボ核酸の側面にないデオキシリボ核酸によって通常側面にある。 「異種」領域のもうひとつの例は、コーディング配列自体が実在しない構造であ る（たとえば、ゲノミヅクコーディング配列がイントロンを含有している相補Ｄ ＮＡ、あるいは在来の遺伝子以外の種々のニートンを持っている合成の配列）。 対立的変動あるいは当然生じる突然変異性事象は、ここに定義されたようなデオ キシリボ核酸の異種領域の原因とはならない。 技術用語″検体ポリヌクレオチド”、および“検体ストランド“は、ターゲット 配列を含有していると考えられている、また生物サンプルに存在するであろう、 単一鎖、または二重鎖の核酸分子に関連する。 本文で使用されているように、技術泪語°プローブとは、標的領域内に配列を持 つプローブ中に少なくとも１つの配列相補性のために、標的配列をもつ雑種構造 を形成するポリヌクレオチドで構成された構造を指す、プローブのポリヌクレオ 千ド領域は、デオキシリボ核酸、及び／′またはリボ核酸及び／′または合成の ヌクレオチド同族体類から構成されていてもよい。 本文で使用されているように、技術用語“標的領域゛とは、増幅されかつ／また は検出される核酸領域を指す。技術用語“標的領域”とは、プローブあるいはプ ライマーか所望の条件の下で安定した雑種を形成する配列を指す。 本文で使用されているように、技術用語“標的ポリヌクレオチド配列”とは、標 的ヌクレオチド配列に相補性ヌクレオチドで構成される、ポリヌクレオチド配列 を指す。この配列は、意図された目的のために十分な安定度を持っている二重鎖 を形成する、標的配列を持つ、十分な長さと相補性のあるものである。 本文で使用されているように、技術用語“結合相手”とは、例えば、このために 特異的に働く抗原および抗体のような、リガンド分子に高い特異性を結合するこ とができる分子を指す。一般的には、特異的な結合相手は、分離条件の下で検体 （あるいは、補足プローブの場合には、コピー／相補性ストランド二重鎖）を動 かないようにするために、十分な親和力をもって結合しなければならない。特異 的な結合相手は、当業者に公知であり、たとえば、ビオチンおよびアビジン、あ るいはストレプトアビジン、免疫グロブリンＧおよびタンパク質Ａ１多数の既知 のレセプタリガンド対、及び相補性ポリヌクレオチドストランドを含んでいる。 相補性ポリヌクレオチドが結合相手の場合には、相手が、少なくとも長さが約１ ５の基であるのが通常であり、最小長さが４０基であってもよい：さらに、それ らは、少なくとも約４０％から約６０％のグアニンとチトンンの内容物を一般に 有している。ポリヌクレオチドは、デオキシリボ核酸、リボ核酸あるいは合成の ヌクレオチド同族体類から構成されてもよい。 本文で使用されているように、技術用語「連結された」とは、共有ボンドによる 、あるいは強い非共有ボンド相互作用（たとえば疎水性の相互作用、水素結合な ど）での連結を指す。共有ボンドとは、例えば、エステル、エーテル、フォスフ 中エステル、アミド、ペプチド、イミド、炭素−硫黄ボンド、炭素リンボンドお よび同種のものであってもよい。 技術用語“担体“とは、所望の結合相手を連結することができる任意の固体ある いは半固体表面を指す。適切な担体としては、ガラス、プラスチック、金属、ポ リマーゲルおよび同種のものか含まれまたビード、ウニル、ディツプスティック 、皮膜および同種のものの形をとっていてもよい。 本文で使用されるような技術用語“ラベル”とは、検出可能な（好適には数量化 可能な）信号を提供するために、使用することができ、それは結合したポリヌク レオチドあるいはポリペプチドでありうる、任意の原子あるいは成分を措す。 本文で使用されているように、技術用語“ラベルプローブとは、検体ポリヌクレ オチド中に検出される標的配列に相補性、標的ポリヌクレオチド配列が含まれて いるポリヌクレオチドを指す。この相補性領域は、ラベルによって検出される“ ラベルプローブおよび“標的配列”で構成される二重鎖を提供する、標的配列に 対して、十分な長さ、および相補性をもつものである。それは、互いに対して高 い特異性を持つ１セツトのリガンド分子によってラベルに直接あるいは間接的に 、連結している。高い特異性を持つセブトのリガンド分子は、スブラ（“結合相 手”を参照）と記述される。 本文で使用されているように、“生体試料“とは、個人から分離された組織ある いは体液の試料を指し、以下に例示のものに限定されるわけではないが、例えば 、血漿、血清、を椎体液、リンパ液体液、皮膚の外部切片、呼吸器官、腸溶、お よび尿生殖路、涙、唾液、乳、血球、腫瘍、組織および試験管中の細胞培養成分 の試料をも含む（この試験管中の細胞培養成分には、限定されるわけではないが 、細胞培地における細胞成長から生じる調製培地、推定上にウィルスに感染して いる細胞、組換え型細胞、および細胞成分類が含まれる）。 “ヒト組織”とは、固体を構成していてもよいヒト細胞の集合体である。この技 術用語はまた、血球のようなヒト細胞、あるいはヒト細胞株の＠濁液を含む。 選択成分Ａを含む成分は、成分Ａが、成分ＡとＢを組合わせた重量の少なくとも 約７５％でできている場合、別の成分Ｂに「本質的に冒されていない」。そして 、好適には、選択成分Ａは、組合わせ重量の約９０％含むことが望ましく、最も 好適には、組合わせ重量の約９９％を含むことが望ましい。 選択された生物学上活性なタンパク質（それは本質的に汚染タンパク質に冒され ていない）を含む成分の場合には、関心のあるタンパク質の活性を持っている成 分が単一分子量（つまり“均賀°成分〕をもつ種を含有することが、時として要 望される。 ２つのアミノ酸配列は、少なくともアミノ酸の約９０％が、好適には、少なくと も約９２０侭より好適には少なくとも約９５％が、アミノ酸配列の定義された長 さにマツチする場合、「本質的に同族」である。 マウスＭＩＰ−２のヒト同族体 マウスのＶＩＰ−２に対する相補ＤＮＡは、浄化されたタンパク質上で決定され たＮ−末端アミノ酸配列の部分に対応する、退化したオリゴヌクレオチドプロー ブブールを使用して、クローン化された。マウスのＭＩＰ−２相１１ｉＤＮＡの コーディング領域を表現する、ヌクレオチド残留物フが、リポ多Ｗ（例２を嘗胆 ）２で刺激された、ヒトマクロファージ細胞株から相補ＤＮＡライブラリを打診 するために、使用された時、種々の候補相補ＤＮＡ配列が識別された。これらの ２つの相補ＤＮＡ配列によってコード化されたタンパク質はそれぞれヒト−ＶＩ Ｐ−２αおよびヒト−ＭＩＰ−２βと指定された。これら３つのタンパク質の核 酸およびアミノ酸配列の例が図に示される　図１＝マウスのＭ［Ｐ−２、図２＝ 人間ＭＩ　Ｐ−２α、図３＝人間ＶＩＰ−２β。 “ヒトマクロファージ炎症性タンパクＮ２αポリペプチド“　（ヒトーＭＩＰ− ２αポリペプチド）は、ヒト−ＭＩＰ−２αおよびヒトーＭＩＰ−２α同族体類 を包含する。 “ヒト−ＭＩＰ−２α”とはヒトマクロファージ炎症性タンパクｔ２αであり、 自然に生じる、リボ多糖に刺激されたマクロファージによって、他のものと一緒 に分泌される成熟したヒトタンパク質であって、さらにヒト−ＭＩＰ−２αの、 前駆体類すべておよび対立的な変種すべてを包含し、生体内での一貫しない処理 から生ずることがある、不均質分子量の形も同様に含むものである。ヒトーＶＩ Ｐ−２α配列の例は図２に示される。 “ヒトーＭＩＦ−２α同族体類”とはつぎのちのを含んでいるペプチドの属であ る １）“ヒト−Ｍ［”−２α突然変異タンパク質＃　（それらはヒト−ＭＩＰ−２ αに本質的に同族のポリペプチドである）。好適には、１突然変異タンパク質゛ のアミノ酸配列は、８あるいはより少数のアミノ酸残留物、好適には、７あるい はより少数の残留物、より好適には約５あるいはより少数の残留物：そして、最 も好適には、約２あるいはより少数の残留物によって、ヒト−ＶＩＰ−２αのそ れと異なる。２つのタンパク質のアミノ酸配列の任！の相違が保存的アミノ酸！ 換物だけを含んでいることが、時々要望される。アミノ酸がそれが置換されるア ミノ酸および置換物がタンパク質のローカル、呂局側コンポメーンヨノに対する 重要な結果を持っていないのと同じ代価を本質的に持っている場合、保存的アミ ノ酸置換が発生する。二者択一的に言えば、活性を変更するンステインの除去あ るいはタンパク質の安定Ｉのような変更が要望されてもよい。 ２）′切断ヒトーＶＩＰ−２αペプチド０　（“ヒト−ＭＩＰ−２α゛あるいは 好適には保持する°ヒトー■ＩＰ−２α突然変異タンｔＺり質”のいずれか、す なわち、　４ｉ１ヒト−ＭＩＰ−２α、′１１）ヒト−ＭＩＰ−２αにユニーク なエピトープあるいは（１日ＩＭＩＰ−２活性にユニークなアミノ酸配列の断片 を含む。 ３）　′ヒトーＶＩＰ−２α融合タンパク質”　（これは異種ポリペプチドを含 む）は、任意の異種アミノ酸配列に融合させられた、上記のポリペプチド（ヒト −ＶＩＰ−２αおよびヒト＝ＭＩ　Ｐ−２α突然変異タンノ々り賞あるいは切捨 てられたヒトーＭＩＰ−２αペプチド）の１つでできている。好適には、このよ うな異種配列は、ヒトーＭＩＰ配列のＮ−末端終端へ融合させられ、直接分泌へ のリーグ配列を含む。 アミノ酸配列あるいは核酸配列であって、それらをコード化する“特異“ヒトー ＭＩＰ−２α配列は、ヒトーＭＩＰ−２αポリペプチド配列と同一の配列である が、これは、少なくとも１つのアミノ酸あるいはヌクレオチド残留物において、 ｈＭＧＳＡ、ヒト−ＭＩＰ−２β９ｍＭＩＰ−２およびマウスのＫＣの配列とは 異なり、好適には、ヒトゲノムにほかのところに見つけられない。同様に、それ がヒトーＭＩＰ−２αポリペプチド上に見つけられるが、同族の遺伝子ファミリ ーの任意のメンバー上には見つけられない場合、エピトープはヒトーＭＩＰ−２ αポリペプチドに対して１特異的“である。 予想されるアミノ酸配列の特徴 ｍＭＩＰ−２，ｈｕ−ＭＩＦ−２ａおよびｈｕＭＩＰ−２βのオープン＆リーデ ィング・フレームは、それぞれ１００，１０７および１０７アミノ酸からなるポ リペプチドをコードしている。この３つのポリペプチドのそれぞれの最初の約３ ０アミノ酸はシグナル配列の特性（Ｐｃ＋１ｎｚｉ、！ｌ　ｉｆ、、１９８３． 　１．１ｌｌｏ１．　！１ｉｏ１１６７：　’１９１；　ｔｏｎ　ｔｌｃｉｉｎ ｅ、　１９８Ｌ　１．　Ｍｏ１．　１ｌｉｏ１．　１７３：　２４３；　ｔｏｎ 　Ｈｅ１ｉ＋普A　１９８６゜ Ｎｕｃ：ｔｉｅ　Ａ＋ｉｄ＋　Ｒｃｉ、ｔＬ　１６ａ３＋を宵している。ＬＰＳ で活性化されたＲＡＷ２６４．７細胞（′Ｉｏｌｐｅ、４１１１．、：ｆｆ３９ １の制限培地から端型された分泌ｍＭＩＰ＝２について決定されたＮ末端アミノ 酸配列から、予〕されるアミノ酸配列中の成、＃％ｍＭＩＰ−２タンパク質の始 点を決定する二とができる。ｈｕ−ＶＩＰ−２αおよびｈｕ−ＭＩＰ−２βにつ いての予想成熟ペプチド配列の始点は、ｍＭＩＰ−２のものと整合しており、共 通のシグナルペプチド切断部位Ｐつ・１ｅａｎ。 ｅ＋　＋１．　１９８３：　ｗｏｎ　Ｗｃ１ｉｎｅ、１９８４．　１９８６１を 有している。これらの３つのタンパク質すへてについて、成熟ペプチド配列の予 想された長さは７３アミノ酸である。 ネズミ類ＶＩＰ−２は塩基性タンパク質であり、ヒトＭＩＰ−２ポリペプチドは 、ｈｕ−ＭＡＰ−２ａおよびｈｕ−ＭＩＰ−２βの予想等電点がそれぞれ９．９ および９．７であることに基づき、同様に塩基性である。天然のまたは組み換え タンパク質は、０−グリコンド結合ｍｉｘを有していてもよい。これらの３つの 予想ポリペプチドは、Ｎグリコンド結合の共通シグナル部位を冑していない。 ネズミｌｌおよびヒトＭＩＦ−２ｃＤＮＡの特徴ｍＭＩＰ−２，ｈｕ−ＭＩＰ− ２ａおよびｈｕ−ＭＩＰ−２βのｃＤＮＡの塩基配列は、それぞれ１つのオーブ ン・リーディング・フレームをコードしている。 ｍＭＩＰ−２の開始ＡＴＧコドンのまわりの塩基配列は、高等真核生物の多くの ｍＲＮＡにみられる共通配列（Ｋｏ＋ｕｋ、１８８６．　Ｃｅ１１．　４４：　 ２８３Ｋｏｏｏｋ、１９８７゜ＷａｃｌｅＩｔ　Ａｃｌ６　Ｒｅｓ、、１５：　 ３１：５）を形成している。ヒトＭＩＰ−２αおよびＭＩＰ−２βについては、 −３位の高度にｉ！！存されたプリン塩基か欠損しているが、−１，−２および 一４位のＣ残基および一４位のＣ残基を含む、共通配列の多くの特徴を有してい る。 ｍＭｆＰ−２の３′非翻訳領域については、−７１９−７２４位に真核生物に共 通のポリＡｌ加シグナルＡＡＴＡＡＡ　（１「ｉｎｓ＋ｉ＋１．　ｅ＋　７１． 、　１９８５．　Ｃ６１１，Ｊ１３４９）を有しており、その後に−７３−５塩 基から始まるポリ入路を育している。 ｈｕ−ＭＩＰ−２３のｃＤＮＡのクローンｈｕ−ＭｆＰ−２−４ａあるいはｈｕ −Ｍ［Ｐ−２−７ｄ、またはｈｕ−ＭｒＰ−２ａのｃ　Ｄ　Ｎ、Ｊ１クローンに は、３′非翻訳領域にＡ　Ａ　Ｔ　Ａ　Ａ　ＡのポリＡ化ノグナルが見いだされ なかった。これは、ポリ八鎖が存在しなかったことから、これらのクローンは欠 失３′非翻訳領域を有していたためであると考えられる。 多くのサイト力イノ遺伝子の３′非翻訳領域に見いだされ（Ｃａｐｕ＋、ｃｌ　 ｉｉ、。 １９３６．　？：ｏｃ、！ｌ＋ｔｌ、Ａ＋ａａ、Ｓｃ＋、ＵＳＡ、１３：　１６ ７Ｑ）　、ｍＲＮＡの安定性□ｈｉｙ。 ｕ、＋１．、ｊ９８６．　Ｃｏ１１．　１６：　６５９）および翻訳の効率Ｋ・ ｉ７ｔ　！Ｉ　！１．．　１９８７．　Ｐ：ｏｓ。 Ｎａｔｌ、　Ａｃ１ｄ　Ｓｋｉ、　ＵＳＡ、　Ｈ：　６０３０：　Ｈｅｎ、ｃｔ 　Ｊ＋、、　１９９ｉ１．　ノ　ｂｐ、Ｗｅｄ、、１７１４６５）に関係する共 通配ダＩＩＴＴＡＴＴＴＡＴが、これらの３つのｃＤＮＡナベてに多コピー存在 する。この配列は、ｍＭ［Ｐ−２の３′非翻訳領域中の４つの位置（−１２２， −１２６，−１４２および−１４６）に存在し、そのうち２つは重なっている。 また、ヒトＭ１１−２３およびＭｉＰ〜２αの３′非翻訳領域においては、それ ぞれ２コピー（、−１５８および−４７１）および５コピー（＋　１４８．士１ ５２．”−１５６，＝１６０および−４９２、うち２つは重なっている）に存在 する。 ネズミ項およびヒトＭｒＰ−２のホモロジー３つのＭＩＰ−２のｃＤＮＡ（ネズ ミ類１つおよびヒト２つ）の間で一致する塩基の割合を、ヒトｇｒｏ／ＭＧＳＡ のｃＤＮＡ　（Ａｎｉ＋ｏｖｉｅ＋、ｅＩｔ［、、１９ｇ７：Ｒｉｃｌ＋ｍｏｎ ａ、ｃｔ　ａｔ、、１９８８）およびネズミ類ＫＣのｃＤＮＡ　（Ｏｑｏｅａａ ｏ、ｅ＋　＊１．。 １９８９：　Ｃｏｃｈ：ｘｎ、ｅ＋　ｉｌ、、１９８３．　Ｃｅ１１．　３３： 　９３９）とともに図４八に示す。ヒトｇｒｏ／ＭＧＳＡのｃＤＮＡはメラノー マ成長促進活性を有するタンパク質をコードしており　（Ｒｔｃｈｍｏｎｊ、ｅ ＋　！１．．　１９８６．　］、Ｃｅ１１．　Ｐｈ７ｔｉｏ１．、　１２９：　 ３７５）　；ネズミ類ＫＣは血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）を誘導しうる遺伝 子であって、ネズミ類における、ヒトＭＧＳへの相同遺伝子であると推定されて いる。注目すべき点は、３つのヒトｃＤＮＡの間、特に、ｈＭＧｓＡとｈｕ−Ｍ ＩＰ−２ａに高度の塩基配列のホモロジーがあることである。図４Ｂに示される ように、コード領域において、３つのヒトの相同遺伝子の間にさらに強い塩基配 列の一致が見られる。ヒトＭＩＰ−２の相同遺伝子の３′非翻訳領域における塩 基配列の一致は、コード領域において見られる一致に比べてはるかに小さい。た だし、ｈｕ−ＭＩＰ−，３αとｈＭＧｓＡのそれぞれの領域は例外である。これ らの２つのＭｕ’−２の１同遺伝子、すなわち、ｈｕ−ＭＩＰ−２ａ、ｈｕ−Ｍ ＪＰ−２３、ヒトｇ　ｒ　ｏ　ｙ’ＭＧ　５　Ａ、　ハムスターにおけるｇｒｏ ／ＭＧＳＡの相同遺伝子（ｈａ−ｇｒｏ）、ｒｎＭＩＰ−２およびｍＫＣの前駆 体タンパク質のホモロジー比較および予想アミノ酸配列を図５　（ＡおよびＢ） に示す。３つのヒトタンパク賀は高いホモロノーを有しているか（８７〜９０％ ）、アミノ酸の相違は予想配列の全体にわたって見られ、特に成熟タンパク質の カルボキノ末端において多く見られる。予想アミノ酸配列のホモロノーのみに基 つくと、ｈｕ−ＶＩＰ−２ａ、ｈｕ−ＭＪＦ−２βまたはヒトｇ　ｒ　ｏ／’Ｍ Ｇ　Ｓ　Ａを、ｍＭＩＰ−２またはネズＥｉＫＣのヒトの相同遺伝子であるとい うことはできない。 塩基配列の一致の割合は、ｈｕ−ＭＪＰ−２α）：ｈＭＧＳＡの間て最も高く、 ｃＤＮＡの全領域にわたって高い一致を示している。ＬＰＳおよびフォルポルミ リスチルアセテート（ＰＭＡ）の双方で活性ｒヒした細胞から辱られたポリＡ− ＲＮＡを用いて１整したじ９３７ＣＤＮＡライブラリーには、ｈｕ−ＭＩＦ’− ２αおよびｈｕ−ＭｒＰ−２βのいずれも存在することから、このライブラリー からｂＭＧＳへのスクリーニングを試みた。ｈＭＧＳＡに特異的な（かつ、ｈｕ −ＭＴＰ−２α／′βに特異的でない）オリゴヌクレオチドを用いて増幅したの ち、ライブラリーから５Ｘ１０’のプラークをスクリーニングしたところ、ポジ ティブな信号は得られなかった。これに対し、５６個のｈｕ−ＭＩＰ−２αボン モイブな信号か検出された。このことは、ＰＭＡおよびＬＰＳて活性化したＵ９ ３７佃胞においては、ｈｕ−ＭＩＰ−２α遺伝子の転写と比較して、ｇｒｏ／Ｍ ＧＳＡの転写が誘導されていないことを示している。 ＶＩＰ−２の活性 ＬＰＳ活性化ＲＡＷ２６４．７佃胞の制限培地から精製された不ズミ類ＶＩＰ− ２は、ＣＦＵ−ＧＭに対するＣ３Ｆ依存性骨髄造血促進活性（Ｂ：＊ｔｍＢ：： 、ｅｔ４１、ニア３９ｊ、皮下注射後の局所炎症反応の刺激、およびヒトＰＭＮ に対する老化活性の可能性（ＶＯＩＤ！、Ｂ　ｘｉ、、１９ａ９！等の多様な活 性を宵している。後者の活性はヒｌ−［Ｌ−８（ｈｕ−ＴＬ−８）の特徴である 。この機能的同等性にのみ基づけば、ｍ＋ＭｒＰ−２はネズミ類におけるｈｕ− ＭＬ、−８の相同遺伝子であることか示唆される。しかし、ｍＭＩＰ−２とｈｕ −ＩＬ−８のアミノ酸のホモロン−は、ｍＭＩＰ−２のｈｕ−ＭＩＰ−２ａ、ｈ ｕ−ＭＩＰ−２βまたはｈｕ−〜４ＧＳＡ（図５）、ｍＭＩＰ−２に対するホモ ロジーと比へて低く、ｍ〜ｆ［Ｐ−２とｈｕ−ＩＬ−８：：不ズミ類、ヒトの相 同遺伝子とは見えない。サイζカイノ間の！ｌ！能の過剰は一般的ではない２カ ケクチン／’ＴＮＦ−ａおよびイノターロイキ７１は重なり合う活性特性を有し ている（Ｍｚｎｏｇｕ＋、ｃｔ　＋１．、　１９８ｇ、’ｃｓｌｌａｌ＋＋ｉｎ ａ　Ｖｏｌ＋ｃｕｌｕ入＋ｐｒｃ＋＋　ｏｆ　Ｉｎ！ｌ＋＋＋ｉａ＋ｉｏｎ’、 Ｐａ１ｎ、ｔ＋　ｚｌ、、ｔｄｒ、、Ｐｌ＋ｎｕｍ、Ｎx。 ０、１２３ｉ。 Ｍ［Ｐ−２およびＩＬ−８はこの機能的冗長性のもうひとつの例であろう。 そのｃＤＮＡ配列に基づいて、ｈｕ−ＶＩＰ−２ａは、マウスＭＩＰ−２を含む ホモロガスな多重遺伝子族の一員として分類できる。この遺伝子族の一員は、好 中球活性化、好中球走化性、ＭＧＳＡ一様マイトジエン活性、繊維芽細胞マイト ジエン活性、Ｃ５Ｆコーフアクター活性、単球走化性、直管新生促進活性および 炎症活性を含むｉｎ　ｖｉｔｒｏ生物活性を有する。ｈｕ−ＭｉＰ−２αポリペ プチドは、多重遺伝子族の任意の一員によって発現されたひとつまたはひとつ以 上の生物活性を育するものを選ぶことができる。ｈｕ−ＭＩＰ−２αポリペプチ ドは骨髄造血の刺激のためにワクチン配合物中のアジュバントとして治療的に、 ならびに揖傷冶癒用に使用され尋る。 ｈｕ−ｙｒｐ−２１２生物活性を１ｏ　ｌ　ｐ　ｅら１９ｇ９＋　：Ｌ’た！ヨ ３ｒｏｘｌＩｅマ＋＋ら’１９８９＋　（それぞれ参照としてここに編入される ）により記載されたアッセイにより測定できる。好中球活性化または走化性など のｈｕ−ＭｒＰ−２α活性に関する他のアッセイを、？ａｌｔｔ　ら　１９８ｇ ）　１．　Ｅｒｐ、　Ｍ＋ｊ、、１７０：　’、７４５　、Ｃｌ５ｒｋ−Ｌｒｖ ｉ＋　ら１９９１１゜Ｂｉｏｔｈ＋ｉ、　、３０　：　、１１２８およびＤｅ： コｌｔｋら１ｇ９θＨｉｖｃｊ＝ｚ、、　２９：　１０２２３　（すべて参照に よりここに編入された。）に記載されたようにｉｎ　ｖｉτｒＱＭ定できる。 ：）＋＝ｎｙｃｋ　らはＭＧＳＡバイオアッセイも記載する。Ｃ８Ｆコーフアク ター活性に関するアッセイはＢ二ｏｕＢｅ：らｌ］９０Ｌ　Ｈ＊ｏａ、７６叫１ １ｔｌおよびｆｌｒｏｒｉｅｙｅｒら１９８９）、１．　ＥＵ、　Ｖｅａ、、　 旦１ｉａ　両方とも参照によりここに編入され副に記載されている。 個々のｈｕ−ＭＩＰ−２αポリペプチドは上記多重遺伝子族の任意の一員のひと つまたはひとつ以上の７ゴニストまたはアンタゴニストとして役立つ。上記の生 物活性アッセイ、およびＭ［Ｐ−２−多重遺伝子族に関するレセプターでのレセ プター結合アンセイは、アゴニストまたはアンタゴニスト活性についてｈｕ−Ｖ ＩＰ−：αポリペプチドをスクリーンするために使用される。アンタゴニスト活 性を現しているｈｕ−ＭＩＰ−２αポリペプチドはレセプターへの結合に関して 多重遺伝子族の所望する員と競合するであろうが、所望の員の生物活性を阻害ら するであろう。アゴニスト活性を有するｈｕ−ＶＩＰ−２αポリペプチドは、増 大した生物活性または所望の多重遺伝子族に匹敵する活性を有するであろう。 アゴニスト活性を有するｈｕ−ＭＡＰ−２αポリペプチドの中には、ツーファク ターとして働きもうひとつの多重遺伝子族の員の活性を増すものもある。他のｈ ｕ−ＭＩＰ−２αポリペプチドは、異なる多重遺伝子族の員からのふたつまたは それ以上の非−重複活性を現す。ｈｕ−ＭｒＰ−２αポリペプチドの中には、例 えば好中球活性化を阻害し、単球活性化活性を増大するひとつのポリペプチドの ようにひとつの活性に対してはアゴニストとして働き、もうひとつの活性に対し てはアンタゴニストとして働くものもある。 治療として、アゴニスト活性を有するｈｕ−Ｍｌ−２αポリペプチドは、他の多 重遺伝子族の員の治療的応用と同様にｈｕ−ＶＩＰ−２αと同じ治療的応用に有 効である。アンタゴニストの活性を有するｈｕ−ＭＩＰ−２αポリペプチドは慝 性疾徽を抑制し、屹癖、リュウマチ関節炎および肺疾患を含む好中球の異常浸潤 のような炎症状態および自己免疫疾徹を予防するであろう。 目的のｈｕ−ＭｒＰ−２αポリペプチドの組の例は、Ｉ　Ｌ−８のレセプター結 合部位に結合するポリペプチドである。ｈｕ−ＭＴＰ−２αはＩＬ−８と［Ｌ− ８レセプターについて効果的に競合する。ＩＬ−８のアゴニストであるｈｕ−Ｍ Ｉ　Ｐ−２αポリペプチドは、レセプターに結合するＩＬ−８と三次元構造の同 じ部分を宵するのであろう。ＩＬ−８に関するＮＭＲおよびＸ−線構造の最近の 研究はレセプター結合部位の決定に有効である：Ｃ１ｏ−亡ら、１９８９．　１ ．　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ、。 ２５４：　１８９０７．Ｃ１ｏ：ｅ　ら、１９９０．　３ｉｏｃｈｔｔｉ、、２ ９：　１６ｇ９：　Ｃ１ｏｒｅ　ら、＋９９１．　）　ＭＤh ＢｉＯｌ、、２ｉ７５ｉｌおよびＢ＋１Ｃｖｉａ　ら、　＋９９１．　Ｐ＋Ｏｃ 、　’ｉ１１．　（＋ｉａ、ＳＣ：、　ＵＳ：八、３８５０２）。 造血細胞の骨ｆｉｔ！血の刺激のために“有効量”のｈｕ−ＭＴＰ−２αポリペ プチド量は、骨髄造血において検出され辱る増加を作る量である（例えばＢ＋ｏ ｘｍ＋マＣ′ら、１９８９のアッセイを参照）そのようなポリペプチドの他の活 性に関するｈｕ−ＭｒＰ−２αポリペプチドの有効量は、上記したような適当な ７ノセイにおいて検出し得る応答を作る量である。 ｈｕ−ＭＩＰ−２αを含有する組成物の調製実賀的に他のヒトタンパク質を含ま ないｈｕ−ＭＩＰ−２αポリペプチドを含有する組成物は天然源から精製するこ とにより、化学合成によりまたは組み替えＤＮＡ法により調製できる。天然に生 産されたｈｕ−ＭＩＰ−２αの粗抽出物は、天然タンパク質の任意の便利な資源 から調製できる。好ましい源はＬＰＳに刺激されたヒトマトクロファージ細胞系 である。ｈｕ−ＭＩＰ−２αを含有する無細胞系抽出物は、例えば以下の免疫ア ッセイで決定されるが、さらなる精製の開始物質として役立つ。この精製は、タ ７バク賞精製技術において周知である技術に従って達成できる。例えば、種々の タイプのクロマトグラフィーを使用できる。 使用できるカラムは、ゲル濾過カラムと同様にＤＥＡＥセルロースカラム、また は陰イオン交換カラムである。好ましい精製法は、Ｔｏｌｐｅ　ら’１９８９＋ の教示に従う。 この精製工程を以下に記載する、Ｔｏｌｐｅ　ら′１９１１９）または１ｌｏｏ ＋ｅｕ：　ら１１９８９＋による免疫アッセイまたはＭＩＰ−２活性アツセイに より監督することができ、これらは参照によりここに編入される。 ｈｕ−ＭＩＰ−２αまたはそのペプチド断片は、免疫アフィニティー技術を使用 しても精製できる。本発明のタンパク質を精製するだめの本発明の抗体の使用は 、これらのほとんど同じようなタンパク質から良好な分離をもたらす。もちろん 、当業者には精製の他の技術も知られ、本発明のペプチドを精製するために使用 できる。 他の方法として本発明のｈｕ−ＭＩＦ’−２αポリペプチドを化学合成によって 調製できる。例えば、Ｍｅ＋＝ｉｌｉｅｌａ技術’Ｊｏｎ！ａａｌ　ａｌ　Ａ＋ ｕ：ＩＣ！ｎＣｈ＋ｚｉｃｉｌ　Ｓｏ＋ｉ＋＋７゜ｖｏｌ、８５．　Ｈ，２１４ ９−−２１５４，１９６＆）を使用できる。 適当な組織／液体供給源からｈｕ−ＭｒＰ−２αを精製することが可能である。 しかしながら、化学的に合成でき又はいくつかの方法の一つで単離できる、ｈｕ −ＭｒＰ−２αコ一ドＤＮＡ配列から組換え法で製造することが好ましい。 合成すべきＤＮＡ配列は、ｈｕ−ＭＩＰ−２αアミノ酸配列の適当なコドンを用 いて設計することができる。一般に、該配列を発現用に用いるのであれば、意図 する宿主のために好ましいコドンが選択されるであろう。完全な配列は、標準的 方法で調製されそして完全コード配列に集成される、重複オリゴヌクレオチドカ ラ集成サレル。例えば、Ｅｃ（＋　１９ａｌｌ　’ｈｕｎｔ、４３辷１５６．　 ＭＡｌｂ＋１＋　ら、’１９ｄ４）Ｋｃｉｅｎｃ＋　、２２３：　！２９９ニジ エイＩ！りら、（１９１１１４，ｌｔ＋ｏ１．　Ｃｈｖ、、２５９：　６３１！ を参照されたい。単離方法はその一部を、適当なオリゴヌクレオチドプローブを 用いた核酸のハイブリダイセージ３ンに依存する。そのようなプローブは、木調 細嘗に開示されているＤＮＡまたはアミノ酸配列に基づいて合成反応で構築可能 であり、或いはこれら木調ｍｙに記載されているゲノムもしくはｃＤＮＡクロー ンから単離可能である。 核酸ライブラリーの１製 オリゴヌクレオチドプローブ及びＤＮＡライブラリーの調製のための基本的戦略 、並びに該ライブラリーを核酸ハイブリダイセージ３によりスクリーニングする 基本的戦略は、当業者に周知である。例えば、ＤＮＡクローニング（ＤＮへＣｌ ｏｎｉｎｇｌ第１巻（１）、Ｐ、Ｇｉｏｗｈ：＠、１９８５）　：核酸ハイブリ ダイゼーシラ７Ｙｕ＋ｌ鼻ｉ：　、ＩＣ：ａ　Ｈ７ｈ＋ｔｄｉ＋Ｊ＋ｉｏａ＋　 ’Ｂ、）、ｔｌｘｍｅ＋　ｋ　Ｓ、１．　Ｈｉｇｇｉ：＋＋４．　！９ｉ１T） 　；オリ ゴヌクレオチドの合成Ｏｌ＋７ｏ＊ｓ：ｌ＋ｐ＋ｉｊ＝　３？＝＋ｈ豐ｉｉ＋ｉ 　’Ｌ　１．　Ｇｚｔｅ！ｉｉ、　１９８４）　；Ｔ、　Ｖａｎ、・ｓｒ（＋　 ら１　モレキュラー・クローニング　ア・ラボラトリ−・マニュアルｖＯｉ＋＋ ＋１＋＋　Ｃｌｏｎｉｎｇ入ＬＪｂａ：ｕ口・マＭａｎａｉｌ！　’ｉ９Ｈ！： 　８．　Ｐ：：５ｘｌ、ア・プラクティカルガイド・ツー・モレキュラー・クロ ーニング（Ａ　？’、！＋ＩＢＮ　Ｇ１１ｌｄ！　ＴＯ’１ａｉｒ＜＊ｌｒ：　 ＣＩｏｎｉＢ）　’１９ε」］を磐照されたい。先ず、ＤＮＡライブラリーを調 製する。ライブラリーはヒトＮＲのゲノムＤＮＡライブラリーであってよい。ヒ トのゲノムラップラリ−は、この分野で知られている。例えば、Ｔｏｎｉ＋＋ｉ ＋ら、１９７８）Ｃｔｉｌ、：５：　５ａ７−；０１：　Ｌｘｖｎ　ら、１９７ ＆ｆ皿、１５：　１１５７−１１７４を参照されたい。 より好ましいのは、逆転写反応によりポリ−Ａ、ＲＮＡ　（ｍＲＮＡ）から調製 されたｃＤＮＡからなるＤＮＡライブラリーである。例えば米国特許４．　４４ ６゜３２５；４．４４０．８５９＋４．４４３．１４０；４．４３１．７４０； ４゜３７０．４１７：４．３８３．８７７を参照されたい。ｍＲＮＡは、マクロ ７ｙ−ジ細胞ラインのようなｈｕ−ＭＴＰ−２αを発現すると信じられる細胞ラ インまたは組織から単離される。ｃＤＮＡライブラリー構築のための適当なｍＲ ＮＡ原は、Ｕ９３７紐胞ラインである。ゲノムＤＮＡまたはｃＤＮＡはライブラ リーの構築に適するベクターにクローニングされる。好ましいベクターはバクテ リオファージベクター、例えば任意のラムダフ７〜ノである。ｉ！１当なライブ ラリーの構築は当業者の技術範囲内である。例えば３Ｐ！・ｂ！１（前記）を！ ＃照されたい。 核酸プローブの調製 ライブラリーが構築できたら、すりゴヌクレオチドを用いてこのライブラリーを プローブ処理し、ｈｕ−ＶＩＰ−２αポリペプチドをコードする配列を担うセグ メ／トを突き止める。一般にプローブは、好ましくは公知の核酸配列もしくはｃ ＤＮＡクローンからの推定アミノ酸配列に基づいて化学合成される。 或いは、ｍＲＮＡ用に良好な組織課不存在においては、タンパク質由来の配列を 得ることが必要になることがある。Ｎ末端の配列は、Ｎ末端配列分析によって得 ることができる。内部配列の決定は、例えば、通常の方法で精製されたタンパク 質のスタフ（Ｓｔａｐｈ）−Ｖ８タンパク質加水分解に続いて、消化産物の還元 的アルキル化および高速液体クロマトグラフィーによる分離によって行うことが できる。次に、分離した酵素断片に対応する溶離ピークは標準法によって配列順 序を決定することができる。そのアミノ酸配列から、オリゴヌクレオチドを、ハ イブリダイゼーシヨンプローブとして用いてゲノムＤＮＡのｃＤＮＡ配列かまた はエキソンの位置を決定するように設計し且つ製造することができる。最終的に 、単離されたエキソンを、成熟タンパク質をコードしている核酸配列に対してそ れらが対応するように互いに連結させる。 ヌクレオチド配列を選択して、アミノ酸配列をコードするコドンに対応するよう にする。遺伝暗号は重複しているので、通常、タンパク質の特定の領域をコード する全部または相応の数の可能なヌクレオチド配列を包含する数ＮＷｉのオリゴ ヌクレオチドを合成する必要がある。したがって、一定領域の配列を選択してそ れに基づいたプローブにする場合、その領域はコドンが高度に縮重しているアミ ノ酸を含まないのが概して好ましい、しかしながら、ヒトには希にしか用いられ ない（ライブラリーを製造する）コドン含有プローブを製造する必要はない。 更に、抗体は、選択された組織、細胞抽出物または体液中に存在する何等かの望 ましいタンパク質を免疫沈降させるのに用いることができる。次に、この源由来 の精製されたＭ［Ｐ−２は、前記に記載の特定のプローブを設計するための基準 として配列決定し且つ用いることができる。 当業者は、対応する核酸配列において高度に重複性を１ｖするであろうアミノ酸 配列のかなり長いおよび／または包含領域であるプローブを製造することが望ま しいことを理解することができる。完全な遺伝子または遺伝子の実質的部分を包 含するプローブは、更に、相同性の予憬された程度ゆえに適当であることができ る。配列は種系列にわたって高度に保存され、そしてマウスなどの別の種由来の コード配列を含むプローブを容易に用いて、ヒトＤＮＡから製造されたライブラ リーをスクリーンすることができる。池の場合において、それぞれが遺伝子の異 なる領域に対する二組のプローブを同時に用いるのが望ましいことがある。用い られた任意のプローブの正確な長さは臨界的ではないが、典型的なプローブ配列 の長さは１０００ヌクレオチド以下であり、更に典型的には、それらは２５０ヌ クレオチド以下であり；それらは１００ヌクレオチド以下であってよいし、更に 、７５ヌクレオチド以下の長さであってよい。概して、当該技術分野において、 約１４〜約２０塩基対のプローブが通常有効であると確認される。ｈｕ−ＭｒＰ −２αは極めて相同のタンパク質の群に萬するので、ｈｕ−ＭＩＰ−２αに特有 の配ア１を含むプローブは、関連配ダＩ間の識別に好適である。一層長い配列は 、関連標的配列を識別できるように十分に異なる特有のポリヌクレオチド領域を 包含するのに必要であることがある。この理由のために、プローブの長さは約１ ０〜釣１００ヌクレオ千ドであるのが好ましく、更に好ましくは、約２０〜約５ ０プローブを用いるクローンの選択 当該技術分野で知られているように、オリゴヌクレオチドプローブを標１法を用 いる放射性ヌクレオチドまたはビオチンなどのマーカーで標識する。次に、プロ ーブの標識されたセントを標準法にしたがって、ライブラリーから単離された５ ｓＤＮＡに対して一重鎖ブローブをハイブリッド形成させることから成るスクリ ーニング工程で用いる。緊縮かまたは許容ハイブリダイゼーション条件は、制限 されないが、プローブの長さ、プローブおよびライブラリーが同一種由来である か否かおよび種か進化的に近縁かａ隔かどうかを含むいくつかの因子に応じて適 当であることができる。桁間配列か゛単離され且つ検出可能な上記のバ、！クグ ラウンドハイブ！Ｊダイゼーン３ンであるようにハイブリダイゼーション条件を 最適にすることは当該技術の範囲内である。基本的要件は、ノ飄イブリダイゼー ンタン条件が、選択的ハイブリダイゼーションを生じるような十分な緊縮から成 る、すなわち、非特異的結合とは反対に、ハイブリダイゼーシヨンが最小の程度 の核酸相同性（例えば、少なくとも約７５％）に依存するまたはＩ＼イブリダイ ゼーン遭ンが一層低い程度の相同性に依存するということである。概して、「核 ６！／−イブリダイゼーション（Ｎｕｅｌｅｉｅ　Ａｃ１ｄ　Ｈ７ｂ＋ｉｄｉｍ ｉｏａｌ　Ｊ　、上記、を；照されたい。 ｍＭ■Ｐ−２と近い関係にある配列数ゆえに、特有のプローブ配列および緊縮） １イブリダイゼ一ンコン条件双方が好ましい。スクリーンされたライブラリーか らのクローンが正のハイブリダイゼーションによって一旦確認されたら、それを 更に、制限酵素分析およびＤＮＡｆ！Ｆｌ決定によって特徴化して、特定のクロ ーンが望ましいタンパク質のコード配列を含むことを確証することができる。 することができる。クローンを３′かまたは３′方向で「染色体歩行」技法を用 いて延長して、完全な遺伝子コード領域の包含を確実にすることができる。次に 、これらのクローンの制限断片を、例えば、望ましいタンパク質をコードしてい るｃＤＮＡを用いて精査することができる。これらのエキソン中に十分な相同性 が存在する場合、他のエキソンは同一のｃＤＮＡクローンで確認することができ る。　ゲノムクローンの他のコード領域は、現在のＭ１３−ジデオキシ配列決定 法を用いるクローン化されたエキソンのＤＮＡ下流の直接配列決定によって速や かに確認することができる。次に、配列を３種類の読み取り枠全部において点検 して読み取り枠を明らかにする。更に、他のエキソンは、それらがインドロンー スプラインングシグナルによって両側に結合するものであり且つ異なる種由米の ＭＡＰ−’ｌ’　ｓに共通するアミノ酸をコードしなければならないので明らか で更に具体的に、ｈｕ−ＶＩＰ−２αの少なくとも一つのエキソンに対する正し い遺伝子コード配列が分かったら、それを用いて、下記の手段の１種類以上によ って酵素の完全なタンパク質コード領域を得ることかできる。最初に、望ましい 配列断片をクローンから削除し且つ一層好都合なベクター、例えば、ｐＢＲ３２ ２に入れて、断片自体のみを含む多量のＤＮＡをハイブリダイゼ一ンヨンプ口− ブとして得且つ用いることかできるようにすることができる。或いは、コード領 域の特有の領域に対応するオリゴヌクレオモトを合成することができる。双方と もゲノムＤＮＡライブラリーのための！ヅブリダイセ−７コンブローブとして用 いることができる。 プラスミドＤＮＡと一緒にモヤイニーズｌ＼ムスター卵巣（Ｃ［（Ｏ）細胞中に 同時トランスフエクトする二とかできる。抗生物質Ｇ４１８およびＣｄ−の存在 下で選択された生存細胞を、タンパク質をコードする配列に対して７％イブリッ ド形成するＲＮ、へ転写物の存在に関して、抽出されたＲＮＡのノーザンブロソ トによって分析することができる。次に、望ましい転写物を含むクローンを、ｃ ＤＮＡライブラリー構築のためのｍＲＮＡ源として用いることができる。或いは 、種々の源、例えば、腹腔細胞および′ｉｌ＋、内皮組織並びに末梢血液白血球 、りン／＜球および大食細胞から得られたｍ　ＲＮ　Ａのノーザンプロットを、 プローブに対するハイブリダイゼーションに関して試験することができる。更に 、種々のｔＨ抱系、例えば、ＬＰＳに刺激されたＵ９３７およびＦ（Ｌ６０から のｍＲＮＡを試験する二ともてきる。次に、検出可能な濃度の１１イブＩＪブト 形成ｍＲＮＡを含む任意の組織またはｗＥ＠源を用いて、望ましいタン／＜り質 をコードする完全な長さのｃＤＮＡを検出するために同一のプローブでスクリー ンされるｃＤＮＡライブラができる。 特定邪位の突然変異誘発は、望ましい突然変異を示す育限誤対合を除いて、突然 変異させる配列を含む一重鎖ファージＤＮＡに相補的なプライマー合成オリゴヌ クレオチドを用いるポリメラーゼ連鎖反応方法論によって実施するのが好ましい 。簡単には、合成オリゴヌクレオチドを、ファージに相補的な鎖の直接合成に対 するプライマーとして用い、そして得られた二重鎖ＤＮＡを）７−ジ支持宿主細 菌中に形質転換させる。形質転換された細菌の培養物を上部寒天にプレートし、 プローブを含んでいる単一細胞からプラークを形成させる。理論的には、新規の プラークの５０％が一重鎖として突然変異型を有するファージを含み：３０％は 元の配列を有する。得られたプラークを、正確な対合のノ＼イブリダイゼーシｊ ンを可能にするが、元の鎖との誤対合がハイブリダイゼーシヨンを妨げるのに十 分である温度でキナーゼ合成（ＶｏａＩ＝ｄ＋２ｎ＋ｈ＋＋ｉｃ）プライマーと Ｉ＼イブリッド形成させる。次に、プローブとハイブリッド形成するプラークを 選択し、培養し、そしてＤＮＡを回収する。 発現のためのクローニング ｈｕ−ＭＴＰ−２αのためのコード配列を製造しまたは単離したら、それを任意 の適当なベクターまたはレブリコ／中にクローン化し、それによって、ＶＩＰ− ２コ一ド配列を含まないベクターを実質的に含まない（例えば、ライブラリーか らの他のクローンを含まない）組成物中で維持することができる。多数のクロー ニングベクターが当業者に知られており、適当なりローニングベクターの選択は 選択の種類の問題である。クローニングのための組換え体ＤＮＡベクターおよび それらが形質転換することができる宿主細胞の例としては、種々のバクテリオフ ァージラムダベクター（大腸菌（ε　ｃｏｌｉｃ）　、ｐＢＲ３２２（大腸菌） 、ｐＡｃＹｃ１７７　（大腸菌）、ｐｋＴ２３０　（グラム陰性細菌）、ｐＧ１ １０６　（グラム陰性細菌）、ｐＬＡＦＲｌ　’、グラム陰性細Ｉり、ｐＨＶ１ ４（大腸菌および枯草ｉｌｌ　（Ｂｉ＋１ｌｌｕ＋　＋ｏ１＋目Ｎｉ１ｌｉ、ｐ ＢＤ９（バチルス属（：Ｂａｃｉ：ｉｕ＋）　）　、Ｉ）　Ｉ　Ｊ　６１　（ス トレプトミセス属（Ｓｔ：：ｐ＋ｏ３７ｃｅｕ）、ｐじＣ６（ストレプトミセス 属〕、アク千ノファージ、ｄｃ３１　（ストレプトミセス属）、ＹＩｐ５　（サ ツカロミセス！Ｋ　（３ｚｃｃｈｚｔｙｍＨ＝ｓノン、ＹＣｐ１９（サノ力ロミ セス＠）およびつ／乳頭種ウィルス（哺乳動物細胞）がある、概して、ｒＤＮＡ りａ−＝ング（Ｃｌｏｎｉｌｌｇ）Ｊ第１および■轡、上記１Ｔ、マニアティス （ｖｉ＋１ｘｔｉｉ）ら、上記、Ｂ、バーパル（ＰｌＨｂｚｌ）、上記、を参照 されたい。 本発明のＤＮＡ配列およびＤＮＡ分子は、広範囲の宿主７′ベクター組合せを用 いて発現させることができる。例えば、有用なベクターは、染色体、非染色体（ 例えば、ＳＶ４０の種々の既知の誘導体および既知の細菌プラスミド、例えば、 ｃｏｌＥｌ、ｐｃＲｌ、ｐＢＲ３２２，ｐＭＢ９およびＲＰ４を含む大腸菌から のプラスミド）または合成りＮＡ配列、ファージの誘導体く例えば、ＮＭ９８９ ）および繊維状−重鎖ＤＮＡファージを含むファージＤＮＡ５　（Ｍ１３）　、 酵母で有用なベクター（例えば、２ミクロンプラスミド）、真核細胞で有用なベ クター（例えば、動物細胞で有用なベクター、例えば、５Ｖ−４０、アデノウィ ルスおよびレトロウィルスに誘導されたＤＮＡ配列を含むもの）およびプラスミ ドおよびファージＤＮＡ５の組合せから誘導されたベクター（例えば、ファージ ＤＮＡを用いるように修飾されたプラスミド）またはそれらの他の誘導体の断片 を含むことができる。 本発明により、ｈｕ−ＶＩＰ−２αポリペプチドのコード配列を、プロモーター 、リポソーム結合部位（細菌の発現に対して）、そして場合により、オペレータ ーく本明細書中において集合的に「制御」要素と称する）の制御下に置き、その 結果、ｈｕ−ＭＩＰ−２αポリペプチドをコードするＤＮＡ配列は、二の発現構 築物を含むベクターによって形質転換された宿主細胞においてＲＮＡ中に転写さ れる。コード配列は、シグナルペプチドまたはリーダー配列を含んでいてよいし または含まなくてもよい。コード配列がシグナルペプチドを含む場合、それはｈ ｕ−ＭＩＰ−２αに当然関係したシグナル配列であってよいしまたはなくてもよ い。＠菌では、例えば、成熟ｈｕ−Ｍ■Ｐ−２αは、哺乳動物シグナルペプチド を含まないコード配列の発現によるが、むしろ翻訳後処理において細菌宿主によ って除去されるリーダー配列を含むコード配列の発現によって製造するのが好ま しい。例えば、米国特許第４．４３１．７３９号明佃書、同第４．４２５．４３ ７号明細嘗：同第４，３３８．３９７号明細書を膠照されたい。 好ましくは、発現ベクターは少なくとも１覆類の発現制御配列を既に含み、それ は、クローン化したＤＮＡ配列の発現を制御し且つ１節するためにそれをベクタ ーに挿入した時に、ＤＮＡコード配列に対して操作によって結合することができ る。有用な発現制御配列の例は、ｌａｃシステム、ｔｒｐシステム、ｔａｃシス テム、ｔｒｃシステム、ラムダフ７一ノの主オペレーターおよびプロモーター領 域、ｆｄコツータンパク質の制御領域、酵母の解糖プロモーター（例えば、３ホ スホグリセリン酸キナーゼのプロモーター）、酵母酸ホスファターゼのプロモー ター（例えば、Ｐｂｏ２）、酵母アルファ接合因子のプロモーターおよびポリオ ーマ、アデノウィルス、レトロウィルスまたはンミアンウイルスから誘導された プロモーター（例えば、ＳＶ４０の初期および後期プロモーター）並びに原核ま たは真核細胞およびそれらのウィルスまたはそれらの組合せの遺伝子の発現を制 御することが知られている他の配列である。 発現ベクターを本発明によって構築し、その結果、ｈｕ−ＭＩＰ−２αコ一ド配 列は、そのコード配列が、制御配列の「制御」下で転写されるような適当な調節 配列と一緒にベクター中に位置する（すなわち、制御配列でＤＮＡ分子に結合す るＲＮＡポリメラーゼはコード配列を転写する）。制御配列は、前記に記載した クローニングベクターなどのベクター中に挿入する前に、コード配列に連結する ことができる。或いは、コード配列は、制御配列および適当な制限部位を既に含 んでいる発現ベクター中に直接クローン化することができる。原核生物および酵 母における望ましいタンパク質の発現に対して、必然的に、制御配列はコード配 列と異種である。宿主細胞が原核生物である場合、更に、そのコード配列はイン トロンを含まないことが不可欠である（例えば、ｃＤＮＡ）。選択された宿主細 胞が哺乳動物細胞である場合、その制御配列はｈｕ−ＭＩＰ−２αコ一ド配列と 異種または相同であることができ、そしてそのコード配列はゲノムＤＮＡ　（イ ントロンを含む）かまたはｃＤＮＡであることができる。ゲノムかまたはｃＤＮ Ａコード配列は酵母において発現することができる。 更に、それぞれの特異的発現ベクター中の種々の部位を、本発明のＤＮＡ配列の 挿入用に選択することができる。これらの部位は、通常、それらを切断する制限 エンドヌクレアーゼによって指定される。それらは当業者によって十分に認めら れている。当然ながら、本発明において有用な発現ベクターは、選択されたＤＮ Ａ断片を挿入するための制限エンドヌクレアーゼ品位を有する必要かないという ことは理解される。その代わりに、ベクターを別の手段によって断片に結合する ことかできる。発現ベクター、特に、選択されたＤＮＡ断片を挿入するためにそ こにおいて選択された部位およびそこにおいて発現制御配列に対するその操作に よる結合は、様々な因子、例えば、特定の制限酵素に敏感な品位の数、タンパク 質の大きさ並びに発現特性、例えば、ベクターに関係する開始および停止コドン の位置によって決定される。ＤＮＡ配列のための挿入品位は、ある与えられた状 態に等しく有効である選択全部ではなく、これらの因子の均衡によって決定され る。多数の原核生物発現ベクターが当該技術分野において知られている。例えば 、米国特許第４．４４０．８５９号明細書、同第４．４３６．８１３号明細書、 同第４，４３１．７４０号明細書、同第４．４３１　７３９号明細書：同第４． ４．２８．９４１号明細嘗：同第４．４２５．４３７号明細嘗：同罵４，４１８ ．１４９号明細書：同第４．４１１．９９４号明細書：同第４，３６６．２４６ 号明細嘗：同第４．３４２．８３２号明細嘗を診照されたい；更に、英国特許公 開公報東ＧＢ２．１２１　０５４号明細書；同第ＧＢ２．００８，１２３号明細 嘗：同第ＧＢ２．００７．６７５号明細嘗；および欧州特許公開公報第１０３゜ ３９５号明細書をＩＩ照されたい。好ましい原核生物発現システムは大腸菌の場 合である。他の好ましい発現ベクターは真核生物システムにおいて用いるための ものである。好ましい真核生物発現システムは、当該技術分野において周知であ るワクシニアウィルスを用いるものである。例えば、マケット（＋ｉ！ｃｋｕｔ ｉら１９８４１ｉｖｉ＊１．　４９：　ａ３Ｔ　；　「Ｄ　ＮＡクローニング」 、第■巻、１９１〜２＋１頁、上記・ＰＣＴ特許公開公報第ＷＯ８６／’０７５ ９３号明細書を膠照されたい。Ｈ発現ベクターは当該技術分野において知られて いる。例えば、米国特許第４．４４６゜２３５号明細嘗、同第４．４４３．５３ ９号明細書：開方４，４３０．４２８号明細書をＩＩ照されたい：更に、欧州特 許公開公報１１１０３．４０９号明細書、同第１００．５６１号明旧書、同第９ ６．４９１号明細書を膠照されたい。もう一つの発現システムは、千ヤイニーズ ハムスター卵巣細胞を形質転換するベクターｐ［（Ｓ　Ｉである。ベクターの使 用はＰＣＴ特許公開公報第ＷＯ８７／　０２０６２号明細書に記載されている。 有用な発現宿主としては、周知の真核生物および原峻生物宿主、例えば、大腸菌 の菌株、例えば、大腸菌５Ｇ−９３６、大腸１１１ＨＢ１０１、大腸菌Ｗ３　Ｌ 　１０、大腸菌Ｘ１７７６、大腸菌Ｘ２２８２、大腸菌ＤＨＩおよび大腸菌ＭＲ Ｃ＋。 ツユ−トモナスｌｌ’Ｐ＋ｉａα０１ＩＯｆｉ！り、バチルス属、例えば、枯草 菌、ストレプトミセス属、酵母および他の真菌、動物細胞、例えば、ＣＯ３細胞 およびＣＨＯ細胞並びに組織培養中のヒト細胞および植物細胞を挙げることがで きる。 当然ながら、全ての宿主／発現ベクターの組合せが、本発明のＤＮＡ配列を発現 する場合にまたは本発明のポリペプチドを製造する場合に等しく効率的に機能す るわけではない。しかしながら、宿主／′発現ベクターの組合せの特別な選択は 、当業者によって行うことができる。例えば、その選択は多数の因子の均衡に基 づいていなければならない。これらには、宿主およびベクターの適合性、ＤＮＡ 配列によってコードされたタンパク質の宿主に対する毒性、望ましいタンｌくり 質の回収の容易さ、ＤＮＡ配列およびそれらに対して操作によって結合した発現 制御配列の発現特性、生物安全性、費用並びに望ましいタンパク質の折りたたみ 、形態または任意の他の必要な発現後修飾がある。好ましくは、宿主細胞は、ｈ ｕ−Ｍｒｐ−２αを分解するプロテアーゼを発現しないものである。 酵母発現システムにおけるクローニング好ましい発現システムは酵母である。ｈ ｕ−ＭＩＰ−２αは、ｈｕ−ＭＩＦ−２αに対するＤＮＡ−−ド配列を含む発現 ベクターを用いて酵母プロモーターの制御下で形質転換した酵母細胞によって発 現することができる。このような発現ベクターは下記のように構築することがで きる。 酵母プロモーターは、酵母ＲＮＡポリメラーゼを結合し且つｍＲＮＡ中へのコー ド配列（例えば、構造遺伝子）の下流（３′）の転写を開始することができる任 意のＤＮＡ配列である。プロモーターは、コード配列の５′末端付近に通常位置 している転写開始領域を有する。この転写開始領域は、典型的に、ｍ　ＲＮ　、 Ａポリメラーゼ結合部位（ｒＴＡＴＡボブクス」〕および転写開始部位を含む。 更に、酵母プロモーターは、上流活性化配列（ビＡＳ）と称する第二のドメイン を有することかでき、通常それは、存在する場合、構造遺伝子の末端である。Ｌ ″ＡＳは調節された（誘導しうる）発現を可能にする。構成性発現はじＡｓ不存 在において生じる。調節された発現は正かまたは負であることができ、それによ って転写を増大させるかまたは減少させる。 酵母は活性代謝経路を有する発酵性生物であり、したがって、代謝経路における 酵素をコードする配列は特に有用なプロモーター配列を提供する。例としては、 アルコールデヒドロゲナーゼ＜Ａ、ＤＨ）（欧州特許庁特許公開公報第２８４０ ４４号明細書〕、エノラーゼ、グルコキナーゼ、クールコース−６−リン酸イノ メラーゼ、グリセルアルデヒド−３−リン酸−デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰまたは ＧＡＰＤＨ）、ヘキソキナーゼ、ホスホフルクトキナーゼ、３−ホスホグリセリ ン酸ムターゼおよびピルビン酸キナーゼ（ＰｙＫ）（欧州特許庁特許公開公報第 ３２９２０３号明細書）がある。酸ホスファターゼをコードする酵母ＰＨ０５遺 伝子は、更に、有用なプロモーター配列を提供する〔ミャノハラ：：Ｍ１！ｕｏ ｈｘｔｚｌら。 （ｉ９Ｂ３）　Ｐｙａｃ、！ｌｕｔ、、４ｃｘｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ、ａＱ：　ｌ ）。 更に、天然に存在していない合成プロモーターも、酵母プロモーターとして機能 する。例えば、一つの酵母プロモーターのＵＡＳ配列は、Ｗｌ＋の酵母プロそ一 ターの転写活性領域と結合することができ、合成ハイブリッドプロモーターを生 じる。このようなハイブリッドプロモーターの例としては、ＧＡＰ転写活性項域 に結合したＡＤＨ調節配列がある（米国特許第４．８７６．１９７号明ｉｔ；同 第４．８８０．７３４号明細Ｍ）。ハイブリッドプロモーターの他の例としては 、遺伝子ＡＤＨ２，ＧＡＬ４．ＧＡＬＩＯかまたはＰＥ（０５の調節配列から成 る、ＧＡＰまたはＰＹＫなどの解糖酵素遺伝子の転写活性領域と組合わされたプ ロモーターがある（欧州特許庁特許公開公報東１６４５５６号明ｌｕｌり。更に 、酵母プロモーターとしては、酵母ＲＮＡポリメラーゼを結合し且つ転写を開始 する能力を宵する非酵母起源の天然に存在するプロモーターを挙げることかでき る。 例えば、ツーｓン（Ｃｏｈｅｏｉら（１９８０）　？：＊ｃ、Ｎ！ｔｌ　〜ｃｈ ａ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ、７Ｔ：　ＩＱτ３：ヘニコフ’ｔｌｔｎｉｋｏｉｌら 、（１１４１）　”ｉ！ｕ：ｔ、２８３：　３３ｇ：ホレンバーグＨｏ１ｌｕｂ ｅ：ｇｌら、　（ＩＨＩ）　Ｃ＋＋゛　丁＊ｐｌｃｓ　＋４ｉ＋＋＊ｂｉ、＋ｉ 、！ｚｍｕｏｏ１．．　９６：　１１９　ホレンバーグら。 Ｐｌｉ＋ｍｉ＋＋　ｏｖｕｉｃｚｌ　Ｅａｖｉ＋Ｏｎ＋ｕｂｔａ：　＋ｎ＊　Ｃ ａｍａｅ：二ｉｒｌ　ｌｕｏ＋ｕｃｃ＋　（Ｋ、Ｎ　ティミス’Ｔｉｍｍ１＋ｉ およびＡ、ピューラー（ｈｎ１＋・）監修）の「ビール酵母園における細菌の抗 生物質耐性遺伝子の発現（丁ｈ＋　Ｅ＋ｐ＋ｅ＋ｉ＋ｏｎ　・）：　３ａ＋ｕ： ｉａｌ〜Ｑ［１ｊｌＯ！（（Ｒｅｉｉｓ＋！ｎ＋ｅ　ＧｅｎｒＩｉｎ　＋ｈｔ　 Ｙｅ！ｉｔ　Ｓｚｃ：ｈａ＋ｏｎ７ｃｃ＋　ｅｅ＋＋ｙｉｉｉｏ）　Ｊ　；メル セルー・ピガロン（Ｍｕｃ＋＋＋ｉｕ−Ｐｌｉｇｉｌｏｎ）らｔ１９ＢＧ）　Ｇ ｏｎｅ、Ｉｔ：　１６３；パンチア：ＰｇＮｂ＋ｅｒＪら（１９８０）　、　Ｃ ｕｔ：、　ｑｅｎ＋＋、、２：　１０９をｔａされたい。 ＤＮＡ分子は細胞内で発現することができる。プロモーター配列はＤＮＡ分子と 直接結合することができ、その場合、組換えタンパク質のＮ末端の最初のアミノ 酸は常にメチオニンであり、それがＡＴＧ開始コドンによってコードされる。 所望ならば、Ｎ末端のメチオニンを、インビトロでの臭化シアンとのインキュベ ーンクンによってタンパク質から開裂させることができる。 融合タンパク質は直接発現に対する変法を提供する。典型的に、内因性酵母タン パク質または他の安定なタンパク質のＮ末端をコードするＤＮＡ配列を、異種の コード果列の５′末端に融合させる。発現によって、この構築物は２種類のアミ ノ酸配列の融合を提供する。例えば、酵母またはヒトのスーパーオキシドムター ゼ（ＳＯＤ）遺伝子は、異種の遺伝子の５′末端に結合し且つ酵母で発現するこ とができる。２種類のアミノ酸配列の結合部のＤＮＡ配列は、開裂しうる部位を コードしてもよいしまたはしなくてもよい。例えば、欧州特許庁特許公開公報第 １９６０５６号明細書を参照されたい。もう一つの例は、ユビキチン融合タンパ ク質である。このような融合タンパク質は、好ましくは、プロセッシング酵素（ ＩＩＦＩＩえば、ユビキチン特異的プロセッンングブロテアーゼ）のための部位 を保持して、異種のタンパク質からのユビキチンを開裂させるユビキチン「リー ダー」またはｒｐｒｏ−ＪｆＪｉ域を用いて製造される。したがって、この方法 により、未変性の異種タンパク質を単離することができる〔参考としてその開示 が本明細書中に包含されている、Ｐ、Ｃ，Ｔ、特許第ＷＯ３８１０２４０６６号 明細書；　１９８９年８月７日出願の同−所育の米国特許出願第３９０．５９９ 号明細書または（ジーウエント・パブリケーンヨン・リミテッドｊＤｅｒτｅＮ 　Ｐσｈｌｉｃｚ＋ｉｎ。 Ｌ＋ｊ、）によって作製された世界特許索引（Ｗｏｒｌｄ　Ｐａｌ＋ｃＨＩｆｉ ｄｅｒ）に記載の）それから優先権を主張する外国特許若しくは出願］。 別法として、酵母内ての分泌を提供するリーダー配列断片と外来遺伝子からなる 融合タンパク質をコードするキメラＤＮＡ分子を作成することにより、細胞から 生育培地中に外来タンパク質を分泌させることもできる。好ましくは、該り一ジ ー配列と該外来遺伝子との間にプロセッング部位（インビボまたはインビトロ） を育する。リーダー配列は、典型的には細胞からのタンパク質の分泌をさせる親 水性アミノ酸からなるノグナルベプキドをコードする。 適切なノブナル配列をコードするＤＮＡは、分泌された酵母タンパク質遺伝子、 例えば酵母インベルターゼ遺伝子（欧州特許公開番号系１２．８７３号。 Ｊ、Ｐ、　Ｏ，公開番号系６２．０９６．０８６号）およびＡ−因子遺伝子（米 国特許第４．５８８．６８４号）由来でありうる。 分泌用リーダー配列の好ましい集団は、！−プレ」ノブナル配列、および１′プ ロ」／グナル領域両方を含む、酵母α〜因子遺伝子の断片を用いるものである。 使用できるα−因子断片の種類は、完全長のブレープロα−因子リーダー（約８ ３アミノ酸残基）並びに切りつめられたα−因子リーダー（約２５から約５０ア ミノ酸残基）（米国特許第４．５４６．０８３号および第４．８７０．００８号 ：欧州特許公開番号系３２４２７４号）を含む。分泌を提供するα−因子リーダ ー断片を用いる追加のリーダーは、第一の酵母のプレ配列と、第二の酵母のα− 因子のプロ領域で作られた准種α−因子リーダーを含む（例えば、ＰＣＴ国際公 開第８９／’０２４６３号を参照されたい）。 典型的には、酵母により認識される転写終結配列は、転写終止コドンの３′側に 位！する制御領域であり、即ちプロモーター、コーディング配列の周辺を含む。 これらの配列はＤＮＡによりコードされたポリペプチドに翻訳されうるｍＲＮＡ の転写を制御する。転写終結配列の例としては、野生型α−因子転写終結配列お よび酵母が認識する池の終結配列、例えば解糖酵素のものを含む。 典型的に：よ、プロモーター、リーダー（必要ならば）、興味のあるコーディン グ配列、および転写終結配列からなる上記成分は共に発現構成物となる。発現構 成物はしばしば、レプリコン、例えば酵母または細菌等の宿主中で安定に保持さ れうる染色体外要素（例えば、プラスミド）中に保持される。レプリコンは、２ つの復製系を薄してよく、即ち例えば、発現のために酵母中で、クローニングお よび増幅のために原核生物中で保持される。そのような酵母−バクテリヤのシャ トルベクターの例は、ＹＥｐ２４　（：ｔａノトンニタインＢｏ＋＋ｔ＋ｔｎｉ ら２１］τ３．　Ｊ６（４３：　ニア−２４，’　、Ｉ）ＣＬ／”’Ｉ　Ｃブレ イク（３：ａｔｅ＋ら、１３４．　？：ｕ、Ｎ！Ｉ１．　Ａ＋ａ：、Ｓｃ＋ＵＳ Ａ、８１　４６４２−１６４６；　、およびＹＲｐ１７（スティンンユコム（Ｓ ｔ＋ｎ＋ｈｃｏｍｂ）　。 １９８２、　１．　Ｍｏｌ、Ｂｉｏｌ、、１５１１５７〕を含む。さらに、レプ リコンはハイコピー数、ローコピー数のいずれのプラスミドでもよい。ハイコピ ー数のプラスミドは、通常約５から約２００、典型的には約１０から約１５０の 範囲のコピー数を賀する。 ハイコピー数のプラスミドを含む宿主は、好ましくは少なくとも約１０、より好 ましくは少なくとも約２０８含む。ハイコピー数またはローコピー数のいずれか のベクターは、ベクターおよび外来遺伝子の宿主への効果に依存して選んでよい 。 例えば、上記ブレイクらの文献を参照されたい。 別法として、発現構成物は挿入ベクターを用いて酵母ゲノム中に挿入されつる。 挿入ベクターは典型的には、ベクターの挿入を許容する酵母染色体に相同な少な くとも１つの配列、好ましくは発現構成物周辺の２つの相同配列を含む。挿入は 、ベクター中の相同ＤＮＡと酵母染色体間の組換えによりもたらされるようであ る（オル−’）工ｒ＜−’Ｏ：＋−Ｊｕｔ：：ｉら、Ｌｕ３．　Ｍｅｔｈｏａ＋ 　ｉｎ　ＥＩｌｒ７ｎｏ！、、１１７１　２２８−２４５）。 挿入ベクターは、ベクターに含まれるための適切な相同配７ｆｉＩを選択するこ とにより、酵母中の特定の部位に挿入されてよい。上記のオル−ウニバーらの文 献をン照されたい。ひとつまたは複数の発現構成物が入り込み、たぶん生産され る組換えタンパク質のレベルに影響を及ぼす〔ライン（Ｒｉｎｅ）ら、　Ｌ９ｇ ３．　Ｐ：ａｃ、Ｎ＊ｔｌＡｕｊ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ、ｊＯ：　６５０）・。ベク ターに含まれる染色体配列は、ベクター全部の挿入をもたらす、ベクター中の単 一のセグメントとして、または染色体中の隣接セグメントに相同なセグメントと 、発現構成物のみの安定な挿入をもたらしうる、ベクター中の発現構成物の周辺 セグメントの２つのセグメントとして生じうる。 典型的には、染色体外および挿入発現構成物は、選択可能なマーカーを含むこと により、形質転換された酵母の選択を可能にする。選択可能なマーカーは、生合 成遺伝子、例えばＡＤＥ２．ＨｒＳ４．ＬＥＵ２．ＴＲＰｌ、およびＵＲＡ　３ を含んでよい。選択可能なマーカーは、薬剤耐性遺伝子、例えばＡＬＧ７および Ｇ４１８耐性遺伝子も含んでよく、それらは酵母中でそれぞれチュニカマイ７ノ およびＧ４１８に耐性を与える。さらに、適切な選択可能なマーカーは、金真の ような有害な化合物の存在下で酵母を生育可能にするものでもよい。例えば、Ｃ ＵＰＩの存在は、銅イオ／の存在下で酵母を生育可能にする〔プツト（ｂＮ）ら 、１９８７．Ｖｉｕｏｂｉｏｌ、Ｒｅｙ、、５１：　８５１〕。 染色体外レプリコンまたは挿入ベクターのいずれかの発現ベクターが、多くの酵 母を形質転換するために開発された。例えば発現ベクターは、中でも以下の酵母 のために開発された・キャンシダ・アービカンスｒｃｕ＋＋ｉｄｉ　１ｌｂｉｃ ａｎｉ＋〔クルツ（Ｋｕ！Ｈ）ら、１９８６．　ｖｏｌ、Ｃｅ１ｌ　Ｒｉｏｔ、 、６１　Ｌ１２３　、キャンジダ−フルトーサ（Ｃｕａｉｄｚ　ｍｔｌ＋ｏｎ） 　（グンゼ（ＫＩＩｎｏ）ら、１９８５．　１．　Ｂｉｔｉｃ　１１ｉｃ＋ｏｂ ｉｏｌ。 ２５：ｉ４１〕、”ンセニスラ・ポリモルファ（Ｉｌｎ＋ｅ＋＋ｕｌ＋　ｐｏｌ ｙｍｏｒｐｂｘ）　（グレッソン（Ｇｌｅｏｏｎｌら、　１９８６．　１．　Ｇ ｅｎ、　Ｗｉｃ：ｏｂｉｏｌ、、１３２：　３４５９：ローゲンキャンプｌＲｏ ｇｇｅａｋａｆｆｉｐｉら、　１９８６．　リｏｆ　Ｇｅｆｌ、　Ｇｅｕｔ、、 ２０２：　３０２〕、クルイベロマイセス・フラジリスＱｌｕｌｎ＋ｏａＢｕ　 ！＋＋ｇｉｌｉ＋）　（ダス（Ｄｌｌ）ら、　１９８１　１．　８ｚｃ、＋ｅ＋ ｉｏ１．。 １５８．１１６５］　、クルイベＯマイセス・ラクティス（Ｋｌｎｙｙｅｒｏ１ １７ｃ＋＋　Ｌｘｃ＋ｉ＋）　Ｃデル−ベンコート（Ｄｅ　ＬｕｖｕｃｏＩＩ＋ ｔ）ら、　１９８３．　ｊＥＩＣＩｒ：ｉｏｌ、、ｉ５４：　７３Ｌフアンデン ベルグｉＴ’＋ｎ　ｊｕ　Ｂｅ：ｇｒら、　！９９０．　８ｉＧ／Ｔｅｃｈｎｏ ｌｏｇｙ、８：　１３５：　、ビチア・グイレリモンデイイ（Ｐｉ＋ｈｉａ　Ｂ ｉｌｌｔｔＢｌｌｌｔｔｌ　［クンゼ（Ｋｕｎ＋ｅ）ら、１９ｇ５．　１．　Ｂ ａｓｉｃＭｉｃｒｏｂ＋ｏ１．、　２５：　１４１Ｅ　、ビチアバストリス〔フ レラグ’Ｃ：ｅＢ）ら、１９８５．　Ｍｏｌ。 Ｃｅ１ｌ　８ｔｏ１．、　５：　３３７６：米国特許第４．８３７．１４８号お よび第４．　９２９．　５５５号］、サツカロマイセス・セレビンアエＳａｃ＋ ：ａ：ｏｉ７ｃｕ　ｃｅ＋＋ｙｉ＋ｉｕｌ　（ヒンネン：ｔｌｉｎｎ＋ｎ）ら、 １９７８．　Ｐｙｏｃ、Ｎｕｔ、Ａｎｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ、７５１　１９２９： 　イト−１ｔｏ）ら、１９８３．　１．　Ｂｏ＋ｃ！ｉｏ１．、　１５３：　１ ６３〕、ンゾサッカロマイセスボンベ〔ビーチとナース！Ｂｅｚｃｈ　＋ｎａ　 ！ｌａ＋ｔ＋ｉ、１９８１、ｈ＋ｌｒｅ、３ＱＯ：　７０６Ｆ　、およびヤロウ イア・リポリチカ（ＹＭ！：ｏｖｉｚ　１ｉｐｏ１７＋ｉｃｓ！　（ダビドウ（ ０１マ１ａｏｖ）　ら、１９８５．　Ｃ＋＝：Ｇ＋ｎ＋ｔ、、ＩＯ：　３９−４ ８：ゲイラルディン’Ｇｚｉｌｌ！＋ａｉａｉら、１９８５．　ＣＨ：：、　Ｇ ＋ｏｒ＋、、ｊ［１３９−４９３゜ 酵母宿主に外来ＤＮＡを挿入する方法は、当業界においてよく知られており、か つ、典型的には、スフ二〇プラストまたはアルカリカチオンで処理された完全な 酵母細胞のいずれかの形質転換を含む。形質転換法は、形質転換される酵母の種 により通常変えられる。例えば、クルツ′Ｋｃｔ：）ら、　＋９８６、Ｖｏｌ、 Ｃａ１ｌ　Ｒｉａｌ、。 ６１４２、クンセＩＫｏｎ＋＋）　ら、１９８５．　１．　Ｂａｔｉｃ　Ｍｉｑ ：ｏＯｉａｌ、、２５１　１４１　（キャンヂダ）、グレソソン＋Ｇｌｅ＋＋ｏ ｎ）ら、１９８６．　１．　Ｇｉｎ、　ＷｉＣ！ｏｂｉＯ１，、＋３２１４４５ ９．ローゲノキャンプ′Ｒｏｇｇ＋ｎＥ＋！Ｒｐｔら、１９８６．　ｖｏｌ、Ｇ ｅｎ、Ｇｅｎｅ＋、、２Ｇ２：　３０２　（ハンセニスラ）１ダス（Ｏｉｉ）ら 、１９８４．　１．　Ｂｘｃｕ＋ｉｏ１．、　１５８：　１１６５．　デ　ルー ヘンコート：’Ｄｅ　Ｌｏｕｙ＋ｎｅａａ：Ｉ）ら、　１９８３．　１．　Ｂｇ ＋＋ｅ＋ｉｏ１．、　１５４：　７３７．ファノデンベルグ′ｖ１０ａｅｎ　Ｂ ＋：ｇ）ら、１９９０．　８ｉｏ／Ｔｓｃｈｎｏｌａｇ７．８：　１３５　（タ ルイベロマイセス）１クレッグＩＣ！ｅｇｇ）　ら、１９８５．　Ｍｏｌ、Ｃ！ １１　Ｒｉａｌ、、５：　３３７６、クンゼＩｕｎ＋ｅ）　ら、１９８５゜１、 Ｂ１１１ｃ　Ｍｉｃ！ｏｂｉｏ１．、　２５：　ｕｌ、米国特許第４，８３７． １４８号および第４．９２９．５５５号（ピチア）；ヒンネノ、’Ｈｉａａｅｏ ｉら、　１９７１　Ｐｔｏｃ、ＮａｔｌＡｓｉａ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ、７５：　１ ９２９．　イト−（１＋ｏ）　ら、１９８３．　１．　Ｂｔ＋＋！ｒｉｏｌ、、 ｌ５３１６３（サツカロマイセス）；ダビドウｊＤａｙｉａｏｖｉ　ら、１９８ ５．　Ｃｕ：：、Ｇ＋ａｅ＋、、１０：　３９゜ゲイラルディンｊＧａｉｌｌａ ＋ａｉｎｉら、　１９８５．　ＣＩＭ、　Ｇ＋ａｅ＋、、ＩＱ：　４９　（ヤロ ウイアリポリチ力）を磐照されたい。 タンパク質の発現 選択された発現系および宿主に依存して、タンパク質か発現される条件下で、ｈ ｕ−ＭＩＰ−２αをコードする配列を含む発現ベクターにより形質転換された宿 主細胞を生育させることによりタンパク質が生産される。次に、タンパク質を宿 主細胞から単離し、そして精製する。適切な生育条件および回収法の選択は当業 界の範囲内である。 本発明の調製物を得るための一つの好ましい手段は、適切な培養条件を用いて、 ｈｕ−ＭＩＰ−２αに対応する、イントロンを含まないＤＮＡからなる発現ベク ターでトランスフェクトした細胞を培養することである。次に、細胞を回収し、 そして細胞画分を標準的な分離方法、例えば遠心分離により単離してよい。発現 系が生育培地にポリペプチドを分泌するのであれば、ポリペプチドは直接無細胞 培地から精製できる。タンパク質が分泌されないのであれば、細胞溶解物から単 離される。ｈｕ−ＭＩＰ−２αを含む粗抽出物が得られれば、標準的な技術を用 いて、上記のように精製を実施できる。 一般的には、ｈｕ−ＭｒＰ−２αポリペプチドの組換え体の生産により、他のヒ トタンパク質を実質的に含まないこのサイトカイニノの組成物を提供できる。 ハイレベルの精製を得る可能性は、インビボの源に対して実質的な量のｈｕ−ｙ ＋ｐ−２αボリベブモドを生産する二ともできる。即ち、組換え体培養物に慣用 的技術を適用することにより、ｈｕ−Ｍ［Ｐ−２ｃボリベブモド組成物をより容 易に生産できる。当業者であれば、実質的に純粋な本発明のペプチドを：Ａ製す るために、上記技術の中から選択できる。 ｈｕ−■ＡＰ−２ａ類似体貯蔵物（ｐｏｏｌ＋ｉ他のヒトタンパク質を実質的に 含まないｈｕ−ＭＩＰ−２ｃ類似体の貯蔵物を含む組成物も、好ましくは組換え ＤＮＡ法または化学合成により調製できる。これらの貯蔵物はりセプター結合ア ッセイまたは上記のあらゆる生物活性アッセイを用い、所望の活性を有するｈｕ −ＭＩＰ−２ｃ類似体をスクリーニングできる。 例えば、ここに引用により本明細書の一部をなすパームレイとスミス（Ｐａ−コ ＩＢａｎａ　５ｉｕｈ１．　１９８８．　Ｇｒｉｔ、７３：　３０５において、 組換えＤＮＡ法を用いた、タンパク質の貯蔵物の生産およびスクリーニングのた めのプロトコルが記載されている。 ＭＩ　Ｐｉマルチ遺伝子ファミリーメンバーのりセブターを用いたこのプロトコ ルは、ｈｕ−ＭＩＰ−２α変異タンパク質、切りつめたｈｕ−ＭＩＰ−２αベプ 拳ド、またはｈｕ−〜ｒｒｐ−２α融合タンパク質の貯蔵物のスクリーニングに 使用できる。最初に、異なったｈｕ−ＭｒＰ−２ｃ項似体をコードするＤＮＡ断 片の貯蔵物を作ることができる。次に、ＤＮＡ断片の貯蔵物は、パームレイとス ミスにより記載された、繊維状ファージのゲノムに挿入することができる。この ファージのライブラリーはコロニーを生じ、その発現産物はスクリーニングする ことができる。所望のコロニー由来のＤＮＡを単離し、そして使用することによ り、所望のｈｕ−ＭＩＰ−２ｃ類似体を同定できる。 ｈｕ−ＭＩＰ−２ｃ頚偲体の貯蔵物も合成できる。リセブター結合アブセイにお ける便宜のため、フロック上に９６ビンの配列に並べられたポリエチレンのピン （標準的な９６ウエルのマイクロタイタープレートの間隔に合わせた）上で、ｈ ｕ−ＭｒＰ−２ｃ類似体を合成できる。例えば、ここに引用により本明細書の− ｇをなすゲイエセン（Ｇｓマｅｓｔｚｊの米国特許第４．７０８．８７１号にお いて、口蹄疫ウィルスのＶＰＩり〉バク賀に適用されたポリペプチド合成法が記 載されている。ポリペプチドのライブラリーを作成するため、および特定の特性 を有するポリペプチドの選択をするための他の方法は、ここに引用により本明細 書の一部をなす米国特許第５．０１０．１７５号、および１９９１年２月６日に 出願された米国特許出願第０７／６５２．１９４号、またはデルベント出版社： Ｄ＋＋ｖｅｎｔＰｌ］ｂ１１＋ｈｉｎｇ　Ｌ＋ｄ、ｉにより作成されたワールド バテンツに掲載された、それらを基に優先権主張された外国特許または出願に記 載されている。 ｈｕ−ＭＴＰ−２αに関連のないポリペプチドの貯蔵物は、組換えＤＮＡ法また は化学合成法を用いて生産でき、そしてＶＩＰ−２遺伝子フアミリーのメツバー のリセブターへの結合可能性によりスクリーニングできる。次に、リセブターを 結合したポリペプチドを、上記生物活性アッセイにおいてアッセイすることによ り、それらのアゴニストまたはアンタゴニスト活性を測定できる。そのようなポ リペプチドは、ｈｕ−ＭＩＰ−２αポリペプチドと同様の治療のための応用に効 果的である。ペプチドの貯蔵物のスクリーニングのための他の方法は、ここに引 用により本明細書の一部をなすクウイルラ（Ｃｙｉ＋ｉりら、　１９９０．　Ｐ ：ｏｃ、Ｎ１１ｌＡＩ直ｌｌ、Ｓｃｉ、　ＵＳＡ、　８７：　６３７ｇに記載さ れている。 薬剤投与の苦痛を取り除くために、小さな有機分子をこれらポリペプチドアゴニ ストまたはアンタゴニストにかぶせることか好ましい。ポリペプチドの構造から 、これらポリペプチドの形および活性に似せた有機分子を見つけてもよい。これ らｈｕ−ＭＩＦ’２αアゴニストまたはアンタゴニストの構造を決定するための 方法は、当業界において公知であり、そしてＸ線結晶解析および２次元磁気共鳴 を含む。 抗体の生産 天然、組換え体または合成のｈｕ−ＶＩＰ−２αポリペプチド（ひとつまたは複 数のエピトープを含む完全長または断片）を使用することにより、ポリクローナ ル抗体およびモノクローナル抗体の両方を生産できる。ポリクローナル抗体が必 要であれば、ｈｕ−ＶＩＰ−２αポリペプチドを使用して、選択されだ補乳動物 （例えば、マウス、ウサギ、ヤギ、ウマ等々）を免疫し、そして後に、既知の方 法により、免疫された動物から血清を回収し、そして処理する。本発明のｈｕ− ＭＩＰ−２αポリペプチドを使用することにより、調製物を有する動物を免疫し て、抗体の生産を高めることができる。そのような免疫は、大きい免疫物質、例 えばキーホールリンペットヘモンアニンに、ポリペプチドを任意にカツプリング してよい。抗体を生産するための、哺乳動物、例えばウサギ、マウス、ヤギ等々 の免疫は当業界において公知である。 ポリクローナル抗体調製物は、本発明の合成または組換えポリペプチドを用いた 免疫親和性技術により部分精製できる。そのような精製法は当業界において公知 である。特に、所望のタンパク質に加えてさまざまな抗原に対するポリクローナ ル抗体を含む組成物は、免疫親和性クロマトグラフィーにより、他の抗原に対す る抗体を実質的に含まずに作成できる。本発明のポリペプチドの実質的に純粋な 調製物を使用することにより、ｈｕ−ＶＩＰ−２αポリペプチドと反応性の抗体 を親和精製できる。抗体の親和精製のために、ポリペプチドを不活性マトリック ス、例えばアガロースビーズにカンプリングできる。そのようなカップリングの 技術は当業界において公知である。 ポリペプチドの調製物も、抗体調製物または他の生物学的サンプル中のｈｕ−Ｍ ＩＶ−２αに特異的な抗体の検出および定量に使用できる。そのような場合、合 成ペプチドは通常、大きな物質、例えば子ラン血清アルブミンまたは固形支持体 にカップリングさせる。再び、そのようなマトリックスへのポリペプチドのカン プリング技術は当業界において公知である。 モノクローナル抗体 ｈｕ−ＭＴＰ−２αに反応性のモノクローナル抗体も、以下の開示に従い、当業 者により容易に生産される。ハイブリドーマによるモノクローナル抗体の作成の ための一般的方法論はよく知られている。唯一のｈｕ−ＶＩＰ−２αエピトープ に反応性のモノクローナル抗体を生じさせることができる。一般的には、ラット またはマウスを本発明のポリペプチドで免疫し、そして後にげっ歯頚を犠牲にし 、そしてミエローマ細胞と融合した＃ＩＩ纒抱を回収する。融合細胞は当業界に おいて知られた技術に従い選択できる。各融合細胞の抗体の生産は、ｈｕ−Ｍｒ Ｐ−２αのエピトープ上に結合した抗体を選択するために、個々にスクリーニン グできる。 ｈｕ−Ｍ［Ｐ−２αポリペプチドに唯一のエピトープと免疫反応性の抗体をスク リーニングするために、単一バノテリーの試験を実施できる。抗体は、本発明の ｈｕ−ＶＩＰ−２αポリペプチドの実質的に純粋な調製物を用いて、ｈｕ−ＭＴ Ｐ−２αポリペプチドとの免疫反応性に関して試験できる。所望の特定の抗体は 、この試験において陽性であるべきである。次に、抗体は、ＶＩＰ−２マルチ遺 伝子フアミリーの他のメンバーとの免疫反応性に関して試験できる。一般には、 この試験で陰性の抗体はｈｕ−ＶＩＰ２αの唯一のエピトープと反応する。 不死の、抗体産生セルラインも、融合以外の技術、例えばオンコジーンＤＮＡを 用いたＢ白面法の直接形質転換、またはエプスタインパールウィルスを用いたト ランスフェクンゴンにより作成できる。例えば、ンユライヤ−（Ｓｃｈｎｉｕ） ら。 ［ハイブリドーマ技術Ｊ　１９ｇＧ）　；ハンマリング（ｔｌａｍｍｅ：ｌｉａ ｇ）ら、　「モノクローナル抗体およびＴ細胞ハイプリドーマＪ　（１９８１） 　；ケンネブト（Ｋｅｎｎｈ口）「モノクローナル抗体Ｊ　（１９８０）　、ま たは米国特許策４．３４１，７６１号、第４．３９９．１２１号、第４，４２７ ．７８３号、第４．４４４．８８７号、第４．４５１．５７０号、第４．４８６ ．９１７号、第４．４７２．５００号、第４．４９１，６３２号、第４．４９３ ．８９０号を参照されたい。 ｈｕ−ＭＩＰ−２αに対して生産されたモノクローナル抗体のパネルは、さまざ まな特性、例えばアイソタイプ、エピトープ、親和性、等々に関してスクリーニ ングできる。特に興味のあるモノクローナル抗体は、Ｍｌ−２またはｈｕ−ＭＩ 　Ｐ−２αペプチドの活性を中和するものである。そのような抗体は、Ｍｌ−２ 活性アツセイ、例えばここに引用により本明細書の一部をなすウォルペ！Ｙｏｌ ｐｅ）ら＋＋ｏ９＋およびブロックスマイヤーｊＢ＋ｏｘｍｅｙｅ＋）ら（１９ ８９）＋、：おいて教示されたアッセイを用いて容易に同定できる。高親和性の 抗体も、天然または組換えｈｕ−ＭＩＰ−２αの免疫親和性精製において有用で ある。 本発明により企画された抗体の種類は、を椎動物の抗体、待に哺乳動物（ポリク ロ−カルおよびモノクローナル）、雑種抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、改変抗 体、−価抗体、単一ドメインの抗体、並びに機能的抗体の断片、例えばＦａｂタ ンパク質を含み、エピトープに選択的に結合さえすればよい。一般的な総論はウ ィンターとミルスタイン！Ｗｉｎｔｅｒ　＆　Ｍｉ！＋ｕｉｎ）、１９９１．　 ｌ５ｓｕｅ、３４９：　２９３：リーヒマン（Ｒｉｅｃｈｕｎｎ）ら、１９８ｇ 、Ｎｕｕｔ、３３２：　３２３：　７−ド（Ｗａｒａ）ら、ｌＮ９゜■＋＋１Ｉ ｒｅ、　３Ｈ：　５４４：米国特許第１．　Ｈ６，１６７号、およびブレニーｆ Ｇｌｅｕｉ＋）ら。 １９８２、Ｎｘ＋ｕｎ、２り５７１２を参照されたい。 エピトープはポリペプチドの抗原決定基である。ひとつのエピトープは、該エピ トープに唯一の空間コノフすメーンヨン中に３またはそれ以上のアミノ酸を含み うる。一般的には、エピトープ：よ少なくとも５つのそのようなアミノ酸からな り、そしてもっとも通常には少なくとも８〜１０のそのようなアミノ酸からなる 。 アミノ酸の空間コン７すメーショ／の決定法は、当業界において公知であり、そ して例えばＸ線結晶解析および２次元咳磁気共鳴を含む。 ｈｕ−ＶＩＰ−２ａの診断アッセイ ｈｕ−ＭｒＰ−２αの検出はヌクレオチドまたはペプチドレベルに基ついてよい 。上記のようにｈｕ−ＭＩＰ−２αのポリペプチドに対応する配′！ｆｉ１から 発現されるベブキドて哺乳動物を免疫し、そして当業界においてよく知られてい る技術を用いてｈｕ−ＭＩＰ−２αに特異的なそれらの抗体を選択することによ り、抗体を調製することかできる。 免疫アッセイ法 抗体は診断への応用に有用である。ｈｕ−Ｍ［Ｐ−２αに特異的な抗体はあらゆ る慣用免疫アッセイのフォーマント、例えば均−系または不均一系、ラノオイム ノアンセイまたはＥＬ　ｒ　ＳＡに公式化することができる。さまざまな）第一 マｌトが当業界においてよく知られている。例えば、ここに引用により木調！ｌ ｌｆの一冊をなす「イムノアッセイ　実用ガイド入？・Ｈ：：！Ｎ　Ｇμ＋６１ ）　Ｊ　〔４−センとバー・レスタイツ’、Ｄ、　１．　Ｃａｎ　ａｚｃ　Ｍ、 ７．　Ｆｙ：ｌ＋＋＋コ１１ｉ集、ＩＩＩ）を参照されたい。 未発明の抗体は、ｈｕ−ＳＨＰ−２ａに結合する二とができ、モしてｈｕ−＼１ ｌＰ−ｐβに結合しないことか好ましい。これらの抗体も、アイソトープ、結合 した抗体、また：よ池のリガンドを用いたインメーノング分析に使用できる。適 切なインメーノング物質の一例は、ｈｕ−ＭＩＰ−２αに特異的な抗体に結合し ！′−１２５１である。 本発明の抗体を使用することによつ、組織の＠識学的セクション、並びに血清中 のｈｕ−ＶＩＰ−２αニビｉ−プを検出する二とができる。当業界において知ら れて゛、するあらゆる検出手段、例えばラノオイムノ７ノセイ、酵素結合特異的 抗体吸着体７ノセイ、補体の固定、比濁度アｔでイ、免疫拡散、免疫電気原動ア ッセイおよび類似物により、組繊セクシヨンに結合した抗体を検出できる。 特に有用な染色剤はバーオキシジーセ、過酸化水素および色素産生物質例えばア ミン二手ルカルバゾルである。パーオキシダーゼ（よく知られた酵素であり、多 くの源から人手できる）はｈｕ−ＭＩＦ’−２αに特異的な抗体にカップリング することかでき、また単にひとつまたは複数の抗体と複合体を作ることができる 。 他の色素産生物質および酵素も使用してよい。そのような技術な当業界において よく知られている。放射性標識抗体はｈｕ−ＭＩＰ−２αに特異的でありえ、あ るいはｈｕ−ＭＩＰ−２αに特異的な抗体と免疫反応性の二次抗体でありえる。 再び、そのような技術はよく知られている。ｈｕ−ＭＩＰ−２αを検出する詳細 な技術は、本発明において重要ではない。 生物学的サンプル中のｈｕ−ＭＩＰ　２αを検出および／または定量するための 一つの特に好ましい方法は、競合アッセイである。ｈｕ−Ｍ［Ｐ−２αに見いだ されるが、ｈｕ−ＭＩＰ−２βに見いたされないエピトープと免疫反応性の抗体 は、当業界において公知の技術を用いて、固形支持体、例えばポリスチレンマイ クロタイタープイノ／ユまたはニトロセルロースペーパーに付着させる。次に、 抗体−抗原か複合体を形成し、かつ安定であるような条件下で、分析されるサン プルの存在下において固形支持体をインキュベートする。過剰の未結合サンプル 成分を除去し、そして抗体−抗原の複合体が固形支持体上に残るように固形支持 体を洗浄する。次に、ｈｕ−ＭＩＰ−２αに見いだされるが、ｈｕ−ＭＩＰ−２ βに見いだされないエピトープを含む標識ポリペプチドの固定量を固形支持体と 共にインキュベートする。標識ポリペプチドは、当業界において公知の検出可能 なモイエティ、例えばビオチン、パーオキシダーゼまたは放射性標識にカップリ ングされた。標識ポリペプチドは、固形支持体に付着したｈｕ−ＭＩＰ−２αに 免疫反応性の抗体に結合する。過剰の未結合のサンプル成分を除去し、そして上 記のように固形支持体を洗浄する。固形支持体に付着した検出可能なモイエティ を定量する。ｈｕ−ＶＩＰ−２αとポリペプチドは同一の抗体結合部位に対して 競合するので、サンプル中のｈｕ−ＭＩＰ−２αは、ポリペプチドの固形支持体 への結合の減少により定量することかできる。別法としては、サンプルと標識ポ リペプチドを同し時間、固形支持体と共にインキュベートする。 本発明により提供されるヌクレオチド配列を使用することにより、あらゆる標準 的技術に従い、遺伝子プローブを作成できる。プローブの大きさは約２０ヌクレ オチド未満から数百ヌクレオチドまで変えられる。プローブは放射性標識、また は蛍光物質による標識、または類似物により標識される。ヌクレオチドプローブ の調製および標識法は当業界においてよ（知られている。 ヌクレオチドプローブを用いる診断試験は個々の生物学的サンプルを用いる。 当業界においてよく知られているＩｌｉ準的技術を用いて、核酸はサンプルから 回収される。次に、核酸をプローブとインキュベートし、そしてその後ハイブリ ダイズを検出する。 以下の記載は例示の目的のみに提供される本発明の実施例である。これらは、請 求の範囲内の実大な態様が本開示に照らして当業者に明らかであるように、いか なる場合も本発明の範囲を限定するものではない。当業者は、本出願中で引用さ れた文献に精通しており（あるいは容易に入手できる）、そしてその開示は引用 により本明細書の一部をなす。 例１ ネズＥＭＩＰ−２をコードするｃＤＮＡの単離およびクローニングの単離および ｃＤＮＡライブラリーの構築は以前に記述した（ダバテルズ（Ｄｚｖｘｔ＋ｌｌ ＋）　ら、１Ｈａ）。 ネズミＭＩＰ−２ｃＤＮＡの単離 Ｍｌ−２のＮ末端の配列のアミノ酸９−１４　（、つオルベ’Ｔｌｏｉｐｅ）　 ら、　１９＆９）に対応する縮重したすリボヌクレオチドの混合物を合成した。 この配列は高度に保存されているコード領域中にあると予想され、しかも部分配 列の他の部分と比較すると二トンの縮重がより少ないので、部分配列のこの部分 を選択した。得られたプローブは１７ヌクレオチドの長さのオリゴマーで、縮重 するために１２８個の混合物から成る。 ＲＡＷ２６４．７ｃＤＮＡライブラリーを培養しく５ＸｌＯラブラーク）、２枚 のニトロセルロースのフィルターへＤＮＡを結合させて、４２℃で５ＸＳＳＣ。 ２Ｘデンハルト溶液、５０ｍＭ＋ノン酸ナト１７ウムＭｉ衝液ｐＨ６，５，５０ ％ホルムアミド、０，２％ＳＤＳおよび０．２５ｍｇ／ｍｌの超音波処理したサ ケ精子ＤＮＡ中でプレハイブリダイズし、次に一晩４２℃で５ＸＳＳＣ，ｌｘデ ンハルト溶液、２０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液ｐＨ６，５，５０％ホルムアミ ド、１０％デキストラン硫酸、０．１％ＳＤＳ、０．　１１ｇ／ｍｌの超音波処 理したサケ精子ＤＮＡおよびミリリットル当たり縮重ごとにＤ　Ｘ　１０　ｃｐ Ｈの３２Ｐ−ＡＴＰで５′末端を標識した合成オリゴヌクレオチドのプローブの 混合物中でハイブリダイズした。 ハイブリダイゼーション後にＴＭＡＣ（ウッド（Ｗｏｆｌｄ）ら、　１９８３． 　Ｐｒｏｅ、Ｎｓ＋１゜入ｅｘｄ、Ｓｋｉ、　ＬＩＳＡ、　Ｈ：　１５８５）を 用いてフィルターを洗浄した。２枚のフィルターでともに陽性だったプラークに ついて密度を低くプラークを形成させてセカンドスクリーニングに進んだ。陽性 なファージクローンを単離し、さらなる解析のためにそれからＤＮＡを調製した 。 ネズミＭＡＰ−２ｃＤＮＡのクローニングＲＡＷ２６４．７１１１胞から抽出し たポリＡ”　ＲＮＡに由来するｃＤＮＡライブラリーの、ネズミＭＩＰ−２のＮ 末端の配列（つｔルベ’、Ｗｏｌｐｅ）ら、１９８９）に特異的な縮重したオリ ゴヌクレオチドの混合物を用いたスクリーニングによってりａ−ンＭＩＰ−２２ ０ａを単離した。インサートｃＤＮＡ（約１１００ｈｐ）を単離して、Ｍｌ３に クローニングして、ヌクレオチド配列を決定した。ヌクレオチド配列および推定 アミノ酸配列を図１に示す。１位で始まる推定される成熟したタンパク質の配列 は、精製したＭｌ−２について以前に決定したＮ末端のペプチド配列（ウォルベ ｊ’１ｏｌｐりら、１９ｇ９）に一致する。 ネズミＭｒＰ−２ｃＤＮＡに類似するヒトの遺伝子を単離するために、成熟した ｍＭＩＰ−２タンパクの大部分をコードする断片を単離して、プローブとし、Ｐ ＭＡで処理したおよびＬＰＳで刺激した細胞のポリ−λ−ＲＮＡから調製したＵ ９３７ｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングした。弱い条件で洗浄して陽性に なったプラークからＤＮＡを単離して、制限酵素で分析して、２つのクラスのク ローンが存在することを示した。各グループの代表のクローンからインサートｃ ＤＮＡを単離してＭｌ３にサブクローニングしてヌクレオチド配列を決定した。 ｃＤＮＡライブラリーの構築 ヒト単核白血球様細胞系列Ｕ９３７の東【１激（サンドストローム’５ｕｎａ＋ ＋：ａｌｌ）ら。 １９７６、Ｉｎ＋　ノ　Ｃｘａｕ：、１７：　５６３）、全ＲＮＡおよびポリ− Ａ　−ＲＮ　Ａの単離およびｃ　Ｄ　Ｎ　Ａライブラリーの構築は以下のように 行った。Ｕ９３７細胞（アメリカノタイプ力ルチャーコレクシッン、ロツクブイ ル・Ｒｏｃｉｖｉｌｌｅ）　、メリーランド州）を細胞同士が接触するまで成長 させて、最終濃度５Ｘ１０’ＭのＰＭＡの添加によって分化させるために刺激し た。ＰＭＡ存在下で２４時間培養した後に、ＬＰＳ（ＬＰＳＷ、大腸Ｍひ１２７ ：　Ｂａ：ディフコラボラトリーズ社（Ｄｉ　］：ｑＬ！ｂｏ＋＋ｔｏ！ｉｌ！ 、Ｉｎｃ、）、デトロイト、ミンガン州）を最終濃度がＩμｇ／ｎｌになるよう に加えて、細胞をさらに３時間３７℃で培養した。全ＲＮＡの調製は本質的ｉ： 　ハ２述すｈｔ＝　ヨウｌ−行ッｔ−’、キ＋　セフ　Ｃ！　＋ｈ！ｌ　ｔ）ら 、　１９ａ３．　ｉ）！ＩＡ、　２：　３２９）。 ポリ−Ａ、　””　ＲＮ　Ａは本質的には記述されたように（マニアチアスｔＪ ｚａｉｏｉ；）ら、！９１！２）　、矛すゴｄＴセルσ−スに１回通して調製し た。 二本ｌ１Ｉｃ　Ｄ　Ｎ　ＡはｃＤＮＡ合成のためのキット（フフルマンアＬＫＢ バイオチクロッジ−社’ＰｈＪ′＋ｕｃｉｉ　ＬＫＢ　ＥｉＯ＋ｅｃｈ口Ｏ１ｏ ｇ７．　Ｉｎｃ、）　、ブリーザントヒル：Ｐｉｕｕ＋１ＩＨｉｌｌ）　、カリ フォルニア州）を用いて調製し、λｇｔｌｏにクローニングしてパッケージング した。 ネズミＭＩ−２に類似するヒトの遺伝子のＲＬｌｌじ９３７　ｃ　ＤＮＡライブ ラリーの培養、ニトロセルロースフィルターの作成、フィルターのプレハイブリ ダイゼーションおよびハイブリダイゼーションはＲ１八Ｗ２６４．”、ＣＤＮＡ ライブラリーのスクリーニングに関して例１で記述したように行った。プローブ のＤＮＡはｍＭＩＰ−２ｃＤＮＡから単離した１８６５ｐのＢａｉｌ−ＢｇｌＩ Ｉ断片だった。突状変異誘発性ブライ７−５’　−ＣＡＡＡＡＧＡＴＣＴＴＧＡ ＡＣＡＡＡＧ−３’　を用いて試ＮＩＷ内突黙変異誘発によってＢｇｌｌＩサイ トを導入した。Ｂａ１ｌ−Ｂ、ｇｌＩｒ断片は成熟したｍＭＩＰ−２のアミノ酸 配列の大部分をコードするが、３つのＮ末端のおよび８つのＣ末端のアミノ酸を コードする塩基対を欠いている。この断片を二ンクトランスシー／ヨンによって 標識し、ミリリットル当り約５Ｑ０．０００：ｐｍになるようにハイプリダイゼ ーンヨノ溶液に加えた。 ハイブリダイゼーション後に、フィルターを室温で各３０分間、２　Ｘ　Ｓ　Ｓ 　Ｃ。 ０、Ｌ９６ＳＤＳ中の弱い条件で３＠洗浄した。２枚のフィルターでともに陽性 のプラークは低密度でプラークを形成させてセカンドスクリーニングに進んだ。 陽性のファージクローンを単離して、さらなる解析のためにＤＮＡをそれから調 製した。 クローニングおよびＤＮＡ配列の解析 ｃ　Ｄ　Ｎ　ＡインサートをＭ１３ファージベクターヘサブクコーニングして、 ＤＮＡの配列決定はす／ガー（Ｓｚｎｇ＋＋）らのジデオキシチニインターミネ ーション法（１９７７、Ｐ：ｏ＋、！ｌａ＋ｌ。Ａｅａｄ、Ｓｅｉ、ＵＳＡ、７ ４：　５４６３）　によって行った。 ｈｕ−ＭＴＰ−２αのヌクレオチド配列および推定アミノ酸配列を図２に示す。 この配列は４つの独立なりローンに関して確認されて、ｍＭＩＰ−２に類似する ヒトｃＤＮＡの２つのクラスの中でより数の多い方を代表する。ｈｕ−ＭＩＰ− ２βのヌクレオチド配列および推定アミノ酸配列はｍＭＩＰ−２に類似なヒトｃ ＤＮＡの２番目のクラスの代表であり、図３に示す。 ＲＡＷ２６４．７細胞からＤＮＡをジレラＬＤｉＬ！ｌｌりらによって記述され たように単離した１１９８７．　ＧｕＩｄｅ　ｔｏ　１Ｖｏｌｔｕｌｚｒ　Ｃｌ ｏａｉＦｇＴｓｃｋｎｉＢ＋ｓにおいて、ベルガ−ｊ３４　Ｈｇ４４１ら編、ア カデミツクプレス（Ａｃｌｆｌｅｍｉｅ　Ｐｉ＋ｓｌ）、オリアンドｉｏ＋１ｚ ｎａｏ）　。 ［９９ページ）。ヒトゲノミブクＤＮＡおよびネズミＣ３Ｈ／ＨｅＮゲノミック ＤＮＡをクロンチック：’、Ｃ１ｏｎｎｃｂｌ　（バロアルト！ＰＩＩＯＡｔｔ ｏ）　、　カリ７ｔルニア州）から購入した。 ゲノミックＤＮＡを制限酵素でその供給者の仕様書に従って消化した。消化した ＤＮＡを１９モアガロースゲルで分離して、次にハイ゛ボンド！Ｉ１７　Ｂｏｎ ｄ）ナイロンｌ１ｌ（アマーンヤム（Ａｗｅ：＋ｈ＊ｍ）　、アルリングトンハ イツ（＾山ｎＨｏｎ　Ｔｏｉｇｈｔ＋）　。 イリノイ州）へ転写した。 ５Ｑ１１１リン酸ナトリウムｐＨ６，５，５ｘＳＳＣ，１ｚｉｌビロリン峻ナト リウム、４０％ホルムアミド、１０％デキストラン硫酸、５×デンハルト溶液、 ０．　１％ＳＤＳおよび１００１１ｇ／ｍｌの超音波処理したサケ精子ＤＮＡ中 でフィルターをプレハイブリダイズし、ハイブリダイズした。サザン分析のため に用いたＤＮＡは、１、Ｈｂ　ｒｎＭ■Ｐ−２ｃＤＮＡ　（クローンｍＭＩＰ− ２−２０ａ）、０．９８ｊｂ　ｈｕ−ＶＩＰ−２βｃＤＮＡ（クローンｈｕ−Ｖ ＩＰ−２−４ａ）および１．０５ｋｂ　ｈ、ｕ−ＭＩＰ−２ａｃＤＮＡ　（クロ ーンｈｕ−ＭＩＰ−２−５８）だった。全てのｃＤＮＡをマルチプライマーＤＮ Ａラベリングシステム（アマーンヤム（ＡｍｐＴ＋ｌｕｍｌ、アルリングトンハ イツ！ＡＡｒ１１ｎ＋＊ｏ　！ｌｅｉｇｈｔ＋）　、イリノイ州）を使用し、３ ２Ｐ−ｄｃＴＰでランダムプライミングによって標識した。２〜４時間３７℃で プレハイブリダイゼーンランを行った後に、標識したＤＮＡをミリリットル当り ｌＸ１０６ｃｐｉになるように加えた。ハイブリダイゼーションは１６〜１８時 間３７℃で行った。フィルターを室温で１０分間２　Ｘ　Ｓ　Ｓ　Ｃ。 ０、Ｌ％ＳＤＳ中でゆすぎ、次に３回６５℃で４５分づつＯ，ｌＸ５ＳＣ。 ０．１％ＳＤＳ中で洗浄した。いくつかの場合には、リハイブリダイゼーション を可能にするためにハイブリダイズしたプローブを４５分間６５℃で０．５×Ｓ ＳＣ，０，１％ＳＤＳおよび５０％ホルムアミド中で処理することでプロットか らはがした。 サザン分叶 ＲＡ、Ｗ２６４．７ＤＮＡを３つの制限酵素ＢａｍＨＩ、ＥｃｏＲＩおよびＥｃ ｏＲＶの各々で消化してアガロースゲル電気泳動で分離して、３２Ｐで標識した ｍＭＬＰ−２ｃＤＮＡをプローブにしてハイブリダイズさせた。図６Ａに示す結 果は単一遺伝子を規定するｍＭｒＰ−２ｃＤＮＡと一致する。マウスＣ３Ｎ／Ｈ ｅＪＤＮＡを同様に解析したときに同じ結果を得た（データは示していない）。 ヒトゲノミックＤＮＡのサザン分析はｈｕ−ＭＵ’−２αおよびｈｕ−ＭｒＰ＝ ２βｃＤＮＡプローブを用いて行った。ハイブリダイゼーションおよび洗浄の条 件は、各々のｃＤＮＡをプローブとしたときにｈｕ−ＭＩＰ−２αおよびｈｕ− ＭＴＰ−２βを区別できるように決定した。しかし用いた条件ではｈｕ−ＭＩＰ −２αおよびｈｕ−ｇｒｏ／ＭＧＳＡに特異的な配列を区別できない。ゲノミッ クヒトＤＮＡをＢａｍＨｌ、ＥｃｏＲＩまたはＥｃｏＲＶで消化してｈｕ−Ｍｒ 　Ｐ−２αまたはｈｕ−ＭｒＰ−２βｃＤＮＡをプローブとしたサザノ分析をそ れぞれ図６ＢおよびＣに示す。各ｃＤＮＡを用いて得られたハイブリダイゼーシ ヨンのパターンは明らかに異なる。Ｍ［Ｐ−２αｃＤＮＡは約２３および１、ｌ ｋｂのＥｃｏＲＶ断片に強くハイブリダイズし、一方でＭＩＰ−２βｃＤＮＡは ７．　０ｋｌのＥｃｏＲＶ断片にハイブリダイズした。同様に、ｈｕ−ＭＩＦ− ２βｃＤＮＡは１．　８ｋｂおよび３．３ｋｂ（弱く）のＥｃｏＲＩ断片に７％ イブリダイズし、一方でｈｕ−ＭｒＰ−２ａは３．　３ｋｂのＥｃｏＲＴ断片に 強く、および約１．　１ｋｂに、および４．　６ｋｂおよび３．　８ｋｂのＥＣ ０ＲＩ断片に弱くハイブリダイズした。最後＋：ＭｒＰ−２βｃＤＮＡは２．　 ４ｋｂのＢａｍＨＩ断片に強く、および４．　３ｋｂｐのＢａｍＨＩ断片にとて も弱くハイブリダイズし、一方でヒトＶＩＰ−２ａｃＤＮＡは２０．　２．　０ およびｌ、ｌｋｂのＢａｍＨＩ断片に強くおよび４．　３ｋｂのＢａｍＥ（Ｉ断 片により弱くハイブリダイズする。持にＢａｍＨＩで消化したＤＮＡから、ｈｕ −ＭＡＰ−２αｃＤＮＡプローブを用いて得た１１イブリダイゼーシヨンのパタ ーンが、ｈｕ−ＭＩＰ−２βｃＤＮＡプローブを用いたものと比較してより複雑 であることは、ｈｕ−ＭＩＰ２αプローブは１つ以上の遺伝子、恐ら＜ｈｕ−Ｍ ＩＰ−２αのみならずｈｕ−ｇｒｏも検出していることを示唆する。ここに示す データからｈｕ−ＭＩＦ−２βおよびｈｕ−ＭＩＰ−２αは２つの別個の遺伝子 であると私達は結論することができる。 （アメリカンタイプカルチャーコレクン３ン、ロックビル１Ｒｏｃｋｙｉｌｌｅ ）　、メリーランド州に１９８５年８月２７日に加入番号５３２４６で寄託した ）プラスミドＡＲＶ−２ｐ２５ｇａｇは、ｔａｃプロモーター、ンヤインデルガ ルノ配列（Ｓｈｉｎｅ　Ｄ！１ｇ１ｒｎｏ　ｓ＋ｑｏｅａｃｏ）　、および元の ｐＢＲ３２２の配列の代わりとしてＥｃｏＲＩおよびＰｖｕｌＩ制限サイトの間 から成るポリリンカーを含むｐＢＲ３２２の誘導体である。ＥＰ１８１．１５０ も見よ。 クローンｈ、ｕ−ＭＩＰ−２−５ａ　（例３）をＰｖｕＩＩおよびＢａ１．Ｉで 切断して、次の配列をもつリンカ−にライゲージタンする：ＡＡＴＴＡＴＧＧＣ ＧＣＣＣＣＴＧＧ ＴＡＣＣＧＣＧＧＧＧＡＣＣ プラスミドＡＲＶ−：）ｐ２５ｇａｇを次にＥｃｏＲＩおよびＰｖｕｆｆで切断 して、ライゲージタンしたｈｕ−ＶＩＰ−２−５ａを挿入した。コヘンｆｃｏｂ ｅｎ）ら。 Ｐｒ８ｃ、Ｎｉｉ、Ａｃ１ｄ、ｂｉ、ｌｌ５Ａ　！１９７２）　６２：　２１１ Ｇの手順に従って得た構築物で次にコンピテント大腸菌Ｄ１２１０細胞をトラン スフォーメーションする。 ２５〜５０ｎｇの構築物で細胞をトランスフォーメーションして、形質転換体の 混合物を１００μｇ　／　ｍ　ｌのアンピシリンを含むＬ−プロスで作成したア ガープレート上で培養した。プレートを３７℃で１２時間インキュベートして、 アンビンリン耐性のコロニーを１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含む１！１１ のＬ−ブロスへ移した。細胞を３７℃で生長させて、１０μｌの１００ｄ　ＩＰ ＴＧを加えて最終濃度１ｚＭにすることで発現を誘導し、その後３７℃で２時間 インキュベーションする。次に細胞を溶解させて、産物を精製する。 プラスミドｐＧＡ＋１は、イーストグリセルアルデヒド３−リン酸デヒドロゲナ ーゼ（ＧＡＰＤＨ）プロモーターの転写制御下で、イーストα−因子先頭配列、 ヒトブロインシュリンの遺伝子、およびα−因子終結配列をコードするＤＮＡを 含む。ベクターはＥＰ３２４．２７４によく記述されている。 次のプライマーを用いてλｇｔｌｏクローン（λｇｔｌＯ−ｈｕ−Ｍ■Ｐ−２− ６ａ）に由来する断片のポリメラーゼチェインリアクンヨン（ＰＣＲ）増幅によ ってｈｕ−ＭＩＦ−２αのタンパクをコードする配列を得た：Ｋｐロ　Ｉ ＰＣＲ増幅の３０サイクル後に、ＤＮＡをＫｐｎＩおよび５ａｌＩで消化して、 α−因子の先頭配列の４つのＣ末端のアミノ酸、二環基のプロセッンングサイト および完全な７３！Ｉのアミノ酸の成熟ｈｕ−ＭＴＰ−２αをコードする２４４ １１ｐ断片をアクリルアミドゲル電気泳動によって単離した。次にこの断片を、 Ｋｐｎｌおよび５ａｉｌて消化してアガロースゲル上で精製したｐＧＡ　Ｉ　Ｌ 中１ニライゲーンコンした。バクテリアをトラ／スフす−メーシヲンしてスクリ ーニング後に、プラスミドｐＭＩＰ５００を得てＤＮＡンークエンシングで推定 ヌクレオチド配列をもつことが明らかになった。 発現プラスミドｐＹＭＩＰ５００を提供するためにこのプラスミドをＢａｍＨ・ Ｉで消化して、ＧＡＰＤＨプロモーター配列、α−因子先頭配列／　ｈ　ｕ　− Ｍｒ　Ｐ−２ａ融合タンパク、およびα−因子転写終結配列を含む得られた１１ ６３ｂｐの断片を、発現ベクターｐＡＢ２４のＢａｍＨＩサイトへクローニング した。 サツ力ロマイセスセレヴジアエ（Ｓａ＋ｃｈａ！ｏＢｃｅ＋　ｃｅ：ｕｉ＋ｉｏ ）の菌株ＭＢ２−’Ｊ−（ｌｅｕ２−３．１ｅｕ２−１１２．ｈｉｓ３−１１． ｈｉｓ３−１５゜ｕｒａ３Δ、ＣＡＮ、Ｃｉ　ｒ’　）をプラスミドｐＹＭＩＰ ５００で標準的な手順によりトランスフォーメーションして、形質転換体をｕｒ ａ原栄養性で選択した。 発現は、独立の形質転換体の単一コロニーのロイシン選択培地への接種および約 ４８時間の生長によって解析した。次に培養を遠心して、ウラシルを欠−）た培 地に細胞を懸濁して、２０倍にｕｒａ選択培地で希釈した。次に培養を約７２時 間生長させて、次に収穫して細胞を含まない上清を調製した。条件を設けた培地 をｈｕ−ＭＴＰ−２αの存在について５ＤＳ−ＰＡＧＥおよびその後のクマシー 染色で解析した。本来のｍＭＩＰ−２標１ｍ　（Ｂ、シェリーｆ８．　５ｈｅ＋ ４）　、ｏソクフエラー大学：Ｒｏｑｋｅ４＋ｌｌｅ＋　Ｕｎｉｙｅｎｉｔ７） によって提供された）と同じく移動するバンドが５ＤＳ−ＰＡＧＥ上で見えた。 このタン１＜り質は分泌されたタンｔＺり賀の〉５％として発現された。 （Ａ）ＣＯ５−７細胞における発現 プラスミドｐｓＶ７ｔＰＡ２１　（ＡＴＣＣＴＩＪ人番号４０１６３．１９８５ 年２月１４日に供託された）は、ＳＶ４０複製起原、初期プロモーターおよびポ リアゾニレ−ジョンサイトに隣接するポリリンカー配列中に全長のヒトｔＰＡを コードするＤＮＡを含む哺乳類の発現ベクターである。このプラスミドもＰＣＴ 特許出願ＷＯ３６１０５５１４に記述されている。 プラスミドｐＳＶ−Ｍ１２Ｓを作成するためにｈｕ−ＭＩＰ−２αをコードする 配列をプラスミドｐＹＭ［Ｐ５００からＰＣＲで増幅してそのサイト５′にＳＶ ４０複製起源および初期プロモーターおよび挿入サイトの３′にポリアデニレー ンコンサイトをもつ発現ベクターｐｓＶ７ｔＰＡ２１のサイトへ挿入する。 グラハム（Ｇｒｚｌｕｍ）および−）７ンデルεｂ、ｊｅａｎ　ｄｅ＋　Ｅｂ、 ｌ、　’／１ｄｏ１．　（１９７３）、５２４５６−６７に記述された手順を修 飾したものを用いてＣＯ３−７１１胞をｐＳＶ−ＭＩＰ２αでトランスフェクシ ョンする。サンプルを２枚の皿に加えて、６時間ＣＯ２インキユベーター中で３ ７℃で細胞上へ置く。培養後に細胞を穏やかに、カルシウムおよびマグネシウム を含まないＰＢＳでゆすぐ。次に皿をアジュバントとしてのグリセロールに３〜 ４分間さらして、ゆすぎ、４．　５αｇ／ｍｌグルコース、３．　７ｇｇ／ｌｌ １重炭酸ナトリウム、２９２μｇ／】１グルタミン、１１０μｇ／１１ピルビン 酸ナトリウム、１００Ｕ／ｍｌペニシリン、１００Ｕ／ａｔストレプトマイシン 、および１０％牛脂児血清（Ｆ　ＣＳ）を補ったＤＭＥＭ培地で栄養を与える。 培養をグリセロールの１１ｒ激から回復させた後、培地を血清を含まない培地に 代える。血清を除去してから１２時間後に、条件を設けた培地をｈｕ−ＶＩＰ− ２αについてアッセイする。 ランスフニラ／シンの前日に、Ｌ　Ｌ８ｍｇ／ｍｌ　ＮａＨＣＯ３，２９２μｇ ／ｌクルタミ／、１１０μｇ１ｍｌピルビン酸ナトリウム、１００Ｕ／ｍｌベニ ンジン、１００Ｕ／ｚｌストレプトマイシン、１５０ｍｇ／ｍｌプロリン、およ び１０％ＦＣ３を補ったＦ１２培地中で培養した。次に上のパート（Ａ）で記述 したように細胞をトランスフェクションするが、さらにアデノウィルス主要後期 プロモーターに結合したｄｈｆｒ遺伝子をもつマーカープラスミドを含める（カ ルシウムリン酸中で共沈させる）。４８時間培養後に細胞を１２０に分けて、選 択培地（ＤＭＥＭ、１５０μｇ、／＋ｉプロリン、および１０％ＦＣ３）中で生 長させて、１〜２週間培Ｉ！する。 例７ Ａ３選択マーカーをコードするプラスミドの調製ネズミＤＨＦＲｃＤＮＡをもつ プラスミドｐ　Ａ　ｄ　−Ｄ　ＨＦ　Ｒは、アデノウィルス−２（Ａ　ｄ−ＭＬ 　Ｐ地図単位１６−２７．３）の主要後期プロモーターのマウスＤＨＦＲＣＤＮ Ａ　（Ｊ、Ｈ，ヌンヘルク（１、ｔｌ、　Ｍａｎｈｅ：ｇ）ら、　Ｃａ　ｌ　ｌ 　：１９ｇＧ１１９３５５−６４）の３′非翻訳配列への融合によってＷＩ築し た。ｍ期転写単位の部分をコードし、小を抗原遺伝子のイントロンを含み、ＳＶ ４０初期部分転写終結部分をもつ５Ｖ４０ＤＮＡｅｐＳＶ２−ｎｅｏから得て（ サザン’４ｏｕ＋ｈ＋＋ｎｌおよびベルブ！Ｂｅ：ｇｌ、　Ｊ、　１ｌｏ１．　 Ａｐｐｌ、　Ｇｅ＋＋、　（＋９Ｈ）　１３２７−４１１、ＤＨＦＲｃＤＮＡの ３′非翻訳末端に融合させた。これらの３つの部分をｐＢＲ３２２へサブクロー ニングしてプラスミドｐＡＤ−ＤＨＦＲを得た。 発現カセットを、哺乳類細胞発現ベクターｐＳＶ７ｄ　（２４２３ｂｐ）を用い て調製した。 プラスミドｐｓＶ７ｄ　（トルエフト、：Ｔ：ｖｅ目）ら、１９８５、憇Ａ、Ｊ ：　３３３を見よ）を次のように構築した：５Ｖ９０復製起源および初期プロモ ーターを含む４００ｂｐのＢａｍＨＩ／ＨｉｎｄｌｌＩ断片を（ポールベルブ！ Ｐｉｕｌ　１ｌｓ４）　、スタッフォード大学（Ｓ＋ｚａｌｏｔｄ　ＩＩａｉｒ ｕＩｉ＋ｒ）　、カリフォルニア州から得た）ｐｓＶｇｔＩから切り出して、精 製した。ＳＶ４０ポリＡ付加サイトを含む２４０ｂｐの５Ｖ４０Ｂ　ｃ　ｌ　Ｉ ／Ｂ　ａｍＨＩ断片をｐｓＶ２／ＤＨＦＲ（サブラマニｊｓｏｈｒ＋＋ｕｎｉ） ら。 Ｍｏ１．　Ｃａ１１．　Ｈｉｏｌ、　Ｃｆ９ｇ！１１：　８５４−ａ６４）から 切り出して精製した。断片を次のりンカーを通して結合した： このリンカ−は全ての３つの涜みわく中にストップコドンを含むのみならず５つ の制限サイトを含む。５Ｖ４Ｑ複製起源、ＳＶ４０初期プロモーター、ストップ コドンの入ったポリリンカーおよびＳＶ４０ボリアデニレーンタンサイトを含む 得られた６７０１の断片を、約１．　５ｋｂの欠損のあるｐ　ＢＲ３２２透導体 であるｐＭＬ（ラスキーＬｌｌｊｋ１）およびボッチャン゛Ｂｏｔ：ｈこＱ）、 （旦１９８４１…　３９１）のＢａｍＨＩサイトへクローニングしてｐＳＶ５を 得た。ｐｓＶ５のｐＭＬ配列中のＥｃｏＲＩおよびＥｃｏＲＶサイトはＥｃｏＲ ＩおよびＥｃｏＲＶで７肖化して除去して、Ｂａ１３１ヌクレアーゼで処理して 両末端の約２００ｂｐを除去して、最後に再びライゲーションしてｐｓＶ７ａを 作成した。Ｂａ１３Ｌの切除で、ＥｃｏＲＶサイトから約２００ｊｐ離れた、Ｓ Ｖ４０部分に隣接する１つのＢａｍＨＩ＠＠サイトも除去された。ＳＶ４０詔分 に隣接する２番目のＢａｍＨＩサイトを除去するために、ｐＳＶ７ａをＮｒｕｌ で消化し、ＮｒｕＩは復製開始点の上流のｐＭＬ配列中を切断する。 ｐｓＶ７ｃおよびｐＳＶ７ｄは連続したポリリンカーの置き換えを代表する。 まずｐ　ＳＶ７　ｂｕｓ　ｔ　ｕ　ＩおよびＸｂａ、Ｉで消化した。次に下のリ ンカ−をベクター中にライゲーノヨンしてｐＳＶ７ｃを作成した・ＢｇｌＩＩ　 Ｅ（ｏＲＩ　；ｍａｉ　Ｋｐｎｌ　ｔｂａｌその後、ｐ　Ｓ　Ｖ　７　ｃをＢａ １ＩＩおよびＸｂａＩで消化して、下のリンカ−をラーゲーンタノしてｐｓＶ７ ｄを作成した ＢＢＩＩＩ　Ｅ：ＯＲ１ｉｍ＋ｌ　Ｘ！＋＋ｌ　Ｂｘｍｊｌｌ　１ｉｉｉ５゛　 −ＧじｃｒｃＳ、ｔじ７口ＣＣＣ５ＧＧＴＣＴ＾いＧＧＡＴＣＣＧＴＣＧＡＣＡ ＧＣ丁゛入ＡＧＧＧＧＣＣＣＡＧＡＴＣＴＣＣＴ入ＧＧＣＡＣＧＴＧＧ：八ＴＣ ２、ｐＣＭＶ６ａ 異質ｔタンパク質のメツセンツヤ−ＲＮＡの転写および安定の水準を改善するた めの努力においてＳＶ４０初期転写開始部分をヒト巨細胞つィルス極初期邪分の 配列（ボシャルトＢＯｒ：ｚ・・）ら、　Ｃ＋！！　’１９＆５Ｈ：　５２１− ５３８）で！き換えた。さらには５Ｖ４１］期部分によってメツセンツヤ−ＲＮ Ａに寄与する５′非翻訳配列を、第１イノトロンを含めたＨＣＭＶＩＥＩ遺伝子 の５′非翻訳配列と！き換えた。スプライシングされる転写物はより速くブフセ ノンングされてより安定なｍＲＮ、へになるという仮定の下に、このイントロン を含める。発現ベクターはＣＯ３７佃抱において一過性の発現を可能にするため のＳＶ４０複製起源およびアンビンリン耐性の選択でＤＮＡのクローニングを可 能にするたのバクテリアのβ−ラクタマーセ遺伝子も持っている。 プラスミドは、（例７、セクション８．　１で記述された）ＳＶ４０ポリアゾニ レ−７３２部分を含むｐＳＶ７ｄの７００ｂｐの５ａｉｌ−Ｐｖｕｌ断片、ＳＶ ４０虐製開始点および残りのβ−ラクタマーセ遺伝子を提供するｐｓＶＴ２（ツ ヤ−ｆ：：ＭＹｒ：Ｓ）う、Ｃｅ１ｌ（１９８１１２５：　３７ｇ−８４：　’ ）オｔＲｉｏ）　ら、Ｃ＋ｌｌ’１９８３）１２１２２７’４０）の１４００ｂ ｐの（クレノーポリメラーゼでフィルインした）ＰｖｕＩ−ＥｃｏＲＩ断片、Ｉ ＥＩタンパク質の翻訳開始点の近くに試験管内突然変異誘発によって５ａｌＩサ イトを導入したヒト巨細胞ウィルス（タウン菌株（Ｔｏｔｎｅ＋ｔ：ａｉｏｌ） のサブクローンのプラスミドに由来する１７００ｂｌＩの５ｓｐｌ−３αｌＩ断 片、および因子■・Ｃ９２Ｃ９２Ｋ！タンパク質をコードするＣＤＮＡを含むｐ ＳＶＦ８−９２Ｃの４３０（ｌｂｐの５ａｌｌ−３αｉｌ断片から構築した。 ｐｃＭＶ６ａ１２０−３Ｆ２プラスミドは、因子■　Ｃ９Ｃ９２Ｋタンパク質を コードする５ａｌＩ−３αｉｌ断片を、異質な遺伝子に融合させたヒトｔＰＡの ５′非翻訳およびシグナル配列を含む発現カセットに置き換えたことを除いては 、上に述べたｐＣＭＶ６ａに等しい。このベクターを、寄託番号６８２４９でＡ ＴＣＣに供託した大腸菌にトランスフォーメーシヲンした。ｐＣＭＶ６ａ１２０ −５Ｆ２をＮｈｅＩおよび５ａｉｌて消化すると異質な遺伝子が除去されるだろ う。任意のｈｕ−Ｍ１１’−２αポリペプチド遺伝子を、哺乳類の発現ベクター １）ＣＭＶ６ａ１２０−３Ｆ　２中に挿入したリンカ−へライゲージ遭ンできる 。 例えばｈｕ−ＭＩＰ−２α遺伝子をイーストプラスミドからポリメラーゼチニイ ンリアクノヨノ（ＰＣＲ）増幅で得る。ＰＣＲ反応を行うためのプライマーは、 図２に示したｈｕ−ＭｒＰ−２αの核酸の配列を下にして容易に構築することが できて、増幅した遺伝子をベクターへ挿入するためのＮｈｅｌおよび５ａｌｔの ような適当な制限サイトを含むようにプライマーを構築することができる。便利 なようにＤＨＦＲ遺伝子をこの新しいｈｕ−ＭＩＰ−２α発現カセットへ挿入す ることができる。この祈しいベクターをｐＣＭＶ−ＭＴＰ２αと呼ぶ。 記述する。 ＤＨＦＲ−ＣＨＯ［ａｌ系列ＤＧ４４　（Ｇ、　ウルラウブ！Ｇ、　Ｔ山ｏｂ） ら、　Ｓｏｗ。 Ｃａ１１．　Ｖｏｌ、Ｇｃｎｅｌ、（１９８６）　１２：　５５５−６６）をま ずプラスミドｐＣＭＶ−ＭＩＰ−２αでトランスフェクシヨンする。このプラス ミド中で（例７Ｂ−２で記述された）ＣＭＶプロモーターは、（例５で記述され た）ｐＹＭＩＰ５００に由来するＭ［Ｐ−２α遺伝子を制御し、（例７Ｂ−２で 記述された）ｔＰＡ先頭配テ１はコードするｈｕ−Ｍ［Ｐ−２αの分泌を指図し 、（例７Ａで記述された）ｐＡｃｔ−ＤＨＦＲに由来するＡｄ−ＭＬＰ／ｄｈ　 ｆ　ｒカッセトの下流を含む。Ｗ、チャネイ（１，Ｃｂｕｅｙ）ら、　５ｏ１１ ．　Ｃａ１１．　Ｖａｌ、　Ｇｅｎｅ＋、　（１９８６］１２：　２３７−４４ によって記述されたポリブレン法を用いて細胞をトランスフェクシヨンした。（ ＤＭＥＭ〒１０％ＤＦＳＣ中で）Ｄ）ＴＦＲ＝細胞に対する選抜によって多くの ｈｕ−Ｍ［Ｐ−２α生産株を単離する。 寄託情報 次の物を、アメリカンタイプ力ルチャーコレクンヨン（ＡＴＣＣ）。 １２３０１パークローンドライブｆＰｕｋｌｓｖｎ　Ｄ＋１ｙｅｌ、ロノクヴイ ル１Ｒｏｃｋｖｉｌｌ＋）、メリーランド州２０８５２に寄託した 名　称　寄託日　寄託番号 チャイニーズハムスター　１９９０年３月　８日　ＣＲＬ１０３７８卵巣細胞Ｃ ＨＯ−ＤＧ４４ 大腸ＩＮＦ（Ｂｌｏｌ　１９９０年３月　８日　６８２４９ｐｃＭＶ６α１２０ −３Ｆ２ サツ力ロマイセスセレヴジアニ　１９９０年６月２０８　７４００３ｉｓ、ｃｅ ＝ξＹ口目＋） ＭＢ２−１　（＋）ＹＭＩＰ５ＱＣ１）これらの物を、特許手続きの目的のため の微生物の寄託の国際的な承認に関するブダペスト条約の約定の下に寄託した。 これらの寄託物は便利な物として該当分野で熟練した人々に提供されて、寄託が ３５Ｕ、Ｓ、　Ｃ，セクション１１２に従って要求されるという承認を表わさな い。寄託された物に含まれるポリヌクレオチドの配列およびそれによってコード されるポリペプチドのアミノ酸配列は、この言及によって本明細書中に含まれる ものとし、本明細書中に書かれた配列の記述についての任意の争議の成り行きを 支配する。寄託された物を構築する、使用する、または売るためには認可を要求 されるかもしれず、そしてそのような認可を本明細１によって承諾しない。 りＣＪ　：ｌｃｐ　胸０　飄く　≧く　≧０ΦＨΦト　ΦＵ　１−１ｃり　１− １ｃり　＋ａ−（Ｊ　！（Ｊ　のｈ　Ｏｏ　ＣりＣ！＋　ｃｚｃｐＯＷＣり　Ｏ ＣＤ　−＋ａ（Ｄ　ＣＣＤ　Ｏ（Ｊ　ｃｅ−＋？ｆ藁　Ｓお　ミ８　Ｓご　記８ 　」矩ｃｏ　ｃｏ　＞＜　”ｓａｏ’ｙｕ　ｖｒ■、−１（Ｊ　ｌ−１（Ｊ　Ｓ ＣＤ　のＥ−Ｉ　ｎΦ０　ヌく＜■　＜ＣＤ　Ｃり（り　＋−１（、ｌ　Ωトー クψＱ　ＨＱ　づ＜−ク　［Ｆ］ＯコＱ −ｓ＜　ｃＥ−１、＋ｕ　、ｃｕ　ｐｃｚ　ｃ＋ｈ：！：ＣＪ　＞Ｑ　＜■　ｈ ＜　＜ｄ、　−ＣＪ浄書（内容に変更なし） ＦＩＧ、４ Ａ、　ｃＤＮＡ ｈｕ−ＭＩＰ−２β　ｈｕ−ＭＩＰ−２ｃｃ　ｈｕ−ｇｒｔｙ　ｍｕ−ＫＣｍｕ −ＭＩＰ−２５４，１５７，２５６−５４６，４ｈｕ−ＭＴＰ−２β　７０．０ 　６９．５　５７．Ｏｈｕ−ＭＩＰ−２ａ　８７．４　４７．６ｍｕｆＭＩＰ− ２７１，３７１，３７０，４７５，６ｈｕ−ＭＩＰ−２β　９４．４　９０．７ 　６７．９ｈｕ−ＭＩＰ−２ｃｃ　９３．５　６９．４Ｃ３’未翻訳 ｍｕ−ＭＩＰ−２４８，１５３，１５３，４４７，３浄書（内容に変更なし） ＦＩＧ、　５Ｂ−Ｉ ＭＩＰ−２同族体のアライメント ＦＩＧ、　５Ｂ−２ ＫＫ工工ＥＫＭＬｎｓｄＫＳＮ １１１１１１１１　１１＋ ＫＫ工工ＥＫＭＬｋｎＧＫＳＮ ＦＩＧ、６ ｋｂ　Ｂ　Ｅ　Ｒｋｂ　Ｂ　Ｅ　ＲＢ　Ｅ　Ｒ補正嘗の翻訳文提出書 （特許法第１８４条の８）

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．ヒト組織を実質的に含まないヒトＭＩＰ−２αポリペプチドからなる組成物 。 ２．実質的に他のヒトタンパク質を含まない請求項１の組成物。 ３．実質的に他のタンパク質を含まない請求項１の組成物。 ４．ｈｕ−ＭＩＰ−２αポリペプチドがｈｕ−ＭＩＰ−２αである請求項１の組 成物。 ５．ｈｕ−ＭＩＰ−２αポリペプチドをコードしている外来領域からなるＤＮＡ 分子からなる組成物であって、実質的に他のＤＮＡを含まない組成物。 ５．ｈｕ−ＭＩＰ−２αポリペプチドをコードしている上記領域がイントロンを 含まないＤＮＡ配列である請求項５の組成物。 ７．ｈｕ−ＭＩＰ−２αポリペプチドのアミノ酸配列をコードしている、イント ロンを含まないＤＮＡ配列からなるＤＮＡ分子。 ａ．ｈｕ−ＭＩＰ−２αポリペプチドがｈｕ−ＭＩＰ−２αである請求項７のＤ ＮＡ分子。 ９．請求項５のＤＮＡ分子によって形質転換された細胞集団であって、該ＤＮＡ 分子によって形質転換されない細胞を実質的に含まない細胞集団。 １０．ｈｕ−ＭＩＰ−２αポリペプチドを製造する方法であって、下記段階から なる方法； 請求項９の形質転換された細胞集団を提供し；該細胞集団を上記ポリペプチドが 発現される条件下に生育させ；そして該ポリペプチドを回収する。 １１．該ポリペプチドが該細胞によって分泌される請求項１０の方法。 １２．少なくとも１０個の配列ヌクレオチドからなる一本鎖ＤＮＡ分子であって 、該配列ヌクレオチドが、ｈｕ−ＭＩＰ−２αに特有の配列またはその相補性Ｄ ＮＡ配列かなる一本鎖ＤＮＡ分子。 １３．ヒトＭＩＰ−２αをコードしている配列に対して実質的に相同なポリペプ チドの存在を決定する方法であって、下記段階からなる方法；該ポリペプチドを 含むことが推測される試料を提供し；該試料を、請求項１２の一本鎖ＤＮＡに相 補性の配列を有するヌクレオチドプローブとともに、該プローブが上記試料由来 の核酸とハイブリッドを形成するであろう条件下にインキュベートし；そして核 酸ハイブリッドを検出する。 １４．ｈｕ−ＭＩＰ−２αポリペプチド上のエピトープとは反応するが、ネズミ のＭＩＰ−２、ヒトｇｒｏタンパク質またはネズミのＫＣ遺伝子によってコード されたタンパク質とは反応しない抗体。 １５．該抗体はモノクローナルである請求項１４の抗体。 １６．請求項１４の抗体からなる組成物であって、実質的に他の免疫グロブリン 分子を含まない組成物。 １７．請求項１５のモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ細胞株。 １８．試料中のヒトＭＩＰ−２αの存在を決定する方法であって、下記段階から なる方法： 上記試料をｈｕ−ＭＩＰ−２αポリペプチドと反応する抗体とインキュベートし ；そして 免疫複合体を検出する。 １９．試料中の抗ｈｕ−ＭＩＰ−２α抗体の存在を決定する方法であって、下記 段階からなる方法； 上記試料を請求項２の組成物とインキュベートし；そして免疫複合体を検出する 。 ２０．有効量のｈｕ−ＭＩＰ−２αポリペプチドからなる、骨髄造血細胞での骨 髄造血を促進する医薬組成物。