JPH06502409A - 単離された金属ポリペプチド：組成物および合成方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】

単離された金属ポリペプチド、組成物および合成方法同時係属出願のクロス・リ ファレンス この出願は、１９９０年ＩＯ月２８１こ出願した米国特許出願番号０７１５９１ ゜９８８号の一部継続出願である。 発明の技術分野 この発明は、単離された金属ポリペプチド（ｒｎｅｔａｌｌｏｐｏｌｙｐｅｐｔ ｉｄｅ）、およびこの種の金属ポリペプチドを合成するための金属イオン補助自 己会合（ｓｅｌｆ−ａｓｓｅｍｂｌｙ）方法に関する。 天然蛋白質は、アミド結合によって連結されたアミノ酸残基の線状鎖で構成され ている。ポリペプチド鎖は可撓性であり、実質的に完全な立体配座自由度を有す る。この自由度にも拘らず、天然ポリペプチドはαヘリックス、βシートおよび βターンのような緊密に詰込まれた高い秩序の折畳み立体配座を有する、すなわ ち非無作為の二次構造を形成する。ポリペプチドの折畳み状態と非折畳み状態と の間のエネルギーバランスは、立体配座エントロピー因子によって制御されると 考えられている。この種の因子の１つである疎水性効果は、現在では蛋白質の折 畳みにおける主要な駆動力であると考えられている。ディル・ケー・ニー、Ｂｉ ｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、２４　：１５０１　（＋９８５）。 ２以上の疎水性基（高い秩序の水の殻体によって最初に溶媒和されたもの）が蛋 白質の内部で互いに集まると、この事態に伴う立体配座エントロピーの喪失によ って溶媒エントロピーの増加が補償されたちの以上になる。ポリペプチドと溶媒 環境との相互作用により、非極性側鎖が内部で互いに集合し、親水基は主として 蛋白質表面に止まることとなる。１つの理論によれば、親水性相互作用力により ポリペプチドは迅速に崩壊して「溶融球体Ｊと呼ばれるコンパクトな状態になり 、これがその後最終構造に再配置する。例えば、パインら、Ｔｒｅｎｄｓ　Ｂｉ ｏｃｈｅｍ、Ｓｃｉ、Ｐｅｒｓ、Ｅｄ、１２：３０９　（１９８７）、　ドリギ クら、ＦＥＢＳ　Ｌｅｔｔ、＋３６：３１１　（１９８１）およびクワシマらＦ ＥＢＳ　Ｌｅｔｔ、２２１：１１５　（１９８７）を参照することができる。 αヘリックスおよびβシートのような折畳み構造は、広範な水素結合ネットワー クによって維持される。リチャードソン・ジエイ・ニス、Ａｄｖ、Ｐｒｏｔｅｉ ｎ　Ｃｈｅｍ、３４：１６７　（１９８１）、この種の水素結合単一の寄与は典 型的には非常に小さいが、特に蛋白質の内部における水素結合の共同的形成が、 恐らく折畳みや安定性に重要な役割を果たしている。折畳まれたポリペプチドの 安定性に寄与する他の力には、静電力、媒体および広範囲イオン対合相互作用、 ヘリックス双極子相互作用、ジスルフィド結合のような共有結合力およびＣおよ びＮ末端アミノ酸残基の性状がある。例えば、パルロウら、Ｊ、Ｍｏ１ｅｃ。 Ｂｉｏｌ、１６８：８６７　（１９８３Ｌベルツーエム・エフ、５ｃｉｅｎｃｅ 。 ２０１：１１８７　（Ｊ９７８Ｌ　リチャードソンら、５ｃｉｅｎｃｅ；　２４ ０：１６４８（＋９８８）およびプレスタら、５ｃｉｅｎｃｅ、２４０：１６３ ２（１９８８）を参照することができる。この点に関しては、分散力およびファ ンデルワールス力は恐ら（重要性は少ない。 折畳まれた蛋白質構造についての大量の情報の１積にも拘らず、特定された立体 配座を有する人工ポリペプチドの新たな設計は、補えどころのない課題のままで ある。線状ポリペプチド配列からこの種のポリペプチドを設計する際の主要な障 害は、−次元配列情報がポリペプチドの別個の三次元状態（トポロジー）の形成 をどのように指向するかの包括的理解が全く欠如していることである。 生物測定的で非線形の２つの種類のアプローチが、ポリペプチドの新たな設計の ために最近報告され利用された。例えば、リチャードソンら、ＴｒｅｎｄｓＢｉ ｏｃｈｅｍ、Ｓｃｉ、＋４　：３０４　（１９８９）およびムラターら、Ａｇｎ ｅｗ、Ｃｈｅｍ、Ｉｎｔ、Ｅｄ、Ｅｎｇｌ、５　：　５３５　（１９８９）を参 照することができる。生物測定による設計のアプローチでは、所望のトポロジー に折畳まれると予期される線状ペプチド配列を設計することにより、蛋白質の天 然の形状と構造をモデル化することが試みられている。例えば、組換えＤＮＡ技 術を使用し、逆平行テトラヘリツクストボロノーを有する合成ポリペプチドが設 計され構成されている。例えば、ヘッチら、５ｃｉｅｎｃｅ、２４９：８８４　 （１９９０）およびレーガンら、５ｃｉｅｎｃｅ、２４１：９７６　（１９８８ ）を参照することができる。トリへりックスペプチドは最近記載された。リーベ ルマンら、Ｊ、Ａｍ、Ｃｈｅｍ、Ｓｏｃ、＋１３：１４７０　（１９９１）。 所望のトポロジーを有する合成ポリペプチドを設計し構成する他の試みは、多数 の問題によって阻害されている。「ｂベリンＪ　（ｂ−ｂｅｌｌｉｎ）と呼ばれ るβ樽形蛋白質が設計されたが、溶解性の問題のためにその構造的特徴は未知の ままである。リチャードソンら、Ｔｒｅｎｄｓ　Ｂｉｏｃｈｅｍ、Ｓ＋ｊ、１４ ：３０４（１９８９）。βおよびαヘリックスの組合せトポロジーを有する合成 ポリペプチドの場合も類似する溶解性の問題に遭遇するものだった。 非線形設計原理の使用によって幾つかの問題が回避された。鋳型会合のアプロー チを使用し、同一の両親媒性ペプチドからなる幾つかのαヘリックスおよびβ鎖 ポリペプチドが設計された。例えば、ササキら、Ｊ、Ａｍ、Ｃｈｅｍ、Ｓｏｃ。 ＩＩＩ：３８０　（１９８９）およびバーンら、５ｃｉｅｎｃｅ、２４８：１５ ４４（＋９９０）を参照することができる。しかしながら、これらのポリペプチ ドのトポロジーは未だ十分には解明されていない。 特定のトポロジーを有する人工ポリペプチドの構成に関する１つのアプローチは 自己構築性分子プロセスを開発することであり、これにより小さなペプチドを、 トポロジー的に所定の大きなポリペプチド三次構造に会合させることができる。 本発明は、人工ポリペプチドの構成のための多価金属イオン補助自己会合プロセ スを提供するものであり、その際、多価金属イオンと適切に設計された金属イオ ン結合部位との間の相互作用を活用することによってポリペプチドの全体的なト ポロジーの操作を行なう。 発明の要旨 本発明によれば、ペプチドか水性溶媒接近可能である２つの配位するアミノ酸残 基で金属陽イオンに結合した金属ペプチドであって、前記結合金属陽イオンによ って安定化された二次構造を有する前記金属ペプチドが提供される。 好適な態様では、この種の金属ペプチドの二次構造は、（ａ）αヘリックスであ り、前記配位するアミノ酸残基がポリペプチド上でｌおよびｉ＋４の相対的アミ ノ酸位置に局在するか、または（ｂ）βターンを有するβシートであり、前記配 位するアミノ酸残基がポリペプチド上でｉおよびｉ＋３またはｉ−１およびｉ＋ ５の相対的アミノ酸位置に局在する。 βターンを有する好適なβシートは、左から右に読んでアミノ末端からカルボキ シ末端の方向にアミノ酸残基配列： Ａｃ−Ｃｙｓ−Ｌｅｕ−３ｅ　ｒ−Ｖａ　ｌ−Ｈｌ　５−Ｐｒｏ−Ｇｌ　ｙ−Ｈ ｉ　ｓ　−Ｔｈｒ−Ｔｙｒ−１１ｅ−Ｇｉｎ−Ｃｙｓ−ＣＯＮＨｔ　（配列番号 ＝１９）または Ｖａ　Ｉ−Ａｓｎ−Ｖａ　１−Ｌｙｓ−Ｈｉｓ−Ｇｌｙ−３ｅｒ−Ｈｉ　５−Ａ ｓｎ−Ｖａ　１−Ｌｙｓ−Ｖａ　ｌ−Ｃ０ＮＨｔ　（配列番号・２０）を有する 。 好ましくは、金属ペプチドにつき配位するアミノ酸残基はヒスチジン、システィ ンおよびメチオニンよりなる群から選択され、金属陽イオンはＺｎ　（Ｉ　Ｉ） 、Ｃｄ　（Ｉｆ）、Ｃｕ　（１）、Ｃｕ　（ＩＩ）、Ｎｉ　（ＩＩ）、Ｒｕ　（ ＩＩ）、Ｒｕ（Ｉ　ＩＩ）、Ｐｔ　（ＩＩ）、Ｐｄ　（ＩｒＬ　Ｃｏ　（ＴＩ） 、Ｃｏ　（ＩＩＩ）−Ｍｇ（ＩＩ）、Ｂａ（Ｉｆ）、５ｒ（ＩＦ）、Ｆｅ（ＴＩ ）、Ｆｅ（ＩＩＩ）、Ｖ（ＩＩＩＬＣｒ　（ＩＩ）、Ｃｒ　（ＩＩＩ）、Ｍｎ　 （ＴＩ）、Ｒｈ　（ＩＩＩ）、Ａｇ（１）、Ｈｇ（ＩＩ）、Ｍｏ（ＩＩＩ）、Ｍ ｏ（ＴＶ）、Ｍｏ（Ｖ）、Ｍ。 （Ｖｌ）、Ｗ（ＩＩＩ）、Ｗ（ＩＶ）、Ｗ（Ｖ）、Ｗ（ＶＩＬ　Ｃａ　（ＩＩ） 、Ｐｂ（ＩＩ）、Ｃｅ（ＩＩＩ）、ＡＩ　（Ｊｌｌ）およびＴｈ（ＩＶ）よりな る群から選択される。 他の観点では、本発明によれば、安定化された二次構造を有する金属ペプチドを 調製するに際し、 （ａ）予備選択されたアミノ酸残基配列を有するポリペプチドを調製し、二次構 造を形成し得る前記配列の一部は、親水性領域を有し、そのポリペプチドは、水 性溶媒接近可能でかつ前記親水性領域中で金属結合部位を特定する２つの配位ア ミノ酸残基を含み、 （ｂ）水溶液中で前記ポリペプチドと予備選択した金属陽イオンとを混合するこ とにより生物学的反応混合物を形成し、（ｃ）前記金属陽イオンが、前記金属− 配位子配位接点を介して前記配位するアミノ酸残基に結合し、前記結合した金属 陽イオンによって安定化された二次構造を有する金属ペプチドを形成するのに十 分な時間、生物学的反応条件下に前記生物学的反応混合物を維持する、 工程を含む安定化された二次構造を有する金属ペプチドの調製方法が提供される 。 この方法は、 （ｄ）工程（ｂ）で混合した金属陽イオンとは異なる金属陽イオンを含む以外は 前記同様に工程（ｂ）および（ｃ）を実施し、（ｅ）工程（ｃ）および（ｄ）で 形成されかつ維持された生物学的反応混合物のそれぞれに存在するポリペプチド によって示される二次構造の量を決定し、（ｆ）工程（ｅ）の測定により最大量 の二次構造を示す、維持された混合物を選択し、安定化された二次構造を有する 金属ペプチドを形成する、工程を更に含むことができる。 この方法で使用する二次構造、配位アミノ酸および金属イオンは、金属ペプチド について前記したのと同一のものとする。 また、本発明によれば、２〜約８のポリペプチド結合配位子に配位結合により結 合した多価金属イオンからなる単離された金属ポリペプチドであって、前記ポリ ペプチド結合配位子の少なくとも２つが線状両親媒性ペプチドに共有結合により 結合した単離された金属ポリペプチドが提供される。 好適な多価金属イオンはＮｉ、Ｃｕ、Ｆｅ、Ｃｏ、Ｒｕ、Ｒｈ、ＰｄまたはＰｔ である。この方法で使用するポリペプチド結合配位子は、好ましくはピリジンま たはイミダゾールの誘導体、例えば２−カルボキシピリジン、３−カルボキシピ リジン、５−カルボキシ−２，２′−ビビリノンまたはＮ　Ｃｒ　Ｃｓアルキル カルボキシイミダゾール、例えばＮ−５−カルボキシペンタニルイミダゾールで ある。 金属ポリペプチドを合成するのに使用する線状両親媒性ペプチドは、溶液中でα ヘリックス、βシートまたはβターン立体配座を有する。１つの態様では、この 種の線状両親媒性ペプチドは金属ペプチドとする。　ポリペプチド結合配位子は 、ペプチドの長さに沿う全ゆる地点で線状両親媒性ペプチドに結合させることが できる。好ましくは、この種の結合は線状両親媒性ペプチドのＮ末端で生起する ものとする。 更に本発明によれば、４つのポリペプチド結合配位子に配位結合により結合した 多価金属イオンからなる平行テトラヘリックス金属ポリペプチドであって、その ポリペプチド結合配位子のそれぞれが、左から右に読んでＮ末端からＣ末端の方 向に式： ％式％ を有する線状両親媒性ペプチドに独立に共有結合により結合した平行テトラヘリ ックス金属ポリペプチドが提供される。好適な態様では、多価金属イオンはＲｕ であり、ポリペプチド結合配位子は３−カルボキシルピリジンである。 また本発明によれば、３つの５−カルボキシル−２，２′−ビビリノンポリペプ チド結合配位子に配位結合により結合した多価金属イオンからなるトリへりック ス金属ポリペプチドであって、そのポリペプチド結合配位子のそれぞれが、左か ら右に読んでＮ末端からＣ末端の方向に式ニーＧｌｙ−Ｇｌｕ−Ｌｅｕ−Ａｌａ −Ｇｌｕ−Ｇｉｎ−Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ｇｌｎ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｇｌｎ −Ｌｙｓ−Ｌｅｕ　−Ａ　Ｉ　ａ　−（配列番号コ１８）を有する線状両親媒性 ペプチドに独立に共有結合により結合したトリへリックス金属ポリペプチドが提 供される。好適な態様では、多価金属イオンはＮｉ、Ｃｏ、ＦｅまたはＲｕであ る。 テトラおよびトリへリックス金属ポリペプチドは、酸４１元酵素および膜横断（ ｔｒａｎｓｍｅｍｂｒａｎｅ）電荷移動物体としての用途を有する。 なお、更に本発明によれば、金属イオン補助自己会合を行うに際し、ａ）単離さ れたペプチド−配位子接合体（ｃｏｎｊｕｇａｔｅ）を取得し、そのペプチド部 分は線状両親媒性ペプチドであり、その配位子部分は、２〜８の配位部位を有す る水溶性多価金属イオンとポリペプチド配位錯体を形成し、ｂ）液体媒体中で過 剰の前記ペプチド−配位子接合体と前記水溶性多価金属イオンとを混合して反応 混合物を形成しく前記過剰は、前記多価金属イオン配位部位のモル数を上回る前 記ペプチド−配位子接合体のモル数を指す）、Ｃ）前記ペプチド−配位子接合体 および前記多価金属イオンが２〜８の線状両親媒性ペプチドを有する金属ポリペ プチドを形成するのに十分な時間および条件下で前記反応混合物を維持する工程 からなる金属イオン補助自己会合方法が提供される。 好適な態様では、線状両親媒性ペプチドは溶液中でαヘリックスを形成し、ポリ ペプチド配位錯体はＣ４対称性、８面体また正方形平面幾何配置を有し、４のペ プチド−配位子接合体に配位しており、金属ポリペプチドは平行テトラヘリック ストポロジーを有する。 Ｃ４対称性および８面体または正方形平面幾何配置を有する好適なポリペプチド 配位錯体は、式：ｔｒａｎｓ−［Ｍ（Ｌ）ａ　（Ｃ１ｘ）、］　（式中、Ｌは３ −カルボキシルピリジンまたはＮ−置換イミダゾールであり、ＭはＮｉ、Ｃｕ、 Ｃｏ、Ｒｈ、Ｒｕ、ＰｄまたはＰｔであり、ｎ＝０または１である（ただし、Ｍ がＰｄまたはｐｔの場合はｎ＝０））。好適な態様では、ＭはＲｕでありｎ＝１ である。 他の好適な態様では、線状両親媒性ペプチドは溶液中でαヘリックスを形成し、 ポリペプチド配位錯体が０３対称性、８面体また正方形平面幾何配置を有し、３ つのペプチド−配位子接合体に配位されており、金属ポリペプチドはトリへりツ クストボロジーを有する。 他の金属イオン補助自己会合方法は、 ａ）２〜８のポリペプチド結合配位子に結合した２〜８の配位部位を備え水溶性 多価金属イオンを有するポリペプチド配位錯体を取得し、ｂ）前記ポリペプチド 配位錯体と過剰の線状両親媒性ペプチドとを混合して反応混合物を形成しく前記 過剰は、前記ポリペプチド配位錯体のモル数を上回る前記線状両親媒性ペプチド のモル数を指す）、Ｃ）前記ポリペプチド配位錯体および前記線状両親媒性ペプ チドが２〜８の線状両親媒性ペプチドを有する金属ポリペプチドを形成するのに 十分な時間および条件の下で前記反応混合物を維持する工程からなる。 図面の簡単な説明 この開示の一部をなす図面において、 図」は、Ｒｕ−ピリジルポリペプチド配位錯体を有する平行テトラヘリックス金 属ポリペプチドの概略説明図である。配位錯体は空洞部の底部を形成し、これは 酸化反応のための基質分子を受容すべく働く。 図２は、αヘリックスの１およびｉ＋４位置のアミノ酸残基の側鎖に対する金属 イオン配位を示すヘリックスリボンの図を示す。ＡｃＮＨとしたＮ末端はアセチ ル化アミンである。Ｃ０ＮＨｔとしたカルボキシル末端はアミド化されたカルボ キシルである。アミノ酸残基配列中の金属イオン結合部位をＸ、およびＸ、によ り示し、この場合ペプチド配列番号：２（表２）はこれらの位置にそれぞれシス ティンおよびヒスチジン残基を有し、またペプチド配列番号＝３（表２）はこれ らの位置に２つのヒスチジン残基を有する。　囚３は図３Ａ、３Ｂおよび３Ｃと する３つの図により、実施例３Ａ　（１）に記載するように測定した金属イオン 塩溶液の存在下でのペプチドの別々の溶液の円偏光二色性（ＣＤ）スペクトルを 示す。増加する波長ｌこ対してＣＤスペクトルをプロットする。 図３Ａでは、増加する量のＣｄＣ１１の存在下におけるペプチド配列番号−２（ 表２）のＣＤスペクトルを示す（１０ｍＭホウ酸ナトリウム、０．５ｍＭメルカ プ″トエタノール、ｐＨ８，０，２１℃中で５．９ｘｌＯ−”Ｍ）。頂部の曲線 快印）から底部の曲線に渡り、示したＣｄ’十濃度は、それぞれ１．０ＸＩＯ− ’。 ２．０Ｘ１０”、４．　Ｏｘ　Ｉ　Ｏ−’オ、ＩＪＪ１．　５　ｘ　Ｉ　Ｏ−’ ヲｔムモノトｔル。ＣＤスペクトル値の減少は、増加した金属イオン濃度による ペプチドαヘリックス立体配座の増加した安定性を反映する。 図３Ｂでは、ｐＨ６，６５の水中かつ４℃で２．２ＸＩＯ−’Ｍ（点線の曲線） オヨヒ７．３ＸＩ　Ｏ−’ＭＣｄＣ１ｔ溶液、ｐＨ６，７，４℃（実線）曲＃） 　ｊ：Ｊ：リペプチド配列番号ｚ２のＣＤスペクトルを示す。４℃で金属イオン が存在する結果、金属イオンのない溶液と比較してαヘリックスの安定化が増加 する。 図３０では、次の濃度のＣｕ５Ｏａ　（実線の曲線）　０．３．３ＸＩＯ−’お よび６．６ＸＩＯ−’Ｍ（頂部から底部）の存在下でペプチド配列番号：３のＣ Ｄスペクトルを示す（２１℃で１．８ＸＩＯ−’Ｍおよび５ｍＭホウ酸ナトリウ ム、ｐ）（６，］）。曲線は、金属イオン濃度が増加するにつれ２２０ｎｍで減 少する。 破線の曲線は５ｍＭホウ酸ナトナトリウム中、４ＸＩ　Ｏ−’ＭＣｕＳＯ＊　、 ｐＨ６゜４．０℃でのペプチド２　（１，８ＸｌＯ−’Ｍ）のＣＤスペクトルを 示す。 金属イオン含有ペプチド溶液のＣＤスペクトルにおける［θ］　、ｔｔ　Ｘ　Ｉ 　（１−’の値は、金属イオンの濃度が増加するにつれて減少し、増加したαヘ リックス形成を反映する。この性質は０℃の溶液において増強される。 図４は、実施例３Ａ　（２）に記載するように測定した場合の、遊離の金属イオ ンの濃度に対するペプチド配列番号：２および３の２ｚ２ｎｍ（［θ］ｔｔｔＸ １０−′）における平均残基モル楕円率の依存性を示す。示した条件および検定 の下で種々の濃度で、１０ｍＭホウ酸ナトリウム、０．５ｍＭメルカプトエタノ ール、２１’Ｃでの５．９ＸＩＯ−”Ｍのペプチド配列番号：２を次の金属イオ ンと組合せた　（黒丸）ＣｄＣ１＊　−ｐＨ８，０、Ｋｍ　＝５．　６　ｘ　Ｉ 　Ｏ−’Ｍ、（黒菱形）Ｚｎ　ＣＩ　ｔ　、ｐＨ８，Ｏｏ同様に（５ｍＭホウ酸 ナトナトリウム中１℃、６．１×１０−’Ｍのペプチド配列番号：３を組合せて 検定した　（白三角）ＺｎＣＩｔ、ｐＨ７，５、Ｋｄ＝７．５ｘｌＯ−’Ｍ、（ 白四角）ＣｕＣＩ２、ｐＨ５，３、Ｋ。 ＝６．６ＸＩＯ−’Ｍ、　（白丸）ＣｄＣＩｔ　、ｐＨ７，５、Ｋ、＝２．　２ Ｘ　Ｉ　Ｏ−’Ｍ、（白菱形）ＮｉＣ１＊　、ｐＨ６，３、Ｋａ　＝２．　ｌ　 Ｘ　１０〜４Ｍ０非線形最小二乗法を使用することにより曲線をデータに適合さ せた。結果は、合成ペプチド中の金属結合部位に依存して金属イオンは異なる親 和力を有することを示す。ペプチド配列番号：３についてＮ　ｉ　ＣＩ　ｔは最 高の親和力を示し、その次がＣｄＣ１１であった。ペプチド配列番号：２につい てはＣｄＣＩｆはＣｄＣＩｇより大きい親和力を示した。 図５は、ビピリジル（ｂ　ｐ　ｙ）ポリペプチド結合配位子に共有結合により結 合した線状両親媒性ペプチドのへリックスホイールの図であり、疎水性（Ａｌ　 ａ、Ｌｅｕ）および親水性（Ｇｉｎ、Ｇｌｕ、Ｌｙｓ）残基の分離を示すもので ある。 図６は、実施例４および図５の２２２ｎＭのペプチドの楕円率の濃度依存性を示 す、（黒三角）、ペプチドに加えて２．５等量のＣｏＣ］ｔ、（白三角）、種々 の濃度における添加金属イオン非存在下でのペプチド。以下の式を使用して単量 体−ηマー平衡に従ってデータ（）を分析した。式中、Ｐ、、Ｐ□。およびＰＴ はそれぞれペプチドの自己会合したもの、単量体および合計の濃度であり、ｎは 会合の程度であり、ｍｏｎは単量体の楕円率であり、ｎはペプチドの自己会合形 態の楕円率である。非線形回帰プログラムＭＩＮＳＱによってｎ＝１．９５１、 。、＝−１０，１００、。＝−２７，９００およびに□＋＋＝６．４　ｘ　ｌ　 Ｏ−’の値を決定した。 １／（ｎｌ） ［Ｎ７ａおよび７ｂとした２つの図で示す図７は、ピリジル（図７ａ）またはイ ミダゾイル（図７ｂ）ポリペプチド結合配位子を有する平行テトラヘリックス金 属ポリペプチドの概略説明図である。 発明の詳細な説明 Ａ、定義 アミノ酸残基：ここに記載するアミノ酸残基は、好ましくは［ＬＪ異性体形態と する。ただし、ポリペプチドによって所望の機能的性質が保持される限り、「Ｄ 」異性体形態の残基により全ゆるＬ−アミノ酸残基を置換することができる。 ＮＨ，は、ポリペプチドのアミノ末端に存在する遊離のアミノ基を指す。Ｃ０Ｏ Ｈは、ポリペプチドのカルボキシル末端に存在する遊離のカルボキシル基を指す 。 アミノ酸残基の省略形を以下の対応表に示す・Ｍｅｔ　メチオニン Ａｌａ　アラニン Ｇｌｕ　グルタミン酸 Ａｓｐ　アスパラギン酸 Ａｓｎ　アスパラギン Ｃｙｓ　ンステイン Ｘａａ　天然に存在しないアミノ酸 ここではその左から右への方向性がアミン末端からカルボキシル末端への慣用的 な方向である式！こよって全てのアミノ酸残基配列を示すことを銘記すべきであ る。また、「アミノ酸残基Ｊという記載は、天然に存在するものおよび天然に存 在しない（非天然）アミノ酸構造を含むべく広範に特定するものとする。更に、 アミノ酸残基配列の始めまたは終りのダッシュは、１以上のアミノ酸残基の更な る配列、またはＮＨ，またはアセチル（Ａｃ）のようなアミノ末端基、またはＣ ００Ｈもしくは第」アミド（ＣＯＮＨ＋）のようなカルボキシル末端基に対する ペプチド結合を示す。 ペプチド　ここで使用するように、「ペプチドＪという用語は、金属ペプチドを 包含するその文法上の全ての形態において、隣接するアミノ酸残基のα−アミノ 基とカルボキシル基との間のペプチド結合によって互いに連結されたアミノ酸残 基の配列を指す。更に、［ペプチドＪという用語は、ここで使用するように、金 属ポリペプチドの合成のためのサブユニットに言及するものである。 ポリペプチド・ここで使用するように、「ポリペプチド」という用語は、金属ポ リペプチドを包含するその文法上の全ての形態において、複数のペプチドからな る分子を指す。［ペプチド」および「ポリペプチド」という用語は場合によって 互換的に使用するが、ここでのそれらの意味は互換し得るものではない。 １つの観点では、本発明は、２〜約８のポリペプチド結合配位子に配位結合によ り結合した多価金属イオンからなる単離された金属ポリペプチドに関し、この場 合少なくとも２つのポリペプチド結合配位子は、線状両親媒性ペプチドに共有結 合によって独立に結合する。残余の配位部位は、当業界で周知のように１．２． ３または４座間位子によって占有され得る。ここで使用するように、「単離され た」という用語は、金属ポリペプチドが他の蛋白質、酵素、核酸および他の類似 する物質を含まないことを意味する。 ａ、多価金属イオン−多くの異なる金属イオンが、この発明における多価金属イ オンとして使用するのに適切である。好ましくは、多価金属イオンは２〜８の配 位部位を有し、金属ポリペプチドトポロジーの最大の安定化を示すものである。 他の多価金属イオンと比較した場合の特定の多価金属イオンのより大きい安定化 効果を示す能力は、特定のポリペプチド結合配位子と錯体形成する多価金属イオ ンの優先性によって特定される。ポリペプチド結合配位子が金属結合部位を形成 する限り、この種の結合配位子であり、この種の結合配位子の幾何配置であり、 これに結合した両親媒性ペプチドであり、特定の多価金属イオンとの相互作用に ついての優先性を生成するこの種の結合配位子の化学的性質である。ポリペプチ ド結合配位子は以下にセクションＩｂで記載する。 与えられた金属ポリペプチドにおける多価金属イオンポリペプチド結合配位子錯 体（ポリペプチド配位錯体として以下に言及する）の安定性は、本発明の望まし い特徴である。ポリペプチド配位錯体の安定性は、ポリペプチド結合配位子がこ の種の配位錯体中で多価金属イオンから解離する条件によって示される。解離に 伴って、ポリペプチド結合配位子と、異なるかまたは元の多価金属イオンとの間 の再会合が起る。 ポリペプチド配位錯体の解離および再会合のプロセスは交換として言及される。 関連する点として、安定な錯体はより交換不活性であり、不安定な錯体はより交 換活性である。交換不活性なポリペプチド配位錯体が先に記載されており、特に 好ましい。交換不活性な配位錯体の一般的議論については、タウベ、Ｃｈｅｍ。 Ｒｅｖ、５０：６９　（１９５２）、ファン・ワード、Ｍｅｔｈ、Ｅｎｚｙｍｏ ｌ。 １５８：９５　（１９８８）、バートン、Ｃｏｍｍ、Ｉｎｏｒｇ、Ｃｈｅｍ、３ 　：３２１（１９８５）、［有機化学および生化学における金属−配位子相互作 用Ｊ、プルマンら、編、ディ・レイデル、ボストン（＋９７７）、マーガリット ら、Ｊ。 Ａｍｅｒ、Ｃｈｅｍ、Ｓｏｃ、１０５：３０１　（＋９８３）およびフリートマ ンら、Ｊ、Ａｍｅｒ、Ｃｈｅｍ、Ｓｏｃ、１１２：４９６０　（＋９９０）を参 照することができる。 金属ポリペプチド中で交換不活性なポリペプチド配位錯体を形成する多価金属イ オンは、他の多価金属イオンより好適である。ポリペプチド配位錯体が交換不活 性であればあるほど、金属ポリペプチドの融解温度（Ｔｍ）は高くなる。よって 、相対的に交換不活性なポリペプチド配位錯体を有する金属ポリペプチドはより 熱安定性であり、これにより金属ポリペプチドに対し、相対的に小さい交換不活 性のポリペプチド配位錯体の場合より高い温度で二次構造を維持する能力を与え る。 本発明で使用し得る例示的な多価金属イオンには、亜鉛（Ｚｎ）、カドミウム（ Ｃｄ）、銅（ＣｕＬニッケル（Ｎｉ）、ルテニウム（Ｒｕ）、白金（Ｐｔ）、パ ラジウム（Ｐｄ）、コバルト（Ｃｏ）、マグネシウム（Ｍｇ）、バリウム（Ｂａ ）、ストロンチウム（Ｓｒ）、鉄（Ｆｅ）、バナジウム（Ｖ）、クロム（Ｃｒ） 、マンガン（Ｍｎ）、　ロジウム（Ｒｈ）、銀（Ａｇ）、水銀（Ｈｇ）、モリブ デン（ＭｏＬタングステン（Ｗ）、カルシウム（Ｃａ）、鉛（Ｐｂ）、セリウム （ＣｅＬアルミニウム（Ａ１）およびトリウム（Ｔｈ）が包含される。 多価金属イオンのイオン状態は周知のように変動し得る。多価金属イオンの好適 な酸化またはイオン状態は、好ましくはＺｎ　（Ｉ　Ｉ）　、Ｃｄ　（Ｔ　Ｉ） 　、Ｃｕ（１）、Ｃｕ　（ＩＩ）、Ｎｉ　（ＩＩ）、Ｒｕ　（ＩＩ）、Ｒｕ　（ ＩＩＩ）−Ｐｔ（冊）、Ｐｄ　（ＩＩ）、Ｃｏ　（ＩＩ）、Ｃｏ　（ＩＩＩ）、 Ｍｇ　（ＩＩ）、Ｂａ（ＩＩ）、Ｓｒ　（ＩＩ）、Ｆｅ　（ＩＩ）、Ｆｅ　（Ｉ ＩＩ）、Ｖ（ＩＩＩ）、Ｃｒ（ＩＩ）、Ｃｒ（Ｉｌｌ）、Ｍｎ（ＩＩ）、Ｒｈ（ ＩＩＩ）、Ａｇ（１）、Ｈｇ（ＩＩ）、Ｍｏ（１１１）、Ｍｏ（ＩＶＬＭｏ（Ｖ ）、Ｍｏ（ＶＩＬＷ（ＩＩＩ）、Ｗ（ＩＶ）、Ｗ（Ｖ）、Ｗ（Ｖｌ）、Ｃａ　（ ＩＩＬ　Ｐｂ　（ＩＩＬＣｅ　（ＩＩＩ）、ＡＩ　（ＩＩＩ）またはＴｈ（ＩＶ ）であり、ここでは酸化状態を括弧内に示す。 特定の多価金属イオンの選択は、金属ポリペプチドの所望のトポロジーにも依存 する。ポリペプチド配位錯体の結合エネルギーおよび金属イオン−結合配位子相 互作用について存在する厳密な幾何学的要件を使用し、オリゴマー状態並びに線 状両親媒性ペプチドの相対的配向性を制御する。所望の金属ポリペプチドの全体 的トポロジーに和合するポリペプチド配位錯体を利用しなければならない。 例えば、単離された金属ポリペプチドがトリへリックスのコイル状コイルのトポ ロジーを有する場合、好適な多価金属イオンはＮ１、Ｃ０１ＦｅおよびＲｕ（以 下の実施例４参照）である。 その他、単離された金属ポリペプチドが平行テトラヘリックスのトポロジーを有 する場合、好適な多価金属イオンはＮｉ、Ｃｕ、Ｃｏ、Ｒｈ、Ｒｕ、Ｐｄおよび ｐｔである。本発明のポリペプチド結合配位子と交換不活性ポリペプチド配位錯 体を形成するその能力から、平行テトラヘリックス金属ポリペプチドに使用する より好適な多価金属イオンはＲｕである（以下の実施例５参照）。 ｂ、ポリペプチド結合配位子一本発明で有用なポリペプチド結合配位子は、１以 上の配位する原子を有することができる（すなわち、単座または多座とすること ができる）。例示的な単座結合配位子には、配位化学において周知のように、水 、アンモニア、水酸化物イオン、ハロゲン化物イオン、例えばフッ化物、塩化物 、臭化物またはヨウ化物、１〜約８の炭素原子を含むモノカルボキシレートイオ ン、シアン化物イオン等が包含される。これらの配位子は、通常はそれぞれアク ア、アミン、ヒドロキシド、フルオロ、クロロ、ブロモ、ヨード、モノカルボキ シラドおよびシアナトと呼ばれる。 例示的な多座配位子には、２．３および４座間位子、例えばカーボネートイオン 、オキザレートイオン、２．２′−ビピリジン、２−置換ビリジン、例えば２− カルボキシルビリジン、３−置換ビリジン、例えば３−カルボキシルピリジン、 エチレンジアミン、アセチルアセトネートイオン、１．１０−フェナンスロリン 、２．２’、２”−トリアミノトリエチルアミン、トリエチレンテトラミン、エ チレンジアミンテトラアセテートイオン、イミダゾール酢酸およびＮ置換イミダ ゾール、例えば５−（ｌ−イミダゾイル）−吉草酸が包含される。これらの配位 子は、括弧内の通常使用されるその省略形と共に、通常はそれぞれカルボナト、 オキサル−１・（ｏｘ）　、２．２’−ビスピリジン（ｂｉｐｙ）、ピ＋）’） ル（ｐｙ）、エチレンジアミン（ｅｎＬアセチルアセトネート（ａｃａｃ）、１ ，１０−フェナンスロリン（ｐｈｅｎ）、２．２’　、２”−トリアミノトリエ チルアミン（ｔｒｅｎ）、トリエチレンテトラミン（ｔｒｉｅｎＬエチレンジア ミンテトラアセクト（ＥＤＴＡ）およびイミダゾリル（ｉｍ）と呼ばれる。５座 および６座間位子も公知である。 好ましくは、ポリペプチド結合配位子は、金属上の配位部位について水と効果的 に競合する。好適な配位子の選択は選択した多価金属イオンの性状に依存するが 、逆に多価金属イオンの選択されるイオンは、好適なポリペプチド結合配位子に 依存する。 他の■、２．３および４（四）座配位子を表１に示すが、なお他のものは当業者 に明らかであろう。 表Ｉ ＩＪ１ １■遣（ａ、　ｂ）　」ｌ〕 Ｒ−５８硫化水素 ｒ＠鎖 （ｂｌ Ｒ＝ニスペーサ 例えば−（ＣＨ２）。ニーＣ（０）−ＮＨ−、−ＮＨ−Ｃ（０）−好適なポリペ プチド結合配位子は、ここに随所に詳細に論するように、Ｎ−置換イミダゾール 、３−置換ピリジン、２−置換ピリジンおよびビピリジン配位子である。 一般に、特定の多価金属イオンを結合する好適なポリペプチド結合配位子の同定 は、最初に線状両親媒性ペプチドに付着することを所望するポリペプチド結合配 位子を選択した後、その配位子に強く結合する多価金属イオンを同定することに より行い得るか、または所望の多価金属イオンを、後に同定される好適なペプチ ド結合配位子を用いて最初に同定することができる。また、好適な多価金属イオ ンの同定の後にポリペプチド結合配位子を検索することができる。この種の検索 方法は当業者に周知である。 有効な多価金属イオン−ポリペプチド結合配位子対の選択に際し、当業者は指針 となる幾つかの周知の原理を使用することができる。最も顕著には、好適な金属 イオン結合配位子対を現象的に同定する。この点に関して、水の存在下で多価金 属イオンに優先的に配位結合により結合するポリペプチド結合配位子が好適であ る。この種の結合配位子は、水の存在下におけるこの種の配位子またはそのアナ ログに対する多価金属イオンの相対的結合効率に注目することにより同定するこ とができる。 この原理の例は、Ｒｕ　（ＮＨ３）　ｓ　・　（ＨＩＯ）（ルテニウムアクアペ ンタミン陽イオン）という水溶液中で窒素を固定することが周知の多価金属イオ ンによって示される。エッチ・タウベら、Ｊ、Ａｍ、Ｃｈｅｍ、Ｓｏｃ、８９　 ：　５７０６（＋９６７）を参照することができる。よって、この錯体は、Ｎ− ルイス塩基含有配位子に対する配位結合のための可能性ある候補物として同定さ れる。同様に、［ｃ　ｉ　ｓ−ルテニウムテトラアミノド７は、配位結合窒素含 有結合配位子塩基の良い候補物であると予期される。その他、良好なキレート化 剤であるポリペプチド結合配位子も好適な候補物である。 他の有用な検索指針は、ジエイ・ヒュヘイ、「無機化学」、／％−ｔＺ−・アン ド・ロウ（＋９７２）、第２２５〜３５頁に論じられたような／く−ルソンの硬 質・軟質・酸・塩基（Ｈ３ＡＢ）理論に関するものである。このＨ５ＡＢ理論に よれば、「硬質酸」は「硬質塩基」に結合する好適な傾向を有するのに対し、「 軟質酸」は「軟質塩基」に結合する傾向を有する。よって、高い酸化状態を備え る硬質酸多価金属イオンは、その荷電／半径比率に基き高い荷電／半径比率を有 する硬質塩基配位子または相対的に局在した電子密度を有する中性結合配位子（ 例えば水和した金属イオンおよび電気陽性金属）に結合する傾向を有する。一方 、その低いかまたはゼロの原子価状態の多価金属イオンのような軟質酸は、金属 から電子密度を受容し得る軟質結合配位子塩基、例えば金属カルボニル、メルカ プタンおよび金属オレフィン化合物に結合する傾向を有する。 ポリペプチド配位錯体（多価金属イオン−ポリペプチド結合配位子錯体）の性状 は、金属ポリペプチドの所望のトポロジーと共に変動する。 単離された金属ポリペプチドが平行テトラヘリックストポロジーを有する場合、 好適なポリペプチド配位錯体は次の通りである。 ａ）ｔ　ｒａｎｓ−［Ｍ　（Ｌ）ａ　ＣＬ　］の形式の不安定な金属錯体（この 場合Ｌ＝３−カルボキシル置換ピリジンについてＭ−Ｎｉ　（Ｉ　Ｉ）　、Ｌ＝ Ｎ−置換イミダゾールについてＭ＝Ｃｕ　（Ｉ　Ｉ）　、Ｎｉ　（Ｉ　Ｉ）およ びＣｏ　（Ｉ　Ｉ）　、および ｂ）交換不活性錯体、例えばｔｒａｎｓ−［Ｒｈ　（Ｌ）４ＣＬ］”、ｔｒａｎ ｓ−［Ｒｕ　（Ｌ）ａｃＩｔ］、［Ｐｄ　（Ｌ、　）　］　’＋および［Ｐｔ　 （Ｌ４　）　］”（この場合Ｌ＝３−置換ピリジンまたはＮ−置換イミダゾール ）。　−これらの錯体は広範に特徴付けられており、赤道位置を占める４つの配 位子により正方形平面（ＰｄおよびＰｔ錯体の場合）または８面体錯体を形成す る。この種の錯体により示されるＣ４対称性は、４つの赤道位置の構築に、した がってテトラヘリックス金属ポリペプチドの構築に良好に適合する。平行テトラ ヘリックス金属蛋白質の２つの態様の概略的表示を図７ａおよび７ｂに示す。 金属ポリペプチドはαヘリックス立体配座を有する４つの線状両親媒性ペプチド からなり、ピリジル（図７ａ）またはイミダゾイル（図７ｂ）ポリペプチド結合 配位子により終止する。４つの末端ポリペプチド結合配位子が８面体または正方 形平面幾何配置で金属イオンに配位する場合、両親媒性ヘリックスは空間的に接 近し、凝集して平行テトラヘリックス構造を形成する。 状両親媒性ペプチドに共有結合により独立に結合させる。ここで使用するように 、［線状両親媒性ペブチ自という用語は、水性媒体中で別々の面、すなわち疎水 性（非極性）領域および親水性（極性）または溶媒接近可能領域に分割すること のできるαヘリックス、βシートまたはβターンからなるアミノ酸残基配列を意 味する。蛋白質構造の包括的な総説については、［蛋白質構造の予測および蛋白 質立体配座の原理」、ノー・ディ・ファスマン編、ブレナム・プレス、Ｎ、　Ｙ 。 （＋９８９）を参照することができる。［線状Ｊという語は、ペプチドが二次構 造を有さないか無作為の二次構造を有することを意味するより寧ろ、その配列的 意味で使用するものである。 与えられた個々の線状両親媒性ペプチドは二１を越えるαヘリックス、βシート またはβターンを含み得ることが理解される。更に、与えられた個々の線状両親 媒性ペプチドは、１を越える種類の線状立体配座を含み得る。よって、例えば、 本発明の個々の線状両親媒性ペプチドは、１以上のαヘリックス、αヘリックス およびβシート、αヘリックス、βシートおよびβターン、βシートおよびβタ ーン等を含むことができる。個々の線状両親媒性ペプチドの立体配座についての 唯一の制限は、その立体配座がこの種のペプチドを含む金属ポリペプチドの所望 のトポロジーを逆行的に妨害しないという点である。 好ましくは、本発明の線状両親媒性ペプチドは、前記した立体配座のｌのみを有 する。 与えられた金属ポリペプチドのそれぞれの別々の線状両親媒性ペプチドは同一ま たは異なる立体配座を有することができる。好適な態様では、金属ポリペプチド が３または４の線状両親媒性ペプチドを含む場合、線状両親媒性ペプチドのそれ ぞれはαヘリックス立体配座を有する。前記したように、唯一の制限は、線状両 親媒性ペプチドの立体配座が金属ポリペプチドの全体的トポロジーを逆行的に妨 害しないという点である。 線状両親媒性ペプチドは全ゆる数のアミノ酸残基を含むことができるが、ただし この種のペプチドは所望の立体配座を有し、金属ポリペプチド合成またはトポロ ジーを逆行的に妨害するペプチド中のアミノ酸残基を有さないものとする。好ま しくは、それぞれの線状両親媒性ペプチドはｌＯ〜約２００のアミノ酸残基から なる。更に好ましくは、線状両親媒性ペプチドはＩＯ〜約４０のアミノ酸残基か らなる。 線状両親媒性ペプチドは、全体的または部分的に特定の立体配座、または溶液中 で特定の立体配座を有するよう設計された合成ペプチドを有することが公知の天 然に存在するペプチドとすることができる。　全体的または部分的にαヘリック ス立体配座を有する例示的な天然に存在するペプチドには、ミオヘモリスチリン 、チトクローム８５６２、チトクロームＣ′およびタバコモザイクウィルス（Ｔ ＭＶ）コート蛋白質が包含される。 全体的または部分的にβシート立体配座を有する例示的な天然に存在するペプチ ドには、免疫グロブリンのＶＬ　ドメイン、ピルビン酸キナーゼのドメイン２、 スーパーオキシドディスムターゼ（ＳＯＤ）およびウシ膵臓トリプシンインヒビ ターが包含される。 全体的または部分的にβターン立体配座を有する例示的な天然に存在するペプチ ドには、免疫グロブリンのＶＬドメイン、ヒトレニンのフラップ（残基８１〜９ ０）、エンドチアペプシン（残基７０〜８５）、キモトリプシンＡ（残基２０１ 〜２０８）およびベニシロペプシン（残基１９８〜２０５および２３７〜２４６ ）が包含される。 公知のアミノ酸残基配列を有する天然に存在するペプチドを二次構造の安定化の ために選択する。ペプチドのアミノ酸残基配列は、公開された文献から、コンピ ユータ化されたデータベース、例えばＧＥＮＢＡＮＫ、ＥＭＢＬ蛋白質配列デー タベース等の周知の情報源から取得することができ、または同様に周知のように それぞれ単離されたペプチドまたはクローン化されたＤＮＡに対してペプチド配 列決定またはＤＮＡ配列決定を実施することにより経験的に決定することができ る。 選択したペプチドのアミノ酸残基配列をその後分析し、親水性表面（領域）を有 する二次構造を形成し得るアミノ酸残基配列の領域の存在を同定する。これらの 二次構造には、前記論じたようにαヘリックス、βシートおよびβターンが包含 される。 アミノ酸残基置換が調製したペプチドに含まれるものとし、金属結合部位を形成 する一対の配位するアミノ酸残基を与える以外は、ここに特定するような二次構 造、すなわちαヘリックス、βシートおよびβターンを形成し得るアミノ酸残基 の配列からなるその公知のアミノ酸残基配列からその後ペプチドを調製する。 その他、天然に存在しない線状両親媒性ペプチドを設計し合成し、ペプチド合成 技術の当業者に周知の設計原理および合成方法を使用し、溶液中でαヘリックス 、βシートまたはβターン立体配座を形成することができる。 αヘリックスは、ヘリックス回転当り約３．６のアミノ酸残基を含む。疎水性お よび親水性アミノ酸残基をペプチドの線状配列に沿って配置し、その際、ペプチ ドのαヘリックス立体配座を想定する場合、疎水性および親水性アミノ酸残基を それぞれへリックスの別々の面に凝集させるようにする。αヘリックスにおける 疎水性および親水性アミノ酸残基の凝集は、シフ７ら、ＢｉｏｃｈｅｍｉｃａＩ 　Ｊ、７：Ｉ２１　（１９８７）に記載され、また以下に仮説的に示すように、 ヘリックスホイールにより視覚化することかできる。 ヘリックス回転当り３．６の残基が与えられた場合、前記示した１８残基配列は ５のその種の回転を含む。この種のペプチドでは、疎水性アミノ酸残基は、例え ば残基位置番号６．１７．１０．３．１４．７．１８および１１からなるヘリッ クスのその面に凝集し得る。このペプチドの親水性残基は、例えば残基位置１５ ．８．１．１２．５、Ｊ６および９からなるヘリックスのその面に凝集する。 疎水性または親水性の程度は、特定のアミノ酸残基の数および特性の両者を変動 させることにより変化させることができる。 一定の疎水性および親水性アミノ酸残基が、αヘリックス特性を構成するのに好 適である。好適な天然に存在する疎水性アミノ酸残基はＬｅｕ、Ａｌａ、１１ｅ 、Ｖａ　ｌおよびＰｈｅである。好適な天然に存在する親水性アミノ酸残基はＧ Ｉｕ、Ｌｙｓ、ＧｉｎおよびＡｓｐである。 βシート立体配座を有するペプチドは、典型的には以下に示すように隣接する鎖 の疎水性（Ｂ）および親水性（Ｌ）アミノ酸残基を互い違いに並べることを特徴 とする。 βシートのアミノ酸残基配列の隣接する鎖は、同一（平行）または異なる（逆平 行）方向に進行し得る。隣接する鎖は、一方の鎖の疎水性残基と隣接する鎖の親 水性残基との間の水素結合（、、、）によって互いに保持される。 βシート立体配座を有するペプチド中の好適な天然に存在する疎水性アミノ酸残 基はＶａｌ、１１ｅ、ＬｅｕおよびＰｈｅである。この種のペプチド中の好適な 親水性アミノ酸残基はＡｒｇ、ＨｉｓおよびＴｙｒである。 βターン立体配座は、ペプチドの方向の逆行を特定する約４アミノ酸残基の配列 からなる。典型的には、このような方向の逆行は、以下に示すように位置ｉのア ミノ酸の００部分と位置ｉ＋３のアミノ酸残基のＮＨ部分との間の水素結合（、 、、）によって達成される。 回転の方向は、前記示したものとは反対とし得ることを理解すべきである。 βターンを含む好適なアミノ酸残基は周知である。チオウとファスマン、Ａｎｎ 、Ｒｅｖ、Ｂｉｏｃｈｅｍ、４７：２５１　（１９７ｇ）、第２５８頁。位置ｉ およびｉ＋３を占有し得る好適なアミノ残基はＨｉｓおよびＣｙｓである。位置 ｉ＋１を占有し得る好適なアミノ酸残基にはＰｒｏ、ＳｅｔおよびＡｌａのよう なＬ−異性体アミノ酸か包含される。位置ｉ＋２を占有し得る好適なアミノ酸残 基にはＤ−異性体アミノ酸またはＬ−異性体アミノ酸Ｇｌｙ、ＡｓｎおよびＰｒ ｏが包含される。 この発明の金属ポリペプチドで使用する線状両親媒性ペプチドは、ペプチド技術 の当業者に公知の種々の手段によってｍ製することかできる。ペプチドを製造す る全ゆる公知の方法が、それがここに記載したような成分を有するペプチドに帰 着する限り適切である。 約５０を越えるアミノ酸残基からなる線状両親媒性ペプチドは、好ましくは遺伝 子操作の周知の技術を使用して組換え形態で取得する。この種の技術によれば、 典型的には、所望のペプチドをコードするＤＮＡ配列を発現ベクタに導入し、そ の後このベクタを使用し、形質転換された宿生細胞がペプチドを発現するように 宿主細胞を形質転換する。宿主細胞を形質転換するのに使用する発現ベクタは、 例えば発現ベクタ中に挿入されたＤＮＡに対応するメンセンジャーＲＮＡを生産 すべく機能するブロモ−先ｍＲＮＡの翻訳を増加させる因子、発現ベクタを含む 細胞の選択を可能とする抗生物質耐性マーカー、および宿主細胞内での発現ベク タの自己複製を可能とする因子をコードする他のＤＮＡ配列も含むことができる 。 細菌エシェリキア・コリ（イー・コリ）のような原核細胞中で、および哺乳動物 および昆虫組織培養細胞のような真核細胞中で働く発現ベクタが設計されている 。例示的な原核発現ベクタにはＴ７ベクタおよびＰＬベクタが包含される。 Ｔ７ベクタはｐＴ７系列（例えばｐＴ？−５、ｐＴ７−６およびｐＴ７−７）お よびｐＥＴ系列を含む。スッジエルら、Ｍｅｔｈｏｄｓ　Ｅｎｚｙｍｏｌ、１８ ５　：　６０　（１９９０）。どのベクタを使用するかの選択は、意図するＤＮ Ａ配列をクローン化すべき特定の制限酵素部位の利用可能性、および意図するＤ ＮＡ配列上のリポソーム結合部位の存在または不存在を含む幾つかの因子に依存 する。 ベクタｐＴ？−７は、Ｔ７ブロモータと、その発現ベクタ中に意図するＤＮＡ配 列を挿入するのに使用する多重クローン化部位との間の強いリポソーム結合部位 を含む。 他の原核発現ベクタ、ＰＬベクタは、温度感受性リプレッサによって制御される バクテリオファージＰＬプロモータを含む。このプロモータを含む例示的なＰＬ 発発現ベクタハベクタ７）ｐＳＫＦ系列（例えばｐＳＫＦ　ｌ　０１．　ｐＳＫ Ｆ　Ｉ　Ｏ２およびｐｓＫＦ２ｏ１）である。この種のＰＬベクタ中の適切な多 重クローン化部位に意図するＤＮＡ配列を挿入した後、これを使用して適切な原 核宿主細胞（例えばイー・コリ株ＡＲ’５８）を形質転換する。その後形質転換 した株を昇温下で生育させ、ＰＬプロモータからの発現を誘導する。意図するＤ ＮＡ配列を含む発現ベクタにより生成したペプチドは、その後標準的な手順に従 って単離することかできる。 発現されたペプチドの翻訳後修飾は細菌細胞中では起らないため、原核宿主細胞 中でのペプチドの発現は不正確な立体配座であると想定し得る。よって、真核宿 主細胞および真核発現ベクタが好適である。 真核発現ベクタは、典型的には発現ベクタの宿主細胞内での複製を可能とする哺 乳動物ウィルス複製開始点、効率的なプロモータ要素、メソセンツヤ−ＲＮＡプ ロセシングおよびポリアデニル化に必要な配列、意図するＤＮＡ配列のベクタへ の導入を可能とする多重複製部位、およびこれらのベクタの細菌宿主細胞中での 繁殖を可能とする原核ベクタ配列を含む。真核発現ベクタ中のプロモータは、多 くの場合例えば熱ショック、重金属イオンおよびグルココルチコイドのようなス テロイドによって誘導し得るものである。 更に、真核発現ベクタは、多くの場合発現ベクタ配列の宿主細胞染色体への安定 な組込みを可能とする選択マーカーを含む。例示的な選択マーカーには、抗生物 質６４１Ｂに対する耐性をコードするアミノグルコシドホスホトランスフェラー ゼ遺伝子（サザンら、Ｊ、Ｍｏ１．Ａｐｌ、Ｇｅｎ、Ｉ　：　３２７　（１９＋ ３２）、メトトレキセート耐性をコードするジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子（シモ センら、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｃｌ、Ｓｃｉ、８（１：２４９５　（１９ ８３）、およびアミノプテリンに対する耐性をフードするチミジンキナーゼ遺伝 子（ＨＡＴ培地、リトルフィールド、５ｃｉｅｎｃｅ、１４５　：　７０９　（ ＋　９６４）が包含される。 哺乳動物宿主細胞の形質移入におけるこれらの発現ベクタの使用、並びにこれら の発現ベクタによって発現されたペプチドの回収は、共に標準的な手順を使用し て行うことができる。 他の有用な真核発現ベクタ系は、バキュロウィルスゲノムに基くものである。 バキュロウィルスは、節足動物（昆虫）に感染する大きな包皮された二本鎖ＤＮ Ａウィルスである。バキュロウィルス発現系は、原核発現ベクタ系に対して幾つ かの利屯を有する。例えば、この種のベクタによって感染される宿主細胞は真核 生物（例えば昆虫組織培養細胞）であるため、翻訳後修飾が起り得る。更に、原 核細胞におけるペプチド生産（これは多くの場合不溶性のペプチドを生成する） とは逆にこの系を使用する場合は発現されたペプチドは多くの場合可溶性のまま である。最後に、バキュロウィルスゲノムは約１３０キロ塩基対であり、したが って外来ＤＮＡの大きな断片を収容することができる。ドエルフレルら、１９８ ６、　［バキュロウィルスウィルスの分子生物学」、スブリンガーベルラグ、ニ ューヨーク。外来ＤＮＡの発現でバキュロウィルスを使用するための完全な手順 は、［分子生物学の現代の手順」　（アウスベルら、編、ジョン・ライレイ・ア ンド・ソング、ニューヨーク、１９８９）に認めることができる。 ｐＶＬ系列のような幾つかの真核発現ベクタ（例えばｐＶＬ９４１、ｐＶＬＩ３ ９２およびｐＶＬ　ｌ　３９３、インビトロゲン）がバキュロウィルスで使用す るのに利用可能である。所望のペプチドをコードするＤＮＡ配列をこれらの発現 ベクタの多重クローン化部位に挿入し、その後無傷バキュロウィルスＤＮＡと共 に昆虫組織培養細胞に共感染させ、バキュロウィルス発現ベクタからのペプチド の発現を可能とするウィルス機能を生成する。大量の組換えウィルスを昆虫組織 培養細胞中で生産し、意図するペプチドの蓄積を可能とすることができる。 当業界で周知のように標準的な固相手順を使用し、約１５０塩基対より小さいＤ ＮＡ配列を合成することができる。例えば、「オリゴヌクレオチド合成　実際的 アプローチ」、エム・ジェイ・ガイド編、ＩＲＬプレス、オックスフォード（１ ９８４）を参照することができる。 周知の相互ブライミング長オリゴヌクレオチド法を使用し、約１５０塩基対を越 えるＤＮＡ配列を合成することができる。［分子生物学の現代の手順」　（アウ スベルら、編、ジョン・ライレイ・アンド・ソング、ニューヨーク、１９８９） 。 簡略には、この方法は、長さ約１００塩基対の長いオリゴヌクレオチドの２っの 対合（ＩおよびＩｎの生成を含む。対Ｉオリゴ７クレオチドの両者の３′末端は 相補的である（３′末端は、アニールしてデユープレックスＤＮＡの鎖を形成す るような付着末端を有する）。対ＩＩオリゴヌクレオチド両者の３′末端も相補 的であるが、対■オリゴヌクレオチドの３′末端とは異なる配列のものである。 対■の最初のオリゴヌクレオチドの５′末端は、Ａとされた与えられた制限酵素 認識部位を特定する。対ＩＩの最初のオリゴヌクレオチドの５′末端は、Ｃとさ れた第２の制限酵素認識部位を特定する。双方の対■およびＴＩ両者の第２のオ リゴヌクレオチドの５′末端は、Ｂとされた第３の制限酵素認識部位を特定する 。オリゴヌクレオチド対■およびＩｆを共に溶液中に配置し、その３′相補性、 付着末端によってアニールさせる。この３′アニールにより生成したそれぞれの 対の短いデユーブレックス領域により、修飾Ｔ７ＤＮＡポリメラーゼがそれぞれ の対の第１および第２のオリゴヌクレオチドを鋳型およびプライマーの両者とし て使用することか可能となり、アニールしたオリゴヌクレオチド（約２００塩基 ）の完全な長さを備えるデユープレックス分子の合成が完了する。これは相互プ ライム合成として知られている。 この相互プライム合成により、２つのＤＮＡデユーブレックス分子（対Ｉおよび 対ＩＩのそれぞれについてのもの）が生成され、その一方（対■）は一方の末端 に制限酵素部位Ａおよび他方の末端に制限部位Ｂを有し、その他方のデｆ−ブレ ックス（対ＩＩ）は一方に制限部位Ｂおよび他方に制限部位Ｃを有する。その後 制限酵素Ｂを用いてこれらのＤＮＡデユーブレックス分子を消化し、互いに連結 して約４００塩基対の単一のＤＮＡ配列を形成する。 幾つかのこの種の４００塩基対ＤＮＡ断片を合成することにより、既知の配列を 有する全ゆる大きさのＤＮＡ断片を製造することができる。 メリフィールドによりＪ、Ａｍ、Ｃｈｅｍ、Ｓａｃ、８５：２１４９　（１９６ ３）において最初に記載された固相合成化学技術を使用して対象ペプチドを調製 することもできる。合成化学技術は、比較的小さい、すなわち約５０残基未満を 有するペプチドに好適である。純度、所望しない副生物からの自由度、製造の容 易性等の理由のためである。他のペプチド合成技術は、例えばバタンスキイら、 「ペプチド合成」、ジョン・ライレイ・アンド・ソング、第２版（＋　９７６） 並びに当業者に公知の他の参考研究に認めることができる。ペプチド合成技術の 要旨は、ジエイ・スチュアートとジエイ・ディ・ヤング、「固相ペプチド合成」 、ビエルセ・ケミカル・カンパニー、ロックフォード、ＩＬ、第３版、ニュラス ・エッチら編、第１０４〜２３７頁、アカデミツク・プレス、ニューヨー人ＮＹ （＋９７６）に認めることができる。この種の合成で使用する適切な保護基は、 前記テキスト並びにジエイ・エフ・ダブリュ・マコーミー、「有機化学における 保護基Ｊ、ブレナム・プレス、ニューヨーク、ＮＥ（１９７３）に認めることが できる。 一般に、これらの合成方法は、成長するペプチド鎖に対し、１以上のアミノ酸残 基または適切に保護されたアミノ酸残基を順次に付加することからなる。通常、 第１のアミノ酸残基のアミノまたはカルボキシル基を、適切な選択的に除去し得 る保護基によって保護する。リジンのような反応性側部基を含むアミノ酸につい ては、異なる選択的に除去し得る保護基を利用する。 例として固相合成を使用し、その保護されていないカルボキシルまたはアミノ基 を介して保護または誘導されたアミノ酸を不活性個体支持体に付着させる。その 後アミノまたはカルボキシル基の保護基を選択的に除去し、適切に保護された相 補的（アミノまたはカルボキシル）基を有する配列の次のアミノ酸を混合し、個 体支持体に既に付着した残基とアミド結合を形成するのに適切な条件下で反応さ せる。その後アミノまたはカルボキシル基の保護基をこの新たに付加したアミノ 酸残基から除去し、その後（適切に保護した）次のアミノ酸を付加し、以下同様 とする。全ての所望のアミノ酸を適切な配列で結合させた後、全ゆる残余の末端 および側部基保護基（および個体支持体）を順次または同時に（所望に応じて） 除去し、最終ペプチドを生成する。 ペプチドが天然に存在しないアミノ酸残基を含む場合、現在の技術ではペプチド 調製のための組換え核酸方法論の使用は可能ではない。現在のところ、クローン 化遺伝子からの蛋白質発現は、蛋白質合成に当る酵素複合体にアミノ酸残基を運 搬するトランスファーリボ核酸分子（ｔＲＮＡ）の能力のために制限されている 。組換え核酸法による蛋白質合成に関与するｔＲＮＡにより、または酵素により 認識されるこれらの天然に存在しないアミノ酸については、ペプチド合成は合成 手段に限定される。 （ｉ）金属ペプチド この発明で使用する天然に存在しない線状両親媒性ペプチドは金属ペプチドとす ることができる。例えば、ガジリら、Ｊ、　Ａｍ、　Ｃｈｅｍ、　Ｓｏｃ、ｌ　 ｌ　２　：１６３０　（１９９（１）およびガジリら、Ｊ、Ａｍ、Ｃｈｅｍ、Ｓ ｏｃ、Ｉ　Ｉ　２　：９６３３　（１９９０）を参照することができる。この発 明で有用な金属ペプチドは、溶液中で無作為コイルではなくαヘソックス、βク ーンまたはβシートを形成するアミノ酸残基の配列を含むアミノ酸残基配列を有 するペプチドからなる。 金属ペプチドは、ペプチド中の一対の配位するアミノ酸残基によって与えられる 配位子を介して金属陽イオンに配位（結合）したペプチドとして更なる特徴があ る。配位するアミノ酸残基の対合は、金属陽イオンの錯体形成を配位する幾何配 置で金属イオンに対する配位子接点を与える。よって、配位するアミノ酸残基の 対は、金属陽イオンを錯体化する金属−配位子配位接点を与えることにより、ペ プチド上で金属結合部位を形成する。更に、ペプチドは、金属ペプチドが結合し た金属陽イオンにより安定化される二次構造を有するよう金属陽イオンに結合さ せる。 金属ペプチド相互作用の構造および立体化学は一般によく理解されている。例え ば、フリーマンら、Ａｄｖ、Ｐｒｏｔｅｊｎ　Ｃｈｅｍ、２２：２５７（１９６ ７）、カナメら、Ａｎｎａｌｓ、Ｎ、Ｙ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、４２９：４９（１ ９８４）およびタイナーら、Ｊ、Ｍｏ１．Ｂｉｏｌ、１６０：１８１　（１９８ ２）を参照することができる。更なる金属ペプチド構造は、プルックハベン・デ ータ・バンクの結晶構造情報により、また［蛋白質構造の予想および蛋白質立体 配座の原理Ｊ、）７スマン編、第９１〜９４頁、ブレナム・プレス、Ｎ、　Ｙ。 （１９８９）の付録Ｉに認められる金属蛋白質の解説およびそれぞれに対する個 々の参照により三次元的に記載されている。 配位するアミノ酸残基の対のそれぞれは少なくとも１つの金属−配位子の配位し た接点を与える。よって、この発明の金属ペプチドの金属結合部位は、２つの、 ただし３つではない配位するアミノ酸残基によって形成される。 １つの態様では、配位するアミノ酸残基自体はｌを越える金属−配位子の配位し た接点を与える種類のものである、すなわちここに論するようにそれ自体２座、 ３座、４座等である。よって、配位するアミノ酸残基は少なくとも１つであるが ４以下の余興配位子の配位した接点を与える。 ペプチドの二次構造を安定化させる目的で金属ペプチド錯体の形成により、金属 結合部位をペプチドに加工する。この錯体は典型的には水性溶媒を含む組成物中 に存在し、金属結合部位はペプチド上に位置して、水性溶媒接近可能表面上にあ る、例えばペプチドの二次構造の親水性表面領域上にあるものとする。よって、 金属結合部位および配位するアミノ酸残基の対は、ペプチドの二次構造の親水性 表面領域（溶媒に露呈される親水性表面）に位置するものとし、溶液中の溶解し た金属陽イオンに金属結合部位が接近することを図る。 したがって１つの！ｉ！様では、本発明は、その配列の一部が親水性領域を含む 二次構造を形成するアミノ酸残基配列を有するペプチド、および親水性領域に局 在する金属結合部位を特定する一対の配位するアミノ酸残基（すなわち、配位す るアミノ酸残基は溶媒接近可能である）からなる安定化された二次構造を有する 金属ペプチドの使用を企図する。金属ペプチドは、それぞれの配位するアミノ酸 残基が少なくとも１つの金属−配位子配位接点を与えるよう金属−配位子配位接 点を介して金属結合部位に錯体化した金属陽イオンを更に含む。 好適な態様では、金属ペプチドは、水溶液中に存在する場合に親水性表面により αヘリックス、βシートまたはβターン二次構造を形成するアミノ酸残基配列か らなる。 二次構造がαヘリックスの場合、２つの配位するアミノ酸残基の好適な位置はペ プチド上でｉおよびｉ＋４の相対的位置にあり、その際、残基の側部基は、ヘリ ックスおよび親水性表面から離間して組成物の隣接する水性溶媒中へと延在する 。別に言えば、金属ペプチドの配位するアミノ酸残基は、次の式による３つのス ペーサ残基によって分離されるニ ーＺ−Ｕ−Ｕ−Ｕ−Ｂ− （式中、ＺおよびＢは同一または異なる配位するアミノ酸残基を示し、Ｕは同一 または異なるスペーサアミノ酸残基、好ましくは天然に存在する残基を示す）。 二次構造がβターンを有するβシートである場合、２つの配位するアミノ酸残基 の好適な位置は、ペプチド上のｉおよびｉ　−１−３の相対的位置またはｉ−１ およびｉ＋５の相対的位置とし　その際、残基の側部基はβ鎖およびβターンに より特定される平面から離間して延在し、ペプチドの隣接する水性溶媒へと延在 する。 よって、金属ペプチドの配位するアミノ酸残基は、それぞれ次の式による２〜５ のスペーサ残基により分離されるニ ーＺ−Ｕ−Ｕ−Ｂ−または−Ｚ−Ｕ−Ｕ−Ｕ−Ｕ−Ｕ−Ｂ〜（式中、Ｚ、Ｂおよ びＵは前記特定した通りである）。 βシルトおよびβターンの両者を含むβターン構造では、慣用的な命名法によれ ば、ターンの始まりのｌ残基前の位置でβシート内に局在する残基が残基ｉとし て同定される。よって位置ｉ−１は、βターンの始まりの２残基前の位置に局在 する。 安定化された二次構造を有する金属ペプチドを調製し使用する場合、安定化の機 構の知識を使用し、所定の金属結合部位の位置を決定する。αヘリックスおよび β鎖およびβターンを含むβシートのような二次構造は、無作為コイル構造を克 服するようなペプチド残基間の十分な相互作用が起るまでは、動力学的に有利で はない。このような原理は、無秩序構造の可能性が少なく特定の立体配座に折り 畳まれて安定化相互作用を与える比較的小さいペプチドに特に適用し得るもので ある。 秩序化された構造の形成の際の核形成の事態は最初のターンの安定化および形成 であるが、これは有利性が最も少なく、したがって律速段階である。αヘリック スの最初のターンが一旦安定化されたならば、ヘリックスを形成する潜在能力を 有するペプチドの領域を下る安定化位置転移は触媒的である。よって、金属−ペ プチド錯体形成によるヘリックスの最初のターンに至る一対の残基の局在した安 定化により、ヘリックスの長さに沿う安定化が促進される。したがって、この核 形成の事態は最初のへソックスの安定化に至り得て、これにより次にαヘリック スまたはβ鎖のような更に遠い二次構造を安定化する支持が与えられる。 核形成の事態によりαへソックスが正に安定化されることから、実際、βターン において核形成が起ると共にそのβターンで始まる全ゆるβ鎖を下る位置転移が 起ることにより、このような最初の核形成の事態によってβシート全体が安定化 される。 よって、核形成による安定化に際し、金属結合部位はより大きいペプチド二次構 造を安定化することができ、ペプチドの三次構造の安定化に寄与することができ る。安定化されるペプチドが、生物学的機能に必要な分子相互作用のための部位 を有する生物学的に活性な分子である場合、安定化する金属結合部位をペプチド の生物学的に活性な部位から離間して位置させるのが有利である。位置転移し得 る安定化により、金属結合部位を生物学的に活性な領域から離間して位置させる ことによって、生物学的機能を破壊することなく公知の生物学的に活性なペプチ ドを変化させることができる。 金属ペプチド中に存在するアミノ酸残基であって、金属イオン−配位子錯体との 配位する接点を与える残基は、ここでは配位するアミノ酸残基として言及する。 金属ペプチド中の配位するアミノ酸残基として使用するのに適切なアミノ酸残基 には、金属蛋白質中で金属陽イオンのための配位子を与えることが当業界で公知 の天然に存在するアミノ酸残基が包含され、Ｈｉ　ｓ、Ｃｙｓ、Ｍｅｔ等の残基 が包含される。 好適な態様では、配位するアミノ酸残基の対は、ＨｉｓとＨｉｓ、ＨｉｓとＣｙ ｓまたはＨｉｓとＭｅｔとすることができる。特に好適なのは、それぞれの配位 するアミノ酸残基がＨｉｓである対である。 天然に存在するアミノ酸に加えて、例えばアミノ酸アナログのような天然に存在 しないアミノ酸も用いることができる。天然に存在しないアミノ酸を使用する明 らかな利点は、これによりペプチド骨格を適切な金属イオン−配位子錯体に連結 すべく働くアミノ酸残基の対の選択に非常に大きい柔軟性を与えることができる 占である。天然に存在しないアミノ酸残基は、所望のαヘリックスまたはβシー トが有利に安定化され得るよう、ペプチド鎖に沿って適切に離間して天然に存在 するアミノ酸残基と組合せても使用することができる。この後者の適用で使用す るのに適切な天然に存在するアミノ酸残基は前記したものと同一である。 適切な天然に存在しないアミノ酸を選択する過程は、天然に存在するアミノ酸残 基の選択に近似する。例えば、天然および天然に存在しないアミノ酸両者の好適 な聾様は、例えはＨｉｓおよびＣｙｓのように金属中心に直接結合する窒素また は硫黄原子を含むものである。 金属ペプチドに使用する適切な天然に存在しないアミノ酸の選択に際して更に考 慮することは「キレート効果」である。「キレート効果Ｊは配位化学の当業界で 周知であり、ｌを越える結合中心（金属−配位子配位接点）を有する配位子がな ぜ１のみの結合中心を有する配位子より金属イオンを結合するより大きい傾向を 示すかを説明するものである。金属イオンと配位子との結合の性状は通常はイオ ン性であるとして特徴付けられるが、これを共有結合型とすることもできる。 キレート効果は、キレート化の際の金属の配位球体からの溶媒分子の解離の際の エントロピーの減少のために金属−配位子錯体の安定性が増強される熱力学的現 象である。よって、配位子は、金属陽イオンをキレートできる場合は、より強力 かつ優先的に結合する。 特定のαヘリックスまたはβシート二次構造を安定化するのに最も適合する一対 の配位するアミノ酸残基および金属イオンを同定するに際し、主たる判断基準は 、配位子が関連する反応条件下で選択した金属イオンに強（結合するという点で ある。天然に存在しないアミノ酸の末端基をペプチド骨格に連結する側鎖の長さ のような他の変数は、適切な配位子を同定した後に決定することができる。これ は、側鎖の長さは選択した配位子の種類に依存するためである。 一般に、金属イオンに結合させるための好適な配位子の同定は、最初にペプチド 骨格に結合させる所望の配位子を決定し、その後その配位子に強く結合する金属 イオンを同定することにより行うことができるが、あるいは続いて同定される好 適な配位子を用いて所望の金属イオンを最初に同定することかできる。よって、 好適な配位子を同定し、その後その配位子への結合の際のその有効性について金 属イオン候補物を検索する。その他、好適な金属イオンの同定の後に配位子を検 索することができる。この種の検索方法は当業者に周知である。 金属ペプチドは、ペプチド骨格に沿プ適切な空間配置で置換された配位するアミ ノ酸残基を有することができる。これらの配位するアミノ酸残基の側鎖は、側鎖 の末端終端に局在する結合部分にペプチド骨格を結合させるべく働くスペーサ基 を有することができる。適切な空間配置基にはメチレン鎖、フェニル基およびこ れらの組合せが含まれる。好適な空間配置基には、末端結合基を側鎖に結合させ るよう働くアミド基が含まれる。他の多くの空間配置基が当業者に明らかである 。 適切なスペーサ基の同定の際に考慮される因子には、スペーサ基の熱安定性、お よび折畳まれたペプチド中のαヘリックスまたはβシートの形成の阻害を回避す るスペーサ基の能力が包含される。適切なスペーサ基を同定する際の他の重要な 因子は、アミノ酸に対する別々に調製された配位子の結合の容易性である。好ま しくは、アミノ酸残基は、側鎖並びに別々に調製された配位子と容易に反応する 反応部位を含む。この種の反応様式の例は、側鎖の酸基と配位子の反応性アミノ 基との縮合、並びに側鎖アミノ官能価と配位子のカルボキシル基との縮合である 。 好適な天然に存在しない配位するアミノ酸は、その側部鎖にジアセタトアミノ（ ＤＡＡ）末端を有する。好ましくはＤＡＡ基を樹脂結合ペプチドに組込み、配位 するアミノ酸の位置に対応するアミノ酸残基配列の２つのオルニチンを組込む。 よって、オルニチンは、フルオレニルメチルオキシカルボニル（Ｆ−Ｍｏｃ）ブ ロックペプチドのｔ−ブトキシカルボニル（ｔ−Ｂｏｃ）により優先的にブロッ クされる。Ｂｏｃ基をトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）により除去し、その後ジイソ プロピルエチルアミン中で過剰のベンジルブロモ酢酸と反応させる。その後アミ ノ酸の窒素原子を酢酸基に結合させる。最後にＭｏｃ基を除去し、所望に応じて アセチル化し得る末端アミン基を与える。 配位子をアミノ酸側鎖に結合させる第２のアプローチはアミド結合形成を含むも のである。よって、例えば、ジクロロビス（トリフェニルホスフィノ）パラジウ ム触媒の存在下で６−クロロニコチン酸エステルおよびトリメチル錫ピリジンを 反応させる。生成物をケン化し、プロトン化して５−カルボキシルー２．２′− ビピリジンを生成し、その後脱プロトン化したオルニチンおよびジシクロへキシ ルカルボッイミドと組合せてアミド結合を形成する。 結合配位子部分、例えばＮ−Ｎキレート化基をアミノ酸に結合させるなお他の方 法は、ベンンルアスバルテートのＢｏｃ誘導体を作製することを含む。カルボジ イミドの存在下にジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）中で生成物を５−アミノ−２ ，２′−ビピリジンに結合させる。エタノール中で木炭上にてＰｄにより水素を 用いてアミドカルボニル基を還元する。この結果得られる２座アミノ酸を、標準 的なｔ−Ｂｏａ化学を使用してペプチドに組込む。 前記論じたのと類似する化学を使用し、表１に示す配位子を調製する。 前記したように、好適な配位子は選択した金属に依存し、また逆に選択される金 属イオンは好適な結合配位子に依存する。例えば、好適な配位子が窒素孤立対を 含む場合［例えばＲｕ　（Ｉ　Ｉ）またはＲｕ　（Ｉ　Ｉ　Ｉ）を安定化金属イ オンとして使用する場合］、窒素孤立対に帰着し得るルイス塩基性を有する全ゆ るＮ含有化合物を使用することができる（例えばアミノ酸に結合したピリジン） 。同様に、窒素中心が相対的に陰性に荷電する場合であれば（例えばＮ−ビロー ルおよびポリフィリン様化合物を用いる）、金属イオンにより強い結合対を期待 することかできる。更に、与えられた結合配位子に随伴するキレート効果により 、更なる好適な結合配位子の同定が補助される。好ましくは、金属上の２または ３の配位部位がこの種のキレート基により占有されるものとする。 例示的な好適な窒素キレート化配位子には、フェナンスロリンおよびビピリジン 配位子が包含される。この種の配位子は好適な金属イオン上で２つの配位部位を 占有する。フェナンスロリンおよびビピリジン配位子は、便利にはそれぞれのＮ −配位子とアミノ酸骨格単位から延在する適切な官能基との間の縮合によってペ プチド骨格に結合させることができる。例えば、アスパラギン酸またはグルタミ ン酸は、先に記載したようにアミノ酸と対応するＮ−配位子のアミノ誘導体との 縮合に際して側鎖カルボキシル基を介してフェナンスロリンまたはビピリジンに 結合させることができる。同様に、好適な配位子が１〜３の硫黄（中性または陰 イオン性）原子を含む場合であれば、アルキリデン側鎖および縮合結合等を介し て配位子を結合させることができる。また、窒素含有配位子と硫黄含有配位子と の組合せを用いて金属イオンを配位させることもできる。 好適な配位子として働き得る窒素誘導体の他の例には、ペプチドの骨格鎖に空間 配置基を介して結合するピリジンおよびピラジンのような単座配位子が包含され る。他の好適なキレート化配位子には、Ｉ、２−ジアミノエタン、ビスピリジル メタン、ポルフィリン様キレート化配位子（脱プロトン化に際して２座様式で金 属イオンに強く結合する）、３座間位子、例えばジアセタタトアミンおよび４座 間位子、例えばトリエチレンテトラミンが包含される。他の１．２．３および４ 　（四）座配位子を表１に示すが、なお他のものは当業者に明らかであろう。 好適な配位するアミノ酸残基は次の式を有する。 ＨＯ，Ｃ−ＣＨ（Ｒ）−ＮＨ。 （式中、Ｒ＝　（ＣＨ，）、−Ｎ　（Ｃｕｔ　Ｃｏｔ　Ｈ）、およびｎ＝１．２ ．３または４）。特に好適なのはｎ＝３の天然に存在しないアミノ酸残基である 。この好適な配位するアミノ酸残基を含むペプチドを以下の表２に示し、ペプチ ド配列番号：ＩＩとする。 更なる好適な態様には、次の式を有する配位するアミノ酸が含まれる：Ｈｏｔ　 Ｃ−ＣＨ（Ｒ）−ＮＨ２ （式中、Ｒ＝　（ＣＨＩ　）、−ＮＨ−Ｃ（０）−５−［２，２’−ビピリジル ］およびｎ−１，２または３）。特に好適なのはｎ＝３の天然に存在しないアミ ノ酸残基である。 他の好適な態様には、次の式を有する配位するアミノ酸が含まれる：ＨＯ，Ｃ− ＣＨ（Ｒ）−ＮＨ。 （式中、Ｒ＝　（ＣＨｔ　）、−ＮＨ−Ｃ（０）−５−［１，Ｉ　Ｏ−フェナン スロリン］およびｎ＝１．２または３）。 表２ ペプチド名称　アミノ酸残基配列 （配列番号） ２　Ａｃ−Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｌｙｓ−Ｇｌｕ−人１ａ −人１ａ−人１ａ−Ｌｙｓ−Ｃｙｓ−人１ａ−Ａｌａ−λ１ａ−Ｈ１ｓ−人１ａ −ＣＯＮ）Ｉ。 ３　Ａｃ−人１ａ−Ｇｌｕ−人１ａ−Ａｌａ−λ１ｍ−Ｌｙｓ−Ｇｌｕ−人１ａ −Ａｌａ−λｌａ−Ｌｙｓ−Ｈ１ｇ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｈｌｓ−Ａｌａ −ＣＯＮ）Ｉ。 ４　人ｃ−Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ａｌａ−＾１ａ−Ａｌａ−Ｌｙｓ−）１ｉｓ−Ａｌ ａ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｈｉｓ−Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ａｌａ−人１ａ−Ｉ、ｙｓ−人 １ａ−ＣＯＩＪＨ２５Ａｃ−人１ａ−Ｗｉｇ−＾１ａ−Ａｌａ−＾１ａ−）１ｉ ｓ−Ｇｌｕ−Ａｌａ−人１ａ−人１ａ−Ｌｙｓ−Ｇｌｕ−人１ａ−ｉｌａ−Ａｌ ａ−Ｌｙ＋ｓ−人１ａ−ＣＣＨＪＨ２６人Ｃ−人ｘａ−ｃｙｓ−人１ａ−人１ａ −Ａｌａ−Ｈｉｓ−Ｇｌｕ−人１ａ−人１ａ−Ａｌａ−Ｌｙｓ−Ｇｌｕ−人１ａ −Ａｌａ−Ａｌａ−Ｌｙｓ−Ａｌａ−ＣＯ）ｒｒ！。 ７　＾Ｃ−人１ａ−Ａｌａ−Ｈｉｓ−＾１ａ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ｈｉｓ−Ｇｌｎ −Ａｌａ−Ｌｙｓ−Ａｌｑ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ−Ｇｌｕ−Ａｌａ−＾１ａ−Ｇｌｎ −Ｌｙｓ−人１ａ−ＣＯＮ’Ｈ２ ８Ａｃ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｃｙｓ−＾１ａ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ｈｉｓ−Ｇｌｎ− 人１ａ−ｚ、ｙｓ−Ａｌａ−ＩＪ！ｕ−ＬｙＳ−Ｇｌｕ−＾１ａ−Ａｌａ−ｃｌ ｎ−Ｌｙｓ−人１ａ−ＣＯＮ）Ｉ２ ９　Ａｃ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｈｌｓ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ｃｙｓ−Ｇｌｎ −Ａｌａ−Ｌｙｓ−人１ａ−Ｌａｕ−Ｌｙｓ−Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｇｌ’ ｎ−Ｌｙｉ−人１ａ−ＯＮＭ２ １０　＾ｃ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｘｍａ、−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ｘａａ、− Ｇｌｎ−１１　＾ｃ−Ａｌａ−人１ａ−Ｘａａ２−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ａ ｌａ２−Ｇｌｎ−＾１ａ−Ｌｙｓ−人１ａ−Ｉａｕ−Ｌｙｓ−Ｇｌｕ−Ａｌａ− Ａｌａ−Ｇｌｎ−Ｌｙｓ−人１ａ−ＣＯ）ｉＨ２ Ａｃはアセチル化アミノ末端を示す。 Ｃ０ＮＨｔはアミド化カルボキシル末端を示す。 配列番号＝ｌＯのアミノ酸残基配列位置３および７のＸａａ、は、次の式を有す る天然に存在しないアミノ酸を示す″（Ｎｌ（、ＸＣＯ，Ｈ）ＣＨ（ＣＨ，）、 ＮＨＣ（ＯＸ　５−　［２、２’−ビピリジン］）配列番号、１１のアミノ酸残 基配列位置３および７のＸａａｔは、次の式を有する天然に存在しないアミノ酸 を示すコ（Ｎ）ｌ！　）（ＣＯｔＨ）ＣＩ（ＣＨＩ　）３Ｎ（Ｃ）ＩｆＣＯ２Ｈ ）！ここでは例えば「配列番号：１」のような配列同定番号によって全てのペプ チドに言及し、この明細書の配列列記の部分に更に記載するものとする。 また、選択された配位子は、同定された金属イオンに互いに配位により結合する 異なる種類の結合部分の組合せをそれぞれ取入れることができる。例えば、ジア セタトアミノ基を側鎖の末端終端に付けて、金属中心に強く配位する天然に存在 しないアミノ酸を生成することができる。同様に、組合せたアミノ−スルフィド 配位子、アミノ−ホスフェート、アミノ−スルホナト、アミノ−カルボキンレー トおよびアミノ−ホスフィノ配位子を使用し、好適な様式で結合する金属イオン をキレート化し、ペプチド立体配座の安定性を増強することができる。 天然に存在しないアミノ酸をペプチド鎖に一旦組入れたならば、溶液中のペプチ ド化合物と同定された金属イオンの適切な塩とを単純に混合することにより、得 られた修飾ペプチドを好適な金属陽イオンと反応させることができる。ペプチド は、金属イオンの配位球体から水分子を放出するその配位子付着側鎖を介して金 属イオンと反応する。金属イオンは、架橋様式で２つの配位子と反応する。 架橋金属イオン含有錯体を一旦形成したならば、これらを「交換不活性」の様式 で操作して金属イオン−配位子錯体の一体性を維持し、これにより反応条件下で ペプチドまたは蛋白質の二次構造を安定化する。好適な配位子は金属の配位球体 に対して交換不活性である、すなわち配位子が金属イオンに一旦配位したならば 、これは金属イオンから解離する傾向は僅がしか有さない。 金属イオンに配位させる選択ペプチドを、標的ペプチドに対するその後の結合の ために調製するようなペプチドも調製することができる。更に典型的には、ペプ チドは、増強すべき所望の立体配座からなるものとする。２つの天然に存在する アミノ酸、または適切な離間距離で天然に存在しないアミノ酸に対して、または 金属イオンを介して結合した天然に存在しないアミノ酸に対して結合した１つの 天然に存在するアミノ酸を介して予備選択した金属イオンにペプチドを結合させ る。この種の組成物は、溶液中で有利なαヘリックスまたはβシート立体配座を 採用する金属−配位子錯体により、水溶液中で増強した安定性を有する。 特定の金属ペプチドの全ゆる特定の配位子について金属の優先性を同定すること ができる。例えば実施例３Ａ　（２）に記載する結果を参照することができ、こ の場合表２のペプチド配列番号＝２および３によって形成された金属結合部位に ついて金属イオン優先性を同定する。 金属ペプチド中で交換不活性の錯体を形成する金属イオンが好適である。好適な 交換不活性金属錯体は、テトラアンモニウムＲｕ　（Ｉ　Ｉ　Ｉ）錯体を含むも のである。 例示的な錯体は次の式を有する： ｃ　ｉｓ　［Ｒｕ　（Ｌ）　、（Ｌ’　）　（Ｌ”　）］　”式中、Ｌ′および Ｌ″は一対の配位するアミノ酸残基により与えられる配位する配位子であり、Ｌ は周知の１．２または３座間位子、例えばＮＨｓ　、エチレンジアミン（ｅｎ） 、トリエチレンテトラアミン（ｔｒｉｅｎ）または２．２’−ビピリジン（ｂｉ ｐｙ）であり、ＬがＮＨｓのような単座の場合ｎは４であり、Ｌがｅｎまたはｂ ｉｐｙのような２座の場合ｎは２であり、Ｌがｔｒｉｅｎのような３座の場合ｎ はｌである。 金属ポリペプチド中で交換不活性の金属錯体を形成するのに適切なものとして、 （Ｔ　Ｉ）酸化状態のＲｕ錯体も企図する。ただし、Ｒｕ　（Ｉ　Ｉ）は、Ｒｕ （ＩＩ■）錯体程不活性ではない交換不活性な金属錯体を形成する。 金属ペプチドの成分として使用する金属イオンは、金属ポリペプチドに関して前 記したように好ましくは多価金属イオンとする。唯一の制限は、この種の多価金 属イオンの錯体化は、金属ペプチドの金属結合部位を特定する２つの配位するア ミノ酸残基によって与えられる配位子により生起するという点である。 特に好適な態様では、金属イオン配位子錯体はテトラアミノＲｕ　（Ｉ　Ｉ　Ｉ ）錯体とし、その際、ｉおよびｉ＋４の相対的位置の一対のＨｉｓ残基によって 配位子を与える。例は実施例２Ｂに記載するペプチド配列番号＝３のＲｕ（ＩＩ Ｄ錯体である。他の態様では、金属ペプチド組成物中で末端のいずれかを修飾し 、金属イオン−配位子錯体形成による安定化を更に与えることができる。ペプチ ドの元のカルボキシル末端をアミド化することにより、カルボキシル末端の強い 荷電双極子が低減される。荷電の低減によりαヘリックスの安定化が促進される 。 ペプチドのアミノ末端をアセチル化することによるアミノ末端における荷電の低 減によってもヘリックスの安定化を促進することができる。 アミノおよび／またはカルボキシル末端で荷電双極子を除去することによる更に 安定化するαヘリックス二次構造の特徴は、安定化するβ鎖およびβターン構造 にも適用される。よって、好適な態様では、金属ペプチドは荷電双極子を低減す る修飾したアミノまたはカルボキシル末端も含む。末端アミノ酸残基に対する多 数の化学修飾を使用して荷電を低減することができるが、好適な修飾は遊離のア ミノ末端のアセチル化および遊離のカルボキシル末端のアミド化である。 二次構造の安定化のエネルギー論が二次構造の程度（すなわち、αヘリックスま たはβシート構造の長さ）に依存する限り、大きいヘリックスまたはシート構造 が小さいヘリックスまたはシート構造よりエネルギー的に有利であることが理解 される。この点に関して、二次構造を不安定化する荷電したアミノまたはカルボ キシル末端の前記した望ましくない効果は、逆に特定の二次構造の大きさに比例 する。 実際、典型的にには約３０アミノ酸残基を越える非常に大きいペプチドの末端の 修飾は、金属ペプチド錯体形成による二次構造の安定化を実質的には改良しない 。よって、ペプチド末端の前記した修飾は、好ましくはより不安定な二次構造を 有する比較的小さいペプチド、すなわち長さにして約３０アミノ酸未満、好まし くは長さにして約１５アミノ酸未満のペプチドに限定される。 安定化された二次構造を有する金属ペプチドを調製する方法は、典型的には予備 選択されたペプチドの調製を含み、ペプチドの選択された領域に配位するアミノ 酸残基を含ませるものとし、金属結合部位を与えるものとする。その後過剰の調 製したペプチドを金属陽イオンと錯体化し、金属イオン配位子錯体とそれぞれの 対の配位するアミノ酸残基との間の接点を含む金属イオン−配位子錯体を有する 金属ペプチドを形成する。先に記載したように、ペプチド内の二次構造を安定化 させる試みは、二次構造を特定する全ゆる与えられたペプチドの独特の環境のた めに困難であることが分った。よって、例えば二次構造を安定化させる内部鎮共 存結合に関与する正確な結合の長さは、ペプチドの二次構造が十分に特徴付けら れている限定された場合にのみ成功裡に決定された。 好適な金属イオンを決定する日常的な手順を使用し、ペプチド内に加工した金属 結合部位と錯体化させ、これにより金属−配位子錯体を有する金属ペプチドおよ び結果的に得られる安定化した二次構造の調製を可能とする。 この種の日常的な手順の鍵となる特徴は限定されてはいるが可変の数の金属イオ ンに基き、予備選択され加工された金属結合部位と錯体化する好適な金属イオン を決定する検索工程に利用可能であり、これにより金属結合部位を含むペプチド の二次構造をより安定にするものである。 利用可能な金属イオンの内、ある範囲の金属配位結合半径、結合角度および電子 を共有する傾向は、少なくとも幾分かのイオンが金属−配位子錯体化の適切な条 件を与え得るものとして示される。更に、錯体化する金属イオンの幾つかは、測 定可能で好ましくは少な（とも結果的に得られる金属ペプチドに存在する二次構 造を安定化する金属−配位子錯体を形成する。よって、利点および利益は再現し 得る容易性であり、これにより構造安定化金属−配位子錯体を同定し、これによ り安定化された二次構造を有する金属ペプチドを形成するものである。 ペプチドの二次構造の実質的な安定化とは、安定化される二次構造の程度が、ペ プチドの二次構造を安定化させる方法を実施した場合に少なくとも１０％、好ま しくは少な（とも５０％増加することを意味する。一対の配位するアミノ酸残基 を形成するのに含まれるアミノ酸置換は、金属ペプチドについて前記特定した全 ゆるアミノ酸残基とすることができる。例は実施例１で製造するペプチドに含ま れるアミノ酸残基であり、その幾つかは、天然に存在するアミノ酸残基からなる 配位するアミノ酸残基の対を含み、他は天然に存在しないアミノ酸残基からなる 対を含む。 一対の配位するアミノ酸残基を含むものとして対象ペプチドを調製した後、金属 イオンおよび許容し得る対イオンを有する溶解した金属塩の形態で金属ペプチド について前記開示したような金属イオンを含む水溶液とこのペプチドとを混合し て生物学的反応混合物を形成する。許容し得る対イオンは好ましくは１価とし、 基本的に溶解および金属ペプチド錯体形成に有利なイオンに対する解離定数を有 するものとする。 生物学的反応混合物は、錯体形成に有利な比率および濃度でペプチドおよび金属 イオンを含む。典型的には、ペプチドは混合物中に１μＭを越えて、好ましくは １０μＭを越えて存在する。金属イオンは好ましくはペプチドの少なくとも１モ ル等量で、更に好ましくは過剰で、例えばペプチドに対して５モル等量を越えて 存在するものとし、生物学的反応条件下で維持した場合に迅速かつ完全な金属〜 ペプチド錯体の形成を確保する。 その後、金属イオンが生物学的反応混合物中でペプチドと錯体化し、金属ペプチ ドを含む組成物を形成するのに十分な時間、生物学的反応条件下に生物学的反応 混合物を維持する。生物学的反応条件は、ペプチドの溶解性および遊離の金属イ オン溶液を維持する温度条件であり、典型的には約り℃〜約５０℃、好ましくは 約４°Ｃ〜約４０℃とする。 ペプチドの金属結合部位における配位子との金属イオンの錯体化は典型的には迅 速な速度で進行し、溶液を完全に混合して生物学的反応混合物を形成するのに必 要な時間で生として完了する。しかしながら、適切な酸化状態を有する金属イオ ンの製造に遅い還元工程が必要な場合、生物学的反応混合物に金属イオン前駆体 を還元する試薬を含ませるのが便利であり、これにより一旦還元された場合、還 元された金属イオンを利用してペプチドと反応（錯体化）させることができる。 この後者の手順の例を実施例２Ｂに記載するが、この場合はペプチドを錯体化さ せる同一の混合物中で亜鉛アマルガムにより６時間かけてルテニウム（ＩＩＩ） 錯体を還元する。 よって、１つの態様では、安定化された二次構造を有する金属ペプチドを調製す る方法は、 （ａ）予備選択されたアミノ酸残基配列を有するペプチドを調製しくその配列の 〜部は親水性領域を有するαヘリックス、βシートまたはβターンを形成し、ペ プチドは、水性溶媒接近可能で前記親水性領域中で金属結合部位を特定する２つ の配位するアミノ酸残基を含む）、 （ｂ）水溶液中でペプチドと予備選択した金属イオンとを混合することにより（ この金属イオンは配位するアミノ酸残基と金属との間の化学結合により金属結合 部位で金属ポリペプチド錯体を形成する）生物学的反応混合物を形成し、（ｃ） 金属イオンか金属−配位子配位接点を介して配位するアミノ酸残基に結合し、結 合した金属イオンによって安定化された非無作為の二次構造を有する金属ペプチ ド（すなわち金属ペプチド）を形成するのに十分な時間、生物学的反応条件下に 生物学的反応混合物を維持する工程を含む。形成された金属ペプチドは好ましく は回収する。 安定化された金属ペプチドを製造する方法の他の態様では、特定の金属イオンに ついて加工または決定された金属結合部位の優先性を決定するのが望ましい。 優先性を決定することにより、最大程度のペプチドの無作為二次構造の安定化を 生成する至適の金属イオンペプチド錯体を製造することができる。 特定のペプチドによって金属イオンの優先性を決定する方法は、最初に前記のよ うに一連の生物学的反応混合物を調製し、それぞれ意図するペプチドを含むもの とし、また異なる金属イオンも含むものとする。その後、前記のように生物学的 反応条件下で混合物を維持することにより、金属イオンがペプチドと錯体化して 金属ペプチドを形成し得るものとする。 その後一連の維持した生物学的反応混合物のそれぞれを、安定化された非無作為 二次構造の存在について、および好ましくは構造安定化の量（程度）について個 々に評価（決定）する。典型的には、金属イオンとの混合の前にペプチドの溶液 中に存在する二次構造の量を測定し、その後維持工程の後に生物学的反応混合物 中に存在する二次構造の量を測定することにより決定を行う。混合の前後を比較 した場合の溶液中の検出し得る非無作為二次構造の増加は、金属イオンがペプチ ドの金属結合部位と錯体化し、これによりこれに含まれる二次構造を安定化した ことを示す。 溶液中のペプチドの二次構造の変化（増加）の検出は、当業界で公知の種々の検 定により行うことができ、円偏光二色性（ＣＤ）の光学的σｊｌ定技術、ラマン スペクトル分析、および熱変性に対する感受性の物理的測定が含まれる。二次構 造を特徴付ける円偏光二色性および熱変性を一１１定する例示的な方法は、実施 例３Ａおよび３Ｂに詳細に記載する。 特定の金属イオンの混合によりペプチド中で誘導された非無作為二次構造の程度 を測定し、幾つかの異なる金属イオンを使用して結果を同時に評価することによ り、金属イオンについての金属結合部位の優先性を決定する。特定のペプチド金 属結合部位に結合するその「優先性」について幾つかの金属イオンを検索するこ の方法は、表２のペプチド配列番号：２．３．５および＋１について実施例３Ａ に示す。 実施例３Ａに記載する結果により、加工された金属結合部位を有する特定のペプ チドについて、ペプチドを有効に安定化し、結果的に得られる金属ペプチドの二 次構造の含量を増加させる１以上の金属イオンが同定されたことが分る。これら の安定化する金属イオンは、率直な検索手順によって容易に決定された。 更に、全ゆる特定の金属結合部位について、最も好適な金属イオンは、異なる金 属結合部位についての好適なイオンとは異なるものとすることができる。例えば 、ペプチド配列番号、２および３はＣｕ　（Ｉ　１）およびＺｕ　（Ｉ　Ｉ）に より優先的に安定化され［実施例３Ａ（２）］、ペプチド配列番号：３．４およ び５はＮ１（ＩＩ）により優先的に安定化され、ペプチド配列番号：１１はＣｕ 　（Ｉ　Ｉ）により優先的に安定化されるし実施例３Ａ　（３）］ことを銘記す べきである。 したがって、安定化された金属ペプチドを製造する方法は、所定のペプチドの非 無作為二次構造を錯体化し安定化するため、好適な金属イオンを決定する前記し た検索手順を組入れることができる。この態様では、この方法は前記の最初の３ つの工程（ａ）、（ｂ）および（ｃ）に加えて、（ｄ）工程（ｂ）で混合した金 属イオンとは異なる金属イオンを含む以外は前記同様に工程（ｂ）および（Ｃ） を実施し、（ｅ）工程（Ｃ）および（ｄ）で形成された維持した生物学的反応混 合物のそれぞれに存在するペプチドによって示される非無作為二次構造の相対的 な量を決定し、 ＣＦ’）工程（ｅ）の測定により最大量の非無作為二次構造を示す維持した混合 物を選択し、安定化された二次構造を有する金属ペプチドを形成する更なる工程 を含む。 前記したようにαヘリックス立体配座を有する金属ペプチドを調製するこれらの 方法の使用に加えて、これらの同じ方法を成功裡に使用し、１以上のβターン並 びにβシートを備えるβターンを有する金属ペプチドを調製した（以下の実施例 ６Ａおよび６Ｂ参照）。 線状両親媒性ペプチドが金属ペプチドを含む場合、金属ペプチドを安定化するの に使用する金属イオンは、好ましくは金属ポリペプチドのポリペプチド結合配位 子を結合するのに使用する多価金属イオンとは異なる。更に、金属ペプチドを安 定化するのに使用する金属イオンは、金属ポリペプチドのポリペプチド配位錯体 の形成または安定化を妨害しないよう選択するものとする。 ｄ、ポリペプチド配位アミノ酸−線状両親媒性ペプチド中のポリペプチド配位ア ミノ酸残基により、線状両親媒性ペプチドをポリペプチド結合配位子に共有結合 により結合させる。ポリペプチド配位アミノ酸残基は多価金属イオンに対するポ リペプチド結合配位子接点を与え、金属イオンの錯体化を配位形成すると共に金 属ポリペプチドのトポロジーを安定化する幾何配置である。 １つの態様では、ポリペプチド配位アミノ酸残基は、１のみのポリペプチド結合 配位子配位結合を与える（すなわち単座である）種類のものとする。 この発明の金属ポリペプチドでは、それぞれのポリペプチド配位アミノ酸残基は 、少なくとも１つのポリペプチド結合配位子配位結合を与える。 ポリペプチド結合配位子に対するポリペプチド配位アミノ酸残基の共有結合が線 状両親媒性ペプチドの立体配座を妨害しない限り、ポリペプチド配位アミノ酸残 基は、線状両親媒性ペプチドの全ゆる部位に局在することができる。好ましくは 、ポリペプチド配位アミノ酸残基は、線状両親媒性ペプチドのＮまたはＣ末端に 局在する。 ポリペプチド配位アミノ酸残基は、天然に存在するアミノ酸残基、または天然に 存在しないアミノ酸残基、例えばアミノ酸残基アナログとすることができる。 天然に存在しないアミノ酸残基を使用する明確な利点は、これにより線状両親媒 性ペプチドを適切なポリペプチド結合配位子に連結すべく働くポリペプチド配位 アミノ酸残基の選択に非常に大きい柔軟性を与えることができる点である。 ポリペプチド配位アミノ酸残基は、ポリペプチド結合配位子に対して直接共有結 合により結合させるか、またはポリペプチド配位アミノ酸残基とポリペプチド結 合配位子との間に散在させたスペーサ基を介して間接的に結合させる。スペーサ 基の長さおよび性状は、就中、用いる特定の結合配位子、ポリペプチド配位アミ ノ酸残基の性状、および金属ポリペプチドの所望のトポロジーに依存する。例示 的なスペーサ基は４アミノ酪酸および５−カルボキンブチル基（Ｎ−置換イミダ ゾール中に存在するようなもの）である。 ｅ、トポロジーの確認 ペプチドの二次構造の同定は現在では十分に開発された技術である。例えば、「 蛋白質構造の予想および蛋白質立体配座の原理」、ジー・ディ・フ７スマン編、 ブレナム・プレス（１９８９Ｌ特に第３０３〜３１６頁の付録１〜５の開示を参 照することができ、その開示を参考によりここに取入れる。 また、ペプチドの二次構造は、例えば三次元構造データを提供するＸ線結晶回折 等の技術によるペプチド標本の物理的分析によって同定することができる。 金属ポリペプチドにおけるトポロジー（非無作為二次構造）の特徴付けは、円偏 光二色性（ＣＤ）を含む種々の光学的測定またはラマンスペクトル分析により、 またｘｌｓ結晶回折手段によって行うことができる。更に、既知の一次アミノ酸 残基配列に適用した場合は、二次構造中の親水性領域の同定を含む非無作為二次 構造の予想モデルを、コンピュータによるモデル化プログラムの使用によって作 成することができる。 例えば、平行テトラヘリックス金属ポリペプチドの成功裡の形成は、幾つかの直 接的な実験によって確立される。まず、ポリペプチド配位錯体は、テトラマー構 成の形成を確立する重要なスペクトル分析プローブとして働く。与えられたポリ ペプチド配位錯体の特徴であるＵＶ−Ｖｉｓ吸収およびＩＲ振動バンドを使用し てこの種の判断基準を確立する。更に、テトラマー金属ポリペプチドの形成は、 寸法排除クロマトグラフ仁沈降平衡遠心分離、質量分析等の技術により確定する ことができる。 線状両親媒性ペプチドが短い場合、主として分子内疎水性相互作用により二次構 造が安定化される。よって、分子内集合体の形成は、二次構造含量の増加を伴う と考えられる。したがって、最も線状である両親媒性ペプチドは低い濃度（１〜 ＩＯμＭ）で無作為溶液立体配座を示すことから、テトラマー金属ポリペプチド における高いヘリックス含量の観察は、ペプチドが金属イオン補助分子内自己会 合プロセスを経たことを示すものである。 更に、ヘリックス安定化に至るテトラマー金属ポリペプチドにおける鎖内疎水性 相互作用は、本設計の予期された熱力学的結果である。まず、ペプチドに随伴す る転移および回転エントロピーの喪失は、ポリペプチド配位錯体の形成によって 補償される。その後線状両親媒性ペプチドは空間的に密に折畳まれ、これはエン トロピー的に有利な鎖内疎水性相互作用、またヘリックス二次構造の開始に至る 。 テトラキスピリジルおよびイミダゾリル錯体の形成により４つのペプチドのＮ末 端が空間的に近くに必然的に引寄せられるため、千行鎮内ヘリックス−へりック ス相互作用について劇的な二次構造の誘導をもたらし得る熱力学的に許容された 形式は２つのみとなる。隣接するヘリックスと係合するそれぞれのヘリッークス の疎水性表面により所望のテトラヘリックストポロジーが形成されるか、または テトラキス錯体中の３つのペプチドのみが相互作用し、溶液中で無作為の配向に ある第４のサブユニットと共に３つの鎖のヘリックスコイル状コイルを形成する 。 これらの２つの可能性は、金属ポリペプチド濃度に対する非無作為の二次構造誘 導の依存性を測定することによって容易に区別することができる。 溶媒に露呈される疎水性表面を欠如するテトラヘリックス構造は、金属ポリペプ チド濃度に依存しないＣＤスペクトルを示すのに対し、更なる分子内相互作用に 利用可能である第４の合致しない線状両親媒性ペプチドを有する三重鎖構造は、 典型的には濃度依存性のＣＤスペクトルを示す。テトラキス金属ポリペプチド錯 体中で２対の２つの鎖のコイル状コイル構造が形成される可能性は少ない。２つ の鎖のヘリックスコイル状コイル構造はこの長さのへワックスでは安定ではない ことは周知であるからである。したがって、前記検討により、平行テトラヘリッ クストポロジーの形成を疑いなく確立することができる。２ＤＮＭＲスペクトル 分析またはＸ線結晶回折により高分解能の構造決定を行うこともできる。Ｃ０５ Ｙ、ＴＯＣ３ＹおよびＮ０ＥＳＹのような２ＤＮＭＲ技術は、新たに設計された 金属ポリペプチドの二次構造を確立するために日常的に使用される。ＮＯＥおよ び距離幾何学計算によってテトラヘリックス金属ポリペプチドのトポロジーを決 定する際は、幾つかの点が考慮すべき重要なものである。 金属ポリペプチドは４つの同一のへワックスで構成されているが、これは一方で 二次構造測定を単純なものにするものの（Ｃ４対称分子について１組のへワック スシグナルが予期される）、他方では大半のへワックス内ＮＯＥを帰属するのが 困離となる。この種の対称な分子については、所望のトポロジーの非存在下では おそら＜ＮＯＥ効果を何ら示さないアミノ酸残基の側鎖間のへワックス内Ｎ。 Ｅ効果により、トポロジーについての情報を取得することができる。その後へワ ックス内ＮＯＥを距離幾何学計算に使用し、テトラヘリックス金属ポリペプチド の更に洗練されたモデルを与えることができる。 Ｉｌ、金属イオン補助自己会合合成決 別の特徴においては、本発明は金属ポリペプチドを調製するための金属イオン補 助自己会合合成法に関する。合成法は、典型的には以下の設計原理に従う。 ａ）自己会合法に使用される直鎖状両親媒性ペプチドの各々は、少なくとも１個 の、多価金属イオンに配位結合するためのポリペプチド結合配位子を供与する。 ｂ）線状両親媒性ペプチドは、ある意味においてはペプチドが望ましい非無作為 立体配座（すなわち、αヘリックス、βシート、βターン）であると仮定される 場合のみ、空間ににおいて多価金属イオンと配位結合するのに充分近いポリペプ チド結合配位子であるように設計されている。 Ｃ）ポリペプチド配位錯体の配列は、所望のトポロジーの形成に都合がよく、そ の他の可能な構造配列を許容しないか又は不都合である。 ｄ）ポリペプチド配位錯体は、所望の金属ポリペプチドの熱力学的安定性に寄与 するのに充分高い形成定数を有する。 更に、得られる金属ポリペプチド集団の単離、精製、及び物理化学的特性を単純 化するために、金属ポリペプチドは又高い動力学的安定性を示すこと、すなわち 交換不活性であることが好ましい。 金属ポリペプチドの合成における線状両親媒性ペプチドの使用は、主として集成 プロセスに関与する線状両親媒性ペプチドの数並びに相対的な空間配向の制御に 依存する。ポリペプチド配位錯体の結合エネルギー及び金属イオン−ポリペプチ ド結合配位子相互作用のために存在する厳しい幾何学的要件が、線状両親媒性ペ プチドのオリゴマーの状態並びに相対的な配向を制御するのに使用される。 所望のトポロジーを有する金属ポリペプチドの合成及び構築には２つの方法を使 用しつる。第一の方法（Ａ）は以下の工程を含む。 ａ）ペプチド部分が線状両親媒性ペプチドであり、配位子部分が２乃至８個の配 位部位を有する水溶性多価金属イオンとポリペプチド配位錯体を形成するポリペ プチド結合配位子である単離されたペプチド−配位子複合体を提供する工程。 ｂ）過剰量の前記ペプチド−配位子複合体を、液体媒体中で前記水溶性多価金属 イオンと混合して反応混合物を形成する工程（前記過剰量とは、前記ペプチド− 配位子複合体のモル数が前記多価金属イオンの配位部位のモル数より多いことを 意味する）。 Ｃ）前記反応混合物を、前記ペプチド−配位子複合体及び前記多価金属イオンが ２乃至８個の線状両親媒性ペプチドを有する金属ポリペプチドを形成するのに充 分な時間充分な条件下に保持する工程。 第二の方法（Ｂ）は以下の工程を含む。 ａ）２乃至８個のポリペプチド結合配位子に結合した２乃至８個の配位部位を有 する水溶性多価金属イオンを有するポリペプチド配位錯体を液体媒体中に提供す る工程。 ｂ）前記ポリペプチド配位錯体を過剰量の線状両親媒性ペプチドと混合して反応 混合物を形成する工程（前記過剰量とは、前記直鎖状両親媒性ペプチドのモル数 が前記ポリペプチド配位錯体のモル数より多いことを意味する）。 Ｃ）前記反応混合物を、前記ポリペプチド配位錯体及び前記線状両親媒性ペプチ ドが２乃至８個の線状両親媒性ペプチドを有する金属ポリペプチドを形成するの に充分な時間充分な条件下に保持する工程。 方法（Ａ）によれば、ポリペプチド配位アミノ酸残基を有する線状両親媒性ペプ チドは、例えば標準メリフィールド固相方法論によりベンズヒドリルアミン樹脂 上に合成される。 次いで樹脂結合ペプチドをスペーサ部分及びポリペプチド結合配位子と反応させ 、ペプチド−配位子接合体を形成する。例えば、ポリペプチド結合配位子が３− カルボキシルピリジンであり、スペーサ基がアミノ酪酸である場合には、樹脂結 合ペプチドをｔ−Ｂｏｃ保護４−アミノ酪酸と反応させ、Ｉ−Ｂｏｃの脱保護及 びπＡによる処理の後、標準ＤＣＣ−）Ｉｏｂｔ法によりニコチン酸（３−カル ボキシルピリジン）とカップリングさせる。 ポリペプチド結合配位子がイミダゾリルであり、スペーサ基か５−カルボキシル ブチルである場合には、樹脂結合ペプチドを直接５−（ｌ−イミダゾリル）ペン タン酸と反応させる。５−（ｌ−イミダゾリル）ペンタン酸は、当業者に公知で あるように、Ｄ＋ｌｌＦ又はテトラヒドロフラン（ＴＨＦ）中で過剰量のナトリ ウムイミダゾレートを５−ブロモ又は５−クロロペンクン酸と反応させることに より一工程で合成しうる。 同様なＮ−置換Ｃ３〜Ｃ，アルキルカルボキシイミダゾールは、２−クロロ酢酸 又は６−タロロカブロン酸のような同様なω−ハロＣ１〜ｃ６カルボン酸を用い 同様な化学により調製しうる。 次いで樹脂結合ペプチド−配位子接合体は、脱保護された、樹脂のないペプチド 側鎖を与える標準条件下で無水フッ化水素酸で処理する（ピリジル部分もイミダ ゾリル部分も無水酸に対して非常に安定である）。次いでペプチド−配位子複合 体を、典型的には逆相高圧液体クロマトグラフィー（ＲＰ　ＨＰＬＣ）により単 離及び精製し、アミノ酸分析及び質量スペクトルにより特性決定する。 液体媒体中でペプチド−配位子接合体を２乃至８個の配位部位を有する水溶性多 価イオンと混合して反応混合物を形成することによりポリペプチド配位錯体が形 成される。 反応混合物を、２乃至８個の線状両親媒性ペプチドを含む金属ポリペプチドを形 成するのに充分な時間充分な条件下に保持する。金属ポリペプチドを形成するの に必要な時間及び条件は、当業者に公知であるように多価金属イオン及びペプチ ド−配位子接合体に依存する。 交換活性なポリペプチド配位錯体を形成するのに使用するペプチド−配位子接合 体及び金属イオンの相対的な割合は、主として多価金属イオンの特定の結合配位 子に対する親和性に依存する。典型的には、ペプチドは、配位錯体の形成を確実 にするために多価金属イオンの配位部位の数より多いモル数存在する。　−交換 不活性な配位錯体を形成するのに使用するペプチド−配位子接合体の多価金属イ オンの配位部位に対する相対的な割合は、約２＝１乃至１：１である。好ましく は、ペプチド−配位子接合体は多価金属イオンの配位部位の数より多いモル数存 在する。 交換不活性なポリペプチド配位錯体の形成は、主として多価金属イオン、その酸 化状態、及び使用するポリペプチド結合配位子の注意深い選択に依存する。例え ば、金属ポリペプチドかトリへリックスのトポロジーを有する場合には、ビピリ ジンとの交換不活性なポリペプチド配位錯体を形成するにはＲｕを使用しうる。 同様に、ピリジル及びイミダゾリルの両方と交換不活性なポリペプチド配位錯体 を形成するにはＲｈを使用しつる。Ｒｈとピリジル又はイミダゾリル結合配位子 との交換不活性なポリペプチド配位錯体の合成には、触媒量の酸化状態の低い曲 を発生させることにより容易となる。 金属ポリペプチドか平行なテトラヘリックスのトポロジーを有する場合には、交 換不活性なポリペプチド配位錯体はＲｕとピリジル又はイミダゾリル結合配位子 との間に形成される。ルテニウム青は、不活性雰囲気下の還流により調製される ＲｕＣｌ　、Ｎ２０の混合物の５０％水性エタノール溶液である。次いで過剰量 のピリジル結合配位子に共有結合した線状両親媒性ペプチドを青の溶液に添加し 、混合物を約６５乃至７０℃に数時間加熱する。反応の進行は吸収スペクトルに より追跡する。 この調製に使用するポリペプチド配位錯体が形成され、発表されている手順によ り特性決定される。例えば、金属ポリペプチドが平行なテトラヘリックスのトポ ロジーの場合には、ペプチド溶液に対応する金属ハロゲン化物塩を添加すること によりｔｒａｎｓ−［Ｍ（Ｌ）＋ＣＩｔｌ（式中、し；ピリジル配位ペプチドの 場合には、Ｍ＝Ｎｉ（１１）でありニレイミダゾリル配位ペプチドの場合には、 Ｍ＜ｕ（（０、Ｎ１（ＩＩ）、及びＣｏ（ＩＩ）である）型の交換活性な錯体が 形成されうる。所望のポリペプチド配位錯体の形成は吸収及びＣＤスペクトルに より追跡しつる。 交換不活性なポリペプチド配位錯体は、好ましくは多価金属イオンＲｈ、　Ｒｕ 、　Ｐｄ、又はＰ

【及びピリジル又はイミダゾリル結合配位子間で形成される。 多くの反応性側鎖の官能基が線状両親媒性ペプチドに存在する場合には、交換不 活性な金属錯体の形成における化学選択性は主として、多価金属イオン、その酸 化状態、及び使用するポリペプチド結合配位子の注意深い選択に依存する。イミ ダゾリル及びピリジル結合配位子は良好なπ−酸π−受容体配位子であり、好ま しい。Ｌがペプチドの１及び内位における２つのＨｉｓ残基のイミダゾリル側鎖 を示す交換不活性な多環状ｃｉｓ−［Ｒｕ（ＮＴＩｓ）＜（Ｌ）ｔｌ’＋錯体が 実施例２Ｂに記載されている。 ピリジル及びイミダゾリル結合配位子のロジウム（ＩＩＩ）錯体は、以下の実験 事実に注意して合成する。Ｒｈ（ＩＩＩ）錯体は不活性であるから、ＲｈＣｌ５ とピリジル及びイミダゾリル配位子との単純な置換は困難である。Ｒｈ（ＩＩＩ ）錯体の合成は、触媒量の低酸化状態のロジウムを発生させることにより容易に なる。ホスフィン酸、亜燐酸水素、アセトアルデヒド、アルコール、錫（ＩＩ） 、ＮａＢＨいＮ７、及びヒドラジンのような還元剤が広＜Ｒｈ（ＩＩＩ）錯体の 合成に使用される。ＲＪ′Ｉ（Ｉ）及び２−電子ブリッジ活性化錯体の形成機構 は触媒反応に含まれることが示された。この種の方法は、ロジウム、ルテニウム 及び白金錯体の不活性な強い錯体の合成経路の工夫に非常に有用である。 ホスフィン酸、アセトアルデヒド、アルコール、ＩＴ）、ＮａＢＩ（ａ　、Ｎ２ 、及びヒドラジンのような還元剤はＲｈ（ＩＩＩ）錯体の合成に使用される。Ｒ ｈ（１）及び２−電子ブリノン活性化錯体の形成機構は触媒反応に含まれること が示された。従って、触媒量の還元剤の存在下５０乃至８０℃において過剰量の ペプチド−配位子接合体（ピリジル又はイミダゾリル）をＲｈＣｌ　３３Ｈ２０ の水溶液に添加すると、通常の精製工程の後に所望のポリペプチド配位錯体が得 られる。所望の錯体の形成は、ＵＶ、可視光、ＩＲ１原子吸収、及び質量スペク トルにより追跡しうる。 触媒量の還元剤の存在下５０乃至８０℃において過剰量のピリジル又はイミダゾ リル配位ペプチドをＲｈＣｌ、３Ｈ２０の水溶液に添加すると所望の錯体が生成 するので、その後通常の精製工程を実施する。所望の錯体の形成は、ＵＶ、可視 光、ＩＲ１原子吸収、及び質量スペクトルにより追跡しうる。 同様にして、テトラキス−Ｒｕ（ＩＪ）ピリジル結合ペプチド錯体も合成しうる 。 ”ルテニウム青”は、不活性雰囲気下でＲｕＣｌ５ｘＨ，０の混合物の５０％水 性エタノール溶液を還流することにより調製される。次いで過剰量のビリジルー ペプチドを青の溶液に添加し、混合物を６５乃至７０℃に数時間加熱する。反応 の進行は吸収スペクトルにより追跡しうる。 第二の合成法（Ｂ）によれば、ポリペプチド配位錯体を調製し、その後液体媒体 中で線状両親媒性ペプチドと反応させて金属ポリペプチドを形成する。 例えば、ｔｒａｎｓ−［Ｒｈ（Ｌ）、ＣＩ、）　”　、　ｔｒａｎｓ−［Ｒｕ（ Ｌ）＋Ｃ１ｔ）　”　、［Ｐｄ（Ｌ）＋１”、及び［Ｐ、　Ｌｌ、！”（式中、 Ｌ＝３−カルボキシピリジン又は前述のＮ−置換イミダゾール）のような型のポ リペプチド配位錯体を有する交換不活性な金属ポリペプチドを合成する方法は、 例えば以下のようにして実施される。 Ｎα−Ｆ−Ｍｏｃが保護されたＧｌｙ残基を有する配列番号：２１の１５−残基 ペプチドは、例えばベンズヒドリルアミン樹脂上に標準固相ペプチド合成法によ り化学的に合成される。）ＩＰ切断後、ＲＰ　）ＩＰＬＣでペプチドを精製する 。カップリング工程を妨げうるＬｙｓの３個のＮε−アミノ酸側鎖官能基を標準 技術によりｔ−Ｂｏｃカルバメートとして再び保護し、Ｎａ−保護ペプチドを形 成する。ペプチドフラグメントはその後のフラグメントカップリングにおいてア ミン成分として使用されるので、必ずしもＧｌｕ残基の側鎖のカルボキシル基を 保護する必要はない。この方法は、（充分に側鎖が保護されたペプチドフラグメ ントに対して）水溶性を増大させ、その後の精製工程を容易にするので有利であ る。塩基処理によりＦ−Ｍｏｃを除去した後、Ｎａ−保護ペプチドをＲＰ　ＨＰ ＬＣにより精製し、質量スペクトルにより特性決定する。 この調製に使用される金属錯体は、公知の手順に従って合成され、特性決定され る。例えば、マドール・オーブリー（Ｍａｄａｕｌｅ−Ａｕｂｒｙ）らにょるＡ ｃｔａ　Ｃｒｙｓｔ。 ３２４ニア５４　（１９６８）；アイルベック（Ｅｉ　Ｉｂｅｃｋ）らにょるＪ 、　Ｃｈｅｍ、　Ｓｏｃ、　７５７　（１９６７）；ドビンソン（Ｄｏｂｉｎｓ ｏｎ）らによるＪ、　ＣｈｅｎＬＳｏｃ、　Ｃｈｅｍ、　Ｃｏｎｎｕｎ、　６２ 　（１９６７）；ランド（Ｒｕｎｄ　）らによるＩｎｏｒｇ、　Ｃｈｅｍ、　３ ：６５８　（１９６４）；及びシンジ（Ｃｉｎｇｉ）らにょるＪ。 ｌｎｏｒｇ、　Ｃｈｉｍｉｃａ　Ａｃｔａ　３９：２６５　（１９８０）参照。 例えば、式［Ｒｕ（Ｌ）＜ＣＩ　、　］Ｃ１の錯体は、エタノール及びジメチル ホルホキンド（ＤＭＳＯ）の存在下でポリペプチド結合配位子をＲｈＣ１，３Ｈ ，０と（加熱）反応させることにより形成される。式Ｐｄ（Ｌ）ＩＣＩｔのパラ ジウム錯体は、エタノール及びジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）の存在下でポリ ペプチド結合配位子をＰｄ（ＣＨｓＣＮ）ｔｃＩ　＊と（加熱）反応させること により形成される。式Ｐｔ（Ｌ）、ＣＩ、の白金錯体は、ポリペプチド結合配位 子をｃｉｓ−ＰＬ（ＤＭＳＯ）ｔｃＩ　ｔと（加熱）反応させることにより形成 される。 過剰量のＮａ−保護ペプチドをＮ−アルキレン−カルボキシルイミダゾールのＮ −ヒドロキシスクシンイミドイルエステル又はニコチン酸のω−アミノ酪酸アミ ドとカンブリングさせる。次いでブロックされたペプチドを交換活性な錯体又は 前述のような所望の金属イオンの錯体と反応させて所望の錯体を形成する。所望 であれば、反応は変性剤の存在下で実施しうる。 本明細書に記載されているいずれかの方法により形成された金属ポリペプチドは 、好ましくは回収して精製する。 前述の方法のいずれにおいても、合成法に使用される約５０未満のアミノ酸残基 の線状両親媒性ペプチドは、好ましくは標準固相合成法を用いて化学的に合成す る。例えば、溶液中でα−へリックスを形成する好ましい線状両親媒性ペプチド は、アミノ末端からカルボキシル末端の方向へ左から右へ書くと以下の式で示さ れる。 −Ｇ　ｌ　ｙ−Ｌｅｕ−Ａ　Ｉ　ａ　−Ｇ　Ｉｎ　−Ｌｙｓ　−Ｌｅ　ｕ−Ｌｅ ｕ−Ｇ　Ｉ　ｕ−Ａ　Ｉ　ａ−Ｌｅｕ−Ｇｌ　ｎ−Ｌｙｓ　|Ａ　Ｉ　ａ−Ｌｅ ｕ−Ａ　Ｉａ−ＣＯＮＨｔ（配列番号：ｌ） 線状両親媒性ペプチドがＮ−末端のアミノ基の他に側鎖アミノ官能基（すなわち 、Ｌｙｓ　）を含む場合には、そのようなアミノ官能基を保護する手段は、ペプ チド及び所与のポリペプチド結合配位子を直接結合させるために使用しなければ ならない。 典型的には、配位アミノ酸残基として作用するアミノ基はＦ−Ｍａｃで保護し、 その他のアミノ官能基はｔ−Ｂｏｃで保護する。このように、配位アミノ酸残基 はポリペプチド結合配位子に結合させるために塩基処理により脱保護しうる。こ の塩基処理は、ｔ−Ｂｏｃ保護アミノ基には影響を及ぼさない。金属ポリペプチ ドの合成が完了した後、ＨＣＩ又はギ酸のような酸で処理することによりｔ−Ｂ ｏｃ保護ペプチドを脱保護する。 トリへリックス金属ポリペプチド及び平行テトラヘリックス金属ポリペプチドの 合成は、それぞれ以下の実施例４及び５に記載する。 本発明の金属ポリペプチドは、酵素、イオン透過担体及び電荷移動タンパク質と しての用途を有する。 ａ、酸化還元酵素の性質 各々かαヘリックス立体配座を有する４個の線状両親媒性ペプチドと共有結合し ているピリジル結合配位子に配位結合しているＲｕ又はＲｈを含む平行テトラヘ リックス金属ポリペプチドは、適する条件下で活性化されて酸化還元酵素の性質 を示す。 平行テトラヘリックス金属ポリペプチドのポリペプチド配位錯体は、疎水性キャ ビティの端部に存在すると考えられる（図１）。テトラヘリックスペプチドの端 部付近の配位金属の基部である疎水性残基は、配位錯体のまわりに疎水性ドーム を形成する。 式［ＲｕＣｌ　ｓ（＋１＞’）ｎ　］の］ＲｕＲｕ−ビリノル錯は独特な触媒性 を有する。穏和な条件下ではこの錯体は酸化されて、式けａｎｓ−（ＲｕＣｌ（ ＯＸｐｙ）ａ　１”″のＲｕ（ｆｆ）−ｏｒｏ錯体となる。公知のようにＯＸＯ 錯体は、主としてアルコールをアルデヒド及び第二アルコールに効果的に酸化す る。例えば、ナガオ（Ｎａｇａｏ）らにょるＩｎｏｒｇ、　Ｃｈｅｍ、　２９： １６９３　（１９９［］）及び同文献中の引用文献参照。 ＯＸＯ錯体は、補助酸化体としてのＮ−メチルモルホリンＮ−オキシト（ａ＋＋ ｎｏ）又はテトラ−ｎ−ブチルアンモニウムペルヨーディトの存在下で高率で触 媒的に機能しつる。同様に、トリへリノクス束金属タンパク質は種々の第−及び 第二アルコールの酸化のための触媒として使用しうる。 ロジウム（Ｉｌｌ）テトラピリジル配位錯体は、水素又はＮａＢ）Ｉ４の作用に より容易に還元されてヒドリドとなる。そのようなヒドリド−ロジウム配位錯体 は、オレフィン及びアルキルハライドを還元すると報告されている。αヘリック スペプチドと共有結合しているピリジル結合配位子に配位結合している多価金属 イオンロジウムを含む平行テトラヘリックス金属ポリペプチドは還元酵素の性質 も示す。 ｂ、イオン透過担体抗生物質の性質 イオン透過担体抗生物質は、典型的には４つの相互に関係のある機構により生物 学的機能を示す。第一に、イオン透過担体は脂質二分子膜に特異的に分配される 。第二に、膜の界面において金属イオンを錯化して親油性包接錯体に包みこまれ る。第三に、内部では非極性膜と相溶性であるイオン透過担体−金属イオン錯体 は膜燐脂質二分子層内を拡散する。最後に、反対の膜の界面において、錯体が解 離し、金属イオンを放出して膜内に拡散し、第二のサイクルが開始する。これら の機構の結果は結局、膜内の金属イオンの輸送である。 膜内でイオン透過担体が触媒した金属イオンの束は細胞及び器官内の膜を横断す る電気的ボテンシャルを変えて代謝の混乱を生ずるので、そのようなイオン透過 担体は非常に毒性である傾向がある。一方、膜内におけるカチオンの交換により 交換拡散キャリヤーとして挙動するイオン透過担体は、膜を横断する電荷の置換 を最少とし、治療薬としての可能性を増大させる。 未錯化イオン透過担体は両親媒性であるため膜の極性面に引きつけられる。界面 においては錯化しつるカチオン、Ｍ７４に遭遇する。錯体が形成されると、分子 がイオンを包封し、中性の親油性包接錯体を形成する。極性の界面から離れうる 錯体は、非極性膜内に拡散して反対の膜の界面に移動する。錯体が反対の膜の界 面の極性領域へ移動することによりカチオンの放出が容易となる。イオン透過担 体は別のカチオン、Ｈ１＋を錯化し、再び膜の内部に入り、最初の界面に戻りＮ ｔ＋を放出する。その結果１つのカチオンが膜を横断して別のカチオンと交換さ れるが、電荷の置換はない。多くのイオン透過担体抗生物質は脂質膜を横断して 一価のカチオンを置換するけれども、二価の遷移金属カチオンを選択的に輸送す る強力な抗生物質もある。 金属イオンを結合し、親油性包接錯体に包みこまれる金属ポリペプチドか設計さ れた。十分な水溶性ばかりでな（脂質界面との優先的な相互作用を許容する、疎 水性及び親水性の両方を有する■４−アミノ酸残基配列（実施例６Ａ参照）が設 計され、合成された。四面体の形で金属イオンと結合するのに４個のＨｉｓ及び Ｃｙｓ残基が用いられた。結合している側鎖の位置のために、又介在する残基の 寸法が小さいために、ペプチド主鎖は３個の連続した回転か強いられ、これらの 側鎖が金属イオンの錯化のために近接する。ペプチドが金属イオンと結合すると 、多くの疎水性側鎖が表面に露出すると考えられ、金属イオンは構造物の近づき がたい内部の溶剤中に包封される。すなわち、親油性包接錯体か形成される。 金属ポリペプチドイオン透過担体のトポロジーは、二次元の核磁気共鳴（２Ｄ距 離幾何学計算に使用されうるＮＯＥクロスピークが得られる。予備的なＩ−Ｄ研 究によれば、ピークの帰属をかなり簡単にする非常に良く解像されたスペクトル が示された。 好ましくは、未錯化ペプチドは脂質膜の極性面と相互作用する。そのような性質 は水溶性タンパク分解酵素からペプチドを保護し、その生物有用性を増大させる 。ペプチドは非常に両親媒性であるため、脂質界面との相互作用に都合がよい。 未錯化ペプチドはまた膜の脂質内部へ自由に拡散しない。生理的条件下でプロト ン化されるＨｉｓ残基のイミダゾリル側鎖が未錯化ペプチド膜を不透過性とする と考えられる。金属イオンと錯化すると、ペプチドは膜の内部の脂質中に容易に 溶解するようになる。必要な疎水性及び親水性を有する特定のアミノ酸残基配列 の選択は、そのような残基の分配係数の決定に基づく。 錯化及び未錯化ペプチドの分配係数は、ジパルミトイルホスファチジルコリン（ ＤＰＰＣ）、又はシミリストイルホスファチジルコリン（ＤＭＰＣ）の小胞を用 いることにより容易に決定しうる。予め形成した小胞（直径＋５０乃至３００人 ）を、まずｐＨ７，５の１００−のホウ酸ナトリウムのような適する緩衝液に対 して透析する（ｓ　ｏ　ｏ　ｏ人を除去）。次いで透析バッグを、遷移金属イオ ンの存在下又は不在下で公知のペプチド濃度の溶液中に置（。適する温置時間の 後、バッグの外側のベプチｌ’ｉ１１度を測定することにより、移動の自由エネ ルギー及び分配係数を決定しうる。脂質の飽和及び小胞の破壊を回避するするこ とを確実にするために、種々のペプチド濃度でこれらの研究を実施する。 金属ポリペプチドイオン透過担体のイオン移動性は、人工脂質二分子層を横断す るイオンの動きをヒリ定することにより確認される。２つの１〜２ｍｌの容器を 分離するホスファチジルコリンニ分子層を公知の手順に従って形成する。公知の 量の金属イオンＭ′＋及びＮｉ＋を別々に各々の容器（イオン強度約０．１Ｍ未 満、ｐＨ７，５の緩衝液）に添加する。これらの研究に好ましい金属イオンはＺ ｎ（ＩＩ）、Ｃｄ（ＩＩ）、Ｃｕ（１１）及びＣｏ（Ｉｆ）である。 次いでペプチドの溶液を一方の容器に添加する。各容器中におけるＭ１′″及ノ １の濃度を決定するために、種々の時間間隔で各容器からアリフートをとる。イ オンの濃度を測色法により決定するために、金属イオン選択指示薬を用いる。 所与の金属イオンに対するペプチドの選択性は、使用するアミノ酸残基の数及び 種類に依存する。特定のポリペプチド結合配位子配列に対する理論的な金属イオ ン選択性を以下の表３に示す。 表３ ＋２　Ａｃ−Ｈｌｓ−Ｌｅｕ−Ｓｅｒ−ＶａｌＪａｌ−Ｈｉｓ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ −Ｚｎ”、ｃｕｔ＋、　ｃｏｔ＋）１ｉｓ−Ｔｈｒ−Ｔｙｒ−＋　１ｅ−Ｇｌｎ −Ｈｉｓ−ＣＯＮＨ。 １３　Ａｃ−Ｈｌｓ−Ｌｅｕ−Ｓｅｒ−ＶａｌＪａｌ−Ｈｉｓ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ −Ｚｎ”、ｃｏ′＋Ｈｉｓ−Ｔｈｒ−Ｔｙｒ−１１ｅ−Ｇｉｎ−Ｃｙｓ−ＣＯＮ ＴＩｔ１４　Ａｃ−Ｃｙｓ−Ｌｅｕ−３ｅｒ−Ｖａｌ−Ｖａｌ−Ｈｉｓ−Ｐｒｏ −Ｇｌｙ−Ｚｎ”、Ｃｄ”Ｈｉｓ−Ｔｈｒ−Ｔｙｒ−１１ｅ−Ｇｉｎ−Ｃｙｓ− ＣＯＮＨｚ１５　Ａｃ−Ｃｙｓ−Ｌｅｕ−３ｅｒ−Ｖａｌ−Ｖａｌ−Ｃｙｓ−Ｐ ｒｏ−Ｇｌｙ−Ｚｎ”″、Ｃｄ’″″Ｈｉｓ−Ｔｈｒ−Ｔｙｒ−１１ｅ−Ｇｉｎ −Ｃｙｓ−ＣＯＮＨ。 １６　Ａｃ−Ｃｙｓ−Ｌｅｕ−３ｅｒＪａｌ−Ｖａｌ−Ｃｙｓ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ −Ｃｄ”、Ｃｏ”Ｃｙｓ−Ｔｈｒ−Ｔｙｒ−１１ｅ−Ｇｉｎ−Ｃｙｓ−ＣＯＮＨ ｔＣ電荷移動特性 広域電子移動は、種々の化学系および生化学系で示されてきた。膜蛋白の配列分 析は、多数の膜横断セグメントが強力な疎水性のαヘリックス単位からできてい ることを示した。脂質膜の内面のように低い誘電率をもつ媒体中では、水素結合 は、約５−６　Ｋｃａｔｍｏｌ−１で有利である。従って、膜環境下では、αヘ リックス形成が非常に有利である。なぜならば、この構造で、ポリペプチドは分 子内水素結合数を最大にするすることができるからである。細胞膜に広がる、ト リスビピリジル金属複合体により、それぞれのＣおよびＮ末端で官能化されたト リへワックス余興ポリペプチドを設計し合成して、活性レドックス金属イオン複 合体を脂質膜の反対側に固定する。 例えば、下記に示す２２アミノ酸残基のペプチドを、αヘリックス構造を有し、 脂質二重膜を貫通するように設計した。 Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−１１ｅ−Ｐｈｅ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｔ　Ｉｅ −Ａ　ｌ　ａ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ　−Ａ　ｌ　ａ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ　−Ａ　Ｉ　ａ −１１ｅ−Ｐｈｅ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｏｒｇ　（配列番号：１７）この ペプチドはそのＣおよびＮ末端で５−カルボキシル置換２，２′−ビピリン〉に より官能化される。このペプチドを合成するために直交固相合成法が用いられる 。 このペプチドの核を形成する疎水性残基は、立体的に好ましいバッキング配列を もつように設計した。膜の内側の脂質と相互反応する、このヘリックス単位の推 定上の外面は、好ましくは、嵩高な疎水性アミノ酸残基を含む。 既知の方法に従い、ホスファチジルコリンの脱ガス水性懸濁液を分散させて小胞 を形成する。金属イオンを溶液に加え、これらのイオンを小胞内に取り込ませる 。その後、小胞を所望の緩衝液に対してゲル濾過（セファデックスＧ−５０）し てｍ製し、取り込まれなかった無関係の金属イオンを除去して均一なサイズの粒 子とする。精製小胞を超遠心して、１層の薄膜小胞を得る。その後、ペプチド溶 液と小胞懸濁液とを数時間インキュベートして、ペプチドを液胞膜に分散させる 。 このペプチドは以下の理由から遊離カルボキシル末端をもつように設計した。 正常な生理学的条件下では、カルボキシル末端はプロトン除去され、陰性荷電を 帯びている。荷電物質が脂質二重膜の内側を通過することは強く排斥されるので 、遊離カルボキシル末端は、最初に膜に挿入されたペプチドの末端に偏るはずで ある。このようにして、ペプチドのＮ末端のビピリジル部分は、小胞の内側表面 に優先的にトリス−キレート複合体を形成する。Ｃ末端複合体は外側表面に存在 するであろう。 ペプチドの小胞内取り込みは、いくつかの方法でモニターできる。ペプチドと脂 質膜の内側との相互作用は、多分にビピリジルの蛍光性増強につながる。複合イ オンは小胞の線状水相に吸蔵されるので、小胞の内側表面におけるトリス−ビピ リジル複合体の形成は、ＵＶ−可視線分光分析によってモニターすることができ 、小胞内へのペプチドの取り込みを確認できる。 さらに、ゲル濾過は、小胞へのペプチドの結合を定性的に立証すると同時に、そ の精製にも用いられる。小胞を、第二の金属イオンおよび／または試薬を含む緩 衝液で予め平衡化させたセファデックスＧ−５０カラムに通す。結合ペプチドは 、小胞分画とともに溶出する（ＵＶ−可視線でモニター）。 膜蛋白の三量体としての性質のためにトリス−キレートペプチド複合体の形成は 、分光吸収により立証することができる。さらに、ＣＤおよびＦＴ−ＩＲ実験も 、膜横断金属蛋白のへリックス性を立証するために用いることができる。 電子移動金属ポリペプチドの例には、多価金属イオン、ＦｅおよびＣｏがビピリ ジン（ｂ　ｐ　ｙ）結合配位子に配位的に結合したものが含まれる。Ｆｅ−ｂｐ ｙ配位複合体は、膜の外側表面に存在し、３つのαヘリックス両親媒性ペプチド によって小胞の内側表面のＣｏ−ｂｐｙ配位複合体に結合する。上記に説明した ように、小胞内水相中にＣｏ　（ＩＩ）イオンおよび還元剤（例えばアスコルベ ート）が存在するとき、小胞は形成される。小胞にペプチドが吸着して、トリへ リックス金属ポリペプチドが、Ｃｏ（用を含む内部配位複合体とともに形成され る。この配位複合体の両親媒性特性の故に、それは決して膜の脂質部分を通り抜 けて拡散せず、したがって、小胞の内側表面に留まる。 電子移動は、過剰量のＦ　ｅ（Ｉｌｌ）イオンを小胞懸濁液に添加することによ り開始させることができる。小胞の外側表面に閉じ込められているトリス−Ｆｅ （ｂ１；ＩＹ）ｓ”の式のポリペプチド配位複合体の形成に際して、電子は、こ の複合体からこの分子の膜横断トリへリックス部分を介して、Ｃｏ　（ｂｐｙ） 　、’＋供与体複合体に与えられる。アスコルベートは、Ｆｅ”／Ｆｅ！＋およ びＣｏト／ｃＯ！＋のために電位を減少させるので、電子移動のための正味の化 学推進力は、およそ８００１ＩＶまたはデルタＧ＝１８ＫｃａＩ・ｔｎｏｌ−’ である。 電子移動のキネティクスは、ある時間内に消費されたＦｅ口およびアスコルベー ト分子の量を、標準的な比色、ＧＣおよびＩ（ＰＬＣ手技により測定することに よって追跡することができる。 電荷移動がイオン移動を全く補うことなく生じるならば、実質的な膜横断電位が 発生する。さらに、イオン拡散の存在しない状態で、膜の電子分極は、外側に結 合したＦｅ”＋イオンのトランスメンブレン還元を、反応が進むにつれますます 障害する。この影響を補うために、カリウム選択性イオン担体（例えばバリノマ イノン）を小胞に加えることができる（用いられる緩衝液はカリウム対イオンを 含む）。また別に、脂質可溶性プロトン担体（例えばカルボニルシアニドｍ−ク ロロフェニルヒドラゾン（ＣＣＣＰ））を小胞に加え、プロトンの急速通過を行 うことができる。 以下の実施例は、本発明の具体例を詳述するためのものであり、どのような意味 においても明細書事項および請求の範囲を制限するものではない。 表２に示す式に対応するアミノ酸残基配列を有する合成ペプチドを、ｔ　−Ｂ。 Ｃを用いて固相法により合成した。既に報告された手順に従った（Ｇ、　Ｂａｒ ａｎｙ、ＴｈｅＰｅｐｊ　１ｄｅｓ、２：３　（＋９７９））　。合成したペプ チドは逆相Ｃ１ｇ　ＨＰ　Ｌ　Ｃで精製した。 天然には存在しないアミノ酸残基Ｘａａ＋およびＸａａｔを有するペプチド配列 番号二１０および１２の合成のために、まずＸａａ＋およびＸａａ、を、慣用的 な既知の合成方法で調製し、それから天然に存在するアミノ酸の場合のように、 固相法を用いて当該ペプチドに取り込ませた。 表２のペプチド配列番号・２および３は、実施例１で説明したように調製した。 表４ ペプチド金属塩溶液混合物 実験　ペプチド　しペプチド］ｌ　緩衝液”　（ｐＨ）　金属　〔金属〕１１　 ２　５．９　Ｂ　８．０　塩無し　−２２５，９Ｂ　８．ＯＣｄＣ１ｚ　１．０ ３　２　５．９　Ｂ　８．０　ＣｄＣ１，２，５４２５，９Ｂ　８．ＯＣｄＣｌ 、　４．０５　２　５．９　Ｂ　８．０　ＣｄＣ１ｚ　５．６６　２　５．９　 Ｂ　８．０　ＣｄＣ１，１５，０７２２，２Ｗ　６．６５　塩無し　− ８２２，２Ｗ　６．６５　ｃｄｃ＋ｔ　７３．０９　２　５．９　Ｂ　８．ＯＺ ｎＣ１ｔ　５．６＋０　３　１．８　Ｂ　６．１　塩無し　−ＩＩ　３　１．８ 　Ｂ　６．Ｉ　ＣｕＳＯ４７３，０＋２　３　１．８　８　６．Ｉ　Ｃｕ５Ｏ＋ 　６．６１３　３　１．８　Ｂ　６．４　Ｃｕ５Ｏ＜　７．４１４　３　６１、 ＯＢ　７．５　ＣｄＣＩｔ　２２．ｆＰ１５　３　６１、ＯＢ　Ｓ、３　ＣｕＣ Ｌ　６．６１６　３　６１、ＯＢ　６．３　Ｎ１ＣＩｙ　２１．０１７３６１． ０　Ｂ？、５　ＺｎＣＩｔ　７．５１ペプチド濃度はＸｌ０−’Ｍで表される。 ２Ｂは硼酸ナトリウムを表し、Ｗは水を表す。 １金属塩の濃度はＸ　ｌ　Ｏ−’Ｍで表される。 ペプチドは、０，５酬のβ−メルカプトエタノールの存在下で、水または１〇− の硼酸ナトリウムに別々に再背濁した。その後、この再懸濁ペプチドを市販の塩 溶液に混合し、表４に表示したペプチドおよび金属塩の最終濃度の溶液を生成し た。 混合ペプチド中に存在するすべてのαヘリックスの安定性についての混合金属イ オンの影響を調べるために、上記混合物について、核磁気共鳴（ＮＭＲ）吸収ス ペクトルおよびＣＤ分析を実施した。これらの実験の結果は下記および実施例３ で述べる。 αヘリックス構造の合成ペプチドの模式図を図２に示す。αヘリックスは、Ｉお よびｉ＋４位に示される配位アミノ酸残基の側鎖に金属イオンをキレートするこ とによって安定となる。これらの位置は、図中のアミノ酸残基配列において、そ れぞれＸｌおよびＸ、と表示されている。一方、他の配位子、Ｌは金属塩によっ て提供されるイオンである。ペプチド配列番号：２のＸｌおよびＸ、は、それぞ れＣｙｓおよびＨｉｓ残基である。ペプチド配列番号　３では、Ｈｉｓ残基は両 方の位置を占める。 Ｂ、ルテニウム化合物を用いたイオン交換不活性金属複合体の形成報告された手 順（Ｐｅｌｔ、ら、Ｉｎｏｒｇ、　５ｙｎｔｈｅｓｉｓ、２６：２５　（＋９８ ９））に従って、Ｃｉｓ　［Ｒｕ　（ＮＨｓ）＋　Ｃｌｔ］Ｃｌを調製した。そ の後Ｃｉ　ｓ　［Ｒｕ　（ＮＨ−）４　Ｃ１ｔ　］　ＣＩの溶液を脱ガスした５ ０酬のトリス緩衝液（ｐＨ７，０）で調製し、さらに溶液中のルテニウム複合体 を、亜鉛アマルガムの存在下で還元し、Ｃｉｓ［Ｒｕ　（ＮＨ＝　）＋　（Ｈ， Ｏ）ｔ　］　’＋を生成した。 脱ガスした５０面のトリス緩衝液（ｐＨ７，１）中に、実施例Ｊのように調製し たペプチド配列番号、３を含む溶液を、Ｃｉｓ　［Ｒｕ　（ＮＨ３）４　（Ｈｔ Ｏ）ｔ］ｈと混合し、１０μＭのペプチドおよび５０μＭのルテニウム複合体と ともに生物学的反応混合物を生成した。この生物学的反応混合物を室温で６時間 保ち、さらに空気酸化してルテニウム−ペプチド配列番号：３複合体を生成する 。またこれは、一般にＲｕ（ＩＩＩ）−ペプチド複合体とも呼ばれる。さらに、 この複合体を、ＢｉｏＲｅｘ−７０カラム（ＢｉｏＲａｄ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒ ｉｅｓ、リッチモノド、カリフォルニア）で陽イオン交換クロマトグラフィーで 精製、回収して、精製ルテニウム−ペプチド配列番号、３複合体、すなわち分離 金属ペプチドを含む組成物を生成する。 ルテニウム−ペプチド配列番号＝４複合体を含む組成物は、上記操作においてペ プチド配列番号：２の代わりに、実施例１のように調製したペプチド配列番号・ ４を用いて同様に調製した。ペプチド配列番号、３または４を用いて得られた、 精製ルテニウム−ペプチド複合体含有組成物の性状は、Ｃ１８ポリスルホエチル アスバルトアミドＲＰ−ＨＰＬＣカラムを用いて分析逆相クロマトグラフィーで 調べたとき、またはＢｉｏＲｅｘ−７０陽イオン交換カラムで分析したとき、９ ８％以上の純度であることが分かった。両組酸物の全ルテニウム含有量を、原子 吸収分光分析で調べ、Ｒｕ：ペプチドの化学量論量比が■・Ｉ　（±１５％）で あることが示された。さらに、両Ｒｕ　（ＩＩＩ）複合ペプチドはアミノ酸分析 の特徴的なパターンおよび、Ｈｉｓピークを除く特徴的なピークを示した。Ｈｉ ｓピークは平均７０％で、これは期待値よりも低く、このＨｉｓ残基は特別に修 飾されていることを示していた。両複合ペプチドのＦＡＢ　ＭＳは、４つのＮＨ ，配位子の損失に対応する、１７２９の優勢ピークのほかに、期待した通りの分 子量イオン（Ｍ／Ｚ＝　＋　７９７）を示した。 Ｃ１金属ペプチド複合体生成のＮＭＲ同定実施例２Ａのように調製したＣｄ（１ １）またはＺｎ（ＩＩ）イオン含有ペプチド金属塩溶液混合物をＮＭＲに付し、 金属ペプチド複合体配位子を同定した。ＮＭＲ実験の結果は、ペプチド配列番号 ＝３の、それぞれ６７．８７，７．７４およびδ６．８９．６．８７で生じるヒ スチジン２Ｈおよび４Ｈの両共鳴（Ｄｔ　Ｏ中で２．５ｍＭ、ｐＨ６，６）は、 Ｚｎ（ＩＩ）の添加に際してそれぞれδ７．７５，７．７１および６６．８７． ６．６７にアップフィールド移動することを示した。ペプチド配列番号：２につ いても同様な結果が得られ（Ｄ、０中２．５−１ｐＨ８，５ン、Ｃｄ　（ＪＪ） の非存在下では６７．９１および６．９５で、存在下ではδ７，７１および６． ９１であった。 ペプチド配列番号：　２　（３，ＯｒｆＭ、　Ｈ，０中でＣｄＣＩｔは０．３Ｍ 、　ｐＨ５，１）の１７の主要なアミドプロトンのうち、１１はｃｏｓｙおよび Ｎ０ＥＳＹスペクトルを用いて連続的に配列されていた。ペプチド配列番号：２ のＮ末端アミノ酸残基のアミド共鳴は”ＪＫＮα＜５Ｈｚを示し、これはヘリッ クス構造がＮ末端に及んでいることをさらに証明するものである。 実施例２Ｂのように調製したＲｕ　（１）−ペプチド配列番号：４の複合体を。 ＮＭＲ分光分析に付し、金属塩によるこのペプチドのＨｉｓ残基の化学選択性官 能化を調べた。これらの実験の結果は、それぞれδ８．５２．８．５Ｉおよび７ ，２０．７．１９で生じる、ペプチド配列番号　４のＨｉｓのＣ−２およびＣ− ４プロトンは、テトラアミンルテニウム（１１）の分子部分付加に際して、それ ぞれδ７．４７．７．１５および６６９８．６．８３へ劇的にアップフィールド 移動することを示した。 さらに、酸化により形成された、このＲｕ　（ＩＩＩ）−ペプチド配列番号・４ 複合体のＨｉｓシグナルは、常磁性ソフトを示し、δｏ、５６および一〇、７８ で幅の広いピークとして出現した。 これらの実験は、金属塩は合成ペプチドのＨ１ｓ残基と相互作用し、ＮＭＲ測定 の間、イオン交換不活性である大環状二座配位複合体を形成することを確認する ものである。 Ｄ、金属ペプチド複合体を同定するための吸収分光分析実施例２Ｂのように調製 したＲｕ（ＩＩＩ）−ペプチド配列番号＝３複合体を吸収分光分析に付し、さら に金属ペプチド複合体の生成を確認した。 吸収分光分析の結果は、ペプチド配列番号、３のＲｕ（Ｉｌｌ）複合体の吸収ス ペクトルは、ｆ）８６．５より下で２８７ｎｍおよび３】３０ｍの金属電子移動 バンドへの配位子を示し、このバンドは、３３１ｎｍで等吸収点をもつｐＨ８よ り上で３７６闇にシフトした。 実施例２Ｂで調製したＲｕ　（ＩＩＩ）−ペプチド配列番号・４複合体の吸収ス ペクトル分析は、吸収分光分析で調べたとき、同様なＵＶスペクトルおよびｐＨ 像を示した。ｐＨ上昇による最大吸収の著しいシフトは、Ｒｕ（Ｉｌｌ）イオン 含有配位イミダゾールの反応と一致し、”ビロール窒素“のＮ−Ｈ脱プロトン反 応に起因すると考えられる（Ｓｕｎｂｅｒｇら、Ｊ、　Ａｍ、　Ｃｈｅｍ、　Ｓ ａｃ、、９６：３８１　（１９７４））。吸収データでは、配位ヒスチジンのイ ミダゾールＮＨについて、ｐＫ、値は７．５となり、この値は、未複合ヒスチジ ンのｐＫａより規模が７オーダー低いものである。単純ルテニウム（Ｉｌｌ）− イミダゾール複合体とのスペクトル類似性、および特徴的で潤滑な金属イオン推 進イミダゾールＮＨイオン化は、金属ペプチド複合体形成に対してさらに支持を 与えるものである。 したがってＣＤ分析に付し、ペプチドとの金属イオン複合化により導入された安 定度を測定した（Ｇｒｅｅｎｆ　１ｅｌｄら、Ｂｉｏｃｈｅｍ、８：４１０８　 （１９６９）　；　Ｊｏｈｎｓｏｎ、　Ａｎｎ、　Ｒｅｖ、Ｂｉｏｐｈｙｓ、ｃ ｈｅｕ　、　１７：１４５　（＋９８８））。本明細書中で報告するすべてのＣ Ｄデーターは、１００％螺旋、［］、］１フ＝−３５００に対して±２から５％ の不確実性をもち、さらに金属イオンの存在下および非存在下の、−１０から一 ２０’Ｃのｊ　種々のＴＥＦ／Ｈ２０混合物中での、ペプチド配列番号＝２およ び３の両方についての、いくつかのＣＤ測定に基づいている。これらの分析結果 を図３に示す。 図３のパネルＡは、ＣｄＣｌ２量を上昇させたときの、２０℃におけるペプチド 配列番号＝２のＣＤスペクトルを示す。この実験では、表４の溶液２．３．４お よび６の溶液を、ＣｄＣ１，を含まないペプチド配列番号、２を含む溶液と比較 した。一番上沃印）から一番下までに示した曲線は、ＣｄＣ１ｔ濃度を増加させ ながら集めたデータを示している。ＣｄＣｌ、の増加量と混合したペプチド配列 番号：２のＣＤ分析結果は、２２２ｎｍ最小における増加により、このペプチド のへリックス量の増加を示している（図３Ａ）。等二色点は２０４ｎｍで生じ、 この点はヘリックスコイル転移に特徴的である。ＣｄＣＬｙを含む溶液８　（表 ４）中のペプチド配列番号：２のＣＤスペクトル分析を、４℃でＣｄＣＩｚを含 まない溶液７と比較した。図３Ｂに示したＣＤスペクトル分析結果（実線）は、 カドミウムイオンと１６番目および１２番目のアミノ酸残基のＨｉｓおよびＣｙ −ｓ　（Ｉｔ！１鎖とのそれぞれの相互作用は、４℃でαヘリックス性（［］　 ｎｔ　＝−３１５００）を９０％まで誘発するに十分な安定化エネルギーを提供 することを示している。 反対に、金属イオン非存在下でのペプチド配列番号：２（溶液７）は、４℃で５ ４％のαヘリックス性（［］ｕｙ＝１８８００）を示した（点線）。 同様な実験を、種々の金属イオン塩溶液との混合物中で、ペプチド配列番号・３ （これは、１２および１６位の両方にＨｉｓ残基をもつ）について実施した。 Ｃｕ　Ｓ　Ｏｓの濃度が増加するペプチド配列番号＝３の溶液（溶液１１．１２ および１３）を、ＣｕＳＯ４を含まないペプチド溶液と２１’Ｃで比較した。こ れらの結果は、図３Ａのように、図３０で実線により表した。ペプチド配列番号 ＝３およびＣｕ５Ｏ＝を含む溶液１３は０℃でも調べた。溶液１３のＣＤスペク トルパターンは、図３Ｃの点線で示されている。 ＣＤスペクトル分析の結果は、相対位置がｉおよびｉ＋４にある１対のＨｉｓ残 基をもつペプチド配列番号：３は、０℃でＣｕ（１１）イオンの存在下でおよそ ９０％のαヘリックス性（［］ｕｔ＝　３１１１）０）を示すことを明らかにし た。 αヘリックス安定化は、０℃で維持されたペプチド金属溶液では、２１℃に比べ てわずかに増強した。したがって、ペプチドのｉおよびｉ＋４位のＨｉｓおよび Ｃｙｓ残基の側鎖は、転移金属イオンと相互作用し、二連配位複合体を形成し、 同時にαヘリックス構造のペプチド骨格を安定させる。このようにして、室温で は水中で７５％までのαヘリックス性を、さらに０−４℃では９０％のαヘリッ クス性をもつペプチドが得られる。 金属イオン選択性は、部位特異的金属−配位子相互作用の予想される結果である 。ヘリ、クス誘導度は、大ざっばに言えば第一に、用いられる配位子に対する金 属イオンの親和性に依存し、さらに、αヘリックス構造に対する金属イオンの立 体配置および配位圏の適合性に依存する。したがって、多数の金属イオンがαヘ リックス形成を誘導し、安定させることができるが、用いられる配位子に対して 最大の相対親和性をもつ金属イオンが好ましく、それは容易に決定できる。 ペプチド配列番号−２および３の配位子との錯体化に対する、種々の金属イオン ＣｄＣ１ｚ　、ＣｕＣＩｔ　、Ｎ１ＣＩｔおよびＺｎＣＩｔの相対的親和性をめ るために、実施例２Ｂで調製した溶液５．９および＋４−１７を、上記に述べた ようにＣＤ分析に付した。この分析の結果を図４に示す。Ｃｕ（ＩＴ）もＺｎ（ ｍも、同じ親和性でペプチド配列番号：３に結合し、同じ程度でヘリックス含有 量が増加した。他方、Ｎ　ｉ　（ＩＩ）はＣｄ（ＩＴ）と比較して同じ結合定数 を示したが、より高いヘリックス誘導を示した。一方、ペプチド配列番号、３は Ｚｎ（ＩＩ）の存在下で顕著なヘリックス誘導を示し、ペプチド配列番号、２は Ｃｃｌ（ＩＩ）選択性で、Ｚｎ（１１）の添加はへリックス含有量に影響をもた なかった。 さらに、ヘリックス性は、ペプチド配列番号：２（硼酸ナトリウム５ｍＭ中に２ ゜５μ閘、ｐＨ８，０）およびペプチド配列番号−３（硼酸ナトリウム５酬中に ２．０ｇＭ、ｐＨ６，１）の両ペプチドに対して、添加ＮａＦの濃度が２５泊両 までは、濃度に左右されなかった。ペプチド配列番号＝２および３は、０．５− ＴＯμＭのびす定範囲では金属イオンの存在下および非存在下でペプチド濃度に 左右されない、分子内へリックス構造と一致したＣＤスペクトルを示した。非連 結金属配位部位は、水分子によって占有されるのが最も可能で、外部配位子、例 えば５−ニトロ−１，１０−フェナントロリンまたはメルカプトエタノールの添 加は、ヘリックス構造の安定性に影響を与えない。 （３）他のペプチドの金属イオン選択性および親和性実施例１のように調製し、 実施例２Ｂで述べたように混合したペプチドをＣＤ分析に付し、αヘリックス配 列中の金属結合部位の位置に関して、金属イオン選択性の性状を調べた。 この実験の結果は、ペプチド配列番号、３は、親和性の高いものから順にＮ１（ ＩＩ）、Ｃｄ　Ｃ１１）　、Ｃｕ（ＩＩ）およびＺｎ（１４）と結合し、Ｃｕ（ ＩＩ）およびＺｎ（１１）の親和性はほぼ等しい。ペプチド配列番号：４は、Ｎ １（Ｊｌ）およびＣｕ（ＩＩ）と結合し、Ｃｄ（ＩＩ）がこれに続き、Ｚ　ｎ　 （ＩＩ）はさらにその後に続く。ペプチド配列番号　５は、親和性の高い順にＮ 　ｉ　（ＩＩ）およびＣｕ（１１）と結合し、Ｃｄ（Ｉｆ）またはＺｎ（ＩＩ） のいずれとも顕著な結合は示さなかった。ペプチド配列番号：ｌｌは、親和性の 高い順にＣｕ（ＩＩ）、Ｈｇ（ＩＩ）、Ｃｄ（ＩＩ）、Ｆｅ（ＩＩ）、Ｚｎ（Ｉ Ｉ）およびＰｌ）（ＩＩ）とｐＨ６，０で結合するが、Ｚｎ（ＩＩ）およびＰｂ （ＩＩ）は等しい。 αヘリックスペプチド上の結合部位に対する金属イオンの親和性は、それらが結 合するアミノ酸の配列所在部位に影響される。３つのアミノ酸残基により分離さ れている残基は、Ｎ末端であろうと、途中またはＣ末端であろうと、配列中の所 在部位に関係なく、最大の親和性でＮ１（ＩＩ）と結合する。Ｚｎ（１１）は３ 種の所在部位のいずれにおいても、残基との結合では最小の効果をもつ。 Ｃｕ（ｌｌ）およびＣｄ（ＩＩ）は、結合部位を含んでいるアミノ酸残基の所在 部位に依存して異なる親和性を示す。ペプチド配列番号　１１では、側鎖末端に ジアセタトアミノ部分をもつ人工アミノ酸が３位および７位に挿入された。Ｃｕ （１１）は、）１ｇ（ＩＪ）、Ｃｄ（ＩＩ）、Ｆｅ（ＩＩ）、Ｚｎ（ＩＪ）また はＰｂ（ＩＩ）より強い親和性でこの部分と結合する。この人工アミノ酸残基へ のＣｕ（ＩＩ）の結合は、αヘリックス構造で観察される最大の安定性を生じた 。０℃でＣｕ（ＩＩ）を用いて、ヘリックス性はおよそ１００％（＝３５６００ ）であり、さらｌ：２０’ｃでｃｕ（用を用いて、ヘリックス性はおよそ８０％ （＝２９３００）であった。上記の実験は、選択された金属イオン錯体化を利用 することにより、前例のないヘリックス量を短い単量体に誘導することができる ことを示した。 （４）　Ｒｕ（ＩＩＩ）−ペプチド複合体＋７＞ＣＤ実施例２Ｂのように調製し たＲｕ（Ｉｌｌ）−ペプチド複合体をＣＤ分析に付し、ペプチド配列番号・３お よび４におけるルテニウムのαヘリックス安定効果を測定した。分析は上記に述 べたように実施した。 結果は、イオン交換不活性大環状Ｒｕ（ＩＩＩ）複合体の形成による、ペプチド 配列番号・３および４の構造的流動性の制限は、安定なαヘリックス金属ペプチ ドをもたらすことができることを示した。Ｒｕ（ＩＩＩ）複合ペプチド配列番号 ：３および４の室温における水中でのＣＤスペクトル分析は、それぞれ＞８０％ （，１ｇ＝−２８０００）および５０％（ｘｔｔ＝　１７３（１０）の（ｚ　ヘ Ｉ）　ックス性を示した。反対に、同じ条件で遊離ペプチド配列番号　３は、４ ５％へワックスで（、。 、＝−１６６００）、一方、非複合ペプチド配列番号：４はランダムコイル構造 のＣＤスペクトルを示した。Ｒｕ（ＩＩＩ）複合体は、０．５から３００μＭの 測定範囲では、ペプチド濃度に非依存性のＣＤスペクトルを示し、溶液中で単量 体複合ペプチド配列番号＝３および４の金属イオン複合および未複合形との間の ヘリックス安定性における相違を調べるために、転移金属イオン存在下および非 存在下における各ペプチド構造安定性を、報告された手順（Ｐａｃｅら、蛋白構 造（Ｐｒｏｌｅｉｎ　５ｔｒｕｃｔｕｒｅ）、３１１ページ、ＩＲＬ　Ｐｒｅｓ ｓ社刊（１９８９））にしたがって熱変成実験からめた。熱変成曲線の分析によ り、Ｇ対Ｔ直線およびファントホッフプロットを得た。このデータは、イオン交 換不活性Ｒｕ（ＩＩＩ）複合体の形成は、αヘリックス構造の安定に対してＩｋ ｃａｌ／ｍａｔまで与え、さらに劇的に両ペプチドの融解温度をおよそ２５℃ま で上昇させることを示した。複合ペプチド配列番号＝３および４は、それぞれ３ ５℃および９．５℃の融解温度（Ｔｍ）を示し、一方、対応する遊離ペプチドの 融解温度はｌ１℃および−１５，５℃であった。 上記の実験は、イオン交換不活性金属複合体は、高度に安定なαヘリックス金属 ペプチドを設計することで効果的に開発できることを明瞭に確立した。安定なα ヘリックスペプチドの形成のための簡単な方法の利用可能性は、生物学的に活性 なペプチドの新規設計において非常に大きな有用性をもつ。 実施例４，３重螺旋金属ポリペプチドの合成５−カルボキシル−２，２°−ビピ リジン結合配位子に、Ｎ末端で共有結合させた１５アミノ酸残基の線状両親媒性 ペプチドを設計し、多価金属イオンの存在下で自然に自己集合して４５残基トリ へりックス金属ポリペプチドを形成することを示した。 トリへワックス形成に向かう性質を避けるために、この合成方法に用いる直鎖の 両親媒性ペプチドは、およそ４つのへワックス反転に限定した。本来そのような 短い両親媒性ヘリックスは、種々のマルチマー集合物に加わることができるが、 他の安定化相互作用の非存在下では安定なトリへりックスポリペプチドを形成す るには十分な長さではない。さらに、線状両親媒性ペプチドは、並列トリへりツ タストポロジーに適合するようにデザインされたが、そのようなペプチドは既知 のαヘリックス巻のコイル構造で示唆される７回繰り返しには順応しない。 下記に示す１５アミノ酸残基ペプチド（プラスＮ末端Ｇ１ｙ残基）を設計し、金 属ポリペプチドのための線状両親媒性ペプチドとして用いた。　−−Ｇｌｙ−Ｇ ｌｕ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ｇｌｎ−Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ｇｉｎ−Ａ ｌａ−Ｌｅｕ−Ｇｌｎ−Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−Ａｌａ（配列番号：１８） このペプチドは、螺旋形成に非常に有利に働く５つのアミノ酸残基を含んでいる 。疎水性および親水性アミノ酸残基は分離され、各々は螺旋表面のおよそ半分を 占存する（図５参照）。ＬｅｕおよびＡｌａ残基は疎水性面を構成し、一方、Ｇ Ｉｕ、ＬｙｓおよびＧｉｎ残基は親水性表面を構成する。好ましい荷電ヘリック スの双極相互作用を最大とし、さらにヘリックス安定性を増強するために、ペプ チドを鎖の末端でブロックし、さらにＬｙｓおよびＧｌｕ残基をそれぞれＣおよ びＮ末端近くに置いた。 該構造物の疎水性核を形成する非極性側鎖のへリックス間バッキングを調べ、立 体的に好ましいバッキング配列を得るようにアミノ酸配列を設計した。最適な疎 水性バッキングは、球形構造の安定性に必須であると考えられているが、手元の 静止モデルに基づきオーバーデザインを避けた。溶媒に１される親水性表面は、 ヘリックス内と同様、いくつかの可能なヘリックス間静電相互作用を助長するよ うにデザインした。グリシノを配位アミノ酸残基として用いた。 所望のトリへりツタストボロジーをもつ全体的なＣ３シンメトリ−を保存するた めに、各線状両親媒性ペプチドを、想像上の八面体配位複合体に二速配位子を与 えるようにデザインした。２．２′−ビピリジン誘導体を結合配位子として選択 した。なぜならば、それは、トリトポロジーのための最も好ましい物理化学特性 を与えるからである。 ２．２°−ビピリジル配位子は、種々の多価金属イオンと容易に反応し、よく性 状が調べられたトリスキレート配位複合体を生成する。さらに、トリスビピリジ ル複合体は、トリトポロジーの形成および分離のために必要な熱力学的、動力学 的安定性を有している。 設計および合成を簡単にするために、結合配位子は、直鎖状両親媒性ペプチドの 各々のＮ末端に、Ｃ−５位で炭素原子を介して共有結合させた。そのような結合 は、立体的混雑性および、アッセンブリー中の配位子対配位子の反発を最小限に することが示された。メリフィールドの同和合成のために、Ｎ−タルトブチルオ キシカルボニル（Ｂｏｃ）アミノ酸誘導体を用いることによって、＋５アミノ酸 残基ペプチド配列番号　１８を調製した。Ｎ−α−Ｂｏｃ−Ｌ−アミノ酸を下記 の側鎖保護基とともに用いた；Ｇｌｕ　（ＯＢｚ　Ｉ）　、Ｌｙｓ　（Ｃｉ−Ｚ ）、粗いガラスフリットを取り付けた３０ｍ１の容器で、手動のペプチド合成を 実施した。４−メチルベンズヒドリルアミン樹脂上で保護ペプチドの手作業によ る組み立てを、以下の反応工程サイクルを用いて室温で実施した。第一に樹脂結 合アミノ酸のα−アミノ基からＢｏｃ保護基をＴＦＡで除去した（ＣＨｔＣＩｔ 中の５０％ＴＦＡで１および２０分）。その後、脱保護ペプチド樹脂をＣＨ，Ｃ Ｉ。 中のｌＯ％ＤＴＥＡで中和した（２×２分）。ＩＯから１５ｍ１のＤＭＦ中で３ 当量のＢｏｃ−アミノ酸、３当量のＢＯＰ試薬および５．３当量のＤＩＥＡを加 えることにより遊離α−アミノ基にアミノ酸を連結させた。反応を合計２時間進 行させた。連結工程はカイザー試験でモニターした。第二の連結が必要なときは 、まず樹脂をジクロロメタン中の１０％ＤＩＥＡで中和させた。 ５−カルボキシ−２，２゛−ビピリジンを調製するために、乾燥ＴＨＦ　（１５ ｍ１）中の２−クロロ−５−エチルニコチネート（２ｇ、Ｉ　Ｃ１，８０１１１ ０１）　、２−　トリメチルチンピ’Ｊ’）ン（２，７ｇ、１１．３ａｎｏｌ） およびＰｄ　（Ｐｈｓ　Ｐ）　２　ＣＩｆ（０゜４ｇ、０．５４　Ｉｍｏｌ）の 溶液を２０時間還流させた。褐色の反応混合物を蒸発させ、ジクロロメタン中に 取り、シリカゲルーセリット床を通して濾過した。溶媒の蒸発により、５−エト キシカルボニル−２，２゛　−ビピリジンを青黄色固体として得た（１．３ｇ、 ５４％）。’ＨＮＭＲおよび薄層クロマトグラフィーで調べたところ、粗生成物 は〉９５％純度であり、さらに精製することなく次の反応に用（ＣＤＣ工、、３ ００　Ｍｚ）　６　ユ、４コ　（ｔ、Ｊｌｍ７Ｈｚ、３）１．　ＣＨ，ＣＨ２） 、４．４コ（Ｃ１゜Ｊ−７Ｈｚ、２Ｈ，ｃＨ２ＣＭ３）、７−コ６　（ｒｎ、Ｉ Ｈ）、７．１１４（ＩＴ＋、１８１．　Ｊｌ、４２（ｍ。 ＩＨＩ、８．５０（ｍ、２Ｊ（ｌ、８．７０（ｄ、３−４．２Ｈｚ、１８）、９ ．２７（ｄ、、７−１．５Ｈｚ）。 ｙ、５（ＦＸＶ）（Ｍ十Ｈ）”＝２２９゜粗エステル（Ｉｇ、４．４　ａｍｏｌ ）をメタノール（５ｍｌ）に取り、これにＩＮのＮａＯＨ（５ｍｌ）を加え、溶 液を室温で３時間撹拌した。溶媒をその後蒸発させ、残留物を最少量の水に溶か した。溶液をジクロロメタンで抽出し、水層を濃塩酸でｐＨ３に酸性化した。分 析的に不純物のない白色結晶として生成物がｌＳｔ、殿した（０．８３　ｇ、９ ５％）。 ’ＨＮ’Ｍ］’ｌ　（ＤＭＳＯ，コｏｏ　Ｆ；Ｅｚ　６　７．：１６　（ｍ、Ｉ Ｈ）、７Ｊ６（ｒ＋＋。 １）＋１．８．４５（ＩＴ＋、　３Ｈｌ、　８．７１（ｄ、　、７−４Ｈｚ、　 １８）、　９．２９（ｓＪ）Ｉ）、ＭＳ（ＦＩＢ）　（Ｍ＋Ｈ）”　−２０１ 上記で説明したように調製した５〜カルボキシル−２，２′　−ビピリジンをＤ ＤＣ−Ｈｏｂｔ法を用いて、Ｎ末端アミノ官能基に連結した。樹脂結合ペプチド サンプル（１，０ｇ、　０．２３ｍｅｑ／ｇ）を１０ｍ１の反応容器に入れ、ジ クロロメタンで樹脂を５度洗浄した。末ｍＢｏｃ保護基を除去し、標準的操作で 樹脂を中和した。別のフラスコに、５−カルボキシ−２，２°　ビピリジン（２ ０１■、１．０ｔｒｍｏ　Ｉ　）、１−ヒドロキシベンゾトリアゾール】水和物 （１５３，１■、１．０画０１）および４−ジメチルアミノピリジン（３０ＩＩ １ｇ、０．２５ａｎｏｌ）を５．０ｍｌのＤＭＦに溶かした。この溶液にジイソ プロピルカルボジイミド（１５７μＩ　、１．　Ｏｎｍｏｌ）を加え、混合物を 室温で３０分撹拌した。その後、この混合物をペプチド／樹脂反応容器に移し、 絶えず撹拌しながら（カイザー試験が陰性となるまで）３−４時間反応させた。 それから樹脂を、ＤＭＦ　（５Ｘ）およびＣＨｔ　Ｃｒｙ　（５Ｘ）で洗浄し、 真空中で乾燥させた。 その後、ペプチドを脱保護し、）（Ｆで処理して樹脂から切り離し、逆相Ｃｒ５ ＨＰＬＣで精製した。乾燥樹脂をＨＦ装置に載せた。ペプチド−樹脂結合と同様 に側鎖保護基を“高ＨＦ“条件下で（９０％ＨＦ、ＩＯ％ｐ−クレゾール）、２ 時間、０℃で切断した。真空下でＨＦを除去した後、ペプチド−樹脂残留物をフ リット漏斗に載せ、ジエチルエーテル（５×）で洗浄した。それから、ペプチド を１０％酢酸水に溶かし、濾過し樹脂をフリットに残した。粗ペプチド溶液を凍 結乾燥し、１５０−２００■のサンプルを２％酢酸水に再溶解し、同じ溶媒で予 め平衡化したセファデックスＧＩ５カラム（２，５０ｃｍ）でゲル濾過し、ゴミ および低分子量夾雑物を除去した。 その後、２２−６３％アセトニトリル／水１０．１％ＴＦＡの直線濃度勾配を用 い、９．０ｍｌ／ｍｉｎの流速で２０分で、ペプチドをＶ　ｙ　ｄ　ｅ　ｃ　Ｃ ４カラムで調製用逆相ＨＰ　Ｌ　Ｃで精製した。所望のペプチド分画く保持時間 １８分）を集め、アミノ酸分析およびＦＩＢ質量分析で性状を調べた（Ｍ／Ｚ＝ 　＋　８２１）。分析用ＲＰ　ＨＰＬＣにより、ゲル濾過粗ペプチドは〉９０％ の純度で、ＨＰＬＣ精製サンプルは〉９９％の純度であることが示された。 その後、水性媒体中で精製ペプチドを、Ｎ１（ＩＩ）、Ｃｏ（Ｉｆ）、Ｆｅ（Ｉ Ｉ）およびＲｕ（ＩＩ）と反応させた。被験金属イオンのいずれの存在下でもペ プチドの水溶液は、トリスビピリジル金属複合体に特徴的な吸収スペクトルを示 した。 アルゴン雰囲気下で、三塩化ルテニウム水和物（０，７■、３．３μΦｏｌ）を 、１．０ｍｌのシュレンク型試験管中のガス抜きした５０％エタノール：水混合 物１００μｌに溶かした。反応混合物を９０℃で３０分加熱した。その間、溶液 の色は褐色から緑、暗青色に変化した。ビピリジルペプチド（２０ｍｇ、１１μ ｍ０１）を脱ガスした５０％エタノール：水混合物の１００μｍに溶解し、アル ゴン雰囲気下でルテニウムの“青色”溶液に加えた。さらに３０分加熱を続けた 。反応が進行するにしたがい、溶液は深青色から赤褐色に変化した。反応混合物 を室温まで冷やし、直接セファデックスＧ−２５，７−カラムにかけ、水で溶出 した。その後、所望の金属蛋白複合体を少量の未反応ペプチドから、ＣＭ−セフ ァデックスＣ−２５でイオン交換クロマトグラフィーを用いて、５０酬のＭＥＳ 　（ｐＨ６，５）緩衝液中の０−２ＭのＮａＣｌの塩濃度勾配で分離した。脱塩 と同様、最終精製をＲＰ　ＨＰＬＣを用いて実施し、およそ１５■の所望の金属 蛋白を得た。所望の複合体の生成は、ＦＩＢ質量分析Ｍ／Ｚ＝５５６３および以 下の特徴的な紫外線および可視線吸収バンド（、、、・　（ｎｍ）２５５；３０ ０；および４７０ｂｒ）により立証された。 ブルーカー（Ｂｒｕｋｅｒ）ＡＭ　３００スペクトロメーターで、プロトン核磁 気共鳴スペクトルを３００ＭＨｚで記録し、ＭｅｔＳｉからダウンフィールドで ＰＰＭで記載した。紫外線可視線スペクトルは、アビブアソシエーツ（Ａｖｉｖ 　Ａｓ５ｏｃｉａｔｅｓ）　１４ＤＳおよびミルトンロイスペクトロ−ｙり３０ ００アレー（Ｍｉｌｔｏｎ　Ｒｏｙ　５ｐｅｃｔｒｏｎｒｃ　３０００　Ａｒｒ ａｙ）分光計で記録した。円偏光二色性測定は、熱安定セルホルダーを備えたア ビブアソシエーツ６２ＤＳ分光計で、ｌ０５ｌおよび０．１ｍヘルマ水晶セルを 用いて行った。すべての報告したＣＤデータは±２−５％の不確実さを有する。 すべての楕円率測定は、単位ｄｅｇ−（至）’　ｄｍｏｌ−’で平均剰余楕円率 、［コとして表した。ペプチド濃度は、内部スタンダードとしてノルロイシンを 用いて定量的アミノ酸分析（３回実施の平均）によりめた。ＦＩＢ陽イオン質量 スペクトルは、セシウムイオンガンを備えたＶＧ　ＺＡＢ−ＶＳＥ二重フォーカ シング質量分光計で得た。調製用逆相ＨＰＬＣは、２．２Ｘ２５ｃｍのＶｙｄａ ｃ　Ｃ４（１０４粒子サイズ）カラムで、Ａ：Ｉ％アセトニトリル／水１０，１ ％ＴＦＡ、Ｂ：９０％アセトニトリル／水１０．０７％ＴＦＡの二元濃度勾配を 用いて実施した。溶出像は２２５および２８０ｒ＋ｍでモニタニした。分析用逆 相ＨＰＬＣは、４．６Ｘ２５０ａｎ＋Ｖ５’ｄａｃ　Ｃｐｓ　（粒子サイズ５μ ）カラムを用いて、上記の二ニシン濃度の関数としてＩ　ＯＯ酬ＨＥＰＥＳ中の ４５０μＭの金属蛋白を含む溶液の平均剰余楕円率を、熱安定性０．１μｍヘル マ水晶セルで２．２２ｎｍで測定することによりめた。溶液は、測定前に２５℃ で少な（とも１時間保持した。記載した各点は、１分間の測定の連続６０回の平 均である。 変成曲線は、以下の等式に適合する最小二乗法（非直線リグレッションプログラ ムＭＩＮＳＱ）を用いて分析した； ｆｕ＝　（ｅｘｐ　（Ｇ　（ＨｆＯ）／ＲＴ−ｍ　［Ｄ］　／ＲＴ）／１＋ｅＸ ｐ　（Ｇ　（ＨｔＯ）／ＲＴ　ｍ　［Ｄ］　／ＲＴ））式中、ｆ、＝（い−、、 、）　／　（、−、）は非展開フラクションで、［Ｄ］は変成物濃度で、ｍは変 成物濃度におけるＧの依存の程度で、７は天然構造に対する測定［］、、、で１ ．は変成構造に対する測定［］、、、で、。１．は観察した変数パラメーターで ある。 Ｎ１（ＩＩ）の存在下では、２４４および２９０ｎｍで生じるビピリジン部分の 内部配位子π−π＊吸収バンドは、同時に生じる、より長波長バンドの３０４お よび３１４ｒｌｆｆｌにおける２ピークへの分割とともに、特徴的な深色シフト を受けた。さらに、自然または変成条件下、並びにＣｏ（ＩＩ）およびＮ１（ｉ ｉ）の存在下および非存在下でのペプチドのサイズ排除クロマトグラフィーは、 二量体の形成と一致することが示された。Ｎ１（１１）およびＣｏ（ＴＩ）配位 複合体のイオン交換不安定性は、ＦＩＢＭＳによるそれらの分析を妨げるが、イ オン交換不活性複合体である［ＲＵ（ビピペプチド）］１＋は、Ｍ／Ｚ＝５５６ ３における予想された分子質量イオンに対応するピークをもつ質量スペクトルを 示した。 線状両親媒性ペプチドのαヘリックス含有量は、ＣＤ分光測定で実証されたよう に、Ｎ１（ＴＩ）またはＣｏ（ＩＩ）イオンの存在下で劇的に増加した。多価金 属イオンの非存在下では、ペプチド（５酬の硼酸ナトリウム中で７．４μＭ、ｐ Ｈ６，４）は、ａヘリックスはわずか３０％６ｔｔ　＝−１００００ｄｅｇ−ｃ ａ＋”　ｄｍｏドっであった。しかし、同様な条件でＮ　ｉ　（ＩＩ）またはＣ ｇ（ＩＴ）イオンの存在下では、ペプチドは７０％より高いαヘリックス性（Ｑ ｙｔ　＝　−２３４００ｄｅｇ−ｃｍ’　・ｄｍｏｌ−’）を示した。αヘリッ クス度は、１５０ｄのＮａＣ１の存在でさらに安定した（８０％、ｔｘｔ　”　 ２５８００ｄｅｇ−ｃｍ’　ｄｍｏドつ。 これらのデータは、ペプチドは金属イオン支援分子内自己集合プロセスを経るこ とを示した。トリスビピリジル金属複合体の生成は、空間で接近している３個の αヘリックスペプチドのＮ末端を必然的に引き付けるので、そのような劇的な非 無作為二次構造誘発を生じる鏡開のヘリックス−ヘリックス相互作用については 、２つの可能な態様が存在するだけである。その１つは、所望のトリへリンクス トボロジーは、隣接のへリックスとかみ合う各ヘリックスペプチドの疎水表面で 形成されるもので、他の１つは、溶液中で不規則（無作為）な方向性をとる第三 のヘリックスペプチドと二本鎖へリックス構造を形成するために、トリス−ビピ リジン複合体の２つのヘリックスペプチドだけが相互作用するというものである 。これら２つの可能性は、金属ポリペプチドの濃度に対する非無作為二次構造誘 導の依存関係を測定することによって明らかにされた。 溶媒に湯された疎水性表面を欠くトリへりックス構造は、金属ポリペプチド濃度 に依存しないＣＤスペクトルを示すと予測される。他方、別の分子間相互作用が 利用し得るマツチしていないヘリックスペプチドをもつ二本鎖構造は、濃度依存 ＣＤスペクトルを示すと予想される。図６に示したように、Ｃｏ（ＴＩ）イオン の存在下における金属ポリペプチドαヘリックス含有量は、５から１００μＭの ペプチド濃度にわたって一定のままであり、したがって、所望のトリへりツクス トポロジーが形成されていることを示した。同様な反応がＦｅ（ＩＩ）およびＲ ｕ（ＩＩ）の存在下で観察された。 添加多価金属イオンの非存在下では、ペプチドは、予想された濃度依存性分子間 凝集を経て、驚くべきことには二量体構造を形成した。そのような反応は、トリ へりツクストポロジーを選択的に安定化させることにより（たとえそのようなト ポロジーが、金属イオンの非存在下では熱力学的に一番安定な存在でなくとも） 、分子間構造の形成に対するペプチドの本質的な好みの方向を変え、または覆す という多価金属イオンの有用性を明らかにした。 トリス−ビピリジル−金属イオン配位複合体はキラルであり、左巻きまたは右巻 きへリックスのいずれかを形成するので、２つの偏左右立体異性のトリへリック ス構造が形成され得る。しかしながら、配位複合体の全体的なＣ３シンメトリ− により強制される幾何学的拘束と同様、その後に続（並列トリトポロジーの立体 発生環境は、集合過程において強い偏左右選択性を強制すると予測される。Ｎｉ （■１）存在下のペプチドのＣＤスペクトル（２８０および３３０ｎｍの範囲） は、左巻きへリックス構造をもつ、１つの偏左右異性体の生成を示していた。そ のような作用は、また、トリへリックス金属ポリペプチドの予測される左巻きス ーパーコイルと一致する。Ｎ　ｉ　（ＩＩ）存在下の金属ポリペプチドの熱変成 曲線分析により、直線Ｇ対Ｖおよびファントホッフプロットが得られた。トリへ リツクス金属ポリペプチドは、安定の自由エネルギーは０．６　Ｋｃａｌ／ｍｏ ｌで、溶解温度Ｔｍは４１℃であることを示した。 これらのデータをまとめると、多価金属イオン支援自己集合過程は、位相幾何学 的に予め決定しておいた金属ポリペプチドのデザインおよび構築のための簡便で 、効果的な手法であることが分かる。このアプローチの平易さは、非蛋白原性ア ミノ酸および分光光学用標識の取り込み同様、最小の合成労力で構造の最適化を 可能にする。 実施例５．並列テトラヘリックス金属ポリペプチドの合成並列テトラヘリックス 金属ポリペプチドを形成するために分子間連係を経ることができる、ペプチド配 列のデザインのための重要な原則は、実施例４のトリヘリックスコイル構造のデ ザインで用いられたものと同じである。目標とする構造の全体的トポロジーに適 合するポリペプチド配位複合化部位を、このような設計原則にしたがって利用し なければならない。 並列テトラヘリックス金属ポリペプチドは、まずαヘリックス構造をもつ非直線 状両親媒性ペプチドを標準的な固相法で合成し、ペプチドのＮ末端を、イミダゾ リルポリペプチド結合配位子に結合したスペーサー分子で官能化してペプチド− 配位子複合体を形成し、その後ペプチド−配位子複合体を多価金属イオンと反応 させて生成する。 この合成方法に従い、下記に示す１５アミノ酸残基ペプチドを、ベンズヒドリル アミン樹脂で標準メリフィールド固相法により合成した。 −Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｇｌｎ−Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ａｌａ −Ｌｅｕ−Ｇｉｎ−Ｌｙｓ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−ＣＯＮＨｙ（配列番号： １） ペプチド配列の設計は、並列テトラヘリックス束構造のＣＰＫモデルを吟味する ことにより支援した。構造物の疎水性核を形成する非極性側鎖のへリックス間バ ンキングを調べ、それによりさらにアミノ酸配列をデザインし、立体的に好まし いバンキング配列を得た。ペプチドの１４残基ヘリックス部分は、本来５つの、 非常にヘリックス構造に有利なアミノ酸から構成されている。極性および非極性 残基は分離され、各々はへリックス表面のおよそ半分を占有している。Ｌｅｕお よびＡｌａ残基は疎水性面を構成し、一方、Ｇｌｕ、ＬｙｓおよびＧｉｎ側鎮側 鎖性は親水性表面を構成する。 好ましい電子−へリックス双極相互作用を最大にしてヘリックス安定性を増強す るために、ペプチドを鎖の末端でブロックし、ＬｙｓおよびＧｌｕ残基をそれぞ れＣおよびＮ末端に置いｔこ。溶媒に爆される親水性表面は、いくつかの可能な ヘリックス間およびヘリックス内静電作用を促進するように設計した。 ペプチドはＧｌｙ残基でＮ−キャッピングを行い、ポリペプチド結合配位子をペ プチドに連結する、構造的に柔軟なスペーサーをその後に続けた。 スペーサーの長さは、ＣＰＫモデルを吟味することにより決定し、金属イオン錯 体化部位およびヘリックス領域を立体的に好ましい連続配列とした。 Ｎ末端Ｇｌｙ残基は、樹脂結合ペプチドを、予め生成しておいたニコチン酸の１ −ヒドロキシベンゾトリアゾールエステルの５当量とジメチルホルムアミド（Ｄ ＭＦ）中で、１０％の４−ジメチルアミノピリジン（ＤＭＡＰ）の存在下で３時 間反応させることにより官能化し、ピリジル−ペプチド複合体を生成した。 ピリジル−ペプチド複合体を、無水ＨＦで処理して樹脂から切り離し、セファデ ックスＧ−２５カラムでゲル濾過して分離し、ＲＰ　ＨＰＬＣで精製し、アミノ 酸分析、　’ＨＮＭＲ，ＦＩＢ−ＭＳおよび分光吸収によりその性状を調べた。 三塩化ルテニウム水和物（０，３ｍｇ、　１．４　μｍｏｌ）を、脱ガスした５ ０％（ｖ／Ｖ）エタノール／水の１２０μｍに１．Ｏｍｌのシュレンク型試験管 中で溶かし、反応混合物を生成し、アルゴン雰囲気下で保持した。反応混合物を ９０℃で２０分加熱したが、その間、反応混合物の色は褐色から緑、暗青色へと 変化した。 上記に説明したように分離精製したピリジルーペプチド複合体（１０ｍｇ、６． ０μｍｏｌ）を、ルテニウムの青色反応混合物と混ぜて混合物をつくり、この混 合物を９０℃で３０分加熱した。その間、混合物は、暗青色から緑へと変化した 。混合物をセファデックスＧ−２５ゲル濾過カラムにかけ、ペプチド含有分画を 集めた。 ５０酬トリス緩衝液（ｐＨ７，６）中の０−２ＭのＮａＣ］濃度勾配によるＣＭ セファデックスＣ−２５のイオン交換クロマトグラフィーを用いて、並列テトラ ヘリックス金属ポリペプチドを未反応ポリペプチドから分離した。ＲＰ　ＨＰＬ Ｃを用いて並列テトラヘリックス金属ポリペプチドを精製して、収量７．０■を 得た。 並列テトラヘリックス金属ポリペプチドは、２５６ｎｍの吸収、＜ノドおよび３ ７７ｎｍに中心をもつ広いバンドをもつ、トランス［Ｒｕ　（Ｐｙ）　４　Ｃ＋ ｔ　］複合体に特徴的な吸収スペクトルを示した。反対に、Ｒｕ非存在下のピリ ジル−ペプチド複合体は、２６０ｎｍのピリジル吸収バンドのみを示した。並列 テトラヘリックス金属ポリペプチドの形成は、サイズ排除クロマトグラフィーを 用いて、分子量をめることにより確認した。並列テトラヘリックス金属ポリペプ チドのＣＤスペクトルＣ１ｘｔ＝　−２９０００ｄｅｇ−ｃｍ２ｄｍｏｌ−’、 αヘリックスは〉９０％）は、そのような金属ポリペプチドと一致する高いヘリ ックス構造を示した。 下記に示す１４アミノ酸残基配列を設計し、下記に示すようなβ−反転構造を確 認するために、その−欠配列を合成した。 Ａｃ−Ｃｙｓ−Ｌｅｕ−５ｅｒ−Ｖａ　１−Ｈｉ　５−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｈｉ　 ５−Ｔｈ　ｒ−Ｔｙ　ｒ　−１１ｅ　−Ｇ　Ｉ　ｎ−Ｃｙ　ｓ　−ＣＯＮＨｓ（ 配列番号：１９） ペプチドは標準的なメリフィールド固相方法を用いて調製し、その後水溶液中で Ｚｎ（ＩＩ）と反応させた。金属ペプチドは、βシート構造をもつ介在残基とと もにβ反転を構成する。亜鉛金属イオン（Ｍ）の電荷は、２個のＣｙｓ残基によ り中和される。亜鉛金属イオンは、溶媒に向けて外側に向く側鎖とともに構造物 の内部に存在する。 金属イオンの非存在下では、このペプチドは、およそ４からおよそ９のｐＨ値で 、水性媒体に容易に溶けた（およそ２ｍｇ／ｍｌ　、１．３ｍ１Ｊまで）。ペプ チドは、およそ５．０より上のｐＨ値で亜鉛１当量と結合し、およそ７．０のｐ Ｈ値でＫｄ＝１−５ＸＩＯ−’Ｍである。ペプチドの水溶液溶解度は、およそ５ ．０より大きいｐＨ値で亜鉛の存在下でおよそｌ／ｌ　００に減少する。 ＣＤおよびＮＭＲ分析のデータにより、亜鉛存在下のペプチドのβ反転構造が確 認された。添加亜鉛の非存在下では、ペプチド（硼酸ナトリウム中で６．０×１ ０−’Ｍ　、ｐＨ７，，５）は、ランダムコイル構造に特徴的なＣＤスペクトル を示した。ペプチドへの１当量の亜鉛添加は、２３０ｎｍで最小、２１０ｒｕｎ で最大というＣＤスペクトルの劇的なシフトを惹起して、β−反転構造を示唆し た。さらに、ＮＭＲデータはＨｉｓの２−Ｈおよび４−Ｈプロトンは亜鉛の存在 下で化学シフトを受けることを示したが、シフトはそのようなＨｉｓ残基の亜鉛 結合における参加を示唆するものであった。 ８、　１つのβ反転をもつ金属ペプチド下記に示す１２アミノ酸残基配列を設計 し、下に示したβ−反転構造を確認するためにその配列を合成した。 Ｖａ　Ｉ−Ａｓｎ−Ｖａ　１−Ｌｙｓ−Ｈｉ　５−Ｇｌｙ−５ｅｒ−Ｈｉ　５− Ａｓｎ−Ｖａ　Ｉ−Ｌｙｓ−Ｖａ　ｌ−Ｃ０ＮＨｙ（配列番号：２０） れかの側の残基とともにβ反転を構成する。このペプチドのトポロジーｉｔ　Ｎ 　Ｍ　Ｒおよび範囲を逸脱することな〈実施され得る。 ＦＩＧ、　７ 波長（ｎｍ） ＦＩＧ、　３８ 波長（ｎｍｌ ＦＩＧ、　３Ｃ ％見かけのへ１月ノクス性 ｆ０Ｊ２２２ｘｌＯ’（ｄｅｇ、ｃｍ’、ｄｍｏ／　）Ｒθ４ Ｒθ５ ＦＩＧ、θ ＥＧ、　７Ａ ＥＧ、　７ｂ 国際調査報告 フロントページの続き （８１）指定国　ＥＰ（ＡＴ、ＢＥ、ＣＨ，ＤＥ。 ＤＫ、　ＥＳ、　ＦＲ，ＧＢ、　ＧＲ，ＩＴ、　ＬＵ、　ＮＬ。 Ｅ）、ＡＵ、ＣＡ、ＦＩ、ＪＰ、Ｎ。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．ペプチドが、水性溶媒接近可能である２つの配位アミノ酸残基において金属 陽イオンに結合した金属ペプチドであって、前記結合金属陽イオンによって安定 化された二次構造を有する前記金属ペプチド。 ２．前記二次構造が、 （ａ）αヘリックスであり、前記配位アミノ酸残基がポリペプチド上でｉおよび ｉ＋４の相対的アミノ酸位置に局在するか、または（ｂ）βターンを有するβシ ートであり、前記配位アミノ酸残基がポリペプチド上でｊおよびｉ＋３またはｉ −１およびｉ＋５の相対的アミノ酸位置に局在する、 請求の範囲第１項記載の金属ペプチド。 ３．βターンを有する前記βシートが、左から右に読んでアミノ末端からカルボ キシ末端の方向にアミノ酸残基配列： 【配列があります】 （配列番号：１９） または 【配列があります】 （配列番号：２０） を有する請求の範囲第２項記載の金属ペプチド。 ４．前記配位アミノ酸残基がヒスチジン、システインおよびメチオニンよりなる 群から選択され、前記金属陽イオンがＺｎ（ＩＩ）、Ｃｄ（ＩＩ）、Ｃｕ（Ｉ） 、Ｃｕ（ＩＩ）、Ｎｉ（ＩＩ）、Ｒｕ（ＩＩ）、Ｒｕ（ＩＩＩ）、Ｐｔ（ＩＩ） 、Ｐｄ（ＩＩ）、Ｃｏ（ＩＩ）、Ｃｏ（ＩＩＩ）、Ｍｇ（ＩＩ）、Ｂａ（ＩＩ） 、Ｓｒ（ＩＩ）、Ｆｅ（ＩＩ）、Ｆｅ（ＩＩＩ）、Ｖ（ＩＩＩ）、Ｃｒ（ＩＩ） 、Ｃｒ（ＩＩＩ）、Ｍｎ（ＩＩ）、Ｒｈ（ＩＩＩ）、Ａｇ（Ｉ）、Ｈｇ（ＩＩ） 、Ｍｏ（ＩＩＩ）、Ｍｏ（ＩＶ）、Ｍｏ（Ｖ）、Ｍｏ（ＶＩ）、Ｗ（ＩＩＩ）、 Ｗ（ＩＶ）、Ｗ（Ｖ）、Ｗ（ＶＩ）、Ｃａ（ＩＩ）、Ｐｂ（ＩＩ）、Ｃｅ（ＩＩ Ｉ）、Ａｌ（ＩＩＩ）およびＴｈ（ＩＶ）よりなる群がら選択される請求の範囲 第１項記載の金属ペプチド。 ５．安定化された二次構造を有する金属ペプチドを調製するに際し、（ａ）予備 選択されたアミノ酸残基配列を有するポリペプチドを調製し（二次構造を形成し 得る前記配列の一部は親水性領域を有し、前記ポリペプチドは、水性溶媒接近可 能で前記親水性領域中で金属結合部位を形成する２つの配位アミノ酸残基を含む ）、 （ｂ）水溶液中で前記ポリペプチドと予備選択した金属陽イオンとを混合するこ とにより生物学的反応混合物を形成し、（ｃ）前記金属陽イオンが前記金属−配 位子配位接点を介して前記配位アミノ酸残基に結合し、前記待合金属陽イオンに よって安定化された二次構造を有する金属ペプチドを形成するのに十分な時間、 生物学的反応条件下に前記生物学的反応混合物を維持する、 工程を含む安定化された二次構造を有する金属ペプチドの調製方法。 ６．（ｄ）工程（ｂ）で混合した金属陽イオンとは異なる金属陽イオンを含む以 外は前記同様に工種（ｂ）および（ｃ）を実施し、（ｅ）工程（ｃ）および（ｄ ）で形成されかつ維持された生物学的反応混合物のそれぞれに存在するポリペプ チドによって示される二次構造の量を決定し、 （ｆ）工程（ｅ）の測定により最大量の二次構造を示す、維持された混合物を選 択し、安定化された二次構造を有する金属ペプチドを形成する、工程を更に含む 請求の範囲第５項記載の方法。 ７．前記二次構造がβターンを有するβシートであり、前記配位アミノ酸残基が ポリペプチド上でｉおよびｉ＋３またはｉ−１およびｉ＋５の相対的アミノ酸位 置に局在する請求の範囲第５項記載の方法。 ８．前記配位アミノ酸残基をヒスチジン、システインおよびメチオニンよりなる 群から選択し、前記金属陽イオンをＺｎ（ＩＩ）、Ｃｄ（ＩＩ）、Ｃｕ（Ｉ）、 Ｃｕ（ＩＩ）、Ｎｉ（ＩＩ）、Ｒｕ（ＩＩ）、Ｒｕ（ＩＩＩ）、Ｐｔ（ＩＩ）、 Ｐｄ（ＩＩ）、Ｃｏ（ＩＩ）、Ｃｏ（ＩＩＩ）、Ｍｇ（ＩＩ）、Ｂａ（ＩＩ）、 Ｓｒ（ＩＩ）、Ｆｅ（ＩＩ）、Ｆｅ（ＩＩＩ）、Ｖ（ＩＩＩ）〜Ｃｒ（ＩＩ）、 Ｃｒ（ＩＩＩ）、Ｍｎ（ＩＩ）、Ｒｈ（ＩＩＩ）、Ａｇ（Ｉ）、Ｈｇ（ＩＩ）、 Ｍｏ（ＩＩＩ）、Ｍｏ（ＩＶ）、Ｍｏ（Ｖ）、Ｍｏ（ＶＩ）、Ｗ（ＩＩＩ）、Ｗ （ＩＶ）、Ｗ（Ｖ）、Ｗ（ＶＩ）、Ｃａ（ＩＩ）、Ｐｂ（ＩＩ）、Ｃｅ（ＩＩＩ ）、ＡＩ（ＩＩＩ）およびＴｈ（ＩＶ）よりなる群から選択する請求の範囲第５ 項記載の金属ペプチド。 ９．２〜約８のポリペプチド結合配位子に配位結合により結合した多価金属イオ ンからなる単離された金属ポリペプチドであって、前記ポリペプチド結合配位子 の少なくとも２つが線状両親媒性ペプチドに共有結合により結合した単離された 金属ポリペプチド。 １０．前記多価金属イオンがＮｉ、Ｃｕ、Ｃｏ、Ｒｕ、Ｒｈ、Ｆｅ、Ｐｄまたは Ｐｔである請求の範囲第９項記載の金属ポリペプチド。 １１．前記ポリペプチド結合配位子がピリジンまたはイミダゾールの誘導体であ る請求の範囲第９項記載の金属ポリペプチド。 １２．前記ピリジン誘導体が３−カルボキシルピリジン、２−カルボキシルピリ ジンまたは５−カルボキシル−２，２′−ビピリジンであり、前記イミダゾール 誘導体がＮ−Ｃ１−Ｃ５アルキルカルボキシイミダゾールである請求の範囲第１ １項記載の金属ポリペプチド。 １３．少なくとも１つの前記線状両親媒性ペプチドがαヘリックス立体配座を有 する請求の範囲第９項記載の金属ポリペプチド。 １４．少なくとも１つの前記線状両親媒性ペプチドが金属ペプチドである請求の 範囲第９項記載の金属ポリペプチド。 １５．前記ポリペプチド結合配位子が、前記線状両親媒性ペプチドのＮ末端アミ ノ酸残基に共有結合により結合した請求の範囲第９項記載の金属ポリペプチド。 １６．４つの３−カルボキシルピリジンポリペプチド結合配位子に配位結合によ り結合した多価Ｒｕイオンからなる平行テトラヘリックス金属ポリペプチドであ って、その結合配位子のそれぞれが、左から右に読んでＮ末端からＣ末端の方向 に式： 【配列があります】 （配列番号：１） を有する線状両親媒性ペプチドに独立に共有結合により結合した平行テトラヘリ ックス金属ポリペプチド。 １７．３つの５−カルボキシル−２，２′−ビピリジンポリペプチド結合配位子 に配位結合により結合した多価金属イオンからなるトリヘリックス金属ポリペプ チドであって、そのポリペプチド結合配位子のそれぞれが、左から右に読んでＮ 末端からＣ末端の方向に式： 【配列があります】 （配列番号：１８） を有する線状両親媒性ペプチドに独立に共有結合により結合したトリヘリツクス 金属ポリペプチド。 １８．前記多価金属イオンがＮｉ、Ｃｏ、ＦｅまたはＲｕである請求の範囲第１ ７項記載の金属ポリペプチド。 １９．金属ポリペプチドを合成するに際し、ａ）単離されたペプチド−配位子接 合体を取得し（そのペプチド部分は線状両親媒性ペプチドであり、その配位子部 分は２〜８の配位部位を有する水溶性多価金属イオンとポリペプチド配位錯体を 形成するポリペプチド結合配位子である）、 ｂ）液体媒体中で過剰の前記ペプチド−配位子接合体と前記水溶性多価金属イオ ンとを混合して反応混合物を形成し（前記過剰は、前記多価金属イオン配位部位 のモル数を上回る前記ペプチド−配位子接合体のモル数を指す）、ｃ）前記ペプ チド−配位子接合体および前記多価金属イオンが２〜８の線状両親媒性ペプチド を有する金属ポリペプチドを形成するのに十分な時間および条件下で前記反応混 合物を維持する、 工程を含む金属ポリペプチドの合成方法。 ２０．金属ポリペプチドを合成するに際し、ａ）ポリペプチド結合配位子に対し て並んだ２〜８の配位部位を備え水溶性多価金属イオンを有するポリペプチド配 位錯体を取得し、ｂ）液体媒体中で前記ポリペプチド配位錯体と過剰の線状両親 媒性ペプチドとを混合して反応混合物を形成し（前記過剰は、前記ポリペプチド 配位錯体のモル数を上回る前記線状両親媒性ペプチドのモル数を指す）、ｃ）前 記ポリペプチド配位錯体および前記線状両親媒性ペプチドが２〜８の線状両親媒 性ペプチドを有する金属ポリペプチドを形成するのに十分な時間および条件の下 で前記反応混合物を維持する、工程を含む金属ポリペプチドの合成方法。 ２Ｉ．前記線状両親媒性ペプチドが溶液中でαヘリックスを形成し、前記ポリペ プチド配位錯体がＣ４対称性および８面体また正方形平面幾何配置を有し、前記 金属ポリペ７チＦが平行テトラヘリックストポロジーを有する請求の範囲第１９ 項または第２０項記載の方法。 ２２．前記線状両親媒性ペプチドが、左から右に読んでアミノ末端からカルボキ シル末端の方向に式： 【配列があります】 （配列 番号：１）または 【配列があります】 （配列番 号：１８） を有し、 前記ポリペプチド配位錯体が式： ｔｒａｎｓ−［Ｍ（Ｌ）４（Ｃｌ２）ｎ］（式中、Ｌは３−カルボキシルピリジ ンまたはＮ−置換イミダゾールであり、ＭはＮｉ、Ｃｕ、Ｃｏ、Ｒｈ、Ｒｕ、Ｐ ｄまたはＰｔであり、ｎ＝０または１である（ただし、ＭがＰｄまたはＰｔの場 合はｎ２０））を有する請求の範囲第１９項または第２０項記載の方法。 ２３．ＭがＲｕでありｎ＝１である請求の範囲第２２項記載の方法。 幽．前記線状両親媒性ペプチドが溶液中でαヘリックスを形成し、前記ポリペプ チド配位錯体がＣ３対称性および８面体また正方形平面幾何配置を有し、前記金 属ポリペプチドがトリヘリックスコイル状コイルトポロジーを有する請求の範囲 第１９項または第２０項記載の方法。