JPH06502546A - アメーバ／細菌共生体とその廃棄物及び汚染物分解への使用 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 アメーバ／細菌共生体とその廃棄物及び汚染物分解への発明の分野 本発明は、微生物共生体及び、廃棄物或いは汚染物の変性もしくは分解に関する 。更に本発明は、特に原生動物及び細菌から成る原生動物由来の共生体に関する ものであり、原生動物／細菌共生体の単離法、廃棄物及び汚染物の変性或いは分 解への、原生動物／細菌共生体の使用法に関する。

発明の背景 廃棄物及び汚染物の溶液は、変性或いは分解させる必要がある。産業並びに技術 の進歩を続ける一方で、汚染の広がっている生態学領域を保護し浄化する為に、 化学的並びに生物学的廃棄物を変性或いは分解する為の効果的な方法を考えるこ とが必要である。物質を変性させるということは、物質を何らかの方法で化学的 に変化させることである、物質を分解するということは、その分子構造を破壊す ることによってその物質を変えることである。

トリクロロエチレン（Ｔ　ＣＥ）は、多くの環境保護部（ＥＰＡ）　５ｕｐｅｒ ｆｕｎｄ用地で、環境に入す込ンテイル、一般的な化学廃棄物である。これらの 化合物は、発がん物質であると考えられ、好気的分解に対して抵抗性があるため 、水道の安全を脅かす。

汚染場所を浄化する為に使われている従来技術は困難を伴う。ヘキサン抽出のよ うな、多量の汚染水の化学処理は、コストが実際的ではない。曝気は、コストは 安いが、汚染物質を空中に希釈するにすぎない。従って、効果的でコストの安い 生物学的処理法は、汚染場所の浄化に向けての重要なステップであろう。ＴＣＥ は種々の機構により分解される。嫌気的状況では、ＴＣＥは塩化ビニルのような 、より強力な発がん物質に変えられる。好気的共生体またはメタン資化性菌及び シュードモナスの純粋培養物（ｐｕｒｅ　ｃｕｌｔｕｒｅｓ　）によるＴＣＥの 生物学的分解も報告されている。シュードモナスからのトルエンジオキシゲナー ゼ酵素は、ＴＣＥを変性或いは分解できることが示されてきた。しかし、トルエ ンもしくはフェノールが必要であった。他のメタン資化性菌の培養物は明らかに メタンモノオキシゲナーゼ酵素により、トルエンを加えることなしにＴＣＥを分 解することができる。

種々の有毒な化学物質の生物学的分解の様々な研究に於いて、いくつかの問題が 明らかになった。ある状況は、検査をする微生物にとって明らかに有毒であった り、化学物質が土壌粒子に吸収され、細菌による分解に利用できなかったりする 。さらに、ある種の土壌は、極めて小さな粒子、即ち「微粒子」を含み、細菌が それらの間に入り込んで隠れている化学物質を分解することを妨げる。

ＴＣＥ及び他の有毒物質の分解に使用される細菌は、一般に環境供給源から直接 単離される。

発明の目的 それ故、本発明の目的は、新規で有用な微生物共生体を供給することである。

本発明のもう一つの目的は、廃棄物及び汚染物を変性及び分解させる為の新規な 改良された方法を供給することである。

本発明の更にもう一つの目的は、廃棄物及び汚染物質を化学的に変性させる為の 、生物学的に誘導される新規な組成物を供給することである。

本発明の、それ以上の及びその他の目的は、ここに含まれている記述から明らか になるであろう。

発明の要約 本発明の観点によれば、新しい微生物共生体は、原生動物と細菌からなる、原生 動物由来の共生体から成る。

本発明の他の観点によれば、分散剤は原生動物由来の微生物共生体に由来する物 質から成り、その物質は、非極性炭化水素を分散させることができる。

本発明の他の観点によれば、微生物は原生動物由来の微生物共生体から単離され る細菌から成る。

本発明の他の観点によれば、分散剤は、原生動物由来の細菌から由来する物質か ら成り、その物質は、非極性炭化水素を分散させることができる。

本発明の他の観点によれば、廃棄物を化学的に変化させる方法は、 原生動物と細菌をから成る、原生動物由来の共生体を供給する工程及び 共生体に廃棄物を接触させ、廃棄物を化学的に変性させる工程 を含む。

本発明の他の観点によれば、非極性炭化水素の分散方法は、 原生動物と細菌から成る、原生動物由来の共生体を供給する工程及び 共生体に非極性炭化水素を接触させて非極性炭化水素を分散させる工程 を含む。

本発明の他の観点によれば、廃棄物を化学的に変性させる為の方法は、 原生動物と細菌から成る、原生動物由来の共生体を供給する工程、 細菌を単離する工程及び 細菌に廃棄物を接触させて廃棄物を化学的に変性させ本発明の他の観点によれば 、非極性炭化水素を分散する方法は、 原生動物と細菌から成る、原生動物由来の共生体を供給する工程、 細菌を単離する工程及び 細菌に非極性炭化水素を接触させて非極性炭化水素を本発明の他の観点によれば 、非極性炭化水素を分散する方法は、 原生動物と細菌から成る、原生動物由来の共生体を供給する工程、 細菌を単離する工程、 細菌から分散剤を誘導する工程及び 分散剤に非極性炭化水素を接触させて非極性炭化水素を分散させる工程 を含む。

本発明の他の観点によれば、有用な細菌を単離する方法は、 原生動物と細菌から成る原生動物由来の共生体を単離する工程及び 細菌を単離する工程 を含む。

本発明の、他の観点によれば、分散剤を調製する方法は、 原生動物及び細菌から成る、原生動物由来の共生体を単離する工程、 細菌を単離する工程及び 細菌から分散剤を誘導する工程 を含む。

好ましい態様の詳細な記載 自由生活をしているアメーバの集団をまず単離し、次に対象となる細菌をアメー バ集団から単離した。最初は原生動物の為の選別の工程であったものが、有毒或 いは危険な廃棄物を変性或いは分解することのできる微生物の培養物の単離とい う結果に終った。培養物のあるものは分散剤を生成した。

アメーバ／細菌共生体は以下のように見い出され、単離された。サンプルとなっ た水は、テネシー州オークリッジ付近の廃棄物処理用地をモニターする為に使わ れた、数ケ所の井戸から得た。検査した場所は、以前トリクロロエチレン（ＴＣ Ｅ）を含む種々の有機物の放下に使われていた。検査した井戸の番号、深さ及び ＴＣＥのおよその濃度は以下の通りであった：井戸１４．１３フイート、２．１ ００ｐ　ｐ　ｂ　、井戸　２７．３０フイート、１３．０ＯＯｐ　ｐ　ｂ　；井 戸４６　、２０フイート、２３０ｐｐｂ０サンプルとなる水は窒素置換式採集装 置［ミシガン州、アナ−バー、ウェル・ウィザード（Ｗｅｌｌ　Ｗｉｚａｒｄ　 ）　３０１３；Ｑ、Ｅ、Ｄ、　Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ　Ｓｙｓｔｅｍｓ、 　Ｉｎｃ、　］により無菌的に採集した。サンプルは数回のポンプ駆動を通して 井戸の水路を浄化した後に採集した。サンプルとなる水はｓ　１．２ｍ硝酸／酢 酸セルロースフィルター［マサチュセッツ州、ベッドフォード（Ｉｉｉｌｌｉｐ ｏｒｅ　Ｃｏｒｐ、ｓ）コを通し、フィルターを反対にして無機塩類（ＮＡＴＥ ）寒天上に置いた。フィルターパッドを加える前に、プレート上に生きている大 腸菌の薄層を広げた。テストプレートは、空気中室温（２３−２５℃）で７−１ ４日培養した。アメーバ状の外植（ｏｕｔｇｒｏｕｔｈ　）がペトリ皿の周縁部 に移動したら、プレートを１０％メタンを含む空気を流したデシケータ−ジャー に移す。識別番号１４．２７及び４６が与えられた、結果として生じた微生物共 生体は、アメーノくの外植に沿い、メタンを含む空気中で２週間後に現れた。

共生体を３〜４週間ごとに、メタンを含む空気中でインキュベートしたＮＡＴＥ 寒天培地プレートに、無菌的に移した。共生体からの従属栄養細菌を単離し、ｔ ｒｙｐｔｉｃａｓｅ　ｓｏｙ　ａｇａｒ　（Ｔ　Ｓ　Ａ）上で室温で保持した。

検査した３つの井戸の水はすべて、食料源である大腸菌を広げたＮＡＴＥプレー トルー、自由生活アメーバを産生じた。アメーバの移動した場所に沿って、メタ ンを含む空気中で細菌の増殖が起き、このことはアメーノくがメタン資化性菌を 、かくまっていたことを意味している。アメーバを移動させる大腸菌が含まれな い対照プレートでは、フィルターから離れたメタン資化性菌の増殖は維持されな かった。アメーバ集団を、大腸菌を含まない新しいＮＡＴＥプレートに移すと、 メタンを含む空気中で細菌の成長が引き続いて起きた。明らかにこれらの共生体 は、メタンを含む空気中でＮＡＴＥ上での継代培養により無限に維持することが できる。

共生体の個々の構成要素を単離し、特徴を調べた。従属栄養細菌及びメタン資化 性菌とアメーバとが共生体の中に絶えず共存していた。アメーバの栄養体及びシ ストの顕微鏡検査はそれらがハルツマンネラ（Ｂａｒｔｍａｎｎｅ　ｌ　ｌａ） であることを示した。メタン大気中で増殖したこれらの共生体の中に、従属栄養 細菌が存在していることは、Ｎ　Ａ　’Ｔ　ＥからＴＳＡへ一部を移すことで明 らかになった。顕微鏡的及び酵素学的分析は、結果として生じた従属栄養細菌が 表１．２．３に見られるように、シュードモナス属、アルカリ土類金属 （Ａｌｉｃａｌｉｇｅｎｅｓ）　、桿菌属、モラクセラ属、キトファガ属、バラ コツカス属及びヒフオミクロビウム属を含む（これだけに限らない）属の混ざっ たものであることを示した。

共生体の懸濁液を０．８μｍのフィルターに通し、ろ液をＴＳＡ上で３回線代培 養し、結果として生じた従属栄養細菌をＮＡＴＥ上に播き直すと、メタンを含む 空気中ではもはや増殖できなかった。逆にメタン大気中でのＮＡＴＥプレートか らのアメーバ集団を、生きている大腸菌の薄層をのばした、非栄養寒天（ＮＮＡ Ｅ）上で空気中で３回線代培養し、新しく生まれた周辺部のアメーバ集団をメタ ン中のＮＡＴＥに播き直すと、おそらくメタン資化性菌と思われる細菌の増殖が 時々再現された。

さらに、ＮＮＡＥプレートで増殖したアメーバ集団をシスト形成が起きるように 、数週間貯蔵したところ、アメーバのシストを、メタン雰囲気中のＮＡＴＥ培地 に移した時のコロニーの成長から明らかなように、生きたメタン資化性菌及び従 属栄養細菌はまだ残っていた。メタン及び空気中でＮＡＴＥ上に維持されていた 共生体を０．８−μｍフィルターに通し、ろ液をメタン中のＮＡＴＥ上に播き直 したところ、検出できるアメーバのいないメタン資化性菌及び従属栄養細菌のコ ロニーが時々得られた。

従って、本発明者らメタン資化性菌とアメーバから従属栄養細菌を取り除き、か つメタン資化性菌及び従属栄養細菌からアメーバを取り除くことができた。しか し、まだ従属栄養細菌からの、メタン資化性菌の分離には成功していない。

表　１ 共生体１４からの細菌の特性 表　２ 共生体２７よりの細菌の特性 表　３ 共生体及びメタン資化性菌／従属栄養細菌混合物の電子顕微鏡による検査では、 前述の場所から以前単離されたことのある■型メタン資化性菌であるという証拠 は何も示されなかった。その代わり、メタン資化性菌／従属栄養細菌混合物の検 査は、典型的なグラム陰性の形態を有するいくつかの細菌と、ヒフォミクロビウ ム属の形態学的性質を有する多くの細胞を示した。的の中心点を思わせる核小体 を有する、典型的な自由生活アメーバが明らかとなった。細菌は概して、栄養体 及びシストの両時期に於いて、アメーバの細胞質中に見られた。どちらの条件下 でも、細菌は膜に結合した液胞の中に存在していた。

メタン／空気雰囲気中に於いて、最小塩類培地上にアメーバと従属栄養生物の両 者が継続して存在していることに示されるように、このような安定したアメーバ ／細菌の結合は、おそらく共生らしい。一般に、従属栄養生物もアメーバも単独 では、これらの条件下では生き残ることはできないと信じられている。事実、共 生体から単離された従属栄養生物もアメーバもそれらの条件下ではもはや増殖し なかった。メタン大気中におけるＮＡＴＥ上でのアメーバ／細菌共同体の安定性 の最も有力な説明は、メタン資化性菌の増殖がアメーバ及び従属栄養生物の存続 を可能にしているということである。

共生体及びメタン資化性菌／従属栄養細菌混合体の電子顕微鏡検査も培養上の知 見及び難点のいくつかを説明する手助けとなった。観察されたアメーバ内の細菌 の存在に照らし合わせると、なぜ、アメーバの培養物の最初の分離が、その後の アメーバの、空気環境中のメタンへの移し替えに於いて細菌の隔離集団（ｉｓｏ ｌａｔｅａ）をもたらしたかがわかる。それは又、メタン資化性菌と従属栄養細 菌からアメーバを除こうとする際の、困難さをも説明している。同様に、困難で まだ実現されていないメタン資化性菌と従属栄養細菌の単離は、細菌成分のほと んどを作っていると考えられるヒフォミクロビウム属の豊富さによって説明され よう。この属の微生物は、他の微生物を結合する傾向があることが示されており 、それらの純粋培養での単離はほとんど達成されていない。ヒフォミクロビウム 属は、ここに使われたような単一の炭素源及び無機塩類の存在下で増殖できる。

それらはメタン資化性菌と結合して見つかり、メタノールの有毒な蓄積を防ぐ為 、メタン資化性菌によって産生されるメタノールを分解しているらしい。ヒフォ ミクロビウムがＴＣＥを分解するかどうかについては、我々は密度勾配法及び他 の技術を試しているが、まだそれらを単離していない為、現在は調べることがで きない。

栄養体もしくはシストの形のアメーバは、結合しているメタン資化性菌及び従属 栄養細菌の代謝活性にとってより安定した生活場所を提供するであろう。例えば 、自由生活をしているアメーバは、結合している細菌を塩素の殺菌効果から守る 能力のあることが報告されている。

従って、包嚢されたアメーバとその後のシストのないアメーバからのメタン資化 性菌の単離は適切であると考えられる。１型メタン資化性菌は、ここに述べたア メーバ／′細菌共同体からは、電子顕微鏡によっても培養によっても同定されな かった。しかしながらＴＣＥの分解が、従属栄養細菌或いはアメーバ集団自身に よるのではなく、共同体全体によるということは、メタン資化性菌が共同体の中 のＴＣＥを分解する成分であることを示唆している。同じ場所から単離したＩ型 メタン資化性菌によるＴＣＥの分解と異なり、ここに記した共生体によるＴＣＥ の分解の際には、＋４Ｃは、細胞及び可溶性分画とは対照的に、Ｃｏ２中に、よ り多く見出された。

実施例■ メタン雰囲気中での、共生体のＴＣＥ分解能を調べた。テフロンの隔壁を取り付 けた２５０ｍＬのびんの中の、１００ｍＬの液体ＮＡＴＥ培地において微生物を インキュベートシた。検査用のびんには、１２ｍＬのろ過した無菌状のメタン（ ０，５３６ミリモル）を、びん頭部の容積１５０ｍＬの空間に注入した。ＧＣで 純度９５％の［１，２−”Ｃ１）リクロロエチレン（３，０ミリキユ一リー／ミ リモル［１１１ミリベクレル（ＭＢｑ）／ミリモルコ、ミズーリー州、セントル イス、Ｐａｔｈｆｉｎｄｅｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ　）を加えた。びんを 逆さにし、振とう台にのせ、２２−２４℃で１２−１４日培養した。ＴＣＥの含 有量を定期的に分析した。オートクレーブ処理した培養をネガティブな対照とし た。他の対照としては、メタンを含まない空気中で培養物をインキュベートする ことと、共生体の代わりに大腸菌を検査することが含まれる。トンキュベーショ ン後、細胞成分、ＣＯ２、及び培養液中の１４ｃｍＴＣＥ含有度を、通常のシン チレーション法で測定した。ＴＣＥは、表４に示したように、メタンを含む空気 中で共生体にさらされた１４Ｃ−標識ＴＣＥの最終結果で示されるように、種々 の共生体によって分解された。

表　４ 微生物共生体によるｌ（：　−トリクロロエチレンｂ、木腸菌またはオートクレ ーブ処理した対照（共生体の値の約１０％）を差し引いた後の測定値。共生体に より分解される１４Ｃ−ＴＣＥのパーセントは２５℃、１２日間のインキュベー ションで３０−４０％の範囲。

実施例ＩＩ 共生体からのアメーバ及び従属栄養細菌のＴＣＥ分解能を調べたところ、分解能 を持たないことがわかった。

共生体から単離したメタン資化性菌及び従属栄養細菌の混合物は、ＴＣＥを分解 した。従属栄養細菌もアメーバ集団も、メタン資化性菌と一緒でなければＴＣＥ を分解しなかった。トリクロロエチレンは空気中では、明らかに共生体又はメタ ン資化性菌によって分解されなかった。オートクレーブ処理した共生体も、大腸 菌も感知される量の１４ｃｍＴＣＥを分解しなかった。結果を表５に示した。

表　５ 微生物共生体の構成成分による＋４Ｃ）リクロロエチレン（Ｔ　ＣＥ）の分解 分画１あたりの１４ｃのカウント ａ、実験系へ加えた平均全カウントは１２．８７５であった。

メタンを含まない空気中でＴＣＥと共にインキュベートした共生体、アメーバ、 メタン資化性菌及び従属栄養細菌は、対照である大腸菌と同じカウントを示した 。

５１元の共生体は０．８μｍのフィルターを通してろ過し、空気雰囲気中のメタ ンにおいて無機塩類培地で３回継代した。結果として増殖した微生物についてア メーバ及び従属栄養細菌の検査をしたところ、アメーバは検出されず、従属栄養 細菌が残っていた。

Ｃ，アメーバは大腸菌の薄層で覆った非栄養寒天上で３回継代した。メタン雰囲 気中で、無機塩類上に播き直したところ、細菌の増殖は見られなかった。

ｄ、従属栄養細菌はＴＳＡ上で３回継代しており、アメ、＜及びメタン資化性菌 を含んでいなかった。

細菌／アメーバ共生体のうち２つ（２７，４６）によってＴＣＥの分解に成功し たので、これらの共生体について、２，４．６−ドリニトロトルエン（Ｔ　Ｎ　 Ｔ）を変性或いは分解する能力を調べた。

実施例ＩＩＩ 無菌のＮＡＴＥ溶液を同量のＴＮＴ飽和溶液（１００ｍｇ／Ｌ　）と混合し、全 量を　１００ｍ１とし、１０】２の共生体を接種した。これは２５０ｍ１の、テ フロンでシールしたびんで行ない、１５ｍ１のメタンをテフロンの隔壁を通して びん頭部の空間に加えた。これらのびんを以下の条件下で検査した　４６共生体 ＋メタン、４６共生体−メタン、２７共生体＋メタン、２７共生体−メタン、Ｔ ＮＴ溶液溶液ダメタン菌なし）及びＴＮＴ溶液（メタンなし、細菌なし）。

共生体４６がメタンの存在下で、培養液を黄色に変化させた以外には、他のびん には何らの視覚上の変化はなかった。色の変化は、（り返し実験に於いて、およ そ１２日回軸迅速に（−晩で）起きた。３週間のインキュベーションの後、それ ぞれのびんからの培養液を、高圧液体クロマトグラフィー（ＨＰ　Ｌ　Ｃ）で分 析した。メタンの存在下の共生体４６はＴＮＴレベルの減少を示した。

実施例ＩＶ ＋４０−標識ＴＮＴを使った実施例ＩＶと同様の実験に於いて、”Ｃ−ＴＮＴは 細胞ペレットに結合しており、アセトニトリルでは（他のびんと異なり）抽出さ れなかった。このことはＴＮＴが細胞に固く結合しているか、もしくは、ＴＮＴ 及びその代謝産物がアセトニトリルで容易に抽出されるという理由から、ＴＮＴ が非極性化したことを示唆している。表６は実際に「変化した」ＴＮＴが、細胞 ペレットと結合しており、二酸化炭素に分解されていないし、上清にも残ってい ないことを示している。

共生体４６からの生物、キトファガ属の種は寒天を分解する（すなわちＣ−Ｃ結 合を切断する）ことか観察され、それにより、単離した細胞についての、Ｃ−Ｃ 結合を基盤とする炭化水素、特にクレオソート、油、ワックス及びグリースのよ うな非極性物質を変性、分解もしくは分散させる能力を調べる実験が導かれた。

油、クレオソート、ワックス及びグリースは、共生体や付加的な生物、或いは他 の方法もしくは自然の工程による分解を容易にするため、微小滴に分散される。

実施例Ｖ 共生体４６中に各々の生物の希釈した懸濁液を、０．１ｇのクレオソートを含む １００ｍ１の塩類溶液及び０，１ｇの原油を含む］、００ｍ１の塩類溶液の各々 に加えた。５つの生物にクレオソート及び原油をただちに微小滴に分散させる能 力が見出された。５つの生物は２つの異なる作用形態の活性を表わしていること がわかった。２つの細菌の隔離集団Ｔ及び９は、細胞が存在する場所にのみ、こ の能力を持つことがわかった。他の３つの生物、隔離集団１３．１５及び】Ｓは 、分散効果を生み出す分散剤を産生ずることがわかった。すべての場合に於いて 、分散剤はオートクレーブ処理そしてその結果として無菌になった後の方がより 効果的であった。各々の分散剤は表面張力計での検査によって示されたように、 液−液間の表面張力を非常に減少させた。ワックス及びグリースの試料も又分散 された。隔離集団１３は、ワックスの分散に特に効果的であることがわかった。

実施例ＶＩ 実施例Ｖに記した細菌の隔離集団について、クレオソートで汚染された木材で検 査したところ、木材からのクレオソートの明らかな脱着という結果を得た。

細菌または菌類の到達できないくぼみを作ることによって汚染物質の分解を妨げ ると仮定される、粒の細かい砂は除去され得る。

実施例ＶＩＩ 実施例Ｖで述べた細菌の隔離集団について、クレオソートで汚染された土壌で検 査した。分散剤は、粒の細かい、或いは極めて細かい粒子状の物質を実際に除去 することにより、土壌の物理学的性質を変えた。

ニコチンのような種々の有機化合物を用いた追加的な検査で、分散剤が予想以上 に短時間内に最高の抽出を可能にすることが示されたか、それは分散剤の、非極 生有機化合物を細かく乳化する能力によるものである。

カラムクロマトグラフィー及び濃縮という手段による予備的な分析では、産生さ れる分散剤は各細菌ごとに少しずつ異なることが示された（異なる分子量及び有 効性）。各分散剤は、分子構造の少なくとも一部に結合した、負の電荷を持って いると考えられる。分散剤は、部分的に変性したタンパク質であり、リパーゼに よりその有効性が有意に減少し得ることから、おそらく一部に脂質があると考え られる。これらは、その存在の知られた初めての、細菌により産生される微小乳 化剤であると思われる。

５つの生物のうちの３つについて、増殖の最適条件を調べたところ、これらの生 物は標準的な微生物学的培地で、わずかに温度及びｐＨを変えるだけで迅速に増 殖させることができた。

多くの型の細菌も、これらの産物を栄養基盤として使用できることがわかり、そ のことはまた、Ｃ−Ｃを基盤とする化合物を分散させるだけでなく、同時に、分 解を容易にする固有の群を増やすという付加的な利益をもつ。

さらに、油、クレオソート、ワックス及びグリースを分散することのできる共生 体から単離した生物はすべて、増殖培地に加えた鉄を沈澱させる能力も有してい た。

油、クレオソート、ワックス及びグリースを分散することのできる細菌は以下の ように特徴づけられる：隔離集団（ｉｓｏｌａｔｅ　）　１５・シュードモナダ セアエ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｄａｃｅａｅ）科、シュードモナス属、おそらく シュードアルカリジェネス（Ｐｓｅｕｄｏａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ　）種ニゲラ ム陰性桿菌、０．５−１．５μｍ０オキシダーゼ陰性、カタラーゼ陽性、運動性 あり、胞子形成なし、Ｔ　Ｓ　Ｉ　（Ｋ／−）　。Ｔｒｙｐｔｉｃ　Ｓｏｙ　Ａ ｇａｒ培地てのコロニーの形態−半透明、波状、拡散した縁、ムコイド、青白− 黄緑色。ミュエラー・ヒントン（Ｍｕｅｌｌｅｒ−Ｈｉｎｔｏｎ）寒天上でぶど う様の香りのある緑色の拡散性の色素を産生ず、る。ＢＣＹＥ培地でのコロニー は、不規則な縁をもち、ムコイド、黄白色である。好気性であるが、メタン雰囲 気中で、メタンを唯一の炭素源として弱く増殖する。増殖及び代謝には、次のよ うな炭素源を利用することができる：ツイーン４０、ツイーン８０、Ｎ−アセチ ル−Ｄ−グルコサミン、Ｌ−アラビノース、Ｄ−アラビトール、Ｄ−フルクトー ス、Ｄ−ガラクトース、Ｄ−マンニトール、Ｄ−マンノース、Ｄ−トレハロース 、メチルピルビン酸、モノメチルコハク酸、酢　酸、ギ酸、クエン酸、乳酸、吉 草酸、プロピオン酸、コハク酸、グリセロール、セリン、オルニチン、ロイシン 、ヒスチジン及びアラニン。０ＮＰＧ。

ＶＰ１硝酸塩還元及びゼラチンは陰性。アルギニンジヒドロラーゼ、リジンデカ ルボキシラーゼ、ウレアーゼ、トリプトファンデアミナーゼ及びオルニチンデカ ルボキシラーゼを有さない。硫化水素は産生されない。増殖の最適温度及び最適 ｐＨは、それぞれ２０℃及び７．０である。

隔離集団１３：科（不確実）、アルカリジェネス（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ　） 属、種（不明）ニゲラム陰性桿菌、０、５−１．５μｍ０オキシダーゼ陽性、カ タラーゼ陽性、運動性あり、胞子形成なし、Ｔ　Ｓ　Ｉ　（Ｋ／−）　。Ｔｒｙ ｐｔｉｃＳｏｙ　Ａｇａｒ培地でのコロニーの形態；不透明、金縁（ｅｎｔｉｒ ｅ）　、乾燥、オフホワイトでかヴ臭い。ミュエラーーヒントン寒天上での増殖 では、半透明な、金縁の薄い黄色の小さなコロニーが散在する。ＢＣＹＥ培地で のコロニーは小さく、金縁、薄い黄色でかび臭い。好気性であり、メタン雰囲気 中てのメタンを唯一の炭素源とする増殖はできない。増殖及び代謝には、次のよ うな炭素源を利用することができる：ツイーン４０、ツイーン８０、Ｌ−アラビ ノース、プシコース、Ｄ−フルクトース、メチルピルビン酸、モノメチルコハク 酸、酢酸、グルコン酸、ギ酸、クエン酸、乳酸、吉草酸、プロピオン酸、コハク 酸、グリセロール、セリン、ロイシン、ヒスチジン及びアラニン。○ＮＰＧ、Ｖ Ｐ、硝酸塩還元及びゼラチンは陰性。アルギニンジヒドロラーゼ、リジンデカル ボキシラーゼ、ウレアーゼ、トリプトファンデアミナーゼ及びオルニチンデカル ボキシラーゼを有さない。硫化水素は産生されない。クエン酸塩陽性。増殖の最 適温度及びｐＨは、それぞれ２５℃及び７．５である。

隔離集団１ｓ、シュートモナダセアエ （Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｄａｃｅａｅ）科、シュードモナス属、種（不明）、グ ラム陰性桿菌、０．５−１．５μｍ０オキシダーゼ陽性、カタラーゼ陽性、運動 性あり、胞子形成なし、ＴＳ　Ｉ　（Ｋ／−）　、　Ｔｒｙｐｔｉｃ　Ｓｏｙ　 ＡｇａｒＳＢＣＹＥ及びミュエラーーヒントンでのコロニーの形態−半透明、金 縁、ムコイド、青白−黄色でほのかなブドウ様の香りがある。

好気性であるが、メタン大気中で、メタンを唯一の炭素源として弱く増殖する。

増殖及び代謝には、次のような炭素源を利用することができる：ツイーン４０、 ツイーン８０、Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミン、Ｌ−アラビノース、メチルピ ルビン酸、モノメチルコハク酸、酢酸、クエン酸、イタコン酸、グルタル酸、乳 酸、プロピオン酸、セバシン酸、アスパラギン酸、コハク酸、Ｌ−プロリン、Ｌ −フェニルアラニン及びフェニルエチルアミン。

０ＮＰＧＸＶＰ、硝酸塩還元及びゼラチンは陰性。アルギニンジヒドロラーゼ、 リジンデカルボキシラーゼ、ウレアーゼ、トリプトファンデアミナーゼ及びオル ニチンデカルボキシラーゼを有さない。硫化水素は産生されない。増殖の最適温 度及び最適ｐＨは、それぞれ２５℃及び明）ニゲラム陰性球桿菌、０．５−１． ０μｍ０オキシダーゼ陰性、カタラーゼ陽性、運動性なし、胞子形成なし、Ｔ　 Ｓ　Ｉ　（Ｋ／−）　。Ｔｒｙｐｔｉｃ　Ｓｏｙ　Ａｇａｒ培地でのコロニーの 形態−不透明、金縁、乾燥、白色。好気性であるが、メタン大気中で、メタンを 唯一の炭素源として弱く増殖する。０ＮＰＧ、ＶＰ、硝酸塩還元及びゼラチンは 陰性。アルギニンジヒドロラーゼ、リジンデカルボキシラーゼ、ウレアーゼ、ト リプトファンデアミナーゼ及びオルニチンデカルボキシラーゼを有さない。硫化 水素は産生されない。増殖の最適温度及びｐＨは、それぞれ２５℃及び７．０で ある。

隔離集団９：シュードモナダセアエ （Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｄａｃｅａｅ）科、シュードモナス属、種（不明）、グ ラム陰性桿菌、０．５−１．５μｍ０オキシダーゼ陰性、カタラーゼ陽性、運動 性あり、胞子形成なし、Ｔ　Ｓ　１　（Ｋ／−）　、　Ｔｒｙｐｔｉｃ　Ｓｏｙ 　Ａｇａｒ培地でのコロニーの形態−不透明、金縁、黄色。好気性−であるが、 メタン雰囲気中で、メタンを唯一の炭素源として弱く増殖する。

○ＮＰＧ、ＶＰ、硝酸塩還元及びゼラチンは陰性。アルギニンジヒドロラーゼ、 リジンデカルボキシラーゼ、ウレアーゼ、トリプトファンデアミナーゼ及びオル ニチンデカルボキシラーゼを有さない。硫化水素は産生されない。増殖の最適温 度及びｐＨは、それぞれ２５℃及び７．０である。

共生体由来の細菌の隔離集団のいくつかは、抗生物質（抗微生物及びもしくは抗 菌）活性を示した。

実施例ＶＩＩＩ 隔離集団が、液体培地中での菌類の増殖を阻害するかどうかを、標準的なダブル ブラインドプロトコールにより調べた。このプロトコールでは、共生体由来の個 々の細菌と、種々の未同定の検査用菌類とを一緒にミクロタイタープレートのウ ェルの希釈された培地中に播いた。

ミクロタイタープレートを１週間インキュベートし、細菌、菌類又は両者の存在 を顕微鏡で調べた。対照であるウェルでは、すべての生物の生存度が確証された 。菌類はアメーバに由来したものではなく、一般的な自然環境からのものである 。それ故細菌による菌類の阻害は、本発明の重要な利点であることが強調される 。もし細菌が存在し、菌類が増殖しないのであれば、細菌が抗菌物質を持ってい ると解釈される。もし菌類が存在し、細菌が増殖しないのであれば、菌類が抗細 菌物質を持っていると解釈される。細菌は、最初アメーバに結合していた為、細 菌の抗生物質としての作用には、アメーバの関与を除外できない。結果を表７に 示した。

表　７ 共生体４６及び２７からの細菌の隔離集団＃　菌類が細菌を阻害 −細菌にも菌類にも影響がない これらの共生体の、種々の化合物を分解、分散或いは変性させる能力により、こ れらの原生動物由来の共生体は生物による浄化の試みにとって有用である。これ らの共生体の病原性の検査では何らの病原体は検出されずその有用性が高まった 。

生物による浄化は一般に、従来の方法を用いて行なわれている。それらは、バイ オリアクターの使用と、その土地に固有の生物に汚染物を除去させるための肥沃 化及び堆肥化を含む。本発明である共生体はこれらの方法のすべて或いは一部に 於いて使うことができる。

バイオリアクターは典型的には操作現場（ｏｎ−ｓｉｔｅ　）の上に置かれ、汚 染物質を汚染場所からバイオリアクターまで処理の為に動かす必要がある。バイ オリアクター自体は種々の形や大きさが可能であるが、典型的には円筒形であり 、細菌が結合できる不活性な物質で満たされている。リアクターに汚染物質が加 えられると、不活性な物質によって作り出される広い表面積が、汚染物質の分解 のための汚染物質と細菌との最大の接触を可能にする。我々の共生体はこのタイ プの浄化に全く適しており、不活性物質に直接添加させることができる。効果的 な濃度は１リットル分のバイオリアクターの表面積当たり１×１０１０からＩ× １０１２個体の範囲である。

肥沃化は、典型的には、汚染物質をより害の少ない濃度に分解したり、無害な形 に変性させることができるその土地固有の生物を刺激する為に、汚染された土壌 や他の汚染された物質への化合物（窒素、リン酸塩）の添加を必然的に伴う。こ れは、通常汚染場所の広い範囲にわたって行なわれ、地中に染み込むようにその 地域の上に噴霧される。この方法すなわち分解する細菌を添加しない方法は、典 型的には長い期間を必要とし、全体としては効果的でない。本発明の共生体を添 加すれば、その進行は増進される。なぜなら、肥沃化はその土地に固有の生物と 同様に本発明の共生体の構成成分をも刺激するからである。又、共生体により生 産される分散剤は、いくつかの汚染物質の脱着を助け、微細な土を除去すること により、その土地に固有の微生物及び加えた微生物の分解能力を増大させる。我 々の共生体は、それ自体が、この形の生物学的浄化にいつでも使用できるように しておくことができ、もし濃度が高すぎなければ、肥料に直接加えることができ る。効果的な濃度は、噴霧液１リツトル当たり、１×１０１０から１×１０１２ 個体の範囲である。

米国陸軍の施設に於ける、爆発性物質の長年にわたる製造及び処理により、１． ０００．０００立法ヤ一ド以上の土壌及び沈澱物がＴＮＴ及び他の爆発物で汚染 されてきた。

唯一可能な浄化の選択方法は焼却のみであり、非常に費用がかかる。焼却は除外 され、代わりの浄化技術として現在は、堆肥化が試されている。これは、土地固 有の微生物（汚染された土壌に由来）が、爆発物を鉱物化するのに好ましい環境 を作るために、汚染された土壌に堆肥、おがくず、干し草、肥料及び他の地質改 良物を混ぜることによって行なわれる。このような処置に本発明の共生体を加え れば、これらの化合物の分解を補い、速度を上げることも可能である。土地に固 有の微生物が、使用できる程に増えるより前に、ＴＮＴの変性が起こり得る。さ らに、共生体４６によるＴＮＴの変性は、ＴＮＴよりも他の生物に分解されやす い代謝産物を産生ずる。先に論したように、汚染物質の脱着及び微細な砂粒の除 去は反応を増大させることができる。効果的な濃度は、堆肥１キログラム当りｌ Ｘ１０１°からｌＸ１０’２の範囲である。

微生物の保護 特許手続きを目的とする、微生物の寄託の国際的な承認に基づくブダペスト条約 の規定により、出願人は共生体４６及び２７の試料をアメリカン・タイプψカル チャー・コレクション［Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ｔｙｐｅ　Ｃｕ１ｔｕｒｅＣｏｌｌ ｅｃｔｉｏｎ　（Ａ　Ｔ　ＣＣ）　］　［米国、メリーランド州２０８５２、ロ ックビル（Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ　）　、１２３０１バークローン・ドライブ（Ｐ ａｒｋｌａｖｎ　Ｄｒｉｖｅ）　］に寄託した。共生体４６は、１９９０年１０ 月１１日にＡＴＣＣに寄託サレ、ＡＴＣＣ受託番号４０９０ｇに指定された。共 生体２７は１９９０年１１月８日ｉ、ｌ：ＡＴＣＣ１，：寄託され、ＡＴＣＣ受 託番号５５１２０に指定された。

何が現時点での提出された具体化なのかを示し、述べて来たが、そこでは、添付 の特許請求の範囲に規定されている本発明の範囲から逸脱せずに、種々の変化及 び変形が可能であることが、当業者には明らかであろう。

手続補正書 平成　５年　６月３０日

Claims (56)

【特許請求の範囲】
1. １．原生動物と細菌からなる、原生動物由来の共生体から成る、微生物共生体。
2. ２．前記原生動物がアメーバから成る、請求項１に記載の微生物共生体。
3. ３．共生体が、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション受託番号（Ｄｅ ｐｏｓｉｔ　Ｎｕｍｂｅｒｓ５）５１２０及び４０９０８と本質的に同一である 、請求項２に記載の微生物共生体。
4. ４．前記共生体が生物学的廃棄物を化学的に変性させることのできる、請求項１ に記載の微生物共生体。
5. ５．前記共生体が、化学的廃棄物を化学的に変性させることのできる、請求項１ に記載の微生物共生体。
6. ６．前記共生体がトリクロロエチレンを化学的に変性させることのできる、請求 項１に記載の徴生物共生体。
7. ７．前記共生体がトリニトロトルエンを化学的に変性させることのできる、請求 項１に記載の徴生物共生体。
8. ８．前記共生体が炭化水素を分散することのできる、請求項１に記載の微生物共 生体。
9. ９．前記炭化水素が、油、クレオソート、ワックス、グリース又はそれらの混合 物から成る、請求項８に記載の微生物共生体。
10. １０．前記共生体が、炭化水素を分散することのできる分散剤を産生する、請求 項１に記載の微生物共生体。
11. １１．前記炭化水素が、油、クレオソート、ワックス、グリース又はそれらの混 合物から成る、請求項１０に記載の微生物共生体。
12. １２．前記共生体が抗生物質活性を示す、請求項１に記載の徴生物共生体。
13. １３．炭化水素を分散することができる、原生動物由来の徴生物共生体から由来 する物質から成る分散剤。
14. １４．前記原生動物がアメーバから成る、請求項１３に記載の分散剤。
15. １５．前記共生体が、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション受託番号 ５５１２０及び４０９０８と本質的に同一である、請求項１４に記載の分散剤。
16. １６．前記炭化水素が、油、クレオソート、ワックス、グリース又はそれらの混 合物から成る、請求項１４に記載の分散剤。
17. １７．原生動物由来の徴生物共生体から単離した細菌から成る徴生物。
18. １８．原生動物がアメーバから成る、請求項１７に記載の微生物。
19. １９．前記共生体が、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション受託番号 ５５１２０及び４０９０８と本質的に同一である、請求項１８に記載の徴生物。
20. ２０．前記細菌が、生物学的廃棄物を化学的に変性させることのできる、請求項 １７に記載の徴生物。
21. ２１．前記細菌が、化学的廃棄物を化学的に変性させることのできる、請求項１ ７に記載の徴生物。
22. ２２．前記細菌が、トリクロロエチレンを化学的に変性させることのできる、請 求項１７に記載の微生物。
23. ２３．前記細菌が、トリニトロトルエンを化学的に変性させることのできる、請 求項１７に記載の徴生物。
24. ２４．前記細菌が、炭化水素を分散することのできる、請求項１７に記載の微生 物。
25. ２５．前記炭化水素が、油、クレオソート、ワックス、グリース又はそれらの混 合物から成る、請求項２４に記載の徴生物。
26. ２６．前記徴生物が、炭化水素を分散することのできる分散剤を産生する、請求 項１７に記載の微生物。
27. ２７．前記炭化水素が、油、クレオソート、ワックス、グリース又はそれらの混 合物である、請求項２６に記載の徴生物。
28. ２８．前記細菌が抗生物質活性を示す、請求項１７に記載の微生物。
29. ２９．炭化水素を分散することができる、原生動物由来の細菌から由来する物質 から成る分散剤。
30. ３０．前記原生動物がアメーバから成る、請求項２９に記載の分散剤。
31. ３１．前記共生体が、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション受託番号 ５５１２０及び４０９０８と本質的に同一である、請求項３０に記載の分散剤。
32. ３２．前記炭化水素が、油、クレオソート、ワックス、グリース又はそれらの混 合物から成る、請求項２９に記載の分散剤。
33. ３３．原生動物と細菌から成る、原生動物由来の共生体を供給する工程及び 前記共生体に廃棄物を接触させて廃棄物を化学的に変化させる工程 を含む、廃棄物を化学的に変性させる方法。
34. ３４．前記原生動物が、アメーバから成る、請求項３３に記載の方法。
35. ３５．前記共生体が、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション受託番号 ５５１２０及び４０９０８と本質的に同一である、請求項３４に記載の方法。
36. ３６．前記廃棄物がトリクロロエチレンである、請求項３３に記載の方法。
37. ３７．前記廃棄物がトリニトロトルエンである、請求項３３に記載の方法。
38. ３８．原生動物と細菌から成る原生動物由来の共生体を供給する工程及び 前記共生体に炭化水素を接触させて前記炭化水素を分散させる工程 を含む、炭化水素を分散する方法。
39. ３９．前記原生動物がアメーバから成る、請求項３８に記載の方法。
40. ４０．前記原生動物が、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション受託番 号５５１２０及び４０９０８と本質的に同一である、請求項３９に記載の方法。
41. ４１．前記炭化水素が、油、クレオソート、ワックス、グリース又はそれらの混 合物から成る、請求項３８に記載の方法。
42. ４２．原生動物と細菌から成る、原生動物由来の共生体を供給する工程、 前記細菌を単離する工程及び 細菌に廃棄物を接触させて廃棄物を化学的に変性させる工程 を含む、廃棄物を化学的に変性させる方法。
43. ４３．前記原生動物がアメーバから成る、請求項４２に記載の方法。
44. ４４．前記共生体が、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション受託番号 ５５１２０及び４０９０８と本質的に同一である、請求項４３に記載の方法。
45. ４５．前記廃棄物がトリクロロエチレンから成る、請求項４２に記載の方法。
46. ４６．前記廃棄物がトリニトロトルエンから成る、請求項４２に記載の方法。
47. ４７．原生動物と細菌から成る原生動物由来の共生体を供給する工程 細菌を単離する工程及び 前記細菌に炭化水素を接触させて前記炭化水素を分散させる工程 を含む、炭化水素を分散する方法。
48. ４８．前記原生動物がアメーバから成る、請求項４７に記載の方法。
49. ４９．前記共生体が、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション受託番号 ５５１２０及び４０９０８と本質的に同一である、請求項４８に記載の方法。
50. ５０．前記炭化水素が、油、クレオソート、ワックス、グリース又はそれらの混 合物から成る、請求項４７に記載の方法。
51. ５１．原生動物と細菌から成る原生動物由来の共生体を供給する工程、 細菌を単離する工程、 前記細菌から分散剤を誘導する工程及び前記分散剤に炭化水素を接触前記炭化水 素を分散させる工程 を含む、炭化水素を分散する方法。
52. ５２．前記原生動物がアメーバから成る、請求項５１に記載の方法。
53. ５３．前記共生体が、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション受託番号 ５５１２０及び４０９０８と本質的に同一である、請求項５２に記載の方法。
54. ５４．前記炭化水素が、油、クレオソート、ワックス、グリース又はそれらの混 合物である、請求項５１に記載の方法。
55. ５５．原生動物と細菌から成る原生動物由来の共生体を単離する工程及び 前記細菌を単離する工程 を含む、細菌を単離する方法。
56. ５６．原生動物と細菌から成る原生動物由来の共生体を単離する工程、 前記細菌を単離する工程及び 前記細菌から分散剤を誘導する工程 を含む、分散剤を調製する方法。