JPH06501838A - 植物におけるフィターゼの発現 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔請求項１１〕　フイラー量をコードするＤＮＡ配列がフイラー量の組織特異的 発現を起こし得る調節配列に機能的に結合することを特徴とする発現構築物。

〔請求項１２〕　請求項１１記載の発現構築物を含むことを特徴とするベクター 。

〔請求項１３〕　請求項１２記載のベクターを含むことを特徴とする細菌。

〔請求項１４〕　植物または植物器官が該植物宿主中でフイラー量の発現を起こ し得る調節配列と機能的に結合するフィラー量コードＤＮＡ配列を含む発現構築 物を含むことを特徴とするトランスジェニック植物または植物器官。

〔請求項１５〕　請求項１乃至７のいずれか１項記載の方法で生産されるフイラ ー量をフィチン酸塩、を含む基質に作用させることを特徴とするフィチン酸塩の イノシトールおよび無機リン酸への変換方法。

〔請求項１６〕　飼料が請求項１乃至７のいずれか１項記載の方法で生産したフ イラー量を含むことを特徴とする動物の飼料組成物。

〔請求項１７〕　飼料が請求項１乃至７のいずれか１項記載の方法で生産したフ イラー量を含むトランスジェニック植物または植物器官を含むことを特徴とする 請求項１６記載の飼料組成物。

〔請求項１８〕　飼料を摂取した動物の成長増進に効果的な最の請求項１６記載 の飼料組成物を含む飼料で動物を飼育することを特徴とする動物の成長の増進方 法。

〔請求項１９〕　飼料中に含まれるフィチン酸塩をイノシトールおよび無機リン 酸塩に変換するのに有効な量の請求項１６記載の飼料組成物を含む飼料で動物を 飼育することを特徴とする動物排泄物中のフィチン酸レベルの減少方法。

〔請求項２０〕　フィチン酸塩の生産方法で、ａ）植物宿主中、多量のフイラー 量を発現しく辱る調節配列に機能的に結合するフィラー量コードＤＮＡ配列を含 む発現構築物で植物宿主をトランスホームし、植物組織中でフイラー量コードＤ ＮＡが発現される条件下で該トランスホーム植物を生育させること、および ｂ）該トランスジェニック植物組織からフイラーゼを抽出すること、 以上ａ）およびｂ）のステップを含む方法。

〔請求項２１〕　食品または飼料中の成分として請求項１乃至７および２１のい ずれか１項記載の方法で生産したフイラー量を使用すること。

明細書 植物におけるフイラー量の発現 （関連分野） 本発明は、トランスジェニック植物におけるフイラー量の産生および工業におけ る該フイラー量の使用に関する。

（関連技術） リンは、あらゆる生物の生育に必須の元素である。畜産においては、単胃動物（ 例えば、ブタ、家禽および魚）を良く生育させるために、飼料に無機リンを補わ なければならない。これに対し反別動物の飼料には無機リンを添加する必要はな い。ルーメン内に存在する微生物が、フィチン酸塩（ｍｙｏ−イノシトールヘキ サキス−ホスフェート）をイノシトールと無機リン酸塩に変換する酵素を生産す る。

フィチン酸は、植物に由来する全ての飼料物質中に貯蔵リンとして存在する（レ ヴユ−：　Ｐｈｙｔｉｃ　ａｃｉｄ、　ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　ａｎｄ　ａｐｐｌ ｉｃ一旦１ｏｎｓ、　Ｅ、グラフ（Ｇｒａｆ）　ｍ、　Ｐｉｌａｔｕｓ　Ｐｒｅ ｓｓ　；　帽ｎｎｅａｐｏ　ｌ　ｉｓ。

ＭＮ、　［１，Ｓ、　Ａ、　（１９８６）　）　、フィチン酸は、あらゆるナツ ツ、穀類、マメ類、種、胞子および花粉に１−３％含まれている。フィチン酸の 複合塩は、フィチンと呼ばれる。フィチン酸は、カルシウム、亜鉛、マグネシウ ム、鉄などのミネラルをキレートし、また蛋白質と反応して、蛋白質や栄養的に 重要なミネラルの利用を減少させることから、反栄養因子と考えられている。フ ィチン酸塩のリンは、単胃動物の胃腸を通過し、排泄される。フィチン酸塩は、 結腸でいくらか加水分解されるが、無機リンは、小腸でのみ吸収されることから このようにして放出される無機リンは栄養的な価値はない。結論として、飼料中 に存在していたとしても、単胃動物は、栄養的に重要なリンを使用できない。

フィチン酸塩のリンの排泄は、重大な問題を含んでいる。この千年、畜産は非常 に盛んになってきている。結果的に生産される排泄物の量は、それに応じて増加 しており、世界中のいろいろな所で環境問題を引き起こしている。これは、一部 は表面水中における排泄物由来のリン酸の蓄積によるもので、これが富栄養化を 起こしている。

フィチン酸塩をイノシトールと無機リン酸に変換する微生物由来の酵素は、フィ ツーゼとして広く知られている。フィラーゼ産生微生物には、枯草菌＜８ａｃｉ ｌｌｕｓ　５ｕｂｔｉｌｉｓ）　（Ｖ、　Ｋ、ペーパー（Ｐａｐｅｒ）およびＶ 、　Ｊ、ジャガナサン（Ｊａｇａｎｎａｔｈａｎ）　（１９８２）Ｊ、　Ｂａｃ ｔｅｒｉｏｌ、１５１．　１１０２＞および”ニードモナス（Ｐｓｅｕ−ｄｏｉ ｏｎａｓ）　（Ｄ、　Ｊ、コスグローブ（Ｃｏｓｇｒｏｖｅ）　（１９７０）　 Ａｕ５ｔｒａｌ。

Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｓｃｉ、２３．　１２０７＞などのバクテリア、サツカロミ セス　セレビシェ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）　（ Ｎ、　Ｒ，ナイーニ（）１ａｙｉｎｉ）およびＰ、　７−カキス（Ｍａｒｋａｋ ｉｓ）　（１９８４）Ｌｅｂｉｎｓｍｉｔｔｅｌ　Ｗｉｓｓｅｎｓｃｈａｆｔ　 ｕｎｄ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅ　１７．　２４）などのイーストおよびアスベ ルギラス　テレウス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ｔｅｒｒｅｉｓ）（Ｋ、ヤマダ （Ｙａｍａｄａ）、　Ｙ、ミノダ（Ｍｉｎｏｄａ）およびＳ、ヤマモト　（Ｙａ ｍａｍｏｔｏ）　（１９８６）　Ａｇｒｉｃ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、３　２．　 １　２　７　５）などの菌類が含まれる。その他のアスベルギラス（Ａｓｐｅｒ ｇｉｌｌｕｓ）種でもいろいろなものがフィツーゼを生産していることが知られ ており、その中でも、アスベルギラス　フィカム＜Ａｓｐｅｒｇ百Ｉｕｓｆ　１ ｃｕｕｎ＋）によって生産されるフィツーゼは、他の微生物によって生産される フイラーゼよりも熱安定性が高いことと同時に、比活性がもっとも高いものの一 つであることが分かった（ファンゴルコム（ｖａｎ　Ｇｏｒｃｏｍ）等（１９９ １）ヨーロッパ特許出願８９２０２４３６゜５、刊行番号０４２０３５８．１９ ８９年９月２７日登録）。

また、フイラーゼは、多くの植物の内部に存在する（ローワス（Ｌｏｅｗｕｓ） 、　Ｆ、Ａ、（１９９０）　Ｐｌａｎｔ　Ｂｉｏｌｏｇｙ　ｖｏｌ、　９　：　 “植物中のイノシトール代謝”　（Ｋ、　Ｊ、モア（Ｍｏｒｒｅ）、　１１．　 Ｆ、ボス（［］ｏｓｓ）。

Ｐ、　Ａ、Ｏ−ワス（Ｌｏｅｗｕｓ）編）１３）、ゲラトリー（Ｇｅｌ　Ｉａｔ ｌｙ）。

Ｋ、　Ｓ、およびＬ／　７　ｘブレ（Ｌｅｆｅｂｖｒｅ）、　Ｄ、　Ｄ、（（１ ９９０）　ＰｌａｎｔＰｈｙｓｉｏｌｏｇｙ　（増補）、９３．　アブストラク ト５６２）は、じゃがいもの塊茎由来のフイラーゼｃＤＮＡクローンの単離およ び特性について報告している。ギプソン（Ｇｉｂｓｏｎ）、口０Ｍ０等およびク リステン（［”ｈｒｉｓｔｅｎ）、　Ａ、　Ａ、等（（１９８８）　Ｊ、　Ｃｅ １ｌ　Ｂｉｏｃｔｕｓ、。

１２Ｃ，アブストラクトＬ４０７およびＬ４０２）は、大豆の種の発芽の際の内 在性フィツーゼの合成について報告している。しかし、植物性フイラーゼは、通 常工業的な用途に使用するには生産量が不十分である。

単胃動物の資料に微生物性フイラーゼを添加するという考え方は、以前からある （ウェア（Ｗａｒｅ）、　Ｊ、　Ｈ，、ブラック（Ｂｌｕｆｆ）。

し、およびシェ（Ｓｈｉｅｈ）、　Ｔ、　Ｒ，（１９６７）米国特許第３．２９ ７゜５４８：ネルソン（Ｎｅｌｓｏｎ）、　Ｔ、　Ｓ、、シ５−（Ｓｈｉｅｈ） 、　Ｔ、　Ｒ，、ウォジンスキー（Ｗｏｄｚｉｎｓｋｉ）、　Ｒ，Ｊ、およびウ ェア（ｆｌａｒｅ）、　Ｊ、　Ｈ。

（１９７１）Ｊ、Ｎｕｔｒｉｔｉｏｎ　１０１．１２８９）、　しかし、今日ま でこの酵素の生産コストが高いという理由から、この考えの応用は、商業的にう まくいっていない（Ｙ、　１１．ハン（Ｈａｎ）　（１９８９）ＡｎｉＬＩＩａ ｌ　Ｆｅｅｄ　Ｓｃｉ、　ａｎｄ　Ｔｅｃｈｎｏｌ、２４．　３４５）　ｏ経済 的理由から、今でも無機リンが単胃動物の飼料に添加されている。

フィツーゼには、他の工業的用途がある。その例には、とうもろこしや小麦等の 穀類から澱粉を生産する工業的プロセスに使用することが挙げられる。このよう な湿式製粉プロセスから得られるコーングルテン等を含む廃棄産物が、動物飼料 として売られている。浸せきプロセスの際に、フィツーゼを補うことが出来る。

その条件（Ｔ＝５０℃およびｐＨ＝５．５＞は、菌類フイラーゼに理想的なもの である（ヨーロッパ特許出願０３２１００４アルコ社）。

都合がよいことに、このプロセスの廃棄産物に由来する動物飼料にはフィチン酸 塩の代わりにリン酸塩を含む。

また、フィツーゼは、大豆処理にも使用できると考えられてきた（アルコ社製フ ィナーセ（Ｆｉｎａｓｅ”）　、フィンランド、ラジセマキ、アルコ社から刊行 されている製品情報パンフレット参照）。

大豆食には、この蛋白質源をベビーフードや魚、牛および他の反部動物用の飼料 への使用に適さないものにする高レベルの反栄養因子フィターセが含まれている 。この高蛋白質源の酵素的変換で、この原料の栄養的および商業的価値が増加す る。

高価な蛋白質の生産システムとしてトランスジェニック植物を使用が提唱された 。今日までの例としては、タバコにおけるインターフ、ロン（グンドマン（Ｇｏ ｏｄ＋ｎａｎ）、　Ｒ，Ｍ、、クノーフ（にｎａｕｆ）。

Ｖ、Ｃ，、コーン　（Ｈｏｕｃｋ）、　Ｃ，Ｍ、およびコマイ　（Ｃｏｍａｉ） 、　Ｌ、（１９８７）ＰＣＴ／１１１０８７１００８６５）、タバコ、ブラシカ 　ナブス（［ｔｒａｓｓｉｃａ　ｎａｐｕｓ）およびアラビドンス　サリアナ（ Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ　ｔｈａｌｉａｎａ＞におけるエンカファリン（バンプ カークホープ（Ｖａｎｄｅｋｅｒｃｋｈｏｖｅ）、　Ｊ、。

ファンダメ　（Ｖａｎ　Ｄａｍｍｅｄ、　Ｊ、、ファンリセベテンス（Ｖａｎ　 Ｌｉｊｓｅｂ−ｅｔｔｅｎｓ）、　Ｍ、、ボタ−マン（Ｂｏｔｔｅｒｍａｎ）、 　Ｊ、、デブロック（ＤｅＢｌｏｃｋ）。

組、デクラーク　（ＤｅＣＩｅｒｑ）、　Ａ、、リーマンス（Ｌｅｅｍａｎｓ） 、　Ｊ、ファンモンターギュ（Ｖａｎ　Ｍｏｎｔａｇｕ）、　Ｍ、およびフレバ ース（Ｋｒｅｂｂｅｒｓ）　。

Ｅ、　（１９８９）　Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏ１．７．　９２９）　、タバコにお ける抗体くハイアット（Ｆｌｉａｔｔ）、　Ａ、、カフアキ−（Ｃａｆｆｅｒｋ ｅｙ）、　Ｒ，およびボーディツシュ（Ｂｏｅｄｉｓｈ）、　Ｋ、　（１９９０ ）　Ｎａｔｕｒｅ３４２．　７６）およびタバコおよびポテトにおけるヒト血清 アルブミン（シモンズ（Ｓｉｊｍｏｎｓ）、　Ｐ、Ｃ，、デフカー（［１ｅｋｋ ｅｒ）、　Ｂ、　＠、　Ｍ、、シラメイヤ（Ｓｃｈｒａｍｍｅｒｊｅｒ）　、　 Ｂ、、バーワード（Ｖｅｒｗｏｅｒｄ）、　Ｔ、　Ｃ，、７ｙンデンエルセ７　 （ｖａｎ　ｄｅｎε１ｚｅｎ）、　Ｐ、　Ｊ、　Ｍ、およびホーケマ（Ｈｏｅｋ ｅｍａ）、　Ａ、　（１９９０）　Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏ１．８．　２１７）の 生産がある。

実際に、多くの植物種、特に双子葉植物種（例えば、タバコ、ポテト、トマト、 ペチュニア（Ｐｅｔｕｎ　ｉａ）、　ブラシカ（Ｂｒａｓｓｉｃａ））のトラン スホーメーンヨンは、当分野においてルーチンになっている（クリ−（Ｋｌｅｅ ）、　Ｊ、、ホーシｘ　（Ｈｏｒｓｃｈ）、　Ｒ，＃よびロジャース（Ｒｏｇｅ ｒｓ）、　Ｓ、　（１９８７）　Ａｎｎｕ、　Ｒｅｖ、　Ｐｌａｎｔ　Ｐｈｙｓ ｉｏｌ。

３８．４６７＋ガサ−（Ｇａｓｓｅｒ）、　Ｃ，Ｓ、およびフレーリー（Ｐｒａ ｌｅｙ）。

Ｒ，Ｔ、（１９８９）　５ｃｉｅｎｃｅ　２４４．　１２９３）　、植物におい て外来遺伝子を発現させる方策は、確立されている（ガサ−（Ｇａｓｓ−ｅｒ） およびフレー’Ｊ　（Ｆｒａｌｅｙ）、上述）。植物および植物細胞内で機能的 に発現されえるキメラ遺伝子の構築に用いられる植物遺伝子由来の調節遺伝子が 同定されている。

この遺伝子構築物の植物への導入のために、アグロバクテリウム　ツメファシェ ンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）またはアグロバ クテリウム　リゾゲネス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｒｈｉｚｏｇｅｎｅｓ ）を用いたトランスホーメーンヨンなど幾つかの方法が使用できる。この方策を 用いて、幅広い植物組織が使われてきたが、その選択は、その植物種や組織培養 の容易さに依存する。うまくいった例には、プロトプラスト、ミクロスポア、ま たは花粉および葉、茎、根、胚軸および子葉等のイクスプラントのトランスホー メーションがある。さらに、マイクロインジェクション、エレクトロポレーショ ン、粒子衝突および直接的ＤＮＡ取り込み等、プロトプラストや植物細胞または 組織への直接的ＤＮＡ導入が使用される（ガサ−（Ｇａｓｓｅｒ）およびフレー リー（Ｆｒａｌｅｙ）　、上述）。

種々の発現システムを用いて、植物中で蛋白質を生産し得る。

例えば、カリフラワー　モザイク　ウィルス（ＣａＭＶ）の３５５プロモーター 等の構成的プロモーターを用いると、トランスジェニック植物の全ての器官中に 発現した蛋白質が蓄積される（ギリー（Ｇｕｉｌｌｅｙ）、　Ｈ，、ダドリー（ Ｄｕｄｌｅｙ）、　Ｒ，Ｋ、、　ジョナード　（Ｊａｎ−ａｒｄ）、　Ｇ、、バ ラズ（Ｂａｌａｚｓ）、　Ｅ、およびリチャード（Ｒｉｃｈａｒｄｓ）、　Ｋ。

Ｅ、（１９８２）Ｃｅｌｌ　３０，７６３）　。それとは別に、非常に組織特異 的でステージ特異的に発現される蛋白質をコードする遺伝子、即ち、標的組織で のみ、かつ、分化の所定の段階でのみ発現される遺伝子（ヒギンズ（旧ｇｇｉｎ ｓ）、　Ｔ、　Ｊ、　Ｖ、、（１９８４）Ａｎｎｕ、Ｒｅｖ、Ｐｌａｎｔ　Ｐｈ ｙｓｉｏｌ、３５．　１９１　；ショー／トウエル（Ｓｈｏｔｗｅｌｌ）、　Ｍ 、　Ａ、およびラーキンス（Ｌａｒｋｉｎｓ　９．　ｂ、　ａ。

（１９８９）　“植物の生化学”ｖｏｌ、１５（アカデミツクプレス、サンディ エゴ：スタ７７　（Ｓｔａｍｐｆ）、　Ｐ、　Ｋ、およびコン（Ｃｏｎｎ）、Ｅ 。

Ｅ、、編）由来のプロモーターも使用しえる。

フィツーゼ生産の経済的方法は、とりわけ動物飼料工業に有益であると考えられ る。より経済的にフィツーゼを生産する方法は、組み換えＤＭＡ技術を用いて、 例えば動物が直接摂取するための動物飼料に添加しえるフィツーゼを発現できる トランスジェニック植物または植物器官を生成するものとなるであろう。それと は別に、これらのトランスジェニック植物または植物器官で発現されるフィツー ゼを抽出し、場合によっては、所望される用途に合うように精製することが出来 る。

（本発明の概要） 本発明は、トランスジェニック植物または植物器官におけるフィツーゼの発現お よびこれらの植物の生産方法を提供する。この事は、フィツーゼ活性を有する蛋 白質をコードするＤＮＡ配列を含む発現構築物を植物に導入することによって行 われる。

本発明により提供される植物のトランスホーメーションを目的としたＤＮＡ発現 構築物は、フィツーゼの発現を指示しえる調節配列のコントロール下にある。こ れらの調節配列は、その植物またはその一部分を使用するかに存在して、構成的 または段階的および、または組織特異的に、植物における転写を指示しえる配列 も含む。

本発明により提供されるトランスジェニック植物および植物器官は、例えば動物 飼料に直接使用する様式で、工業プロセスに使用することもできるし、また、そ こから発現したフィツーゼを抽出したり、場合によっては精製することもできる 。

（図面の簡単な説明） 第１図　フィツーゼｃＤＮＡのクローニングの方法。

第２図　フィツーゼｃＤＮＡフラグメントの翻訳領域のヌクレオチド配列および 誘導されるフィツーゼ蛋白質のアミノ酸配列。

成熟フィツーゼ蛋白質の開始は＋１で示されている。

第３図　バイナリ−ベクターｐＭＯＧ２３゜第４図　クローニングに使用するオ リゴヌクレオチド二本鎖。

第５図　プラスミドｐＭＯＧ２９゜植物中での構成的発現を目的とした発現カセ ットおよびタバコシグナルペプチドを含むプラスミドｐＵＣ１８゜ 第６図　フィツーゼからの無機リンの放出に関するフィツーゼ含有種子粉砕物の 添加の効果。

第７図　インビトロ消化モデルにおけるアスペルギラス（Ａｓｐｅ−ｒｇｉｌｌ ｕｓ）フィツーゼの投与一応答関係。

第８図　インビトロ消化モデルにおけるアスベルギラス（Ａｓｐｅ−ｒｇｉｌｌ ｕｓ）フィツーゼおよびタバコ種子に含まれるフィツーゼの投与一応答関係。

（発明の詳細な説明） 本発明に従い、フィツーゼを生産するトランスジエニ・ツク植物または植物器官 が得られる。この事は、フィツーゼ活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡ配列 を含む発現構築物の植物への導入で行われる。

本発明により、フィツーゼをコードする遺伝子による植物の安定なトランスホー メーションを目的としたＤＮＡ発現構築物が提供される。これらの構築物は、フ ィツーゼの発現を指示しつる調節配列と機能的に結合したフィツーゼをコードす るＤＮＡ遺伝子を含む。また、これらの調節配列には、その植物またはその一部 分を使用するかに従って、構成的に、または段階的および、または組織特異的に 植物中での転写を指令しえる配列も含む。

本発明で提供される発現構築物は、選択された植物宿主のノくクチリア依存のト ランスホーメーションで使用するベクター、好ましくはプラスミドに挿入しえる 。さらに、この発現構築物はその植物の宿主のゲノムに組み込まれることが好ま しい。

本発明の範囲において、フィツーゼという言葉は、種々のＩＩＩｙ〇−イノシト ールリン酸塩から無機リンを放出する反応を触媒する一連の酵素が含まれる。こ の事は、フィツーゼ活性を有する全ての蛋白質が含まれると理解される。

フィツーゼをコードするＤＮＡ配列は、微生物、植物または動物など種々の生物 から得ることが出来る。このＤＮＡ配列は、繊維状菌類アスベルギラス（Ａｓｐ ｅｒｇｉｌｌｕｓ）等の微生物から得ることが望ましい。更に、このＤＮＡは、 アスペルギラス　フイカム（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ｆｉｃｕｕｍ）　、アス ベルギラス　ニガー（Ａｓｐｅｒｇ　ｉ　Ｉ　ｌｕｓ旧ｇｅｒ）、アスペルギラ ス　アワモリ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ａｗａｍｏｒｉ）およびアスペルギラ ス　ニズランス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ｎ１ｄｕｌａｎｓ）から得ることが 望ましい。

フィツーゼ蛋白質をコードする遺伝子またはｃＤＮＡのクロ・−ニングは、種々 方法で行いえる。一つの方法は、フィツーゼ蛋白質の精製、Ｎ−末端および幾つ かのアミノ酸配列の決定、およびそのアミノ酸配列に基づくオリゴヌクレオチド プローブを用いたフィツーゼ産生生物のゲノムまたはｃＤＮＡライブラリーのス クリーニングを含むものである。

もし、少なくともその遺伝子の部分的配列が分かっているなら、この情報を用い てポリメレースチェーンリアクション（ＰＣＲ）等によりそれに対応するｃＤＮ Ａをクローン化することが出来る（ＰＣＲ技術：原則およびＤＮＡ増幅への応用 、（１９８９）ＨｏＡ、７−リツヒ（［１ｈｒｌｉｃｈ）編、ストックトンプレ ス、ニューヨーク）。

上述のクローン化したフィツーゼ遺伝子は、他の微生物からのフィツーゼコード 遺伝子の単離を目的とした異種ハイブリダゼーション実験に使用しえる。

別の特徴として、上述のクローン化フィターゼ遺伝子は、第二世代フィツーゼの 構築の原料として使用しえる。第二世代フィツーゼとは、突然変異誘発（例えば 、部位特異的突然変異誘発）で変化し野生型のフィツーゼまたは本発明により生 成された組み換えフィツーゼとは異なる性質を有するフィツーゼである。例えば 、至適濃度またはｐＨ１比活性または基質親和性を所定の過程に使用するのによ り適したものになるように変えることが出来る。

フィツーゼをコードするｃＤＮＡを単離すれば、例えば、プロモーター、分泌シ グナル、またはそれらの組み合わせたもののような調節要素の交換などの組み換 えＤＮＡ技術を使用して、選択された植物宿主におけるフィツーゼの生産を指令 しえる発現構築物を構築できる。

フィツーゼは、このトランスジェニック植物において、分化のあらゆる段階で構 成的に生産される。この酵素は、植物または植物の器官の使用に依存して、例え ば、塊茎形勢または果実分化の際など、段階特異的に発現しえる。また、その使 用に依存して、この酵素は、たとえば、果実、塊茎、葉または種子など植物器官 内に組織特異的に発現される。

本発明の範囲のトランスジェニック植物には、所望の植物または植物器官内のフ ィツーゼ生産の開始や増加を起こすように組み換えＤＮＡ技術により遺伝適の修 正された植物（外植物の一部および細胞も同様に）およびそれらの子孫も含まれ る。

本発明において、フィツーゼの増加という語句は、同量の未修正植物組織に見ら れる平均的フィツーゼ酵素量と比較して統計的に有意に増加したフィツーゼを含 む統計的に有意な量の植物組織を示す。

本発明において、選択される植物には、カリフラワー（Ｂｒａｓｓｉ−ｃａ　ｏ ｌｅｒａｃｅａ）およびチョウセンアザミ　（Ｃｙｎａｒａ　ｓｃｏｌｙｍｕｓ ）のような食用孔、リンゴ（Ｍａｌｕｓ、例えばｄｏｍｅｓｔ　１ｃｕｓ）、バ ナナ（Ｍｕｓａ。

例えばａｃｕｍｉｎａｔａ）、べり−（スグリ等、Ｒｉｂｅｓ、例えばｒｕｂｒ ｕｍ）。

チェリー（スイートチェリー等、Ｐｒｕｎｕｓ、例えばａｖｉｕｍ）　、　キュ ウリ　（Ｃｕｃｕｍｉｓ、例えば５ａｔｉｖｕｓ）、ブドウ（Ｖｉｔｉｓ、例え ばｖｉｎｉｆ−ｅｒａ）、レモン（Ｃｔｒｕｓ　Ｉｉｍｏｎ）、メロン（Ｃｕｃ ｕｍｉｓ　ｍｅｌｏ）、ナツツ（ウオールナツツ等、Ｊｕｇｌａｎｓ、例えばｒ ｅｇｉａ　；ビーナツツ、Ａｒａｃｈｉｓｈｙｐｏｇｅａｅ）　、オレンジ（Ｃ ｉＬｒｕｓ、例えばｍａｘｉｍａ）、ビーチ（Ｐｒｕｎｕｓ。

例えばｐｅｒｓ＋ｃａ）、す’、ｙ　（Ｐｙｒａ、例えばｃｏｍｍｕｎ　ｉｓ） 　、プラム（Ｐｒｕｎｕｓ。

例えばｄｏｍｅｓｔ　１ｃａ）、ストロベリー（Ｆｒａｇａｒ　ｉａ、例えばｍ ｏｓｃｈａｔａ）。

トマト　（Ｌｙｃｏｐｅｒｓ　１ｃｏｎ、例えばｅｓｃｕｌｅｎｔｕｍ）、アル ファルスア（Ｍｅｄ　ｉｃａｇｏ、例えば５ａｔｉｖａ）、キャベツ（例えばＢ ｒａｓｓｉｃａ　ｏｌｅｒａｃ−ｅａ）、エンジブ（ＣＩｃｈａｒｅｕｍ、例え ばｅｎｄｉｖｉａ）、リーク（ＡＩＩｉｕａ＋。

例えばｐｏｒｒｕｍ）、レタス（Ｌａｃｔｕｃａ、例えば５ａｔｉｖａ）、はう れん草（Ｓｐ　１ｎａｃ　ｉａ、例えばｏ　Ｉｅｒａｃｅａｅ）　、タバコ（Ｎ 　１ｃｏｔ　Ｉａｎａ、例えばｔａｂａｃｕｉ）等の葉、アロールート（Ｍａｒ ａｎｔａ、例えばａｒｕｎｄｉｎａｃｅａ）。

ビート＜Ｂｅｔａ、例えばｖｕｌｇａｒｉｓ）、　エンジブ（Ｄａｕｃｕｓ、例 えばｃ　ａｒｏｔａ）、キャラサバ（Ｍａｎｉｈｏｔ、例えばｅｓｃｕ　Ｉｅｎ ｔａ）　、ターニップ（Ｂｒａｓｓｉｃａ、例えばｒａｐａ）、ラディッシュ（ Ｒａｐｈａｎｕｓ、例えば５ａｔｉｖｕｓ）、ヤム（Ｄ　１ｏｓｃｏｒｅａ、例 えばｅｓｃｕｌｅｎｔａ）、スィートポテト（Ｉｐｏｍｏｅａ　ｂａｔａｔａｓ ）等の根およびビーン（Ｐｈａｓｅｏｌｕｓ、例えばｖｕ　Ｉｇａｒ　ｉｓ）　 、ビー（Ｐｉｓｕｍ、例えばａｓｔｉｖｕａ＋）、大豆（Ｇｌｙｃｉｎ、例えば ｗａｘ）、小麦（Ｔｒ　ｉｔ　ｉｃｕｍ、例えばａｅｓｔｉｖｕｌ）、大麦（） ｆｏｒｄａｔ＋Ｉ１１゜例えばｖｕｌｇａｒｅ）、コーン（Ｚｅａ、例えば５ａ ｙｓ）　、米（Ｏｒｙｚａ、例えば５ａｔｉｖａ）、レープシード（８ｒａｓｓ ｉｃａ　ｎａｐｕｓン、ミレット（Ｐａｎｉｃｔｎｗし、）、ひまわり　（Ｈｅ ｌｉａｎｔｈｕｓ　ａｎｎｕｓ）、オーツ（Ａｖｅｎａ　５ａｔｉｖａ＞等の種 子、コールラビ（［１ｒａｓｓ　ｉｃａ、例えばｏｌｅｒａｃｅａｅ）、ジャガ イモ（Ｓｏｌａｎｕｍ、例えばｔｕｂｅｒｏｓｕｍ）等の塊茎が含まれるが、こ れらの限られるわけではない。

基本的に、植物種の選択は、その植物またはその一部のトランスホーメーション の容易性により決定する。

フィツーゼコードＤＮＡ配列を含む発現構築物の標的植物への導入法には幾つか ある。これらの方法には、カルシウム／ポリエチレングリコール法、エレクトロ ポレーションおよびマイクロインジェクションまたは（コート化）粒子衝突（ボ トリカス（Ｐｏｔｒ−ｙｋｕｓ）、　１．　（１９９０）　Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎ ｏ１．８．　５３５＞等を用いたプロトプラストのトランスホーメーションが含 まれる。

これらのいわゆる直接的ＤＮＡ　ｌ−ランスホーメーション法に加えて、ウィル スベクター（たとえば、カリフラワーモザイクウィルス（ＣａＭＶ）　）および バクテリアベクター（例えば、アグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕ ｍ）属）（ボトリクス（Ｐｏｔｒｙｋｕｓ）　、上述）等のベクターを含むトラ ンスホーメーションシステムが広＜使ワれている。選択および、またはスクリー ニングの後、トランスホームしたプロトプラスト、細胞または植物の一部分を当 分野でよく知られている方法を用いて完全な植物体に再生する（ホーシュ（）Ｉ ｏｒｓｃｈ）、　Ｒ，Ｂ、、フライ（Ｆｒｙ）、　Ｊ、　Ｅ、、ホフマン（ｔｌ ｏｆ　ｆｍａｎｎ）。

Ｎ、Ｌ、、アイクホルツ（Ｅｉｃｈｈｏｌｔｚ）、　Ｑ、、ｏジャース（Ｒｏｇ ｅｒｓ）　。

Ｓ、　Ｇ、およびフレーリー（Ｆｒａｌｅｙ）、　Ｒ，Ｔ、（１９８５）　５ｃ ｉｅｎｃｅ２２７．１２２９＞。トランスホーメーンヨンおよび、または再生の 方法の種類は、本発明に本質的ではない。

双子葉植物の場合、本発明の好ましい１様では、バイナリ−ベクターシステムを 使用する（ホーケマ（Ｈｏｅｋｅｍａ）　、＾、　バーシュ（旧ｒｓｃｈ）、　 Ｐ、　Ｒ，ホイカース（Ｈｏｏｙｋａａｓ）、　Ｐ、　Ｊ、　Ｊ、およびシルパ ルート（Ｓｃｈｉｌｐｅｒｏｏｒｔ）、　Ｒ，Ａ、（１９８３）　Ｎａｔｕｒｅ 　３０３゜１７９；シルバルート（Ｓｃｈｉｌｐｅｒｏｏｒｔ）、　Ｒ，Ａ、、 ホーケア　（Ｈｏｅｋ−ｅｍａ）、　Ａ、およびホイカース（Ｈｏｏｙｋａａｓ ）、　Ｐ、　Ｊ、　Ｊ、　（１９８４）ヨーロッパ特許出１ｆｉＮｎ　０１２０ ５１６）。このシステムでは、毒性遺伝子を含むｖｉｒプラスミドおよび転移す べき遺伝子構築物を含む適合プラスミドを有するアグロバクテリウム（Ａｇｒｏ ｂａｃｔｅｒｉｕａ＋）を使用する。このベクターは、大腸菌およびアグロバク テリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒ　ｉｕａ＋）の両方で複製でき、かつ、本発明 に関係ない詳細な修正を行えるバイナリ−ベクターＢ１ｎ１９　（ビーパン（Ｂ ｅｖａｎ）。

Ｌ　（１９８４）　Ｎｕｃｌ、　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、１２．　８７１１）から 誘導される。本実施例で使用されているように、このバイナリ−ベクターには、 Ｔ−ＤＮＡの左−および右−境界配列のあいだに、カナマイシン耐性をコードす るＮＰＴＩＩ−遺伝子（ビーパン（３ｅｖａｎ）上述）および必要とされる遺伝 子構築物をクローニングするための多重クローニング部位がある。

単子葉穀物のトランスホーメーションおよび再生は、標準的方法ではない。しか し、最近の科学の進歩は、原則的に、単子葉植物はトランスホームしやすく、か つ、トランスジェニック植物は、トランスホーム細胞から再生しえることを示し た。遺伝子物質の植物への導入に関する強力な方法とともに、これらの穀物の再 生産可能な組織培養システムの発展が、トランスホーメーションを容易にした。

現在、単子葉植物のトランスホーメーション法の選択には、植物片または懸濁細 胞のマイクロプロジェクタイルボンバードメントおよびプロトプラストの直接的 ＤＮＡ取り込み、またはエレクトロポレーションがある。例えば、トランスジェ ニック稲植物は、選択マーカーとして、ハイグロマイシン耐性をコードするバク テリアｈｐｈ遺伝子を用いてうまく得ることが出来る。

この遺伝子は、エレクトロポレーションにより導入する（シマモト　（Ｓｈｉｍ ａｍｏｔｏ）、　Ｋ、、　テラダ（Ｔｅｒａｄａ）、　Ｒ，、イザワ（ｌｚａｗ ａ）、　Ｔ。

およびフジモト（Ｆｕｊｉｌｌｏｔｏ）、　Ｈ，（１９８９）　Ｎａｔｕｒｅ　 ３３８゜２７４）。トランスジェニックトウモロコシは、微粒子衝突によりトウ モロコシ懸濁培養物の胚細胞に、（除草剤ホスフィノスリシンヲ不活性化する酵 素）ホスフィノスリシン　アセチルトスンスフエラーゼをコードするストレプト ミセス　バイグロスコピカス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｈｙｇｒｏｓｃｏｐ ｉｃｕｓ）　ｂａｒ遺伝子を導入することによって得られる（ゴートンカム（Ｇ ｏｒｄｏｎ−にａｉｍ）、　１１．Ｊ、、　スヘ：／１（Ｓｐｅｎｃｅｒ）、　 Ｔ、　Ｍ、、　？７ガノ（Ｍａｎｇａｎｏ）、　Ｍ、　Ｌ、、アダムス（Ａｄａ ｍｓ）、　Ｔ、Ｒ，、デイネス（口ａｅｎｅｓ）、　Ｒ，Ｊ、、スター）　（Ｓ ｔａｒｔ）。

１１、Ｇ、、オブライエン（口’　０ｒｉｅｎｔ、　ｊ、　Ｖ、、チャンパース （Ｃｈａｍｂｅｒｓ）。

Ｓ、　Ａ、、アダムス（Ａｄａｍｓ）　Ｊｒ、　、　Ｒ，Ｗ、、コーシュ（Ｋａ ｒｓｃｈ）、　Ａ。

Ｐ、およびレモークス（Ｌｅｍａｕｘ）、　Ｐ、　Ｇ、（１９９０）　Ｔｈｅ　 ＰｌａｎｔＣｅｌｌ　２．　６０３）。小麦や大麦などのその他の単子葉穀物の アルローンプロトプラストへの遺伝子物質の導入も、報告されている（リー（Ｌ ｅｅ）、　Ｂ、、？−ドック（Ｍｕｒｄｏｃｈ）、　Ｋ、、Ｌｙピング（Ｔｏｐ ｐｉｎｇ）、Ｊ、、フレイス（Ｋｒｅｉｓ）、　Ｍ、およびジョーンズ（Ｊｏｎ ｅｓ）。

Ｍ、　Ｇ、に、　（１９８９）　Ｐｌａｎｔ　Ｍｏ１．　Ｂｉｏｌ、１３．　２ １）、小麦は、胚懸濁培養を行うための成熟した緻密でこぶのある胚形成カルス 組織を選択することによって、胚懸濁培養物から再生する（バシル（Ｖａｓｉｌ ）、　Ｖ、、レドウエイ（Ｒｅｄｗａｙ）、　Ｆ、およびバンル（Ｖａｓｉｌ） 。

１、　Ｋ、（Ｌ　９９０）　Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏ１．８．　４２９＞　、この 穀物に対して幾つかのトランスホーメーションシステムを組み合わせて用いるこ とは、本発明の単子葉植物への応用を可能にする。また、これらの方法は、双子 葉植物のトランスホーメーションおよび再生にも適用しえる。

このフィツーゼ構築物の発現には、組み替えＤＮＡ技術の分野でよく知られてい る植物ポリメラーゼによる遺伝子の転写やｍＲＮＡの翻訳などの詳細な事項が含 まれる。本発明の理解に関連する事項のみを以下に説明する。

本発明では、フィツーゼの発現を起こすことが知られている調節配列を用いてい る。使用する調節配列の選択は、所望する標的穀物および、または標的器官に依 存する。このような調節配列は植物体または植物ウィルスから得ることが出来る し、また、化学的に合成することもできる。このように調節配列には、植物また は植物の一部分の使用に依存して、構成的にまたは段階的および、または組織特 異的に植物における転写を指令するプロモーターがある。これらのプロモーター には、これらに限られるわけではないが、カリフラワーモザイクウィルス（Ｃａ ＭＶ）の３５３プロモーター等の構成的発現を示すプロモーター（ギ’）　−（ Ｇｕｉｌｌｅｙ）等、（１９８２）Ｃｅｌｌ　３０．７６３）、ノブロース　ビ スホスフェートカルボキシラーゼスモールサブユニット遺伝子のプロモーターな どの葉特異的なもの（コルジ（Ｃｏｒｕｚｚｉ）等、（１９８４）ＥＭＢＯＪ、 ３．　（１６７１）、グルタミンシンテース遺伝子由来のプロモーターなどの板 枠異的発現に関するもの（チンゲイ（ＴｉｎｇｔｌＪ＞等、　（１９８７）ｌｉ ＭＢＯＪ、、６．３５６５＞、ブラシカ　カルス（Ｂｒａｓｓｉｃａ　ｎａｐｕ ｓ）由来のクルジフェリンＡプロモーターなどの種子特異的発現に関するもの（ ライアン（Ｒｙａｎ）等、（１９８９）Ｎｕｃｌ、　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、　１ ７．　３５８４）　、ポテトのクラス−■バタチンプロモーター等の塊茎特異的 発現に関するもの（ロカーソサまたは、トマトのポリガラクトウロナーゼ（ＰＣ ）プロモーターなどの果実特異的発現に関するもの（バード（Ｂｉｒｄ）等、（ １９８８）Ｐｌａｎｔ　Ｍｏ１．Ｂｉｏｌ、１１．　６５１）などがある。

ターミネータ−やポリアゾニレ−ジョンシグナル等その他の調節配列には、植物 中でそのような機能を果たすものが含まれ、その選択は当業者によって行いえる 。このような配列の例には、アグロバクテリウム、゛ンメ７７シエンス（Ａｇｒ ｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｔｕｍｅｆａｃｉ−ｅｎｓ）のツバリンシンテース（ｎ ｏｓ）遺伝子の３゛隣接領域がある（ビーパン（Ｂｅｖａｎ）、　Ｍ、、上述） 。

また、調節配列には、ＣａＭＶの３５３プロモーターに見られるエンハンサ−配 列、アルファルファモザイクウィルス（ＡＩＭＶ）　ＲＮＡ４のリーダー配列な どのｍＲＮＡ安定化配列（ブレブロード（Ｂｒｅｄｅｒｏｄｅ）、　Ｆ、　Ｔ、 、ｒパーワルトフ（Ｋｏｐｅｒ−Ｚｗａｒｔｈｏｆｆ）、　Ｅ、Ｃ。

およびポル（Ｂｏｌ）、　Ｊ、　Ｆ、　（１９８０）　Ｎｕｃｌ、　Ａｃ１ｄｓ 　Ｒｅｓ、　８．２２１３＞または、同様の機能を果たすその他の配列が含まれ る。

フィツーゼは、発現された蛋白質の安定性が保証される環境に発現されなければ ならない。本発明においてフィツーゼの生物物理学的パラメーターに依存して、 細胞質ゾル、小胞体、液胞、プロティンボディー、または細胞周辺腔等の細胞部 分を選択することでそのような安定した環境を作ることが出来る。このようなパ ラメータには、至適ｐＨ、プロテアーゼに対する感受性または所望される細胞部 分のモル濃度に対する感受性などが含まれる。

この細胞の細胞質で発現させるためには、発現される酵素は分泌シグナルペプチ ドまたはその他の標的配列を含むべきではない。

葉緑体およびミトコンドリアでの発現のためには、発現される酵素はこれらのオ ルガネラに移行させるための特異的ないわゆるトランジットペプチドを含むべき である。この事を行うための、目的の酵素に結合しつる標的配列は、良く知られ ている（スミーケンズ（Ｓｍｅｅｋｅｎｓ）等、（１９９０）　Ｔ、　ｌ、　Ｂ 、　Ｓ、　１５．７３；ファンデンブルーク（ｖａｎ　ｄｅｎ　Ｂｒｏｅｃｋ） 等、（１９８５）　Ｎａｔｕｒｅなら、この酵素を液胞に送る特異的標的配列と 同時に、分泌シグナル配列が存在しなければならない（タグ−（Ｔａｇｕｅ）等 、（１９８８）Ｐｌａｎｔ　Ｐｈｙｓ、８６．　５０６）　ｏ種子におけるプロ ティンボディーについても同じことが言える。目的の酵素をコードするＤＮＡ配 列は、この酵素が細胞中の所望される位置で作用できるように、修正されなけれ ばならない。

フィツーゼの細胞外発現を行うために、本発明の発現構築物は分泌シグナル配列 を使用する。植物宿主と同種（天然）のシグナル配列が望ましいが、異種配列、 すなわち、他の植物種または微生物起源のものも同様に使用できる。このような シグナル配列は当分野でよく知られている。本発明で使用しえる適当なシグナル 配列は報告されている。ウォルタ−（Ｗａｉｔｅｒ）、　Ｐ、およびプロベル（ Ｂｌｏｂｅｌ）、　Ｇ、　（１９８６）　Ｂｉｏｃｈｅｍ、Ｓｏｃ、　Ｓｙｍｐ 、＋　４７．１８３　；ホンハイ：／　（Ｖｏｎ　Ｈｅ１ｊｎｅ）、　Ｇ、（１ ９８６）　Ｊ、Ｍｏ１．　Ｂｉｏｌ、。

１８９．２３９；およびシモンズ（Ｓｉｊｍｏｎｓ）、　Ｐ、Ｃ，、デツカ−（ Ｄｅｋｋｅｒ）、　Ｂ、　Ｌ　Ｍ、、シュラメイア−（Ｓｃｈｒａｍｍｅｉｊｅ ｒ）、　Ｂ、、バーワード（Ｖｅｒｗｏｅｒｄ）、　Ｔ、　Ｃ，、ファンデンエ ルゼン（ｖａｎ　ｄｅｎ　Ｅｌｚ−ｅｎ）、　Ｐ、　Ｊ、　Ｍ、およびホーケ？ （Ｈｏｅｋｅｍａ）、　Ａ、（１９９０）Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌ、、８．　２ １７゜本発明の関連するＤＮＡ構築物のあらゆる部分（プロモーター、調節、分 泌、安定化、ターゲツティング、またはターミネーション配列）は、望ましいな ら当分野でよく知られている方法を用いてそれらのコントロール特性を変えるこ とができる。

本発明を用いて得られるフィツーゼを含む植物用いて、より高レベルのフィツー ゼを有する植物または植物器官を得ることが出来ることが指摘される。例えば、 ソモクローナル変化技術または交配技術により、このような植物または植物器官 を得ることが出来る。これらの技術は当分野でよく知られている。

本発明の態様においては、アスペルギラス　フィカム（Ａｓｌｌｌｅｒｇ−ｉｌ ｌｕｓ　ｆｉｃｕｕｍ）から単離したｍＲＮＡからフィツーゼをコードする二重 鎖ｃＤＮＡを調製する。このＤ　Ｎ、　Ａ構築物は、ブラシカナブス（Ｂｒａｓ ｓｉｃａ　ｎａｐｕｓ）由来の１２５貯蔵蛋白質をコードする遺伝子の調節配列 のコントロール下に置く。それからこの構築物をｐＭＯＧ２３　（大腸菌に−１ ２ＤＨ５α中、１９９０年１月２９日オランダ、バーン、セントラルプリューボ アシメルカルチャーズに受理番号ＣＢ５１０２．９０で登録された）等のバイナ リ−ベクターにサブクローニングした。このベクターをジスアームドＴｉプラス ミドを含むアグロバクテリウム　ツメファシェンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕ ｍ　ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）に導入する。この構築物を含むバクテリア細胞を タバコまたはブラシカ（３ｒａｓｓ　１ｃａ）植物由来の組織と共培養し、そし て、トランスホームした植物細胞を抗生物質を含む栄養培地で選択してから、誘 導してこのような培地で分化した植物に再生する。生成した植物は、このＤＮＡ 構築物を発現する種子を生産する。

本発明の別の態様においては、このフィラーゼコードＤＮＡ１ｉ築物は、カリフ ラワーモザイクウィルス（ＣａＭＶ）の３５３プロモーター由来の調節配列のコ ントロール下に置く。その後、このベクターをジスアームドＴｉプラスミドを含 むアグロバクテリウムツメファシェンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕ＋＋＋　ｔ ｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）に導入する。この構築物を含むバクテリア細胞をタバコ またはブラシカ（Ｂｒａｓｓｉｃ−ａ）植物由来の組織と共培養し、そして、ト ランスホームした植物細胞を抗生物質を含む栄養培地で選択してから、誘導して このような培地で分化した植物に再生する。生成した植物は、構成的にこのＤＮ Ａを含み、これを発現する。

フィラーゼ活性は、多くの検定法で測定できるが、その選択は、本発明にとって 重要ではない。例えば、トランスジェニック植物組織のフィラーゼ酵素活性は、 比色技術やゲル検定法を用いたＥＬＩＳＡ検定法、ウェスタンブロッティング、 または直接的酵素検定法で試験する。

本発明で生産されるフィツーゼを含む植物または植物器官は、フィツーゼの作用 を必要とする種々の工業的プロセスで使用しえる。このような応用の例には、非 反栃動物の飼料添加物、大豆処理、またはフィチン酸塩からのイノシトールまた はイノシトールホスフェートの生産がある。その他には、澱粉工業や醸造工業の ような醗酵工業のようなフィチン酸塩を含む基質を用いる工業プロセスがある。

フィチン酸塩による金属イオンのキレート化は、これらのミネラルを生産微生物 に使用できなくしてしまう。フィチン酸塩の酵素的加水分解は、この問題を回避 する。

また、植物中で生産されるフィツーゼは、トウモロコシやサトウモロコシの穀粒 の浸せき処理に使用しえる。この植物組織は、浸せきトウモロコンに添加する前 に粉砕する。植物組織から放出されたフィツーゼは、多くのトウモロコシ調製物 に存在するフィチンに作用する。浸せきコーン中のフィチンの分解は、動物飼料 や微生物醗酵の栄養として使用されるコーン浸せき液の商品価値を高くする。さ らに、フィチンの分解は、コーン浸せき液の濃縮、輸送および貯蔵の際のフィル ター、バイブ、反応容器などのゴミの蓄積に関する問題を回避できる（パーラ（ Ｖａａｒａ）、　Ｔ、等、（１９８９）ヨーロッパ特許出願０３２１００４＞。

また、フィツーゼの作用は、コーン湿式粉砕における浸せき過程および分離過程 を促進する。

この植物または植物器官は、直接すなわちさらに処理することなく使用できるか 、または、まず使用する前に望ましい固さにまで粉砕するような従来取られてい る処理を行うこともある。

これとは別に、このフイラーゼを、この植物または植物器官から抽出したり、ま た、望ましい場合は使用する前に従来の抽出法や精製法で精製することもある。

意図した応用にかなう植物中でのフイラーゼの生産は、非常に便利であり、また 、たとえば動物飼料などに経済的に使用できる点で、微生物フイラーゼに比べて 生産コストを押さえることが出来、事実上、無機リン酸と争えるほどのコストバ ーホーマンスを得ることが出来る。さらに、排泄物中のリン含量をかなり低く出 来るというメリットがある。

無機リンとコストを争えるフイラーゼの使用は、高品質の飼料を生産する混合飼 料工業の自由度を増すと考えられる。例えば、飼料にフィツーゼを補う場合、無 機リンの添加を省略することが出来るし、また、フィチン酸を含む種々の物質の 含量を増やすことが出来る。

以下の実施例は、本発明の完全な公開およびその内容の製造法および使用法の説 明を当業者を対象にして示したものであり、本発明の範囲を制限するものではな い。使用している数値（例えば、量、温度、ｐＨ）は、正確を期するよう配慮し たが、ある程度の実験誤差やばらつきを考慮しなければならない。特記しないか ぎり、温度は、℃で表し、また、圧力は、大気圧付近である。

（実施例１） アスペルギラス　フィカム（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ｆｉｃｕｕｍ＞からのポ リＡ”　ＲＮＡ０単離 ２２．７２　ｇ／　ｉ！　）ウモロコシ粉（ｐＨ７，８５℃で１５分間アミラー ゼ処理したもの）、９．３６ｇ／Ｉｌグルコース、２．９　ｇ／　ｊ！　ＫＮＯ −。

０．１４２ｇ／ｊｉ！　ＫＣｌ、　０．１４２　ｇ／ｌ　Ｍｇ５Ｏ，・７Ｈ２０ および５６．８■／１ＦｅＳＯ・７Ｈ２０を含む培地中でアスベルギラス　フィ カム（Ａｓｐｅｒｇｉ−１１ｕｓ　ｆｉｃｕｕｍ）Ｎ　ＲＲＬ　３１３５株を培 養する。６日後、その菌糸体を収穫する。

感想菌糸体（０，５ｇ＞を液体窒素で凍結し、粉砕する。つづいて、オー７　Ｌ ／　−（Ａｕｆｆｒａｙ＞およびロージャン（Ｒｏｕｇｅｏｎ）　（１９８０） 物質をウルトラッラックス（１分間、最高速度）を用い、３ＭＬｉＣ１，６Ｍ尿 素中、０℃で、ホモジナイズし、ついで、４℃で、−晩装置する。全細胞ＲＮＡ は、１６０００Ｘｇの遠心と、フェノール：クロロホルム：イソアミルアルコー ル（５０：４８：２）による二回の抽出で得られる。このＲＮＡをエタノールで 沈殿させ、ｌｌ１ｌｌの１０ｍＭ）リス−ＨＣ１（ｐｔ１７．４　）　、０．５ ％ＳＤＳに溶解する。ポＩＪＡ”選択のため、全ＲＮＡサンプルを６５℃で５分 間加熱し、０．５　ＭＮａＣ！ｌに調製してから、オリゴ（ｄ　Ｔ）−セルロー スカラムにかける。１０ｍＭ）リスｐｌＩ７．　Ｏ１１＋ＭＥＤＴＡおよび０． １ｍＭ　ＮａＣ１を含む溶液で、数回洗浄した後、■Ｏｆｆ１ＭトリスｐＨ７， ０および１ｍＭＥＤＴＡで溶出する事によりボＩＪ　Ａ″ＲＮＡを回収した。

（実施例２） フィツーゼをコードするｃＤＮＡの調製およびクローニングｃＤＮＡの第−鎮合 成のために、実施例１にしたがって単離した５μｇのポＵ　Ａ″ＲＮＡを１６． ５μｌの水に溶解し、以下の成分を添加した：　２．５　ｔｔｌ　ＲＮａｓｉｎ 　（３０Ｕ／１ｔｌ）　、ｌ　Ｏｔｔｌの５０ｍＭ）すｘ−Ｈｌ　ｐＨ７，６， ６ｍＭＭｇＣＬおよび４０ｍＭＫＣＡ’を含むバッファ、２μｉ！（１）ＩＭＫ Ｃｊ！、５μｆのｏ、Ｉ　ＭＤＴＴＳ　０．５Ａｌｌのオリゴ（ｄＴ）　＋２− ＋ｅ　（２，５ｍｇ／ｍｌ　、５μＪの８　ｍ　Ｍ　ｄＮＴＰ−ミックス、５ｔ ｔｌのＢＳＡ　（１ｍｇ／＋ｎ１）および２．５ｔ、ｔｌのモロニーＭＬＶ逆転 写酵素（２００Ｕ／μｌ）。この混合物を３７℃で、３０分間インキュベートし 、反応を、１０μｌの０．２Ｍ　ＥＤＴＡおよび５０μｌのＨ，０を添加して停 止する。　１１０μｌのクロロホルムを用いて抽出を行い、５分間遠心したのち 、上清に５　Ｍ　ＮＨ，Ａｃおよび４４０μｊ！エタノール（−２０℃）を添加 する。ドライアイス／エタノール溶液中３０分間かけて沈殿化を行う。遠心後（ ０℃、１０分間）　、ｃＤＮＡ／ｍＲＮＡぺレフトを、７０％エタノールで洗浄 する。ベレット乾燥後、２０μｌの水に溶解する。

フィターゼをコードするｃＤＮＡは、二つのフラグメントとして、ポリメレース チェーンリアクション（ＰＣＲ）で単離する。

これらの二つの７ラグメントをこの遺伝子内のＢａ１８１部位を用いて、結合し 、完全な長さのｃＤＮＡを得る。フイターゼｃＤＮＡのクローニング法を第１図 に示す。

フィターゼ遺伝子の部分的シーケンシングは（ファンゴルコム（Ｖａｎ　Ｇｏｒ ｏｍ）等、上述）、開始コドンから約８００塩基対のところのＢａｎＨ１部位の 存在を示している。フイターゼ遺伝子の開始コドンの前のヌクレオチド配列およ び終止コドンの後のヌクレオチド配列同様、この１３ａｍ８１部位付近のヌクレ オチド配列を用し）でＰＣＲ用のオリゴヌクレオチドを設計した。

第−鎮合成の反応産物および０．５μｇの各オリゴヌクレオチドを含む１，５μ βの溶液を用い、Ｔａｑ−ポリメラーゼの製造元（シータス）の（旨示１こした がい、ポリメレースチェーンリアクションを行う。増幅は、パーキンエルマー／ ンータスのＤＮＡ増幅器で行う。９４℃、２分間、５５℃、２分間、７２℃、３ 分間の２５サイクル後、この反応物にフェノールおよびクロロホルム抽出による 脱蛋白質処理を行う。このＤＮＡを沈殿させ、１０ｍＭＩＪス、ＰＨ７および０ ．１ｍＭＥＤＴＡを含むバンファに溶解してから、適当な制限酵素で消化する。

この蛋白質のＮ−末端部分をコードするフラグメントを増幅するために、以下の 二つのオリゴヌクレオチドを使用する：オリゴ１　：　５　’　ＧＧＧＴＡＧＡ ＡＴＴＣＡＡＡＡＡＴＧＧＧＣＧＴＣＴＣＴＧＣＴＧＴＴＣＴＡ　３’オリゴ２ ・５　’　ＡＧＴＧＡＣＧＡＡＴＴＣＧＴＧＣＴＧＧＴＧＧＡＧＡＴＧＧＴＧＴ ＣＧ　３’増幅したフラグメントを、ＥｃｏＲＩて消化し、ｐＴＺ１８Ｒ（ファ ルマシアから購入）のＥｃｏＲ１部位にクローン化する。制限地図およびヌクレ オチドシーケンシングは、このフラグメントの正当性を示している。このプラス ミドをｐＧＢ９２５と命名する。

第二の７ラグメントを増幅するために、以下の二つのオリゴヌクレオチドを使用 する： オリゴ３　：　５　’　ＧＡＧＣＡＣＣＡＡＧＣＴＧＡＡＧＧＡＴＣＣ３’オリ ゴ４　：　５　’　ＡＡＡＣＴＧＣＡＧＧＣＧＴＴＧＡＧＴＧＴＧＡＴＴＧＴＴ ＴＡＡＡＧＧＧ　３’増幅したフラグメントをＢａｎ＋ＨＩおよびＰｓｔｌで消 化し、予めＢａｉ＋ＨＩおよびＰｓｔＩで消化したｐＴＺ１８Ｒにクローン化す る。

制限地図およびヌクレオチドシーケンシングは、このフラグメントが正しいもの であることを示している。このプラスミドをｐＧ８９２６と命名する。

完全な長さのｃＤＮＡを単離するために、ｐＧＢ９２５をＥｃ。

ＲＩおよび１３ａｍＨＩで消化し、フィターゼコードＤＮＡを含むフラグメント を単離する。このフラグメントを予めＥｃｏＲＩおよびＢａａ＋ＨＩで消化した プラスミドｐＧＢ９２６にクローン化し、プラスミドｐＧＢ９２７とする。プラ スミドｐＧＢ９２７は、１．８ｋｂｐという適当な長さで、フィターゼをコード する完全な長さのｃＤＮＡを含む。フィターゼ蛋白質をコードするｃＤＮＡ領域 の配列および誘導されるフィターゼ蛋白質のアミノ酸配列を第２図に示す。

（実施例３） バイナリ−ベクターｐＭＯＧ２３の構築本実施例では、バイナリ−ベクターｐＭ ＯＧ２３　（大腸菌に−１２ＤＨ５α中、１９９０年１月２９日受理番号ＣＢ　 ３１０２．９０で、セントラルプリューボアンメルカルチャーズに登録）の構築 について説明する。

このバイナリ−ベクターｐＭＯＧ２３　（３１！２図）は、ベクターＢ１ｎ１９ （ビーパン（Ｂｅｖａｎ）、　Ｍ、、上述）の誘導体である。ｐＭＯＧ２３を得 るために、分子生物学の分野でよく使われている方法を用いて、本発明に影響し ないようにベクターＢ１ｎ１９を修正する。

まず、レフトボーダー（ＬＢ）とライトボーダー（ＲＢ）の位置をネオマイシン ホスホトランスフエラーセ遺伝子ｎ（ＮＰＲＩＩ遺伝子）に関して交換する。第 二に、そのＭＰＴＩＩ遺伝子の方向をＬＢの転写の方向について逆向きにする。

最後に、Ｂ１ｎ１９のボＩＪ　ＩＪンカーを以下の制限酵素認識部位：　Ｅｃｏ ＲＩ、Ｋｐｎｌ。

ＳｍａＩ、ＢａｍＨＩ、　Ｘｂａｌ、５ａｃＩ、　ＸｈｏｌおよびＨｉｎｄＩＩ Ｉを含むポリリンカーと交換する。

（実施例４） 植物における構成的発現を目的とした発現構築物へのアスベＪレギラス　フイカ ム（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ｆｉｃｕｕｍ）のフイターゼｃ　ＤＮＡのクロー ニング　アスヘルギラス　フイカム（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ｆｉｃｕｕｍ） のフィターゼ遺伝子を加工し、構成的発現を目的とした発現構築物内のカリフラ ワーモザイクウィルス３５Ｓプロモーターの下流に、クローニングする。また、 この発現構築物は、植物起源のシグナルペプチド配列のコーディング情報を含ん でいる。

このフィターゼｃＤＮＡをプラスミドｐＭＯＧ２９（以下のａ）に述べる）に存 在するように発現構築物にクローン化する。つづいて、この構築物全体を、バイ ナリ−ベクターｐＭＯＧ２３１こ導入し、それをアグロバクテリウム　ツメファ シェンス（Ａｇｒｏｂａｃｔ−ｅｒｉｕｏ＋　ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）　Ｌ　 Ｂ　Ａ　４４０４株に移行させる。

ａ）発現ベクターｐＭＯＧ２９の構築 ＲＯＫＩ　（ボールカム（Ｂａｕ　Ｉｃｏｍｂｅ）等、（１９８６）　Ｎａｔｕ ｒｅ３２１．４４６）の発現構築物をＥｃｏＲ［／　Ｈｉｎｄ　［７ラグメント としてｐＵｃ１８Ｉクローン化する。この構築物には、ＥｃｏＲＩ／ＢａｍＨＩ フラグメント上にカリフラワーモザ゛イクウイルス（ＣａＭＶ）３５３プロモー ターを含んでおり、Ｂａｎ＋ＨＩ　／　Ｈ１ｎｄＩＩ［フラグメント上にツバリ ンシンテース（ｎｏｓ）転写ターミネータ−を含んでいる。このプロモーターフ ラグメントには、ＣａＭＶ　３５３プロモーターの−８００から＋１迄の配列を 含んでいる。含まれている部位＋１は、転写開始部位である（ギ’）−（Ｇｕ− ｉ　Ｉ　１ｅｙ）等、上述）。部位−５１２のＮｃｏ１部位の上流の配列を欠失 させ、この部位をＥｃｏＲ１部位に変える。これは、ｐＵｃ１８に存在する発現 構築物をＮＣ０Ｉで切断し、クレノーフラグメントで一本鎖末端を充填し、Ｅｃ ｏＲＩリンカ−をライゲーションすることによって行う。このプラスミドを、Ｅ ｃｏＲＩで切断し、元のＮｃｏＴ部位の上流にある３５Ｓプロモーターの配列を 有するＥｃ。

ＲＩフラグメントを欠失させる。口ａＳターミネータ−を含むＢａＩＩＩＨＩ／ ＨｉｎｄＩＩＩフラグメントを、アルファルファモザイクウィルス（ＡＩＭＶ） のＲＮＡ４のリーダー配列を含む合成りＮＡフラグメント　（第４図、オリゴヌ クレオチド二本ｍＡ）と置き換える（プレブロード（Ｂｒｅｄｅｒｏｄｅ＞等、 上述）。このことは、ＢａｍＨＩとそれにつづ＜ＨｉｎｄＩＩＩによる切断、お よび合成りＮＡフラグメントとのライゲーションによって行われる。このＢａｍ ＨＩ部位および上流の三個のヌクレオチドを部位特異的突然変異誘発で欠失させ る。このプラスミドには、ｎｏｓターミネータ−配列を含むＢａｍＨＩ／Ｈｉｎ ｄ　ＩＩＩフラグメントが、再導入されている。Ｎｃｏｌ／Ｂａ１ＨＩフラグメ ントとして、β−グルクロニダーセをコードする遺伝子（プラスミドｐＲＡＪ２ ７５由来、ジェファーソン（Ｊｅｆｆｅｒｓｏｎ）、　Ｒ，Ａ、（１９８７）　 Ｐｌａｎｔ　Ｍｏｌ、　Ｂｉｏｌ、Ｒｅｐｏｒｔｅｒ５、３８７）ｒライケーン ヨンして、プラスミドｐＭＯＧ１４を作製した。文献から、−３４３と−９０の 間の配列の重複は、３５３プロモーターの活性を増加することが知られている（ ケイ（Ｋａｙ）。

Ｒ１チャン（Ｃｈａｎ）、　Ａ、、ディリー（口ａｙｌｙ）、　Ｍ、およびマク ７フーソン（ＭｃＰｈｅｒｓｏｎ）、　Ｊ、　（１９８７）　５ｃｉｅｎｃｅ　 ２３６．１２９９）。

二重の、いわゆるエンハンサ−配列を含むプロモーターフラグメントを得るため に、当分野では良く知られている以下の操作を行う。プラスミドｐＭＯＧ１４か ら、ＡＣＣＩ　／　ＥＣＯＲＩフラグメントとして、エンハンサ−フラグメント を単離し、つづいて、クレノーフラグメントで平滑末端化する。このフラグメン トを、ＥＣ０ＲＩで切断し、平滑末端化したｐＭＯＧ１４に導入し、平滑末端化 したＥｃｏＲＩおよびＡｃｃＩＦＡ位の間の境界に新しいＥｃｏＲＩｉ位を作る 。このプラスミド（ｐＭＯＧ　１８）は、二個のエンハンサー配列を持つ３５Ｓ プロモーター、ＡＩＭＶ由来のＲＮＡ４のリーダー配列、およびＥｃｏＲＩ　／ 　Ｈｉｎｄ　ｍフラグメント上になあ存在する発現構築物中のｎｏｓターミネー タ−を含んでいる。最後にβ−グルクロニダーゼをコードするＮｃｏ　Ｉ　／　 ＢａｍＨＩフラグメントをＰＲＯＢ１２　ｃＤＮＡから誘導した合成りＮＡフラ グメントＢ（第４図）と置き換える（コーネリ七ン（Ｃｏｒｎｅｌ　１ｓｓｅｎ ）。

Ｂ、　Ｊ、　Ｃ，、フートファンフズイネン（）Ｉｏｏｆｔ　ｖａｎ　Ｈｕｉｊ ｓｄｕｉｊｎｅｎ）。

Ｒ，Ａ、Ｍ、およびポル（Ｂｏｌ）、　Ｊ、　Ｆ、＜　１９８６）　Ｎａｔｕｒ ｅ　３２１゜５３１）。このフラグメントＢは、タバコ　サムサンＮＮのＰＲ− 蛋白質　ＰＲ−Ｓシグナルペプチド配列をコードしている。一つのヌクレオチド を変えることによって、シグナルペプチドコードＤＮＡ配列中に５ｐｈ１部位を 作製する。この変化では、コードされているＰＲ−Ｓシグナルペプチドのアミノ 酸配列は、変化しない。このプラスミドをｐＭＯＧ２９と呼ぶ（第４図）。

ｂ）アスペルギラス　フィカム（Ａｓｐｅｒｇ目１ｕｓ　ｆｉｃｕｕｍ）のフイ ターゼ遺伝子のバイナリ−ベクターへのクローニングオリゴヌクレオチド二本鎖 Ｃ（第４図）を、５ｐｈｒおよびＢａｍＨＩで消化したプラスミドｐＭＯＧ２９ にクローン化して、プラスミドｐＭＯＧ４０７を作製する。このオリゴヌクレオ チド二本鎖は、成熟フィツーゼの最初の６個のアミノ酸の前のＰＲ−３のシグナ ルペプチドの最後の二個のアミノ酸に関するコード情報を含んでいる。

完全な長さのフィツーゼｃＤＮＡを含むプラスミドｐＧＢ９２７をＸｈｏＩ（部 分的）およびＰｓｔＩで消化する。アミノ酸６から先の成熟フィツーゼをコード するＤＮＡ配列を含むＸｈｏｌ／Ｐｓｔｌフラグメントを、ＸｈｏｌおよびＰｓ ｔｒで線状化したプラスミドにクローン化し、プラスミドｐＭＯＧ４１７を作製 する。キメラフィターゼ遺伝子を含むこの構築物をＥｃｏＲＩ　／　Ｈｉｎｄ　 ｍフラグメントとして、ＥＣ０ＲＩおよびＨｉｎｄＩＩ［で線状化したバイナリ −プラスミドｐＭＯＧ２３にクローン化する。生成したパイナリーベク９−ｐＭ ＯＧ４１３を、大腸菌に−１２ＲＫ２０１３（プラスミドｐＲＫ２０１３を含む ）との王者交配において、植物へのＴ−ＤＮＡ転移に必要な毒性遺伝子を含むプ ラスミドを有するアグロバクテリウム　ツメファシェンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅ ｒｉｕｎ＋　ｔｕｍｅｆａｃｉ−ｅｎｓ）ＬＢＡ４４０４株に動員される（ジッ タ（Ｄｉｔｔａ）、　Ｇ、、　スタンフィールド（Ｓｔａｎｆｉｅｌｄ）、　Ｓ 、、］−ビン（Ｃｏｒｂｉｎ）、　［１，およびヘリンスキー（Ｈｅｌ　１ｎｓ ｋｉ）、口、　Ｒ，（１９８０）　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ。

Ｓｃｉ、　［ＩＳＡ　７７、　７３４７）。

（実施例５） タバコプロトプラストにおけるキメラフイターゼ遺伝子の一時的発現 タバコのプロトプラストを構成的ＣａＭＶ　３５Ｓプロモーターの調節下のキメ ラフィターゼ遺伝子を有するプラスミドＤＮＡでトランスホームする。７２時間 後フイターゼ活性検定を用い、処理したプロトプラストについて導入されたフイ ターゼ遺伝子の一時的発現を検定する。

プロトプラストは、無菌的に生育した月齢１−２才のタバコ（Ｎｉｃｏｔｉａｎ ａ　ｔａｂａｃｕｍ　５ＲＩ）から調製する。全操作は、ローデンノく−グ（Ｒ ｏｄｅｎｂｕｒｇ）、Ｋ、Ｗ、、デグロート　（口ｅＧｒｏｏｔ）、　Ｍ、　Ｊ 、Ａ、。

ンルペルート　（Ｓｃｈｉｌｐｅｒｏｏｒｔ）、　Ｒ，Ａ、およびホイカース（ Ｈｏｏｙｋａ−ａｓ）、Ｐ、Ｊ、Ｊ、　（（１９８９）　ＰＩａｎｔＭｏｌ　、 　Ｂｉｏ＋、１３．　７１　１）により報告されている。トランスホーメーショ ンは、５ｘｌＯ’個のプロトプラストを４０μｇのプラスミドｐＭＯＧ４１７Ｄ ＮＡでエレクトロポレーションする事によって行う。エレクトロポレーション後 、プロトプラストを３　ｍｌのに３Ｇ培地に！！！濁する。

フィターゼ活性検定するために、このプロトプラストをペレット化し、その上清 ３　ｍｌを過剰の水に対して、−晩透析する。透析物を凍結乾燥し、３００μｌ の２５ｍＭ酢酸ナトリウムρ１１５．５に懸濁する。それから、２５０ｍＭグリ シン−ＨＣｌバッフｙ　ｐＨ２，５の代わりに、２５ｍＭ酢酸ナトリウムバッフ ァｐｕｓ、　５を用いること以外、実施例１０に詳細に説明しているように、検 定を行う。

これら実験において、フィツーゼ１ユニット（ＰＴＵ）は、３７℃、ＰＨ５，５ で、１．５１１ＩＭフィチン酸ナトリウム溶液から毎分１μｍｏｌのフィチン酸 塩を放出すると定義する。

未処理のプロトプラストでは、活性は検出されない。プラスミドｐＭＯＧ４１７ でエレクトロポレーションしたプロトプラストは上清中量白質し■当たり０．２ ６ＰＴＵの活性を示す。

（実施例６） ＣａＭＶ３５Ｓプロモーターのコントロール下のタバコ植物におけるキメラフィ ターゼ遺伝子の安定な発現タバコを、ＣａＭＶ３５Ｓプロモーターの調節下のキ メラフィターゼ遺伝子を有するバイナリ−ベクターｐＭＯＧ４１３を含むアグロ バクテリウム　ツメファシェンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｔｕｍｅｆａ −ｃｉｅｎｓ）ＬＢＡ４４０４株とその植物組織との共培養によりトランスホー ムする。トランスホーメーションは、ホーシュ（Ｈｏｒｓｃｈ）等の方法（上述 ）に従い、タバコにコチアナ　タバカム（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ　ｔａｂａｃｕＩ ｉ）　Ｓ　ＲＩ　）葉ディスクの共培養によって行う。トランスジェニック植物 を、選択培地（１００ｎ＋ｇ＃カナマイシン）で生育した若芽から再生し、根づ け土壌に移す。この若い植物のＮＰＴＩＩ活性を検定しくカナマイシン耐性）、 成熟させて自家授粉させて結実させる。

トランスジェニック植物の葉のフィツーゼ活性を検定するために、若い葉の直径 約５１ｍの断片を各植物から採取し、３００μｌの２５ｍＭ酢酸ナトリウムバッ ファｐＨ５，５中でホモジナイズする。

つづいて、一時的検定で説明したように、フィツーゼ活性を検定する。３２個の 独立したトランスホームタバコ植物をテストしてみると、最高の活性は、抽出物 中の総可溶性蛋白質ｆｍｇ当たり２ＰＴＵであった。これは、総可溶性蛋白質の １．７％に相当する。

これらのトランスホームタバコ植物の種子においては、最高総可溶性種子蛋白質 の０．４％に当たるフィツーゼ発現レベルが観測された。非トランスホーム植物 では、フィツーゼ活性は検出されなかった。二つのトランスジェニック植物系列 、４１３．２５および４１３゜３２、を高いフィツーゼ発現レベルに基づいて選 択した。

（実施例７） 種子特異的発現構築物におけるアスベルギラス　フィカム（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌ ｕｓ　ｆｉｃｕｕｎ）のフィツーゼｃＤＮＡのクローニングブラシカ　ナブス（ Ｂｒａｓｓｉｃａ　ｎａｐｕｓ＞　１２５貯蔵蛋白質遺伝子クルジフエリン（ｃ ｒｕ　Ａ　；ライアン（Ｒｙａｎ）等、上述）の配列を用いて、種子特異的発現 が行われるように発現構築物を構築する。

これらの配列は、本発明と同じ目的を達成するために、同様の種子特異的遺伝子 由来の配列と置き換えることが出来る。

フィツーゼｃＤＮＡを、この発現構築物にクローン化する。最後に、全構築物を アグロバクテリウム　ツメファシェンス（Ａｇｒ。

ｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）に導入し、これをトランスホー メーションに使用する。本実施例における全ての大腸菌のトランスホーメーショ ンには、大腸菌に−１２ＤＨ５αを用いる。

ａ）発現構築物の構築 種子特異的発現を目的とした発現構築物を構築するため、プランカナバス（Ｂｒ ａｓｓｉｃａ　ｎａｐｕｓ）　ｃｖ、　Ｊｅｔ　Ｎｅｎｆのクル／フェリンＡ（ ｃｒｕＡ〉遺伝子由来のプロモーターおよびターミネータ−をテンプレートとし て単離したゲノムＤＮＡを用いたＰＣＲで合成する（メトラー（ＭｅＨｌｅｒ） 、１．Ｊ、（１９８７）　Ｐｌａｎｔ　Ｍｏ１．　Ｂｉｏｌ、Ｒｅｐ。

５．３４６）。この遺伝子は種子特異的発現を示す。そのコード配列および隣接 配列はシーケンシングされている（ライアン（Ｒｙａｎ）等、上述）。

２組のオリゴヌクレオチドを合成する。１組はＥｃｏＲＩ／Ｎｃ。

ＩフラグメントとしてｃｒｕＡ　５　’隣接領域およびシグナルペプチドコード 配列の一部を増幅するのに使用する。

５　’　ＧＴＴ［ＧＧＡＡＴＴＣＧＧＧＴＴ［：ＣＧＧ　３’および５’　ＡＡ ＣＴＧＴＴＧＡＧＣＴＧＴＡＧＡＧＣＣ３’もう１組はＢｇｌｌｌ／　Ｈｉｎｄ 　Ｉｎフラグメントとして３′隣接配列の増幅に使用する。

５　’　ＣＴＴＡＡＧＡＴＣＴＴＡＣＣＣＡＧＴＧＡ　３’および５　’　ＣＧ ＧＡＧＡＡＧＣＴＴＧＣＡＴＣＴＣＧＴ　３’オリゴマーはその末端に適当な制 限部位を含み、フラグメントを制限酵素で消化後直接発現構築物を構築できるよ うに設計する。

シグナルペプチドをコードする５４ヌクレオチドの配列を含むｃｒｕＡ遺伝子の ５′フラグメントをＥｃｏＲＩおよびＮｃｏｌで切断したベクターｐＭＯＧ４４ ５　（ＳｓｔｌおよびＥｃｏＲＩで線状化したベクターｐＵｃ１８にオリゴヌク レオチド二重鎖Ｅ（第４図）をクローン化したもの）にクローン化し、ベクター ｐＭ　ＯＧ　４２４を生成する。プランカナバス（Ｂｒａｓｓｉｃａ　ｎａｐｕ ｓ）クルジフェリンのシグナル配列の最後の５個のコードトリブレット、成熟フ ィツーゼのアミノ＃１〜６をコードする配列および多重クローニング部位を含む 合成オリゴヌクレオチド二本ｊｌｌＤ　（罵４図）をＮｃｏｌおよびＨｉｎｄＩ ［Ｉで切断したベクターｐＭＯＧ４２４にクローン化する。生成するベクターを ｐＭＯＧ４２５と呼ぶ。Ｂｇｌｌｌ／ＨｉｎｄＩＩＩフラグメントとして３’　 ｃｒｕＡ　ＰＣＲフラグメントをＢｇｌ■およびＨｉｎｄｌＩＩで消化したｐＭ ＯＧ４２５にクローン化し、ｐＭＯＧ４２６を生成する。

ｂ）アスベルギラス　ライヵム（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ｆｉｃｕｕｍ）のフ ィツーゼ遺伝子のバイナリ−ベクターへのクローニングアスペルギラス　フィカ ム（Ａｓｐｅｒｇ＋目υｓｆｉｃｕｕｍ）のフィツーゼをコードする全配列を含 むプラスミドｐＧＢ９２７をＸｈｏＩ（部分的）およびＰｓｔｌで消化する。ア ミノ酸６からの成熟フィツーゼをコードするＤＮＡ配列を含むＸｈｏｌ／Ｐｓｔ ＩフラグメントをＸｈｏｌおよびＰｓｔｌで切断したベクターｐＭＯＧ４２６に クローン化する。このベクターｐＭＯＧ４２８からキメラフィターゼ遺伝子を含 む全構築物をＥｃｏＲｆ／Ｈｉｎｄ　ＩＩＩＩｎフラグメントてＥｃｏＲＩおよ びＨｉｎｄｌｌｌで線状化したバイナリ−ベクターｐＭＯＧ２３に挿入する。こ のバイナリ−ベクターｐＭＯＧ４２９を大腸菌に一１２ＲＫ２０１３　（プラス ミドｐＲＫ２０１３を含む）（ジッタ（Ｄｉｔｔａ＞等、上述）と共に植物への Ｔ−ＤＮＡ転移に必要な毒性遺伝子を含むプラスミドを有するアグロバクテリウ ム（＾３ｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）　Ｌ　Ｂ　Ａ　４４０４株（ホーケマ（Ｈｏ ｅｋｅ＋ｎａ）等、１９８３、上述に導入して王者交配させる。

（実施例８） タルシフニリンプロモーターのコントロール下のタバコ種子内におけるフィツー ゼの安定な種子特異的発現タルシフニリンプロモーターのコントロール下のフィ ツーゼＣＤＮＡを含むバイナリ−ベクターｐＭＯＧ４２９を有するアグロバクテ リウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）　Ｌ　Ｂ　Ａ　４４０４株をトランスホ ーメーション実験に用いる。タバコ（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ　ｔａｂａｃｕｍ　５ ＲＩ）のトランスホーマンヨンはホーシュ（ｔｌｏｒｓｅｈ）等（上述）の方法 に従がい葉ディスクの共培養を用いて行う。トランスジェニック植物は選択培地 ＜１００ｍｇ／Ａ’カナマイシン）で生育する若木から再生する。若木のＮＰＴ ＩＩ活性（カナマイシン耐性）を検定し、成熟させ、自家授粉により結実させる 。各トランスホーマントの種子を集め、その一部でフィツーゼの存在を検定する 。トランスホームしていないコントロール種子と比較して、最も高い発現を示す クローンの残りの種子をカナマイシン存在下で（２００ｍｇ／ｌ）発芽させる。

生成する８２種子のデータから、ＮＰＴｎと（同時にフィツーゼと）同種の種子 を選択し、最も多くフィツーゼを生産し得る植物を大量に増やすのに使用する。

これらは消化実験等に使用する。トランスジェニック種子に存在するフィツーゼ 活性を測定するため、約５０ｍｇの種子を採り、１＋＋／！２５ｎ＋１４酢酸す ）　ＩＪウムバッファ（ｐｆ１５．５　）中、氷冷した乳鉢および乳棒でホモジ ナイズする。遠心後、一時的検定で説明した方法で上清を検定する。５５個のト ランスホームしたタバコ植物で全可溶性種子タンパク質の０．１５％という最高 フィツーゼ発現レベルが観測された。フィツーゼ活性はトランスジェニック植物 の茎、根および葉には検出されず、またトランスホームしていない植物にも検出 されなかった。

（実施例９） ナタネ種子のトランスホーメーション この実施例ではキメラフィターゼ遺伝子を含むバイナリ−ベクターを有するアグ ロバクテリウム　ツメファシェンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｌｌｔｕｌｌｅ ｆａｃ＋ｅｎｓ）と植物組織を共培養することによりナタネの種子のトランスホ ーメーションを行う。トランスジェニックＭ物は抗生物質で選択する。トランス ジェニック植物のフィツーゼ活性を検定する。高発現体をさらに解析し、次の実 験に使用する。

バイナリ−ベクター（ｐＭＯＧ４２９）における同じキメラフィターゼ構築物を 実施例７で説明した方法でアグロバクテリウムツメファシェンス（Ａｇｒｏｂａ ｃｔｅｒｉｕｍ　ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）　Ｌ　Ｂ　Ａ　４４０４株に導入す る。この株を用いてナタネの種子（ブラシカナバス（Ｂｒａｓｓｉｃａ　ｎａｐ ｕｓ）ｃｖ、ウェスター（Ｗｅｓｔｅｒ）　）をトランスホームする。この目的 のため開花直前の週令５〜６オの植物から採った表面滅菌した茎断片を１ｍｇ／ ｉ’ＢＡＰを含むＭＳ培地（フライ（Ｆｒｙ）等、（１９８７）　Ｐｌａｎｔ　 Ｃｅ１ｌ　Ｒｅｐｏｒｔｓ　６．　３２１）中で２４時間前処理し、ついで同じ 培地を入れた新しいプレート中、４８時間アグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃ ｔｅｒ　ｉｕｍ）と共培養する。トランスジェニック植物は選択培地（５００ｍ ｇ／ｎｌカルベニシリン、４０ｍｇ／ｌパロモマイシン）で生育する若木から再 生し、タバコについて実施例８で述べた方法でさらに分析した。

（実施例１０） 総計的０．２５　Ｐ　Ｔ　Ｕを含むトランスジェニック植物を粉砕した。

（ＰＴＵ−フィツーゼユニット。フィターゼ活性１ユニットは３７℃、ｐＨ２， ５において１．５＋＋＋Ｍフィチン酸ナトリウムから１μｍｏｌ／ｌｌｌ１ｎの 速度で無機リンを放出する酵素量と定義する）。それとは別に、この量のフィツ ーゼを植物から抽出する。

粉砕植物を、０．８６ｇフィチン酸すｌ−Ｕラム１１Ｈ２０を含む２５０ｍＭグ リシン／ＨＣｌバッファ（ｐＨ２，５）　５０　ｍｌ中でインキュベートする。

アスペルギラス（Ａｓｐｅｒｇ　ｉ　ｌ　１ｕｓ）フィツーゼは至適ｐ）１２． ５または５．５で発現されるが植物のフィツーゼ活性を排除するため低い方のｐ Ｈを用いた。

生成する混合物を３７℃で１５分または６０分インキュベートする。インキュベ ート物５１Ｉ１１を１０％ＴＣＡ　（トリクロロ酢酸）５　ｍｌと混ぜることに より反応を停止する。その後指示薬（２，５ｇ　（ＮＨＪｓＭｏｔＯｚｎ　−４ Ｈ２０および３　ａｌｌ＠　Ｈ−ＳＯ４を水で２５０ｒｍｌに希釈したモリブデ ン酸アンモニウム溶液５０ＩＩｌｌに３．６６ｇのＦｅ５０．・７Ｈ２０を溶か したもの）を反応液に加える。青色の強度を７００ｎｎ＋における分光測定によ り測定する。

Ｔ＝Ｏにおける無機リン含量をブランクとする。

０．１ｍＭ範囲のリン酸塩の校正曲線から、リン酸の放出量を得る。

（実施例１１） 飼料とニコチアナタバカム植物粉砕物のインキュベーション典型的には０．２５ ｇの溶媒抽出大豆ミールをフィチン酸す）　ＩＪウムを添加すること以外、先に 述べたように約０．２５ＰＴＵを含む粉砕したニコチアナタバカムとインキュベ ーションする。この場合添加したインキュベーション試薬には４１０ｎｊ！バッ ファド９０ｍ１の水の混合物が含まれている。

溶媒抽出大豆ミールにおけるフィチン酸塩からのリン酸の放出を第６図に示す。

粉砕植物を入れないと活性は観測されない。

実質的に同じ実験で基質としてトウモロコシグルテン飼料を用いても同じ結果を 与える。トランスジェニック種子を用いた結果を第６図に示す。

粉砕植物が無い場合やフィツーゼ活性を含まない植物を用いた場合活性は観測さ れなかった。

（実施例１２） 家禽の消化管をシミュレートした条件下でのフィツーゼ含有トランスジェニック 植物のインビトロテストトランスジェニックタバコ植物で生産されたフィツーゼ 効果を検定するためアスペルギラス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）由来のフィツー ゼ活性を家禽の消化管の条件をシミュレートしたモデルで測定する。

まず標準的家禽飼料を３９℃で６０分間１ｇ／１５ｍ１水の濃度でインキュベー トし、家禽のニブクロの条件をンミュレートする。つづいて５　ｍｌのペプシン 溶液（メルク、５．２８ｇ／ｌ、ｐＨ３，０−塩酸で調整）を添加し、ＨＣｌ１ でｐＨ３，０でｐｌを調整した後、同温度でさらに９０分間インキュベートして 胃の条件をノミュレートする。

このインキュベーションの際に、順次サンプルを採取して飼料に存在するフィチ ン酸塩から放出されるリン酸塩の量を測定する。

菌類フィツーゼの作用は第７図から明らかである。飼料１　ｋｇ当り２５０　Ｐ ＴＵから１００ＯＰＴＵへとフィツーゼ投与量を増していくと飼料から放出され るリン酸塩が増加する。

種子または葉のトランスジェニックタバコ植物サンプルを（系列４１３．２５Ｊ よび４１３゜３２、乳鉢で粉砕後）菌類フィツーゼ代りに用いると、同様のリン 酸放出の増加が見られる（第８図）。フィツーゼを含まないコントロールのタバ コ植物もテストしたが、ブランクコントロールと比較してリン酸の放出は観測さ れなかった。

ｋｇ当り５００および７００　ＰＴＵの結果をｋｇ当り５０ｇのトランスジェニ ックタバコ種子の結果との比較は、このインビトロ家禽消化モデルにおいて１ｇ のタバコ種子は約１２ＰＴＵに匹敵することを示している。葉を用いたサンプル 比較は１ｇのタバコの葉は約２５ＰＴＵを含んでいる。

（実施例１３） 動物テスト 植物種子中で発現するフィツーゼの効果および動物に対するタバコ種子の許容性 を示すためブロイラーを用いたテストを行う。

フィターゼ発現タバコ種子およびコントロール種子を収穫する。

種子１００グラムを冷却に配慮しながら５００μｍのポアサイズのフルイ　（レ ッチミルＺＭＩ）で粉砕する。

日令１才の雄ブロイラーのヒヨコ（バイブロ）を２つのケージ（０，４５ｍ’） に入れる。最初の２日の室温は３２℃で、次の１週間は４℃づつ下げていく。さ らに１週間ごとに２℃づつ温度を下げていく。またブロイラーは１時間光を照ら し、３時間暗闇に置くという条件で生育させる。

その鳥は１８目にクローン３０ワクチンでニューキャッスル病に対して免疫化す る。実験中、このブロイラーには全てフスマとアドリビタムの実験飼料を与える 。成長と飼料／重量増比を測定する。全リンの見かけの使用量を３日間測定し、 その間乾燥物質としての飼料消費を測定し、その排泄物を定量する。

フィツーゼを添加していない以下のコントロール飼料を使用する。

飼ＨＣａ　（％）　全リン（％）　フィチン酸のリン（％）１　０．６０　０． ４５　０．３０ ２　０．７５　０．６０　０．３０ ３　０．９０　０．７５　０．３０ 飼料１　（基本飼料）には飼料用リン酸を添加しない。飼料２と３には無水リン 酸二カルシウムおよびリン酸−アンモニウムの混合物（５：　ｌ）由来のカルシ ウムおよびリンを補う。全ての実験飼料は基本飼料への添加で得られる（第１表 ）。

実験飼料４にはファンゴルコム（Ｖａｎ　Ｇｏｒｃｏｍ）等（上述）ノ方法で調 製した飼料ｋｇ当り４００ＰＴＵａ度の微生物フィツーゼを添加する。

実験飼料５は飼料９０ｋｇ当り３ｋｇの割合で非トランスジェニックタバコの種 子粉砕物を添加すること以外は飼料４と同様である。

実験飼料６は９０ｋｇ飼料混合物に最終的に飼料ｋｇ当り４００ＰＴＵの濃度と なるようにトランスジェニックタバコ（系列４１３．２５＞種子粉砕物３ｋｇを 添加すること以外飼料４と同様である。

実験は２４日まで１６のケージ中１７６羽（ケージ当り１１羽）のブロイラーを 用いて行う。処理（飼料）は２度繰り返し、各段のケージはランダムに指定する 。

リンの使用量は日令２１〜２４才のものについて測定する。

各々飼料４．５および６を供給した動物のリン使用量および成長の結果はフィツ ーゼ添加のポジティブ効果を示す（第２表）。

また、飼料４．５および６の比較は飼料中のタバコ種子がブロイラーなどの家畜 の胃腸管における微生物フィツーゼの作用を起こし、動物にネガティブな効果を 起こさないことを示している。

本発明は特定の態様で説明しているが、本発明の精神および範囲を逸脱すること なく変化や置換を行ない得ることは明白である。

さらに本発明の目的、精神および範囲に対して特定の状況、物質、植物、種子、 方法、操作に多くの修正を行うことができる。これらの変化も以下に示す特許請 求の範囲内にある。

第１表　ブロイラーを用いた実験に使用する基礎飼料の組成成　分　含有（ｇ／ ｋｇ） イエローマイズ　２８０．０ ツルガム（低タンニン）　２００．０ ひまわり種子ミール（溶媒抽出物）　８０．０大豆ミール（溶媒抽出物、４８． ８％たんばく質）　３５０．０大豆油　５８．５ ビタミン類９５．０ ミネラル類”　１５．０ 石灰石　１．０ 合成メチオニン　１．０ ＭＥ　（ＭＪ／ｋｇ）　１３．１ カルシウム　６．０（６，０−６，６）　”全リン　４．５（４，７−４，７） 　”有機性フィチン酸塩　３．０（３，１−３，１）　”本飼料ｋｇ当りの量； 　１２０００１１Ｊビ９　ミンＡ　；　２０００１Ｕヒタミ７Ｄ、　＋５１Ｕ　 ビタミンＢ　；　１．５ｍｇビタミンに３；　１ｍｇチアミン；　５ｍｇリボフ ラビン；ＩＢピリドキシン；　３０ｍｇニコチン酸；７．５ｍｇ　ローパントテ ン酸；　０，０１５ｍｇビタミンＢ＋ｚ　；　０．５ｎ＋ｇ葉酸；３５軸ｇ　塩 酸コリン；　７５１１ｇエトキシキン；　９．５ｇＣａＣＯ３；　２．５　ｇ　 ＮａＣ１；　０．２６ｇ　Ｆｅ５Ｏ−＋　０．２４ｇＭｎ５Ｏｎ　；　４５ｍｇ 　ＣＬＩＳＯ４；　６０ｍｇ　ＺｎＳＯ４；　１０５ｍｇ　Ｋｌ。

本震（）は各々実験１および２の分析値。

Ｆｉｇｕｒｅ　１ ＶＸａυＲＥ　２　（Ｅｉｈｅｅｔ　ｌ　ｏｆ　２）−１◆１ Ｐ工ＧυＲＥ　２　（Ｅｉｈｅｅｔ　２　ｏｆ　２）生成リン酸塩（ｍｍ○ｌ／ ｋｇ乾燥物質）Ｐ　放出量　（ｍｍｏｌ／ｋｇ） Ｐ　ａ出量　（ｍｍｏｌ／ｋｇ） 国際調査報告 、□ＡＩｅ１．ｌａ＋ゆ。師、ＰＣＴ／ＮＬ　９１１０００４７国際調査報告 Ｓ＾　４６１４３ 国際調査報告 フロントページの続き （５１）　Ｉｎｔ、　Ｃ１，５識別記号　庁内整理番号Ｃ１２Ｎ　１／２１　７ ２３６−４Ｂ １５１５５　ＺＮＡ ／／（Ｃ１２Ｎ　１／２１ Ｃ１２Ｒ１：０１） （Ｃ１２Ｎ　１５１５５ Ｃ１２Ｒ１：６６） （７２）発明者　フッケマ　アンドレアスオランダ国　エフエル−２３４１カー イツクスウーヘストヘースト　ワルモンデルウェッヒ　６６ （７２）発明者　セイモンス　ペーテル　クリスチャンオランダ国　エヌエル− １０７５へ一カー　アムステルダム　ヴエレリウスストラートＩ （７２）発明者　ファン　オーイエン　アルベルト　イエ−イエ− オランダ国　エヌエル−２２７５へ一カー　アムステルダム　オーヴエルピュル クカーデ（７２）発明者　レイトフェルト　フレインオランダ国　エフエル−３ １３２チーエル　ヴラールディンへン　ファン　デル　ヴアールスストラート１ ２９ （７２）発明者　フェルヴールド　テラニス　コルネリスオランダ国　エフエル −２３１２エルカ−レイデン　アウデシンヘル　２８６

Claims (21)

【特許請求の範囲】
1. 〔請求項１〕植物宿主中でのフィターゼの発現を起こし得る調節配列に機能的に 結合するフィターゼをコードするＤＮＡ配列を含む発現構築物で植物宿主をトラ ンスホームし、該植物をフィターゼコードＤＮＡ配列が発現する条件下で生育す ることを特徴とする多量のフィターゼを含むトランスジェニック植物または植物 器官の生産方法。
2. 〔請求項２〕前記発現構築物がフィターゼの構成的発現を起こし得る調節配列を 含む請求項１記載の方法。
3. 〔請求項３〕前記発現構築物がフィターゼの組織特異的発現を行ない得る請求項 １記載の方法。
4. 〔請求項４〕前記フィターゼコードＤＮＡ配列が微生物由来ものである請求項１ 記載の方法。
5. 〔請求項５〕前記フィターゼコードＤＮＡ配列が繊維状菌類に由来する請求項４ 記載の方法。
6. 〔請求項６〕前記フィターゼコードＤＮＡ配列がアスペルギラスに由来する請求 項５記載の方法。
7. 〔請求項７〕前記フィタービコードＤＮＡ配列がＡ．フィカム、Ａ．ニガー、Ａ ．アワモリおよびＡ．ニズランスからなる群から選ばれるアスベルギラスに由来 する請求項６記載の方法。
8. 〔請求項８〕フィターゼをコードするＤＮＡ配列がフィターゼの構成的発現を起 こし得る調節配列に機能的に結合することを特徴とする発現構築物。
9. 〔請求項９〕請求項８記載の発現構築物を含むことを特徴とするベクター。
10. 〔請求項１０〕請求項９記載のベクターを含むことを特徴とする細菌。
11. 〔請求項１１〕フィターゼをコードするＤＮＡ配列がフィターゼの組織特異的発 現を起こし得る調節配列に機能的に結合することを特徴とする発現構築物。
12. 〔請求項１２〕請求項１１記載の発現構築物を含むことを特徴とするベクター。
13. 〔請求項１３〕請求項１２記載のベクターを含むことを特徴とする細菌。
14. 〔請求項１４〕植物または植物器官が該植物宿主中でフィターゼの発現を起こし 得る調節配列と機能的に結合するフィターゼコードＤＮＡ配列を含む発現構築物 を含むことを特徴とするトランスジェニック植物または植物器官。
15. 〔請求項１５〕請求項１乃至７のいずれか１項記載の方法で生産されるフィター ゼをフィチン酸塩を含む基質に作用させることを特徴とするフィチン酸塩のイノ シトールおよび無機リン酸への変換方法。
16. 〔請求項１６〕飼料が請求項１乃至７のいずれか１項記載の方法で生産したフィ ターゼを含むことを特徴とする動物の飼料組成物。
17. 〔請求項１７〕飼料が請求項１乃至７のいずれか１項記載の方法で生産したフィ ターゼを含むトランスジェニック植物または植物器官を含むことを特徴とする請 求項１６記載の飼料組成物。
18. 〔請求項１８〕飼料を摂取した動物の成長増進に効果的な量の請求項１６記載の 飼料組成物を含む飼料で動物を飼育することを特徴とする動物の成長の増進方法 。
19. 〔請求項１９〕飼料中に含まれるフィチン酸塩をイノシトールおよび無機リン酸 塩に変換するのに有効な量の請求項１６記載の飼料組成物を含む飼料で動物を飼 育することを特徴とする動物排泄物中のフィチン酸レベルの減少方法。
20. 〔請求項２０〕フィチン酸塩の生産方法で、ａ）植物宿主中、多量のフィターゼ を発現し得る調節配列に機能的に結合するフィターゼコードＤＮＡ配列を含む発 現構築物で植物宿主をトランスホームし、植物組織中でフィターゼコードＤＮＡ が発現される条件下で該トランスホーム植物を生育させること、および ｂ）該トランスジェニック植物組織からフィターゼを抽出すること、 以上ａ）およびｂ）のステップを含む方法。
21. 〔請求項２１〕食品または飼料中の成分として請求項１乃至７および２１のいず れか１項記載の方法で生産したフィターゼを使用すること。