JPH06502406A - 脳中への細胞の移植方法およびそのための治療的使用 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 脳中への細胞の移植方法およびそのための治療的使用神経科学と医学の分野の本 発明は、神経学的疾患の治療に有用な、補乳類の脳中への細胞の移植方法に関す る。

背景技術の説明 神経細胞およびニューロン様細胞を脳中へ直接に移植することは、神経系の衰弱 性疾患、例えばパーキンソン病（ＰＤ）　、ハンチントン病ＣＨＤ）　、アルツ ハイマー病（Ａｆｔ）　、てんかん、および家族性自律神経異常症、並びに神経 系に対する損傷または外傷からの回復を促す具体的なアプローチであろう。脳中 に入れられた細胞の神経伝達物質の表現型発現に影響を与える因子をキャラクタ ライズすることは、神経系の通常の細部に関与するプロセスのより良い理解につ ながるであろうし、異常な表現型の発現より起こる生まれながらの欠陥を治療に より防止し矯正する手段を示すことにつながるであろう。

ニューロンまたはニューロン様細胞は、固体組織の塊または分散させた細胞のい ずれかの形で、中枢神経系（ＣＮＳ）、特に脳中に移植することができる。しか し、現在までのところ、技術的および倫理的性格の多くの問題が臨床的に実施可 能な移植法の開発を抑制してきた。

パーキンソン病（ＰＤ）はドーパミン作動性ニグロ線条体（ｎｉｇｒ。

５ｔｒｉａｔａｌ）ニューロンの選択的欠損から起こり、原質から線条体へのイ ンプットの欠如をもたらす。ドーパミンを産生しうる組織の固体移植片、例えば 成人の副腎髄質および胚の原質（ＳＮ）は、ドーパミン作動性細胞の破壊のため 、６−ヒドロキシドーパミン（６−ＯＨＤＡ）で処置したラットおよび霊長類へ の実験的な移植に広く用いられている（Ｄｕｎｎｅｔｔ、　Ｓ、Ｂ、　ｅｔ　ａ ｌ、、　Ｂｒａｉｎ　Ｒｅｓ、　２１５：１４７−１６１　（１９８１）：同上 、２２９：４５７−４７０　（１９８１）；　Ｍｏｒｉｓｈａ、　Ｊ、Ｍ、　ｅ ｔ　ａｌ、、　Ｅｘｐ、　Ｎｅｕｒｏｌ、　８４：６４３−６５４　（１９８４ ）；　Ｐｅｒｌｏｗ、　ＭＪ、　ｅｔ　ａｌ、、　５ｃｉｅｎｃｅ　２０４：６ ４３−６４７　（１９７９））　、胚ＳＮの移植も、ＰＤ様疾患を引き起こす神 経毒の１−メチル−４−フェニル−１，２，３，４−テトラヒドロピリジン（Ｍ ＰＴＰ）で損傷を受けた霊長類の治療に用いられた（Ｒｅｄｍｏｎｄ、　Ｄ、Ｅ 、　ｅｔ　ａｌ、、　Ｌａｎ、：ｅｔ　８４９０：１１２５−２７　（１９８６ ））。

５ｔｅｎｅｖｉら（Ｂｒａｉｎ　Ｒｅｓ、　１１４：１−２０　（１９７６）は 、神経移植片の生存のための最適条件を調べて、最上の結果が、（ａ）胎児ＣＮ Ｓニューロンを用いたときと、（ｂ）移植細胞を豊富な血管供給部分に隣接して 入れたときに得られることを発見した。実際、当文献の概説によれば、胎児脳の ほとんど全ての部分からの組織は、手順の詳細に注意を払えばうまく移植できる ことを明らかにしている（例えば、０１ｓｏｎ、　Ｌ、Ａ、　ｅｔ　ａｔ、、　 Ｉｎ：　Ｎｅｕｒａｌ　Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔｓ：　Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ　 ａｎｄ　Ｆｕｎｃｔｉｏｎ、　５ｌａｄｅｋ、　Ｊ、Ｒ，ｅｔ　ａｌ、、　ｅｄ ｓ、　Ｐｌｅｎｕｍ　Ｐｒｅｓｓ。

Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ、　１９８４．　ｐｐ、１２５−１６５を参照）。

胚の組織は外来環境において分化を起こし、宿主組織と一体化する細胞のすぐれ た供給源を提供する。例えば、６−０ＨＤＡで処置したラント中への胚ＳＮの移 植は、ドーパミンを産生し、アポモルフイン−またはアンフェタミン−誘導回転 を減少させ、感覚欠損を緩和し、宿主の線条体中でシナプスを作ることがわかっ た（上記のＤｕｎｎｅｔｔ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｍｏｒｉｓｈａ　ｅｔ　ａｌ、、 　Ｐｅｒｌｏｔｖ　ｅｔ　ａｌ、）　、移植されたニューロンも自発的な活性が あり、通常の成熟ＳＮニューロンに似ている（Ｗｕｅｒｔｈｅｌｅ、　Ｓ、Ｍ、 　ｅｔ　ａｌ、、Ｉｎ：　Ｃａｔｅｃｈｏｌａｍｉｎｅｓ、　ＰａｒｔＢ、　（ Ｅ、υ５ｄｉｎ　ｅｔ　ａｌ、、　ｅｄｓ。）、　Ａ、Ｒ，Ｌｉ５ｓ、　Ｉｎｃ 、、　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ、　ｐｐ３３３−３４１　）。

胎児神経組織の成功した移植とは対照的に、成熟ＣＮＳニューロンは移植組織中 で生き続けられないことが判明した（Ｓｔｅｎｅｖｉ、　Ｕｅｔ　ａｌ、　Ｂｒ ａｉｎ　Ｒｅｓ、　１１４：１−２０　（１９７６））　ｏ胎児ＣＮＳ二ｘ　ｏ ンは移植処置に耐えるのに対し、成熟ニューロンは耐えない理由は確がでないが 、おそらくいくつかの因子に関連している。第一に、胎児ニューロンは成熟ニュ ーロンよりも低い酸素量により影響を受けることが少なく　（Ｊｉｌｅｋ、　Ｌ 、、Ｉｎ＋　Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ　Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌｏｇｙ、Ｈｉｍ ｗｉｃｈ、Ｗ、Ａ、、ｅｄ、、Ｃ，Ｃ，Ｔｈｏｍａｓ　Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒ、Ｓ ｐｒｉｎｇｆｉｅｌｄ。

ＪＬ、　１９７０．　ｐｐ、　３３１−３６９）　、それに移植処置は移植片へ の十分な血液供給が確立するまで、酸素欠乏症の期間が必ず伴う。第二に、胎児 ニューロンは、急速な成長期の間で、かつ標的組織との連結が確立される前に採 取されるとき最もよく生き残るように思える（Ｂｏｅｒ、　Ｇ、Ｊ、　ｅｔ　ａ ｌ、、　Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ　１５：ｌ０８７−１１０９．　（１９８５ ））。

また、胎児組織は、損傷した宿主の脳の環境中に存在することが知られている成 長（または「生存」）因子に特に応答するようだ（Ｎｉｅｔｏ−Ｓａｍｐｅｄｒ ｏ、　Ｍ、　ｅｔ　ａｌ、、　５ｃｉｅｎｃｅ　２１７：８６０−８６１　（１ ９８２）；　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ　８１： ６２５０−６２５４　（１９８４））。

しかし、胎児組織と細胞移植片の有望的期待にもがかわらず、当該技術は、人間 医学で胎児組織の利用に付随する倫理的、道徳）　的および法律的問題のために 、移植用のドナー組織の代わりとなる供給源に関心が向けられることになった。

これらの供給源として、器官ドナーおよび培養細胞系からの神経細胞と傍神経細 胞がｔ　ある（例えば、Ｇａ５ｈ、　Ｄ、Ｍ、　ｅｔ　ａｌ、、　Ｉｎ：　Ｎｅ ｕｒａｌ　Ｇｒａｆｔｉｎｇ　ｉｎ　ｔｈｐ、　ｅ　Ｍａｍｍａｌｉａｎ　ＣＮ Ｓ、Ｂｊｏｒｋｌｕｎｄ、Ａ、ｅｔ　ａｌ、、ｅｄｓ、Ｅｌｓｅｖｉｅｒ、Ａｍ ｓｔｅｒｄａｍ、　１９８５．　ｐｐ、　５９５−６０３；　Ｇａ５ｈ、　Ｄ、 Ｍ、　ｅｔ　ａＪ、、　５ｃｉｅｎｃｅ　２３３：１４２０−２２　（１９８６ ）を参照）。

」、　移植法を用いる初期の臨床的実験は、長期にわたる効果をもたらさなかっ たが、ある研究の当初の報告は、より期待できるように思われた（Ｍａｄｒａｚ ｏ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｓａｃ、　Ｎｅｕｒｏｓｃｉ、　Ａｂｓｔｒ、　１２：５ ６３（１９８６）　、大要に関しては、参照によりここに引用されるＬｉｅｂｅ ｒｍａｎ、　Ａ、　ｅｔ　ａｌ、、　Ａｄｖ、　Ｔｅｃｈ、　５ｔａｎｄ、　Ｎ ｅｒｏｓｕｒｇ、　１７：６５−７６　（１９９０）を参照）。さらに別のいく つかの観察は、移植副腎細胞が実行可能なアプローチであることを示唆している 。副腎髄質細胞は神経稜に由来するもので、交換神経系ニューロンのように、イ ンビボまたはインビトロで突起を神経成長因子（ＮＧＦ）に応答して成長させる （Ｕｎｓｉｃｋｅｒ、　Ｋ、　ｅｔ　ａｔ、、　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃ ａｄ、　Ｓｃｉ、　ＩＪｓＡ　７５：３４９Ｂ−３５０２（１９７８））。幼若 ラットがらの副腎髄質の固体移植片は、８−０）ＩＤＡで処置されたラットの脳 中で少な（とも５カ月間生き続け、ドーパミンを作り、アポモルフイン誘導回転 を減少させることができる（上記のＤｕｎｎｅｔｔ　ｅｔ　ａｔ、　：　Ｆｒｅ ｅｄ、　Ｗｊ、　ｅｔ　ａｌ、。

Ａｎｎ、　Ｎｅｕｒｏｌ、　８：５１０−５１９　（１９８０）；　Ｆｒｅｅｄ 、　Ｗ、Ｊ、　ｅｔ　ａｌ、　５ｃｉｅｎｃｅ２２２：９３７−９３９　（１９ ８３））。これらの観察から、適当な環境が与えられれば、副腎髄質細胞は脳組 織中ヘカテコールアミン合成性の繊維を成長させる潜在能力を持つことが示唆さ れる。

クロム親和性細胞の神経分化の潜在能力は、ラット線条体中に導入されると突起 を成長させる解離した副腎クロム親和性細胞の移植によって更によく解明されて いる。培養された副腎髄質細胞もＮＧＦの存在下で培養すると、突起を有するニ ューロン様細胞に分化する（上記のＵｎｓｉｃｋｅｒ）。副腎細胞のこの注目す べき適応性は、形態学的のみならず、神経伝達物質の表現型の発現においても観 察されている。血管作動性腸ペプチド、ならびにモノアミン、セロトニンなどの 多数の神経ペプチド群が副腎髄質細胞中にカテコールアミンとともに共存して局 在している（Ｓｃｈｕｌｔｚｂｅｒｇ、　Ｍ。

Ｎｅｕｒｏｓｃｉ、　３：　１１６９−１１８６　（１９７８）；　Ｌｕｎｄｂ ｅｒｇ、　Ｊ、Ｍ、　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ。

Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ　７６：４０７９−４０８２　（１９７９））　 、これら多様な表現型の発現は外因性シグナルにより調整することができる。例 えば、エンケファリンおよびＶＩＰの発現は、動物をニコチン遮断薬で処置する ことによるインビボでの副腎の神経除去の後、またはインビトロで副腎細胞を維 持した後に増加する（Ｔｉｓｃｈｌｅｒ、　Ａ、Ｓ、　ＬｉｆｅＳｃｉ、　３７ ：１８８１−１８８６　（１９８５））　、これらの観察は、神経稜に由来する ニューロンが正常な発達の間に（Ｈａｈｎ、　Ｍ、Ｃ，ｅｔ　ａｌ、、　ＤｅＶ ｅｌ。

Ｂｉｏｌ、　８２：１−１０　（１９８１）；　Ｊｏｎａｋａｉｔ、　Ｇ、Ｍ、 　ｅｔ　ａｌ、　Ｄｅｖｅｌ、　Ｂｉｏｌ、　８８：２８８−２９６　（１９８ １））または微視的環境の実験的操作後に（ＬｅＤｏｕａｒｉｎ、　Ｎ、Ｍ、　 ５ｃｉｅｎｃｅ　２３１：１５１５−１５２２　（１９８６））表現型を変える ことができることを示す他の研究の観察と一緒に考えてみれば、将来的には、移 植の前および／または後で、移植された細胞により発現される神経伝達物質の表 現型をコントロールすることが可能になるこもしれないことを示唆するものであ る。

組織の塊に比較して、ばらばらにした細胞を移植することの別の利点は、移植前 に成長因子などの多様な物質とともに細胞を前もって培養できること、または分 化の特別なパラメータを促進する他の細胞もしくは物質とともに細胞移植を行な うことができることにある。さらに、ダリア細胞は特別な局所的効果を持ち、神 経成長因子を作ることができる（Ｂａｒｂｉｎ、　Ｇ、　ｅｔ　ａｌ、、　Ｄｅ ｖｅｌ、　Ｎｅｕｒｏｓｃｉ、　７：２９６−３０７　（１９８５）：　Ｓｃｈ ｕｒｃｈ−Ｒａｔｈｇｅｂ、　Ｙ、　ｅｔ　ａｌ、、　Ｎａｔｕｒｅ　２７３： ３０８−３０９　（１９７８）；　Ｕｎｓｉｃｋｅｒ、　Ｋ、　ｅｔ　ａｌ、　 Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、ＵＳＡ　８１：２２４２−２２ ４６　（１９８４）；　Ｗｈｉｔａｋｅｒ−Ａｚｍｉｔｉａ、　Ｐ、Ｍ、　ｅｔ ａｌ、、　Ｂｒａｉｎ　Ｒｅｓ、　４９７：８０−８５　（１９８９））　。こ のことは、ダリア由来の因子を産生ずる特定の型のダリアとともに所望の神経伝 達物質を提供する細胞を共移植することが、神経成長と移植細胞の所望の分化を 促進するかもしれないことを示唆している。

従って、移植方法の実施可能性は実験的に確立されている。しかし、この方法は 、限定された利用性と大きな政治的結果を有する胎児組織の使用の必要性により 厳しい限定を受けている。根本的に、中絶妊娠からのヒト胎児組織の移植はアメ リカ合衆国では禁止されている。従って、もし、成熟組織の脳中への移植の成功 のために、簡単で、日常的でしかも安全な方法が衰弱性神経疾患　。

の治療に利用できたとしたら、大きな利益を持ったことであろう。

Ａｅｂｉｓｃｈｅｒと彼の共同研究者は、選択的透過性の生体適合性ポリマーカ プセルを脳中に移植することに成功したが、これはこの環境において生き続ける ことのできる神経組織の断片をカプセル化したものである（Ａｅｂｉｓｃｈｅｒ 、　Ｐ、　ｅｔ　ａｌ、、　Ｂｒａｉｎ　Ｒｅｓ、　４４８：３６４−３６８　 （１９８８）；　Ｗｉｎｎ、　Ｓ、Ｒ，ｅｔ　ａｌ、、　Ｊ、　Ｂｉｏｍｅｄ　 Ｍａｔｅｒ　Ｒｅｓ、　２３：３１−４４　（１９８９）。ポリマーカプセルは 、ポリ塩化ビニルのアクリル性共重合体ＸＭ−５０からできていた。そのような 選択透過性材料は、宿主細胞によるカプセル化組織への侵入とおそらくは抗体と ウィルスによる侵入も膜の透過性に基づいて完全に防いだ。ドーパミン放出ポリ マー・ロッドをそのような選択透過性ポリマー中にカプセル化して、神経除去さ れたラットの線条体に移植したときに、実験的に誘導されたパーキンソン病症候 群の軽減が達成された（Ｗｉｎｎ　Ｓ、Ｒ，ｅｔ　ａｔ、、　Ｅｘｐ、　Ｎｅｕ ｒａｌ、　１０５：２４４−５０　（１９８９）。さらに、米国特許第４．８９ ２．５３８号（Ａｅｂｉｓｃｈｅｒ　ｅｔ　ａｌ、　１９９０年１月９日に公布 ）は、外部環境に存在するウィルス、抗体および他の有害な薬剤を排除するが、 神経伝達物質の拡散を可能にする半透性膜内の分泌細胞からなる、神経伝達物質 の輸送のために被験者に移植する細胞培養装置を開示している。半透性の膜はア クリル性共重合体、ポリフッ化ビニリデン、ポリウレタン、ポリアルギネート、 セルロースアセタール、ポリスルホン、ポリビニルアルコール、ポリアクリロニ トリル、またはそれらの誘導体または混合物からなり、分子量が５０　ｋＤまで の溶質の拡散を可能にするものである。この装置は、神経伝達物質、前駆体、ア ゴニスト、フラグメント等を標的領域、特に脳に、持続的に局所輸送することに よって、パーキンソン病などの神経伝達物質欠損状態の治療に有用であるといわ れている。この装置は、回収可能にすることができるので、内容物を新しくした り、補給することができ、そして細胞は免疫学的応答およびウィルス感染に対し て防御されている。

発明の要約 本発明者らは、最初に細胞をインビトロで支持体マトリックス、例えば直径９０ μｍのガラスピーズ上で培養することにより、成熟したＣＮＳニューロンまたは 培養細胞などの細胞を首尾よく哺乳類の脳に移植することができるという予期で きない発見をした。細胞が付着するビーズをレシピエンドの脳中に走触性的に注 入する。

このように注入された細胞は生存力を保ち、従って効果的に移植することができ る。種の障壁を超えて移植されたときでさえ、細胞はインビボで長期の生存と生 存力を示す。

本発明の目的は先行研究の上記の欠陥を克服することである。

本発明は、細胞が支持体マトリックスに付着するように細胞を支持体マトリック スとともに培養し、付着した細胞を有する支持体マトリックスを脳中に移植する ことからなる、哺乳類被験者の脳への細胞の移植方法を提供する。

本方法は、ガラスおよび他の酸化ケイ素、ポリスチレン、ポリプロピレン、ポリ エチレン、ポリアクリルアミド、ポリカーボネート、ポリペンテン、アクリロニ トリルポリマー、ナイロン、アミラーゼ、ゼラチン、コラーゲン、デキストラン およびセルロース（例えばニトロセルロース）などの天然および修飾多糖類、寒 天およびマグネタイトから作られた支持体マトリックスを含むものである。好適 な支持体マトリックスはビーズであり、特に直径が約９０から約１５０μｍまで のマイクロビーズである。

本発明の方法は、多くの異なるタイプの細胞、好適には神経または傍神経由来の 細胞、例えば副腎クロム親和性細胞を用いることができる。インビトロで生育さ せた細胞系も有用である。繊維芽細胞などの神経または傍神経に由来しない細胞 も、神経ペプチド、または神経伝達物質の生産に寄与する酵素または一組の酵素 、または神経成長因子をコードするＤＮＡによるトランスフェクション後に用い てもよい。

本発明は、上記の方法により、疾患を治療できる効果的な数の細胞を移植するこ とからなる、被験者の神経学的疾病の治療方法を包含するものである。本発明に より治療できる疾病には、パーキンソン病、アルツハイマー病、ハンチントン病 、てんかん、家族性自律神経異常症、および外傷性の脳損傷があるが、これらに 限定されるものではない。

図面の簡単な説明 図１は、ガラスマイクロビーズ上の成熟副腎髄質細胞を移植したラット脳の断面 図の光学顕微鏡写真である。この断面図は、チロシンヒドロキシラーゼ（ＴＨ） を西洋ワサビペルオキシダーゼを用いて組織化学的に固定・染色したものである 。暗く染色された部分は、ＴＨを含む細胞を示している。染色パターンは、切片 に入ったニードル管を右側に示している。中央の大きな円形染色部分は、移植さ れた細胞の塊を示している。注入された細胞は、一部がニードル管まで後方に延 びて、「腺様Ｊパターンを形成している。（厚さ、２０ミクロン；　倍率：１０ ０ｘ）好適な実施態様の説明 本発明は、通常は哺乳類の脳中に移植および生存のできない成熟細胞または培養 細胞を最初に支持体マトリックスに付着させることにより生存させることができ るという本発明者らの予期されなかった発見に基づいている。

多（の異なるタイプの細胞が本発明に有用である。典型的には、細胞はレシピエ ンドの脳に欠落している物質を提供する能力に基　゛づいて選択されるであろう 。欠落物質とは、神経伝達物質か他の神経活性分子であり、それらの欠如が神経 学的疾患か機能障害をもたらす物質である。移植された細胞は、一度しシピエン トに挿入されると腫瘍として成長しないことが重要である。

以下に挙げる文献は、特別に引用されるかどうかにかかわらず、参照により全て 本文中に引用されるものとする。

［神経または傍神経由来の」という用語は、胚神経稜に由来する細胞を意味する 。傍神経由来の細胞の好適な例は、副腎髄質クロム親和性細胞である。哺乳類の 副腎髄質の前駆体細胞は神経後に由来し、ニューロン系もしくは内分泌系の分化 に沿って発達する能力を有する（Ｂｏｈｎ、　Ｍ、Ｃ，ｅｔ　ａｌ、、　１９８ １．上記、　Ｄｅｖｅｌ、　Ｂｉｏｌ。

８９：２９９−３０８　（１９８２）；　Ｕｎｓｉｃｋｅｒ、　Ｋ、、　Ｄｅｖ ｅｌｏｐ、　Ｂｉｏｌ、　１０８：２５９−２６８　（１９８５））。ラット、 サル、およびヒトの副腎髄質からのクロム親和性細胞は、副腎皮質の影響から離 されて、神経成長因子（ＮＧＦ）にさらされると、内分泌腺表現型から神経表現 型に変化する（Ｎｏｔｔｅｒ、　Ｍ、Ｆ、　ｅｔ　ａｌ、、　Ｃｅ１ｌ　Ｔｉ５ ｓ、　Ｒｅｓ、　２４４：６９−７０　（１９８６）；　Ｓｔｒｏｍｂｅｒｇ、 ［、ｅｔ　ａｌ、、　ＥＸｐ、　Ｂｒａｉｎ　Ｒｅｓ、　６０：３３５−３４９ 　（１９８５）；　Ｕｎｓｉｃｋｅｒ、　Ｋ、　ｅｔ　ａｌ、、　１９７８上記 ）。副腎クロム親和性細胞は、大脳皮質組織または海鳥組織とともにラットの眼 の前室に共移植すると、共移植を受けた近接の脳組織を刺激し発達させる神経繊 維を形成する（Ｏｌｓｏｎ、　Ｌ、Ａ、　ｅｔ　ａｌ、、　Ｅｘｐ、　Ｎｅｕｒ ｏｌ、　７０：４１４−４２６　（１９８０））。もう一つの別のタイプの傍神 経細胞は網膜色素上皮細胞である（Ｓｏｎｇ、　Ｍ−Ｋ　ｅｔ　ａｔ、、　Ｊ、 　Ｃｅ１１．　Ｐｈｙｓｉｏｌ、　１４８：１９６−２０３　（１９９０））　 。

ドナー細胞の一つの供給源は、確立された神経細胞系である。

発生のモデル系として広く用いられてきた多くのニューロンクローンが存在する が、これは、これらクローンが適当な表面レセプター、特異的な神経伝達物質、 シナプス形成性および形態学的、生化学的に正常なニューロンに分化する能力を 持って、電気的活性があるためである。神経系はＣＮＳニューロンで見られる遺 伝的発現に対応する膨大な量の遺伝情報を発現することができる。そのような細 胞は以下の文献に記載がある：　Ｋｉｍｈｉ、　Ｙ、　ｅｔ　ａｌ、、　Ｐｒｏ ｅ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ　７３：４６２−４６６　（ １９７６）、Ｉｎ：　ＥｘｃｉｔａｂｌｅＣｅｌｌｓ　ｉｎ　Ｔｉ５ｓｕｅ　Ｃ ｕ１ｔｕｒｅ、　Ｎｅ１ｓｏｒ＋、　Ｐ、Ｇ、　ｅｔ　ａｔ、、　ｅｄｓ、、　 Ｐｌｅｎｕｍ　Ｐｒｅｓｓ、　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ、　１９７７、　ｐｐ、　１７ ３−２４５）；　Ｐｒａｓａｄ、　Ｋ、Ｍ、　ｅｔ　ａｌ、。

Ｉｎ：　Ｃｏｎｔｒｏｌ　ｏｆ　Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ　ｏｆ　Ａｎｉｍ ａｌ　Ｃｅ１ｌｓ、　Ｃ１ａｒｋｓｏｎ、　Ｂ。

ｅｔ　ａｌ、、　ｅｄｓ、、　Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂ ｏｒａｔｏｒｙ　Ｐｒｅｓｓ、　Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ、　Ｎ Ｙ、　１９７４．　ｐｐ、　５８１−５９４）；　Ｐｕｒｏ、　Ｄ、Ｇ、　ｅｔ 　ａｌ、、　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、ＵＳＡ　７３：３ ５４４−３５４８　（１９７６）；　Ｎｏｔｔｅｒ、　Ｍ、Ｆ。

ｅｔ　ａｌ、、　Ｄｅｖｅｌ、　Ｂｒａｉｎ　Ｒｅｓ、　２６：５９−６８　（ １９８６）；　５ｃｈｕｂｅｒｔ、　Ｄ、　ｅｔａｌ、、　Ｐｒｏｃ、　Ｎａ１ １．　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＬＩＳＡ　６７：２４７−２５４　（１９７０） ；　Ｋａｐｌａｎ。

Ｂ、Ｂ、　ｅｔ　ａｌ、＋　Ｉｎ：　Ｂａ５ｉｃ　ａｎｄ　Ｃ１１ｎｉｃａｌ　 Ａｓｐｅｃｔｓ　ｏｆ　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌｏｇｙ、　Ｇ ｕｆｆｒｉｄａ−３ｔｅｌｌａ、　Ａ、Ｍ、　ｅｔ　ａｌ、、ｅｄｓ、、　Ｍｉ ｌａｎｏ　Ｆｏｎｄｏｚｉｏｎｅ　Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ　Ｍａｎａｒｉ ｎｉ、　１９８２乃。

これら培養細胞の主要な利点は、表現型および遺伝子型をコントロールする際に 、環境ならびに細胞それ自体を操作する能力にある。

例えば、１）ＪＲ３２細胞系からのヒト神経芽細胞腫細胞が、移植後の９力月間 、霊長類の脳中で生き続けてコリン作動性マーカーを発現できる（Ｇａｓｈ、　 Ｄ、Ｍ、　ｅｔ　ａｌ、、　５ｃｉｅｎｃｅ　２３３：１４２０−２２　（１９ ８６））。これらの細胞は、好適には形態学的ならびに生化学的にインビトロで 分化するように処置され、移植前に、永久に熱系分裂とされなければならないが 、これは細胞の生存をさらに助けるものである（Ｇａｓｈ　ｅｔ　ａｌ、、上記 ；　Ｇｕｐｔａ、　Ｍ、　ｅｔ　ａｌ、、　Ｄｅｖ、　Ｂｒａｉｎ　Ｒｅｓ、１ ９：２１−２９　（１９８５））。

成熟ラットの線条体中に移植された未処理の褐色細胞腫／神経芽細胞腫の細胞（ ＰＣ１２細胞）は、インビボで２週間後の生存を示さなかった（Ｈｅｆｔｉ、　 Ｆ、　ｅｔ　ａｌ、、　Ｂｒａｉｎ　Ｒｅｓ、　３４８二２８３−２８８　（１ ９８５））が、ニューロン分化を促進するＮＧＦでインビトロで処置した後に細 胞増殖を抑制する抗有糸分裂剤にさらすことは、カテコールアミン神経伝達物質 の発現にも生存力にも有害な影響を与えず、移植後の刺激促進に価値があるもの である。従って、本発明の一つの実施態様において、細胞の生存を促しかつ悪性 能力９発現を防ぐために、細胞系の細胞は、適当な成長因子もしくは分化因子に より、および移植前に抗有糸分裂剤によりインビトロで調整される。

通常の方法を用いるインビトロのクローン細胞の神経細胞表面の試験により、本 発明に従って使用される適当な細胞の選択が可能であることは当業者にとって明 白であろう。正常な発生と分化ノ間に、ニューロン細胞の表面は、ＣＮＳ中での ニューロンの移動、認識および一体化の原因となる著しい変化を受ける。例えば 、マウスＣ１３００クローンのニューロン細胞系を、プロスタグランジンＥ、お よび環状ＡＭＰなどの抗有糸分裂剤または成長調節剤で処置すると、低分子量の 新しい細胞表面糖タンパク質が作られる（ＢＯｔｔｅｎｓｔｅｉｎ、　Ｊ、Ｅ、 、Ｉｎ：　Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｌｙ　Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｅｄ　Ｃｅ１ ｌ　Ｌｉｎｅｓ。

５ａｔｏ、　Ｇ、Ｈ，、ｅｄ、、　Ａｉａｎ　Ｒ，Ｌｉ５ｓ、　Ｎｅｗ　Ｙｏｒ ｋ、　１９８１）　ｏ破傷風毒素に結合するＣＮＳ表面ガングリオシドが誘導さ れるが（Ｎｏｔｔｅｒ、　Ｍ。

Ｆ、、　１９８６、上記）、一方、通常の中枢神経果糖タンパク質に類似する特 定のレクチン結合性糖タンパク質が現われる。さらに、神経伝達物質と神経ペプ チドに対する神経芽細胞腫細胞上のレセプターは、ＣＮＳ中に見られる細胞と類 似する方法により修飾することができる（Ｃｏｓｔａ、　Ｌ、Ｇ、　ｅｔ　ａｔ 、、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、　Ｐｈａｒ＋＋＋ａｃｏ１．９１：３４０７−３４１３ 　（１９８２））。

可能な移植材料のもう一つの重要な供給源は、単一ニューロンを不死化すること ができる方法である体細胞ハイブリダイゼーションによって作られた細胞である 。体細胞ハイブリダイゼーションは、多様な遺伝子型を持つ細胞系を作るための みならず、分化の多様な表現型の発現を調節する機構を分析するためにも用いら れる強力な細胞生物学的道具である。特定遺伝子の発現が異なる細胞を融合する ことは、遺伝子発現を調節する機構の研究を可能にするが、染色体の変更が遺伝 学的に異なる細胞系を作る率で生じる。分化した細胞の性質を保持するハイブリ ッド細胞を形成することができる。交感神経節と神経芽腫細胞の融合から得られ るハイブリッドはドーパミンを合成することができるが（Ｇｒｅｅｎｅ。

Ｌ、Ａ、　ｅｔ　ａｌ、、　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｃｌ、　Ｓｃｉ、 ＵＳＡ　８２：４９２３−４９２７　（１９７５））、脳細胞ハイブリッドはコ リンアセチルトランスフェラーゼを発現する（Ｍｉｎｎａ、　Ｊ、Ｄ、　ｅｔ　 ａｌ、、　Ｇｅｎｅｔｉｃｓ　７９：３７３−３８３　（１９７５））。従って 、ＣＮＳからのドーパミン作動性ニューロンに対する胚前駆体は分裂細胞と融合 して、経時的に余分な染色体を失う単一のゲノム中に両方のゲノムを取り込んで 、新しいハイブリッド系となる。そのようなハイブリッドの神経または傍神経の 細胞を過度の実験を行なうことなしに作り、それらを所望の特質、例えばドーパ ミン分泌についてスクリーニングし、移植に最高の能力を持つ細胞を選択するこ とは当業者の技量の範囲内にある。

本発明による移植のための細胞のもう一つの供給源は、副腎髄質である。神経稜 に由来するこの組織は、ＰＤを治療するための臨床的試験に関与している（「背 景」を参照）。成熟したサルの副腎髄質はインビトロで少なくとも約３週間、単 一の細胞として培養することができる（Ｎｏｔｔｅｒ、　Ｍ、Ｆ、　ｅｔ　ａｌ 、、　Ｃｅ１ｌ　Ｔｉ５ｓ、　Ｒｅｓ、　２４４：６９−７６　（１９８６）） 。これら細胞は、上皮様、線状の形態から、細胞が微細管アレイを含む広範な神 経突起の分岐を示すニューロンの形態への表現型の変化により、ＮＧＦに応答す る。このニューロンの表現型は、宿主ＣＮＳ中でのラット髄質細胞の長期生存お よびそれら細胞の宿主組織との一体化に重要であるように思われる（上記Ｓｔｒ ｏｍｂｅｒｇ、　Ｌ、　ｅｔ　ａｌ、）　ｏ移植された副腎髄質組織は、ラット におけるニグロ線条体ドーパミン欠損から起こる機能的欠損を治すことができる （例えば、上記Ｆｒｅｅｄ　ｅｔ　ａｌ、、　１９８１を参照）。

しかし、これは、移植の３〜６力月後に減少する現象である移植片からのドーパ ミンの拡散によりもたらされると考えられる。移植細胞のＮＧＦ処理は、移植片 から宿主への繊維成長を誘導して、さらに長く続く挙動の回復（少なくとも１年 間）を誘導する。実際、ＮＧＦ処理なしには、ラット（上記Ｆｅｅｄ　ｅｔ　ａ ｌ、）またはアカゲザルの尾細胞核（Ｍｏｒｉｈｉｓｉａ、　Ｊ、Ｍ、　ｅｔ　 ａｌ、、　Ｅｘｐ、　Ｎｅｕｒｏｌ、　８４：６４３−６５３　（１９８４）） のとちらかに先行技術の手法を用いて移植されたクロム親和性細胞は、はとんど が生き続けることがない。同じように、網膜色素上皮細胞は、ドーパミンと他の 因子を分泌し、本発明による脳移植に用いてもよい（Ｌｉ、　Ｌ、　ｅｔ　ａｌ 、、　ＥＸＩ）、　Ｅｙｅ　Ｒｅｓ。

４７：７７１−７８５　（１９８８）：　Ｌｕｉ、　Ｇ、Ｍ、　ｅｔ　ａｌ、、 　Ｐｒｏｃ、　Ｉｎｔ’１．　Ｓｏｃ、　ＥｖｅＲｅｓ、　６：１７２　（１９ ９０）；　Ｌｉ、　Ｌ、　ｅｔ　ａｌ、、　Ｉｎｖ、　０ｐｈｔｈａ１．　Ｖ’ ｓ、　Ｓｃｉ。

３１（Ｓｕｐｐｌ）：５９５　（１９９０，ａｂｓｔｒ、　２９１５−１３）； 　５ｈｅｅｄｌｏ、　Ｈ，Ｊ、　ｅｔ　ａｌ。

、同論文中、　ａｂｓｔｒ、　２９１６−１４；　Ｆｅｋｔｏｒｏｖｉｃｈ、　 Ｅ、Ｇ、　ｅｔ　ａｌ、、同論文中（ａｂｓｔｒ、　２９１７−１５）；上記Ｓ ｏｎｇ、　Ｍ−Ｋ　ｅｔ　ａｌ））。

本発明に従って哺乳類の脳中に移植された細胞は、成長因子の添加がない状態で 生存を示した。しかし、本発明のさらに別の実施態様は、移植前にインビトロで 、移植後にインビボで、またはその両方で、適当な成長／分化因子による処置と 組み合わせた支持体マトリックス付着細胞の移植に向けられている。

ヒト副腎髄質細胞は、ニューロン表現型を有して少なくとも９週間インビトロで 維持することができる（Ｎｏｔｔｅｒ、　Ｍ、Ｆ、　ｅｔ　ａｌ、。

５ｃｈｔｎｉｔｔ　Ｎｅｕｒｏｌ、　Ｓｃｉ、　Ｓｙｍｐ、、　Ｊｕｎｅ　３０ ．１９８７．　ａｂｓｔｒ、）　。ＮＧＦはこの変換を線状の状態から誘導する 。Ｃ６神経膠腫細胞とともに培養された副腎髄質細胞は、広範な神経突起の分校 を示し、かつ神経膠腫細胞との密接な接触を示す。有糸分裂を抑制するために、 抗有糸分裂剤で処理したこれらの星状膠細胞は、インビトロて交感神経ニューロ ンを支持するＮＧＦに似た成長因子を産生ずることが知られている（Ｂａｒｄｅ 、　Ｙ、Ａ、、　Ｎａｔｕｒｅ　２７４：８１８　（１９７８））　、移植され たダリア細胞は、ニューロンの機能回復に重要な役割を果たしているかもしれな いし、栄養因子の重要な供給源かもしれない（Ｄｏｅｒｉｎｇ、　Ｌ、Ｃ，ｅｔ 　ａｌ、、　Ｊ、　Ｎｅｔ＋ｒｏｌｏｇ、　Ｓｃｉ、　６３：１８３−１９８　 （１９８４）；　Ｇｕｍｐｌｅ、Ｊ、ｅｔ　ａｌ、、Ｎｅｕｒｏｓｃｉ、Ｌｅｔ ｔ、３７：３０７−３１１　（１９８４））。従って、本発明のもう一つの実施 態様は、神経または傍神経の細胞をダリア細胞とともに培養し、それら細胞を支 持体マトリックスとともにインキュベートして、その後に両方のタイプの細胞を 有する支持体マトリックスを移植することからなるものである。

本発明のさらに別の実施態様では、神経もしくは傍神経に由来しないが、神経学 的興味のある物質を産生ずるように変更された細胞を用いる。好適なタイプの細 胞は入手および培養が簡単で、本発明の方法を用いたラット脳中への移植で生き 続けるヒト包皮繊維芽細胞である（例Ｉ１１を参照）。本発明で使用するために 、細胞は、公知の方法を用いて遺伝学的に変更して、神経成長因子、神経伝達物 質、神経ペプチド、または脳の代謝に関与する酵素を発現させる。（例えば、Ｇ ａｇｅ、　Ｆ、Ｈ，ｅｔ　ａｌ、、　Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ　２３ニア９５ −８０７　（１９８７）；　Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ、　Ｍ、Ｂ、　ｅｔ　ａｌ、、 　５ｃｉｅｎｃｅ　２４２：１５７５−１５７８　（１９８８）；　Ｓｈｉｍｏ ｈａｍａ、　Ｓ、　ｅｔ　ａｌ、、　Ｍｏ１．　Ｂｒａｉｎ　Ｒｅｓ、　５：２ ７１−２７８（１９８９）を参照；　これらは参照によりここに引用される）。

参照によりここに引用される組換えＤＮＡ技術と細胞生物学の一般原理を説明す る標準的な文献として、Ｗａｔｓｏｎ、　Ｊ、Ｄ、、　ｅｔ　ａｌ、、　Ｍ。

Ｉｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ　ｏｆ　ｔｈｅ　Ｇｅｎｅ、Ｖｏｌｕｍｅｓ　 Ｉ　ａｎｄ　ＩＩ、Ｂｅｎｊａｍｉｎ／ＣｕＣｕｍｍ１ｎ　Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎ ｇ　Ｃｏ、、　Ｉｎｃ、、　Ｍｅｎｌｏ　Ｐａｒｋ、　ＣＡ　（１９８７）；　 Ｄａｒｎｅｌｌ、　Ｊ、Ｅ、　ｅｔ　ａｌ、、　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｃｅ１ｌ 　Ｂｉｏｌｏｇｙ、　５ｃｉｅｎｔｉｆｉｃ　Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ｂｏｏｋｓ、 　Ｉｎｃ、、　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ、　ＮＹ　（１９８６）；　Ｌｅｗｉｎ、　Ｂ 、Ｍ、、　Ｇｅｎｅｓ　ＩＩ。

Ｊｏｈｎ　Ｗｉｌｅｙ　＆　５ｏｎｓ、　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ、　ＮＹ　（１９８ ５）；　Ｏｌｄ、　Ｒ，Ｗ、　ｅｔ　ａｌ、。

Ｐｒ１ｎｃｉｐｌｅｓ　ｏｆ　Ｇｅｎｅ　Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｏｎ：　Ａｎ　 Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ　ｔｏ　Ｇｅｎｅｔｉｃ　Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ、 ２ｎ４　Ｅｄ、、［Ｊｎｉｖｅｒｓｉｔｙ　ｏｆ　Ｃａ１ｉｆｏｒｎｉａ　Ｐｒ ｅｓｓ、Ｂｅｒｋｅ！ａｙ、ＣＡ　（１９８１）＋　Ｍａｎｉａｔｉｓ、Ｔ、、 ｅｔ　ａｔ、（Ｍｏｌｅｌｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ：　Ａ　Ｌａｂｏｒａｔ ｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｐｒｅｓｓ、 Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ、ＮＹ　（１９８２））：　Ｓａｍｂｒ ｏｏｋ、Ｊ、ｅｔ　ａｌ、（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ：　Ａ　Ｌａ ｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ、２ｎｄ　Ｅｄｉｔｉｏｎ、Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒ ｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ、 ＮＹ　（１９８９）　ａｎｄ　Ａｌｂｅｒｓ、Ｂ、ｅｔａｌ、、Ｍｏ１ｅｃｕｌ ａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ　ｏｆ　ｔｈｅ　Ｃｅ１ｌ、２ｎｄ　Ｅｄ、、Ｇａｒｌａ ｎｄ　Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ、Ｉｎｃ、、　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ、　ＮＹ　（１９ ８９）などがある。

本発明の方法に有用な組換えＤＮＡ分子は、多様ないかなる手段、例えばＤＮＡ またはＲＮＡ合成、またはより好適には組換えＤＮＡ技術の適用により作ること ができる。そのような分子の合成技術は、例えば、Ｗｕ、　Ｒ，、ｅｔ　ａｌ、 　（Ｐｒｏｇ、　Ｎｕｃｌ、　Ａｃ１ｄ、　Ｒｅｓ、　Ｍｏ１ｅｃ、　Ｂｉｏｌ 。

２１：１０１１４１　（１９７８））に開示がある。組換え分子を構築する手順 は、上記のｓａｍｂｒｏｏｋらにより詳しく開示されている。

典型的には、対象の遺伝子または複数の遺伝子を（該遺伝子を発現することので きる細胞からの）　ＤＮＡ、より好適にはｃＤＮＡを発現ベクター中にクローニ ングすることにより作製した発現ベクターのライブラリーからクローン化する。

次に、そのライブラリーから、対象の遺伝子産物に特異的な抗体と結合する抗体 を用いて、遺伝子産物、例えば神経伝達物質合成酵素を発現することのできるメ ンバーのスクリーニングを行なう。対象の遺伝子産物を発現することのできる細 胞から、ＤＮＡ、より好適にはｃＤＮＡを抽出精製する。精製ｃＤＮＡを断片化 しく剪断、エンドヌクレアーゼ消化等による）、ＤＮＡまたはｃＤＮＡフラグメ ントのプールを作る。次に、このプールからのＤＮＡまたはｃＤＮＡのフラグメ ントを発現ベクターにクローン化して、それぞれが唯一のクローン化ＤＮＡまた はｃＤＮＡのフラグメントを含む発現ベクターのライブラリーを作る。

「発現ベクター」とは、ベクター中にクローン化されたＤＮＡ（またはｃＤＮＡ ）分子を（適当な転写および／または翻訳調節配列の存在のために）発現するこ とができ、それにより、ポリペプチドまたはタンパク質を生産することのできる ベクターである。発現ベクターを適当な宿主細胞に導入すると、クローン化され た配列の発現が起こる。適当な哺乳類の宿主細胞は、クローン化された配列を発 現できればいかなる哺乳類の細胞であってもよい。ｃＤＮＡの調製手順と遺伝子 ライブラリーの作製手順は、ＳａｍｂｒＯＯｋら（上記）により開示されている 。

本発明のために発現が望まれる産物もしくは複数の産物をコードするＤＮＡ配列 は、連結のための平滑末端または付着末端、適当な末端を作る制限酵素消化、適 宜に付着末端の修復、望まれない連結を避けるためのアルカリ性ホスファターゼ 処理、および適当なりガーゼによる連結などの通常の手法に従ってベクターＤＮ Ａに再結合できる。そのような操作技術は、上記のＳａｍｂｒｏｏｋらにより開 示されており、当業者にはよく知られているものである。

ＤＮＡなどの核酸分子は、もし、それが転写および翻訳調節情報を含むヌクレオ チド配列を含み、そのような配列がポリペプチドをコードするヌクレオチド配列 に「操作可能に連結されている（ｏｐｅｒａｂｌｙ　１ｉｎｋｅｄ）　Ｊならば 、ポリペプチドを「発現することができる」と言われる。操作可能な連結とは、 調節ＤＮＡ配列と発現を望むＤＮＡ配列とが遺伝子発現を可能にするように結合 している連結である。遺伝子発現に必要な調節領域の正確な性質は生物により異 なるであろうが、原核生物においては、（ＲＮＡ転写を開始させる）プロモータ ーとＲＮＡに転写されたときにタンパク質合成開始のシグナルを出すＤＮＡ配列 の両方を含むプロモーター領域から一般には成るものである。そのような領域と しては、通常、転写および翻訳の開始に関与する５°−非コード配列、例えばＴ ＡＴＡボックス、キャッピング配列、ＣＡＡＴ配列などがある。。

所望ならば、タンパク質をコードする遺伝子配列の３°側の非コード領域を上に 記載の方法により得ることができる。この領域は、終止およびポリアデニル化の ようなその転写終止調節配列のために保持されているようだ。従って、タンパク 質をコードするＤＮＡ配列にもともと近接する３−領域を保持することにより、 転写終止シグナルが提供できよう。転写終止シグナルが、発現宿主細胞中で十分 に機能しない場合は、宿主細胞中で機能する３′領域と置換してもよい。

２つのＤＮＡ配列（例えば、プロモーター領域配列とコード配列）は、もし、そ の２つのＤＮＡ配列間の連結の性質が、（１）フレームシフト変異の導入をもた らさず、（２）コード配列の転写を指示するプロモーター領域配列の能力を妨げ ないか、（３）プロモーター領域配列により転写を受けるコード領域の能力を妨 げないならば、操作可能に結合されていると言える。プロモーター領域は、もし そのプロモーターがＤＮＡ配列の転写に影響を与えることができたとすると、Ｄ ＮＡ配列に操作可能に結合されているといえよう。従って、タンパク質を発現す るためには、宿主細胞により認識される転写および翻訳シグナルが必要である。

プロモーターは、ＲＮＡポリメラーゼに結合することができ、「操作可能に連結 された」核酸配列の転写を促進することのできる２本鎖のＤＮＡもしくはＲＮＡ 分子である。ここで用いる場合、「プロモーター配列」は、ＲＮＡポリメラーゼ により転写されるＤＮＡがＲＮＡＮ玉鎖上在するプロモーターの配列である。［ プロモーター配列相補体」は、その配列が「プロモーター配列」の相補体である 核酸分子である。従って、一本鎖「プロモーター配列相補体」に隣接するプライ マーＤＮＡもしくはＲＮＡの伸長、すなわち「プロモーター配列Ｊの伸長の際に 、もし、その伸長が「プロモーター配列」または「プロモーター配列相補物」に 向がって進むならば、機能的プロモーターを含む２本鎖分子が作られる。この機 能的プロモーターは、「プロモーター配列」を含む２本鎖分子の鎖（［プロモー ター配列相補体」を含む分子の鎖ではない）に操作可能に連結した核酸分子の転 写を指示するであろう。

本発明のための細胞作製に有用なプロモーター配列は、真核細胞もしくはウィル ス性のどちらかである。適当なプロモーターは抑制的か、または、より好適には 構成的なものである。有用な真核細胞のプロモーターとして、マウス・メタロチ オネインＩ遺伝子のプロモーターがある（Ｈａｍｅｒ、　Ｄ、、　ｅｔ　ａｌ、 、　Ｊ、　Ｍｏ１．　Ａｐｐｌ、　Ｇｅｎ、　１：２７３−２８８　（１９８２ ））　；　ｔｈｅ　ＴＫ　ｐｒｏｍｏｔｅｒ　ｏｆ　Ｈｅｒｐｅｓ　ｖｉｒｕｓ 　（ＭｃＫｎｉｇｈｔ、　Ｓ、、　Ｃｅ１ｌ　３１：３５５−３６５　（１９８ ２））；　ｔｈｅ　ＳＶ４０　ｅａｒｌｙ　ｐｒｏｍ。

ｔｅｒ　（Ｂｅｎｏｉｓｔ、　Ｃ，、ｅｔ　ａｌ、、　Ｎａｔｕｒｅ　（Ｌｏｎ ｄｏｎ）　２９０：３０４−３１０　（１９８１））。好適なプロモーターは、 特にヒト繊維芽細胞用としては、コラーゲンプロモーターである（Ｐｒｏｃｋｏ ｐ、　Ｄ、Ｊ、　ｅｔ　ａｌ、、　Ｎ、　Ｅｎｇ。

Ｊ、　Ｍｅｄ、　３０１：１３−２３．７７−８５　（１９７９）；　Ｅｙｒｅ 、　Ｄ、Ｒ，、５ｃｉｅｎｃｅ　２０７：１３１５−１３２２　（１９８０）； 　Ｍａｒｔｉｎ、Ｇ、Ｒ，ｅｔ　ａｌ、、Ｔｒｅｎｄｓ　Ｂｉｏｃｈ、Ｓｃｉ、 １０：２８５−２８７　（１９８５）　；これら文献は参照によりここに引用さ れる）。

本発明に従って支持体マトリックスに付着させた細胞も、本発明の範囲に入るこ とが意図されるもので、これらは公知の方法を用いて凍結して凍結状態で保存す る。解凍後、マトリックスに結合した細胞はレシピエンド脳中に移植する。

本発明の方法に有用な細胞は異種発生のもの（＝異種、すなわち宿主とは異なる 種に由来するもの）、同種間のもの（＝相同、すなわちレシピエンドと同じ種の 遺伝的に異なるメンバーに由来するもの）または自己由来のもの（ここではレシ ピエンドもドナーとしても役立つ）でもよい。

本発明の目的を達成するために必要とされる細胞の数は、被験者のサイズ、年令 、体重、内在する病気の性質、同時に行なわれている他の治療等により変えるこ とができる。このことは、過度の実験を必要とせずに当業者により決定すること ができる。ヒト成人において、支持体マトリックスに付着させた細胞の効果的な 数は、約ｌＸＩＯ３〜約ｌＸｌ０’細胞の範囲にあり、より好適には約５×１０ ３〜約ｌＸｌ０’細胞の範囲にある。その代わりとしては、移植細胞の効果的な 量は、ビーズの体積に加えられた細胞の量に基づいて決定することができ、例え ばビーズ１　ｍｌにつき４０１０ｇの細胞Ｉである。

支持体マトリックスを構成することのできる材料としては、インビトロのインキ ュベーション後に細胞が吸着し、その上で細胞が成長でき、移植細胞を破壊する か細胞の生物学的または治療的活性に干渉する毒性反応、炎症または神経膠症反 応を起こさすに哺乳類の脳中に移植することができる材料がある。そのような材 料として、ガラスおよび他の酸化シリコン、ポリスチレン、ポリプロピレン、ポ リエチレン、フッ素化ポリビニリデン、ポリウレタン、ポリアルギネート、ポリ スルフォン、ポリビニルアルコ−ルボネート、ポリペンテン、ナイロン、アミラ ーゼ、ゼラチン、コラーゲン、デキストランおよびセルロース（例えばニトロセ ルロース）などの天然および修飾多糖類、寒天、およびマグネタイトがあるが、 これらに限定されるものではない。再吸収性または非再吸収性の材料も用いるこ とができる。

本発明の支持体マトリックスは、Ａｅｂｉｓｃｈｅｒと彼の共同研究者に記載さ れたもの（上記参照）とは以下の点において異なる二本発明に従うと、細胞は支 持体の外側表面に付着する；　細胞は、閉じられた室内にカプセル化されてはお らず、この室内においては、開示されたカプセル化支持体の排除容量を所与のも のとすると、細胞の生存は疑わしいものとなるであろう。さらに、本発明の支持 体マトリックスは、低分子量物質は通過させるが巨大分子（＞５０　ｋＤ）は排 除させるＡｅｂｉＳＣｈｅｒ装置の選択的透過性などの材料が特別な透過性を持 つという必要要件を提出しない。

支持体の形状は、好適にはビーズなどの球状であるが、円柱状、長円形、平坦シ ートまたはストリップ、針またはピンの形等々であってもよい。支持体マトリッ クスの好適な形態はグラスビーズである。もう一つの好適なビーズはポリスチレ ンビーズである。

ビーズの大きさは、直径が約１０μｍｘ１ｃｍ、好適には約９０〜１５０μｍの 範囲にある。多様なマイクロキャリアー・ビーズの記載については、例えば、Ｆ ｉｓｈｅｒ　Ｂｉｏｔｅｃｈ　５ｏｕｒｃｅ　８７−８８．　Ｆｉｓｈｅｒ　５ ｃｉｅｎｔｉｆｉｃ　Ｃｏ、、　１９８７．　ｐｐ、７２−７５：　Ｓｉｇｒｎ ａ　Ｃｅ１ｌ　Ｃｕ１ｔｕｒｅ　Ｃａｔａｌｏｇ、　Ｓｉｇｍａ　Ｃｈｅｍｉｃ ａｌ　Ｃｏ、、Ｓｔ、Ｌｏｕｉｓ、１９９１．　ｐｐ、１６２−１６３；　Ｖｅ ｎｔｒｅｘ　Ｐｒｏｄｕｃｔ　Ｃａｔａｌｏｇ、　Ｖｅｎｔｒｅｘ　Ｌａｂｏｒ ａｔｏｒｉｅｓ、　１９８９を参照：　これらを引き起こすかもしれない神経膠 症などの望まれない宿主反応のビーズによる刺激・促進により決まる。そのよう な限定は当業者により容易に決定できるものである。

細胞の付着、生存および機能を向上させるために、細胞の吸着、生存および機能 を向上させることが公知のファクターを固体マトリックスの外部表面に随意に被 覆してもよい。そのようなファクターとして、細胞付着分子、細胞外マトリック ス、例えばフィブロネクチン、ラミニン、コラーゲン、エラスチン、グリコサミ ノグリカン、またはプロテオグリカン（上記のＡｌｂ−ｅｒｓ、　Ｂ、　ｐｐ、 　８０２−８３４を参照）または成長因子、例えばＮＧＦなどがある。その代わ またはその複数の因子をマトリックス材料中に取り込むことができ、移植後にイ ンビボで除々に放出されるであろう。

本発明の別の実施態様において、再吸収性マトリックス（例えばコラーゲン）上 で生育する細胞は、神経再成長か回復を促進するために、脳以外の神経学的に興 味のある部位に移植することができる。例えば、本発明のマトリックスに結合し た細胞は、を社中に移植してもよいし、視覚神経中もしくはそれに隣接して入れ てもよい。

本発明の方法は、多くのヒト神経学的疾患の治療に有用である。

パーキンソン病は、本発明に従いドーパミン生成細胞を宿主の線条体に移植する ことにより治療することができる。アルツハイマー病（ＡＤ）は、核バサリス（ ｂａｓａｌｉｓ）のコリン作動性細胞の欠損が関与する。従って、本発明により 、ＡＤを有するかその危険がある対象体にアセチルコリンを作る細胞を移植して もよい。

ハンチングトン病は、尾（ｃａｕｄａｔｅ）の核と被殻（ｐｕｔａｍｅｎ）のヘ ッドの全体的な消耗が関与するもので、通常は編目の中程度の病気を伴う。ハン チングトン病に苦しむ被験者は、神経伝達物質であるガンマアミノ酪酸（ＧＡＢ Ａ）　、アセチルコリン、またはその混合物を作る細胞の移植により治療するこ とができる。本発明によれば、そのような細胞が結合する支持体マトリックス材 料は、好適には尾と被殻に移植される。

てんかんは実際は単一の病気ではなく、むしろ潜在的にある異常により起こされ る症状である。当業者は、それぞれのてんかん被験者が個々にユニークな損傷も しくはてんかん病巣を持つことを理解するであろう。そのような病巣は、当業者 によく知られている脳波記録法およびコンピューター化された軸断層撮影法およ び核磁気共鳴画像を含む診断方法の組み合わせを用いて場所の特定ができる。

てんかんに苦しむ患者は、本発明に従い、ＧＡＢＡ生産細胞が付着した支持体マ トリックス材料を影響を受けている部位に移植することにより治療することがで きる。脳中のグルタメート・レセプターおよびＮＭＤＡレセプターの遮断薬が実 験的なてんかんをコントロールするために用いられてきたので、刺激性アミノ酸 経路を遮断する分子を作る細胞を本発明に従って用いることができる。従って、 スペルミジンなどのポリアミンを通常よりも多い量で作るように、ここに記載の 通り修飾した細胞の移植は、てんかん治療に用いることができよう。

本発明の方法は、本発明の方法の有利な効果を経験できるどんな哺乳類への使用 も意図されるものである。そのような哺乳類として、ヒトが最初に挙げられるが 、本発明はそのような限定を意図するものではなく、獣医学使用にも応用できる 。

ここまでに本発明の一般的な記載を行なったが、同じことが、実例として挙げら れた以下の実施例を参照すれば容易に理解されるであろうが、本実施例は、特に 断りのない限り本発明の限定を意図するものではない。

実施例Ｉ 成熟ラットからの副腎クロマフィン細胞を公知の方法に従って調製した（Ｉｎｏ ｕｅ、　Ｍ、　ｅｔ　ａｌ、、　Ａ、Ｊ、　Ｐｈｙｓｉｏｌ、　２５７　（Ｃｅ ｌｌ　Ｐｈｙｓｉ。

Ｉ、２６）：Ｃ９０６−９１２（１９８９）を参照）。ネンブタールによる麻酔 の後、頭を切除して殺し、副腎を除去した。注意深い顕微解剖により、髄質から 被膜および皮質物質を取り除いた。組織を２片もしくは３片に切断して、１４０ 　ｍＭ　ＮａＣ１，５ｍＭ　ＫＣＩ、５．２　ｍＭ　ＭｇＣ１ｚ、５　ｍＭＨＥ ＰＥＳ、　ｌｏｍＭ　Ｄ−ｇｌｕｃｏｓｅを含むｐＨ７，４のカルシウムを含ま ない平衡塩類溶液中の０．２％コラゲナーゼとともに３０分間インキュベートし た。この酵素処理後、調製物を９９．９Ｎ　Ｏｘをあわ立たせることによりやさ しく振とうした。消化後、組織を上記の塩溶液で３〜４回洗浄し、次にパスツー ルピペット中でやさしく粉砕した。

■）に、ばらばらにしたクロマフィン細胞を移し、３７℃で５％ＣＯ□雰囲気中 で一晩培養した。これらの条件下では、細胞は２〜３日本的にはビーズ上に単層 を形成した。インビトロでの調製の２４時が培養では生存しなくなったとき）に おいて、細胞はインビボで定された（図１を参照）。ガラスピーズは、注入自体 に特有の壊死的損傷以上の損傷を引き起こさなかった。

日間、完全な健康状態で生き続けた。どんな免疫学的拒絶の兆候も見られなかっ た。

実施例ＩＩＩ 培養したヒト包皮繊維芽細胞を上記のようにガラスマイクロビーズに付着させて 、これをラット脳に注入した。細胞の局在する場所は、繊維芽細胞に選択的に結 合するヒトＩｇＧ、次にフルオレスセイン結合ヤギ抗ヒトＩｇＧ抗体を用いる免 疫蛍光によって特定した。移植されたヒト細胞は少なくとも２１日間完全な健康 状態で生き続けた。どんな免疫学的拒絶の兆候も見られなかった。

これまでに本発明を完全に記載したので、同じことが本発明の精神と範囲を離れ ることなく、かつ過度な実験を持たずして広い範囲の同等のパラメーター、濃度 、および条件内で行なえることを当業者は理解するであろう。

この発明はその具体的な実施態様に関連させて記載されているが、さらに修正変 更が可能であることが理解されるであろう。一般的に、本発明の原理に従い、本 発明が関連する技術において公知または慣用の実施に入り、かつ本特許請求の範 囲に記載で述べているような既述の必須要件に適用される本発明からの離脱を含 めて、本出願は、本発明のどんなバリエーション、使用、または適用の包含を意 図するものである。

具体的な実施態様の前記記載は、本発明の一般的性質を十分に開示するであろう から、現在の知識を適用することにより、多様な応用のために、本来の概念から 離れることなくそのような具体的な実施態様を容易に改変および／または適用で きるであろうし、従って、そのような適用と改変は、開示された実施態様の等価 物の意味と範囲内において理解されるべきであり、そのように意図載の目的のた めであり、限定を目的とするものではないことを理解すべきである。

国際調査報告　ＰＣＴ１０５９１１０７４４］フロントページの続き （５１）　Ｉｎｔ、　Ｃ１，５識別記号　庁内整理番号Ｃｌ２Ｎ　１５１０９ Ｉ

Claims (13)

【特許請求の範囲】
1. １．細胞を支持体マトリックスの外側表面にインビトロで付着させ、付着した細 胞を有する支持体マトリックスを脳中に移植することからなる、哺乳類被験者の 脳中へ細胞を移植する方法。
2. ２．支持体マトリックスがマイクロビーズである、請求項１記載の方法。
3. ３．マイクロビーズが約９０から約１５０μｍまでの直径を有する、請求項２記 載の方法。
4. ４．支持体マトリックスが酸化ケイ素、ポリスチレン、ポリプロピレン、ポリエ チレン、ポリカーボネート、ポリペンテン、アクリロニトリルポリマー、ナイロ ン、天然多糖類、修飾多糖類、アミラーゼ、コラーゲン、天然セルロース、修飾 セルロース、寒天およびマグネタイトからなる群より選ばれた材料からつくられ る、請求項１記載の方法。
5. ５．支持体マトリックスが酸化ケイ素である、請求項４記載の方法。
6. ６．細胞が神経もしくは傍神経に由来する、請求項１記載の方法。
7. ７．細胞が副腎クロム親和性細胞である、請求項６記載の方法。
8. ８．細胞が網膜色素上皮細胞である、請求項１記載の方法。
9. ９．細胞がインビトロで培養された細胞系からのものである、請求項１記載の方 法。
10. １０．培養細胞が繊維芽細胞である、請求項９記載の方法。
11. １１．培養細胞がタンパク質もしくは複数のタンパクをコードする遺伝物質のト ランスフェクションにより遺伝的に修飾されており、遺伝的に修飾された該細胞 が神経伝達物質もしくは神経成長因子を生産できるようにしてある、請求項９記 載の方法。
12. １２．請求項１の方法により疾患を治療できる効果的な数の細胞を被験者の脳中 に移植することからなる、被験者の神経学的疾患を治療する方法。
13. １３．疾患がパーキンソン病、アルツハイマー病、ハンテントン病、てんかん、 および外傷性脳損傷からなる群より選ばれる、請求項１２記載の方法。