JPH06502396A - 好塩基球からのサイトカイン誘導ヒスタミン放出のインターロイキン８阻害 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 好塩基球からのサイトカイン誘導ヒスタミン放出のインターロイキン８阻害 基金二本発明の開発はＮＩＨ認可ＮａＡｌ２７８６４からの基金により一部補助 された。したがって、連邦政府はある権利を有している。

ヒスタミン放出因子（ＨＲＦ）は好塩基球及び肥満細胞から媒介物貰ヲ放出する 一部のサイトカイン類を代表する。我々の従来の関連出願第１４３．０９４号及 びその継続した国際出＠ＷＯ第８９１０６５４５号明細書（双方とも特に参考の ためここに組み込まれる）は単核細胞由来ＨＲＦで誘導されるヒスタミン放出を 阻害するサイトカイン類について記載している。我々は組換えインターロイキン ３（ＩＬ−８）がＨＲＦ誘導ヒスタミン放出の強力な阻害剤であることをここに 発見した。肥満細胞及び好塩基球のようなプロアレルギー細胞を有効濃度のＩＬ −８と接触させることによりアレルギー媒介物質のＨＲＦ誘導放出を阻害するた めの方法が請求されている。

好塩基球及び肥満細胞はそれらが１８７０年代にＰａｕ　ＩＥｈｒｌｉｃｈによ り記載されて以来科学的研究の対象であった。肥満細胞は通常結合組織で、好塩 基球は血中でみられる。その２つの細胞タイプは多くの類似性を有する。

双方とも多数の真束顆粒を含み、双方ともＩｇＥと高親和性で結合する細胞表面 レセプターを有し、双方とも皮膚のかゆみから最も生命脅威的な臨床状態、アナ フィラキシ−までにわたる症状を引き起こせる無数の様々なアレルギー媒介物質 を含んでいる。好塩基球及び肥満細胞は事実上すべての全体内ヒスタミンの包括 的な供給源であり、ヒスタミン含有プロアレルギー細胞として包括的に呼ばれる 。

肥満細胞及び好塩基球がアレルギー過敏反応の誘導にとり必須であることを確信 させる証拠がある。例えば、実質的証拠では肥満細胞が喘息、アレルギー性鼻炎 、結膜炎、尊麻疹及びアナフィラキシ−のようなアレルギー疾患の一部エフェク ター細胞であることを示唆している。

多数の肥満細胞はこれら障害において気管支肺胞洗浄液、呼吸粘膜、鼻粘膜及び 尊麻疹領域のバイオプシー標品中でみられた。加えて、ヒスタミン及びプロスタ グランジン（ＰＧ）Ｄ２のような肥満細胞媒介物質は自然及び誘発アレルギー反 応時に血清、気管支肺胞洗浄液、鼻洗液及び皮膚水庖液から回収された。更に最 近になり、肥満細胞顆粒特異性酵素トリブターゼ（好塩基球ではみられない）が アレルギー及びアナフィラキシ一様反応のある患者からの血清で検出された。最 後に、はとんどの肥満細胞由来媒介物質は単独で又は組合せで気管支痙章、血管 柱浮腫、せき、粘液分泌、昇温、くしゃみと膨疹及び発赤皮膚反応のような典型 的アレルギー症状を引き起こし、肥満細胞特異性脱顆粒剤はインビボでアレルギ ー反応を誘導できる。

加えて、組織学的証拠では肥満細胞がいくつかの慢性炎症疾患の病因に関与する ことを示唆している。多数の肥満細胞はリウマチ様関節炎、潰瘍性大腸炎、クロ ーン病、サルコイド−シス、過敏性肺炎、肺繊維症、鼻ポリープ、アトピー性皮 膚炎、アレルギー性接触皮膚炎、水庖性類天庖癒、ケロイド形成、硬皮症及び進 行性全身性硬化症、急性及び慢性対宿主性移植片病と寄生虫侵入の患者からのバ イオプシー標品中で検出された。肥満細胞は神経成長の調節にも係わり、肥満細 胞脱顆粒の調節は神経繊維腫症に有用であることがわかった。更に、高レベルの ヒスタミンはサルコイド−シス、過敏性肺炎及び特発性肺繊維症の患者からの気 管支肺胞洗浄液中で検出された。推定肥満細胞安定剤のクロモリンナトリウムは 潰瘍性大腸炎患者、特に直腸炎患者のサブグループにとり有益であることがわか った。

好塩基球は特にウルシ及び実験的にはジニトロクロロベンゼンに対する一部の形 のアレルギー性接触皮膚炎に特に関与しているらしい。これらの細胞は全侵入細 胞の５〜１５％であり、皮膚へのアレルゲンの適用後８時間以内で存在する。肥 満細胞及び好塩基球により多数の炎症媒介物質が放出されるとすれば、これら細 胞の緩徐的脱顆粒は前記障害の慢性炎症状態に関与していると考えられる。

残念ながら、肥満細胞及び好塩基球をこれら及び他の病状にむすびつける確信的 証拠にもかがゎらず、アレルギー疾患を含めた肥満細胞及び好塩基球依存性障害 の正確な病因は完全には理解されていない。例えば、肥満細胞及び好塩基球は適 切なアレルゲンによる細胞表面結合ＩｇＥ抗体（又は抗ＩｇＥ抗体）の架橋でヒ スタミン、ロイコトリエン類及び他の炎症媒介物質を放出するように刺激される が、但しいくつかのアレルギー疾患、例えば気管支喘息、鼻炎及び結膜炎の重篤 度は患者のＩｇＥレベルと相関していないことが知られている。更に、肥満細胞 は炎症性腸疾患、リウマチ様関節炎、肺繊維症及びサルコイド−シスのような様 々な他の疾患で役割を果たしていると考えられるが、これら疾患の大部分におい てＩｇＥ抗体は発見できない。

したがって、他のメカニズムのアレルギー媒介物質放出が好塩基球及び肥満細胞 が関与する前記のアレルギー疾患及び他の障害の病因で重要な役割を果たしてい るらしい。このようなメカニズムの解明は多数の熟練医療科学者のゴールであっ たし、なおもゴールのままである。

この分野において最も感動的な開発の１つは、本発明者らの研究所で働く研究者 らによる、ヒスタミン放出活性体（ＨＲＡ）、即ちヒスタミン放出因子（）ｆＲ Ｆ）としてここで命名されたサイトカイン類の発見であった。

Ｔｈｕｅｓｏｎ　ら　（Ｊ、！ｓｍｕｎｏ１．，１２３：６２Ｂ（１９γ９）； 　Ｊ、ｆｍｕｎｏｌ、。

１２３二６３３（１９７９）　）及びＬｅｔｔ−Ｂｒｏｗｎら（Ｃｅｌｌ　ｌｍ ５ｕｎｏ１．．８７：４３４（ｌＨ４）；Ｃｅ１１　ｌｍ５ｕｎｏ１．．８７： ４４５（１９１１４））は抗原又はミトゲン刺激ヒト単核細胞が好塩基球及び肥 満細胞からヒスタミンの放出を誘導するタンパク質因子を分泌することを最初に 報告した。その後他の研究所が単核細胞によるＨＲＦの合成を確認した。ＨＲＦ はインビトロで培養されたＢ−リンパ球及びＴ−リンパ球、肺胞マクロファージ 、血小板、好中球と血中単球によっても合成されることがここに示された。ＨＲ Ｆを分泌することが報告された様々な細胞タイプはそれが顕著な生物学的重要性 を有することを示唆している。ヒスタミン放出を媒介することに加えて、ＨＲＦ はロイコトリエン類の分泌を誘導しかつ好塩基球及び単球にとり走化性であるこ とが示された（検討のため、Ｇｒａｎｔ、ｅｔ　ａｌ、、Ｐｅｄ、Ｐｒｏｃ、、 ４５：２６５３（１９Ｈ）；　Ｊ、ＡＩＩｅｒｇｙ　Ｃ１１ｎ、ｌｍ５ｕｎｏ１ ．．７７：４０７（１９８Ｂ）；　Ａｌａｍ。

Ｉｎｓｆｇｈｔｓ　ｉｎ　Ａｌｌａｒｇｙ、Ｖｏｌ、２．ｎｏ、８（１９１１７ ）、ＣＶ　Ｍｏ５ｂｙ、Ｓｔ。

Ｌｏｕｔｓ参照；すべて参考のためここに組み込まれる）。

多数の研究がヒトアレルギー疾患の媒介物質としてＨＲＦの重要性を直接支持す るデータを提供している。

例えば、ＨＲＦ様物質は遅延アレルギー反応時に得られる皮膚水層液から得られ たが、これは慢性喘息及び他のアレルギー状態の病因において重要な因子である と現在考えられている。ＨＲＦは鼻洗液中でも回収された。加えて、ＨＲＦは喘 息者による吸入で気管支収縮とヒト及び非ヒト霊長類で膨疹及び発赤反応を誘導 する。喘息患者からの単核細胞は比較的多量のＨＲＦを自発的に産生ずることが 示され、ＨＲＦ産生は特定アレルゲンとのインビトロインキュベートで高められ る。更に、自発的ＨＲＦ産主の程度は喘息患者における気管支過剰反応の重篤度 と相関している〔＾ｌａｗ、ｅｔ　ａｌ、、Ｊ、ＡＩＩｅｒｇｙ　Ｃｌ１ｎ。

１ｎｍｕｎｏ１．．７９：１０３（１９８７）　）　、これらの発見は、喘息患 者において自発的ＨＲＦ産生の増大が肥満細胞又は好塩基球からアレルギー媒介 物質の緩徐的放出を引き起こし、慢性炎症を起こして、最終的に気管支過剰反応 を進行させることを示唆している。

加えて、免疫療法はアレルギー疾患を治療する上で十分に許容された様式である が、その作用のメカニズムはまだ不明瞭である。血清１ｇＥ抗体に関する変化は 免疫療法の効力とあまり相関していない。血清１ｇＧ阻止抗体は長期治療後に通 常生じる。一部の研究者らは免疫療法の効力とＩｇＧ抗体のレベルとの相関につ いて示したが、その相関は薄弱すぎてカジュアルな関係を意味しないことが多い 。しかしながら、最近、本発明者らの一人は免疫療法がＨＲＦ産生の季節的上昇 を破り、患者における自発的ＨＲＦ産生を減少させて臨床的に改善することを発 見した。このため、症状薬物療法スコアと自発的ＨＲＦ産生との間には高い相関 がある（ｒ−０，９２、ｐ−０，０００２）。

好塩基球及び肥満細胞からの媒介物質の放出を含めたアレルギー疾患及び他の障 害の病因に関してＩ’ｌＲＦが重要な役割を果たすとすれば、ＨＲＦ誘導媒介物 質放出を阻害できる薬剤はアレルギー疾患を含めた肥満細胞／好塩基球依存性障 害を治療する上で貴重な手段を提供しうるであろう。我々の従来の特許出願は約 ８０００〜１０．０００ドルトンの分子量を有するヒトヒスタミン放出阻害因子 について記載している。我々は組換えヒトインターロイキン８　（ＩＬ−８）　 （ｍ、ｖ、約８０００ドルトン）がＨＲＦ誘導ヒスタミン放出の極度に強力な阻 害剤であることをここに決定した。ＨＲＩＦ及びＩＬ〜８はサイトカイン媒介ヒ スタミン放出と特異的に拮抗する。

ＩＬ−８は７９アミノ酸ペプチドとして分泌され、しかる後これはタンパク質分 解開裂をうけて、双方とも好中球アクチベーター／誘引物質として活性である７ ７又は７２アミノ酸ペプチドのいずれかを生じる（Ｔ、Ｙｏｓｈｉｓｕｒａ　ｅ ｔ　ａｌ、、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ、８４：９２３３ （１９８７）；Ｌｅｏｎａｒｄ、Ｅ、Ｊ、及びＴ、Ｙｏｓ旧ａｕｒａ、Ａｍ、Ｊ 。

Ｙｏｓｈｌｓｕｒａは７９．７７及び７２アミノ酸ペプチドに関して各々Ｉ　Ｌ −８／ＮＡＰ　１　（好中球活性化ペプチド）α、β及びγという用語を提案し たが（Ｔ、Ｙｏｓｈｉｓｕｒａ　ｅｔａｌ、、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、 Ｓｃ１．ＵＳＡ、８４：９２３３（１９８７））、属名■Ｌ−８はそれら種の各 々をカバーするとしてここでは採用されている。ＩＬ−８は単球、マクロファー ジ、リンパ球、内皮細胞、繊維芽細胞及びケラチン細胞を含めた多くの細胞によ り産生きれる。組換えヒトＩＬ−８β、即ちＮ末端にアラニンを有する７７アミ ノ酸ペプチドが下記研究で用いられた。

本発明の一般的態様によれば、プロアレルギー細胞をインターロイキン８と接触 させることからなる、プロアレルギー細胞からのアレルギー媒介物質のＨＲＦ誘 導放出を阻害するための方法が提供される。具体的態様において、プロアレルギ ー細胞は肥満細胞又は好塩基球からなり、アレルギー媒介物質はヒスタミンであ る。その方法は好ましくはヒトインターロイキン８及びヒトプロアレルギー細胞 を用いてインビトロ又はインビボのいずれかで実施されると考えられる。好まし い態様において、インターロイキン８は少くとも約１０’Ｍの濃度で存在する。

（好中球活性化ペプチド又は白血球付着阻害剤としても知られる）ＩＬ−８の７ ９．７７又は７２アミノ酸種のいずれかが本発明に従い用いられてもよいが、７ ７アミノ酸種の使用が組換え産生ＩＬ−８の使用と同様に好ましい。本発明には 、ヒスタミン放出を阻害するためにプロアレルギー細胞を有効濃度のインターロ イキン８と接触させることからなる、プロアレルギー細胞からのアレルギー媒介 物質の放出を阻害するための方法も含む。好ましい態様において、ヒスタミン放 出はここで記載されたプロトコールに従い測定された場合に少くとも約１０〜少 くとも約６０％、少くとも約１５〜少くとも約６０％、更に好ましくは少くとも 約３０〜少くとも約６０％阻害される。本発明のこれらの及び他の面は図面と合 わせて読んだ場合に具体的態様の記載から更に明らかとなるであろう。

図１．ＩＬ−８による好塩基球からのＨＲＦ誘導ヒスタミン放出の阻害。ドナー ２０例（アレルギー者１ＯＰｊ及び正常者１０例）からの白血球が様々な濃度の ＩＬ−８と共に５分間前インキュベートされ、しかる後単核細胞由来ＨＲＦで侵 襲された。ＩＬ−８と共にインキュベートされた細胞からのヒスタミン放出の阻 害率が緩衝液と比較して示されている。ＨＲＦによる平均ヒスタミン放出率はア レルギー個体からの細胞の場合５０±８％及び非アレルギー個体からの細胞の場 合３８±７％であった。その２群間におけるヒスタミン放出の阻害率に関する差 異は統計学的にｐ＜Ｑ、０４で有意（＊）であった。

図２．ＭＮＣ−ＨＲＦ、抗Ｉ　ｇＥ、ＦＭＬＰ及び０５ａによる好塩基球からの ヒスタミン放出に関するＩＬ−８の効果。白血球はＩ　Ｌ　−８（１０−６Ｍ） と共に５分間前インキュベートされ、しかる後既定用量の様々な分泌促進物質で 侵襲された。実験数（Ｎ）はＭＮＣ−ＨＲＦの場合２０回、抗１ｇＨの場合１０ 回、ＦＭＬＰ及びＣ５ａの場合３回である。星印は放出をコントロールする上で 比較されたｐ＜０．０４の統計学的差異を示す。

図３．白血球とＩＬ−８との前インキュベートに関する必要性が研究された。細 胞は緩衝液又はＩＬ−８と別々に５分間前インキュベートされ、しかる後ＨＲＦ で侵襲された。もう１組の実験において、ＩＬ−８及びＨＲＦは同時に細胞に加 えられたか又はＨＲＦが最初に細胞と共に前インキュベートされ、ＩＬ−８が５ 分間後に加えられた。実験３回のうち１回の結果が示されている。

図４．ヒスタミン放出の阻害に関する前インキュベート後におけるＩＬ−８の除 去効果。ＩＬ−８との前インキュベート後に、白血球が３０倍容量の緩衝液と３ 回洗浄された。次いで細胞がＨＲＦで侵襲された。コントロール実験において、 細胞は緩衝液と共に前インキュベートされ、しかる後前記のように処理された。

実験３回のうち１回の結果が示されている。

図５．好塩基球からのＩＬ−８誘導ヒスタミン放出。

ドナー２０例からの白血球が様々な濃度のＩＬ−８と４５分間インキュベートさ れ、放出されたヒスタミンが測定された。緩衝液の存在下における自発的ヒスタ ミン放出率が減算された。ドナー２０例中６例（正常者２例及びアレルギー者４ 例）からの好塩基球はＩＬ−８βに応答した。示された結果は応答ドナー６例か らの好塩基球によるヒスタミン放出の平均±ＳＥＭである。

図６．好塩基球からのＩＬ−８誘導ヒスタミン放出に関する好中球枯渇の効果。

ドナー３例からの好中球に冨む及び好中球に枯渇した白血球がヒドロキシエチル デンプンでの沈降及びフィコール−ハイパキュー（Ｆｉｃｏｌｌ−Ｈｙｐａｑｕ ｅ）勾配（ｓｐ、ｇｒ、１．　０７７）遠心を各々用いて分離された。次いで細 胞はＩＬ−８と共にインキュベートされ、放出されたヒスタミンが調べられた。

図７．白血球からの後におけるＩＬ−８誘導ヒスタミン放出に関するＩＬ−８と の前インキュベートの効果。

前選択されたアレルギードナー４例からの白血球が異なる濃度のＩＬ−８と共に ５分間前インキュベートされ、しかる後Ｉ　Ｌ−８（１０−６Ｍ）で侵襲された 。誤差棒は明確化のため省略された（ＳＤ＜１％）。

図８．好塩基球に関するＩＬ−３、ＩＬ−８及びＧＭ−Ｃ５Ｆの組合せ作用とＭ ＮＣ−ＨＲＦとの比較。アレルギードナー７例からの白血球が細胞に同時に加え られたｒＬ−３（最終濃度１μｇ／ｍｌ）　、Ｉ　Ｌ　−８（１０−６Ｍ）及び ＧＭ−Ｃ５Ｆ　（１ａｇ／ｍｌ）と共にインキュベートされた。これら３種のサ イトカイン類によるヒスタミン放出はＭＭＣ−ＨＲＦによる場合と比較された。

ＩＬ−３、！Ｌ−８及びＧＭ−Ｃ５Ｆによるヒスタミン放出は各々ＳＣで３０％ 、７％及び７％、ＴＷで１５％、６％及び１２％並びにＢＷで１２％、６％及び ０％であった。他のドナーにおけるサイトカイン類による放出は無視しえた。

例 ■、物質及び方法 Ａ、試薬。

ＲＰＭ１１６４０はＮＹ、グランドアイランドのギブコ・ラボラトリーズ（ＧＩ ＢＣＯＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）から；ヒト血清アルブミン、グルタミン、フ ィコール、ハイパキュー、コンカナバリンＡＣＣｏｎ　Ａ）、ペニシリン、スト レプトマイシン、ＦＭＬＰ及び組換えＣ５ａはＭＯ，セントルイスのシグマ・ケ ミカルズ社（Ｓｉｇｍａ　Ｃｈｅｍｌｃａｌｓ　Ｃｏ、）から：へベスはＯＨ， クリーブランドのリサーチ・オーガニクス社（Ｒｅｓｅａｒｃｈ　Ｏｒｇａｎｌ ｃｓ、Ｉｎｃ、）から；ヒドロキシエチルデンプン〔ヘタスターチ（ＨｅｔａＳ ｔａｒｃｈ））はＣＡ。

アービンのアメリカン−７クゴウ（Ａｍｅｒｉｃａｎ　ＭｃＧａｖ）から；ヒト 組換えＩＬ−３及びヒト組換え内皮ＩＬ−８（Ｎ末端にアラニンを有する７７ア ミノ酸ペプチド）はＮＪ。

０−／キーヒルズのベブｏ−チク社（Ｐｅｐｒｏ　Ｔｅｃｈ、Ｉｎｃ、）から得 た。ＩＬ−３（５Ｘ１０６Ｕ＃＋ｇ）及びＧＭ−ＣＳＦ（１、７ｘ　１０７Ｕｈ ｇ）のサンプルはＭＡ、　ボストン。

ジェネティクス・インスティチニ）　（ｃｅｎｅｔ＋ｃｓＩｎｓｔｉｔｕｔｅ） からＤｒ、５ｔｅｖｅｎ　Ｃ１ａｒｋの好意により得た：ウサギ及びヒトＩｇＥ 血清（４６０，００Ｄ　ＩＵ／ｍｌ）はＮＹ。

サマビルのベージング・ジアグノスティクス（ＢｅｈｒｉｎｇＤｌａｇｎＱＳｔ ｌｅｓ）から得た。

Ｂ、ＨＲＦ含有上澄の生成 白血球を正常血液バンクドナーから得られたバフィーコートから単離した。ＭＮ Ｃを前記（Ｒ，ＡＩａｍ、ｅｔ　ａｌ、、Ｊ。

Ｃｌ１ｎ、１ｎｖｅｓｔ、、８２：２０５６（１９ＢＢ））のようにフィコール ＝ノ＼イパキュー勾配遠心により単離し、Ｃｏｎ　Ａ　（ＲＰＭ１１６４０培地 中２５μｇ培地９２フ８し、ハンクスの平衡塩類溶液で２回洗浄し、ＲＰＭ１１ ６４０培地に再懸濁し、しかる後７２時間培養した。上澄を回収し、ＹＭ−５フ イルター（ＭＷカットオフ５０００）を有するアミコン（ＡｓＩｃｏｎ）限外濾 過室を用いて５０倍に濃縮し、超遠心した。活性体の回収率は約５０〜６０％で あった。超遠心上澄をＴＳＫ２０００ゲル濾過カラムに適用した。ＨＲＦ活性体 含有分画（１５〜４　０　ＫＤ）をプールし、等分割した。一部を一７０℃で凍 結し、ＨＲＦ源として用いた。このｊｌＩＩＡ品のタンパク質濃度は８μｇ／ａ ｔであった。

Ｃ０末梢血白血球の単離 血液ドナーは我々の研究所でＨＲＦ，抗１ｇＥ及びＣ５ａに対するヒスタミン放 出に関してスクリーニングされたアレルギー及び非アレルギー者の大きな群から 選択した。アレルギー状態は臨床症状、過去のアレルギー歴及び局所エアロアレ ルゲン（３２種のアレルゲン）群に対する穿刺皮膚試験に対する陽性反応の存在 により規定した。

ドナーからの静脈血を１０ｗＭＥＤＴＡで凝固阻止し、室温で３０分間かけて１ ．５％ヒドロキシエチルデンプンで沈降させた（１？．ＡＩａｍ．ｅｔ　ａｌ． 、Ｊ．Ｃｌ１ｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．、８２：２０５Ｂ＜１９８８））。白血球に富 むバフィーコートを集め、冷却遠心機（４℃）においてＨＡ緩衝液（ｐＨ７．４ のへペス緩衝液及び０．０３％ヒト血清アルブミン）中３００Ｘｇで３回洗浄し た。洗浄された白血球をＨＡＣＭ緩衝液（ｐＨ７．４のヘベス緩衡液、０．０３ ％ヒト血清アルブミン、２ｍＭＣａＣｌ２及び１　ｍＭＭ　ｇ　Ｃ　Ｉ　２　） に懸濁した。

Ｄ．ヒスタミン放出アッセイ 一部５０μｇのＨＲＦ，抗Ｉ　ｇＥ　（１　：　３０００のストック溶液、４６ ０，０００１０／■１）又は組換えＩＬ−８（最終濃度：１０　〜１０ー６Ｍ） を振盪水浴中３７℃で４５分間にわたり白血球懸濁液５０μｇと共にインキュベ ートした。各実験は２重に行った。）ＩＡ緩衝液４００μｇをインキュベートの 最後に各チューブに加えた。インキュベート後に上澄を４℃で５分間にわたり６ ００Ｘｇで遠心により細胞から分離した。上澄のヒスタミン含有量は自動ケイ光 測定分析機を用いて測定した（Ｒ，ＡＩａｍ、ｅｔ　ａｌ、、Ｊ、ｃ目ｎ、Ｉｎ ｖｅｓｔ、、８２：２０５Ｂ（１９８ｇ））　、自発的ヒスタミン放出はＨＡＣ Ｍ緩衝液単独中で細胞をインキュベートすることにより評価した。細胞の全ヒス タミン含有量は細胞を３％過塩素酸で溶解させることにより測定した。ヒスタミ ン放出率は下記式に従い計算した：［（上澄中におけるヒスタミン）Ｘ１００） ／　（細胞中における全ヒスタミン）細胞からの自発的ヒスタミン放出率は通常 ５％以下であった。自発的ヒスタミン放出率の値は計算ヒスタミン放出値から減 算した。

Ｅ、ヒスタミン放出阻害アッセイ 阻害アッセイにおいて、細胞５０μｇアリコートを最初に室温で５分間にわたり 様々な希釈倍率のＩＬ−８（１０〜１０−６Ｍ）と共にインキュベートし、しか −１す る後５０μｇのＨＲＦ、抗１　ｇＥ　（１：　３０００希釈）、Ｉ　Ｌ　−３（ ｌμｇ／ｍｌ）　、Ｃ５ａ　（ｌμｇ／＊Ｉ）又はＦＭＬ。

Ｐ　（１：　３０００希釈）で別々に侵襲させた（示されたすべての濃度は最終 である）。次いで細胞を更に水浴中３７℃で４５分間インキュベートし、上澄を 遠心により分離した。上澄のヒスタミン含有量及び全細胞含有量は前記のように 調べた。

典型的実験プロトコールには以下がある：前インキュベート　侵襲 ａ、白血球士緩衝液　＋緩衝液 ｂ２白血球＋緩衝液　＋ＨＲＦ＊ Ｃ３白血球＋ＩＬ−８＋緩衝液 ｄ、白血球＋ＩＬ−８　＋ＨＲＦＩ ＊又は他の分泌促進物質 ヒスタミン放出の阻害率は下記式に従い計算した（１？。

ＡＩａｍ、ｅｔ　ａｌ、、Ｊ、Ｃｌ１ｎ、Ｉｎｖｅｓｔ、、８２：２０５６（１ ９８ｇ））　：（（ｂ−ａ）（ｄ−ｃ））Ｘ１００／　（ｂ−ａ）結果は平均± ＳＥＭとして表示されている。統計分析はウィルコクソンのランク合計試験で行 った。

１１．１Ｌ−８のヒスタミン放出阻害活性の証明ＩＬ−８の阻害活性を評価する ため、ＭＮＣ−ＨＲＦによるヒスタミン放出に関する白血球とサイトカインとの 前インキュベートの効果をアレルギードナー１０例及び非アレルギードナー１０ 例からの細胞で調べた。ＩＬ−８は２０例中１７例から得られた好塩基球からの ＨＲＦ誘導ヒスタミン放出を阻害した（図１）。２例の非阻害白血球サンプルを アレルギードナーから得た；他は非アレルギードナーから得た。しかしながら下 記セクション１１１で示されるように、アレルギードナー２例からの白血球はＩ Ｌ−８単独との接触で低レベルのヒスタミンを放出したが、但し正常ドナーから の細胞は放出しなかった。有意の阻害活性（〉１５％）が１０−９ＭでみられＩ Ｉ たが、一部のドナーではこれは１０　Ｍでみられた。

ヒスタミン放出の阻害は１０’Ｍにおいてアレルギー患者よりも正常者で有意に 高かった（５９±９％ｖｓ３１±７％、ｐｒｏ、０４、図１）。ＩＬ−８は抗Ｉ ｇＥ、ＦＭＬＰ及びＣ５ａで誘導されるヒスタミン放出に影響を与えない（図２ ）。

ＩＬ−３もアレルギー患者のサブグループからヒスタミン放出を引き起こした。

我々は我々の研究所においてルーチン血液ドナー３０例の中でＩＬ−３に応答す るアレルギー患者３例を確認した。下記研究はＩＬ−８が好塩基球からのＩＬ〜 ３誘導ヒスタミンを阻害するか否かについて調べるために実施した。３例すべて のドナーからの好塩基球をＩＬ−８によるＩＬ−３誘導ヒスタミン放出の阻害に 関して調べた。ＩＬ−８はドナー２例からのＩＬ−３誘導ヒスタミン放出を阻害 した。緩衝液と共に前インキュベートされた白血球からのＩＬ−３（１ａｇ／■ １）による放出はドナー１及びドナー２から各々４０±１％及び１５±０．５％ であった。白血球をＩＬ−８（１０〜１０−６Ｍ）と共に前インキュベートした 場合、ＩＬ−３による放出は最大濃度のＩＬ−８のとき各々３１±１％及び７± ０．３％であった。第三のドナーはいかなる阻害も示さなかった。この特定ドナ タミン放出の阻害がなかったため、ＩＬ−８に対して起こりつる非応答者である 。

ヒスタミン放出の最良阻害のため好塩基球とＩＬ−８との前インキュベートの必 要性についても試験した。我々のインビトロ系において、ＩＬ−８は細胞にＭＮ Ｃ−ＨＲＦと同時に加えられたか又はＭＭＣ−ＨＲＦの５分間後に加えられた場 合にいかなる阻害活性も示さなかった（図３）。ＩＬ−８の継続的存在が細胞と の前インキュベート後に必要であるか否かについて調べるため、白血球をＩＬ− ８と共に５分間前インキュベートし、３０倍容量の緩衝液で３回洗浄し、しかる 後ＭＮＣ−ＨＲＦで侵襲させた。図４で示されるように、その操作はＩＬ−８の 阻害効果を消失させなかった。

そのため、これらの結果はＩＬ−８が１０−９〜１０−８Ｍはどの低濃度でサイ トカイン誘導ヒスタミン放出の強力な阻害剤として作用することを立証した。

＋１１．Ｉ　Ｌ　−８のヒスタミン放出活性に関する研究前記結果は他の研究者 からの報告からみて意外であり（Ｍ、Ｖ、Ｉ／ｈｆｔｅ　ａｔ　ａｌ、、Ｉｇｇ ｕｎｏｌ、Ｌａｔｔ、、２２；１５１（１９８９）；Ｃ，Ａ。

Ｄａ旧ｎｄｅｎ　ｅｔ　ａｌ、、Ｊ、Ｅｘｐ、Ｍｅｄ、、１７０：１７８７（１ ９８９））、彼らはＩＬ−８がプロアレルギー細胞からのヒスタミン放出を誘導 又は増強できると結論付けていた。したがって、我々は前記の同ドナー２０例か らの好塩基球を用いて１Ｌ−８のヒスタミン放出活性について調べた。１０−１ １〜１０−ＢＭの濃度範囲を用いて、我々はヒスタミン放出阻害が観察された濃 度より１００〜１０００倍高い最大試験濃度（１０−６Ｍ）のときだけ非アレル ギードナ−１０例中２例及びアレルギードナー１０例中４Ｎから得られた好塩基 球からＩＬ−８がヒスタミンを放出させることを発見した。ヒスタミン放出は６ 〜１６％の範囲であり、平均は８，７±０．８％であった（図５）。実験は別々 に２回応答ドナー３例で繰返したところ、結果は再現された。ＩＬ−８の濃度を ３　Ｘ　１０−’Ｍ以内まで増加させることにより１５〜２０％範囲でヒスタミ ン放出に関してわずかな増加を観察することができた。比較のため、抗１ｇＥ及 びＭＮＣ−ＨＲＦは同ドナーから各々３４±７％及び５１±７％のヒスタミンを 放出させた。

好中球はＩＬ−８に関して高親和性のレセプター（好中球活性化ペプチド１とし ても記載される）を有する（Ｔ、Ｙｏｓｈｌｇｕｒａ　ｅｔ　ａｌ、、Ｐｒｏｃ 、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃ１．ＵＳＡ、８４：９２３３（１９８７））。我々 の白血球調製品は好中球を含有していたため、我々はＩＬ−８による好塩基球か らの低ヒスタミン放出が好中球へのサイトカインの強い結合によるのであろうと 仮定した。したがって、我々は２〜３％の好塩基球を含有した好中球に枯渇した 単核細胞調製品を用いて約６０％の好中球を含有した白血球調製品とＩＬ−８活 性について比較した。好中球に枯渇した単核細胞（好中球３％以下）をフィコー ル−ハイパキュー勾配（ｓｐ、ｇｒ、　１　、０７７　）により精製した。図６ で示されたように、好中球に枯渇した及び好中球に富む調製品で行われた同時実 験ではヒスタミン放出に関していかなる差異も示さなかった。

ＩＬ−８は選択されたドナーの細胞から少量のヒスタミンを放出させたため、我 々はＩＬ−８によるＨＲＦ誘導ヒスタミン放出の阻害が特異的脱感作（レセプタ ーの調節低下）によるのか否かについて調べるため下記実験を実施した。その実 験では、選択されたＩＬ−８応答ドナーから得られた白血球を様々な濃度のＩＬ −８と前インキュベートし、しかる後１０−ＢＭのＩＬ−８で侵襲させた。４実 験の結果は図７で示されている。中度の脱感作が低濃度のＩＬ−８においてドナ ー２例で観察されたが、結果は他の２例であいまいであった。しかしながらその 応答者の間であっても、非常に低いヒスタミン放出がＩＬ−８に対する細胞の接 触で得られ、このためその結果の解釈を複雑にした。

他の実験において、我々はＤａｈｉｎｄｅｎら（Ｊ、Ｅｘｐ、Ｍｅｄ、。

１７０：１７１１７（１９８９））により記載されたＩＬ−８誘導ヒスタミン放 出に関するＩＬ−３のブライミング効果について試験した。６例がＩＬ−８に応 答せず及び１例が応答したドナー７例からの白血球をＩ　Ｌ　−３（２５ｎｇ／ ａｔ）と５分間前インキュベートし、しかる後１０〜１０’Ｍの濃度でＩＬ−８ で侵襲させた。ヒスタミン放出は非応答ドナー６例からの細胞で観察されなかっ た。応答ドナー１例からの細胞はＩＬ−３及びＩＬ−８の相乗効果を示した。Ｉ Ｌ−８による放出率は各々１０　及び１０−６Ｍの濃度において５±０．１％及 び８±０，１％であった。

ＩＬ−３単独（２５ｎｇ／ｍｌ）では８±０．２％のヒスタミンを放出した。Ｉ Ｌ−３との前インキュベート、シかる後ＩＬ−８とのインキュベートでは各々２ ０±０，５％及び３２±１％のヒスタミン放出を起こした。この特定アレルギー ドナーは我々のドナーの中でヒスタミンの最大“放出者”であり、彼はＩＬ−３ 及びＩＬ−８の双方に応答する数人のドナーの中の一人でもある。

我々はＩＬ−３及びＧＭ−Ｃ５Ｆが選択されたドナーの好塩基球から高濃度（１ μｇ／■１）でヒスタミンを放出することを証明した（１？、ＡＩａｍ、ｅｔ　 ａｌ、、Ｊ、Ｉｓｍｕｎｏｌ、、Ｉ４２：３４３１（１９８９））。したがって 、我々はＩＬ−３、ＩＬ−８及びＧＭ−Ｃ８Ｆの組合せ作用がそれらドナーから の細胞において単核細胞由来ＨＲＦの活性と似ているか否かについて問うた。患 者７例を比較的高濃度のＩＬ−３（最終濃度１μｇ／＊＋）　、Ｉ　Ｌ　−８（ １０−’Ｍ）及びＧＭ−ＣＳＦ　（１μｇ／■１）を用いて試験した。アレルギ ー患者３例は有意量のヒスタミンを放出したが、但しＭＮＣ由来ＨＲＦよりも少 なかった。他のアレルギー者４例は！Ｌ−３、ＩＬ−８及びＧＭ−Ｃ８Ｆに応答 しなかったが、但しＭＭＣ由来ＨＲＦに応答してヒスタミンを放出した（図８） 。我々は健常コントロールからの好塩基球で何ら実験を実施しなかったが、それ は彼らの白血球が一般に前記のようにＩＬ−３、ＧＭ−Ｃ８Ｆ　（２）及びＩＬ −８に応答しないためである。逆に、ＭＮＣ由来ＨＲＦはほとんどの正常ドナー から得られた好塩基球からヒスタミンを放出させた。

臨床適用 あらゆる新薬の開発に必ず伴う予防処置のせいで、本発明は人体で臨床的にまだ 試験されていない。したがって、ヒスタミン放出を阻害するインターロイキン８ のインビトロ活性は、ヒスタミン放出アッセイがインビボヒスタミン放出の信頼 しつる相互関係として当業者により許容されていることから、薬理物質として本 発明の利用可能性を証明するために用いられた。下記子＃Ｊ！！様は様々な臨床 設定で本発明を実施するため本発明者らにより考えられた最良の様式を表す。

最初に、インターロイキン８は肥満細胞及び好塩基球が関与する多くの疾患、特 にアレルギー障害を治療する上で作用とわかるだろうと考えられる。特に、これ らとしては格別限定されず、気管支喘息、アレルギー性鼻炎、結膜炎及び尊麻疹 がある。その因子を投与する最良様式は具体的臨床状態に依存するが、その因子 はそれを適切な製剤賦形剤と一緒に処方してその処方剤を局所投与することで最 も容易に投与されるであろうと考えられる。

例えば、その因子は鼻内又は気管支内投与用のエアゾールの成分として処方でき る。これらのデリノ〈リー装置はフレオンで噴出されるように変えてもよい。こ の投与様式はあるアレルギー疾患、例えばアレルギー性鼻炎及び気管支喘息を治 療する上で特に有用であろう。その因子は皮膚又は目にも局所投与できるコニの 処方剤はこれらの部位でアレルギー疾患に有効とわかるであろう。一方、その因 子は静脈内、筋肉内、皮下、皮肉又は関節内注射用に処方してもよい；このよう な注射剤は好塩基球及び肥満細胞からの媒介物質放出の誘発が病因に関与するこ れらの部位において炎症反応を治療するために用いてよい。すべてのこれら処方 剤において、適切な賦形剤、例えば塩水又は生理緩衝液は当業者に公知であり、 使用してもよい。勿論一部のケースにおいては、この賦形剤中に保存剤を配合す ることが望ましいであろう。製剤ビヒクル中に治療剤を配合するための方法は当 業界の技術的範囲内にまさしく属すると考えられる。

前記のように、本発明は臨床的にまだ用ｔ）られて（１ない。本発明者らはイン ターロイキン８に関して許容される薬剤投薬量を予想する上で他のサイトカイン 類に関して公表された結果に依存した。エアゾールの最も関連した研究はウィル ス上部呼吸器感染を予防するための鼻内α　２−インターフェロンの使用であっ た。Ｄｏｕｇｌａｓら（Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌ、Ｊ、Ｍｅｄ、、３１４：６５（１９ １１６））及びＨａｙｄｅｎら（匠Ｅｎｇ１．Ｊｊｌｅｄ、、３１４ニア１（１ ９１ｉ８））は有効応答のために５×１０６国際単位（ＩＵ）／日を投与した。

このサイトカインは筋肉内又は皮下投与により３　Ｘ　１０　”　ＩＵ／日の用 量で毛様細胞性白血病の治療用に現在許諾されている。

Ｎａｔｈａｎら（Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌ、Ｊ、Ｍｅｄ、、３１５：６（１９１１８） ）は治療応答のため癩腫癩の患者に２０，０００〜２００．０ＯＯＵのインター フェロンγを皮内投与した。インターフェロンの開発及び臨床使用が最近Ｂａｒ ｏｎ、ｅｔ　ａｌ、。

Ｔｈｅ　Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ　Ｓｙｓｔｅｍ：　Ａ　Ｃｕｒｒｅｎｔ　Ｒｅｖ ｉｅｗ　ｔｏ　１９８７゜Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ　ｏｒ　Ｔｅｘａｓ　Ｐｒｅｓ ｓ、Ａｕ５ｔｉｎ　により考察されたＯＮｅｗ　Ｅｎｇｌ、Ｊ、Ｍｅｄ、、３１ ３：１４１１５（１９８５）で報告されたように、インターロイキン−２は８時 間にわたり１０４〜１０５単位八ｇの用量で及び３．３ｘ１０６／ｋｇ以内の最 大用量で癌患者に静脈内投与された。最後に、最近Ｖａｋｈａｎ−Ｒａｊら（Ｎ ｅｖ　Ｅｎｇｌ、Ｊ、Ｍｅｄ、、３１７：１５４５（１９１１７））はを髄形成 異常患者において有効応答のため１．５〜２５×１０６単位／Ｍ２体表面の用量 で持続的注入によりＧＭ−ＣＳＦを注射した。したがって、本発明者らはインタ ーロイキン８の有効用量が約１０４〜約１０７単位であろうと提案できる。更に 、本発明者らは伝統的方式で単位を規定する：１単位はＨＲＦ刺激好塩基球から のほぼ最大のヒスタミン放出の５０％を阻害する。特定の臨床適用で用いられる インターロイキン８の正確な用量は製薬業界の当業者にとり公知の許容された薬 学的方法で決定されねばならない。

前記の発明は特許法規の要求と説明及び実証の目的に従い特定の好ましい態様に 関するものであった。しかしながら、多数の修正及び変更が発明の範囲及び精神 から逸脱せずに行えることは当業者にとり明らかであろう。

参考文献 本出願は本発明のある面の理解又は実施を容品にするいくつかの参考文献を含ん でいる。この出願における参考文献の包含は考えられず、このような参考文献が 本発明に関して従来技術を表わすと承認するものではない。

好塩基球からのヒスタミン放出率％ 好塩基球からのヒスタミン放出率％ Ｆ■（、Ｅ３　凡例： 補正書の翻訳文提出書（特許部１８４条の８）平成　５　年　１　月　２２８−

Claims (11)

【特許請求の範囲】
1. １．プロアレルギー細胞をインターロイキン８と接触させることからなる、プロ アレルギー細胞からのアレルギー媒介物質のＨＲＦ誘導放出を阻害する方法。
2. ２．プロアレルギー細胞が肥満細胞からなる、請求項１に記載の方法。
3. ３．プロアレルギー細胞が好塩基球からなる、請求項１に記載の方法。
4. ４．アレルギー媒介物質がヒスタミンである、請求項１に記載の方法。
5. ５．方法がインビトロで実施される、請求項１に記載の方法。
6. ６．インターロイキン８がヒトインターロイキン８である、請求項１に記載の方 法。
7. ７．インターロイキン８が少くとも約１０−９Ｍの濃度で存在する、請求項１に 記載の方法。
8. ８．インターロイキン８が７７アミノ酸からなる、請求項１に記載の方法。
9. ９．インターロイキン８が７９アミノ酸からなる、請求項１に記載の方法。
10. １０．インターロイキン８が７２アミノ酸からなる、請求項１に記載の方法。
11. １１．ヒスタミン放出を阻害するためにプロアレルギー細胞を有効濃度のインタ ーロイキン８と接触させることからなる、プロアレルギー細胞からのアレルギー 媒介物質の放出を阻害する方法。