JPH06501611A - 細胞培地の酵素的再生方法およびそれらの培地およびキット - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 細胞培地の酵素的再生方法およびそれらの培地およびキ・ット発明の分野 本発明は、同時に栄養素の合成をしながら、細胞培養系において細胞老廃物の集 積を調節および減少する方法に関する。

発明の背景 培養細胞は、炭素源、アミノ酸およびビタミンを含むある種の栄養素を異化する 。細胞は細胞分裂を経て、モノクローナル抗体のような有用な細胞物質並び１ニ アンモニアおよび乳酸のような不要物を産生ずる。しかしながら、不要物の蓄積 および栄養素の減少は細胞培養の機能的寿命を限定する。ツク・ソチ培養では、 細胞の死は最小レベルの栄養素が枯渇および／または不要物の過度レベルが蓄積 した後に起こる。不要物の増加および栄養素の減少に対する様々な解決が試みら れている。

培養の連続成長は、培養部分の除去および一定間隔で新しい培地に置き換える　 ゛ことにより達成することができる。このことは、不要物を除去し、必要な栄養 素を補充するのに役立つ。本方法では、細胞および培地を含む流体を、細胞培地 容器から連続的に取り除き、新しい培地に置き換える。別法として、かん流系で は、新しい培地が加えられる間に培地のみが取り出されるように、細胞が細胞培 養管に監禁することができる。

しかしながら、細胞培養系の成分は一様に減少しない。すなわち、かん流培地は ３または４種の栄養素が減少することがあり得るが、他の成分の適当な量を含む ことができる。かん流によるこれらの有用な成分の除去は不経済である。

これらの様々な系では、栄養素および不要物のレベルは「使（Ａきった」培地を 回収し、新しい培地に置き換えることで維持される。しかしながら、特番二人規 模／高い密度の培養では、栄養素のかん流は製造者から培養設備、）くイオＩＪ アクタ−１および最終的な物質単離設備までへの大きな体積の培地の高価な転移 が必要となる。大きな体積の培地を移動する価格および不都合さを小さくする１ つの方法は、組織培養培地の濃縮物を使用することである。しかしながら、濃縮 物は培地に添加する前に水で再構成する必要があり、大きな体積の使いきった培 地が生じる。

がん流は他の不利に関連する。例えば、かん流系は使いきった培地から分離する べき細胞による押し出しを受け易い。流体の莫大な量、時には１日あたり１培養 体積以上を交換しなければならないので、このことは高密度培養物にとって顕著 な関心事である。さらに、細胞物質は生じた大きな体積の使いきった培地から単 離しなければならず、物質を単離した後、大きな体積の使いきった培地を廃棄す る必要がある。

吸収技術が不要物であるアンモニアの除去を支持してきた（ゴートン、エイおよ びグリーンバーム、エム　、マランツ、エル１、マツカーサ−、エム　およびマ クスウェル、エム　、「溶媒に基づ（低体積再循環透析物系」、トランスファー ・アメリカン・ソー／セル・アーティフィシャル・インターナショナル・オーガ ン、第１５巻、箪３４７−３５２頁（１９６９年））。この系はアンモニアを除 去するが、栄養素レベルには影響しない。さらに、りん酸ジルコニウムのような 吸収剤の現場での再生は、その剤がアンモニアで飽和した後では困難である。逆 相浸透系はこの場合、栄養素レベルを増加させずに毒素減少能力だけを提供する 。

すなわち、栄養素および不要物が大きな体積の培地のかん流の必要なしで所望の レベル内で維持することができる場合、細胞培養の実施に明らかに有利となる。

発明の要約 本発明によると、複合酵素系は、細胞培養系におけるアミノ酸のような栄養素の 合成およびアンモニアおよび乳酸のような不要物の減少を可能にする。好ましい 態様としては、乳酸デヒドロゲナーゼは補因子であるＮＡＤ＋の存在下で乳酸を ピルビン酸へ転換する。ロイシンデヒドロゲナーゼは、乳酸デヒドロゲナーゼ反 応により生じるＮＡＤＨの存在下でα−ケト酸を対応アミノ酸へ転換する。補因 子は適当なレベルの基質の存在下で連続的に再循環する。

本発明は、有害な不要物をそのままでは細胞培養系中に欠乏する栄養素に転換す る機構を提供する。それは、培養中における細胞の連続的な成長に必要なアミノ 酸および他の成分のレベルを維持するための系に適用することができる。結果と しては、培養した細胞の産生寿命が延長される。

図面の簡単な説明 第１図。第１図は代表的な複合酵素系を示す。

発明の詳細な記載 本発明によると、細胞培養系における不要物の減少およびアミノ酸および／また は他の栄養素の同時に起こる合成が、複合酵素系を使用して達成することができ る。

「細胞培養系」の語は、培養管中でインビトロで成長する細胞の系を意味する。

系は具体的な培養管配置または細胞型に限定されないが、好ましい態様では哺乳 類細胞が液体培地で成長する。

細胞培地に関する「接触」の語は、複合酵素系の酵素が、（ａ）不要物のような 培地の少なくとも１種の成分とアミノ酸前駆体のような複合酵素系の成分との反 応を触媒し、（ｂ）複合酵素系の再循環する補因子を再生するように、本発明の 複合酵素系に細胞培地をさらすことを意味する。

「再循環する補因子」の語は、酵素の活性に必須の非蛋白基質を意味する。本発 明の１つの態様では、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤ”）は補 因子である。ＮＡＤ”は電子転移によりＮＡＤＨに転換することが可能である。

本発明の１つの態様では、ＮＡＤ“はアミノ酸前駆体に対するロイシンデヒドロ ゲナーゼの作用（アミノ酸を形成する）により生じる。乳酸デヒドロゲナーゼは 乳酸をピルビン酸へ転換し、この反応によりＮＡＤＨのような補因子が再生する 。

「栄養素」の語は、培養における細胞の成長および／または分裂に必須の任意の 生物学的化合物を意味する。本発明の１つの態様では、アミノ酸は栄養素である 。ピルビン酸のような非アミノ酸化合物もまた栄養素である。

「栄養素前駆体」の語は、栄養素への酵素的変換が可能である化合物を意味する 。本発明の１つの態様では、アミノ酸前駆体であるα−ケトイソカプロン酸、α −ケトイソ吉草酸およびα−ケト−β−メチル吉草酸はそれぞれロイシン、バリ ンおよびイソロイシンの前駆体である。これらの１種またはそれ以上の前駆体は 複合酵素系で使用することができる。

「複合酵素系」の語は、少なくとも１種の不要物および少な（とも１種の栄養素 前駆体を利用した少なくとも１種の栄養素の合成を達成することが可能である複 数の共同機能性生物学的成分を意味する。好ましい態様によると、本発明の複合 酵素系は、乳酸デヒドロゲナーゼ、ロイシンデヒドロゲナーゼ、ＡＤＰ、ＫＣｌ 、ＮＡＤ−１α−ケトイソカプロン酸、α−ケトイソ吉草酸およびα−ケト−β −メチル吉草酸を含む。

本発明の複合酵素系における有用な酵素は、次の８因子に基づいて試験し選択す ることができる。

１）毒性および酵素および補因子の必要な濃度。作用濃度で、必要な分子は細胞 の成長および／または細胞の生物学的物質の合成に毒性または阻害してはならな い。

２）細胞培地における酵素活性。ある種の酵素は細胞培地の主成分である様々な アミノ酸により阻害されることが知られている。

３）様々な酵素の好ましい種類およびイソタイプ。異なる種類の酵素およびある 種内のイソタイプは、異なる基質に対するそれらの親和性が変化し得る。例えば 、牛の心臓の乳酸デヒドロゲナーゼは４つの型が存在し、それぞれは乳酸塩に対 して異なる親和性を有する。これらの親和性は骨格筋乳酸デヒドロゲナーゼの親 和性と異なり、そのピルビン酸塩は好ましい基質である。また、羊の脳のグルタ ミン合成酵素は、細菌性源からのものよりもアミノ酸により阻害される可能性が 低い（メソッズ・イン・エンザイモロシー、第１１３巻、セクション■（グルタ ミン）、（１９８５年））。

４）細胞培養系のプロテアーゼおよび他の成分による酵素系の不活性化。多数の 蛋白質分解および抑制性分子は、特に高密度で細胞培養系における酵素の作用遂 行に影響する可能性がある。

５）生理学的環境は重要である。多くの哺乳類細胞培養は、多くの天然酵素が不 安定である本質的に中性ｐＨで３７±２℃の温度の培地が必要である。

６）アンモニア／乳酸塩の開始濃度。これらの濃度は細胞培養系と適合しなけれ ばならない。

７）マイクロカプセル化のための原料の滅菌。細胞培養系で使用する場合、マイ クロカプセル化方法の全ての成分および相は滅菌しなければならない。

８）反応動力学の効果。ピルビン酸から乳酸への反応は熱力学的に有利である。

これは細胞培養では好ましくない。

複合酵素系において使用する特定の酵素を選択する１つの方法は、細胞培養中に おける好ましくない不要物の蓄積を最初に同定することである。いったんこの物 質が同定されると、不要物を別の形、好ましくは細胞培養の栄養素源に変換する 酵素を選択する。酵素は適当な補因子、好ましくは適当なレベルの基質の存在下 で連続的に再循環することが可能な補因子と結合して使用することができる。

補因子の特定は選択された酵素およびそれらの特定の基質の必要条件により決定 される。

代表的な複合酵素系は第１図に示される。この系は細胞培養系で使用される上記 で列挙した必要条件に従う。

好ましい態様では、系は乳酸デヒドロゲナーゼおよびロイシンデヒドロゲナーゼ の２つの酵素、および再循環補因子（ＮＡＤ７ＮＡＤＨ）を使用する。乳酸デヒ ドロゲナーゼはＮＡＤ゛の存在下で乳酸をピルビン酸に変換する。ロイシンデヒ ドロゲナーゼは、乳酸デヒドロゲナーゼ反応で生じるＮＡＤＨの存在下で、α− ケト酸（α−ケトイソカプロエート、α−ケトイソ吉草酸およびα−ケトーβ− メチル吉草酸）を対応アミノ酸（それぞれロイシン、バリンおよびイソロイシン ）に変換する。補因子は、適当なレベルの乳酸、アンモニアおよびアミノ酸前駆 体が存在する限り、連続的に再循環する。

細胞培養では、複合酵素系は不要物であるアンモニアおよび乳酸を同時に減少し ながらアミノ酸の合成を達成する。

別の態様では、アラニンはピルビン酸の還元的アミノ化により産生ずることがで き、グルタミンはグルタミン合成酵素の作用によりグルタミン酸から産生ずるこ とができる。

本発明の形は可溶性溶液またはマイクロカプセル化酵素に限定されない。本発明 は容器ユニットと共同して利用することができ、ある種または全ての細胞培地は その容器内で複合酵素系にさらされる。例えば、複合酵素系は中空の繊維ユニッ ト内、半透性膜により分離される区画内に置くことができる。細胞培養物（培地 および細胞）は中空繊維の中央を通り抜け、培地からの不要物は酵素系に接触す る半透性膜を通って拡散する。不要物は、複合酵素系の作用によりアミノ酸のよ うな栄養素に変換し、これらの栄養素は膜を経て細胞培養物へ通り抜ける。

上記の系では、連続的自動調節操作が可能である。不要物レベルが増加する場合 、複合酵素系が起動するが、不要物が新規細胞培養の開始時のように低濃度であ る場合、複合酵素系は相対的に不活性である。

容器ユニットは細胞培養系での好便な使用のためのキットの成分として含むこと ができる。キットの容器ユニットは複合酵素系の酵素を含むことができる。他の 複合酵素系の区画、具体的に栄養素前駆体および再循環補因子は別個に供給する ことができる。キットはまた細胞培養が複合酵素系と接触する手段を提供する。

所望により、キットはまた細胞培地を含有する容器を提供する。

キットの１つの態様では、容器手段は中空の繊維ユニットであり、酵素は最初の 区画内に含まれる。１つまたはそれ以上の栄養素前駆体および再循環する補因子 を酵素を含む区画に加える。細胞培養は、半透膜により最初の区画から分離する 第２区画を経て複合酵素系と接触する。第２区画は、例えば中空チューブを通り 主要培養管から細胞培地、または培地および細胞を受け取る。

キットの他の態様では、容器ユニットの最初の区画が複合酵素系の酵素およびさ らに、１種またはそれ以上の前駆体および／または再循環補因子を含むことがで きる。

キットの別の態様では、それぞれ酵素、補因子および栄養素前駆体を含有する別 個の容器を提供する。所望により、酵素はマイクロカプセル化形で提供すること ができる。成分は、培養物の成長条件に基づき、適当な時に培養系に加える。

細胞培養の先行技術は、細胞培養の維持に関連する様々な機能系で知られている 。本発明によると、複合酵素系は実質的に任意の細胞培養系に好便に組み入れる ことができる。しかしながら、本発明は既知細胞培養系での使用に限らず、新規 および改良した機能的細胞培養系および装置が改良する場合、使いきった細胞培 地は本発明の複合酵素系を使用して再生することができるという見通しが立だ− れている。

以下に示す実施例は、細胞培養系に対する非マイクロカプセル化およびマイクロ カプセル化複合酵素系の適用を示す。

実施例１ 一般的方法　次の酵素および補因子は次に示した順番で細胞培養系に加える。

Ａ、乳酸デヒドロゲナーゼを組織培地に加える。

Ｂ　ロイシンデヒドロゲナーゼとｒＡＪで再構成する。

Ｃ，ＮＡＩ）”をｒＢＪに加える。

Ｄ、ＡＤＰを「Ｃ」に加える。

Ｅ、ＫＣＩをｒＤＪに加える。

Ｆ、α−ケトイソカプロエート、α−ケトイソ吉草酸およびα−ケト−β−メチ ル吉草酸をｒＥＪに加える。

Ｇ、ｒＥＪを０．２２μ非バイロジエンデユロポール膜（ミリボア・コーポレイ ノヨン、ベッドフォード、マサチューセッツ０１７３０）で濾過する。

Ｈ０別に使用するまで２−４℃で貯蔵する。

上記試薬を使用する組織培地に直接加えるかまたは、細胞培地の濃縮物としてこ れを製剤化し、適応最終濃度を提供するためにその後組織培地に溶解することが 可能である。（このことは、数種の型の細胞または条件が同時に試験される場合 に望ましい。）細胞型、培養栄養素の減少の所望な割合および不要物の発生の割 合により反応物の濃度を調整することもできる。

実施例２ 酵素系のマイクロカプセル化 試薬 Ａ）ヘキサンジアミン溶液 １、ＮａＨＣＯｓｏ、３７８ｇを脱イオン水５ｍｌに加える。

２、　１．　６−ヘキサンジアミン０．４６４ｇを加え、溶解する。

３．５Ｎ　ＨＣＩＴｐＨ９，０に調整する。

４．５０％ポリエチレンイミン２ｍｌを加える。

５、反転により混合し、ｐＨ９，０に再調整する。

６、脱イオン水でｌＱｍ１体積に調整する。

７、　０．２２μデユロボア膜で濾過する。

８２°−４℃で貯蔵する。

Ｂ）有機溶媒 １　クロロホルム１２ｍ１とンクロヘキサン４８１１１とを混合する（クロロホ ルム　シクロヘキサン　１：４ｖ／ｖ）。

２　スパン８５（ソルビタントリオレート、シグマ・ケミカル・コーポレイショ ン、セント・ルイス、ミズーリ）０．９ｍｌを加える。

３．０．２μロ径アクロデイスクＣＲ（ケルマン、オートクレーブにより滅菌） で濾過する。

４、毎日新しいものを製造する。

５２℃−４℃で貯蔵する。

Ｃ）塩化テレフタロイル溶液 １　塩化テレフタロイル５５ｍｇを有機溶媒１５ｍ１に加える。３０分間氷上で 撹拌（または優しく撹拌）し溶解する。

２０２μロ径アクロデイスクＣＲ（ゲルマン、オートクレーブにより滅菌）で濾 過する。

Ｄ）ツイーン−２０溶液（５０％） ツイーン−２０を脱イオン化し、蒸留したＨ２０同体積で溶解する。５ＮＮａ○ ＨでｐＨ７，５に調整する。オートクレーブで滅菌する。全てのガラス容器（例 えば遠心管、フタ付きフラスコ、ガラスシリング、ピペット等）は使用する前に オートクレーブ処理しなければならない。

製造 １、乳酸デヒドロゲナーゼを組織培地に加える（第１表参照）。

２、（１）でロイシンデヒドロゲナーゼを再構成する。

３、濾過滅菌（０，２２μデユロボア膜）。

４、滅菌条件下、（３）の同体積とヘキサンジアミン溶液と混合する。氷で放置 する。

５、（激しく）渦動して乳化し、渦動している間に有機溶媒１５ｍ１を加える（ フタ付き１２５ｍ１エーレンマイヤーフラスコを使用する）。

６．１分間渦動続ける。

７．１分間後、塩化テレフタロイル溶液１５ｍ１を加える。３分間さらに渦動続 ける。

８．３分間後、有機溶媒３０ｍ１を加える。３０秒渦動する。

９、マイクロカプセルを無菌ガラス遠心管に注ぐ。１１００ＲＰで２．５分間遠 心する。

１０、無菌条件下上清を捨てる。ｐＨ７，５の５０％ツイーン−２０２５ｍ１を 加える。渦動じ混合する。無菌脱イオン水５Ｑｍｌを加え、渦動し、５分間２５ ０ＯＲＰＭで遠心する。

１１、ＰＢＳで数回洗浄する。

１２、使用するまで４℃で貯蔵する。

１３．使用する前に、細胞培養に選択した培地で２回洗浄する。

１４、実施例：酵素溶液１．５ｍ１（段階「２」）を、細胞培！ｆｆ１１５ｍ１ ＋；：加えるのに十分なマイクロカプセルおよそ３　４＋ａｌを得る。

１５、細胞培養後、（以下参照して）酵素溶液を一緒に混合し、酵素系の残留成 分を加える必要がある（すなわち、ＮＡＤ“、ＡＤＰＳＫＣｌおよびα−ケト酸 ）。これらはマイクロカプセル化酵素細胞培養混合物に濃縮物（チャート参照） として加えることができる。

実施例３ 細胞培養説明書 酵素再生技術の用途は、不要物が増加して、アンモニアおよび乳酸の濃度を生み 出す場合に、高細胞密度で最も適切で有用性を有する。細胞密度がより高ければ 、与えられるユニット／ｍ１ｌ１度に必要な酵素は少なくなる。ハイブリドーマ 細胞では、よい結果が１０”／ｍｌで塗布した細胞で観察される。この濃度では 、撹拌が凝集から細胞を保護および適当な酸化を確実にするために必要である。

細胞はインペラーデザインのバイオリアクター（酸素、ｐＨ制御）または１２ウ エルトレーで培養することができる。

１）細胞は９０に以上の生存率を有し、遅延対数相にある。遅延相細胞を避ける ことが好ましい。

２）細胞計数を実施し、１０７細胞／ｍｌを含む体積に調整する。

３）グルタミン不足を避けるために、３倍（５ｍＭ）ａ度（総合で８ｍＭ）で基 礎培地にグルタミンを補充することが好ましい。

４）第１表により、ＮＡＤ”、α−ケト酸、ＡＤＰおよびＫＣＩを製造する。

５）実施例１の段階Ａ　−Ｈに従って、組織培地の酵素を製造する。

６）細胞を遠心し、組織培地で再けんだくする。最終濃度がｌＸｌ０”細胞／１ １にするために、酵素混合物の添加時の希釈を考慮することが重要である（段階 ８）。

７）培養管またはトレーに細胞を加える。

８）酵素混合物、ＮＡＤ“、α−ケト酸、ＡＤＰおよびＫＣＩを直ちに加える。

アルカリ性条件を避けることが好ましい。

９）５−１０％　ＣＯ２／９０％−９５％空気を含む湿度室内の培養管またはト レーに置く。この室はおよそ１５０ＲＰＭの回転子の上に置くことができる。

１０）３７℃でインキユベートスる。

１１）グルコース、乳酸、アンモニア、生存度、アミノ酸含量および産生能力の 決定するための毎日のサンプル（例えばモノクローナル抗体）を実施するべきで ある。

結果 第２表は、１６８時間にわたるＰＢＳ水相（細胞なし）でのアミノ酸の合成を示 す。見てわかるように、イソロイシン、ロイシンおよびバリンはこの時間にわた って有意に増加する。

第３および４表は、溶液中で遊離した酵素（第３表）およびマイクロカプセル化 した酵素（第４表）を用い高細胞密度においてｐＨおよび酸素制御バイオリアク ターで製造された合成アミノ酸の製造レベルを示す。両方の試験は、アミノ酸レ ベルが細胞培養物中で酵素的手段により増加することおよび、マイクロカプセル 化が細胞環境から酵素を隔てるための利用できる別法であることを示す。

第５および６表は、高密度１２ウエルトレーアツセイの結果を示す。酵素混合物 の存在は、細胞生存率およびモノクローナル抗体産生並びに、少ないアンモニア および乳酸が酵素混合物がない時よりも有意に高いことと相互に関係する。デー タは、アミノ酸レベルおよび乳酸およびアンモニアの濃度が、生存率およびモノ クローナル抗体産生と相互関係することを示す。

■　アミノ酸のレベル（第５表） イソロイシン、ロイシンおよびバリンのレベル（その合成はロイシンデヒドロゲ ナーゼにより触媒される）は、酵素系が不足している培養物と比較して、（骨格 筋および牛心臓乳酸デヒドロゲナーゼ両方で）試験した全ての酵素の希釈度での 全ての酵素含有培養物および培地において有意に上昇する。酵素系を含まない培 養物のこれらのアミノ酸レベルは本質的に減少する。

■、アンモニア／乳酸のレベル（第６表）多（の培養物におけるアンモニアおよ び乳酸のレベルは、酵素系をもたない培養物と比較して酵素系のある方が減少す る。（酵素系は非酵素含有培養物に関連する乳酸対照の適当なレベルに達するた めの滴定が必要であることが見られる。）アンモニアのレベルはモノクローナル 抗体レベルと極めて密接に相互関連することが観察される（第６表参照）。

■、細胞生存率（第６表） 適当な酵素系が非酵素含有培養物（例えば骨格筋ＬＤＨ／ＰＦＨＭ−ＩＩ）と比 較して生存率を有意に増加することが見られる。骨格筋ＬＤＨ／ＰＦＨＭ−１６ ４０＋ＧＭＳ　ＸおよびＰＦＨＭ−ｎを有する牛心臓ＬＤＨもまた培養の生存率 を改良する。

■、モノクローナル抗体製造（第６表）細胞培養系の産業に対する最も重要な見 地は細胞産生における影響である。見てわかるように、各部門の適当に滴定した 酵素系の存在がモノクローナル抗体産生における有意な改良と相互に作用する。

第１表 複合酵素系の製剤 ドロゲナーゼ　培地に直接凍結乾燥した酵素に再構成。

Ｌ−乳酸デヒト　牛心筋ＬＤＨ−１１７，５ユニット林／ｍｌ　１　：　５　（ 培地）−１：５０ロゲナーゼ　（Ｈ４）又はウサギ　（ＰＢＳ）濃縮物。

筋型ＸＸＸＩＸ α−ケト酸　α−ケトイソ　０．５ａ＋ｇ／ｍｌ　培地に直接粉末を加えるまカ プロエート　たはＰＢＳで１００倍を製造。

ＮＡＤ＋（β−ＮＡＤ）　酵母からの約９８％１．３ｇｇ／ｍｌ　１：１００　 １：５００β−ニコチン　のグレードＩＩＩ　（ＰＢＳ）＃縮物。

チド ＡＤＰ（アデノシ　酵母ＡＴＰからの　１０μｇ／ｌｌ１ｌ　１：１００−１・ ５００ン５−ジホス　９５−９９％、グレー　（ＰＢＳ）濃縮物。

フェート　ド■ナトリウム塩 ＫＣＩ　公認のＡＣ３７７ｕｇ／ｍ１　１：１００−１：５００（ＰＢＳ）濃縮 物。

木　１単位は３７℃ｐＨ１０，５で毎分り一ロイシン１．０μモルをα−ケトイ ソカプロエートに変換する。

０１単位は３７℃ｐＨ７，５で毎分ピルビン酸１０μモルをＬ−乳酸に変換する 。

第２表 室温での細胞なしのＰＢＳにおけるバリン、イソロイシンおよびロイシンの経時 合成 アミノ酸濃度（ｍｇ／　Ｉ　） アミノ酸　１５分　１４５時間　２４時間　６３時間　１３７時間　１６５時間 バリン　７６　３５３　４７７　７５９　１０４８　１１０６イソロイノン　７ ３　３５１　４７７　７７３　１１１４　１１９７０イシン　１２４　５６７　 ７２２　１０６７　１４５６　１５５１第３表 けんだく物中酵素なしの高細胞密度（１０’ＡＥ−１ハイブリド一マ細胞／ｍ１ ）での、Ａ　Ｉ）Ｈ１０２制御バイオリアクターにおけるバリン、イソロイシン およびロイシンのレベル（ｍｇ／ｌ）バリン　１５３　３１２　５９　５５９　 ３２イソロイノン　１５６　２２６　２２　４７３　２０イシン　３１９　３８ ７　７０　６２６　１９第４表 マイクロカプセル化した酵素を有する高細胞密度（１０７，ＡＥ−１ハイブリド 一マ細胞／ｍ１）でのｐＨ１０２制御バイオリアクターにおけるバリン、イソロ イシンおよびロイシンのレベル（ｍｇ／ｌ）アミノ酸　対照　＋Ｅ（２４時間） 　−Ｅ（２４時間）　＋Ｅ（４８時間）　−Ｅ（４８時間）バリン　１５６　３ ０４　９０　４５２　９２イソロイシン　１５４　２３１　４６　３３７　３４ ０インン　３０８　４０９　１２０　５６０　９８本発明を好ましい態様に関連 して記載したが、本発明の趣旨および範囲から逸脱しない修正および変化が考え られることが理解される。上記修正および変化は本発明および付記した請求の範 囲の範囲内であると考えられる。

八 、き ζ　ζ　七 補正書の翻訳文提出書 （特許法第１８４条の８）

Claims (22)

【特許請求の範囲】
1. １．少なくとも１種の栄養素の前駆体、上記栄養素前駆体と上記老廃物間の反応 の触媒が可能である第１の酵素、再循環補因子、および上記補因子の再生が可能 である第２の酵素を細胞培養系に加えることを含む細胞培養系で少なくとも１種 の老廃物の濃度を制御する方法。
2. ２．上記老廃物がアンモニアであり、上記栄養素前駆体がアミノ酸前駆体である 請求の範囲第１項記載の方法。
3. ３．上記アミノ酸前駆体がα−ケトイソカプロエート、α−ケトイソバレレート およびα−ケト−β−メチルバレレートを含む群から選択され、上記第１酵素が ロイシンデヒドロゲナーゼである請求の範囲第２項記載の方法。
4. ４．上記第２酵素が乳酸デヒドロゲナーゼである請求の範囲第１項記載の方法。
5. ５．上記再循環する桶因子がＮＡＤ＋である請求の範囲第１項記載の方法。
6. ６．さらにアデノシンニりん酸を上記培養系に加えることを含む請求の範囲第１ 項記載の方法。
7. ７．第１および第２の酵素がマイクロカプセル化型で上記培養系に加えられる請 求の範囲第１項記載の方法。
8. ８．上記培地が少なくとも１種の老廃物を含み、少なくとも１種の栄養素前駆体 、上記前駆体および老廃物から栄養素を産生することが可能である第１酵素、再 循環補因子、および上記補因子の再生が可能である第２酵素を細胞培地に加える ことを含む細胞培地を再生する方法。
9. ９．上記栄養素前駆体がアミノ酸前駆体であり、上記不要物がアンモニアである 請求の範囲第８項記載の方法。
10. １０．上記アミノ酸前駆体がα−ケトイソカプロエート、α−ケトイソバレレー トおよびα−ケト−β−メチルバレレートを含む群から選択され、上記第１酵素 がロイシンデヒドロゲナーゼで、上記再循環補因子がＮＡＤ＋である請求の範囲 第９項記載の方法。
11. １１．第２酵素が乳酸デヒドロゲナーゼである請求の範囲第１０項記載の方法。
12. １２．さらにアデノシンニりん酸を上記細胞培養系に加えることを含む請求の範 囲第９項記載の方法。
13. １３．上記第１および第２の酵素がマイクロカプセル化型で上記細胞培養系に加 えることを含む請求の範囲第８項記載の方法。
14. １４．少なくとも１種の栄養素前駆体、上記栄養素前駆体から栄養素に変換する ことが可能である第１酵素、再循環補因子、上記補因子の再生が可能である第２ 補因子、および上記細胞培地を上記栄養素前駆体、上記酵素および上記補因子と 接触させる手段を含む容器手段を含む細胞培地を再生する装置。
15. １５．上記栄養素前駆体がアミノ酸前駆体である請求の範囲第１４項記載の装置 。
16. １６．上記第２酵素が乳酸デヒドロゲナーゼである請求の範囲第１５項記載の装 置。
17. １７．上記再循環補因子がＮＡＤ＋である請求の範囲第１４項記載の装置。
18. １８．上記アミノ酸前駆体がα−ケトイソカプロエート、α−ケトイソバレレー トおよびα−ケト−β−メチルバレレートを含む群から選択され、上記第１酵素 がロイシンデヒドロゲナーゼである請求の範囲第１５項記載の装置。
19. １９．上記容器手段が、上記栄養素前駆体、酸素および補因子が第１区画にあり 、上記培地が第２区画に位置する半透膜により分離した少なくとも２つの区画を 有する中空繊維ユニットを含む請求の範囲第１４項記載の装置。
20. ２０． （ａ）栄養素前駆体から栄養素への変化が可能である少なくとも１種の酵素を含 む容器ユニット、 （ｂ）少なくとも１種の栄養素前駆体を含む容器ユニット、（ｃ）少なくとも１ 種の再循環補因子を含む容器ユニット、および（ｄ）上記補因子の再生が可能で ある少なくとも１種の酵素を含む容器ユニットを含む細胞培地を再生するキット 。
21. ２１．上記容器ユニット（ａ）がロイシンデヒドロゲナーゼを含み、上記容器ユ ニット（ｂ）がα−ケトイソカプロエート、α−ケトイソバレレートおよびα− ケト−β−メチルバレレートを含む群から選択された少なくとも１種のアミノ酸 前駆体を含み、上記容器ユニット（ｃ）が乳酸デヒドロゲナーゼを含み、上記容 器ユニット（ｄ）がＮＡＤ＋を含む請求の範囲第２０項記載のキット。
22. ２２．さらに細胞培地を含む容器ユニットを含む請求の範囲第２０項記載のキッ ト。