JPH06501619A - 取り外し自在な細胞成長表面又は組織成長表面を備える培養装置 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 取り外し自在な細胞成長表面又は組織成長表面を備える培養装置発明の分野 本発明は、細胞又は組織を生体外で成長させるための装置に関する。

背景 組織又は細胞を生体外で成長させる従来の技術では、生物学的試料は、代表的に は、試験管又はペトリ皿の底に固定され、上方から栄養溶液又は培地で浸される 。この構成は細胞が栄養物を生体条件内で取り入れる方法を反映しない。

改良型の組織培養装置であるトランスウェルは、１９８６年３月２０日に出願さ れ、本願と同様に現在係属中である特許出願第０６．８４１，５６２号に記載さ れている。尚、同特許に開示されている内容は、その特許番号をもって本明細書 に組み入れたものとする。トランスウェル（登録商標）では、組織の試料は、透 析膜によって栄養培地から分離されている。この場合、栄養物の濃度勾配がこの 透析膜を通して細胞を成育し且つ栄養を与え、この構成は生体状態内での状態を より強く反映する。透析膜は管状支持体の底端に取り付けられ、管状支持体はそ の上端のフランジで栄養物が入った容器の頂部から吊り下げられている。この容 器は組織培養皿の一部を構成することが多い。支持体のフランジが支持体及び膜 を容器の中央に位置決めする。支持体の側壁には、容器に流体を加え及び容器か ら流体を取り出すためにピペットを通すための開口部が設けられている。

概要 本発明の特徴の一つはトランスウェルの改良にある。本発明のそれは、トランス ウェルのように一体的ではなく、分離可能な二つの部品から形成されている。

具体的には、細胞の成長を支持するのに使用される代表的には膜である装置の部 分は、成長培地の入った容器内に膜を吊り下げるのに使用される装置の部分に取 り外し自在に固定されている。この構成により、培養された細胞を容易に取り扱 うことができる。

三部品トランスウェルは、２つの構成要素、即ち細胞保持要素及び細胞保持要素 を容器内の予め選択された位！に吊り下げるためのハンガーからなる。保持要素 は、ハンガーの底部分に取り外し自在に固定されている。細胞保持要素は、多孔 膜成長表面を有する。ハンガーは、その底部分が容器内に延びた状態で容器の周 囲から吊り下げられるように構成されている。ハンガーを容器の周囲から吊り下 げた場合には、保持要素は、容器内の予め選択された位置で容器内に水平に吊り 下げられる。

一実施例では、保持要素は摩擦液めてハンガーの底に固定される。他の実施例で は、保持要素はハンガーの底に摩擦液めで固定されているが第１の実施例と比べ ると逆様にした配向である。更に別の実施例では、保持要素はハンガーから吊り 下げられる。

ハンガーは、好ましくは、組織培養クラスタ皿（ｃｌｕｓｔｅｒ　ｄｉｓｈ）の 容器の上端で吊り下げられるように段が付けられた外方に延びるフランジを有す る。この段付きフランジによりハンガーが容器内で横方向にずれることがなく、 これによって、側壁間の流体の毛管作用をなくすように、ハンガーの側壁を容器 の側壁から間隔を隔てられた状態に保つ。更に、一実施例では、毛管作用は、１ 斗状ハンガーを使用することによって阻止される。漏斗状ハンガーは、ハンガー の側壁を容器の側壁から更に遠ざける。フランジは、容器内の培地に近づくこと ができるように、ハンガーと容器の側壁との間の空間にピペットを挿入できるよ うにする開口部を構成するため、不連続である。

本発明の別の特徴は、保持要素自体である。保持要素は、好ましくは、内部を構 成する側壁、及び側壁から延びる周囲リップを有する。膜が側壁の底面に取り付 けられ、組織又は細胞の成長支持体を形成する。周囲リップは、以下に詳細に説 明する特定の流れ装置で保持要素を使用できるようにする構造を提供するばかり でなく保持要素を容易に取り扱えるようにする。

本発明の別の特徴によれば、保持要素及びハンガーの底部の両方が多孔膜を支持 する。この場合、二膜三培地室を構成する組立体がつくりだされる。これらの室 は、一つが膜の下、一つが膜の間、そして一つが膜の上である。これは、輸送の 研究及び細胞間相互作用の研究を行うため、細胞が膜上で成長できるようにする 。

本発明の更に別の特徴は、上述のように組織培養装置が入った複数の容器を持つ クラスタ皿である。

本発明の目的は、栄養物が組織又は細胞に与えられると同時に、培地を加えるた め又は取り出すためクラスタ皿の容器に近づ（ことができるようにクラスタ皿に 配置できる、組織又は細胞の培養装置を提供することである。

本発明の他の目的は、栄養物が人体内の細胞又は組織に通されるのに類似の方法 で、例えば、細胞の表面を成長表面に取り付け、この成長表面を介して栄養物を 受け取ることができるようにする方法で栄養物を組織又は細胞に通すことができ る装置を提供することである。

本発明の別の目的は、成長支持体のいずれかの側の細胞が可溶性因子によって連 通できるようにする方法で、細胞の成長を成長支持体のいずれかの側で支持する ことができる、組織又は細胞の培養装置を提供することである。

本発明の目的は、成長支持体のいずれかの側の細胞が成長支持体を貫通する細胞 の突起によって連通できるようにする方法で、成長を成長支持体のいずれかの側 で支持できる組織又は細胞の培養装置を提供することである。

本発明の更に他の目的は、成長支持体のいずれかの側で培養された細胞又は組織 間の連通を研究するための方法を提供することである。

本発明の他の目的は、成長表面を持つトランスウェルを提供することである。

この成長表面は、トランスウェルから容易に取り外すことができる。

本発明の別の目的は、簡単に取り外すことができる成長表面を有するトランスウ ェルを提供することにあり、この成長表面は、第１装置に一つの配向で配置でき 、第１装置から取り外すことができ、第２装置に逆の配向で配置することができ る。

本発明の他の目的は、取り外して流れ装置に配置できる保持要素を持つ、細胞又 は組織の培養装置を提供することである。

本発明の更に他の目的は、細胞又は組織を成長させるための室を形成する間隔を 隔てられた二つの膜を持つ装置を提供することである。

本発明の更に池の目的は、保持要素の側壁をクラスタ皿の容器の側！から十分な 距離間隔を隔てることができ、これによって毛管作用による夫々の側壁間の流体 の吸い上げを阻止する装置を提供することである。

本発明の更に他の目的は、細胞を吊り下げられた状態で成長させることのできる 細胞装！又は組織装置を提供することである。

図面の簡単な説明 第１図は、摩擦液めを使用した本発明による培養装置の分解図であり、第２図は 、組み立てた状態の第１図の装！の断面図であり、第３図は、吊り下げ嵌めを使 用した本発明の別の培養装置の分解図であり、第４図は、組み立てた状態の第３ 図の装置の断面図であり、第５ａ図は、本発明の保持要素とともに使用するため の流れ装置の第１二二・ノドの斜視図であり、 第５ｂ図は、第５ａ図の流れ装置の第１ユニツトと連結される第２ユニツトの断 面図であり、 第６図は、第５ａ図及び第５ｂ図の第１ユニツトと第２ユニツトとの間に形成さ れた流路の概略断面図であり、 第７図は、摩擦液めを使用し、第１図に示す実施例と比べて成長表面が逆の配向 になった、本発明の別の培養装置の分解図であり、第８図は、組み立てた状態の 第７図の装置の断面図であり、第９図は、ハンガーに直接取り付けられた膜を更 に有する、第１図の）＼ンガー及び保持要素の断面図である。

実施例 第１図及び第２図の各々に示す組繊又は細胞の成長袋！は、細胞又は組織の保持 要素１０及びハンガー１２を有する。保持要素１０は、生物学的試料、例えば細 胞又は組織に生体条件内に相当する又は生体条件内と同様の方法で栄養を与える ことができるように、生物学的試料を支持するためのものである。ハンガー１２ はクラスタ皿１６の培養容器１４のリムから吊るされているように構成され、こ のハンガーは、保持要素を容器１４内に支持し且つ位置決めするためのものであ る。保持要素１０は、とりわけ、保持要素１０よりも大型で取扱いの面倒なハン ガー１２とは別に容易に取り扱うことができるように、ハンガー１２に取り外し 自在に固定されている。

クラスタ皿１６は、添付図面には部分的にしか示してないが、本発明の譲受人で あるデータパッケージング社に譲渡された１９８５年１月２日付けの米国特許第 ４．４９５，２８９号に詳細に示されている。同特許に触れたことによりその特 許に開示されている内容は本明細書に組み入れたものとする。本願では、クラス タ皿の容器１４を一つだけ示しであるが、クラスタ皿は六個、十二個、二十四個 、又は装置が使用される特定の目的について選択された他の数の容器を有するの がよいということは理解されよう。勿論、皿の容器の各々は、別々の組織成長装 置組立体即ち細胞成長装置組立体を収容しているのがよい。他の容器の各々が図 示の容器と同じであり、各々が他とは別個に使用されるため、単一の容器だけを 示す。

クラスタ皿は、底が閉じていて頂端が開いている多数の容器１４を有する。各容 器１４の側壁１８はほぼ円筒形であり、容器が形成される金型からのベースの取 り出しを容易にする僅かな抜き勾配を有するのがよい。クラスタ皿１６は、代表 的には、透明であり、ポリスチレンで成形されている。

代表的には、クラスタ皿１６と同じ材料で成形されているのがよい蓋（図示せず ）が、容器１４の開放端を覆うため、クラスタ皿上に位置決めされるように設け られる。

以上の記載で図示のクラスタ皿の細部を成る程度詳細に説明したが、皿の細部は 本発明を構成するものではなく、本発明の組織又は細胞の培養装置は、他のクラ スタ皿と適合するように種々の大きさ及び形状でつくることができるということ は理解されよう。

第１図及び第２図に示す本発明の第１実施例では、保持要素１０は摩擦液めてハ ンガー１２に取り外し自在に固定されている。これを行うために、保持要素１０ 及びハンガー１２は入れ子式になった嵌まり合う部分を有する。これらの入れ子 式になった嵌まり合う部分は互いに係合して保持要素１０とハンガー１２との間 に漏れ止め嵌合を形成する。このようにして、装置を組み立てたとき、ハンガー １２の底及び保持要素１０によって構成される内部組織成長室１９が形成される 。

ハンガ一部材１２は、全体に漏斗形状であり、幅広の円錐形頂部分及び幅狭のほ ぼ円筒形の底部分とを有する。頂部分は、半径方向に延びる周囲フランジ２０で 包囲されている。このフランジ２０は、容器１４の頂層面２２と係合するように 構成されている。ハンガー１２の円筒形底部分２４は、保持要素１０に取り付け られるように形成されている。フランジ２０及び底部分２４は、直径が頂部から 底部まで減少する円錐形の側壁２６によって接合され、これによって、／＼ンガ ー１２の底部分２４を容器１４の側壁１８から間隔を隔てる。この構成は、容器 １４の側壁１８とハンガー１２の側壁２６との間で流体の吸い上げが起こらない ようにするのを助け、これによって、流体が容器１４から外に又は隔絶された中 央組織成長室１９内へ吸い上げられないようにする。

ハンガー１２の頂層の周りを延びるフランジ２０は環状であり、好ましくは、段 が付いており、これにより、ハンガー１２と容器１４とが僅かな遊びでぴったり と嵌合する。これにより、ハンガー１２は、容器内に正確に位置決めされ、容器 内での横方向移動について自由でない。フランジ２０の下面は、その最外縁部に 沿ってハンガー壁２８によって画成されている。ハンガー壁２８は、容器１４の 頂層面２２上に載止するように容器１４の開口の内径よりも大きい外径を有する 。環状段壁３０がハンガー壁２８からほぼ垂直方向下方に延びる。段壁３０の外 径は、容器１４を画成する側壁１８の内径よりも僅かに小さい。この構成により 、ハンガーは容器１４内の中央に正確に位置決めされ、／飄ンガー１２が容器】 ４に関して横方向に移動しないようにされる。

段壁３０は連続していなくてもよいということを理解すべきである。つまり、段 壁は断続的であってもよい。同様に、他の構造もまた可能である。例えば、容器 の側壁と係合するようにハンガーの周囲に配置された断続的な突出部が同じ目的 、即ちハンガーを容器内の中央に位置決めし、ノ＼ンガー１２が容器１４内で横 方向に移動しないようにすることを達成することができる。

フランジ２０は、ハンガー１２の全周に亘って延びていてもよいし、好ましくは 、周囲の一部のみ、例えば約２／３に亘って延びているのがよく、これによって 、容器１４の床にほぼ垂直な方向から容器１４に直接近づくことができるように するためのフランジ開口部３２が提供される。フランジにこの開口部がない場合 には、フランジは、このように垂直方向から近づくことを妨げる。更に、このよ うな開口部が幾つか設けられているのがよく、好ましくは、これらの開口部はフ ランジの周囲に亘って等間隔に間隔を隔てられている。この場合、フランジは断 続的であり、フランジの各区分の幅は、例えば、側壁２６の幅と一致する。

フランジ２０の上面は、間隔を隔てられた複数のノブ３３を備えるのが好ましい 。これらのノブは、容器１４の内部と大気条件との間を連通させることができる ように、蓋の頂壁の底面と係合するようになっている。更に、間隔を隔てられた ノブ３３は、容器内の流体の気化速度を更に制御された状態に置く。更に、間隔 を隔てられたノブ３３は、カバーの下側上で凝縮が起こったときに液体の表面張 力により、カバーを取り外すときにハンガーがカバーに（つつくことがないよう にする隙間を提供する。

好ましくは、フランジ２０は容器の中央に向かって半径方向内方に延び、ハンガ ー側壁２６は、容器の側壁１８から間隔を隔てられたフランジ２０の位置から延 び、ハンガー側壁２６を容器の側壁１８から間隔を隔てる。好ましい実施例では 、フランジ２０の下向きの離間壁３４は段壁３０から内方に延び、ハンガー側壁 ２６はこの下向きの離間壁３４の内縁部から延びている。

ハンガー側壁２６は、好ましくは、ハンガー１２を容器１４から取り外さなくて も容器１４の底に例えばピペットを介して近づくことができるようにする側！開 口部３６を有する。側壁開口部３６は、好ましくは、ハンガー側壁の周りに対称 に配置されている。これらの側壁開口部３６は補足的なものであり、容器の底に 更に近づき易（するため、組み合わせ開口部３８におけるようにフランジ開口部 ３２と間延であるのがよい。

ハンガー１２は、容器１４内でのハンガー１２の位置決め又は芯出しを助けるフ ィン４０を有するのがよい。フィン４０は、段壁３０からハンガー側壁２６の外 側面の一部に沿って下方に延び、ハンガーの円筒形底部分の前で終端する。フィ ン４０は、容器１４の頂層面２２に当接しているのがよ（、ハンガーヲ容器１４ 内に配置し、芯出しするための案内体として作用する。フィン４０は、比較的薄 いため、吸い上げに適した表面を提供しない。

ハンガー側壁２６の底は、バンカー１２のほぼ円筒形の底部分２４と隣接してい る。底部分２４は、保持要素１０と摩擦嵌めするようになっている。この摩擦嵌 めは、ハンガー１２及び保持要素１０で形成された組繊成長室１９内に配置され た組織又は細胞を容器内の培地４４と直接接触しないように隔絶することができ る漏れのない嵌合である。中空円筒形底部分２４は、開放しているのがよ（、或 いは以下に更に詳細に説明するように膜でカバーされているのがよい。

ハンガー１２は、ハンガー側壁２６と底部分２４との接合点に近接して円筒形底 部分２４に配置された環状肩止め４６を有するのがよい。肩止め４６は、保持要 素１０とハンガー１２の底部分２４との間の入れ子係合を制限し、固定的な漏れ 止め摩擦嵌合が達成されたとき、これを表示する。更に、肩止め４６は、ハンガ ー１２上での保持要素１０の位置決めを装置同志について標準化する。

第１図及び第２図の保持要素１０は、環状底面５０を構成する中空円筒形側壁４ ８を有する。組織成長膜５２が環状面５０に取り付けられている。組織成長膜５ ２は、細胞又は組織を容器内の培地と直接接触しないように実質的に隔絶された 状態で支持できると同時に、少なくとも選択された材料がこれを通過して細胞と 接触できるようにする任意の材料で形成されているのがよい。このような材料に は、多孔質不活性フィルム、水和ゲル、スクリーン上に支持されたゲルのような 層をなした組み合わせが含まれる。代表的には、成長膜５２は多孔質の施条膜で あり、ヒートシール、溶剤接着、又は、膜の性質又は膜上の細胞の成長に悪影響 を及ぼさない任意の池の方法で環状面５０に取り付けることができる。

好ましくは、保持要素１０は、側壁４８の頂部の周囲の周りに延びる把持フラン ジ５４を有する。このフランジ５４は、保持要素の取扱いを容易にする把持部分 を構成する。このフランツは、更に、Ｏ−リング用の密封面を提供することによ って、以下に詳細に説明する装置と同様の流れ装置等で保持要素１０をハンガー １２とは別に使用できるようにする。

使用に際しては、細胞又は組織の試料４２を成長膜５２の上面上に配置する。

次いで、培地を容器１４に入れる。この培地の高さは、成長膜５２の下面が培地 と接触するが、培地が側壁開口部３６を越えて流入し、成長膜５２の上面と直接 接触する高さよりも低い。実施される特定の試験又は実験に応じて、開放した成 長室１９に同じ又は異なる培地を加え、細胞又は組織の試料４２ど直接接触させ る。同様に、開放した成長室１９に培地が実質的になくてもよい。試験材料は、 容器１４内の培地又は成長室１９内の培地のいずれかに随意に加えることができ る。容器内の培地並びに容器内の試験材料は、成長膜５２を通した拡散にのみに よって細胞又は組織の試料と接触する。

容器内の培地は、ハンガーを容器から取り外さな（ても変えることができ又は維 持することができる。十分な培養の後、装置を容器１４から取り外し、保持要素 １０をハンガー１２から取り外すことによって、細胞又は組織の試料４２を検査 し、又は取り扱うことができる。

培養装置を容器内に位置決めしたとき、蓋は培養袋！を容器内で所定位置に保持 するのに役立つ。従って、組立体は溶液中で浮動せず、段付きフランジを着座し ていない状態にすることがない。成長膜５２を容器の底壁５６の１ｍａ＋上方に 位置決めするのが一般に行われているけれども、所望であれば、／％ンガーの大 きさを調節するか或いは更に大きい深さを持つ容器を選択するかのいずれかを行 うことによって、成長膜５２と容器１４の底壁５６との間に追加の空間を形成す るのがよい。

本発明の他の実施例では、保持要素はハンガーから吊り下がっている。このハン ガーは、好ましくは、第３図及び第４図に示すようなハンガーである。この実施 例では、ハンガー１１２及び保持要素１１０は、実質的に、入れ子式の軽量中空 円筒体として形成され、保持要素１１０の大きさはハンガー１１２の中空内に位 置決めされるような大きさである。

この実施例のハンガー１１２は、第１図及び第２図の実施例に関連して説明した フランジとほぼ同様の段付きフランジ１１４を有する。このフランジは、容器１ ４の頂層面１１８と係合するためのハンガー壁１１６、及びハンガーを容器１４ 内で位置決めしハンガーが容器内で横方向に移動しないようにするための段壁１ ２０を宵する。段付きフランジ〕１４は、円筒形ハンガー側壁１２４が取り付け られた離間壁１２２を更に有する。円筒形ノλンガー側壁１２４は、フランジの 離間壁１２２の内縁部から下方に延び、か（して容器１４の側壁から間隔を隔て られている。

ハンガー側！１２４はほぼ円筒形である。ハンガー側壁１２４の頂部分の周りに は開口部１２６が等間隔に間隔を隔てられている。これらの開口部１２６はほぼ 矩形形状であり、好ましくは、フランジ１１４の離間壁１２２内に少な（とも部 分的に延び、これによって、容器１４内の培地へ近づ（ことができるようにする 。これらの開口部は、第１図及び第２図に示すように、段付きフランジを完全に 貫通しているのがよいということは容易に理解されよう。

各開口部１２６の部分は、三つの壁、即ち、互いにほぼ平行に延び且つハンガー 側壁１２４に沿ってほぼ下方に延びる二つの側壁１２８及びこれらの二つの側壁 を連結する底壁１３０によって構成される。底壁１３０は、保持要素１１０がハ ンガー１１２のハンガー側壁１２４内に嵌まり且つこのハンガー側壁から吊り下 げられるように、保持要素１１０の突出部と相互係合するための座として作用す る。

ハンガー１１２は、更に、フィン１３２及びノブ１３３を有し、これらは第１図 及び第２図に関して説明したのとほぼ同様に構成されている。

円筒形ハンガー側壁１２４の底端は環状底縁部１３４を構成する。膜１３６がこ の縁部に取り付けられてカップ状ハンガーを構成する。この場合、カップ状ハン ガーが構成する内部空間は容器内の培地から隔絶されている（第４図参照）。

変形例では、ハンガー１１２の底縁部１３４には膜が取り付けられておらず、ハ ンガー側壁１２４が構成する内部空間は、この場合、容器内の培地から隔絶され ていない。

更に、保持要素１１０は、はぼ円筒形であり、ハンガー１１２の内部に実質的に 嵌まるような大きさ及び形状にされている。突出部１３８は、保持要素１１０の 外面の頂部に向かって配置され、外方に突出している。これらの突出部１３８は 、保持要素１１０がハンガー１１２から吊り下げられるように開口部１２６の底 壁１３０と相互係合するように構成されている。突出部１３８は、上述の周囲フ ランジ１１４と同様である。突出部は、開口部１２６の底壁１３０と係合するた めの突出部ハンガー９１４０を有する。突出部の段！１４２は、突出部ハンガー 壁１４０の内縁部から下方に且つ、突出部ハンガー壁１４０にほぼ垂直に延びる 。突出部の段壁１４２は、ハンガー側壁１２４の内面内に僅かな遊びを伴って嵌 まるような大きさになっている。これによって、保持要素１１０はハンガー内に 正確に位置決めされ、ハンガー内で横方向に自由に移動しない。突出部離間壁１ ４４が突出部段壁１４２から横方向内方に延びる。保持要素１１０の円筒形側壁 １４６は、突出部離間壁１４４の内縁部から下方に延び、突出部離間壁１４４に よってハンガー側壁１２４から間隔を隔てられている。好ましい実施例では、離 間壁１４４は、保持要素１１０の側壁１４６の外面の頂部の周りを完全に延びて いる。

保持要素１１０の側壁１４６は、環状底縁部１４８で終端する。成長膜１５０は 、保持要素１０と関連して上述したように、この環状底縁部１４８に取り付けら れている。

第４図に示すように、ハンガー１１２に設けられた成長膜１３６と保持要素１１ ０に設けられた成長膜１５０とを組み合わせることによって、これらの膜間に二 膜室１５２をつ（りだす。このような構成は、種々の関係で有用である。例えば 、細胞又は組織の第１の試料を二膜室１５２内に配置し、細胞又は組織の第２の 試料を細胞又は組織の第１の試料から成長膜１５０で分離された状態で成長膜１ ５０の上面上に配置するのがよい。次に、一方の組織試料の他方の組織試料から の分離の効果を説明する。他の用途は当業者には明らかであろう。

今日、培養された細胞における薬物及び栄養物の細胞間輸送を研究するための流 れ装置が開発されている。細胞の単層が多孔質膜面上で培養されている。細胞の この単層は、循環する培地の２つの流路間に障壁として配置できる。この場合薬 物のような分子が一方の流路に導入され、薬物又は薬物によって刺激された細胞 の生成物の存在が他方の流路で計測される。

このような流れ装置の一つを第５Ａ図及び第５Ｂ図に示す。第５Ａ図は、流れセ ルの一方の半部の斜視図であり、第５Ｂ図は流れセルの他方の半部の断面図であ る。流れセル装置は、はぼ矩形のブロックの形状の第１ユニツト１６０（第５Ａ 図参照）を有する。第１ユニツト１６０は、はぼＵ字形状の流路１６２を有する 。０２／ＣＯ２人ロ１６４が第１ユニツトの側壁を通して設けられ、Ｕ字形状流 路］６２の一方の側と連通ずる。段付き円筒形開口部が第】ユニ、ト１６０の反 対側の側壁を貫通し、Ｕ字形状の流路１６２の他方の側と連通ずる。更に、複数 のビン受入れ開口部１６８が第１ユニツトの段付き円筒形開口部１６６と同じ側 に配置さねている。

第２ユニツト１７２は第２ユニツトが開口部１６８に嵌まるビン１７０を支持し ていることを除けば、第１ユニツト１６０と鏡像対称に形成されている。容易に 理解されるように、第１ユニツトと第２ユニツトとを整合させ且つビン１７０を 開口部】６８に嵌めることによって面と面とを向き合わせた関係にしたとき、段 付き円筒形開口部１６６が嵌まり合って、環状幅広部分が流路の中央に配！され た円筒形流路を形成する。この環状幅広部分は、本発明の保持要素１０のフラン ジを捕捉するのに使用できる。この構成を第６図に概略に示す。第６図では、保 持要素１０の保持フランジ５４は、流路の環状幅広部分１７４内で一対の０−リ ング１７６間に密封をなして捕捉された状態で示しである。この構成により、第 １ユニｙト１６０のＵ字形状流路１６２を通って流れる培地は第２ユニツト１７ ２のＵ字形状流路１６２を通って流れる培地と保持要素１０の成長膜の表面上に 支持された細胞を通してのみ連通する。

更に、本発明は、細胞又は組織を維持するための装！に関し、この装置は、各容 器１４に配置された上述の組織又は細胞の成長装置を有するクラスタ皿１６を含 む。クラスタ皿１６は、１９８５年１月２日付けの米国特許第４．　４９．５． 　２８９号に記載されたトレー１５４に取り付けられた複数の容器１４を有する 。この特許に触れたことによりその特許に開示されている内容は本明細書に組み 入れたものとする。クラスタ皿１６のトレー１５４は、カバー（図示せず）を更 に有する。

好ましくは、全ての構成要素は透明なポリスチレンである同じ材料から成形され ている。これらの構成要素は、当該技術分野で周知の方法を使用して成形される 。

第７図及び第８図に示す本発明の別の実施例では、保持要素１０は摩擦嵌めてハ ンガー２１２に取り外し自在に固定されている。この実施例では、保持要素１０ は、第１図及び第２図に示す保持要素と実質的に同じである。王な相違点は、二 つの実施例のハンガーの円筒形底部分の幅が異なっているということである。

この相違により、保持要素１０をハンガー２１２に第１図及び第２図に示す配向 とは逆の配向で固定することができる。保持要素１０をハンガー２１２内に位置 決めするため、保持要素１０及びハンガー２１２は入れ子式になった嵌まり合う 部分を有し、ハンガー２１２の入れ子式の部分の中空は、保持要素１０の入れ子 式の部分内に位置決めされるような大きさになっている。保持要素１０及びハン ガー２１２が互いに係合して漏れ止め嵌合を形成すると、ハンガー２１２の底部 分２２４及び保持要素１０で構成された内部組織成長室２１９が形成される。

ハンガ一部材２１２は、ハンガ一部材１２と同様に、全体に漏斗形状であり、幅 広の円錐形頂部分及び幅狭のほぼ円筒形の底部分とを有する。頂部分は、半径方 向に延びる周囲フランジ２２０で包囲されている。このフランジ２２０は、容器 １４の頂部面２２と係合するように構成されている。フランジ２２０及び底部分 ２２４は、直径が頂部から底部まで減少する円錐形の側壁２２６によって接合さ れ、これによって、ハンガー２１２の底部分２２４を容器１４の側壁１８から間 隔を隔てる。

ハンガー２１２の頂部の周りを延びるフランジ２２０は環状であり、好ましくは 、段が付いており、これによって、ハンガー２１２と容器１４とが僅がな遊びで ぴったりと嵌合する。ハンガー２１２は、容器内に正確に位置決めされ、容器内 での横方向移動について自由でない。フランジ２２０の下面は、その最外縁部に 沿ってハンガー壁２２８によって画成されている。ハンガー壁２２８は、容器１ ４の頂部面２２上に載止するように容器１４の開口の内径よりも大きい外径を有 する。環状段壁２３０がハンガー壁２２８からほぼ垂直方向下方に延びる。段壁 ２３０の外径は、容器１４を画成する側壁２１８の内径よりも僅かに小さい。

この構成により、ハンガーは容器１４内の中央に正確に位置決めされ、ハンガー ２１２が容器１４に関して横方向に移動しないようにされる。

フランジ２２０は、ハンガー２１２の全周に亘って延びていてもよいし、好まし くは、周囲の一部のみ、例えば約２／３に亘って延びているのがよく、これによ って、容器１４の床にほぼ垂直な方向から容器１４に直接近づくことができるよ うにするためのフランツ開口部２３２が提供される。フランジにこの開口部がな い場合には、フランジは、このように垂直方向から近づくことを妨げる。

フラン）２２０の上面は、好ましくは、間隔を隔てられた複数のノブ２３３を有 し、これらのノブは、容器１４の内部と大気条件との間を連通させることができ るように、■の頂壁の底面と係合するようになっている。更に、間隔を隔てられ たノブ２３３は、容器内の流体の気化速度を更に制御された状態に置く。

好ましくは、フランジ２２０は容器の中央に向かって半径方向内方に延び、ハン ガー側壁２２６は、容器の側壁１８から間隔を隔てられた２ランジ２２０の位置 から延び、ハンガー側壁２２６を容器の側壁１８から間隔を隔てる。フランジ２ ２０の下向きの離間壁２３４は段壁２３０から内方に延びている。ハンガー側壁 ２２６はこの下向きの離間壁２３４の内縁部から底部分２２４まで内方及び下方 に延びている。

ハンガー側壁２２６は、好ましくは、ハンガー２１２を容器１４から取り外さな くても容器１４の底に例えばピペットを介して近づくことができるようにする側 壁開口部２３６を有する。側壁開口部２３６は、ハンガー側壁の周りに対称に配 置するのが好ましい。これらの側壁開口部２３６は補足的なものであり、容器の 底に更に近付き易（するため、組み合わせ開口部２３８におけるようにフランジ 開口部２３２と間延であるのがよい。

ハンガー２１２は、容器１４内でのハンガー２１２の位置決め又は芯出しを助け るフィン２４０を有するのがよい。フィン２４０は、段壁２３０からハンガー側 壁２２６の外側面の一部に沿って下方に延び、ハンガーの円筒形底部分の前で終 端する。フィン２４０は、容器１４の頂層面２２に当接しているのがよく、ハン ガーを容器１４内に配置し、芯出しするための案内体として作用する。フィン２ ４０は、比較的薄いため、吸い上げに適した表面を提供しない。

ハンガー側壁２２６の底は、ハンガー２１２のほぼ円筒形の底部分２２４と隣接 している。底部分２２４は、保持要素１０と摩擦嵌めするようになっている。

この実施例では、摩擦嵌めは、保持要素１０の底部分２４８をハンガー２１２の 底部分２２４の中空内に位置決めされるような大きさにすることによって行われ る。この摩擦嵌めは、ハンガー２１２及び保持要素１０で形成された組織成長室 ２１９内に配置された組織又は細胞の試料４２を容器内の培地４４と直接接触し ないよ・）に隔絶することができる漏れのない嵌合である。中空円筒形底部分２ ２４は、保持要素１０を受入れるため開放しているのがよい。

第１図及び第２図に示す実施例と関連して論じたハンガーの形状及び壁構造の変 更は本実施例にも適用できるということを理解すべきである。

第７図及び第８図の保持要素１０は、第１図及び第２図と関連して上文中に説明 したのと同じである。しかしながら、保持要素１０は、第７図及び第８図に示す 実施例におけるように、逆様の配向で使用される。

使用に際しては、細胞又は組織の試料４２を成長膜５２の上面上に配置するのが よい（第８図参照）。次いで、培地を容器１４に入れる。この培地の高さは、培 地が成長膜５２の下面と接触するが、好ましくは、側！開口部２３６を越えて培 地を流入させる量以下である。実施される特定の試験又は実験に応じて、開放し た成長室２１９に同じ又は異なる培地を加え、細胞又は組織の試料４２と直接接 触させる。同様に、開放した成長室２１９に培地が実質的になくてもよい。試験 材料は、容器１４内の培地又は成長室２１９内の培地のいずれかに随意に加える ことができる。容器内の培地並びに容器内の試験材料は、成長膜５２を通した拡 散にのみによって細胞又は組織の試料と接触する。容器内の培地は、ハンガーを 容器から取り外さな（でも変えることができ又は維持することができる。十分な 培養の後、装置を容器１４から取り外し、保持要素１０をハンガー２１２から取 り外すことによって、細胞又は組織の試料４２を検査し、又は取り扱うことがで きる。

本発明の一実施例では、保持要素１０は、先ず、最初にハンガー２１２で、次い でハンガー１２で、順次使用される。細胞の単層は、先ず最初に、ハンガー２１ ２とともに使用した場合に上方を向いた成長膜５２の表面上で成長される。最初 は、単層が未だ形成されておらず、保持要素の側壁４８内に捕捉された空気が膜 を通って散逸できるため、膜の下で蒸気閉塞が起こらない。単層が形成された後 、保持要素１０をハンガー２１２から取り外し、逆様にし、次いでハンガー１２ に摩擦嵌めする。次いで、細胞の単層を下に向け、これで上を向いた膜５２の反 対側の表面上で第２細胞層を成長させる。このようにして、種類の同じ又は異な る細胞又は組織を成長膜の各側止で培養する。装置をハンガー１２とともに使用 し、単層を先ず最初に膜上で成長させる場合には、装置を逆様にしハンガー２１ ２とともに使用するとき、蒸気閉塞が起こる可能性が非常に大きくなる。

以上の構成により、成長表面の何れかの側に配置された細胞間の連通を、培養し た細胞又は組織から放出される溶解可能な因子によって媒介されるものとして検 出し、研究することができる。更に、成長膜の孔径が非常に大きい場合には、細 胞突起が膜を貫通し、これによって成長表面のいずれかの側に配置された細胞間 の連通を、成長支持体を通って成長し細胞間接触をもたらす細胞突起によって媒 介されるものとして研究することができる。

成長膜５２の各側で成長する二つの細胞の種類に加え、第３の種類の細胞を標準 的な培養方法に従って容器１４内で培養することができる。この方法では、細胞 間連通を３細胞システムでの溶解可能な因子によって媒介されるものとして研究 することができる。

第９図に示すように、成長膜５３をハンガー１２に固定してもよい。）λシガー １２に成長膜５３を組み合わせ、保持要素１０に成長膜５２を組み合わせること によって、これらの二つの膜間に二膜室５５をつくりだす。第９図は、二膜室５ ５を更に明瞭に示すため、参照番号を最小にとどめである。しかしながら、ハン ガー１２及び保持要素１０の構成要素構造は、第１図及び第２図に示す構成要素 構造と同じである。このような構成は、第３図及び第４図と関連して上文中に説 明した種々の関係で有用である。当業者には他の用途が明らかである。

本発明の詳細な説明したが、当業者は、本発明の精神から逸脱することなく多く の変形を行うことができる。従って、本発明の範囲を図示し且つ説明した実施例 に限定しようとするものではない。むしろ、本発明の範囲は、添付の請求の範囲 及びその等個物によって決定される。

補正書の翻訳文提出書 （特許法第１８４条の８） 平成　５年　４月　２日ｊ１

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、側壁及び底部を持つ容器内に配置するための組織又は細胞の成長装置におい て、 少なくとも一部が容器内に容器の側壁又は底部と接触しないように配置されるよ うに構成されたハンガーと、 側壁及び成長表面を有する保持要素とを有し、該保持要素はハンガーに取り外し 自在に固定されている、組織又は細胞の成長装置。 ２．前記ハンガーはほぼ中空の円筒形部分及び周囲フランジを有し、該フランジ は、円筒形部分が容器内に容器の側壁又は底部と接触しないように位置決めされ るように、容器の周面と係合するように構成されている、請求項１に記載の組織 又は細胞の成長装置。 ３．前記ハンガーは、容器の周面と係合するように構成された周囲フランジを有 し、更に、フランジに取り付けられ且つフランジから延びる中空のほぼ円筒形の 側壁を有する、請求項１に記載の組織又は細胞の成長装置。 ４．前記ハンガーは、容器の周面と係合するように構成されたフランジを有し、 更に、フランジに取り付けられ且つフランジから延びる直径の減少する円錐形側 壁を有する、請求項１に記載の組織又は細胞の成長装置。 ５．前記ハンガーはほぼ漏斗形状である、請求項４に記載の組織又は細胞の成長 装置。 ６．前記周囲フランジは、装置が周囲フランジで容器内に支持されているとき、 容器の底部に近づけるようにする開口部を有する、請求項２に記載の組織又は細 胞の成長装置。 ７．前記保持要素はハンガーに摩擦嵌めで取り外し自在に固定されている、請求 項１に記載の組織又は細胞の成長装置。 ８．前記摩擦嵌めは、ハンガー及び保持要素のほぼ円筒形であるが僅かにテーパ した嵌まり合う表面によって行われる、請求項７に記載の組織又は細胞の成長装 置。 ９．前記ハンガー及び前記保持要素は、摩擦嵌めが漏れ止め接合部を構成するよ うに構成されている、請求項７に記載の組織又は細胞の成長装置。 １０．前記保持要素はハンガーに吊り下げ嵌めで取り外し自在に固定されている 、請求項１に記載の組織又は細胞の成長装置。 １１．前記吊り下げ嵌めは、保持要素に設けた突出部とハンガーの壁とを相互係 合することによって行われる、請求項１０に記載の組織文は細胞の成長装置。 １２．ハンガーは、容器内でのハンガーの案内性及び芯出し性を高めるためのフ ィンを有する、請求項１に記載の組織又は細胞の成長装置。 １３．ハンガーは、容器内でのハンガーの案内性及び芯出し性を高めるように構 成されたフィンを有する、請求項７に記載の組織又は細胞の成長装置。 １４．ハンガーは、容器内でのハンガーの案内性及び芯出し性を嵩めるように構 成されたフィンを有する、請求項１０に記載の組織又は細胞の成長装置。 １５．ハンガーに直接取り付けられた第２成長表面を更に有する、請求項１に記 載の組織又は細胞の成長装置。 １６．ハンガーに直接取り付けられた第２成長表面を更に有する、請求項７に記 載の組織又は細胞の成長装置。 １７．ハンガーに取り付けられた第２成長表面を更に有する、請求項１０に記載 の組織又は細胞の成長装置。 １８．保持要素は環状フランジを有する、請求項１に記載の組織又は細胞の成長 装置。 １９．保持要素は環状フランジを有する、請求項７に記載の組織又は細胞の成長 装置。 ２０．クラスタ皿の、側壁及び底部を有する容器内に配置するための、組織又は 細胞の成長装置において、 ハンガーを有し、このハンガーは、ハンガーの少なくとも一部が容器内に容器の 側壁又は底部と接触しないように配置された状態でハンガーを支持するための手 段を有し、更に、 側壁及び成長表面を含む保持要素と、 保持要素をハンガーに取り外し自在に固定する、ハンガー及び保持要素と関連し た手段とを有する、組織又は細胞の成長装置。 ２１．細胞又は組織を支持し、これらの細胞又は組織を成長中に保持するための 組織及び細胞の保持要素において、 底面を持つ中空円筒形側壁と、 底面に取り付けられ且つ底面に亘された膜と、円筒形側壁の周囲の周りを延びる フランジと、を有する組織及び細胞の保持要素。 ２２．組織又は細胞の成長装置において、頂部及び底部と、頂部から延びる段付 き周囲フランジと、底部で延びるほぼ円筒形の壁とを持つ、漏斗形状ハンガーを 有する、組織又は細胞の成長装置。 ２３．細胞又は組織を保持するのに有用な装置において、複数の容器がトレーに 取り付けられたクラスタ皿と、容器のうちの少なくとも一つに配置された、請求 項１に記載の組織又は細胞の成長装置とを有する、装置。 ２４．保持要素の円筒形嵌合表面がハンガーの円筒形嵌合表面上に嵌まっている 、請求項８に記載の組織又は細胞の成長装置。 ２５．ハンガーの円筒形嵌合表面が保持要素の円筒形嵌合表面上に嵌まっている 、請求項８に記載の組織又は細胞の成長装置。 ２６．細胞又は組織を成長支持体の二つの側上で成長させるための方法において 、ａ）成長表面を持つ保持要素を提供し、この保持要素を第１ハンガーに取り外 し自在に固定する工程と、 ｂ）細胞又は組織を成長支持体の第１の側で培養する工程と、ｃ）保持要素を前 記第１ハンガーから外す工程と、ｄ）保持要素を逆様にしてこれを第２ハンガー に取り付ける工程と、ｅ）細胞又は組織を成長支持体の第１の側で培養する工程 と、を有する方法。