JPH06502720A - 分析方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 分析方法 本発明は化学的、生化学的或いは生物学的なエンティティの分析方法、その分析 方法に使用する装置、またかかる装置の製造方法及び使用に関する。

現在、試料内の分析対象物の有無の検出及びその測定を行なう分析技術の開発が 大きな関心を集めており、利用可能な種々の方法が例えば、Ｂｉｏｓｅｎｓｏｒ ｓ；　Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌｓ　ａｎｄ　Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ＠（Ａ、 Ｐ、Ｆ　Ｔｕｒｎｅｒ、　１．　Ｋａｒｕｂｅ、　Ｇ、Ｓ、　Ｗｉｌｓｏｎ　［ 著作、　０ｘｆｏｒｄ　５ｃｉｅｎｔｉｆｉｃ　Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ、　１ ９８７）等で広範囲にわたり見直されている。しかし、現在の技術は、温度や試 薬の安定性、恒温保持時間、発達時間、そして観察される信号のレベルに影響を 与えるような他の条件や干渉要因に敏感に反応するものである。

従って、公知の分析技術の精度は、標準試料の分析を通常行なう較正工程により 制限される。例えば、抗体を用いる分析では、生じる免疫学的結合反応はしばし ば不可逆性のものである。従って、較正工程は何れも別個の装置を場合によって は複数用いて（好ましくは同じ製造場所からのもの）行なう必要があり必然的に エラーを招くことになる。

別個のゾーンに適切な試薬をそれぞれ配置し、較正工程を分析手順内で行なうよ うにした装置を分析に用いれば他の感知装置を必要とする較正工程を別個に行な う必要性を無（すことができる。分析手順内で別個の較正工程を行なう分析方法 を使用することには２つの目的がある。即ち、ｉ）分析手順内で種々の試薬がそ れらの仕様に従って機能していることを確認するためと、ｉｉ）試験中の試料内 の濃度を成るレベルに規定し、これにより背景の干渉性（例えば背景の蛍光状！ ！りや、温度及びｐＨの変化、観察する信号のレベルを変え得るような、試料マ トリクスから生じる他の要因を補償するため、である。

ＢＰ−Ａ−００９３６１３（ＳＹＶＡ）は測定領域及び較正領域を用いて試料に おける分析対象物の有無を判断する分析方法を開示している。この方法は両領域 で共通な種を使用して１、試料内の分析対象物の量に関する測定領域での信号、 及び分析対象物の１度から独立した較正領域での信号を提供するものである。そ の共通の種は測定領域で生じるものとは異なる結合反応により較正領域内で獲得 される。

従って、上記ＥＰ−＾−００９３６１３に開示される分析方法は分析手順内で別 個に較正を行なうものであり、上記目的ｉｉ）をある程度まで達成する。しかし 、このような較正の方法には多くの欠点がある。較正領域で異なる結合反応を使 用することは、２つの結合反応（即ち、測定領域及び較正領域におけるそれぞれ の反応）の動作が、例えばｐＨや温度に対する感応性、試薬の安定性、試薬の経 時変化といった種々の要因から同じにはならないことを意味している。較正領域 内での結合反応は試料マトリクスからも異なる影響を受けることになり、そのた め試料マトリクスに起因して測定領域での結合反応から発生する信号に与える変 化に何の補償もすることができない。また、測定領域で生じる結合反応について も何らチェックがなされない（上記目的ｉ）を参照）。更に、かかる分析用の装 置の製造は、異なる２組の試薬が必要なためより複雑になる。

本発明者はＥＰ−＾−００９３６１３の方法における上述の欠点を克服すると共 に、上記目的ｌ）及びｉｉ）を満足させる別の分析方法を開発した。

本発明の１つの形態においては、ｉ）採用する分析技術に適した不動化試薬（「 測定試薬」）を担持する面（「測定面」）と接触させて試料を、希望するのであ れば１つ或いは複数の補助試薬と共に恒温保持することにより、試料内に配位子 が存在する場合には、前記測定試薬及び配位子及び／或いは（存在すれば）前記 補助試薬との複合体の形成により試料内の（存在すれば）配位子の量の第１の関 数となる検出可能な信号を発生させ；ｉｉ）それと同時に或いはそれに引き続い て、採用する分析技術に適した試薬（「較正試薬」）であってゼロでない信号を 発生させるか或いは前記配位子及び／或いは補助試薬と共に複合体を形成するよ うな試薬が不動化された別の面（「較正面」）に、希望するのであれば一つ或い は複数の補助試薬と共に、試料を接触させることにより、前記測定面上での複合 体の形成（或いは形成されていなければ配位子の存在によって形成されることに なる）に関与するものと同じ構造の結合部位の相互作用の結果かかる複合体を形 成させ、かかる複合体の形成により試料内の（存在すれば）配位子の量の第２の 関数となるか或いはその量から独立したゼロでない信号を発生させ；ｉ）オプシ ョンとして同時に或いは引き続いて、試料内の（存在すれば）配位子の量の第３ の関数となるか或いはその量から独立した信号（ゼロ或いはゼロでない信号）を 発生させる試薬（「前記補助較正試薬」）が不動化された別の較正面（「補助較 正面」）に、希望するのであれば一つ或いは複数の補助試薬と共に、試料を接触 させ；ｉｖ）前記測定面１、前記較正面、及び存在する場合には前記補助較正面 から生じる信号を、採用する分析技術に適した方法で監視して、分析対象の配位 子が試料内に存在するか否か及び／或いはどの程度存在するかを適切なアルゴリ ズムを使用して判断する：各工程よりなる方法を提案する。

測定面で生じるものと類似した結合反応が較正面で生じる（配位子が試料中に存 在する場合）後述の実施例においては、上記目的ｉ）が達成される。即ち、信号 を発生させる複合体内の試料が劣化していないこと、或いは結合反応が充分に起 きていること、即ち、そのような反応における結合パートナが劣化していないこ とを確認できる。目的ｉｉ）もこれらの実施例で達成できる。

補助試料との結合反応を何ら伴わずに、較正面で較正試料がゼロでない所望の信 号を生じさせることになる後述の実施例においては、上記目的ｉｉ）が達成され る。

較正面による較正はオプションの較正面を使用れば補足される。かかる補助較正 面には、較正面で使用するものと同様の試料を利用しても良い。或いは補助較正 面には、ここで規定するゼロでない更に別の信号或いはゼロ信号の何れかを生じ させるような、測定面や較正面で発生するものとは異なる別の結合反応が補助較 正面で起きる試料を利用しても良い。

本発明の別の側面によれば、上述の分析方法による試料内の配位子の分析への使 用に適したバイオセンサ装置であって、上述の測定面及び較正面を有し、また一 つ或いは複数の上述の補助較正面をオプションで有するものが提供される。

上記工程ｉｉ）では、信号が試料内の配位子の量の第２関数である場合には、こ の第２の関数は工程ｉ）に明記された第１の関数とは異なる。

工程迅）では、信号が試料内の配位子の量の第３の関数の場合には、この第３の 関数は工程ｉ）で明記された第１の関数とは異なる。この第３の関数は工程ｉｉ ）で明記された第２の関数と異なるのが好ましいが、同じであっても良い。

補助較正面が存在する場合、較正試薬及び補助較正試薬は、較正面から生じる信 号と補助較正面から生じる信号とが同一にならないように選択される。このよう な同一でない信号は、較正面から生じる信号と補助較正面から生じる信号とが試 料内の配位子の量の同じ関数である場合に発生可能である。１つの例として、較 正試薬と補助較正試薬が同じであるが、それら較正試薬及び補助較正試薬と複合 体を形成する補助試薬の量を異ならせた場合がある。別の例として、較正試薬及 び補助較正試薬の両方が、補助試薬を必要とせずに信号を発生し、また両者の量 が異なる場合がある。較正試薬と補助較正試薬のこのような選択にかかわらず、 同一の信号が発生したとすれば、（例えば、試料のｐＨ値が極端であったり、試 料の背景信号が高過ぎたり或いは試薬の劣化に起因する）装置の故障が表示され 、分析を拒絶することができる。これは本発明の更に別の利点である。

試料内の配位子の定性分析方法では、１つの補助較正面が存在することが好まし い。半定量方法では、少なくとも１つの補助較正面が存在する。定量方法では、 存在する補助較正面の数は２つ以上であるのが好ましく、４つ以上あればより好 ましい。

本発明による分析方法は直接分析、競合分析及びサンドイッチ分析を含む幅広い 多種の分析技術に適用できる。

ここで使用する「直接分析」という用語は、補助試薬を必要としない分析、即ち 、適切な特異の結合パートナへの試料配位子の結合が測定信号を直接調整する分 析を意味し、例えば表面プラズモン共鳴或いは圧電バイオセンサを使用する分析 が挙げられる。しかし、（例えばＰＨ−Ａ−２７８１４２に記載されるように） このようなバイオセンサは自身の性能を向上させるために時として標識を使用し ている。本発明の方法に適用してこのような間接的な分析技術を使用することは 本願の範囲内である。

ここで使用する「ゼロ信号」という用語は関係する分析のための背景信号を意味 する。従って、「ゼロでない信号」という用語は対応して解釈すべきものである 。

直接分析或いはサンドイッチ分析では、ゼロ信号は分析対象物が存在しない時に 得られる信号である。競合分析では、ゼロ信号は適切な分析曲線の下方の漸近線 に対応する信号であり、従ってこれは分析対象物が存在しない時に得られる信号 ではない。

直接分析及びサンドイッチ分析では、検出可能な信号は試料内に存在する配位子 の量に略比例する。競合分析では、測定試薬と補助試薬との複合体は試料内の配 位子の有無に関係無く形成されるが、検出可能な信号は複合した補助試薬の量に 依存する。これは試料内の配位子の存在量と反比例する。ここで使用する「競合 分析」という用語は文脈の許す範囲で、置換分析、例えば、測定試薬を適切な補 助試薬と予め複合させ、その後この複合体を試料と共に恒温保持することにより 試料内に配位子が存在する場合にはその少なくとも一部を対応する量の補助試薬 と置換する分析を含む。

従って、本発明の１つの実施例による分析の一形態として、上記分析方法に加え 、前記工程１）において、前記測定試薬（或いはオプションとして、該測定試薬 と予め複合されているか、或いは該測定試薬を含む複合体を形成可能な補助試薬 ）は分析対象の配位子に特異の結合ノ々−トナであり、前記工程ｉｉ）において 、補助試薬として配位子アナログが存在すると共に、較正試薬（或いはオプショ ンとして、該較正試薬と予め複合されているか、或いは該較正試薬を含む複合体 を形成可能な補助試薬）が分析対象の配位子に特異の結合パートナであり、前記 工程ｉｉ）において、ａ）前記補助較正試薬及び補助試薬は前記工程ｉｉ）で限 定した前記較正試薬及び補助試薬にそれぞれ等しいか、ｂ）分析対象の配位子と は異なる配位子が補助試薬として存在すると共に、前記補助較正試薬（或いはオ プションとして、該補助較正試薬と予め複合されているか、或いは該較正試薬を 含む複合体を形成可能な補助試薬）が分析対象の配位子とは異なる配位子に特異 の結合パートナであるか、或いはＣ）前記補助較正試薬は分析対象の前記配位子 に対して非特異の結合パートナである分析方法が提供される。

本発明の更に別の実施例による競合分析では、前記工程ｉ）において、ａ）補助 試薬として配位子アナログが存在すると共に、前記測定試薬（或いはオプション として、該測定試薬と予め複合されているか、或いは該測定試薬を含む複合体を 形成可能な補助試薬）が分析対象の前記配位子に特異の結合パートナであるか、 或いはｂ）分析対象の配位子に特異のオプションとして、標識化された結合パー トナが補助試薬として存在すると共に、前記測定試薬（或いはオプションとして 、前記測定試薬に予め複合されているか或いはその測定試薬を含む複合体を形成 可能な補助試薬）が配位子アナログであり、前記工程ｉｉ）において、ａ）配位 子アナログが補助試薬として存在すると共に、前記較正試薬（或いはオプション として、該較正試薬と予め複合されているか或いは該較正試薬を含む複合体を形 成可能な補助試薬）が分析対象の配位子に特異の結合パートナであるか、或いは ｂ）分析対象の配位子に特異のオプションとして、標識化された結合パートナが 補助試薬として存在すると共に、前記較正試薬（或いはオプションとして、該較 正試薬と予め複合されているか或いは該較正試薬を含む複合体を形成可能な補助 試薬）が配位子アナログであるか、或いはＣ）前記較正試薬は補助試薬の存在を 必要とせずに所望のゼロでない信号を発生させ、前記工程ｉｉ）において、ａ） 前記補助較正試薬及び補助試薬は前記工程ｉｉ）で限定した較正試薬及び補助試 薬にそれぞれ等しいか、或いはｂ）分析対象の配位子とは異なるオプションとし て標識化された配位子が補助試薬として存在すると共に、前記補助較正試薬（或 いはオプションとして、該補助較正試薬と予め複合されているか或いは該補助較 正試薬を含む複合体を形成可能な補助試薬）が分析対象の前記配位子とは異なる 配位子に特異の結合パートナであるか、或いはＣ）前記補助較正試薬が補助試薬 （存在すれば）に非特異の結合パートナであるか、或いはｄ）前記補助較正試薬 が補助試薬の存在を必要とせずに所望のゼロ信号を発生する。

本発明の更に別の実施例によるサンドイッチ分析では、前記工程ｉ）において、 分析対象の配位子に特異のオプションとして標識化された結合パートナが補助試 薬として存在すると共に、前記測定試薬（或いはオプションとして、該測定試薬 と予め複合されているか或いは該測定試薬を含む複合体を形成可能な補助試薬） が分析対象の前記配位子に特異の別の結合パートナであり、その結合パートナは 前記オプションとして標識化された特異の結合パートナの向けられたエピトープ とは異なる分析対象の配位子のエピトープに向けられ、前記工程ｉｉ）において 、ａ）前記較正試薬（或いはオプションとして、該較正試薬と予め複合されてい るか或いは該較正試薬を含む複合体を形成可能な補助試薬）が分析対象の前記配 位子に特異の結合パートナであり、分析対象の前記配位子に特異のオプションと して標識化された結合パートナが補助試薬として存在すると共に、オプションと して標識化された特異の結合／り一トナと予め複合した分析対象の配位子が既知 量更に別の補助試薬として存在するか、或いはｂ）分析対象の配位子に特異のオ プションとして標識化された結合パートナが補助試薬として存在すると共に、前 記較正試薬（或０【ヨオプションとして、該較正試薬と予め複合されているか或 いは該較正試薬を含む複合体を形成可能な補助試薬）が不動化された特異結合ノ く一トナに予め複合した既知量の分析対象配位子であるか、或−）はＣ）前記較 正試薬が補助試薬の存在を必要とせずに所望のゼロでなり％信号を発生させ、前 記工程ｉｉ）において、ａ）前記補助較正試薬及び補助試薬（ま前記工程ｉｉ） で限定した前記較正試薬及び補助試薬とそれぞれ等しく１カ）、或いはｂ）分析 対象の前記配位子とは異なる配位子が補助試薬として存在すると共に、前記較正 試薬（或いはオプションとして、該較正試薬と予め複合されているか或いは該較 正試薬を含む複合体を形成可能な補助試薬）が分析対象の配位子とは異なる配位 子に特異なオプシ９ンとして標識化された結合パートナであるか、或いはＣ）前 記補助較正試薬力（補助試薬（存在すれば）に非特異のオプションとして標識化 された結合ノ々−トナであるか、或いはｄ）前記補助較正試薬が補助試薬の存在 を必要とせずに所望のゼロ信号を発生させる。

ここで使われている「配位子アナログ」という用語は、分析対象の配位子と同じ 特異の結合パートナの同じエピトピープの部位に結合できる種を意味し、特に、 分析対象の配位子の既知量或いはその配位子の標識化されたアリクラ中ブトをそ の範囲に含む。

本発明の方法を実行するためには、例えば計量棒或いは「試験片」を用いたバイ オセンサ、「試料通過」構造を用いた装置、或も１１を試料を内部に封入した装 置等の多種の装置を使用することができる。本発明の方法に使用し得るバイオセ ンサの例には、表面プラズモン共鳴、圧電技術及び総内部反射度（ｔｏｔａｌ　 １ｎｔｅｒｎａｌ　ｒｅｆｌｅｃｔａｎｃｅ）技術を有するセンサが含まれる。

本発明の方法を実行するのに好ましい装置は毛管フィル装置、特に蛍光毛管フィ ル装置、例えばＢＰ−Ａ−１７１１４８やＷＯ−９０／１４５９０に記載される 型の装置である。このような毛管フィル装置は単独で使用しても良いし、ＷＯ− ９０／１８３０に記載されるような適切なホルダに入れて使用しても良い。

ＥＰ−Ａ−１７１１４８に記載されるように、毛管フィル装置（ｃａｐｉｌｌａ ｒｙ　ｆｉｌｌｄｅｖｉｃｅ；以下ＣＦＤと称す）は典型的には、例えばガラス 等の透明な材料でできた２枚のプレートの間を狭い間隙或いはキャビティで互い に隔離して構成される。一方のプレートは光学導波管として機能し、装置内で実 行される試験に適した不動化された試薬を担持する。Ｎｏ−９０／１４５９０に 記載されるように、他方の透明プレートはキャビティから離れた面に光を吸収す る或いは不透明な材料の層を担持することができる。競合分析で使用する際には 、不動化された試薬は例えば検出を希望する配位子に特異の結合パートナであっ ても良く、またプレートの一方は蛍光染料で標識化された配位子アナログよりな る可溶性試薬（補助試薬）を担持しても良い。ＣＦＤの一端に試料を配置すると 、試料は毛管作用により間隙内へ吸入されて補助試薬を溶解する。抗原を対象と する競合分析では、蛍光標識化された抗原アナログが、導波管に不動化された限 られた数の抗体結合部位と結合すべく試料の抗原と競り合う。毛管の間隙は狭い ため（典型的には約１００ミクロン）、反応は概ね短時間で終了し、試料マトリ クス及び抗体の親和性により通常は５分未満で終了する。従って、競合分析では 、複合体形成により導波管に間接的に結合する蛍光標識化された抗原の量は試料 内の抗原の１度と反比例する。サンドイッチ分析では、導波管が検出を希望する 配位子に特異の結合パートナを担持し、何れか一方のプレートが蛍光染料で標識 化された別の特異の結合パートナよりなる可溶性試薬（補助試薬）を担持するこ とになる。抗原を対象とするサンドイッチ式免疫分析では、試料の抗原は蛍光標 識化された抗体及び導波管に不動化された抗体とサンドイッチ複合体を形成する 。

従つて、サンドイッチ式免疫分析では、複合体形成により導波管に間接的に結合 する蛍光標識化された抗体の量は試料内の抗原の濃度に直接比例する。

ここで使用する「抗原」という用語は、抗原性の種（例えば、プロティン、バク テリア、バクテリアの断片、セル、セルの断片、及びウィルス等）、及び適切な 条件下で抗原性になるハプテンの両方を含むものと理解されたい。

本発明の装置の好適な実施例によれば、前記装置は一つ或いは複数のキャビティ を有する、配位子の分析に使用するための特に反応性の高い試料の収集及び試験 装置であり、前記キャビティの１つの面は互いに離隔した３つのゾーン■、■及 び■を有し、これら各ゾーンは所望の分析に適した離脱可能な試薬からなる層を 担持し、前記面は透明な材料で形成された第１固体プレートの面であり、該第１ 固体プレートに対向する前記キャビティの壁部は透明な材料より形成されて光透 過性の導波管として機能する第２プレートからなり、該第２プレートの前記キャ ビティに隣接する面は前記ゾーン！、■及び■にそれぞれ対応して配向させられ た３つのゾーン■、■及び■を有し、これら各ゾーン■、■及び■は所望の分析 に適した不動化試薬よりなる層を担持することを特徴とするバイオセンサ装置が 提供される。第１プレートの外面には不透明なコーティングを施すのが好ましい 。

便宜上、かかる装置のより詳細な記載においては、前述のゾーン■。

ｎ、　ｍ、　ｒｖ、ｖ及び■により担持される試薬は以下のように示される：ゾ ーン　試薬 ■、（トッププレート）　Ｘ　（溶解・離脱可能な補助試薬）■、（トッププレ ート）　Ｙ　（溶解・離脱可能な補助試薬）■、（トッププレート）Ｚ（溶解・ 離脱可能な補助試薬）ＩＶ、　（ベースプレート）　Ａ　（不動化試薬）Ｖ、　 ＜ベースプレート）　Ｂ（不動化試薬）Ｖｌ、　（ベースプレート）　Ｃ（不動 化試薬）「トッププレート」及び「ベースプレート」という用語は単に記載を簡 便なものとすべく使用したものであり、これらの用語により、使用する装置の形 状に何らかの限定を加えることは意図していない。

上記ゾーンの配置は、ゾーン■がゾーン■と、ゾーン■がゾーンＶと、またゾー ン■がゾーン■とそれぞれ対を成すようにし、そのうち一対が装置において分析 を希望する配位子の量を測定する領域（測定領域）を形成し、他の２対が装置に おいて制御或いは構成用のパラメータとして使用可能な測定を行なう領域（較正 領域）を形成する。

希望するのであれば、本発明の方法で使用するＣＦＤには２つ以上の補助較正ゾ ーンを設けても良く、また同−試料内の異なる配位子を同時に或いは順次に分析 することを可能にすべく多数の分析ゾーンを設けても良い。例えば装置に、１つ の分析を行なうための、ここで規定する第１の測定ゾーン及び較正ゾーンと、別 の分析のための別の測定ゾーンを設けることもできる。前記較正ゾーンは前記別 の測定ゾーン用の較正が第１測定ゾーンの較正とは異なっている場合でも、前者 のための較正ゾーンとしても使用できる。また、必要に応じて補助較正ゾーンを 設けることもできる。

試薬Ｘ、　Ｙ、　Ｚ、　Ａ、Ｂ及びＣの識別は、分析を希望する配位子及び分析 の方法論の両方に依存する。第１透明プレート上の各ゾーンに担持された試薬は 適切な材料でできた可溶性の層に含有させても良い。その可溶性試薬を付着させ た後、例えばポリビニルアルコール（ＰＶＡ）製のカバ一層を試薬の上に重ねて も良く、その場合カバ一層は装置に試料を添加した後数秒間試薬の溶解を遅らせ るものである。これは試薬があるゾーンから別のゾーンまで流されて移動しこれ により正確な分析を妨げることを防ぐためである。装置のキャビティは、他の充 填方法を用いても良いが、毛管作用による試料液の吸入を可能とするのに充分な 小寸法とするのが好ましい。第」透明プレート上のゾーン及び第２透明プレート 上の対応するゾーンは縦並びに、或いは各ゾーンの独立性を維持する他の幾何学 的な構成に配列することが出来る。

直接分析での使用に適した装置の第１実施例では、試薬Ｘはゼロとし、試薬Ｙは 分析対象の既知量の配位子とし、また試薬Ｚはゼロとすることができる。この実 施例では、試薬Ａを、分析対象の配位子に特異の結合パートナであるプレート表 面に不動化された反応性の種とし、試薬Ｂを試薬Ａと同一とし、試薬Ｃを、分析 対象の配位子に非特異の結合バートナでプレート表面に不動化された反応性の種 としても良い。

直接分析での使用に適した装置の第２実施例では、試薬Ｘはゼロとしても良い。

この実施例では、試薬Ｙは、充分に飽和した複合体が存在するように特異の結合 パートナを所定量伴った既知量の分析対象の配位子としても良い。かかる実施例 では、試ＮＺはゼロでも良い。従って、ゾーン■は特異の結合パートナに結合し た既知量の配位子を担持する。試薬Ａは分析対象の配位子の特異の結合パートナ でありプレート表面に不動化された反応性の種とし、試薬Ｂは試薬Ｙに特異の結 合パートナでありプレート表面に不動化された反応性の種としく、試ＭＣは分析 対象の配位子の非特異の結合パートナでありプレート表面に不動化された反応性 の種としても良い。

競合型分析での使用に適した装置の第１実施例では、試ａｉＸは分析対象の試料 配位子に特異の結合パートナを既知量有する、蛍光標識化された配位子アナログ としても良い。この実施例では、試薬Ｙは充分に飽和した複合体が存在するよう に特異の結合パートナを所定量伴っている、蛍光標識化された分析対象の配位子 アナログであっても良い。この実施例ではまた、試薬Ｚは、充分に飽和した複合 体が存在するように特異の結合パートナを所定量伴っている蛍光標識化された分 析対象の配位子アナログであっても良い。従って、ゾーンＩは蛍光標識化された 既知量の配位子アナログ及びその特異の結合パートナの両方を担持し、ゾーン■ は特異の結合パートナに結合した蛍光標識化された既知量の配位子アナログを担 持し、またゾーン■は特異の結合パートナに結合した分析対象の配位子を既知量 担持する。試薬Ａは分析対象の試料配位子の特異の結合パートナのための特異の 結合パートナである、プレート表面に不動化された反応性の種でも良く、試薬Ｂ 及びＣは両方共試薬Ａの等価物でも良い。

競合型分析で使用するのに適した装置の第２実施例では、試薬Ｘを蛍光標識化さ れた配位子アナログとし、試薬Ｙを既知量の配位子自身を伴う試薬Ｘとし、試薬 Ｚを充分に飽和した複合体が存在するように特異の結合パートナを所定量伴う蛍 光標識化された分析対象の配位子のアナログとしても良い。これにより、ゾーン Ｉは蛍光標識化された既知量の配位子アナログを担持し、ゾーン■は蛍光標識化 された配位子アナログと分析対象の配位子の両方を既知量担持し、ゾーン■は特 異の結合パートナに結合した蛍光標識化された既知量の配位子アナログを担持す ることになる。試薬Ａをプレート表面に不動化された反応性の種とし、試薬Ｂを 試薬Ａの等価物とし、試薬Ｃを分析対象の試料配位子の特異の結合パートナに対 する特異の結合パートナである、プレート表面に不動化された反応性の種として も良い。

競合型分析での使用に適した装置の第３実施例では、試薬Ｘは蛍光標識化された 配位子アナログでも良い。この実施例では、試薬Ｙはゼロとし、試薬２は試薬Ｘ の等価物でも良い。従って、ゾーンＩ及び■の両方が蛍光標識化された既知量の 配位子アナログを担持する。試薬Ａを分析対象の試料配位子の特異の結合パート ナである、プレート表面に不動化された反応性の種としても良（、試薬Ｂを分析 対象の試料配位子に特異或いは非特異の蛍光標識化された結合パートナである、 プレート表面に不動化された反応性の種としても良い。試薬Ｃを分析対象の試料 配位子に特異の結合パートナである、プレート表面に不動化された反応性の種と しても良い。

競合型分析での使用に適した装置の第４実施例では、試薬Ｘは蛍光標識化された 配位子アナログであっても良い。この実施例では、試薬Ｙは充分に飽和した複合 体が存在するように特異の結合パートナを所定量伴った蛍光標識化された分析対 象の試料配位子のアナログであっても良い。またこの実施例では、試薬Ｚは充分 に飽和した複合体が存在するように特異の結合パートナを所定量伴った分析対象 の配位子であっても良い。とれにより、ゾーン■は蛍光標識化された配位子アナ ログ及びその特異の結合パートナの両方を既知量担持し、ゾーン■は結合パート ナに結合した蛍光標識化された既知量の配位子アナログを担持か、またゾーン■ は特異の結合パートナに結合した分析対象のの配位子を既知量担持する。試薬Ａ を分析対象となる試料配位子に特異の結合パートナである、プレート表面に不動 化された反応性の種としても良い。試薬Ｂ及び試薬Ｃは試薬Ａの等価物でも良い 。

競合型分析での使用に適した装置の第５実施例では、試薬Ｘは蛍光標識化された 配位子アナログでも良い。この実施例では、試薬Ｙはゼロであり、試薬Ｚはゼロ か或いは試ａｉＸの等価物でも良い。従りて、ゾーンＩ及びオブシ３ンとしてゾ ーン■は両方共蛍光標識化された既知量の配位子アナログを担持する。試薬Ａを 分析対象の試料配位子のための特定の結合パートナである、プレート表面に不動 化された反応性の種とし、試ＪＩＢは試薬Ａと同じで、しかも充分に飽和した試 薬Ａと試薬Ｘの複合体が存在するか或いはかかる複合体が分析作業時に形成され るように試薬Ｘを所定量伴ったものとしても良い。また試薬Ｃは試薬Ａと同じで あって、しかも充分に飽和した試薬Ａ及び分析対象の試料配位子の複合体が存在 するか、或いはかかる複合体かの複合体が分析作業時に形成されるようにその分 析対象となる試料配位子を所定量伴ったものとし、また試薬２が存在する場合に は、充分に飽和した試薬Ａと配位子アナログとの複合体が存在するか、或いは分 析作業時にその複合体が形成されるように蛍光標識化された配位子アナログを所 定量伴った試薬Ａを更に含むものとする。

競合型分析での使用に適した装置の第６実施例では、試薬Ｘは蛍光標識化された 配位子アナログであっても良い。この実施例では、試薬Ｙは充分に飽和した複合 体が存在するように特定の結合パートナを所定量伴った蛍光標識化された配位子 アナログ、及び、充分に飽和した複合体が存在するように結合パートナを所定量 伴った分析対象の配位子としても良い。この実施例では、試薬Ｘは試薬Ｘの等価 物であっても良い。従って、ゾーンＩは蛍光標識化された既知量の配位子アナロ グを担持する。

ゾーン■は自身の結合パートナに結合した分析対象の既知量の配位子と共に、特 異の結合パートナに結合した蛍光標識化された既知量の配位子アナログを担持す る。ゾーン■はゾーンＩと同じ試薬を担持する。試薬Ａを分析対象の試料配位子 の特異の結合パートナである、プレート表面に不動化された反応性な種としても 良く、試薬Ｂを分析対象の試料配位子の特異の結合パートナである、プレート表 面に不動化された反応性の種でも良い。また試薬Ｃを分析対象の試料配位子の非 特異の結合パートナである、プレート表面に不動化された反応性の種としても良 い。

上述の実施例における測定領域及び較正領域の幾つかは、測定或いは較正面上の 不動化された試薬に結合する種が１つの介在成分（ｉｎｔｅｒｖｅｎｉｎｇ　ｍ ｏｉｅｔｙ）を介して間接的に結合するように設定される。介在成分のないもの 、或いは２つ以上の介在成分が存在するような例は本明細書に読み取れるもので あり、従って本発明の範囲内にある。以下の１４の実施例は介在成分が無いケー ス、即ち種が測定或いは較正面に不動化された試薬に直接結合するケースに関す るものである。

競合型分析での使用に適した装置の第７実施例では、試薬Ｘは蛍光標識化された 配位子アナログであっても良い。かかる実施例では、試薬Ｙは配位子自身を有す る試薬Ｘであっても良く、試薬Ｚは試薬Ｘの等価物或いはゼロでも良い。従って 、ゾーン■は蛍光標識化された配位子アナログを既知量担持し、ゾーン■は蛍光 標識化された既知量の配位子アナログと分析対象の配位子の両方を担持する。試 薬Ｚが存在する場合、ゾーン■はゾーンＩと同じ試薬を担持する。この実施例で は、試薬Ａを分析対象の試料配位子の特異の結合パートナである、プレート表面 に不動化された反応性の種とし、試薬Ｂを試薬Ａの等価物としても良い。試薬Ｃ は充分に飽和した試薬Ａの複合体が試薬Ｘと共に存在するように、或いは分析作 業時に複合体が形成されるように所定量の試薬Ｘを伴った試薬Ａでも良い。

競合型分析での使用に適した装置の第８実施例では、試薬Ｘは蛍光標識化された 配位子アナログであっても良い。この実施例では、試薬Ｙは配位子自身を有して いれば試薬Ｘと同じでも良い。試薬Ｚを試薬Ｘの等価物としても良い。従って、 ゾーンＩは蛍光標識化された既知量の配位子アナログを担持し、ゾーン■は蛍光 標識化された既知量の配位子アナログと分析対象の配位子の両方を担持すること になる。ゾーン■はゾーンＩと同じ試薬を担持する。試薬Ａを分析対象の試料配 位子の特異の結合パートナである、プレート表面に不動化された反応性の種とし 、試薬Ｂを試薬Ａの等価物としても良い。試薬Ｃは充分に飽和した試薬への複合 体が分析対象の試料配位子と共に存在するか、或いは分析作業時に複合体か形成 されるように分析対象の所定量の試料配位子を伴った試薬Ａであっても良い。

競合型分析での使用に適した装置の第９実施例では、試薬Ｘは蛍光標識化された 配位子アナログでも良い。この実施例では、試薬Ｙは配位子自身を有していれば 試薬Ｘと同じでも良い。また試薬Ｚを試薬Ｘの等価物としても良い。従って、ゾ ーン■は蛍光標識化された既知量の配位子アナログを担持し、ゾーン■は蛍光標 識化された既知量の配位子アナログと分析対象の配位子との両方を担持すること になる。ゾーン班はゾーンＩと同じ試薬を担持する。試薬Ａを分析対象の試料配 位子の特異の結合パートナである、プレート表面に不動化された反応性の種とし ても良い。試薬Ｂは試薬Ａの等価物であっても良い。試薬Ｃを分析対象の試料配 位子以外の配位子の特異の結合パートナである、プレート表面に不動化された反 応性の種とし、充分に飽和した上記反応性の種がその特異の結合パートナと共に 存在するように、或いは分析作業時で複合体が形成されるように特異の結合パー トナである所定量の配位子をオプシヨンとして備えていても良い。

競合型分析での使用に適した装置の第１Ｏ実施例では、試薬Ｘは蛍光標識化され た配位子アナログでも良い。この実施例では、試薬Ｙは配位子自身を有していれ ば試薬Ｘと同じでも良い。試薬Ｚを試薬Ｘの等価物としても良い。従って、ゾー ンＩは蛍光標識化された既知量の配位子アナログを担持し、ゾーン■は蛍光標識 化された配位子アナログと分析対象の配位子との両方を既知量担持することにな る。ゾーン■はゾーンＩと同し試薬を担持する。試薬式を分析対象の試料配位子 の特異の結合パートナである、プレート表面に不動化された反応性の種としても 良い。

試薬Ｂを試薬Ａの等価物としても良い。試１１Ｅｃを分析対象の試料配位子以外 の配位子の特異の結合パートナである、プレート表面に不動化された反応性の種 とし、充分に飽和した上記反応性の種の複合体が特異の結合パートナである配位 子のアナログと共に存在するように、或いは分析作業時に複合体が形成されるよ うに特異の結合パートナである配位子の蛍光標識化された所定量のアナログをオ プションとして備えていても良い。

競合型分析での使用に適した装置の第１１実施例では、試薬Ｘは蛍光標識化され た配位子アナログでも良い。この実施例では、試薬Ｙは配位子自身を有していれ ば試薬Ｘと同じでも良い。この実施例では、試薬Ｚは配位子アナログでも良い。

この配位子は試料配位子とは異なり、試料配位子が特異の結合パートナとなる反 応性の種に特異の結合パートナではない。従って、ゾーンＩは蛍光標識化された 既知量の配位子アナログを担持し、ゾーン■は蛍光標識化された既知量の配位子 アナログと分析対象の配位子との両方を担持する。ゾーン■はゾーン■で使用さ れる配位子アナログとは異なる蛍光標識化された配位子アナログを既知量担持す る。試薬Ａを分析対象の試料配位子の特異の結合パートナである、プレート表面 に不動化された反応性の種とし、試薬Ｂ及びＣを両方共試薬Ａの等価物としても 良い。

競合型分析での使用に適した装置の第１２実施例では、試薬Ｘは蛍光標識化され た配位子アナログでも良い。かかる実施例では、試薬Ｙは配位子自身を有してい れば試薬Ｘと同じでも良い。この実施例では、試薬Ｙ及び２を試薬Ｘの等価物と しても良い。従って、これらゾーン１．　Ｕ及び■は全で、蛍光標識化された既 知量の配位子アナログを担持する。

試薬Ａは分析対象の試料配位子の特異の結合パートナである、プレート表面に不 動化された反応性の種とし、試薬Ｂを試薬式と同じでも良いが、充分に飽和した 試薬Ａの複合体が試薬Ｘと共に存在するように、或いは分析作業時に複合体が形 成されるように所定量の試薬Ｘを伴っていても良い。試薬Ｃを分析対象の試料配 位子以外の配位子の特異の結合パートナである、プレート表面に不動化された反 応性の種とし、充分に飽和した上記反応性の種に特異の結合パートナと共に存在 するように、或いは分析作業時に複合体が形成されるように特異の結合パートナ である所定量の配位子をオプシヨンとして備えていても良い。

競合型分析での使用に適した装置の第１３実施例では、試薬Ｘは蛍光標識化され た配位子アナログでも良い。この実施例では、試薬Ｙを試薬Ｘの等価物としても 良い。かかる実施例では、試薬Ｚは蛍光標識化された配位子アナログでも良い。

この配位子は試料配位子とは異なり、試料配位子が特異の結合パートナである反 応性の種に対して非特異な結合パートナである。従って、ゾーン■及び■は両方 共蛍光標識化された既知量の配位子アナログを担持し、ゾーン■はゾーン■で使 用される配位子アナログとは異なる蛍光標識化された既知量の配位子アナログを 担持することになる。試薬Ａを分析対象の試料配位子のための特異の結合パート ナである、プレート表面に不動化された反応性の種としても良い。また試薬Ｂを 試薬Ａと同じとし、充分に飽和した試薬への複合体が試薬Ｘと共に存在するよう に、或いは分析作業時に複合体が形成されるようよ所定量の試薬Ｘを備えても良 い。試薬Ｃを試薬Ａと同じとし、充分に飽和した上記反応性の種がその特異の結 合パートナと共に存在するように、或いは分析作業時に複合体が形成されるよう に特異の結合パートナである所定量の配位子をオプションとして備えていても良 い。

競合型分析での使用に適した装置の第１４実施例では、試薬Ｘは蛍光標識化され た配位子アナログでも良い。この実施例では、試薬Ｙをゼロ、或いは試薬Ｘの等 価物とし、また試薬Ｚを試薬Ｘの等価物としても良い。従って、ゾーンＩ及び■ 、またオプションとしてゾーン■は蛍光標識化された既知量の配位子アナログを 担持する。試薬Ａは分析対象の試料配位子の特異の結合パートナである、プレー ト表面に不動化された反応性の種としても良い。また試薬Ｂをプレート表面に不 動化された蛍光標識化された反応性の種とし、オプションとして分析対象の試料 反の特異の結合パートナとしても良い。試薬Ｃは充分に飽和した上記反応性の種 がその特異の結合パートナと共に存在するように、或いは分析作業時に複合体が 形成されるように特異の結合パートナである所定量の試料配位子を伴った試薬Ａ でも良い。

競合型分析での使用に適した装置の第１５実施例では、試薬Ｘは蛍光標識化され た配位子アナログでも良い。この実施例では、試薬Ｙはゼロでも良く、試薬Ｚは 試薬Ｘの等価物でも良い。従って、ゾーンＩ及び■は蛍光標識化された配位子ア ナログを既知量担持する。試薬Ａを分析対ヤの試料の特異の結合パートナである 、プレート表面に不動化された反応性の種としても良い。また試薬Ｂをプレート 表面に不動化された蛍光標識化された反応性の種とし、またオプションとして分 析対象の試料配位子の特異の結合パートナとしても良い。試薬Ｃを分析対象の試 料配位子以外の配位子の特異の結合パートナである、プレート表面に不動化され た反応性の種とし、また特異の結合パートナである配位子を伴った充分に飽和し た反応性の種の複合体が存在するように、或いは分析作業時に複合体が形成され るように、特異の結合パートナである所定の配位子をオプションとして伴ってい ても良い。

競合型分析での使用に適した装置の第１６実施例では、試薬Ｘは蛍光標識化され た配位子アナログでも良い。この実施例では、試薬Ｙは分析対象の配位子を備え ていれば試薬Ｘと同じでも良い。この実施例では、試薬Ｚは分析対象の所定量の 配位子を伴った試薬Ｘでも良く、この量は試薬Ｙ中に存在する量とは異なる。従 って、ゾーンＩは蛍光標識化された配位子アナログを既知量担持し、ゾーン■及 び■は、蛍光標識化された配位子アナログと分析対象の配位子の両方を担持する ことになる。試薬Ａを分析対象の試料配位子の特異の結合パートナである、プレ ート表面に不動化された反応性の種とし、試薬Ｂ及びＣを両方共試薬Ａと同じに しても良い。

競合型分析での使用に適した装置の第１７実施例では、試薬Ｘは分析対象の配位 子の蛍光標識化された特異の結合パートナであっても良い。

この実施例では、試薬Ｙは分析対象の配位子の蛍光標識化された特異の結合パー トナ及び、充分に飽和した複合体が存在するうよに所定量の分析対象の配位子を 備えた、分析対象の配位子の蛍光標識化された特異の結合パートナであっても良 い。この実施例では、試薬Ｚは分析対象の配位子に対して非特異な蛍光標識化さ れた結合パートナであっても良い。

従って、ゾーンは分析対象の配位子の蛍光標識化された既知量の特異の結合パー トナを担持する。ゾーン■は分析対象の配位子に特異な、標識化されていない既 知量の結合パートナを備えた分析対象の配位子に結合して分析対象の配位子の蛍 光標識化された既知量の特異の結合パートナを担持する。ゾーン■は分析対象の 配位子に対して非特異である蛍光標識化された結合パートナを既知量担持する。

試薬Ａを分析対象の配位子である、プレート表面に不動化された反応性の種とし ても良い。試薬Ｂ及びＣを試薬Ａと同じにしても良い。

競合型分析での使用に適した装置の第１８実施例では、試薬Ｘは分析対象の配位 子の蛍光標識化された特異の結合パートナであっても良い。

この実施例では、試薬Ｙはゼロでも良い。この実施例では、試薬Ｚは充分に飽和 した複合体が存在するように分析対象の配位子を所定量伴った分析対象の配位子 の蛍光標識化された特異の結合パートナと、蛍光標識化された、分析中ではない 配位子アナログであっても良い。従って、ゾーンＩは分析対象の配位子の蛍光標 識化された既知量の特異の結合パートナを担持する。ゾーン■は、蛍光標識化さ れた、分析対象の配位子とは異なる配位子のアナログを備えた、分析対象の配位 子に結合した分析対象の配位子のための標識化されていない既知量の特異の結合 パートナを担持する。試薬Ａを分析対象の配位子である、プレート表面に不動化 された反応性の種としても良い。試薬Ｂを蛍光標識化された配位子アナログであ る、プレート表面に不動化された反応性の種とし、試薬Ｃを分析対象の配位子の 特異の結合パートナである、プレート表面に不動化された反応性の種としても良 い。

競合型分析での使用に適した装置の第１９実施例では、試薬Ｘは分析対象の配位 子の蛍光標識化された特異の結合パートナであっても良い。

この実施例では、試薬Ｙは充分に飽和した複合体が特定の比率（例えばｌ：２） で存在するように特異の結合パートナを備えた分析対象の既知量の配位子てあっ ても良い。この実施例では、試薬Ｚは分析対象の配位子に対して非特異な、蛍光 標識化された結合パートナであっても良い。

従って、ゾーンは分析対象の配位子の蛍光標識化された既知量の特異の結合パー トナを担持する。ゾーン■は分析対象の配位子に結合した分析対象の配位子の蛍 光標識化された既知量の特異の結合パートナを担持する。ゾーン■は分析対象の 配位子に非特異な、蛍光標識化された結合ノく一トナを既知量担持する。試薬Ａ はプレート表面に不動化された反応性の種でも良い。試薬Ｂはプレート表面に不 動化された反応性の種で分析対象の配位子に特異の結合パートナであるか、或い は試薬への等価物の何れかであっても良い。試薬Ｃは試薬Ａの等価物であっても 良い。

競合型分析での使用に適した装置の第２０実施例では、試薬Ｘは分析対象の配位 子の蛍光標識化された特異の結合パートナであっても良い。この実施例では、試 薬Ｙはゼロでも良い。この実施例では、試薬Ｚは分析対象の配位子に対して非特 異な、蛍光標識化された結合パートナであっても良い。従って、ゾーンＩは分析 対象の配位子の蛍光標識化された既知量の特異の結合パートナを担持する。ゾー ン■は分析対象の配位子に対して非特異な、既知量の蛍光標識化された既知量の 結合／り一トナを担持する。試薬Ａを分析対象の配位子である、プレート表面に 不動化された反応性の種としても良い。試薬Ｂは分析対象の配位子であり、プレ ート表面に不動化された反応性の種とし、分析対象の配位子の複合体がその特異 の結合パートナと共に存在するか、或いは装置の作動下でその複合体が形成され るように、分析対象の配位子に対して特異な蛍光標識化された結合パートナを備 えている。試薬Ｃを試薬Ａと同一としても良い。

競合分析で使用するのに適した装置の上記実施例において、試薬の１っが蛍光標 識化された配位子アナログである場合、これは分析対象の配位子の蛍光標識化さ れたアリクウオットであれば好都合である。

サンドイッチ型分析での使用に適した装置の第１実施例では、試薬Ｘは分析対象 の配位子の蛍光標識化された特異の結合パートナであっても良く、試薬Ｙと充分 に飽和した試薬Ｘの複合体と既知量の配位子自身であっても良い。この実施例で は、試薬Ｚは分析対象の配位子に対して非特異な、蛍光標識化された結合パート ナであっても良い。従って、ゾーン■は蛍光標識化された既知量の特異の結合パ ートナを担持する。ゾーン■は分析対象の配位子に結合した蛍光標識化された既 知量の特異の結合パートナを担持する。ゾーン■は試薬Ｘと同じ蛍光標識を有す る、分析対象の配位子に対して非特異な結合パートナを既知量担持する。試薬Ａ を分析対象の試料配位子の特異の結合パートナである、プレート表面に不動化さ れた反応性の種としても良い。試薬Ｂ及びＣを試薬Ａと同一としても良い。

サンドイッチ型分析での使用に適した装置の第２実施例では、試薬Ｘは分析対象 の配位子の蛍光標識化された特異の結合パートナであっても良く、試薬Ｙは充分 に飽和した試薬Ｘの複合体と既知量の配位子てあっても良い。この実施例では、 試薬Ｚは試薬Ｘと同一でも良い。従って、ゾーン■は分析対象の配位子の蛍光化 された既知量の特異の結合パートナを担持する。ゾーン■は分析対象の配位子の 蛍光標識化された既知量の特異の結合パートナを担持する。ゾーン■はゾーン■ と同じ試薬を担持する。試薬Ａを分析対象の試料の特異の結合パートナである、 プレート表面に不動化された反応性の種とし、試薬Ｂを試薬Ａと同一としても良 い。試薬Ｃを分析対象の試料配位子以外の配位子の特異の結合パートナである、 プレート表面に不動化された反応性の種とし、特異の結合パートナである配位子 を伴った充分に飽和した反応性の種の複合体が存在するうよに、或いは分析作業 時に錯体が形成されろうよに、所定量の配位子をオプションとして備えていても 良い。

サンドイッチ型分析での使用に適した装置の第３実施例では、試薬Ｘは分析対象 の配位子の蛍光標識化された特異の結合パートナであっても良い。この実施例で は、試薬Ｙはゼロであっても良い。この実施例では、試薬Ｚは充分に飽和した複 合体における分析対象の配位子を備えた、分析対象の配位子の蛍光標識化された 特異の結合パートナであっても良い。従って、ゾーン■は分析対象の蛍光標識化 された特異の結合パートナを既知量担持し、ゾーン■は分析対象の配位子に結合 した蛍光標識化された特異の結合パートナを既知量担持する。試薬Ａはプレート 表面に不動化された反応性の種であっても良く、分析対象の配位子の特異の結合 パートナである。試薬Ｂはプレート表面に不動化された反応性の種であっても良 く、分析対象の試料配位子の特異の結合パートナをオプションとして備えていて も良い。試薬Ｃは充分に飽和した複合体が存在するように分析対象の配位子を所 定量伴った試薬Ａであっても良い。

サンドイッチ型分析での使用に適した装置の第４実施例では、試薬Ｘは分析対象 の配位子の蛍光標識化された特異の結合パートナであっても良い。この実施例で は、試薬Ｙはゼロでも良い。かかる実施例では、試薬Ｚは分析対象の配位子に対 して非特異な、蛍光標識化された結合パートナであっても良い。従って、ゾーン Ｉは分析対象の配位子の蛍光標識化された特異の結合パートナを既知量担持する 。ゾーン■は分析対象の配位子に対して非特異な、蛍光標識化された既知量の結 合パートナを担持する。試ＨＡを分析対象の配位子の特異の結合パートナである 、プレート表面に不動化された反応性の種としても良い。また試薬Ｂをプレート 表面に不動化された反応性の種とし、分析対象の試料配位子の特異の結合パート ナをオプションとして備えても良い。

サンドイッチ型分析での使用に適した装置の第５実施例では、試薬Ｘは分析対象 の配位子の蛍光標識化された特異の結合パートナであっても良い。この実施例で は、試薬Ｙは、充分に飽和した複合体が存在するように分析対象の所定量の配位 子と、この分析対象の配位子の蛍光標識化された特異の結合パートナとを伴った 分析対象の配位子の蛍光標識化された特異の結合パートナでも良い。この実施例 では、試薬Ｚは分析対象の配位子に対して非特異な、蛍光標識化された結合パー トナであっても良い。従って、ゾーンＩは分析対象の配位子の蛍光標識化された 既知量の特異の結合パートナを担持する。ゾーン■は分析対象の配位子に結合し た蛍光標識化された既知量の特異の結合パートナと、分析対象の配位子の蛍光標 識化された既知量の特異の結合パートナとを担持する。ゾーン■は分析対象の配 位子に対して非特異な、蛍光標識化された結合パートナを既知量担持する。試薬 Ａを分析対象の配位子の特異の結合パートナである、プレート表面に不動化され た反応性の種とし、試薬Ｂ及びＣを試薬Ａと同一としても良い。

サンドイッチ型分析での使用に適した装置の第６実施例では、試薬Ｘは分析対象 の配位子の蛍光標識化された特異の結合パートナであっても良い。この実施例で は、試薬Ｙは、充分に飽和した複合体における分析対象の所定量の配位子と、充 分に飽和した複合体における分析対象の所定量の配位子を伴った分析対象の配位 子の特異の結合パートナとを伴った、分析対象の配位子の蛍光標識化された特異 の結合パートナであっても良い。この実施例では、試薬Ｚは分析対象の配位子に 対して非特異な、蛍光標識化された現地代理人バイオセンサであっても良い。従 って、ゾーン■は分析対象の配位子の蛍光標識化された既知量の特異の結合パー トナを担持する。ゾーン■は分析対象の配位子に結合した蛍光標識化された既知 量の特異の結合パートナと、分析対象の配位子の標識化されていない既知量の特 異の結合パートナを担持する。ゾーン■は分析対象の配位子に対して非特異な、 蛍光標識化された既知量の結合パートナを担持する。試薬をはプレート表面に不 動化された反応性の種とし、また試薬Ｂ及びＣを試薬Ａと同一としても良い。

サンドイッチ型分析での使用に適した装置の第７実施例では、試薬Ｘは分析対象 の配位子の蛍光標識化された特異の結合パートナであっても良い。この実施例で は、試薬Ｙをゼロとしても良い。この実施例では、試薬Ｚは分析対象の配位子の 蛍光標識化された非特異な結合パートナであっても良い。従って、ゾーンＩは分 析対象の配位子の蛍光標識化された既知量の特異の結合パートナを担持すること になる。。ゾーン■は分析対象の配位子の蛍光標識化された既知量の特異な結合 パートナを担持する。試薬Ａを分析対象の配位子の特異の結合パートナである、 プレート表面に不動化された反応性の種としても良い。また試薬Ｂは、充分に飽 和した複合体が存在するように、或いは分析作業時にかかる複合体が形成される ように、分析対象の所定量の配位子と、該配位子の蛍光標識化された所定量の結 合パートナとを伴った、分析対象の配位子の特異の結合パートナである、プレー ト表面に不動化された反応性の種であっても良い。試ＥＪＣは試薬Ａと同一であ っても良い。

種々の実施例用に記載された試薬Ｘ、　Ｙ、Ｚ、　Ａ、　Ｂ及びＣを使用する理 由については後述する。

以上に記載した装置の実施例では、分析対象の配位子が溶液中において不安定で あったり、或いはかかる配位子が稀少、高価もしくは充分な純度及び／或いは量 で作成するのが困難な場合、分析対象の配位子を較正領域で較正試薬として使用 するのであれば、この配位子の代わりにＥＡ−へ−３４３９３２に記載されるキ ャリブレータを使用しても良い。

本発明による毛管フィル装置はＥＰ−Ａ−１７１１４８に記載されるものに類似 した方法で製造することができる。

従って、本発明によれば、（ａ）多数の前記装置の一部を提供するシート材の表 面に、前記ゾーン■、■及び■により担持される適切な試薬のパッチの列を形成 し；　（ｂ）別の構造体の表面に、適切な場合には特に反応性の高い種の不動化 も含めて、前記ゾーン■、■及び■に担持される適切な試薬のパッチの列を形成 し、適切な試薬の前記層と接触させて或いは容積の試料液体を収集・保持すべ（ 、前記層の構造体及び前記シート材により、前記多数の装置のそれぞれに好まし くは毛管作用をなす寸法のキャビティを提供し；　（Ｃ）前記シート材を、それ ぞれが一つ或いは複数の前記試料収集及び試験装置を提供する複数の部分に分離 する。各工程よりなる製造方法が提供される。

この方法では、第２プレートに含まれる試薬ゾーンは、これらのゾーンに含まれ る試薬が同じ性質のものであれば連続していても良い。代わりに、第１プレート に含まれる試薬ゾーンと同様に、第２プレートに含まれる試薬ゾーンは、例えば ２次元的なパッチ列の如く、不連続部からなるパターンに区分しても良い。この ようなパッチを形成する場合、例えば、一連なりの層を先ず形成し、次いでその 層の部分的な除去を行なって所望のパターンを構成する複数の同一形状の試薬パ ッチを残すことで作ることができる。別の方法として、所望のパターンのパッチ を（例えばスクリーン印刷により）直接貼り付けても良く、このような技術は、 各プレート毎にそのプレート上のゾーンに含まれる試薬の性質が同一でなかった り、或いはその試薬が高価でその使用を最小限に抑えなければならないような実 施例には最適である。

キャビティの表面に特に反応性の高い種を不動化することは直接的或いは間接的 に行われる。例えば、その反応性の高い種が抗体である場合、自身がキャビティ の表面に結合された抗種の抗体により間接的に不動化しても良い。別の方法とし て、抗体にビオチンを結合し、キャビティの表面に予め不動化されたアビジンと 複合させるか、或いはその逆を行なうことにより不動化しても良い。間接的な不 動化の更に別の例として、イソチオシアン酸フルオレセイン（ＦＩＴＣ）を分析 対象の種に特異の結合パートナに結合し、キャビティの表面に抗ＦＩＴＣ抗体を 不動化するものがある。直接的な不動化は、抗体が適切なりロスリンク試薬（例 えば、グルタルアルデヒド或いはグリコールアルデヒド）の使用により共有結合 できる適切な試薬（例えばアミノプロピルトリメトキシシラン等のシラン化試薬 ）で処理することによりキャビティの表面を活性化して行なうことができる。か かるコーティングの不動化を得るために当業者によく知られた他の技術を使用し ても良い。適切な不動化化学を利用してハプテン及び抗原をキャビティの表面に 直接不動化しても良い。或いは、これらのハプテン及び抗原を例えばポリーＬ− リジン等のプロティンに結合し、次いで公知の方法を用いてこのプロティンを介 してキャビティの表面に不動化しても良い。

本発明のより深い理解のために、添付図面に沿った説明を行なう。図１は本発明 の一実施例による蛍光毛管フィル装置（以下ＦＣＦＤと称す）の概略断面図であ り、図２は図１と同じ装置の平面図である。

図３ａ〜３ｘ、４ａ〜４を及び５ａ〜５ｕは図１の装置の種々の実施例における 領域Ｔ、Ｒ及びＳを示すもので、これらの図で使用される記号は以下のエンテイ テイーを示している。

０　分析対象の抗原 →　蛍光標識 ン＋　蛍光で標識化された抗原アナログ口　分析対象の抗原とは異なる抗原 −（或いはさ（分析対象の抗原に特異の抗体−く　分析対象の抗原に特異の抗体 に対する特異の抗体レイ或いはＨ分析対象の抗原に非特異の抗体→分析対象の抗 原に非特異の抗体に対する特異の抗体０　不動化を促進する或いは抗体及び抗原 の結合を促進する種図６は図１の装置からの測定値を得るための簡単な蛍光分析 装置を概略的に示す。

図７は、モルヒネ標準溶液にモルヒネ−３−グルクロニドを２種類の濃度（Ｏｎ ｇ／ｍｌ及び１００．０００　（１００Ｋ）　ｎ　ｇ／　ｍ　１　＞含むものを 用い、例１に記載の分析方法に使用する装置のゾーンＶで測定時間に対して得ら れた信号のプロットを示す。

図８は例１に記載の分析方法に使用した装置のゾーン■でモルヒネの標準溶液中 のモルヒネ−３−グルクロニドのＩｏｇ１１度に対して得られた信号のプロット を示している。

図９は例２に記載の分析方法に使用した装置のゾーン■及び■でモルヒネ標準溶 液中のモルヒネ−３−グルクロニドのログ１度に対して得られた信号のプロット を示す。

図１０ａ及び１０ｂは例３に記載されるタイプの試料に関して標準分析方法及び 例３に記載の分析方法のそれぞれを用いてモルヒネ標準溶液果の数のプロットを 示している。図１０ａ及び１０ｂで使用した以下の記号は使用した試料のタイプ を示す。

口　不純物のない正常な尿 ◇　ｐＨ１ｏの尿 Δ　蛍光レベルがｌｕｍ／Ｌの尿 ＋　蛍光レベルが６ｕｍ／Ｌの原 図１１は例４に記載の分析方法に使用した装置のゾーン■及びＶでモルヒネ標準 溶液中のモルヒネ−３−グルクロニドのログ濃度に対して得られた信号のプロッ トを示す。

図１２は例５に記載の分析方法に使用した装置のゾーン■、■及び■（それぞれ 記号Δ、十及び◇で示す）でモルヒネ標準溶液中のモルヒネ−３−グルクロニド のログ濃度に対して得られた信号のプロットを示す。

図１３は例５に記載の分析方法に使用した装置の光学的縁部からのバーニヤ距離 に対して得られた信号のプロットを示す。

図１４は例６に記載の分析方法に使用した装置のゾーン■、■及び■でモルヒネ 標準溶液中のモルヒネ−３−グルクロニドのログ濃度に対して得られた信号のプ ロットを示す。

図１５は例６に記載の分析方法で使用した装置のゾーン■及びＶでモルヒネ標準 溶液中のモルヒネ−３−グルクロニドのログ濃度に対して得られた信号のプロッ トを示す。

図１６は例６に記載の分析方法で使用した装置のゾーンＶ及び■でモルヒネ標準 溶液におけるモルヒネ−３−グルクロニドのログ濃度に対して得られた信号のプ ロットを示す。

図１７は例７に記載の分析方法で使用した装置のゾーン■及びＶ（それぞれ記号 Δ及び◇で示す）でモルヒネ標準溶液中のモルヒネ−３−グルクロニドのログ濃 度に対して得られた信号のプロットを示す。

以下、一つの補助較正面を有するＦＣＦＤについて特に説明する。しがし、異な る設計の装置、或いは異なる数の補助較正面を有するＦＣＦＤ或いはその他の装 置も同様に製造できることは明らかである。

図１において、図示される装置は外面に不透明なコーティング８を施された透明 な材料（例えばプラスチック材料、石英、シリカ或いはガラス）製の上部プレー ト２と、透明な材料で構成された下部プレート４よりなり、両プレートは厚さ約 １ｍｍで、互いに略平行に固定され、適切な接着剤で構成した接合トラック３８ （図２参照）より互いに１ｍｍ未満離隔している。図示される実施例では、この ように形成されたセルキャビティ６がその両端で周囲に開口しており、従って液 体試料が毛管作用によりキャビティ６の一方の開口部から吸入されると、空気が 他方の開口部から排出される。図示例では、上記２つのプレートは互いにずれて 配置されるが、これは必須の特徴ではない。

上部プレート２の内面には実行する試験に適した３つのバッチ状の試薬が担持さ れ、それぞれ前後のゾーンＩ（１２）、ゾーンＩ［（１４）及びゾーンＩＩＩ　 （１６）に担持されている。これらの試薬は溶解・離脱可能な形態（それぞれ試 薬Ｘ、　Ｙ及びＺ）で装置内に収容されている。

下部プレート４の内面には実行する試験に適した３つのパッチ状の試薬が担持さ れ、それぞれ前述のゾーン■（９）、ゾーンＶ　（１０）及びゾーンＶＩ　（１ １）に担持されている。これらのゾーン９．１０及び１１はプレート２の各ゾー ン１２．１４及び１６の真下にある。免疫分析の場合、ゾーン９．１０及び１１ は例えば不動化された適切な抗体、抗原或いはハブテンが担持さる。これらは試 薬Ａ、Ｂ及びＣである。

図１に示される装置の幾つかの実施例の使用時の操作について説明する。以下の 記載はｔ！ＩＡｆｆｉ化された抗原形態の競合型分析での装置の使用に関するも のであるが、本発明による装置は標識化された抗体形態の免疫分析（競合型及び サンドイッチ型の両方）や、他の形式の分析（直接、サンドイッチ型、或いは競 合型）、或いは他の形式の化学的或いは生化学的試験での仕様にも適している。

試料液は図１に示される矢印の方向に沿って装置内に入る。キャビティ６が試料 液で満たされると短時間でパッチ１２．１４及び１６の材料が溶は出してそれぞ れの試薬を試料液中に開放する。

本発明の分析方法の成否は、パッチ１２．１４及び１６から試料溶液中に開放さ れる試薬の空間的分離（即ち非混合）にかかっている。前述のように、パッチ１ ２．１４及び１６は適切な可溶性材料により上部プレート２上に担持することが できる。適切な可溶性材料としては、例えばスクロース系やソルビトール系の保 湿剤コーティングがある。図１に示される実施例では、パッチ１２．１４及び１ ６は互いに離隔している。プレート２及び４の長さは約１５ｍｍで、キャビティ ６の最小寸法は１ｍｍ未満（典型的には約０．１ｍｍ）でパッチ間の横方向の間 隔１８及び２０は典型的には２〜３ｍｍである。この装置は、試料液を充填した 時の横方向の試薬の混合は非常が遅い（典型的には２〜３時間）一方で狭い毛管 溝を横切る上下方向の混合が速くなる（数秒）ように構成される。従って、試料 液を装置に充填した後の３つのパッチから溶は出る試薬の混合は、殆どの試験（ 免疫分析を含む）が２時間未満で平衡状態に到達するため、問題にはならない。

横方向の混合が起きる可能性が最も高くなるのは装置への試料液の導入時であり 、その試料液の流れる方向に試薬の「移動」が発生する可能性がある。このよう な移動の発生を防止する手段として、パッチ１２．１４．１６にそれらの内部か らの試薬の解放を遅らせる材料の薄い層をコーティングすることがある。パッチ のコーティングに適した材料としては例えばポリビニルアルコール（ＰＶＡ）が ある。適切なＰＶＡコーティングを施すと試料液と最初に接触してから溶解する のに典型器には２〜１０秒かかる。図１に示されるものに代わる実施例としては 、パッチ１２．１４．１６同志を、また、これに対応してパッチ９．１０．１１ 同志を互いに当接させても良い。この場合、試薬バッチの当接面で横方向の混合 が生じるであろう。しかし、それに続いて測定場に選択される部分は、後述する ように隣接するゾーンでかかる部分の間に混合が生じないように選ばれる。

抗原を対象とした競合型免疫分析場に準備された図１に示される型の装置の１つ の実施例では（この実施例は前述の競合分析装置の第１実施例に対応する）、パ ッチ１２は分析対象となる抗原に特異の抗体を所定量伴う蛍光標識化された抗原 アナログを含むものとしても良い。その場合、パッチ９は分析対象の抗原に特異 の抗体に対する特異の抗体である、不動化された特異の結合パートナよりなる。

従って、試料液を入れると、パッチ１２は溶解して抗原アナログと分析対象の抗 原に特異の抗体とを試料液中に解放する。パッチＩ２から離脱したこれらの試薬 は、図１の符号Ｔで示す領域内に実質的に残るのが好ましい。一般に、これは横 方向の拡散が遅い時の状態である。試料液中に導入された抗原は、その抗原に特 異の抗体のエピトープ結合部位をめて抗原アナログと競り合うもので、この抗原 はかかる競合の前或いは後にパッチ９に含まれる特異抗体の層上のエピトープ結 合部位に結合する。従って、パッチ９に不動化されている特異抗体に間接的に結 合する蛍光物質の量は試料液における抗原の濃度の関数である。従来の競合型の 光学的免疫分析はこの種の競合平衡化を含んでいる。従って、領域Ｔは「測定領 域」として機能する。パッチ１４が溶解すると、既知量の蛍光標識化された抗原 アナログがその特異抗体と共に充分に飽和した複合体をなして、図１のＭ域Ｒに 存在する試料液中に解放される。従って、領域Ｔとの比較で抗原アナログと特異 抗体との複合体がパッチ１０（パッチ９と同一である）内に含まれる不動化され た特異の抗体に結合する。従って、先ず、最大量の蛍光物質がバッチ１０内の不 動化された抗体に間接的に結合する。従って、較正領域Ｒは「高信号較正領域Ｊ として機能する。かなりの時間、例えば１〜２時間が経つと、不動化された抗体 に結合した抗原アナログは試料液からの抗原と競り合うことになる。この競り合 いにより、それが平衡状態に到達するまでバッチｌｌ内の不動化された抗体と間 接的に結合している蛍光物質の量がゆっくりと減少する。パッチ１６が溶解する と、分析対象の既知量の抗原がそのｆｒ！異抗異色体に充分に飽和した複合体を なして図１の領域Ｓに存在する試料液中に解放される。従って、領域Ｒと類似し た方法で、抗原と特異抗体との複合体がパッチ１１（パッチ９及び１０と同一で ある）に含まれる不動化された特異の抗体に結合する。従って、最初及びそれに 続く段階では、パッチｌｌ内の不動化された抗体には蛍光物質が間接的に結合し ない。従って、較正領域Ｓは「ゼロ信号較正領域」として機能する。

第１実施例に対応して、３つの領域Ｔ％Ｒ及びＳｌそしてそこに含まれる試薬を 図３ａに概略的に示す。

本発明による装置の例に関する以下の説明は上述の３つの領域Ｔ、Ｒ及びＳと関 連したものである。ここで記載する領域Ｔの何れかをここで記載する領域Ｒの１ つと併せて使用しても良く（この場合領域Ｒ内の表面４で結合反応が生じれば、 それは領域Ｔ内の表面４で生じたものと類似する）、オプションとしてここで記 載する領域Ｒ及びＳの何れかから選択した１つ或いは複数の領域を更に使用して も良い。

競合　Ｖを行なう装置の第２の例では、分析対象の抗原に特異の抗体はパッチ９ 内に含まれる。第３の例では、分析対象の抗原に特異の抗体はパッチ９に含まれ る不動化された抗体に予め結合される。第４の例では、分析対象の抗原の特異の 抗体はパッチ９を含む表面に不動化されている。これら３つの例のそれぞれにお いて、結果として生じる競合は上述の測定領域のものと類似するであろう。この ため、これらの例では更に別の測定領域が記載される。

上記３つの例の領域Ｔはそれぞれ図３ｂ、３ｃ及び３ｄに概略的に示される。

競合分析を行なう装置の第５の例では、パッチ１４が溶解すると、蛍光標識化さ れた既知量の抗原アナログが分析対象の既知量の抗原と共に図１に示す領域Ｒ内 の試料に解放される。装置が申し分なく作動する上での必須の条件ではないが、 一般に、パッチ１２及び１４内の抗原アナログの量は同じである。従って、領域 Ｔとの比較で、抗原アナログは、パッチ１０に含まれる特異抗体の結合部位と結 合すべく、例えば試料抗原及び装置内に既に存在する抗原等の増加した量の抗原 と競り合う。この特異の抗体は分析対象の抗原に対する特異の抗体であり、／ク ツチェ０に含まれる不動化された特異の抗体と飽和した複合体の形態で存在する ０パツチ１０内の不動化された特異の抗体に間接的に結合する蛍光物質の量は、 従って、領域Ｒにおける試料液の抗原の全体量の濃度の関数である。従って、較 正領域Ｒは「陽性の較正領域」として機能する。第６の例では、分析対象の抗原 の特異の抗体自身をパッチｌＯに不動化させる。第７の例では、分析対象の抗原 に特異の抗体は抗原アナログ及び抗原の両方と充分に飽和した複合体を形成して 存在し、パッチ１０に含まれる不動化された特異の抗体は分析対象の抗原の特異 の抗体に対する特異の抗体である。これら第６、第７の例でも、類似する陽性の 較正領域が提供される。

これら３つの例の領域Ｒはそれぞれ図３ｅｓ３ｆ及び３ｇに示されている。

競合型分析場の装置の第８の例では、パッチ１４は試薬を含んでｔ）なくても良 い。分析対象の抗原の特異の抗体は、蛍光標識化された同量の抗原アナログ（パ ッチ１２と同じ試薬）と、分析対象の抗原の特異の抗体に対する特待の抗体であ る不動化された同量の特異の抗体と共（こ、＜、。

チ１０に含まれる。第９の例では、分析対象の抗原の特異の抗体は／り・ノチｌ Ｏ内の不動化された特異の抗体に複合体として予め結合されている。第１０の例 では、抗原アナログと分析対象の抗原の特異の抗体とが両方パッチ１０内の不動 化された特異の抗体に複合体として予め結合されている。第１１の例では、分析 対象の抗原の特異の抗体が、抗原アナログと共に好ましくは充分に飽和した複合 体をなす、バッチＩＯ内の不動化された抗体自身である。これら４つの例では、 最大量の蛍光物質がバッチ１０内の不動化された抗体と先ず結合する。従って、 これらの例では、領域Ｒは高信号較正領域として機能する。長時間、例えば１〜 ２時間経過後、不動化された抗体に結合した抗原アナログは試料液内の抗原と競 合する。この競合により、それが平衡状態に到達するまで、バッチ１１内の不動 化された抗体と間接的に結合する蛍光物質の量がゆっくりと減少する。

これら４つの例の領域Ｒはそれぞれ図３ｈｓ　３　Ｉｓ　３　ｊ及び３ｋに示さ れている。

競合分析用の装置の第１２の例では、パッチ１６が溶解すると、蛍光標識化され た抗原アナログが図１の領域Ｓに存在する試料液中に開放される。分析対象の抗 原の特異の抗体は、同量の分析抗原と、その分析抗原に特異の抗体に対する特異 抗体である不動化された同量のけくい抗体と共に、パッチ１１内に含まれる。第 １３の例では、分析抗原に特異の抗体は複合体内でパッチＩＯ内の不動化された 特異抗体に複合体として予め結合する。第１４の例では、分析抗原及びその分析 抗原に特異の抗体が共に、パッチ１０内の不動化された特異抗体に複合体として 予め結合される。第１５の例では、分析抗原に特異の抗体自身が好ましくは予め 形成された複合体をなすように、分析抗原と共にパッチｌＯ内に不動化された抗 体である。これら４つの例では、最初にｌくフチ１１内の不動化された抗体に結 合する蛍光物質はない。従って、これら４つの例で１よ、領域Ｓはゼロ信号較正 領域として機能する。長時間、例えば１〜２時間経過後、不動化された抗体に結 合した抗原はツク・ソチ１６から離脱した蛍光抗原アナログに置換され、抗原及 び抗原アナログの競合が起こる。

この競合工程に続いてパッチ１１内の不動化された特異の抗体に結合する量の蛍 光物質の量を加えても良い。

これら４つの例の領域Ｓはそれぞれ図３１．３ｍ、３ｎ及び３ｐｌ二力（いりや つ的に示されている。

競合型分析を行なう装置の第１６及び１７の例では、〕くツチ１４が溶解すると 、分析抗原の特異の抗体かその分析抗原に対し特異でな（Ｘ抗体の何れかである 蛍光標識化された特異の抗体が図１の領域Ｒに存在する試料液中に開放される。

バッチ１０内に含まれる不動化された抗体番ヨ／＜フチ１４内の蛍光標識化され た抗体に対して特異の抗体である。従って、最大量の蛍光物質がパッチ１０内の 不動化された抗体に結合する。従って、領域Ｒは高信号較正領域として機能する 。

これらの例の領域Ｒはそれぞれ図３ｑ及び３ｒに概略的に示されて（兎る。

競合型分析に適した装置の第１８の例では、Ｉくフチ１４唱ま試薬力（含まれて いない。パッチＩＯに含まれる不動化された抗体は、分析抗原に特異の、或いは 分析抗原ではない抗原に特異の蛍光標識化された抗体である。何れの場合でも、 更に蛍光物質が／（ブチ１０内の不動化された抗体に結合することはない。不動 化された抗体に蛍光標識力（付（１て（Ｘることは領域Ｒが高信号較正領域とし て機能することを意味する。

この実施例の領域Ｒは図３ｓに概略的に示されている。

競合型分析に適した装置の第１９の例では、パッチ１６が溶解すると、蛍光標識 化された抗原アナログ（パッチ１２と同じ試薬）が図１の領域Ｓに存在する試料 液中に開放される。装置が申し分なく作動する上での必須の条件ではないが、一 般に、パッチ１６内の抗原アナログの量はパッチ１２内の量と同じであるが、パ ッチ１１に含まれる不動化された抗体は試料液内の抗原に対して特異でない不動 化された結合パートナである。従って、パッチ１１内の不動化された抗体には蛍 光物質は結合しない。従って、領域Ｓはゼロ信号較正領域として機能する。

この実施例の領域Ｓは図３ｔに概略的に示されている。

競合型分析用の装置の第２０の例では、パッチ１６が溶解すると、蛍光Ｉｌｌ識 化された抗原アナログ（この抗原は分析抗原ではない）が図１の領域Ｓ内に存在 する試料液中に開放される。パッチ１１に含まれる抗体は分析抗原に特異の結合 パートナである。従って、蛍光物質はパッチｌｌ内の不動化された抗体へは結合 しない。このため、領域Ｓはゼロ信号較正領域として機能する。

この実施例の領域Ｓは図３に概略的に示されている。

競合型分析を行なう装置の第２工の例では、パッチ１４が溶解すると、蛍光標識 化された抗原アナログ（パッチ１２と同じ試薬）は図１の領域Ｒ内に存在する試 料液中に開放される。パッチ１０に含まれる抗体は試料液中の抗原に対して非特 異の結合パートナであり、試料液にはまたパッチ１０内の抗体に特異の結合パー トナである蛍光標識化された抗原アナログが成る量複合体として含まれており、 かかる複合体は好ましくはパッチｌｌ内で予め形成される。従って、最大量の蛍 光物質がパッチ１０内の不動化された抗体に結合する。これにより、領域Ｒは高 信号較正領域として機能する。

この実施例の領域Ｒは図３ｖに概略的に示されている。

競合型分析用の装置の実施例の更に別の例が図４ａ〜４ｔに示されている。図４ ａ〜４ｃは測定領域Ｔの例を示している。図４ｄ及び４ｅは陽性の較正領域Ｒの 例を示している。図４ｆ〜４ｍは高信号較正領域Ｒの例を示している。図４ｎ〜 ４ｒはゼロ信号較正領域Ｓの例を示している。図４ｇ、４ｈ及び４ｒを除き、こ れらの例は標識を付した抗体を使用する。図４ａｓ　４ｅ、４　ｆｓ　４ｈ、４ に、及び４１は関連するパッチ内での抗原の不動化を容易にするために、例えば 、ポリーＬ−リジン、牛の血清アルブミン或いはキーホールリムペットヘモシア ニン（ｋｅｙｈｏｌｅｌｉｍｐｅｔ　ｈａｅｍｏｃｙａｎｉｎ）等の種を使用す ることを示している。また、図４ｂは抗原と抗体との結合反応を容易にするため に、例えばアビジン等の種を使用することを示している。

前述の間接分析を行なう装置の実施例として５、測定領域Ｔの例が図５ｎに示さ れている。陽性の較正領域Ｒの例は図５ｐ及び５ｑに示されている。高信号較正 領域の例は図５ｒ〜５ｔに示されている。較正領域Ｓは図５ｕに示されており、 これはゼロ信号較正領域である。

前述のセンディッチ分析を行なう装置の実施例として、測定領域Ｔの例が図５ａ に示されている。正の較正領域Ｒの例は図５ｂに示されている。高信号領域Ｒの ６つの例が図５ｃ〜５ｈに示されている。ゼロ信号較正領域Ｓの２つの例が図５ ｉ、５ｊに示されている。

競合型分析に使用するとして記載された較正領域の例のあるものはサンドイッチ 分析を行なう装置の実施例で使用しても良く、またその逆も可能である。図５０ 及び５ｇは競合型分析及びサンドイッチ型分析の両方に使用できるこのような２ つの例を示している。

前述の全ての例において、標識化されたと説明している試薬には、蛍光標識とし て同じ蛍光種が使用される。

図１に示される装置の実施例では、パッチ１２（先にゾーンＩと規定したもの） は、プレート２上の３つのパッチの中で、試料液が導入される装置端部に最も近 く、一方パッチ１６はプレート２上のそれら３つのパッチの中で上記装置の端部 から最も遠い。装置の別の実施例では、パッチ１２．１４．１６、及び対応する パッチ９．１０，１１は試料液の導入される装置端部から如何なる順序で配設し ても良い。

前述した本発明による装置の種々の実施例では、１対のゾーンが測定領域を提供 し、他の２対のゾーンが較正領域を提供する。これら較正領域は陽性の較正領域 、ゼロ信号較正或いは高信号較正領域から選択したものとされる。

前述の装置の幾つかの実施例にでは、所望の信号を提供するために、付随して発 生する種々の結合反応の動態特性を考慮に入れなければならない。試薬が選択さ れ、種々の領域からの信号が適切な時期に読み取られて所望の信号が得られる。

ある形式では、意図する種の結合の発生と、信号の読取りの前に最初に形成され る複合体に分離が生じないことを確実にすることが重要である。

較正領域を１つだけ、或いは３つ以上備えた装置のその他の実施例は自ずから明 らかであり、本発明の範囲内のものである。かかる較正領域は前述の較正領域、 或いはこの後に例示する較正領域から選択するのか好ましい。

分析測定値は、適切な周波数或いは周波数領域の光を用いて不動化層の領域ＴＳ Ｒ及びＳに■する部分（或いはその一部のみ）を照射することにより得られる。

この光により照明領域内の蛍光体が励起される。これらの蛍光体はそれにより蛍 光を発し、その発光の一部は第２プレート４内に入り、同プレートに安定され、 ＥＰ−Ａ−１７１１４８に記載の特徴を有して滑らかな縁部２２から出ていき、 その光はその後濾過されて所望の分析を受ける。

異なるゾーン９、ｌＯ及び１１の連続する照射は、照射光学に基づく遮蔽機構に より行われる。その詳細については当業者には明らかであろう。各ゾーンの蛍光 種から発せられる光信号は総て光学的縁部２２から外に出てくることになり、希 望する方法で処理される前に同一の光検出器により検出される。不動化された層 １０の異なる領域を交互に照射するには同じ光源を多数使用しても良い。或いは 、単一の光源を使用してその光源を通過する装置をインデックス処理することに より、不動化された層ｌＯの異なる領域を順次照射することも可能である。

以上の説明では、特に蛍光標識について触れたが、他の特性を示す標識を結合さ れた試薬にも適用できることを理解されたい（例えば、燐光や冷光）。

図２は図１に示される装置の下部プレートの平面図である。材料３２．３４及び ３６のパッチは図１の参照番号１２．１４及び１６で示したパッチにそれぞれ対 応する。図２には装置の上部及び下部プレートを互いに接着する接合トラック３ ８も示されている。毛管分析の深さは接合トラック３８に使用する接着剤に適切 な直径（例えば約１００ミクロン）のガラス球を組込むことにより定められる。

本発明の方法は抗原或いは抗体の分析、即ち免疫分析に特に適用可能であり、好 適な実施例では、配位子は抗原であり、特異の結合パートナはその抗原に対する 抗体である。しかし、本発明は抗体或いは抗原の分析だけに限定されるものと理 解すべきではない。本発明の方法で分析される配位子の例は下の表１に、各側に 特異の適切な結合パートナと共に示される通りである。

表１ 配　位　子　特異の結合パートナ 抗原　特異の抗体 抗体　抗原 ホルモン　ホルモン受容体 ホルモン受容体　ホルモン ポリヌクレオチドストランド　相補ポリヌクレオチドストランドアビジン　ビオ チン ビオチン　アビジン プロティンＡ　免疫グロブリン 免疫グロブリン　プロティンＡ 酵素　酵素共同因子 （基質）或いは反応抑制剤 酵素共同因子　酵素 （基質）或いは反応抑制剤 レクチン　特異の炭水化物 レクチンに特異の炭水化物　レクチン 本発明の方法は非常に広い応用性を有するが、特に、ペプチドホルモン（例えば 、甲状腺刺激ホルモン（ＴＳＨ）、黄体形成ホルモン（ＬＨ）、人体絨は膜生殖 腺刺激ホルモン（ｈＣＧ）、小胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）、インシュリン及びプ ロラクチン）またはノンペプチドホルモン（例えば、コルチソル、エストラジオ ール、プロゲステロン及び試験ステロン等のステロイドホルモン、またはチロキ シン（Ｔ４）及びトリョードチロニン等の甲状腺ホルモン）；プロティン（例え ば、癌胎児抗原（ＣＥＡ）とその抗体、及びアルファフェトプロティン（ＡＦＰ ））；薬剤（例えば、ジゴキシン、薬剤の乱用）；糖；毒素；ビタミン；インフ ルエンザ、バラインフリエンザ、アデノ−ウィルス、肝炎ウィルス、呼吸器官ウ ィルス及びエイズウィルス等のウィルス；ウィルス状の粒子；または微生物を分 析するのに使用することができる。

ここで使用する「抗体」という用語は、以下のものをその範囲内に含むと理解さ れたい。

（ａ）例えば、羊、うさぎ、やぎ或いはマウス等の従来使用されている動物から 得られる種々のクラスまたはサブクラスの免疫グロブリン、例えば、ＩｇＧ、Ｌ ｇＡ、Ｉｇｍ、ＩｇＥ（ｂ）単一クローン系抗体 （Ｃ）単一クローン系或いは多クローン性の抗体のそのままの分子または分子片 （かかる分子片は、抗体の結合分析、即ち、Ｆｃ部分（例えば、Ｆａｂ、Ｆａｂ ’　、Ｆ　（ａｂ’　ｔ　）を持たない断片や、そのままの抗体中の重鎮成分を 連結するジスルフィド結合分析の還元分割により得られる所謂「半分子」、剛性 方法で得た断片を含む）抗体片の作成方法は本技術分野で良く知られているので 、ここでは説明しない。

ここで使用している「抗原」という用語は、恒久的抗原種（例えば、プロティン 、バクテリア、バクテリア断片細胞、細胞断片及びウィルス）、及び適当な条件 下で抗原化されるハブテンの両方を含むものと理解されたい。

本発明による分析方法に使用し得る蛍光体の例としては、フルオレセイン及びそ の誘導体（例えば、イソチオシアン酸フルオレセイン（ＦＩＴＣ））；ローダミ ン及びその誘導体（例えば、ＸＲＩＴＣ，ＴＲＡＰ、ＴＲＩＴＣ）；ダシフェル イエロー；２．４−ジニトロフルオロベンゼン；フェニルイソチオシアネート； ダンジルクロライド；フィコビリプロティン（例えば、アロフィコシアニン及び フィコエリチリン）及びインドシアニンが含まれる。

本発明は更に、前述の本発明による分析方法に使用するのに適した装置を提供す るものであり、かかる装置は本発明による前述の蛍光毛管フィル装置と、使用時 に毛管フィル装置に放射線が入ると蛍光体が励起されるように構成可能な放射線 源と、放射線の動きを監視する手段よりなる。別の実施例では、毛管フィル装置 をマスクを介して照射でき、それにより結合反応が生じる装置の有効体積を規定 する。その有効体積は装置の上下プレート間の距離と、光学列においてマスク５ ５により規定される照射ゾーンの面積との積である。

本発明は更に、前述の装置及び適切な補助試薬よりなり、本発明の分析方法を遂 行するキットを提供する。

定量競合分析では、試料中の特定の分析対象物の１度を正確に測定することが必 要である。種々の要因により分析下の観察信号のレベルが変化する場合があり、 従って、標準となる分析曲線を構成できるように分析対象物の特定の濃度に関連 する多数の規定信号を用意することが重要である。従って、前述の実施例で述べ た既知量の試薬を用いて構成面への蛍光体の結合を前もって判断できる種々の較 正領域を使用することにより、かかる規定信号が得られるものであり、これらの 信号は上述の種々の要因の補償をすることにもなる。一般に、公知の分析技術は ４ポイント或いは５ポイント較正方法を採用しており、そのため定量分析では、 ４つ以上の較正領域を用いるのが好ましく、５つ以上の較正領域を用いるのが最 も好ましい。

定性或いは半定量競合分析では、試料における特定の分析対象物の濃度がある一 定レベルより高いか低いかを判断することだけが必要であり、この濃度は特定の 分析における「切り捨てレベル」と呼ばれる。従って、試料内の分析対象物の測 定量をこの「切り捨てレベル」に関連させることにより、試料が「陽性」か「陰 性」がを判断することができる。

このような「切り捨てレベルＪには、測定面への種の結合が５０％のレベルに達 し信号を発生させることになるポイントを選択するのが普通であるが、他のポイ ントを選択しても良い。

サンドイッチ分析に対しても同様な考え方ができる。しかし、サンドイッチ分析 では、測定面に結合する蛍光体の量が試料の分析対象物の量に直接比例するため 、直線の標準分析グラフを構成する必要がある。これは競合分析用の標準分析曲 線を構成するよりも容易である。従って、一般には定量分析では３ポイントの構 成手順しか必要とせず、従って、サンドイッチ型分析では２つの較正領域、より 好ましくは３つの較正領域を用いるのが好ましい。

競合分析或いはサンドイッチ分析に関して前述した種々の実施例において、「高 信号較正領域」は、面に最初の最大量の蛍光物質が結合するように設定するのが 好ましい。しかし、関連する種々の試薬の量を変化させれば最初に結合する蛍光 物質の量も異なったものとなってこれらの領域からゼロであい他の嵌合が発生す ることになり、このような量は要求される「切り捨てレベル」に対応する信号を 発生するように選択される。その例としては図３ｇ、３Ｗ、３Ｓ、３Ｖ、３ｈ、 ３ｉ、３ｊ、３に、３ｘ、４ｇ、４ｈ、４に、４１，４ｔ、５ｃ、５ｅ、５ｆ、 ５ｇ及び５ｈに示されるものが含まれる。

競合型分析で前述した「陽性の較正領域」は、好ましくは信号が標準分析曲線の 屈曲点に対応する「切り捨て値」と関係するように設定される。

前述のゼロ信号較正領域は分析装置の背景信号に対応する信号を提供する。競合 分析では、これらの領域は、得られた信号が標準分析曲線の低い漸近線に対応す るよう設定されるのに対し、サンドイッチ分析では、これら領域は信号が標準分 析グラフの下限に対応するように設定される。

以下の例は本発明の詳細な説明するためのものであるが、本発明はこれに限定さ れない。

例１〜８は抗原の競合分析のための抗原に標識を付したフォーマットを記載した 本発明の実施例を示すものである。

例１ １　初期材料の調合 １、　１　抗体で被覆し導波管の作成 厚さ約１ｍｍのパーマブロック（Ｐｅｒｍａｂ　１ｏｃ）ガラス（Ｐｉｌｋｉｎ ｇｔｏｎ　Ｇｌａｓｓ　Ｌｔｄ、、　ＳＬ、　Ｈｅ１ｅｎｓ、英国）のシートを 極めて純粋な水の中で洗剤を用いて超音波攪拌により洗浄した。ガラスをアミノ プロピルトリメトキシシラン２％の水溶液の中でｐＨ３〜４、温度７５°Ｃにて ２時間恒温保持することによりその表面を活性化した。このガラスシートを水中 で濯いだ後、温度１１５″Ｃにて少なくとも４時間乾燥させた。その後ガラスシ ートを０．０５Ｍの燐酸バッファ（ｐＨ７）に２．５％のグルタルアルデヒドを 加えた溶液の中で６０分間恒温保持し、その後蒸留水で完全に洗浄した。ガラス を燐酸バッファ（ｐＨ７）に１％のラットの抗マウス単一クローン性抗体を加え た溶液の中で２〜４時間恒温保持した。

その後ガラスシートをバッファ溶液で洗浄した。６Ｍのウレア溶液に公知の方法 で不要な吸着プロティンを除去した。これにより図１に示されるようなＦＣＦＤ 試験装置のプレート４を形成した。

１．２　イソチオシアン酸フルオレセイン（ＦＩＴＣ）に結合したモルヒネの調 合 ２００ｍｇのＦＩＴＣ（Ｓｉｇｍａ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏｍｐａｎｙ社、英 国）及び５ｍｇのモルヒネ−３−グルクロニドを１．４ｍｌの０．２Ｍ炭酸水素 ナトリウムバッファ溶液（ｐＨ９，０”）の中で混合した。その混合物を室温で １８時間放置し、その間にモルヒネに対するＰＩＴＣの結合が生じた。その後混 合物を５ｅｐｈａｄｅｘ　Ｇ−５０５ｕＤｅｒｆｉｎｅ”でゲル濾過することに より浄化した。

１．３　分離した各基準ゾーンせの特異の試薬の微量投与不透明なコーティング をＷｏ−９０／１４５９０に記載されるパーマブロックガラスの清潔なシート上 にスクリーン印刷した。モルヒネ−ＦＩＴＣ結合体の層を、またそれに続いてマ ウスの抗モルヒネ単一クローン性抗原の別の層をガラスのゾーンＩの上に３Ｘ７ ｍｍの面積で微量投与して測定ゾーン（ゾーンＩ）を作成した。その上面に第２ 試薬層を設ける前に、これらの層を空気乾燥させた。これらの層は別個根底で作 成するため、分析時に被験試料を加えた時、モルヒネ−ＦＩＴＣと抗モルヒネ単 一クローン性抗体との優先的結合が起きることはない。

この例では、ゾーン■は、マウスの抗モルヒネ単一クローン性抗体とモルヒネ− ＦＩＴＣ結合体を予め混合したものをゾーン■の領域に正確に微量投与しておく ことにより、測定ゾーンからの標準曲線の高い漸近線と等しい信号を発生すべく 作成された。

ゾーン■はマウスの抗モルヒネ単一・クローン性抗体とモルヒネとを予め混合し たものをゾーン■の領域に正確に微量投与しておくことにより、測定標準線が形 成する下方の分析漸近線と等しい信号を発生すべく作成された。

ゾーンＩ、ＩＩ及び■を含むこのガラスシートは図１に示されるＦＣＦＤ試験装 置のプレート２を形成する。

１．４　ＦＣＦＤ試験装置の製造 上記工程１．１で得られた導波管に、直径１００ミクロンのガラス小球体（Ｊｅ ｎｃｏｎｓ社、英国）を含む紫外線硬化性接着税（ｕｖｓ９１．　Ｎｏｒｌａｒ ＋＋ｆ　Ｉｎｃ、社、米！ｉｔ）の接合トラックを、毛管フィル装置（図２参照 ）の長辺を画成するパターン状にスクリーン印刷して、ＥＰ−＾−０１７１１４ ８に記載されているような試験装置をせいぶうした。上記工程１．３のガラスシ ートを導波管の上に載せ、その積層体に負圧をかけた。負圧により、上部のガラ スシートが接着剤の上に押し付けられ、ガラス小球体が両ガラスはガラスシート 間に１００　ミクロの間隙を画成する。この積層体を紫外線光源に晒して接着剤 を硬化させた。最終的に、この積層体のシートを［！Ｐ−Ａ−０１７１１４８に 記載されるような個々の試験装置に分割した。

１、　５　モルヒネ標準溶液の調合 “Ｓｉｇｍａ　Ｃｈｅｍｉｃａ！　Ｃｏｍｐａｎｙ　Ｌｔｄ”よりモルヒネ−３ −グルクロニドのフリーズドライ調合品を得た。この試料をバッファでｐＨ７， ５にした人間の尿で希薄化し、必要な範囲のモルヒネ標準溶液を得た。

１．６　モルヒネ分析の測定に使用する装置図６はＧＢ８９１１４６２．３に記 載の適切な分析測定を行なうために使用した簡単な蛍光分析装置を示している。

ゼノンフラッシュランプ５１　（Ｈｅｉｎｍａｎｎ社）からの光をレンズ５１に より概ね平行にし、その後ＦＩＴＣで標識化した抗体を励起するための波長範囲 を規定するフィルタスタック５３を通過させる。フィルタスタックは３つのフィ ルタ、即ち、ＢＯ２５ｃｈｏｔｔガラスフイルタ（Ｅａｌｉｎｇ　Ｅｌｅｃｔｒ ｏ　０ｐｔｉｃｓ　ＵＫ　Ｌｔｄ、社、　Ｗａｔｆａｒｄ、英＠）、４５０〜４ ８０ｎｍのＦＩＴＣバンドパス干渉フィルタ（Ｏｐｔｏｍｅｔｒｉｃｓ　Ｌｔｄ 、社、英国）、及び４７４ｎｍのショートパス干渉フィルタ（Ｃｏｍａｒ　Ｉｎ ｓｔｒｕｍｅｎｔｓ　Ｌｔｄ、社、　Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、英国）よりなる。第 ２のレンズ５４は試験セル５６の照射面積、従ってその活性容積を規定する穴５ ５から励起光の焦点を試験セル５６の活性面に合わせるように働く。

試験セルの光学的縁部６３から出た光は穴５７を通過する。この穴は溶液から直 接出た光が光検知装置に入ることを防ぐ。

レンズ装置５８は放出された光を集め、穴５９は放出光の測定角度範囲を規定す る。これは消失しながら結合する蛍光と関連する角度に合致するように選択され ている。５ｃｈｏｔｔ　０Ｇ５１５５１５ｎ　ｍのコロイドガラスロングパスフ ィルタ６０　（Ｅａｌｉｎｇ　Ｅｌｅｃｔｒｏ　０ｐｔｉｃｓ　ＵＫ　Ｌｔｄ、 社、　Ｗａｔｆｏｒｄ。

英国）は拡散したポンプ光を除去し、第２レンズは光線の焦点を光電子倍増管検 出器に合わせる（Ｈａｍａｍａｔｓｕ　Ｒ９３１Ａ、　Ｈａｋｕｔｏ　ＵＫ　Ｋ ｔｄ）。

２、モルヒネの分析方法 標準曲線を得るのに８個のＣＦＤ試験装置を選択し、各ＣＦＤに異なるモルヒネ 標準溶液を充填した。湿った環境で恒温保持した後、ＣＦＤの読み取りをした。

ゾーンＶ及び■を３分間恒温保持した後に読み取ったため、測定した信号は分析 用の（即ち大きな分離が起きる前）それぞれ上方及び下方の漸近線を示すと考察 できた。図７はゾーンＶにおける時間の経過に伴う信号のプロットを示す。この 図から、１〜２００秒の間では信号は分析対象物の濃度から独立しているが、２ ００秒を過ぎると標識化された試薬はベースプレートから分離し始めて標識化さ れた配位子アナログと配位子間の競合が起きるため信号が分析対象物の濃度に依 存するようになることが分かる。従って、このゾーン（またゾーン■）の読み取 りは２００秒が経過する前に行わなければならない。ゾーン■は１５分間恒温保 持した後（分析が平衡状態に達した）に読み取った。このゾーンから標準曲線が 作成された（図８）。基準ゾーンの読み取りを要求される時間（例えばこの特定 の例では２００秒）は分析装置の種類及び使用する試薬に依存することを理解さ れたい。図８は被験試料における分析対象物の濃度をゾーン■の信号を使ってｌ ことができることを示している。ゾーンＶ及び■はそれぞれ分析の上方及び下方 の漸近線を決めるのに使用できる信号を発生する。読み取りに選択した時点では ゾーン■及び■からの信号は分析対象物の１度から独立している。

従って、ゾーンＶ及び■からの測定値を使用してそれらの値を装置の製造中に得 た各ゾーンＶ及び■の基準データと比較することで、背景の蛍光や分析範囲の変 化に対してゾーン■からの信号を補償することができる。

１．１　抗体で被覆した導波管の製造 ゾーンＶ及び■がラットの抗マウス抗体とマウスの抗モルヒネ抗体との予め混合 して得た溶液で処理されることを除き、前述の例１と同様である。ゾーン■はこ の例２では使用しなかった。

１．２　イソチオシアン酸フルオレセイン（ＦＩＴＣ）に結合したモルヒネの調 合例１と同様 １．３　分離した各基準ゾーンへの特定の試薬の微量投与ゾーン■がモルヒネ− ＦＩＴＣ結合体及び標準化されていないモルヒネの層（予め混合された溶液とし て或いは別々の層として）をガラスの上に微量層よして設けされている点を除き 、例１と同様である。ゾーン■はモルヒネ−ＦＩＴＣ結合体で微量化される。

１．４　ＦＣＦＤ試験装置の製造 例１と同様。

１．５　モルヒネ標準溶液の調合 例１と同様。

１．６　モルヒネ分析の測定に使用する装置例１と同様。

２、　モルヒネの分析方法 ＣＦＤにモルヒネ標準液を充填し、湿った環境で恒温保持した後に読み取った。

分析が平衡状態に達した後、即ち１５分後にゾーン■及びＶを読み取った（図９ ）。ゾーン■は分析測定ゾーンである。ゾーンＶは低い分析対象物が低い濃度の 状態でゾーン■と比較してずれを見せている。このゾーンは分析の切り捨てを規 定するのに使用される。従って、ゾーン■がゾーンＶよりＸユニット大きい時、 被験試料は競合分析では陰性であると考察される。更に、ゾーン■からの試料が ゾーンＶよりもｙユニット小さい時、被験試料は陽性であると考察される。ゾー ン■を担持するプレートをラットの抗マウス抗体で処理し、ゾーン■を担持する プレートのマウスのモルヒネ抗体とモルヒネ−ＦＩＴＣ結合体との複合体で処理 すれば、これらのゾーン■及び■を較正領域の完成に使用できるであろうことは 予測されるところである。

すくてい信号が分析値の高い方の漸近線を示すものと考察でき、且つこの信号が 被験試料のモルヒネ濃度から独立しているように、３分間恒温保持した後にゾー ン■の読み取りが行われる。従って、ゾーンＶは切り捨てＩを決めるために、ゾ ーン■は被験試料の濃度に関わらず試薬が働いていることを確認するのに使用す ることができよう。

例３ １、　初期材料の調合 １．１　抗体で被覆した導波管の作成 ゾーン■及びＶがラットの抗マウス抗体とマウスの抗モルヒネ抗体とを予め混合 して得た溶液で処理されたことを除き、前述の例１と同様である。ゾーン■はこ の例３では使用しなかった。

１．２　イソチオシアン酸フルオレセイン（ＦＩＴＣ）に結合したモルヒネの調 合例１と同様 １．３　分離した各基準ゾーンへの特定の試薬の微量投与ゾーン■がモルヒネ− ＦＩＴＣ結合体及び標識化されていないモルヒネの層（予め混合された溶液とし て或いは別々の壮図して）をガラスの上に微量投与して設けられきいる点と、ゾ ーン■がモルヒネ−Ｆ［ＴＣ結合体を微量投与される点を除き、例１と同様であ る。ゾーン■はこの例３では使用しなかった。

１．４　ＦＣＦＤ試験装置の製造 例１と同様。

１．５　モルヒネ標準溶液の調合 例１と同様。

１．６　不純物の混じった尿を使用したモルヒネ標準溶液の調合尿試料はモルヒ ネを使用していないことを確認した志願者から得た。

プールした後、この試料は以下のように処理された。

ａ）　水酸化ナトリウムを添加して尿のｐＨを１０まで増加した。

ｂ）　塩酸を添加して尿のｐＨを４．５まで減らした。

Ｃ）　塩酸を添加して尿のｐＨを４．０まで減らした。

ｄ）　ＴＲＡＰを添加して最終的な濃度をｌｕｍ／Ｌとなるように尿の蛍光を増 加した。

ｅ）　ＴＲＡＰを添加して最終的な濃度が６ｕｍ／Ｌとなるように尿の蛍光を増 加した。

例１のように上記５種の尿を使用してモルヒネの標準溶液を作り、そのモルヒネ の１度を分析の切り捨てレベルの上下の範囲とした。

１．７　モルヒネ分析の測定に使用する装置例１と同様 ２、　モルヒネの分析方法 不純吻合まない尿を使用した８種の標準液をそれぞれ３組使用して分析曲線を作 った。不純物の混じった尿から作った試料を分析し、分析値から得た信号を標準 曲線で読み取った。測定ゾーン、基準ゾーンがら得た信号を例２に記載の方法で 各タイプの試料のために使用した。

図１０ａ及び１０ｂは、最初に標準分析方法（図１０ａ）を使用し、次に陽性制 御基準フォーマット（図Ｊｏｂ）を使用して種々の尿への投与量に対する数多く の陽性結果を表したプロットを示している。理想的には、陽性及び陰性試料間の 工程変化は急激となるべきであるが、標準分析方法では、この工程変化は試料の タイプにより変わる。基準ゾーンの使用で、曲線はより厳密にグループ分けされ ることになる。

例４ １、　初期材料の調合 １．１　抗体で被覆した導波管の作成 ＰＩＴＣで標識化したマウスの（ｈＣＧに対する）単一クローン性抗体でゾーン Ｖを処理し、ラットの抗マウス抗体とマウスの抗モルヒネ抗体とを予め混合した ものでゾーン■を処理した点を除けば例１と同様である例１と同様 １．３　分離した各基準ゾーンへの特定の試薬の微量投与モルヒネ−ＦＩＴＣ結 合体をゾーンＩだけに微量投与した点以外は例１と同様である。

１．４　ＦＣＦＤ試験装置の製造 例１と同様。

１．５　モルヒネの標準的溶液の調合 例１と同様。

１．６　モルヒネ分析の測定に使用する装置例１と同様。

２、　モルヒネの分析方法 ＣＦＤにモルヒネの標準液を充填し、湿った環境で所定時間恒温保持した後に読 み取った。各ゾーンの読み取り時間はそれぞれ独立して最適なものに設定できる が、ゾーン■及びＶは両方共１５分後に読み取った。

ゾーン■は測定ゾーンであるため、その信号は分析対象物の濃度の測定値である （図１１）。

ゾーン■の試薬は、高い漸近線即ち切り捨て■に等しい信号をゾーンＶから出す ように選択される。この基準ゾーンは蛍光信号の強度及び被験試料へ蛍光を補正 するが、分析精度には依存しない。

ゾーン■及び■を使用して分析のチェックを行なうための領域を加えることがで きる。この領域は、例２の高い方の漸近線に等しい信号を擾供する領域と同様な 方法で製造することができる。

例５ １、　初期材料の調合 １．１　抗体で被覆した導波管の作成 ラットの抗マウス抗体とマウスの抗モルヒネ抗体とを予め混合したものでゾーン ■を処理し、ラットの抗マウス抗体のみでゾーンＶ及び■を処理した点以外は例 １と同様である。

１．２　イソチオシアン酸フルオレセイン（ＦＩＴＣ）に結合したモルヒネの調 合例１と同様 １．３　分離した各基準ゾーンへの特定の試薬の微量投与例１の方法を使用し、 モルヒネ−ＦＩＴＣ結合体をゾーン■で微量投与し、モルヒネ−ＦＩＴＣ結合体 とマウスの抗モルヒネ抗体とを予め混合したものをゾーン■に微量投与し、モル ヒネとマウスの抗モルヒネ抗体とを予め混合したものをゾーン■に微量投与した 点を除けば例１と同様である１、４　ＦＣＦＤ試験装置の製造 例１と同様。

１．５　モルヒネ標準溶液の調合 例１と同様。

１．６　モルヒネ分析の測定に使用する装置例１と同様。

２、　モルヒネの分析方法 ＣＦＤをモルヒネ標準液で充填し、湿った環境で恒温保持した後読み取った。

ゾーン■は１５分後、平衡状態に達した後に読み取った。ゾーンＶ及び■は、そ れより短い恒温保持時間の経過後、微量投与した試薬と分析物との競合が生じる 前に読み取る必要がある。この時間は分析の分離により決められる。この例５で は（図１２）、ゾーンＶ及び■は９ｏ秒後に読み取られた。

これらの条件下で、ゾーンＶ及び■は被験試料のモルヒネ濃度には関係なく、そ れぞれ高い方及び低い方の漸近線に等しい信号を発生する。

図１３はＣＦＤの光学的縁部からの距離に対してプロットされた信号を示す。３ つのゾーンの読み取り位置は典型的には１ｍｍ、４ｍｍ及び８ｍｍである。

五互 １、初期材料の調合 １．１　抗体で被覆した導波管の作成 全てのゾーンをラットの抗マウス抗体とマウスの抗モルヒネ抗体とを予め混合し たもので処理した点以外は例１と同様である。

１．２　イソチオシアン酸フルオレセイン（ＦＩＴＣ）に結合したモルヒネの調 合例１と同様 １゜３　ｌ！４なる各参照ゾーンでの特定の試薬の微量化プレートに微量化され たモルヒネ−ＦＩＴＣ結合体を使用して例１のようにゾーン■を製造した。（１ ，１に記載されるように）抗体で被覆した導波管に特定の試薬を微量化した。

ゾーン■はモルヒネ−ＦＩＴＣ結合体で微量化することより高い漸近線と等しい 信号を発生するように構成され、ゾーンＶを標識化されていないモルヒネで微量 化して低い漸近線と等しい信号を発生させた。

１．４　ＦＣＦＤ試験装置の製造 例１と同様。

１．５　モルヒネ標準溶液の調合 例１と同様。

１．６　モルヒネ分析の測定に使用する装置例１と同様。

２．　モルヒネの分析方法 ＣＦＤをモルヒネ標準液で充填し、湿った環境で恒温保持した後読み取った。ゾ ーン■は１５分後、即ち平衡状態に達した後に読み取った。゛ゾーン■は１５分 で、即ち分析が平衡した後で読み取った。この読み取り時間は分析対象物が微量 投与した試薬と競合する前にゾーンを測定できるように選択し、この時間は分析 の分離速度に依存する。図１６はゾーン■及び■からのデータを示す。図１５は ゾーン■及びＶからのデータを示す。図１４は３つのゾーン■、■及び■の全て からのデータを示す１、　初期材料の調合 １．１　抗体で被覆した導波管の作成 ゾーン■をラットの抗マウス抗体で処理し、ゾーンＩをラットの抗マウス抗体と マウスの抗モルヒネ抗体とを予め混合したもので処理した点を除いて例１と同様 である。

１．２　イソチオシアン酸フルオレセイン（ＦＩＴＣ）に結合したモルヒネの調 合例１と同様 １．３　分離した各基準ゾーンへの特定の試薬の微量投与例１に秘めされる方法 を使用し、ゾーン■にはモルヒネ−ＦＩＴＣ結合体を微量投与し、ゾーン■には マウスの抗モルヒネ抗体、モルヒネ及びモルヒネ−ＦＩＴＣ結合体を予め混合し たものを微量投与した。

ゾーンＩＩ／Ｖが高い方或いは低い方の漸近線ではなく分析の切り捨て位置に等 しい信号を発生できるように、モルヒネ及びモルヒネ−ＦＩＴＣ結合体の組合せ を使用した。

１．４　ＦＣＦＤ試験装置の製造 例１と同様。

１．５　モルヒネ標準溶液の調合 例１と同様。

１．６　モルヒネ分析の測定に使用する装置例１と同様。

２、モルヒネの分析方法 ＣＦＤをモルヒネ標準液で充填し、湿った環境で恒温保持した後読み取った。測 定ゾーンであるゾーン■を１５分後、即ち分析が平衡状態に達した後に読み取っ た。ゾーンＶは９０秒後に読み取った（図１７）。この時間は、分析対象物が微 量投与されたモルヒネと競合可能になる前に信号を読み取れるように選択した。

この時間は分析の分離速度に依存する。

ゾーン■及び■を使用して分析チェックを行なう領域を加えることができる。そ の場合、ゾーン■はモルヒネ−ＦＩＴＣ結合体で処理し、ゾーン■をラットの抗 マウス抗体だけで処理する。

ゾーン■の結合体の濃度は分析値の低い方の漸近線に等しい信号を発生するよう に選択される。使用する結合体は測定ゾーンのものと同じであるが、ゾーン■を 担持するプレートには結合しない。従って、信号は分析値の背景信号に等しい。

」 １、初期材料の調合 １．１　抗体で被覆した導波管の作成 マウスの抗モルヒネ抗体と予め混合された山羊の抗マウス抗体を装置のゾーン■ に不動化し、表面の残りの部分には山羊の抗マウス抗体のみを不動化した点を除 けば例１と同様である。

１．２　ローダミンに結合したモルヒネの調合蛍光体に代えてローダミンを用い た意思外は例１と同様。

１．３　ローダミンで標識化した抗体の調合既存の技術を用いてマウスの抗モル ヒネ抗体にローダミンを結合した。

１．４　各基準ゾーンへの特定の試薬の微量投与ゾーンＩにはＴＲＡＰで標識化 したモルヒネだけが印刷され、ゾーン■にはＴＲＡＰでｍｉ化したマウスの抗モ ルヒネ抗体だけを有する点を除いて例１と同様である。ゾーン■はこの例８では 使用しなかった。

１．５　モルヒネ標準溶液の調合 例１と同様。

１．６　モルヒネ試料 成る濃度範囲のモルヒネを含む複数の尿試料を得て、ＦＣＦＤで分析する前に市 販の分析装置を使用して分析した。

１．７　モルヒネ分析の測定に使用する装置例１と同様。

２、　モルヒネの分析方法 不純物のない尿を使用した８種の標準液を３組使用して分析曲線を作った。不純 物が混じっている尿から作成した試料を分析し、その分析値から得た信号を標準 曲線で読み取った。

ゾーン■の試薬を切り捨て位置に等しい信号を提供するように選択した。この基 準は蛍光信号の強度及び被験試薬の蛍光を補正する。これも分析精度に依存する 。

ゾーン■の試薬では試料の結合は起きない。従って、この領域からの信号は分析 の背景信号に等しい。

以下の表はこの分析における基準ゾーンが分析の全体的精度を改善し真陰性試料 の数　５９９　６０６ 真陽性試料の数　１９８　１９９ 偽陰性試料の数　１２　１１ 偽陽性試料の数　７０ 全体の相関％　９７．　７　９８．　７陽性試料の相関％　９４．　３　９４． 　５陰性試料の相関％　９８．８　１００．０信号処理 これまでの例は高い、Ａ及び低い方の漸近線から分析対象物の切り捨て値の何れ かを測定するための種々の方法を明らかにしてきた。測定領域からのデータを較 正領域のデータにより補正するために種々の方法を使用してきた。

これらの方法は加算法、乗算法、或いはこれら加算法、乗算法の組合せの何れか として要約することができる。全ての方法は製造な際の較正領域の特性化に依存 するため、分析時に測定されたる差異せ測定領域からのデータの補正に使用する ことができる。

最も簡単な方法は較正領域を使用して切り捨て値を直接法めることである。しか し、提案した全ての例でこれが出来る訳ではないので、切り捨て値を高低の漸近 線から計算しても良い。

Ｃつ ＦＩＧ、１０ａ ＦＩＧ、１０ｂ ＦＩＧ、１３ ＦＩＧ、１５ ＬＯＧ濃度　ｎｇ／ｍｌ 補正書の写しく翻訳文）提出書 （特許法１８４条の８） 平成５年５月２４日

Claims (13)

【特許請求の範囲】
1. １．試料内の配位子の分析方法であって、ｉ）採用する分析技術に適した不動化 試薬（「測定試薬」）を担持する面（「測定面」）と接触させて試料を、希望す るのであれば一つ或いは複数の補助試薬と共に恒温保持することにより、試料内 に配位子が存在すれば、前記測定試薬及び配位子及び／或いは（存在すれば）前 記補助試薬との複合体の形成で試料内の（存在すれば）配位子の量の第１の関数 となる検出可能な信号を発生させ；ｉｉ）それと同時に或いはそれに引き続いて ，採用する分析技術に適した試薬（「較正試薬」）であってゼロでない信号を発 生させるか或いは前記配位子及び／或いは補助試薬と共に複合体を形成するよう な試薬が不動化された別の面（「較正面」）に、希望するのであれば一つ或いは 複数の補助試薬と共に、試料を接触させることにより、前記測定面上での複合体 の形成（或いは形成されていなければ配位子の存在によって形成されることにな る）に関与するものと同じ構造の結合部位の相互作用の結果かかる複合体を形成 させ、かかる複合体の形成により試料内の（存在すれば）配位子の量の第２の関 数となるか或いはその量から独立したゼロでない信号を発生させ； ｉｉｉ）オプションとして同時に或いは引き続いて、試料内の（存在すれば）配 位子の量の第３の関数となるか或いはその量から独立した信号（ゼロ或いはぜロ でない信号）を発生させる岳薬（「前記補助較正試薬」）が不動化された別の較 正面（「補助較正面」）に、希望するのであれば一つ或いは複数の補助試薬と共 に、試料を接触させ；ｉｖ）前記測定面、前記較正面、及び存在する場合には前 記補助較正面から生じる信号を、採用する分析技術に適した方法で監視して、分 析対象の配位子が試料内に存在するか否か及び／或いはどの程度存在するかを適 切なアルゴリズムを使用して判断する；各工程からなる、分析方法。
2. ２．前記工程ｉ）において、前記測定試薬（或いはオプションとして、該測定試 薬と予め複合されているか或いは該測定試薬を含む複合体を形成可能な補助試薬 ）は分析対象の配位子に特異の結合パートナであり、前記工程ｉｉ）において、 補助試薬として配位子アナログが存在すると共に、較正試薬（或いはオプション として、該較正試薬と予め複合しされているか或いは該較正試薬を含む複合体を 形成可能な補助試薬）が分析対象の配位子に特異の結合パートナであり、前記工 程ｉｉｉ）において、ａ）前記補助較正試薬及び補助試薬は前記工程ｉｉ）で限 定した前記較正試薬及び補助試薬にそれぞれ等しいか、ｂ）分析対象の配位子と は異なる配位子が補助試薬として存在すると共に、前記補助較正試薬（或いはオ プションとして、該補助較正試薬と予め複合されているか或いは該較正試薬を含 む複合体を形成可能な補助試薬）が分析対象の配位子とは異なる配位子に特異の 結合パートナであるか、或いはｃ）前記補助較正試薬は分析対象の前記配位子に 対して非特異の結合パートナであることを特徴とする、請求の範囲第１項記載の 分析方法。
3. ３．前記分析は競合分析であって、 前記工程ｉ）において、ａ）補助試薬として配位子アナログが存在すると共に、 前記測定試薬（或いはオプションとして、該測定試薬と予め複合されているか或 いは該測定試薬を含む複合体を形成可能な補助試薬）が分析対象の前記配位子に 特異の結合パートナであるか、或いはｂ）分析対象の配位子に特異のオプション として標識化された結合パートナが補助試薬として存在すると共に、前記測定試 薬（或いはオプションとして、前記測定試薬に予め複合されているか或いはその 測定試薬を含む複合体を形成可能な補助試薬）が配位子アナログであり、前記工 程ｉｉ）において、ａ）配位子アナログが補助試薬として存在すると共に、前記 較正試薬（或いはオプションとして、該較正試薬と予め複合されているか或いは 該較正試薬を含む複合体を形成可能な補助試薬）が分析対象の配位子に特異の結 合パートナであるか、ｂ）或いは分析対置の配位子に特異のオプションとして標 識化された結合パートナが補助試薬として存在すると共に、前記較正試薬（或い はオプションとして、該較正試薬と予め複合されているか或いは該較正試薬を含 む複合体を形成可能な補助試薬）が配位子アナログであるか、或いはｃ）前記較 正試薬は補助試薬の存在を必要とせずに所望のゼロでない信号を発生させ前記工 程ｉｉｉ）において、ａ）前記補助較正試薬及び補助試薬は前記工程ｉｉ）で限 定した較正試薬及び補助試薬にそれぞれ等しいか、或いはｂ）分析対象の配位子 とは異なるオプションとして標識化された配位子が補助試薬として存在すると共 に、前記補助較正試薬（或いはオプションとして、該補助較正試薬と予め複合さ れているか或いは該補助較正試薬を含む複合体を形成可能な補助試薬）が分析対 象の前記配位子とは異なる配位子に特異の結合パートナであるか、或いはｃ）前 記補助較正試薬が補助試薬（存在すれは）に非特異の結合パートナであるか、或 いはｄ）前記補助較正試薬が補助試薬の存在を必要とせずに所望のゼロ信号を発 生することを特徴とする、請求の範囲第１項記載の分析方法。
4. ４．前記分析はサンドイッチ分析であり、前記工程ｉ）において、分析対象の配 位子に特異のオプションとして標識化された結合パートナが補助試薬として存在 すると共に、前記測定試薬（或いはオプションとして、該測定試薬と予め複合さ れているか或いは該測定試薬を含む複合体を形成可能な補助試薬）が分析対象の 前記配位子に特異の別の結合パートナであり、その結合パートナは前記オプショ ンとして標識化された特異の結合パートナの向けられたエピトープとは異なる分 析対象の配位子のエピトープに向けられ、前記工程ｉｉ）において、ａ）前記較 正試薬（或いはオプションとして、該較正試薬と予め複合されているか或いは該 較正試薬を含む複合体を形成可能な補助試薬）が分析対象の前記配位子に特異の 結合パートナであり、分析対象の前記配位子に特異のオプションとして標識化さ れた結合パートナが補助試薬として存在すると共に、オプションとして標識化さ れた特異の結合パートナと予め複合した分析対象の配位子が既知量更に別の補助 試薬として存在するか、或いはｂ）分析対象の配位子に特異のオプションとして 標識化された結合パートナが補助試薬として存在すると共に、前記較正試薬（或 いはオプションとして、該較正試薬と予め複合されているか或いは該較正試薬を 含む複合体を形成可能な補助試薬）が不動化された特異結合パートナに予め複合 した既知量の分析対象配位子であるか、或いはｃ）前記較正試薬が補助試薬の存 在を必要とせずに所望のゼロでない信号を発生させ、 前記工程ｉｉｉ）において、ａ）前記補助較正試薬及び補助試薬は前記工程ｉｉ ）で限定した前記較正試薬及び補助試薬とそれぞれ等しいか、或いはｂ）分析対 象の前記配位子とは異なる配位子が補助試薬として存在すると共に、前記較正試 薬（或いはオプションとして、該較正試薬と予め複合されているか或いは該較正 試薬を含む複合体を形成可能な補助試薬）が分析対象の配位子に特異なオプショ ンとして標識化された結合パートナであるか、或いはｃ）前記補助較正試薬が補 助試薬（存在すれば）に非特異のオプションとして標識化された結合パートナで あるか、或いはｄ）前記補助較正試薬が補助試薬の存在を必要とせずに所望のゼ ロ信号を発生させることを特徴とする、請求の範囲第１項記載の分析方法。
5. ５．前記工程ｉｖ）において、監視される前記信号は蛍光、燐光或いは冷光信号 であることを特徴とする、請求の範囲第１乃至４項の何れかに記載の分析方法。
6. ６．前記分析は免疫学的分析であることを特徴とする、請求の範囲第１乃至５項 の何れかに記載の分析方法。
7. ７．請求の範囲第１乃至６項の何れかに記載の分析方法に使用するのに適したバ イオセンサ装置であって、該装置は請求の範囲第１項に限定した測定面及び較正 面と、オプションとして、請求の範囲第１項に限定した一つ或いは複数の補助較 正面とよりなる、バイオセンサ装置。
8. ８．前記装置は毛管フィル装置であることを特徴とする、請求の範囲第７項記載 のバイオセンサ装置。
9. ９．前記装置は一つ或いは複数のキャビティを有する、配位子の分析に使用する ための特に反応性の高い試料の収集及び試験装置であり、前記キャビティの１つ の面は互いに離隔した３つのゾーンＩ、ＩＩ及びＩＩＩを有し、これら各ゾーン は所望の分析に適した離脱可能な試薬からなる層を担持し、前記面は透明な材料 で形成された第１固体プレートの面であり、該第１固体プレートに対向する前記 キャビティの壁部は透明な材料より形成されて光透過性の導波管として機能する 第２プレートからなり、該第２プレートの前記キャビティに隣接する面は前記ゾ ーンＩ、ＩＩ及びＩＩＩにそれぞれ対応して配向させられた３つのゾーンＩＶ、 Ｖ及びＶＩを有し、これら各ゾーンＩＶ、Ｖ及びＶＩは第１の分析に適した不動 化試薬よりなる層を担持することを特徴とする、請求の範囲第７或いは８項の何 れかに記載のバイオセンサ装置。
10. １０．前記第１プレートは前記キャビティから離れた面に光吸収材料或いは不透 明材料の層を担持することを特徴とする、請求の範囲第９項記載のバイオセンサ 装置。
11. １１．前記装置は更に一対或いは複数対のゾーンを有し、これら対をなすゾーン のうちの一対の一方の部材は請求の範囲第１項に限定した補助較正面に対応する ことを特徴とする、請求の範囲第９或いは１０項の何れかに記載のバイオセンサ 装置。
12. １２．請求の範囲第９項記載の装置の製造方法であって、（ａ）多数の前記装置 の一部を提供するシート材の表面に、前記ゾーンＩ、ＩＩ及びＩＩＩにより担持 される適切な試薬のバッチの列を形成し；（ｂ）別の構造体の表面に、適切な場 合には特に反応性の高い種の不動化も含めて、前記ゾーンＩＶ、Ｖ及びＶＩに担 持される適切な試薬のパッチの列を形成し、適切な試薬の前記層と接触させて或 いは容積の試料液体を収集・保持すべく、前記別の構造体及び前記シート材によ り、前記多数の装置のそれぞれに好ましくは毛管作用をなす寸法のキャビティを 提供し； （ｃ）前記シート材を、それぞれが一つ或いは複数の前記試料収集及び試験装置 を提供する複数の部分に分離する；各工程よりなる製造方法。
13. １３．請求の範囲第７乃至１１項の何れかに記載の装置と、適切な補助試薬とよ りなり、請求の範囲第１乃至６項の何れかに記載の分析方法を実行するためのキ ット。