JPH06502729A

JPH06502729A - 放射性標識化合物の配合物

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Publication number: JPH06502729A
Application number: JP5515158A
Authority: JP
Inventors: プライス，ロジャー・マルコム; メイ，クリストファー・チャールズ; バックリー，エリザベス・マーガレット; ストーン，ティモシー
Original assignee: アマーシャム・インターナショナル・ピーエルシー
Priority date: 1992-04-30
Filing date: 1993-04-27
Publication date: 1994-03-24
Anticipated expiration: 2015-12-18
Also published as: DE69301300D1; EP0594837A1; ES2081717T3; DE69301300T3; DK0594837T3; AU4266593A; WO1993022260A1; JP3117719B2; CA2105402C; DK0594837T4; CA2105402A1; AU655548B2; ES2081717T5; US5494654A; EP0594837B2; DE69301300T2; ATE132842T1; EP0594837B1

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】放射性標識化合物の配合物放射性化学物質の自己放射線分解は、製造業者および利用者にとって常に同様に問題となっている。保存寿命は、個々の化合物または同位体に最適な貯蔵温度および物理的分散法を採用するにもかかわらず、数週間程度である場合がある。

この主題については、Ｒｅｖｉｅｗ　１６、放射性化学物質の自己分解、アメルノヤム・インターナ／ヨナル社、アメルンヤム、に論じられている。

放射性不純物の形成を最小限に抑えることにより保存寿命を延長するために、かつ有効性を改善するために放射性化学物質に添加しうる、一般に利用される添加物があれば、経済的かつ科学的に多大な価値があるであろう。安定化された放射性化学物質の利用者はより長期間にわたって実験を行うことができ、同一放射性化学物質のバッチ間でより一致した結果を得ることができ、かつより緩和な貯蔵条件を採用することができるという利点を得るであろう。その添加物は、放射性化学物質を実験系に、たとえば蛋白質または核酸の操作に用いる際に行われるプロセスに対する妨害が最小限であるか、またはそれと親和性でなければならない。

米国特許第４．３９０，５１７号明細書には、広範な可溶性の第一、第二および第三アミンを放射性標識化合物の安定剤として用いることが教示されている。

米国特許第４．４１１．８８１号明細書には、チオカルボニル化アミンを安定剤として用いることが教示されている。

米国特許第４．４５１，４５１号明細書には、４−アミノ安息香酸をテクネチウム−９９ｍ含有組成物に酸化防止剤として用いることが教示されている。

米国特許第４，７９３．９８７号明細書には、広範などリジンカルボン酸を安定剤として用いることが教示されている。

３２−Ｐ放射性標識ヌクレオチドはしばしば緩衝化された水溶液として市販され、ドライアイス中で輸送され、利用者が一２０℃で貯蔵するものとして市販される。放射性標識ヌクレオチドを周囲温度で供給し、かつ凍結しない形で貯蔵しうるならば、輸送業者および利用者の双方にとって著しく有利であろう。

放射性標識ヌクレオチドその他の有機化合物の溶液は、一般に無色で市販されている。着色溶液があれば、操作に際して溶液がより見えやすいので有利であろう。ただし適切な色素は、放射性標識有機化学物質を用いるいかなるプロセスをも妨害しないことが必要である。

１観点においては、本発明はβ線放出型の放射性核種で標識した有機化合物であって放射性標識した該有機化合物が貯蔵および輸送に際して放射線分解を生じるもの、ならびにトリプトファン、バラ−アミノベンゾエート、インドールアセテート、ルミノール、および互いに直結した少なくとも２個の環窒素原子を含む５員環を有する化合物である一群のアゾールから選ばれる安定剤を含む組成物を提供する。

他の観点においては、本発明はβ線放出型の放射性核種で標識した有機化合物および色素の溶液を含む組成物を提供する。

本発明は主として、溶液、一般に水溶液、またはこれより一般的ではないが親水性有機溶剤中の溶液として供給、輸送および貯蔵される放射性標識した有機化合物に関するものである。本発明は、固体状態の組成物、たとえば液体組成物を凍結乾燥その他の方法で乾燥させることにより調製されたものをも包含する。本発明は、自己放射線分解する放射性標識した有機化合物、たとえばアミノ酸、ステロイド、脂質、脂肪酸、ペプチド、炭水化物、蛋白質、ならびに特にヌクレオチド、チオヌクレオチド、ヌクレオシドおよび核酸に利用することができる。

β線放出型の放射性核種の性質は決定的なものではない：３−Ｈおよび１４−Ｃも可能であるが、３２−Ｐ、３５−８および３３−Ｐが好ましい。

安定剤は好ましくは下記より選ばれる：Ｌ−およびＤ−トリプトファン：パラ− アミノベンゾエート、この語は遊離酸ならびにそれらの塩類およびエステルを含めて用いられる：インドールアセテート、この語は遊離酸ならびにそれらの塩類およびエステルを含めて用いられる。ルミノール（３−アミノフタルヒドラジド）：ならびに互いに直結した少な（とも２個の環窒素原子を含む５員環を有する化合物であるアゾール類。これらの化合物は好ましくは下記の構造式を有する。

この構造式は２個の理工重結合を含み、式中の−ｘＳｙおよびＺのうち１個もしくは２個はＮを表すか、またはＸ、ＹおよびＺのうち１個はＳを表し、残りのＸ、ＹおよびＺはＣを表し、−ＲＩ、　Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４およびＲ５が存在する場合、それらはそれぞれ環に直結した、もしくは最高１０個の炭素原子の連鎖を介して結合した一０Ｈ１−３Ｈ。

−Ｈｌ−ＣＯｏＨｌ−ＮＨ２、−ＣＨ，を表すか、またはＲ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４およびＲｓのうち２個の隣接量子が一緒に芳香環を構成してもよい。

Ｘ、ＹおよびＺの性質、ならびに２個の理工重結合の位置に応じて、Ｒ１，Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４およびＲ５が存在するか、または存在しないことは理解されるであろう。

考慮されるアゾール化合物類の例は下記のものである。

これらアゾール類のうち考慮される化合物は実施例に示したものである。安定剤の濃度は、放射性標識有機化合物の放射線分解を減少させるのに十分であり、一方では放射性標識有機化合物が用いられる反応系を本質的に妨害するほど高くないものである。液体組成物において好ましい濃度は１ｍＭないし１Ｍ、特に１０ −１００ｍＭである。これらの濃度で使用した場合、好ましい化合物は特にヌクレオチドにとって有効な安定剤であることが認められた。

色素は、好ましくはスルホローダミンＢ、キシレンサイアノール、アゾカルミンＢおよび二ニー・コクシン（Ｎｅｗ　Ｃｏｃｃｉｎｅ）から選ばれる。使用しうる他の色素には下記のものが含まれるニオレンジＧ、タルドラジン、サフラニン０、メチルグリーン、ブロモフェノールブルー、エオシン、エバンスブルー、ブリリアントブルー６１ブロモクレゾールグリーン、ポンソーＳ１カルモイシンレツド、レマゾールレッドＲＢ、サンドブラック、サンドバイオレット１、サンドブリリアントグリーン、レマゾールゴールダンイエロー、レマゾールレッドＢ１アシッドレッド４０、アシッドアリザリンバイオレットＮ１ノルダンドブラウン６、およびＢＰＢＤＴＣ（３，３’　−（４，４’−ビフェニレン）−ビス（２゜５−ジフェニル−２Ｈ−テトラゾリウムクロリド）。色素の濃度は、溶液を見える程度に着色するが、放射性標識有機化合物が導入される反応系を本質的に妨害するほど高くないものとすべきである。好ましい色素濃度は２０−３０００μ ｇ／ｍｌ、特に５０−４００μｇ／ｍｌ；すなわちほぼ（色素の分子量に応じて）３Ｘ１（ｌ’−６Ｘ１０−３ｍｏｌ／Ｌ特に８ｘｌＯ−’−ＩＸＩＯ−３ｍｏ１／１である。これらの濃度において色素は、着色するほかに実際には緩和な安定化効果をもつ。しかしこれらの色素を含有する組成物の色は経時的に消失する。これは恐らく色素の環構造の二重結合が放射線分解することによるものであろう。この退色は組成物を無効にはしないが、それにもかかわらず不都合である。

本発明に用いられる好ましい安定剤および色素の構造式を、それぞれ表１および２に挙げる。

本発明の他の好ましい観点によれば、放射性標識有機化合物の組成物は色素および安定剤の双方を含む。安定剤は色素が退色するのを防止するのに役立つ。色素は放射性化学物質の可視性を改良する。色素および安定剤は相乗的に作用して、放射性標識有機化合物の安定性を改良すると思われる。

本発明の組成物は緩衝剤を含有しうる。緩衝剤の性質は本発明にとって決定的なものではないが、２−メルカプトエタノールまたはジチオトレイトールにより安定化された水性緩衝液からなる、標準的な市販のヌクレオチド用希釈剤が好ましい系である。これらは後記の実施例において用いた系である。しかし他の系を試験して、同等に有効であることが示された。

放射性標識ヌクレオチドその他の有機化合物は、一般に一２０６Ｃ以下で輸送および貯蔵され、ドライアイスの使用を必要とする。本発明による好ましい組成物は、４°Ｃ（氷上）、またはより好ましくは周囲温度での輸送および貯蔵に適している。

実験以下の実施例において各種の組成物を調製し、安定性につき試験した。表に示した若干の実験データは３２−Ｐで標識したｄＣＴＰのバッチについてのものであるが、安定剤を他の３２−Ｐα標識ヌクレオチドｄＡＴＰ、ｄＧＴＰおよびｄＴＴＰについても試験した。これらの安定剤の試験は３２−Ｐγ標識ＡＴＰおよび３２−８標識ｄＡＴＰについても実施された。３２−Ｐの半減期は１４．３日であるが、市販のバッチは一般に販売の翌週の金曜日を基準日としている。従って安定性試験は利用者の使用期間を概算して２１日間実施された。３−Ｈ，１４− Ｃおよび３３−Ｐで標識した各種の化合物の安定性も調べた。

試験結果はすべて、対照配合物、すなわち上記の希釈剤に基づ（同一バッチからのものであって、さらに安定剤または色素を添加せず、室温または＋４℃または一２０℃で貯蔵したものと比較したヌクレオチドの絶対取込み率として表される。

ヌクレオチドの安定性につき各種の試験を行ったニ一種々の期間貯蔵したのち、薄層クロマトグラフィープレートを用い、次いでこれをレイチクＲＩＴＡスキャナーにより走査することによって、標識ヌクレオチドの放射化学的純度を測定した。これをＲＣＰとして報告する。

−各種の核酸アッセイ法および操作法における配合物を試験した：Ｔ７、ＴａｑおよびクレノーＤＮＡポリメラーゼ酵素を用いるサンガージデオキシ配列決定法、ランダムプライマーおよびニックトランスレーションによるＤＮＡの標識反応 −−ファージλおよびヒトゲノムプローブの双方、たとえばｒａｆ−１およびＮ　−ｒ　ａ　ｓにつきｍ−、ならびにプローブのＰＣＲ標識。上記により得たプローブを単一コピー検出のためのゲノムハイブリダイゼーションおよびコロニースクリーニングに用いた。３′末端テイル形成および５′末端標識をも行い、後者には特に３２−Ｐγ標識ＡＴＰを用いた。

採用した他の技術は、ｃＤＮＡ第１鎖合成および蛋白質リン酸化であった。

これらより、ランダムプライマーによるプローブ形成（アメルシャム・インターナショナル・マルチプライムキット反応：アメルシャムキットＲＰＮ　１６００、ファインバーブおよびフォーゲルスタイン（Ｆｅｉｎｂｅｒｇ、　Ｖｏｇｅｌｓｔｅｉｎ）　Ａｎａｌ、　ＢｉｏｃｈｅＩｌｌ、　１３２．６−１３（１９８３）、およびアデンダム（＾ｄｄｅｎｄｕｍ）　Ａｎａｌ、Ｂｉｏｃｈｅｍ、１３７．２６U −２６７（１９８４）に基づく）を、放射性標識有機化合物の安定性およびｄＮＴＰに対する活性についてのストリンジェントかつ代表的な試験法を提供するものとして選択した：３２−Ｐγ標識ＡＴＰについては５′末端標識法を主な試験法として選択した。

以下の実施例においてＲＣＰは試料の放射化学的純度を表し、ＭＰはアメルシャム・インターナショナル・マルチプライムキットにおいてランダムプライマーによるＤＮＡ標識法を採用して得た取込み率％を表す。

ＳＢ、ＸＹ、ＡＢおよびＮＣはそれぞれスルホローダミンＢ１キシレンサイアノール、アゾカルミンＢおよびニュー・コクシンである。ｐＡＢＡはバラ−アミノベンゾエートである。ＩＡＡはインドール酢酸である。２ＭＥは２−メルカプトエタノールであり、ＤＴＴはジチオトレイトールである。

貯蔵条件＋４０／ＲＴ／＋４は、ヌクレオチドを＋４０℃で２４時間、次いで室温で（ＲＴ；２１−２４°Ｃ）４８時間貯蔵したのち、残りの試験期間を＋４℃ で貯蔵したことを示す。

対照試料は、アメルシャム・インターナショナルが現在市販しているヌクレオチド配合物にさらに安定剤または色素を添加しないものからなる。

実施例１−８実施例１−８においては、３２−Ｐ標識ヌクレオチド（ｄＣＴＰ）を比活性３０００Ｃｉ／ｍｍｏ　ｌおよび濃度１０ｍＣ１／ｍｌで用いた。試験には１ｍＣｉのロットを用いた。特に指示しない限り、用いた配合物は２−メルカプトエタノールで安定化した水性緩衝液である希釈剤であった。

実施例１種々の濃度の安定剤を含有する配合物につき試験した。すべての安定剤が良好に作用した。

試料　貯蔵　８日目　１５日目　２２日目ＲＣＰ　ＭＰ　ＲＣＰ　ＭＰ　ＲＣＰ　ＭＰ対照　＋４０７Ｒτ／＋４−　１　２１　−　１２　０Ｌ−）リブト７ア７２５ｍＭ　＃　７０　５４　７８　−　６９　６０ｐＡＢＡＮａ５０ｍｊｌ　７９　７３　７７　−　７９　６６ｐＡＢ＾　５ｈＭ　８０　７１　８２　−　７９　７０ＩＡＡ５０１１ｏＭ　８１　７４　８３　−　７７　６４実施例２２種類の色素スルホローダミンＢおよびキシレンサイアノールを含有する配合物を調製し、種々の温度の貯蔵条件下で試験した。両方の色素とも＋４℃では安定化効果が小さいように思われる。

試料　貯蔵　７日目　１４日目　２３日目ＲＣＰ　ＭＰ　ＲＣＰ　ＭＰ　ＲＣＰ　ＭＰ対照　−２０℃　８７　６８　７９　６５　８２　６７ＳＢ　４００μｇ／ｍｌ　＃８７　６１　８１　６５　８４　６９ＸＹ　’　７７　６０　７３　６４　７４　６０対照　＋４０／ＲＴ／＋４　１３　１１　６　０　０　０５８４００ｍｇ／ｍｌ　＃３５　３５　１５　９　０　０ＸＹ　’　２９３０１６　５　０　０普通の濃度５ＱｍＭの安定剤ｐＡＢＡ　Ｋ、および色素ニュー・コクシンを含有する配合物につき試験した。これらの色素は最終モル濃度３．５ｘ　１０−４ｒｎｏｌ／１　（２００μｇ／ｍｌのスルホローダミンＢに相当）で用いられた。

色素の強固さくｒｏｂｕｓｎｅｓｓ）を試験するために、貯蔵は表に示すように室温、３７℃、または４２−４５℃で１．２または３日間行われた。この期間ののぢ、すべてのポットを残りの試験期間中＋４℃で貯蔵した。

試料　貯蔵　０週目　１週目　２週目　３週目ＲＣＰ　ＭＰ　ＲＣＰ　ＭＰ　ＲＣＰ　ＭＰ　ＲＣＰ　ＭＰ対照　−２０℃　９５　８８　９１　８２　９１　９１　−　７３対照　＋４０／ｌ？Ｔ／＋４　８９　８０　９４　５７　９５　６６　−　１２ＮＣ＋ｐＡＢＡＫ　７２ＨＲ３＠ＲＴ　９２　７５　９３　７１　７６　７６　−　−２４１（Ｒ３＠３７　９７　７２　９１　８２　８２　８３　−　７４４８ＨＲ３＠３７　９２　６４　９２　８３　９１　８２　−　６４７２　［ＴＲ３・３７　７９　７３　９４　８３　９４　７９　−　−２４ＨＲ３＠４２　８９　７５　９４　ｇｌ　９０　７９　〜　３６４８ＨＲ５＠４２　９２　８１　９３　７６　９１　６９　−　〜７２［（Ｒ３＠４２　９６　７７　７７　８１　９１　７６　−　一実施例４アゾカルミンＢについてはマルチプライムアッセイ法によるＲＣＰおよび取込み率％をも測定した。実験の詳細は実施例３の場合と同様である。色素は最終モル濃度３．５ｘ１０”ｍｏ　Ｉ／Ｉで用いられた。

試料　貯蔵　０週目　１週目　２週目　３週目ＲＣＰ　ｉｌＰ　ＲＣＰ　ＭＰ　ＲＣＰ　ＭＰ　ＲＣＰ　ＭＰ対照　−２０℃　９３　８９　８８　８２　９３　９１　−　７１対照　＋４０／ＲＴ／＋４　９３　８８　６４　５８　７３　３９　−　４ＡＢ＋ｐＡＢＡＫ　７２ＨＲ３＠ＲＴ　９１　７９　８９　８６　８１　７４　−　−２４ＨＲ３＠３７　９１　８８　９３　８３　８９　８１　− 　７６４８ＨＲ８＠３７　９３　７７　９２　８０　９１　７７　−　６６７２ＨＲ３＠３７　９３　８１　９２　７３　９３　６９　−　−２４ＨＲ３＠４２　９４　７３　９３　７６　９１　７１　−　７８４８ＨＲ３＠４２　９０　８２　９３　８１　９３　７８−　−２種類の異なる色素および２種類の異なる安定剤を含有する配合物につき試験した。両方の色素とも４００μｇ／ｍｌの濃度で用いられた。Ｌ−１−リブトファンおよびｐ−アミノ安息香酸カリウムはそれぞれ２５ｍＭおよび５ＱｍＭの濃度で用いられた。

試料　貯蔵　８日目　１５日目　２１日目ＲＣＰ　ＭＰ　ＲＣＰ　ＭＰ　ＲＣＰ　ＭＰ対照　＋４０／ＲＴ／＋４　１２　２　６　１　３　１ＳＢ４００＋＋ｇ／ｍｌ＋ＬＴｒｙｐ　＃７１　４８　６６　４９　６１　３４ＳＢ　４００μｇ／ｍｌ＋ｐＡＢＡＫ　Ｉ７６　５２　６７　５３　６６　４１ＸＹ４００ｇｇ／ｍｌ＋ＬＴｒｙｐ　□　７５　６７　６２　５８　５５　４０安定剤の強固さを試験するために、５ＱｍＭのｐＡＢＡ　Ｋ”を含有する配合物を室温、３７℃、または４２−４５℃で１．２または３日間貯蔵した。

対照以外のすべての条件が５０ｍＭのｐＡＢＡ　Ｋを含有する。

安定化されていない対照（全体を通じて一２０℃に保持された）以外のすべての条件については、表に示すように高められた温度での期間ののち、残りの試験期間は＋４°Ｃで貯蔵された。

試料　貯蔵　７日目　１４日目ＲＣＰ　ＭＰ　ＲＣＰ　ＭＰ対照　−２０℃　８９　８５　８６　７８ｐＡＢＡＫ　２４ＨＲＳ＠ＲＴ　８６　７３　８４　７５＃４８ＨＲ５＠ＲＴ　８６　７１　８３　７４＃７２ＨＲ５＠Ｒ７８５７４８３７２＃２４ＨＲＳ＠３７　８７　７１　８３　７４＝　４８ＨＲ５＠３７　８８　６９　８３　７３−　７２ＦＩＲ５＠３７　８６　８３　８３　７３−　２４ＨＲＳ＠４２　８６　７１　８３　７２＃４８ＨＲＳ＠４２　８６　７９　８４　７２種々の濃度のスルホローダミンＢを色素として、およびバラ−アミノ安息香酸（カリウム塩）を安定剤として、ならびにこれら両者の組み合わせを種々の濃度で含有する配合物につき試験した。

試料　貯′ｉａ　７日目　１５５日目　２２日目ＲＣＰ　ｉ［Ｐ　ＲＣＰ　ＭＰ　ＲＣＰ　ＭＰ対照　−２０℃　８４　７４　６７　６７　７５　６３２０ｍＭｐＡＢＡＫ　＋４／ＲＴ／＋４　８３　６８　７１　５９　６８　４９４０　＃８６　６７　８４　６４　７８　５４５０　Ｉ８９　６９　８６　７０　ｇｌ　６２５０μｇ／１ＩｌｌｓＢ　２０　８　７　１　０　０１００　’　２３　１０　６　１　０　０２００　＃３０　１８　１０　４　−　０２０ｍ１ｌ　ｐＡＢＡＫ／１５０μｇ／国ＩＳＯ’　７３　６０　６８　５７　６６　５１１００　’　７４　６２　７１　５７　６６　５２２００　＃７３　５６　６９　５１　６２　５１４００　’　７８　６５　７７　５４　６７　５４３０ｍＭｐＡＢＡＫ／１５０μｇ／＋ｏｌＳＢ　１８５　６８　７５　６４　７２　５６１００　’　８３　７０　７７　８３　７１　６８２００　＃７７　６６　７１　７５　７０　５７４００　’　８０　６７　７６　６７　７５　５９４０ＩＩＩＭｐＡＢＡＫ／１５０ｍｇ／ｍ１ｓＢ　’　７９　６８　７８　６３　７９　６０ｔｏｏ　＃８４　６５　７８　６２　７７　５８４００　”　８６　６７　８４　６５　７９　６３５０ｍＭｐＡＢＡＫ／１５０ｇｇ／ｍ１ｓＢ　・８８　７１　８７　６３　８３　６３１００　’　８８　６９　８５　６４　８１　６６２００　’　８６　７２　８７　６３　８１　６８４００　’　８７　７５　８６　６５　８１　６７および含有しない配合物を調製した。

ＳＢ４Ｏ０１１ｇ／ｍｌ／１５０ｄＬＴＲＹＰ　’　７０　４５　ｇ２　−　７３　６３’　／１５０ｍ１ｉｐＡＢＡＮａ　’　７９　７２　８８　−　７８　７２’　／１５０ｍＭｐＡＢＡＫ　Ｉ８３　７３　８８　−　８０　７２ＬＴＲＹＰＴＯＰＥＩＡＮＯＮＬＹ　７０　５４　７８　−　６９　６０間貯蔵された。すべての試料が２０ｍＭジチオトレイトール（ＤＴＴ）を含有していた。

試料　２週目　４週目　８週目　１４週目ＲＣＰ　ＭＰ　ＲＣＰ　ＭＰ　ＲＣＰ　ＭＰ　ＲＣＰ　ＭＰ対照−２０℃　９２　７２　９１　７４　９１　７７　８７　６１３−アミノ−５−メルル升トリアゾール　９２　６７　９１　７３　８９　７８　８８　５３２−アミノ−１，３，４−チアノアゾール　８７　７２　８４　７４　８１　７４　７５　６１２．５−ノメルカブトー１．３．４−チアノアゾール　９２　６２　９０　８０　９０　７７　８７　４７４−メチル−４Ｈ−１，２，４−トリ了ゾールー３−チオール　９１　６６　８８　７９　９１　７２　８３　４３３．５−ノアミノ−１，２，４−）り了ゾール　８１　７３　８４　７５　８３　７３　６５　５３３−アミノヒラゾール　８８　７３　８７　７０　８５　７８　７１　５３５−アミノ−１，３，４−チアノアゾール− ２−チオール　９２　７９　９２　７９　９４　８８　７１　７０３−アミノ− ５−ヒトＯキノピラゾール　８４　７１　８４　７１　８３　７５　７２　６３ＩＨ−１，２，４−チアゾール−３−チオール　９１　７０　９１　７３　８９　８１　９０　７８５−メルカプトトリアゾール（Ｎａ”）２Ｈｚ０　９１　７３　９１　７８　８９　７８　８６　５５ｐ−７ミノ安息香酸（Ｋつ　７９　６０　８１　６９　６６　６６　５８　４０５−メルカプト−１−テトラゾール酢酸（Ｎａ”）　９１　７５　８６　８０　７８　７０　５３　４０５−メルカプト−１−メチルテトラゾール　８９　７３　８４　６５　７８　７０　６５　３７すべての配合物において安定化が認められた。

実施例１０実施例９の安定剤を３２Ｐ　ｄＣＴＰ標識ヌクレオチドについても試験した。

これらも使用濃度５０ｍＭで用いられた。ｄＣＴＰの放射能濃度は１０ｍＣ１／ｍ１であった。すべての試料が５ｍＭの２−メルカプトエタノールを含有していた。貯蔵条件は、−２０℃の対照以外は＋４０／ＲＴ／＋４であった。

試料　６日目　１４４日目　２１日目ＲＣＰ　ＭＰ　ＲＣＰ　ＭＰ　ＲＣＰ　ＭＰ対照　−２０℃　７９　７１　８０　６８　７９　７０３−了ミノー５−メルカプトトリアゾール　７７　７０　７６　６８　７６　６６　−ｐＡＢＡ　Ｋ”″　７８　６５　７６　６３　７１　６１２−アミノ−１，３，４−チアノアゾール　７３　６０　６５　５８　６８　５１２．５−ノメル６７）−１，３，４−チアノアゾール　７９　７４　７８　６７　７９　６５４−メチル−４Ｈ−１，２，４−トリアゾール−３−チオール　７８　７５　７８　７７　７９　６９３．５−ノアミノ−１，２，４１リアゾール　７８　７２　７６　７３　７４　６５５−メルｈブドー１−テトラゾール酢酸（Ｎａつ　８１　６９　７３　６８　７３　６５５−メルカ升−１−メチルテトラゾール　７５　７０　７７　６６　７１　７０３−アミノピラゾール　７６　７３　７６　６５　７４　６３５−アミノ−Ｌ　３．４−チアジアゾール −２−チトル　７２　８３　７８　７０　７４　６６３−アミノ−５−七ドロキンピラゾール　６９　７６　７４　６４　６８　５８１１１−１．２．４−）リアゾール−３−チオール　７６　７２　７８　７２　７８　６４５−メルル升トリアゾール（Ｎａ”）２ｔｌｚＯ７５７１７８６８７６６７上記の結果は、これらの化合物が溶液中でヌクレオチドの安定化活性を示した試験し、この場合も使用濃度５ＱｍＭで用いた（使用濃度４５ｍＭで用いたルミノール以外）。

試料　８日目　１６６日目　２３日目ＲＣＰ　ＭＰ　ＲＣＰ　ＭＰ　ＲＣＰ　ＭＰ対照−２０℃　９０　５０　８８　５２　８３　４９ｐＡＢＡＫ”　８７　４４　８２　３３　７８　３１５−メチル−ＩＨ−ベンゾトリアゾール　８０　４０　７１　３９　６７　４８３−アミノ−４−ピラゾールカルボン酸　８４　４５　８１　４２　７５　４７３−アミノ−５−メルカプトトリアゾール　８７　４１　８８　４０　８２　４フルミノール　８０　３９　８０　４４　７７　４７寓施例１２安定剤および／または色素を含有する配合物を、放射能濃度１０ｍＣ１／ｍｌのｄＡＴＰ　（α　３５−３）ヌクレオチド溶液につき試験した。表中の標識は、各試料中に存在する安定剤および／または色素を、それらの濃度を含めて示す。

貯蔵条件は、−２０℃の対照以外は＋４０／ＲＴ／＋４であった。

試料　２週目　４週目　８週目　１４週目ＲＣＰ　ＭＰ　ＲＣＰ　ＭＰ　ＲＣＰ　ＭＰ　ＲＣＰ　ＭＰ対照−２０℃　８２　６４　６５　４１　２２　２３　１５　１６対照＋４０／ＲＴ／＋４　５６　４５　０　０　０　０　０　０２０ｍＭＤＴＴ　９２　７１　９１　５２　７８　４３　６５　５０５Ｑ　ｍｌｌ　ｐＡＢ＾（Ｎａ”）　８８　７７　７７　４３　７６　４４　５４　４５２５　ｌＩＩＭ　トリ１）７Ｔ７　８６　７０　７８　５０　５９　３４　４１　３８２００ｕｇ／ｍ１ｓＢ　６４　５６　１７　７　０　０　０　０５０ｍＭｐＡＢＡ、２００Ｊｇ／ｍ１ｓＢ　８６　６９　７４　３１　６７　３４　４８　４２ＤＴＴ、　ｐＡＢ＾、ＳＢ　９１　６７　８８　３７　８６　４９　７９　４９２０　ｍＭ、　５０　ｍＭ、　２００　ｕｇ／ｍｌこれらの結果は、ＤＴＴＳｐＡＢＡ、トリプトファン、およびよりゎずがな程度ではあるがＳＢがすべて、３５ −８標識ヌクレオチドを安定化したことを示す。

色素および安定剤の組み合わせが可能であることが立証された。

安定剤を含有する配合物をｄＡＴＰ　（α　３５−８）について試験した。試料はすべてｐＨ１０，０であった。放射能濃度は１０ｍＣ１／ｍｌであった。存在する安定剤は、結果を示す表中に各試料につき指示される。貯蔵条件は＋４０／ＲＴ／＋４であった。Ａ〜ＩＰ＝３−アミノ−５−メルカプトトリアゾール。

試料　２週目　４週目　８週目　１４週目ＲＣＰ　ＭＰ　ＲＣＰ　ＭＰ　ＲＣＰ　ＭＰ　ＲＣＰ　ＭＰ２０　Ｊ　ＤＴＴ対照−２０℃　９４　５５　８９　７０　８１　６６　７８　６７５０ＩＩＩＭＡＭＴ、　９５　６８　９４　７６　９０　６０　８８　８４５０ｍＭＡＭＴ、　５０１ＩＩＭＤＴＴ　９３　５２　９４　７３　９２　６２　９１　８３５０ｍＭＡＭ７．２（１＋ＭＤＴＴ　９３　６４　９４　８４　９２　７０　９１　８４５０ｍＭＡＭ７．１００ｍＭ２ＭＥ　９５　６０　９４　７８　９２　７２　９３　８０５０ｍＭＡＭＴ、　４０ｍＭ２１１Ｅ　９４　５０　９３　７３　９２　７０　９０　７７２５ｍＭＡＭＴ、　９３　６７　９２　８１　８７　７０　８０　６９２５ｍＭＡＭＴ、　５０ｍＭＤＴＴ　９６　４４　９４　７８　９２　６８　９０　７７２５ｍＭＡＭＴ、　２０ｍＭＤＴＴ　９６　５３　９３　８５　９０　７５　８９　７５２５ｍＭＡＭＴ、　１００１１００１ｎ　９５　４５　９４　７２　９２　７６　９２　８３２５ｍＭＡＭＴ、　４０ｍＭ２ＭＥ　９５　５０　９２　８７　９１　７７　８９　８０適切な安定化を達成するために、３種の安定剤、すなわちアゾール、ＤＴＴおよび２−ＭＥを組み合わせて使用しうると推定しつる。アゾール系安定剤は他の安定剤が存在しない状態でも使用しうる。

実施例１４−２１実施例１４−２１は各種の放射性標識化合物についての安定剤の他の試験を示す。特に指示しない限り、安定剤は使用１度５ＱｍＭで用いられた。

実施例１４安定剤をｄＡＴＰ　（α　３５−８）につき試験した。試料はすべてｐＨ１０゜０であり、放射能濃度は１０ｍＣ１／ｍｌであった。すべての試料が２０ｍＭＤＴＴを含有していた。貯蔵条件は、−２０℃で貯蔵した最初の２対照以外は＋４０／ＲＴ／＋４であった。

試料　２週目　４週目　８週目　１４週目ＲＣＰ　ＭＰ　ＲＣＰ　ＭＰ　ＲＣＰ　ＭＰ　ＲＣＰ　ＭＰ対照−２０℃　９５　６１　９２　７６　９０　８２　９０　７６対照−２０℃　９３　５１　９１　７８　８７　８０　８７　７６対照＋４０／ＲＴ／＋４　９２　５３　５８　５６　４０　３９　３０　３８５−アミノ−１，３，４−チアノアゾール−２−チオール　９５　５５　９１　７２　９０　７１　８５　７６２〜アミノ−１，３，４−チアノアゾール　９２　５６　８８　７１　８５　７１　８５　７２４−メチル−４８−１，２，４−）リアゾール−３−子オール　９１　４９　８８　６３　８７　６４　９１　６ｇ３− アミノピラゾール　９３　５６　８５　７０　８５　７１　８８　７９安定剤をｄＡＴＰ　（α　３５−５）につき試験するために、他の実験を実施した。実験の詳細は実施例１４の場合と同様であった。

試料　２週目　４週目　８週目　１４週目ＲＣＰ　ＭＰ　ＲＣＰ　ＭＰ　ＲＣＰ　ＭＰ　ＲＣＰ　ＭＰ対照−２０℃　９３　６７　９０　７４　８８　７２　８９　７６対照−２０℃　９３　６５　９０　７６　８７　７７　８４　７４対照＋４０／ＲＴ／＋４　９０　６１　８３　７７　７５　７１　６２　６０５−アミノ−１，３，４−チアノアゾール−２−チオール　９３　５４　９０　７９　８７　６６　９０　７６４−メチル−４８−１，２，４−）り了ゾールー３−チオール　９３　４８　９１　７３　８８　６１　８８　７４３−アミノヒラノール　９１　６４　８７　７８　８３　７０　８０　８０３−７ミノヒラゾールー４−１＋１１１ボン酸　９１　６１　８６　８２　８３　７２　７９　８０３．５−ノアミノトリアメール　９０　５８　９０　７７　８４　７７　８２　７５２５　ｍＭ　）リブドアｒ７　９０　５１　９０　７４　−−　７０　７９　７４安定剤を３３−Ｐγ標識ＡＴＰにつき試験した。試料はすべて０．１％の２− メルカプトエタノールを含有していた。放射能濃度は５ｍＣ１／ｍｌであった。

−２０℃で貯蔵した１対照試料（温度サイクルなし）以外は、すべての試料が＋４℃に貯蔵された。

試料　６日目　１４４日目４５日目ＲＣＰ　ＲＣＰ　ＲＣＰ対照−２０℃　８８　８６　８３対照＋４℃　７６　６４　５０５−アミノ−１，３，４−チアノアゾール−２−チオール　９０　８９　８７４ −メチル−４Ｈ−１，２，４−）リアゾール−３−チオール　９０　８７　８６３−アミノ−５−ヒドロキノピラゾール　８９　８１　７８３−アミノ−５−メルカプトトリアゾール　８８　７７　７５３．５−ノアミノ−１，２，４−）リアゾール　８９　８８　８１すべての安定剤が安定化効果を示し、すべての純度が＋４℃の対照より高かった。若干の安定剤の存在はヌクレオチド溶液の純度を一２０℃での貯蔵より効果的に維持した。

実施例１７安定剤を３５−８標識メチオニンにつき試験した。試料はすべて０．　１％の２ −メルカプトエタノールを含有していた。放射能濃度は３４ｍＣ１／ｍｌであった。−２０°Ｃで貯蔵した第１対照試料以外は、すべての試料が＋４℃に貯蔵された。

試料　７日目　１４日目　２５日目　３２日目ＲＣＰ　ＲＣＰ　ＲＣＰ　ＲＣＰ対照−２０℃　８４　６３　４１　２７対照＋４℃　５２　１０　３　− ５−アミノ−１，３，４−チアソ了ゾールー２−チオール　９５　９３　８７　８３４−メチル−４Ｈ−１，２，４−）リアゾール−３−チオール　９３　９０　８４　８４３−アミノ−５−ヒドロキシヒラノール　６７　１９　２　−−３ −アミノ−５−メルｈ１トトリＴＩ−ル　９４　９４　９２　９２３．５−ノアミノ−１，２，４−トリアノール　８２　３９　１２　５すべての安定剤が４℃ の対照と比較しである程度の安定化を与えた。これらの安定剤のうち数種は、３５−８標識メチオニンに対し、安定剤の存在なしに一２０℃で貯蔵するより＋４ ℃の方がより良好な安定性を付与した。

実施例１８安定剤を３−Ｈ標識フェニルアラニンにつき試験した。放射能濃度は領　５ｍＣ１／ｍ＋であった。＋２℃で貯蔵した第１対照試料以外は、すべての試料が室温に貯蔵された。

試料　１３日目　２３日目　３６日目　４１日目ＲＣＰ　ＲＣＰ　ＲＣＰ　Ｉ？ＣＰ対照＋２℃　８２　７４　７４　６ｇ対照ＲＴ　８１　７１　６９　６２５−アミノ−１，３，４−チアノアゾール−２−チオール　９２　９０　９３　９２３．５−ノアミノ−１，２，４−トリアゾール　９１　８７　８７　８６３ −アミノ−５−しドロキノピラゾール　９２　８８　９３　９２バラアミｌ安息香酸　９２　１１ｔ８　９３　９１すべての安定剤が両方の対照試料と比較して安定化を与えた。貯蔵が室温で行われたにもかかわらず、卓越した安定性が達成された。

安定剤を（メチル−３Ｈ）チミジンにつき試験した。放射能濃度は０．５ｍＣ１／ｍｌであった。＋２℃で貯蔵した第１対照試料以外は、すべての試料が室温に貯蔵された。

対照＋２℃　−７４６９６８対照ＲＴ　７８　７３　６６　６４５−アミノ−１，３，４−チアノアゾール−２−チオール　８６　８７　８５　８５３．５−ノアミノ−１，２，４〜トリアゾール　８５　８４　８４　８５３ −アミノ−５−ヒドロキノピラゾール　８６　８３　８５　８６バラーアミノ安息香酸　８５　８６　８５　８６すべての安定剤が両方の対照試料と比較しである程度の安定化を与えた。安定化された試料がすべて室温で貯蔵されたにもかかわらず、卓越した安定性が達成安定剤をＬ−（Ｕ−１４Ｃ）ヒスチジンにつき試験した。放射能濃度は１００ｍＣ１／ｍｌであった。＋２℃で貯蔵した第１対照試料以外は、すべての試料が室温に貯蔵された。

試料　１３日目　２３日目　３６日目　４１日目ＲＣＰ　ＲＣＰ　ＲＣＰ　ＲＣＰ対照＋２℃　９９　９９　９８　９９対照ＲＴ　９７　９７　９６　９５５−アミノ−１，３，４−チアジアゾール−２−チオール　９７　９８　９９　９７３．５−ジアミノ−１，２，４〜トリアゾール　９８　９７　９８　９８パラ−了ミノ安息香酸　９９　９８　９８　９７これらの安定剤は室温対照試料と比較しである程度の安定化を与えた。すべての試料が十分な性能を示した。１４Ｃの半減期は極めて長＜　（５７３０年）、このため１４Ｃ標識化合物は比較的安定であると考えられる。長期安定性試験においては、安定剤を含有する試料が対照と比較して有意の安定性改良を示すである他の化合物の安定性を同様にして測定した。Ｌ−（５−３Ｈ）プロリン（０゜５ｍＣ１／ｍ＋）および（８−１４Ｃ）ＡＴＰ　（０，７５ｍＣ４／ｍｌ）を６週間にわたって分析した。これらの化合物は安定剤が存在しなくてもかなり安定であることが認められた。両方の化合物ともそれらの純度を約９７−９８％に維持した。これらの結果から、安定剤の存在はＬ−（５−３８）プロリンおよび（８−１４Ｃ）ＡＴＰの安定性を低下させないと結論することができる。

表１ ■ 表１．続ＩＮＨ２表１．続２＄性懺＝會１、事件の表示ＰＣＴ／ＧＢ　９３１０　Ｏ８６９平成５年特許願第５１５１５８号２、発明の名称放射性標識化合物の配合物３、補正をする者事件との関係　特許出願人４、代理人５、補正の対象請求の範囲（別紙）特許請求の範囲を下記の通りに訂正する。

「１．β線放出型の放射性核種で標識した有機化合物であって放射性標識した該有機化合物が貯蔵および輸送に際して放射線分解を生じるもの、ならびにトリプトファン、パラ−アミノベンゾエート、インドールアセテート、ルミノール、および互いに直結した少なくとも２個の環窒素原子を含む５員環を有する化合物である一群のアゾールから選ばれる安定剤を含む組成物。

２、β線放出型の放射性核種で標識した有機化合物および色素の溶液を含む組成物。

３、β線放出型の放射性核種で標識した放射性標識有機化合物、色素、ならびにＬ−トリプトファン、パラ−アミノベンゾエート、インドールアセテート、ルミノール、および互いに直結した少なくとも２個の環窒素原子を含む５員環を有する化合物である一群のアゾールから選ばれる安定剤を含む組成物。Ｊ以上国際調査報告　ＯｒＴ＃Ｊｌ　＠１／ｎｎ１ｌｔ＠、　、、、＝Ｎ、　ＰＣＴ／ＧＯ９３１００８６９フロントベージの続き（５１）　Ｉｎｔ、　Ｃ１，５識別記号　庁内整理番号Ｃ０７Ｄ　２０９／２０　９２８４−４Ｃ２３１／３８　７４３１−４Ｃ２３１／４４　７４３１−４Ｃ２４９１０４７１６７−４Ｃ２４９／１４　７１６７−４Ｃ２４９／１８　７１６７−４Ｃ２５７１０４７４３３−４ＣＣＯ９Ｋ　１５１０４　７１８８−４Ｈ９２８４−４Ｃ（７２）発明者　メイ、クリストファー・チャールズイギリス国ハートフォードシャー　エイエル４・８ジェイジー、ウィートハムステッド、マナー・ロード　２３ＩＣＯ７Ｄ　２８５／１２　Ｅ（７２）発明者　バッタリー、エリザベス・マーガレットイギリス国パツキンガムシャー、ニア−・アイルズバリー、クエイントン、ザ・ストランド　１．コーナー・コテッジ（７２）発明者　ストーン、ティモジ−イギリス国パツキンガムシャー　エイチピー１５・６イージー、ハイ・ワイクーム、グレート・キンゲスヒル、ロウランズ・クレセント　１４

Claims

【特許請求の範囲】

１．β線放出型の放射性核種で標識した有機化合物であって放射性標識した該有機化合物が貯蔵および輸送に際して放射線分解を生じるもの、ならびにトリプトファン、パラ−アミノベンゾエート、インドールアセテート、ルミノール、および互いに直結した少なくとも２個の環窒素原子を含む５員環を有する化合物である一群のアゾールから選ばれる安定剤を含む組成物。
２．β線放出型の放射性核種で標識した有機化合物および色素の溶液を含む組成物。
３．β線放出型の放射性核種で標識した放射性標識有機化合物、色素、ならびにＬ−トリプトファン、パラ−アミノベンゾエート、インドールアセテート、ルミノール、および互いに直結した少なくとも２個の環窒素原子を含む５員環を有する化合物である一群のアゾールから選ばれる安定剤を含む組成物。
４．放射性標識有機化合物が溶液中に存在する、請求の範囲第１項または第３項に記載の組成物。
５．放射性標識有機化合物がヌクレオチドである、請求の範囲第１項ないし第４項のいずれかに記載の組成物。
６．放射性標識有機化合物がアミノ酸である、請求の範囲第１項ないし第４項のいずれかに記載の組成物。
７．放射性標識が３２−Ｐ、３５−Ｓ、３３−Ｐ、３−Ｈおよび１４−Ｃから選ばれる、請求の範囲第１項ないし第６項のいずれかに記載の組成物。
８．安定剤が１０−１００ｍＭの濃度で存在する、請求の範囲第１項および第３項ないし第７項のいずれかに記載の組成物。
９．色素が５０−４００μｇ／ｍｌの濃度で存在する、請求の範囲第２項ないし第７項のいずれかに記載の組成物。
１０．４℃または周囲温度での輸送および貯蔵に適した、請求の範囲第１項ないし第９項のいずれかに記載の組成物。
１１．色素がスルホローダミンＢ、キシレンサイアノール、アゾカルミンＢおよびニューコクシンから選ばれる、請求の範囲第２項ないし第１０項のいずれかに記載の組成物。
１２．アゾールが下記の構造式を有するものである、請求の範囲第１項ないし第１１項のいずれかに記載の組成物： ▲数式、化学式、表等があります▼ （この構造式は２個の環二重結合を含み、式中の−Ｘ、ＹおよびＺのうち１個もしくは２個はＮを表すか、またはＸ、ＹおよびＺのうち１個はＳを表し、残りのＸ、ＹおよびＺはＣを表し、−Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４およびＲ５が存在する場合、それらはそれぞれ環に直結した、もしくは最高１０個の炭素原子の連鎖を介して結合した−ＯＨ、−ＳＨ、−Ｈ、−ＣＯＯＨ、−ＮＨ２、−ＣＨ３を表すか、またはＲ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４およびＲ５のうち２個の隣接因子が一緒に芳香環を構成してもよい）。