JPH06502987A - Ｏ―グリコシル化ｉｆｎ―アルファ - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 Ｏ−グリコジル化ＩＦＮ−アルファ 本発明は、Ｏ−グリコジル化アルファーインターフェロン、特に、実質的にＩＦ Ｎ−α２の生物学的、および／または免疫学的性質を有するインターフェロン− アルファ、その製造法、および医薬組成物としての使用に関する。

３０年以上前のインターフェロンの発見以来、細胞間コミュニケーションの仲介 物としてのその生物学的性質は、十分研究されてきている。当初、それらが生成 される特定の細胞に因んで、種々のタイプの命名がなされた（例えば、白血球− ＩＦＮ、繊維芽細胞−ＩＦＮ）。それらの構造の知見が増すに連れて、新しい命 名法が導入された。現在では、４種のインターフェロンに分類されており（ＩＦ Ｎ−α、ＩＦＮ−β、ＩＦＮ−γおよびＩＦＮ−ω）、特にＩＦＮ−α、ＩＦＮ −βおよびＩＦＮ−ωは、同様の構造および性質を有することから、所謂“クラ ス１インターフエログと分類されている。

ＩＦＮ−γは、抗原またはマイトジェン物質により刺激を受けたリンパ球から生 成する。クラスｌインターフェロンとホモロジーを持たないアミノ酸配列には２ つの強力なＮ−グリコジル化部位が含まれる。

ＩＦＮ−α、ＩＦＮ−βおよびＩＦＮ−ωは、ウィルス感染に対する反応として 、または二本鎖ＲＮＡによる誘導によって種々の細胞で合成される。

実際に、ＩＦＮ−αは１群のタンパク質である。現在までに、種々のタイプのＩ ＦＮ−αをコードする少な（とも１４種の機能性遺伝子か発見されている。これ らのタンパク質は近い関係にあり、通常、それらのアミノ酸配列は約８０％のホ モロジーを有している。ＩＦＮ−α１４は例外として、その他のＩＦＮ−αのア ミノ酸配列にはＮ−グリコジル化部位（ＡＳＮ−Ｘ−ＳＥＲ／ＴＨＲ）は存在し ない。従って、ＩＦＮ−αＩ４は別として、全ての場合にＮ−グリコジル化は除 外しうるが、ＩＦＮ−アルファのＯ−グリコジル化も議論されている（ラブトン 等、Ａｒｃｈ、Ｂｉｏｃｈｅｍ、Ｂｉｏｌ）ｈｙｓ、２３２．４２２−４２６（ １９８４）　）。

天然の多くのタンパク質は、翻訳後に最も一般的な修飾の１つであるグリコシル 化による修飾を受けている。糖蛋白質は、細胞内および細胞外マトリクスの両方 に膜結合型または可溶型として生成する。グリコジル化の機能には種々の見解が ある。確かなものには、グリカンがタンパク質分解からそのタンパク質を保護し うろこと、またはそれらが細胞−細胞間の相互作用を担っている事などがある。

さらに、これらはタンパク質を折り畳み、かつ、その分子の構造の安定性に寄与 している。また、そのタンパク質の可溶性も炭水化物鎖の影響を基礎としている 。

Ｎ−およびＯ−グリコジル化タンパク質の間には、明確な区別がある。Ｎ−グリ カンは、トリブレット−ＡＳＮ−Ｘ−ＳＥＲ／ＴＨＲ−（Ｘは、ＰＲＯまたはＧ ＬＵを除（アミノ酸のいずれか）のＡＳＮに単独で転移する。しかし、全ての強 力なグリコジル化部位を炭水化物が専有しているわけではないことから、そのタ ンパク質に必要な構造は、幾つかあるうちの１つだけでよい。０−グリカンの場 合は、詳細に限定された構造上の特性は無い。０−グリカンが、ＰＲＯｌＳＥＲ およびＴＨＲに富む領域に合成されやすいという明確な証拠がある。この事で、 ０−グリカンに対して重要な特定のアミノ酸配列があるというよりは、むしろそ のグリコジル化部位の立体的な接近可能性が重要であると考えることが出来る。

タンパク質の医薬的速度論および免疫学的特性に関するグリコジル化の影響を除 外することは出来ない。イースト中で生産された組み換えヒトＧＭ−Ｃ３Ｆ　（ 顆粒球−マクロファージ−コロニー刺激因子）で治療した１６人中４人の患者は 、このタンパク質に対する抗体を発現したという簡単な報告があった（ギポン等 、Ｌａｎｃｅｔ、３３５，４３４−４３７　（１９９０））。これらの抗体は、 ０−グリコジル化の結果として内在するＧＭ−Ｃ８Ｆに保護された形で存在する が、その組み換え因子に自由に接近しうるエピトープと反応することが分かった 。

これまでに、ＩＦＮ−α２中の炭水化物含量を検出することも、また０−グリコ ジル化ＩＦＮ−αを単離することも出来ていない。現在、天然のＩＦＮ−αおよ び組み換えＩＦＮ−Ｃ２の種々の調製物がウィルスや癌に対する薬剤として使用 されている。このＩＦＮ−Ｃ２は大腸菌中で生産され、従ってグリコジル化され ていないことから、炭水化物含量がインビボでの生物学的活性には重要であると は考えられない。しかし、最近、大腸菌で生産した組み換えＩＦＮ−Ｃ２で長期 間治療した患者は、それに対する抗体を発現するという報告が増えてきている（ 例えば、フィブリンおよびイトリ、Ｓｅｍ１ｎ、Ｈａｅｍａｔｏｌ、２５．９− １５　（１９８８））。

本発明の目的は、新しいＩＦＮ−Ｃ２を提供することにある。

この目的は、特定の発現ベクターにＩＦＮ−Ｃ２をコードするＤＮＡ配列を挿入 し、これを多細胞生物の細胞に転移することで達成される。驚くべきことに、こ のように修正した細胞の培養後、既知の組み換えＩＦＮ−Ｃ２とは分子量が有意 に異なるＩＦＮ−α２様のタンパク質が得られた。

本発明に従って新しいインターフェロンを調製するためには、多細胞生物の培養 物、特にを椎動物細胞または昆虫細胞の培養物を使用しつる。哺乳類細胞の例に は、ＶＥＲＯ細胞、ＨｅＬａ細胞、ＣＨＯ細胞、ＷＩ３ｇ細胞、ＢＫＨ細胞、Ｃ ０８−７細胞、ＭＤＣＫ細胞またはミエローマ細胞がある。必要ならば、これら の細胞の発現ベクターには、複製部位、プロモーターが含まれ、さらに必要なら ば、ＲＮＡスプライシング部位、ポリアゾニレ−ジョン部位および転写停止配列 が含まれる。通常、これらのベクターのコントロール機能はウィルスに由来する 。通常のプロモーターは、ポリオーマ、アデノウィルス２、シミアンウィルス４ ０　（ＳＶ４０）　、および望ましくはサイトメガロウィルス（ＣＭＶ）から得 られる。必要な複製部位は、適当なベクター構築物、例えば、ＳＶ４０、ポリオ ーマ、アデノ、ｖＳｖまたはＰＢＶの複製部位から提供されうるし、また宿主細 胞の染色体複製メカニズムによっても提供されつる。ベクターが宿主細胞の染色 体に組み込まれている場合には、後者の手段で十分である。

本発明に従い、プラスミドの一部から新しく構築した発現ベクターを使用するこ とが望ましい。本発明の発現ベクターは、異種ＤＮＡ配列の目的とした挿入を可 能にするマルチクローニング部位を含み、さらにアンピシリン耐性により大腸菌 中で高コピー数の複製が可能である。哺乳類細胞における異種遺伝子の発現を可 能にするためには、本発明の発現プラスミドにサイトメガロウィルス（ＣＭＶ） プロモーター／エンハンサ−が含まれることが望ましい（Ｍ、ポジヤード等、Ｃ ｅ１ｌ　４１．　（１９８５）５２１−５３０）、本発明に従う発現プラスミド の高コピー数の発現を自動的に行う場合、また、それにより例えばアデノウィル スでトランスホームしたＣ０８−７または細胞系列２９３　（ＡＴＣＣＣＲＬｌ 　５７３）等の適当な細胞系列中での一時的発現を高速で行うためには、５ｖ４ ０複製オリジンが使用された。恒久的トランスホーム細胞系列を調製したり、ま た、メソトレキセートにより発現カセットを持続的に増幅するためには、選択マ ーカーとしてンハイドロフォレート・リダクターゼ（ＤＨＦＲ）用に修正型のハ ムスター・ミニジーンを使用した（コーディング領域と最初のイントロンを伴う プロモーター）。プラスミドＤＮＡのシーケンシングおよび突然変異誘発を簡単 にするために、ヘルパーファージ、例えばＲ４０８またはＭ１３ＫＯ７でトラン スホーム細菌をスーパーインフェクシコンした後、−重鎖プラスミドＤＮＡを調 製する場合には、本発明のプラスミドの態様にはＭ１３のインタージェニック領 域が含まれることが望ましい。他の好ましい態様においてＴ７プロモーターがマ ルチクローニング部位の前に置かれている場合には、インビトロでのＲＮＡ転写 物の生産が可能となる。

本発明に従う好ましい発現プラスミドには、Ｉ）ＡＤ−ＣＭＶｌ　３、ｐＡＤ− ＣＭＶｌ　５、および、特にｐＡＤ−ＣＭＶｌ９がある。これらの調製の詳細は 実施例１で説明する。

ｍＲＮＡの５′非コード領域の配列で置換するＰＣＲにより、ＩＦＮ−Ｃ２をコ ードするｃＤＮＡを修正した（ローン等、Ｃｅ１ｌ　２１．　（１９８０）６４ ７−６５１）。同時にこのｃＤＮＡの両端に制限酵素切断部位を挿入し、コント ロール可能なりローニングを可能にした。予想外にも、この変化で発現量が有意 に増加した。

このＩＦＮ−Ｃ２に関する修正ｃＤＮＡを対応する制限酵素で切断した本発明の 発現ベクター、望ましくはプラスミドｐＡＤ−ＣＭＶ１９に挿入した。このＩＦ Ｎ−Ｃ２に関する発現プラスミドで適当な哺乳類細胞をトランスフェクトし、適 当な培養培地で培養した。この哺乳類細胞の培養上清を穏やかな条件下、従来の 方法に従って精製した。精製には、ＩＦＮ−Ｃ２に対するモノクローナル抗体を 用いたアフィニティークロマトグラフィーを使用することが望ましい。好ましい モノクローナル抗体には、ＦＢＩ−１またはＥＢＩ−１０またはこれらの相当物 がある。このような高い特異性を有する抗体の調製については報告がある（アド ルフ　Ｇ、Ｒ，Ｊ、Ｇｅｎ、Ｖｉｒｏｌ、６８．１６６９−１６７６（１９８７ ）：アドルフ等　Ｊ、Ｃｅ１１．Ｐｈｙｓｉｏｌ、５ｕｐｌ）１．２．６ｌ−６ ８（１９８２））。また、これらの使用法に関する報告もある（セチャーおよび プルケ、Ｎａｔｕｒｅ　２８５，４４６−４５０　（１９８０）；アドルフ等、 Ｊ。

Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、２６５．９２９０−９２９５　（１９９０）；アドルフ等 、Ｂｉｏｃｈｍ、Ｊ、２７６．５１１−５１８　（１９９１））。特に、細胞の 破壊を回避できるＥＰＡＯ２０３３８２に従う方法が好ましい。哺乳類細胞で生 成した組み換えＩＦＮ−Ｃ２の分析には、逆相ＨＰＬＣを使用した。そのＮ末端 とＣ末端を分析した。比較のために大腸菌中で生成した組み換えＩＦＮ−α２Ｃ も分析した。ＳＤＳゲル電気泳動により、哺乳類細胞で生成した組み換えＩＦＮ −Ｃ２は大腸菌で生成した組み換えＩＦＮ−Ｃ２よりも高い分子量を有すること が確認された。両組み換えインターフェロンをＮａＯＨで処理すると、哺乳類細 胞で生成した組み換えＩＦＮ−Ｃ２の分子量は、大腸菌で生成したＩＦＮ−Ｃ２ の分子量にまで減少した。従って、哺乳類細胞で発現した組み換えＩＦＮ−α２ ブチドの同定で、部位１０６に存在するスレオニン（ＴＨＲ−１０６）がグリコ ジル化していることが分かった。この結果をウィルスで刺激した白血球由来の天 然のＩＦＮ−Ｃ２と比較することで、グリコジル化部位およびオリゴサツカライ ド含量の両方が概ね等しいことが分かった。

しかし、本発明の目的は、ＩＦＮ−Ｃ２の置換を修正または排除する段階を含ま ない精製法によって達成された。本発明の精製法は非常に特異的なモノクローナ ル抗体を使用し、かつ、全精製過程を通して、ｐＨ８，０以上のアルカリ条件は 避けるように注意している。

天然のヒトＩＦＮ−α２は、白血球のインターフェロンから得られる非常に特異 的なモノクローナル抗体を用いて単離した。イムノアフィニティー・カラムを用 いた２つの連続する精製ステップでタンパク質９５％以上の純度が得ちれた。

配列分析では予想されたＮ末端配列の結果が得られ、最初のアミノ酸としてはＣ ＹＳが間接的に示された。

現在までに、ＩＦＮ−α２には３種の変異体が知られており、これらは部位２３ および３４のアミノ酸が異なる。即ち、”ＬＹＳおよび”ＨＩＳを含むＩＦＮ− β２ａ（当初、Ｌｅ　ＩＦＮとして知られていた。ゴーデル等、Ｎａｔｕｒｅ、 ２９０．２０−２６　（１９８１））、”ＡＲＧおよび”ＨＩＳを含むＩＦＮ− α２ｂ（ストレウリ等、５ｃｉｅｎｃｅ、２０９．１３４３−１３４７（１９８ ０））および”ＡＲＧおよび！４ＡＲＧを含むＩＦＮ−α２ｃ（当初、ＩＦＮ− α２“Ａｒｇ”として知られていた。ドーキン・ラスドル等、Ｊ、Ｉｎｔｅｒｆ ｅｒｏｎ　Ｒｅｓ、２，５７５−５８５　（１９８２）；ボドおよびムレア・ホ ギー、Ｔｈｅ　Ｂｉｏｌｏｇｙ　ｏｆ　ｔｈｅ　Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ　Ｓｙｓ ｔｅｍ１９８５　（スチワート　■、Ｗ、　Ｅ、およびシエレハス　Ｈ９編）５ ９−６４（１９８６）　）。単離したインターフェロンでは部位２３にＡＲＧの みが検出され、この事でＩＦＮ−α２ａの存在は除外される。部位３４のアミノ 酸は、明らかにヒスチジンであり、この事は単離したインターフェロンがＩＦＮ −α２ｂであることを示している。しかし、出発物質として使用する細胞に依存 して変異体ＩＦＮ−α２ａおよびＩＦＮ−α２ｃを得ることが可能である。ナマ ルワ細胞にはＩＦＮ−α２ｂおよびＩＦＮ−α２Ｃの両方が存在することが知ら れている。

比較物質として使用した大腸菌の組み換えインターフェロンはＩＦＮ−α２Ｃで あった。

精製した天然のＩＦＮ−α２のＲＰ−ＨＰＬＣ分析は、この精製物が組み換え大 腸菌ＩＦＮ−α２Ｃよりも速（カラムから溶出する２つのピークを含んでいるこ とを示している。また、５ＤＳ−ＰＡＧＥは、天然のＩＦＮ−α２の見かけの分 子量の高い不均一性を示した。天然のＩＦＮ−α２中に検出される全てのタンパ ク質は、大腸菌由来の組み換えＩＦＮ−α２Ｃよりも実質的に大きな分子量を有 している。ＩＦＮ−α１４は別にして、これまでに述べてきたＩＦＮ−α種には 、Ｎ−グリコジル化部位（−ＡＳＮ−Ｘ−ＴＨＲ／５ＥＲ−）が含まれていない 。従って、ＩＦＮ−α２に関するＮ−グリコジル化も除外しうる。Ｏ−グリカン に対しては、このような構造上の特性は知られていない。従って、０−グリコジ ル化したＩＦＮ−α２を除外することは出来ない。

０−グリカンは弱アルカリ条件でもタンパク質から切断しつるので、両ピークフ ラクションに弱アルカリ条件を課してみた。この反応は両方の分子量を大腸菌由 来の組み換えＩＦＮ−α２の分子量までに減少させた。この事は、０−グリコジ ル化を明確に示している。

ニューラミニダーゼおよびＯ−グリカナーゼを用いた実験では、１つのピーク（ ピーク２）（第１４図参照）に関し大腸菌のＩＦＮ−α２ｃの分子量へと分子量 を減少させ、この事でＯ−グリコジル化が確認された。このニューラミニダーゼ および０−グリカナーゼを用いたグリカンの連続的分解の結果は、ピーク２の不 均一性かＮ−アセチルニューラミノ酸（ＮｅｕＡｃ−シアル酸）の含量の差に基 づくものであることを示している。３個のバンド１２０図、トレース４）は、ジ ・またはモノ・シアル化（それぞれＭｒ２１．０００および２０，０００）およ び非シアル化（Ｍｒ１９，０００）型の天然のＩＦＮ−α２を示している。最も 軽いＩＦＮ−α２は、０−グリカナーゼだけの反応で分解しつる。Ｏ−グリカナ ーゼは、不飽和のジサッカライドＧａ１（β１−３）Ｇａ　１ＮＡｃを切断する だけなので、この反応は、２つのシアル化型に加えてＩＦＮ−α２のアシアロ変 異体が存在する事に対する証拠と見なさねばならない。

一方、ピークｌの見かけの分子量は、酵素反応では減少しなかった。予想される ように、ニューラミニダーゼとのインキュベーションでは、見かけの分子量は減 少しなかった。従って、このジサッカライド・コアは、ＮｅｕＡｃとは異なる置 換を起こしていなければならず、この事から０−グリカナーゼでは切断できない 。

天然および大腸菌で発現した組み換えＩＦＮ−α２のトリプシン切断後のペプチ ド地図を比較することにより、このグリコペプチドをピークｌおよび２から同定 しうる。これらのグリコペプチドのシーケンシングでグリコジル化部位としての Ｉ　Ｏａ　Ｔ　ＨＲが確認された。

天然のＩＦＮ−α２のオリゴサツカライドの構造に対するレファレンスは、酵素 反応だけでなくグリコペプチドのマス・スペクトル測定によっても提供される。

５ＤＳ−ＰＡＧＥの結果およびマス・スペクトルの考察は、天然のＩＦＮ−α２ が少なくとも４つの異なるグリカン構造：ピーク２における中性ジサッカライド Ｇａ１（βｌ−３）Ｇａ　１ＮＡｃ　（この構造はＯ−グリカナーゼの高い特異 性によって高い確度で存在すると考えつる）、モノ−およびジ−シアル化変異体 、およびピークｌにおける２つのヘキソースおよび２つのＮ−アセチルへキソサ ミン単位を含む中性オリゴサツカライドであることを示している。既に述べられ てきており、しばしば見られるＯ−グリカンと同様に、このテトラサツカライド の構造として以下の構造：Ｇａ１−　（Ｇａｌ−ＧｌｃＮＡｃ−）ＧａｌＮＡｃ が考えられる。

本発明の功績により、始めて高い純度でＯ−グリコジル化ＩＦＮ−α２を調製し えた。このインターフェロンは、部位１０６のアミノ酸スレオニン（＋　ｏ　ａ 　Ｔ　ＨＲ）の所でＯ−グリコジル化している。この部位に含まれつるオリゴサ ツカライドは、中性ジサッカライドＧａ１（β１−３）Ｇａ　１ＮＡｃ、そのモ ノ・およびジ・シアル化変異体、および中性テトラサツカライドＧａ　１−　（ Ｇａ　ｌ　−Ｇ　ｌ　ｃＮＡｃ−）Ｇａ　ｌＮＡｃである。

このＯ−グリコジル化ＩＦＮ−α２は、大腸菌中で発現する組み換えＩＦＮ−α ２と同様に従来の方法で成形し、ＩＦＮ−αに関して知られている全ての処方で 治療に使用しつる。

本発明のタンパク質は、有効量のＩＦＮと、場合によっては有意な量の有機また は無機、固体または液体の医薬的に許容可能なキャリヤーを共に含む医薬製剤と してウィルス感染および腫瘍疾患の治療に使用しうる。

医薬製剤は、ヒトに使用する場合、筋肉、皮下または静脈注射など非経口的に使 用することが望ましい。これらの製剤は、本発明のタンパク質と、場合によって はキャリヤー、望ましくは安定剤、エマルジョン剤、可溶化剤、ｐＨおよび浸透 圧調整用の塩、保存剤および／または湿潤剤等のアジュバントを含む等張水溶液 またはサスペンションである。この医薬製剤は、本発明のタンパク質および医薬 的に許容可能なキャリヤーおよびアジュバントを混合し、望ましくは凍結乾燥し 、使用前に溶解する方法等、従来の方法で調製しうる。

この医薬製剤の投与量は、治療する病気、患者の体重、年齢および症状、担当医 の所見および投与方法に依存する。

従って、本発明は、ＩＦＮ−α２の抗ウィルスおよび抗悪性腫瘍特性に基づく、 とりわけ、ウィルス病および腫瘍の治療に適したＯ−グリコジル化インターフェ ロン−α２を含む薬剤を始めて提供する。

以下の実施例は、本発明の説明を目的としたもので、これを制限するものではな い。

図面の簡単な説明 第１図ニブラスミドルＣＭＶ＋ＳＶ４０の構築。

第２図ニブラスミドｐＡＤ−ＣＭＶＩ　ＯＡの構築。

第３図・プラスミドｐＡＤ−ＣＭＶｌ　５の構築。

第４図ニブラスミドｐＡＤ−ＣＭＶ１３およびｐＡＤ−ＣＭＶ１９の構築。

第５図：発現プラスミドｐＡＤ１９Ｂ−ＩＦＮの構築。

第６図：発現プラスミドｐＡＤ１９Ｂ−ＩＦＮのＨｉ　ｎ　ｄＩＩＩ／ＸＢ　ａ 　Ｉ挿入。

第７図　プラスミドｐＡＤ−ＣＭＶ１９のＤＮＡ配列。

第８図ニブラスミドルＣＭＶ−ＳＶ４０の構築。

第９図ニブラスミドｐＳＶ２ｇｐｔＤＨＦＲＭｕｔ２の構築。

第１Ｏ図・プラスミドｐＡＤ−ＣＭＶＩおよびｐＡＤ−ＣＭＶ２の構築。

第１１図・プラスミドｐＡＤ−ＣＭＶｌのＤＮＡ配列。

第１２図：ヒト白血球インターフェロンのモノクローナル抗体アフィニティーク ロマトグラフィー。

第１３図：ヒトＩＦＮ−αのＥＬ　Ｉ　ＳＡ　：（○）組み換えヒトＩＦＮ−α ２ｃのレファレンス調製物；（○）白血球インターフェロン（出発物質）（ロ） スルーフロー（ロ）溶出物Ａのフラクション；（△）溶出物Ｂのフラクション。

第１４図：天然のＩＦＮ−β２　（ｂ）および大腸菌Ｉ　ＦＮ−ａ　２　ｃ　（ ａ）のＲＰ−ＨＰＬＣ。

第１５図：ＩＦＮ−α２ｃのアミノ酸配列。

第１６図ユニューラミニダーゼおよびＯ−グリカナーゼとの反応前後の天然ＩＦ Ｎ−α２の５ＤＳ−ＰＡＧＥ。

（１）ピークｌ、未処理；（２）ピークｌ、ニューラミニダーゼとの反応後；（ ３）ピークｌ、ニューラミニダーセおよびＯ−グリカナーゼとの反応後：（４） ピーク２、未処理：（５）ピーク２、ニューラミニダーセとの反応後；（６）ピ ーク２、ニューラミニダーゼおよびＯ−グリカナーゼとの反応後；（７）大腸菌 ＩＦＮ−α２ｃ。

第１７図：０−グリカナーゼとの反応前（１）および後（２）の天然のＩＦＮ− α２（第１４図（ｂ）のピーク２）の５ＤＳ−ＰＡＧＥ。

第１８図：　０．１Ｍ　ＮａＯＨとのインキュベーション後の天然ＩＦＮ−α２ （ピークｌおよびピーク２）および大腸菌ＩＦＮ−α２Ｃの５ＤＳ−ＰＡＧＥ、 （１）大腸菌ＩＦＮ−α２；（３）ピーク１；（５）ピーク２；ピーク１（２） およびピーク２（４）の未処理比較サンプルも記録した。

第１９図、大腸菌ＩＦＮ−α２Ｃおよび天然ＩＦＮ−α２の比較ペプチド地図。

（１）第１４図（ｂ）のピークｌ；（２）第１４図（ｂ）のピーク２；零、これ らのピークは、非グリコジル化ペプチドに由来し、その保持時間は常に同じであ る。

第２０図・天然ＩＦＮ−α２および大腸菌ＩＦＮ−α２Ｃの５ＤＳ−ＰＡＧＥ。

（１）分子量マーカー；（２）大腸菌ＩＦＮ−α２ｃ；（３）天然ＩＦＮ−α２ 、第１４図（ｂ）のピーク１；（４）天然ＩＦＮ−α２、第１４図（ｂ）のピー ク２：染色：コマ−ジブルー。

第２１図：　ＣＨＯ−Ｉ　Ｆ　Ｎ−ａ　２　ｃ（ａ）および大腸菌ＩＦＮ−ａ２ ｃ（ｂ）の逆相ＨＰＬＣ（ＲＰ−ＨＰＬＣ）。

第２２図：　ＣＨＯ−ＩＦＮ−α２Ｃのピークｌ　（ａ）およびピーク２（ｂ） および大１１ｉＥＩＩＩＦＮ−α２ｃ（ｃ）比較ペプチド地図。

第２３図：ＣＨＯ−ＩＦＮ−α２Ｃおよび大腸菌ＩＦＮ−α２ＣのＳＤＳゲル電 気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）。

トレースｌおよび８：分子量マーカー（スケールｋＤ）　；トレース２−４：非 還元条件、 トレース５−７：還元条件ニ トレース２および５　：　ＣＨＯ−ＩＦＮ−α２Ｃのビークｌニドレース３およ び６　：ＣＨＯ−ＩＦＮ−α２Ｃのピーク２；トレース４および７：大腸菌ＩＦ Ｎ−α２Ｃ；上部ゲル、各４μｇの全てのＩＦＮＩ−レース；下部ゲル　各ｌｔ １ｇの全てのＩＦＮトレース；染色二コマ−ジブルー。

第２４図：０．ＩＭＮａＯＨとのインキュベーション前後のＣＨＯ−ＩＦＮ−α ２Ｃおよび大腸菌ＩＦＮ−α２ＣのＳＤＳゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）。

トレースｌおよび８：分子量マーカー（スケールｋＤ）　；トレース２．４．６ ・未処理サンプル、トレース３．５．７：０．ＩＭＮａＯＨとのインキュベーシ ョンしたサンプル；トレース２．３：大腸菌ＩＦＮ−α２Ｃ；トレース４および ５　：ＣＨＯ−ＩＦＮ−α２Ｃのビークｌ；トレース６および７　：ＣＨＯ−Ｉ ＦＮ−α２Ｃのピーク２；約１．５μｇを還元条件下で全てのＩＦＮトレースに 使用した。

染色：コマ−ジブルー。

実施例１ 発現プラスミドｐＡＤ−ＣＭＶ１３、ｐＡＤ−ＣＭＶｌ　５およびｐＡＤ−ＣＭ Ｖｌ９の構築 発現プラスミド（ｐＣＤＭ８、シードおよびアルフォ、Ｐｒｏｃ、　Ｎａ　ｔ　 １゜Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ　８４　（１９８７）８５７３−８５７７；Ｂ、 シード、Ｎａｔｕｒｅ　３２９　（１９８７）８４０−８４２）；インビトロゲ ン社、サンディエゴ、ＣＡ；　ｐＳＶ２ｇｐｔＤＨＦＲ２０、ＥＰ−Ａｌ　０３ ２１８４２）の一部およびｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ　ＫＳ−（ショート等、Ｎｕ ｃ　１．　Ａｃ　ｉｄｓ　Ｒｅｓ、１１　（１９８ｇ）５５２１−５５４０；ス トラタジーン、ラジョラ、ＣＡ）から、異種ＤＮＡ配列の挿入用のマルチクロー ニング部位を含み、かつ、アンピシリン耐性により大腸菌内で高コピー数で複製 しつる新しいプラスミドを構築した。ヘルパーファージ（例えば、Ｒ４０８また はＭｌ　３ＫＯ？）によるトランスホーム細菌のスーパーインフエクシコン後、 Ｍｌ３の介在領域により一重鎖プラスミドＤＮＡが生産され、このプラスミドＤ ＮＡのシーケンシングおよび突然変異誘発が容易に出来る。このマルチクローニ ング部位の前にあるＴ７プロモーターによりインビトロでＲＮＡ転写物を生成し つる。哺乳類細胞においては、サイトメガロウィルス（ＣＭＶ）プロモーター／ エンハンサ−による異種遺伝子の発現が起こる（Ｍ、ポジヤード等、Ｃｅ１ｌ　 ４１　（１９８５）５２１−５３０）。ＳＶ４０複製オリジンにより、適当な細 胞系列（例えば、ＣＯ５−７等のＳＶ４０でトランスホームした細胞、アデノウ ィルスでトランスホームした細胞系列２９３　（ＡＴＣＣＣＲＬ１５７３））中 の中間的発現において、この発現プラスミドの高コピー数、従って高速の自動的 複製が可能となる。恒久的なトランスホーム細胞を調製し、つづいてメソトレキ セートを用いて発現カセットを増幅するために、選択マーカーとしてのジｌ＼イ ドロア０レート・リダクターゼ（ＤＨＦＲ）用に修正したハムスター・ミニジー ンを使用する（プロモーターを伴うコード領域および最初のイントロンを含む） 。

ポリメラーゼ・チェーン・リアクシコン（ＰＣＲ）によるベクターおよびプロモ ータ一部分の調製 プラスミドｐＢ１ｕｅｓｅｒｉｐｔ　ＫＳ−をＨｉｎｄＩ［［で線状とし、１１ ００ｎのＤＮＡを１００μｌのＰＣＲＣサイキ等、５ｃｉｅｎｃｅ　２３９　（ １９８８）４８７−４９１）混合物（反応液：５０ｍＭ　ＫＣＩ、１０−　トリ ス−ＨＣｌ　（ｐＨ８，３）、１．　５ｏ＃　ＭｇＣＩｔ、　０．　０１Ｘ　（ Ｗ／Ｖ）ゼラチン、各０．２酬の４種のデオキシヌクレオチド３リン酸（ｄＡＴ Ｐ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＴＴＰ）、２．５ユニツトのＴａｑポリメラーゼ（ １，００μｌ中））に入れた。

プライマーには、各５０ｐｍｏ１の合成オリゴヌクレオチドＥＢＩ−１７８６（ ５”一部ＡＡＴＴＣＡＧＣＣＴＧＡＡＴＧＧＣＧＡＡＴＧＧＧ−３°）おＪ：ヒ Ｅ　Ｂ　Ｉ　−２１３４（５’　−ＣＡＣＴＧＡＡＣＴＣＧＡＧＣＡfＣＴ ＧＣＧＴｒＧＣＴＧＧＣＧｍＴＴＣＣ−３’　）　ヲ使用シタ。９４℃、５分ノ 変性後、ＰＣＲをＩＯサイクル行った（サイクル条件：９４℃、４０秒：５５℃ 、４５秒；７２℃、５分、パーキン・エルマー・シータス・サーマル・サイクラ −）。オリゴヌクレオチドは、Ｍｌ３の介在領域、または、β−ラクタマーゼの 介在遺伝子を伴う複製オリジン（ｏｒｉ）に隣接している。同時にｏｒｉの末端 にＸｈｏＩおよびＰｖｕＩＩ切断部位、また、他端にＥｃｏＲＩ切断部位が導入 される。この反応混合物からフェノール・クロロホルム抽出でタンパク質を除き 、ＤＮＡをエタノール沈殿する。このＤＮＡをＸｈｏｌおよびＥｃｏＲＩで切断 し、アガロースゲルによる電気泳動後、２．　３ｋｂのフラグメントを単離した 。先に述べた条件と同じ条件で、オリゴヌクレオチドＥ　Ｂ　Ｉ　−２１３３（ ５’−ＧＧＴＣＡＣＴＧＴＣＧＡＣＡＴｒＧＡＴｒＡ’１ＴＧＡＣＴＡＧ−３° ）およびＦ　Ｂ　Ｉ−１７３４（５’　−ＧＧＡＡＴＴＣＣＣＴＡＧＧＡＡＴＡ ＣＡＧＣにＧ−３’　）を用いたＰＣＲにより５０ｎｇの５ａｃＩＩで線状化し たプラスミドｐＣＤＮ８を増幅した。オリゴヌクレオチドはＣＭＶ−プロモータ ー／エンハンサ−配列の先端に結合して５ａｌＩ切断部位を生成しくＦＢ　Ｉ− ２１３３）　、また、ＳＶ４０のポリアゾニレ−ジョン部位の末端に結合してＥ ｃｏＲＩ切断部位を生成する（ＦＢＩ−１７３４）。

ＰＣＲ産物を５ａｌＩおよびＥｃｏＲＩで切断し、１．８ｋｂのＤＮＡフラグメ ントをアガロースゲルから単離した。

２つの切断したＰＣＲ産物をＴ４ＤＮＡリガーゼでライゲーションし、大腸菌Ｈ ＢＩＯＩ株にトランスホームした。所望する構造（第１図参照）を有するプラス ミドをｐｃＭＶ＋Ｍ１３と命名した。

プラスミドｐｓＶ２ｇｐｔＤＨＦＲ２０（ＥＰ−Ａｌ　０３２１８４２）からＳ Ｖ４０複製オリジン（ＳＶ４０　ｏｒｉ）を単離した。これを行うために、この プラスミドをＨｉｎｄｎＩおよびＰｖｕＩＩで二重切断し、このＤＮＡの末端を ４種のデオキシヌクレオチド３リン酸の存在下、大腸菌のＤＮＡポリメラーゼの ラージ・フラグメント（クレノー酵素）で処理することで平滑化した。得られた ０、３６ｋｂのＤＮＡフラグメントをアガロースゲルから単離し、ＥｃｏＲＩで 線状化したプラスミドベクターｐｃＭＶ＋Ｍ１３にライゲーションした。β−ラ クタマーセ遺伝子およびＣＭＶ−プロモーターと同じ方向性を有するＳＶ４０の Ｏｒｉを含む、大腸菌ＨＢＩＯＩのトランスホーメーシコン後に得られたプラス ミドをｐＣＭＶ−８Ｖ４０と命名シタ（第１図）、プラスミドｐＣＭＶ＋ＳＶ４ ０をＥｃｏＲＩおよびＢａｍＨＩで二重切断し、そのＤＮＡ末端をクレノー酵素 で平滑化した。ＤＮＡをフェノール・クロロホルムによる抽出およびエタノール 沈殿で精製した。このＤＮＡの一部をＴ４ＤＮＡリガーゼで環状化し、大腸菌の トランスホーメーシコン後に得られたプラスミドをｐＡＤ−ＣＭＶＩＯと命名し た（第２図）。残りのｐＣＭＶ＋ＳＶ４０のＤＮＡは、アルカリ・ホスファター ゼとインキュベーションすることにより脱リン酸化し、４．４ｋｂ長のベクター をアガロースゲルから単離した。

突然変異誘発によりＥｃｏＲＩ、Ｐｓ　ｔ　Ｉ、ＢｇｌＩＩ、ＢａｍＨＩおよび ＫｐｎＩの制限酵素切断部位を除去した修正型ハムスター・ジハイドロホレート ・リダクターゼ（ＤＮＦＲ）　ミージーン’ｌｒ：含むプラスミドｐＳＶ２ｇｐ 　ｔＤＨＦＲ−Ｍｕｔ２（実施例４、第９図参照）をＥｃｏＲＩおよびＰｓｔＩ で二重切断し、そのＤＮＡ末端をｌ１℃で２０分間、５ユニツトのＴ４ＤＮＡポ リメラーゼ（反応液：５０ｍＭ　トリス−ＨＣｌ　（ｐＨ８，０）、！４１　Ｍ ｇＣＩｔ、５酬　ジチオスレイトール、各０．　１−の４種のデオキシヌクレオ チド３リン酸、５０μｇ／ｍｌ　牛血清アルブミン）とインキュベートすること により平滑末端化した。変異したＤＨＦＲ遺伝子を有する２、４ｋｂ長のフラグ メントをアガロースゲルから単離し、先に述べたようにｐｃＭＶ＋５Ｖ４０にラ イゲーションした。大腸菌のトランスホーメーシコン後に得られるプラスミドで ＤＨＦＲ遺伝子をＣＭＶ−プロモーターと同じ配向で含むプラスミドをｐＡＤ− ＣＭＶｌ　ＯＡと命名した（第２図）。

マルチクローニング部位およびポリアゾニレ−ジョン・シグナルの間にイントロ ン配列を含む発現プラスミドｐＡＤ−ＣＭＶＩ　（実施例４、第１Ｏ図参照）か ら始めて、そのマルチクローニング部位に対してイントロンの数および位置が異 なる種々の変異体を生成した。ｐＡＤ−ＣＭＶｌ　３　（第４図）は、マルチク ローニング部位とポリアゾニレ−ジョン部位の間にあるＳＶ４０・を抗原のイン トロンが欠失している：　ｐＡＤ−ＣＭＶｌ　５　（第３図）は、ＣＭＶプロモ ーターとマルチクローニング部位の間に合成イントロン、およびマルチクローニ ング部位とポリアゾニレ−ジョン・シグナルの間にＳＶ４０・を抗原イントロン を含む；ｐＡＤ−ＣＭＶｌ　９　（第４図）は、ＣＭＶプロモーターとマルチク ローニング部位の間に単一のイントロンを含む。

１１００ｎのＨｉｎｄＩ［［で線状化したプラスミドｐＡＤ−ＣＭＶｔから出発 して、１００μｍのＰＣＲ混合物（上述）中、各５０ｐｍｏｌのオリゴヌクレオ チドＦＢＩ−２６２５（５°−ＣＡＣＴＧＡＴＣＴＡＧＡＧＡＴＡＴＣＴｒＧｍ ＡＴＴＧＣＡＧＣＴｒＡＴＡＡＴＧＧ−３”）　オよびＥＢＩ−１８５７（５° −ＧＧＣＡＡＧＧＧＣＡＧＣＡＧＣＣＧＧ−３’　）を用いた１０サイクル（９ ４℃、４０秒；５５℃、４５秒；７２℃、９０秒）のＰＣＲで１．２６ｋｂ長の ＤＮＡフラグメントを増幅した。ＥＢＩ−２６２５は、ＳＶ４０のポリアゾニレ −ジョン・シグナルの直前に結合しくＪ）ＡＤ−ＣＭＶＩの部位１２８０ＬＸｂ ａＩおよびＥｃｏＲＶに関する付加的制限部位を含む。ＦＢＩ−１８５７は、下 流のＤＨＦＲミニジーンの最初のイントロン中の相補的ＤＮＡ鎖に結合する（ｐ ＡＤ−ＣＭＶｌの部位２５２５）。ＰＣＲ産物からフェノールおよびクロロホル ム抽出でタンパク質を除き、ＤＮＡをエタノール沈殿した。このＤＮＡをＸｂａ ｌおよびＢｇｌ■で二重切断し、アガロースゲルから０．３２ｋＦ４のＤＮＡフ ラグメントを単離して、同酵素で二重切断したプラスミドベクター（５，８ｋｂ ）ｐＡＤ−ＣＭＶＩにライゲーションした。大腸菌ＨＢＩＯＩのトランスホーメ ーシコン後に得られた所望する性質のプラスミドをｐＡＤ−ＣＭＶｌ３と命名し た（第４図参照）。

ＣＭＶプロモーターに先行するスプライス・ドナー配列（Ｍ、ポジヤード等、Ｃ ｅ１ｌ　４１　（１９８５）５２１−５３０）を５ＯＥ−ＰＣＲ（重複伸長によ るスプライシング、Ｓ、　Ｎ、ホ等、Ｇｅｎｅ　７？　（１９８９）５１−５９ ）により、プラスミドｐＡＤ−ＣＭＶＩのマルチクローニング部位の上流のヒト β−グロビン遺伝子の最初のイントロンのスプライス・アクセプタ一部位（ロー ン等、Ｃｅ１ｌ　２１　（１９８０）６４７−６５１）に結合した。これを行う ために、ヒトのサイトメガロウィルスＡＤ１６９株（ポジヤード等、Ｃｅ１ｌ　 ４１（１９８５）５２１−５３０）のプロモーターおよびエンハンサ−配列を含 むプラスミドｐＧＪ７　（Ｇ、ジャン等、Ｊ、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ　４９　（１９ ８４）３６３−３７０）１００ｎｇを、１００μｌのＰＣＲ反応混合物中、各５ ０ｐｍｏｌのオリゴヌクレオチドＥＢＩ−２１３３（上述）およびＥＢ　Ｉ−２ ５８６（５’−ＧＣＡＧＡＧＡＧＡＧＴＣＡＧＴＧＣＣＴＡＴＣＡＧＡＡＡＣＣ ＣＡＡＧＡＧＴＣＴｒＣＴＣＴＡＴＡＧＧＣＧＧＴＡＣＴＴＡＣＣＴＧＡＣＴＣ ＴＴf−３’　）をプ ライマーとした３０サイクル（サイクル条件：９４℃、４０秒：４５℃、４５秒 ；７２℃、９０秒）以上のＰＣＲで増幅した。ＥＢＩ−２５８６の最後の２４塩 基はＣＭＶ配列（アンチセンスの方向で）と完全に適合しており、また、オリゴ ヌクレオチドＥＢＩ−２５８５の逆相補記列に完全に適合している１８塩基を含 む先行塩基はβ−グロビン・イントロン配列に対応していることから５ＯＥ−Ｐ ＣＲの重複ＤＮＡ配列を形成している。このＰＣＲ産物をアガロースゲルで分離 し、０．８ｋｂのＤＮＡフラグメントを単離した（第３図）。同様に、１１００ ｎのプラスミドｐＡＤ−ＣＭＶＩを、オリゴヌクレオチドＦＢ　Ｉ−２５８５（ ５’−ＧＣＡＣＴＧＡＣＴＣＴＣＴＣＴＧＣＣＴＡＴｒＧＧＴＣＴＡＴ’１Ｔｒ ＣＣＣＡＣＣＣＴＴＡＧＧＣＴＧＣＴＧＧＴＧＣＴＴＡＡＣＴＧＧＣＴＴＡsＣ Ｇ−３’　）お 、にヒＥＢ　Ｉ−２１１２（５°−ＧＴＣＣＡＡＴｒＡＴＧＴＣＡＣＡＣＣ−３ ’　）を用いたＰＣＲで増幅し、０、２　ｋｂのＤＮＡフラグメントをアガロー スゲルから単離した。ＦＢＩ−２５８５は、β−グロビン・イントロンの最後の ４５塩基、および５個の連続する塩基、および３°末端の１７塩基を含み、ｐＡ Ｄ−ＣＭＶＩの配列の部位６１１−６２７に完全にハイブリダイズしうる。ＥＢ Ｉ−２１１２は、ｐＡＤ−ＣＭＶＩ配列の部位７４３−７６０の相補ＤＮＡ鎖に 結合する。単離した０、８ｋｂのＤＮＡフラグメントの１０分の１および０．２ ｋｂのＤＮＡフラグメントの３０分の１を新しいＰＣＲ反応混合物１００μｌ中 で混合しく５ＯＥ−ＰＣＲ）　、各５０ｐｍｏｌのオリゴヌクレオチドＥＢＩ− ２１３３およびＥＢＩ−２１１２を用いた３０サイクル（９４℃、４０秒；４５ ℃、４５秒；７２℃、２分）のＰＣＲで増幅した。

フェノールおよびクロロホルムによる抽出で反応を停止し、ＤＮＡをエタノール で沈殿させた。このＰＣＲ産物の５°末端をＴ４ポリヌクレオチド・キナーゼ（ 反応バッファ・７０−　トリス−ＨＣｌ　（ｐＨ７，６）、１０酬　ＭｇＣＩｔ 、５ｒｒＭ　ジチオスレイトール、１ｍＭ　ＡＴＰ）でリン酸化し、ついで、Ｘ ｂａＩで切断した。このＤＮＡをアガロースゲルで分離し、０．９８ｋｂ長の７ ラグメントを単離した。プラスミドｐＡＤ−ＣＭＶＩＯをＰｖｕＩＩおよびＸｂ ａＩで二重切断し、ＣＭＶプロモーターを含まないベクタ一部分をアガロースか ら単離した。

このプラスミドベクターをイントロンおよびマルチクローニング部位と共にＣＭ Ｖプロモーターおよびエンハンサ−を含む０．９７ｋｂのＤＮＡフラグメントと ライゲーションし、大腸菌ＨＢＩＯＩにトランスホーメーシコンした。生成した トランスホーマントからプラスミドＤＮＡを調製し、ついで、修正型Ｔ７ＤＮＡ ポリメラーゼ（Ｓ、ティパーおよびＣ，Ｃ，リチャードソン、Ｐｒｏｃ、　Ｎａ 　ｔ　Ｉ。

Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ　８４　（４７６７−４７７１）；シークエネース、 ユナイテッド・ステート・バイオケミカル社）を用いたダイデオキシ・チェーン ・ブレーキング法（Ｆ、サンガー等、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、 ＵＳＡ　７４　（１９７７）５４６３−５４６７）で、プライマーとしてオリゴ ヌクレオチドＥＢＩ−２１１２、ＦＢＩ−２５８６およびＥＢ　Ｉ−１７３３（ ５”ＧＧＴＣＧＡＣＡＴ′ｒＧＡＩＴＡηＴｌ１ＡＣＴＡＧ−３°）を使用して 新しいＤＮＡ挿入物をシーケンシングした。

期待された配列を有するプラスミドをｐＡＤ−ＣＭＶｌ５と命名した（第３図） 。

ｐＡＤ−ＣＭＶ　１０　Ａｔ−８ｐ　ｅ　Ｉ　オヨびＢｇｌＩＩで二重切断し、 ＣＭＶブ、ロモーターを含まないベクタ一部分をアガロースゲルから単離した。

ｐＡＤ−ＣＭＶｌ５をＳｐｅ　ＩおよびＨｉｎｄＩＩ［で二重切断し、ＣＭＶプ ロモーターおよび合成イントロンを含む０．８ｋｂのＤＮＡフラグメントを単離 した。ｐＡＤ−ＣＭＶｌ３をＨｉｎｄＩ［ＩおよびＢｇｌＩ［で二重切断し、マ ルチクローニング部位、ＳＶ４０初期ポリアゾニレ−ジョン・シグナルおよびハ ムスター・ＤＨＦＲＨＦ上−ター領域を含む０．３６ｋｂのＤＮＡフラグメント を単離した。これら３個のＤＮＡフラグメントをＴ４ＤＮＡリガーゼでライゲー ションし、大腸菌ＨＢＩＯＩにトランスホームした。生成したトランスホーマン トからプラスミドＤＮＡを単離し、種々の制限酵素による切断で解析した。所望 する構造を有するプラスミドをｐＡＤ−ＣＭＶｌ　９と命名した（第４図、第５ 図）。

実施例２ ｈｕＩＦＮ−ａ２ｃの修正型ｃＤＮＡの調製ヒトＩＦＮ−ａ２ｃをコードするク ローンｌＦ７のｃＤＮＡ　（Ｅ、ドーキン・ラスドル等、Ｊ、Ｉｎｔｅｒｆｅｒ ｏｎ　Ｒｅｓ、２（１９８２）５７５−５８５；Ｅ、ドーキン・ラスドル等、Ｇ ｅｎｅ　２１　（１９８３）２３７−２４８）に対し、その５′非コード領域を ＰＣＲによりヒトβ−グロビンｍＲＮＡの５′非コード領域（ローン等、Ｃｅ１ ｌ　２１　（１９８０）６４７−６５１）と交換する修正を行った。このような ５゛非コード領域における変化は、おそらく、翻訳の効率的開始により発現の明 確な増加をもたらす。同時に、このｃＤＮＡの両端に制限酵素の切断部位が導入 され、その後の発現プラスミドにおけるｃＤＮＡのクローニングが容易になる。

１００μｌのＰＣＲ混合物中、各５０ｒＭ１ｏｌのオリゴヌクレオチドＥＢＩ− ２７ＧＴＩ’夏９貫Ｃ工ＡＣ買Ｃ−３’　）を用いた２０サイクル（９４℃、４ ０秒：５５℃、４５秒；７２℃、９０秒）のＰＣＲで１１００ｎのＥｃｏＲＩで 線状化したプラスミドｌＦ７を増幅した。ＥＢＩ−２７２４は、ＨｉｎｄＩＩＩ 切断部位の下流にヒトβ−グロビンｍＲＮＡの５′非コード領域、つづいてｈｕ ｌＦＮ−α２ｃのシグナルペプチドをコードする配列の最初の２２塩基（開始コ ドンに下線を施した）を含んでいる。ＥＢＩ−２７４４は、ｈｕＩＦＮ−α２ｃ をコードする配列の末端の相補鎖と結合しく停止コドンに下線を施した）、かつ 、Ｘｂａｌの切断部位を含む。フェノールおよびクロロホルムによる抽出で反応 を停止し、ＤＮＡをエタノールで沈殿させた。このＰＣＲ産物の両端をＨｉｎｄ ｎｌおよびＸｂａＩで切断し、アガロースゲルから０．６４ｋｂ長のＤＮＡフラ グメントを単離した（第６図、第７図）。また、プラスミド［）ＡＤ−ＣＭＶｌ 　９をＨｉｎｄＩＩ［およびＸｂａｌで二重切断し、そのｃＤＮＡフラグメント とライゲーションした。大腸菌ＨＢＩＯＩのトランスホーメーシコン後、得られ たコロニーを培養し、プラスミドＤＮＡを調製した。得られたプラスミドの１つ を挿入したＨｉｎｄＩ［Ｉ−ＸｂａＩ領域の配列に関して完全にシーケンシング した。コードされるアミノ酸（Ｌｅｕ）に変化を起こさないシグナルペプチドの 第８コドンにおける単一の塩基置換（ＣＴＧからＴＧＧ）以外は、期待された配 列が得られた。分泌型で、かっ０−グリコジル化されたｈｕＩＦＮ−α２ｃに関 する発現プラスミドをｐＡＤｌ　９Ｂ−ＩＦＮと命名した（第６図）。

プラスミドｐＡＤ−ＣＭＶｌ　９の配列要素の説明（第５図）塩基 １−２１　オリゴヌクレオチドＥＢＩ−２１３３の結合部位１−５９０　サイト メガロウィルスのエンハンサ−およびプロモーター７２２−７４０　サイトメガ ロウィルスのイントロン配列（スプライス・ドナー） ７４１−８０５　ヒトβ−グロビンのイントロン配列（スプライス・アクセプタ ー） ８３６−８５３　Ｔ７プロモーター ８６２−９２２　マルチクローニング部位９２３−１０５５　５Ｖ４０（７）ポ ’Ｊ７デニレーシコン部位１０５６−１９５３　ハムスターＤＨＦＲ遺伝子のプ ロモーターおよび５′非コード領域 １９５４−２０３９　ＤＨＦＲエクソン１２０４０−２３３３　ＤＨＦＲイント ロン１２１５１−２１６８　ＥＢＩ−１８５７の結合部位２３４４−２８２１　 ＤＨＦＲエクソン２−６コード領域２８２２−３４７４　ＤＨＦＲ３’ＨＦ−ド 領域３４７５−３８１２　ＳＶ４０複製オリジン（ＳＶ４０　ｏｒｉ）３８１３ −６０５５　ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ部分３８１３−４２９１　Ｍ１３介在領域 （Ｍ１３ｏｒｉ）４４２３−５２８３　β−ラクタマーゼ、コード領域６０３８ −６０６２　ＥＢＩ−２１３４の結合部位実施例３ 高等真核細胞における中間的発現 ８０ｍｍシャーレ当たり約１０’個の細胞（２９３、アデノウィルスＡＤ５ゲノ ムでトランスホームしたヒト胎児腎臓細胞、Ｆ、Ｌ、グラハム等、Ｊ、　Ｇｅｎ 。

Ｖｉｒｏｌ、、３６　（１９７７）５９−７７　；ＡＴＣＣＣＲＬ１５７３）を トランスフェクション２４時間前、１０％の熱失活処理したウシ胎児血清を含む 培地（１５ｍＭ　ヘペスを含むダルベツコＭＥＭ／ニュートリエンド・ミックス Ｆ１２（１：ｌ）；ギブコ）と混合し、５％ＣＯ１雰囲気下、３７℃でインキュ ベートした。トランスフェクションの３時間前、細胞に新鮮な培地１０ｍ１を与 え、３７℃でインキュベートした。０．５ｍｌの２５　（ＭＯＭ　ＣａＣＩｔに 溶解したｌＯμｇのプラスミドｐＡＤｌ　９Ｂ−ＩＦＮのＤＮＡ（ＣｓＣ１密度 勾配で二回遠心して精製したもの）を０．５ｍｌの２ｘＨＢＳ　（１６，３６ｇ ／Ｉ　ＮａＣ１，ｌ　１．９ｇ／Ｉ　ヘペス、０．４　（Ｉｇ／Ｉ　ＮａｔＨＰ ＯいｐＨ７，１２）に滴下した。得られた沈殿をシャーレに添加し、細胞を３７ ℃でさらに４時間インキュベーションした。その細胞をＰＢＳで洗浄し、１ＸＨ ＢＳ中１５％のグリセリンで３０秒間ショックを与えた後、再び３７℃でＰＢＳ で洗浄してから１０ｍ１の１０％ウシ血清を含む新鮮な培地を用いてインキュベ ートした。７２時間後、細胞上清を回収し、分泌されたＩＦＮの検出に使用した 。

実施例４ 発現プラスミド［）ＡＤ−ＣＭＶｌおよびｐＡＤ−ＣＭＶ２の構築発現プラスミ ドｐＣＤＭ８の一部（シートおよびアルホ、Ｐｒｏｃ、　Ｎａ　ｔ　Ｉ。

Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ　８４　（１９８７）８５７３−８５７７；　シード 、Ｎａｔｕｒｅ　３２９　（１９８７）８４０−８４２：イントロン配列トンデ ィエゴ、ＣＡ）、ｐｓＶ２ｇｐｔＤＨＦＲ２０（ＥＰ−Ａｌ　０３２１　８４２ ）およびプラスミドＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ　ＳＫ＋　（ショート等、ｌ’Ｊｕｃ １．Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、１１．５５２１−５５４０；ストラタジーン、ラジョ ラ、ＣＡ）から、異種ＤＮＡ配列の挿入用のマルチクローニング部位を有し、か つアンピシリン耐性により大腸菌内で高コピー数で複製しうる新しいプラスミド を構築した。

Ｍｌ３の介在領域は、ヘルパーファージ（例えば、Ｒ４０８またはＭｌ　３ＫＯ ７）によるトランスホームした細菌のスーパーインフエクシタンによる一本鎖プ ラスミドＤＮＡの調製を可能にし、プラスミドＤＮＡのシーケンシングおよび突 然変異誘発を容易にする。マルチクローニング部位に先行するＴ７プロモーター は、インビトロでのＲＮＡ転写を可能にする。哺乳類細胞における異種遺伝子の 発現は、サイトメガロウィルス（ＣＭＶ）のプロモーター／エンハンサ−により 起こる（ポジヤード等、Ｃｅ１ｌ　４１　（１９８５）５２１−５３０）。ＳＶ ４０複製オリジンは、適当な細胞系列（例えば、Ｃ０８−７等のＳＶ４０でトラ ンスホームした細胞、アデノウィルスでトランスホームした細胞系列２９３（Ａ ＴＣＣＣＲＬ１５７３））における発現プラスミドの高コピー数での自動的複製 を可能とし、それにより高速な中間的発現が可能となる。恒久的にトランスホー ムした細胞系列を調製し、つづいてメソトレキセートによる発現カセットの増幅 を行うために、選択マーカーとしてデバイドロホレート・リダクターゼ（ＤＨＦ Ｒ）に関する修正型ハムスター・ミニジーンを使用した（コード領域および最初 のイントロンを伴うプロモーター）。

ａ）ＰＣＲによるベクターおよびプロモータ一部分の調製プラスミドＢｌｕｅｓ ｃｒｉｐｔ　ＳＫ＋をＨｉｎｄｌＩＩで線状化し、そのＤＮＡ５ｎｇを１００μ ｍのＰＣＲ混合物（反応ノクツファ：５０ｍＭＫｃＩ、１０蘭トＩＪス−ＨＣｌ 　（ｐＨ８，３）、１．５ｍＭ　ＭｇＣｌ、、０．０１％（Ｗ／’Ｖ）　セラチ ン、各０，２蘭の４種のデオキシヌクレオチド３リン酸（ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、 ｄＣＴＰ、ｄＴＴＰ）、１００μｍ当たり２．５ユニツトのＴａｑポリメラーゼ ）に用いた。プライマーには、各５ｏｐｍＯ１の合成オリゴヌクレオチドＥＢＩ −１７８６（５’−ＧＧＡＡＴｒＣＡＧＣＣＴＧＡＡＴＧＧＣＧＡＡＴＧＧＧ− ３°；Ｍ１３ｏｒｉの配向とは独立にＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ部位４７５中のＭ１ ３ｏｒｉ領域の丁度外側に結合する）およびＥ　Ｂ　Ｉ−１７２９（５’　−Ｃ ＣＴＣＧＡＧＣＧＴｒＧＣＴＧＧＣＧＴＴ了ｎｃｃ−３’　；ｐＣＫＭ８中のＢ ｌｕｅｓｃｒｉｐｔ配列の開始部分に相当する、ｏｒｉの前の部位１１９５でＢ ｌｕｅｓｃｒｉｐｔと結合する；５゛側の６塩基はＸｈｏ１部位を生ずる）を使 用した。９４℃、５分の変性後、２０サイクル（９４℃、４０秒；５５℃、４５ 秒ニア２℃、５分、パーキン・エルマー・シータス、サーマル・サイクラ−）以 上のＰＣＲを行った。オリゴヌクレオチドは、Ｍｌ３の介在領域およびβ−ラク タマーセの中間遺伝子を伴う複製オリジン（ｏｒｉ）に隣接する。同時に、復製 オリジンの終わりにＸｈｏｌ切断部位が生成し、または他端にはＥｃｏＲＩ切断 部位が生成した。反応混合物からフェノール・クロロホルム抽出でタンパク質を 除き、ＤＮＡをエタノールで沈殿させた。このＤＮＡをＸｈｏＩおよびＥｃ。

Ｒ１で切断し、アガロースゲルでの電気泳動後、２．　３ｋｂのフラグメントを 単離した。

Ｂｌｕｅｓｃｒｉｐｔ　ＳＫ十について述べた条件と同様の条件で、５ｎｇの５ ａｃｎで線状化したプラスミドｐＣＤＭ８をオリゴヌクレオチドＥＢＩ−１７３ ３（５’−ＧＧＴＣＧＡＣＡＴＴＧＡＴｒＡＴＴＧＡＣＴＡＧ−３’　；　ｐＡ Ｄ−ＣＭＶ中部中部位対応すルｐＣＤＭ８のＣＭＶプロモーター領域（部位１５ ４２）に結合する、クローニング用５ａｌＩ部位）およびＥ　Ｂ　Ｉ−１７３４ （５’　−ＧＧＡＡＴｒＣＣＣＴＡＧＧＡＡＴＡＣＡＧＣＧＧ−３’　＋　ｐＣ ＤＭＳ中の３’　５Ｖ４０ｐｏｌｙＡ領域のポリオーマ・オリジンに結合する（ 部位３５９０））によりＰＣＲ増幅した。これらのオリゴヌクレオチドはＣＭＶ プロモーター／エンハンサ−配列の最初の部分に結合して５ａｉｌ切断部位を生 成しくＦＢＩ−１７３３）、またＳＶ４０ポリアゾニレ−ジョン部位の末端に結 合してＥｃｏＲＩ切断部位を生成する（ＦＢＩ−１７３４）。このＰＣＲ産物を ５ａｌＴおよびＥｃｏＲＩで切断し、１．８ｋｂのＤＮＡフラグメントをアガロ ースゲルで単離した。

これら２つのＰＣＲ産物をＴ４ＤＮＡリガーゼでライゲーションし、大腸菌ＨＢ ＩＯＩにトランスホーメーシコンした後、プラスミドＤＮＡを標準的方法で増幅 した。所望する特性を有するプラスミドをｐＣＭＶ−Ｍｌ３と命名した（第８図 参照）。

ＳＶ４０複製ｔ’Ｊ　’）ン（ＳＶ４０　ｏ　ｒ　ｉ）をプラスミドｐＳＶ２ｇ ｐｔＤＨＦＲ２０（ＥＰ−Ａｔ　０３２１８４２）から単離した。この目的のた めに、このプラスミドをＨｉｎｄｌｌＩおよびＰｖｕＩ［で二重切断し、そのＤ ＮＡ末端をデオキシヌクレオチド３リン酸の存在下、大腸菌のＤＮＡポリメラー ゼのラージ・フラグメント（クレノー酵素）による処理で平滑化した。このよう にして得られた０、３６ｋｂのＤＮＡフラグメントをアガロースゲルから単離し 、ＥｃｏＲＩで線状化したｐＣＭＶ−Ｍｌ　３にライゲーションした。大腸菌Ｈ ＢＩＯＩのトランスホーメーシコンによって得られるプラスミドであって、β− ラクタマーゼ遺伝子およびＣＭＶプロモーターと同じ配向の５Ｖ４０ｏｒｉを含 むプラスミドをｐＣＭＶ−ＳＶ４０と命名した。このプラスミドの構築を第８図 に示す。

（ｂ）ＤＨＦＲ遺伝子の突然変異誘発 多様なマルチクローニング部位を有する発現プラスミドを調製するために、２つ の制限酵素切断部位をコントロールされた突然変異誘発によりＤＨＦＲミニジー ンから除去し、また３つの制限酵素切断部位を欠失により除去した。これを行う ために、ハムスターＤＨＦＲ遺伝子の全コード領域を含むフラグメントである、 プラスミドｐｓＶ２ｇｐｔＤＨＦＲ２０の１．　７ｋｂのＢｇｌＩ［フラグメン トをプラスミドｐＵＣ２１９（ＩＢＩ）のＢｇｌＩＩ部位にクローニングし、プ ラスミドｐＵＣＤＨＦＲを得た。ｐＵＣＤＨＦＲでトランスホーメーシコンした 大腸菌ＪＭ１０９（ストラタジーン）に約４０倍過剰量のヘルパーファージＲ４ ０８（トスラタジーン）を感染させ、ＬＢ培地中、３７℃で１６時間振盪した。

この細菌上清から一本鎖のプラスミドＤＮＡを単離した。

コントロールされた突然変異誘発は、インビトロ突然変異誘発システムＲＰＮ１ ５２３　（アマ−ジャム）を用い、２段階で行った。エクソン２の始めに存在す るＥｃｏＲ１部位は、塩基置換でＧＡＡＴＴＣをＧＡＧＴＴＣとすることにより 破壊した。この塩基置換は、コードされているアミノ酸配列を変化させず、さら に天然のラットＤＨＦＲ遺伝子中のヌクレオチド配列に対応している（マグロ− ガン等、Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、２６０　（１９８５）２３０７−２３１４　 ；ミッチェル等、Ｍｏ１．Ｃｅ１１．Ｂｉｏｌ、６　（１９８６）４２５−４４ ０）。

突然変異誘発ニハ、配列５’　−ＧＴＡＣＩＴＧＡＡＣＴＣＧＴｒＣＣＴＧ−３ ’　（Ｅ　Ｂ　Ｉ−１７５１）を有するオリゴヌクレオチド（アンチセンス配向 ）を使用した。所望する変異を有するプラスミドを先に述べたように一本鎖ＤＮ Ａとして調製し、オリゴヌクレオチドＥＢ　Ｉ　−１８５７＜７ン＋センス配向 、５’−ＧＧＣＡＡＧＧＧＣＡＧＣＡＧＣＣＧＧ−３°）を用いた突然変異誘発 により、最初のイントロン中に存在するＰｓｔｌをＣＴＧＣＡＧからＣＴＧＣＴ Ｇへと置換することで除去した。この突然変異誘発はシーケンシングにより確認 し、生成したプラスミドをｐＵＣＤＨＦＲ−Ｍｕｔ　２と命名した。

このプラスミドｐＵＣＤＨＦＲ−Ｍｕｔ　２から１．７ｋｂのＢｇｌＩＩフラグ メントを単離し、ＢｇｌｍおよびＢａｍＨＩで二重切断したプラスミドｐＳＶ２ ｇｐｔＤＨＦＲ２０にライゲーションした。大腸菌へのトランスホーメーシコン 後、そのＤＮＡを増幅および単離する事により所望する性質を有するプラスミド が得られ、これをＩ）ＳＶ２ｇｐｔＤＨＦＲ−Ｍｕｔ２と命名した。ＤＨＦＲ遺 伝子の３′非コード領域をＢａｍＨＩで切断することにより、Ｂｇ１ｍ部位に続 き、さらにＫｐｎｌ切断部位を含む０．１２ｋｂのＤＮＡフラグメントを除去し た。ＢｇｌＩＩおよびＢａｍＨＩで生成する重複ＤＮＡ末端を連結することによ り、これら２つの酵素の認識配列も破壊した。

プラスミドｐＣＭＶ−３Ｖ４０をＥｃｏＲＩおよびＢａｍＨＩで二重切断し、そ のＤＮＡ末端をクレノー酵素で平滑化した。このＤＮＡをフェノールおよびクロ ロホルムによる抽出およびエタノール沈殿で精製し、アルカリ・ホスファターゼ とのインキュベーションで脱リン酸化した後、アガロースゲルから４゜４ｋｂの ベクターＤＮＡを単離した。

プラスミドｐＳＶ２ｇｐｔＤＨＦＲ−Ｍｕｔ２　（第９図）をＥｃｏＲＩおよび ＰｓｔＩで二重切断し、そのＤＮＡ末端をｌ１℃で５ユニツトの７４ＤＮＡポリ メラーゼと２０分間インキュベートすることにより平滑化した（５０ｍＭ　トリ ス−ＨＣｌ　（ｐＨ８，０）、５酬　Ｍ　ｇ　ＣＩ　ｔ、５酬　ジチオスレイト ール、各０．１−　の４種のデオキシヌクレオチド３リン酸、５０μｇ／ｍｌ　 ウシ血清アルブミン）。

変異したＤＨＦＲ遺伝子を含む２．４ｋｂ長のＤＮＡフラグメントをアガロース ゲルから単離し、先に調製したｐＣＭＶ−８Ｖ４０とライゲーションした。大腸 菌のトランスホーメーシコン後に得られるプラスミドであって、ＣＭＶプロモー ターと同じ配向でＤＨＦＲ遺伝子を含むプラスミドをｐＣＭＶ−８Ｖ４０ＤＨＦ Ｒと命名した。最後のステップでは、開始プラスミドｐＣＤＭ８に由来するＣＭ Ｖプロモーターの後の０．４ｋｂ長の７ラグメントをマルチクローニング部位と 交換した。この事を行うために、プラスミドｐＣＭＶ−８Ｖ４０ＤＨＦＲをＨｉ ｎｄ■およびＸｂａＩで二重切断し、そのベクタ一部分をアガロースゲルから単 離した。２つのオリゴヌクレオチドＦ　Ｂ　Ｉ−１８２３（５’　−ＡＧＣＴｒ ＣＴＧＣＡＧＧＴＣＧＡＣＡＴＣＧＡＴＧＧＡＴＣＣＧＧＴＡＣＣＴＣＧＡＧＣ ＧＧＣＣＧＣＧＡＡＴｒＣＴ−３’　）およびＥ　Ｂ　Ｉ−１８２９（５’　− ＣＴＡＧＡＧＡＡＴｒbＧ ＣＧＧＣＣＧＣＴＣＧＡＧＧＴＡＣＣＧＧＡＴＣＣＡＴＣＧＡＴＧＴＣＧＡＣＣ ＴＧＣＡＧＡ−３’　）から生成するマルチクローニング部位は、ＨｉｎｄｌＩ ［−Ｘｂａｌへのクローニングに適合する末端を含めて、酵素Ｐｓｔ１．５ａｌ Ｉ、Ｃ１ａ　Ｌ　ＢａｍＨＬ　ＫｐｎＩ、ＸｈｏＬ　ＮｏｔＩおよびＥｃｏＲＩ に対する制限切断部位を含んでいる。２つのオリゴヌクレオチド各ｌμｇを２０ μｌの反応バッファ（７０酬　トリス−ＨＣｌ　（ｐＨ７，６）、１０ｍＭ　Ｍ ｇＣＬ、５蘭　ジチオスレイトール、０．ｌｄ　ＡＴＰ）中、５ユニットのＴ４ ポリヌクレオチドキナーゼで３７℃、１時間処理し、その５゛末端をリン酸化し た。この反応は、７０°Ｃ１１０分間加熱することで停止し、さらに、このサン プルを５６℃で１０分間加熱した後、室温までゆっくりと冷却することでこれら の相補的オリゴヌクレオチドを互いにハイブリダイズさせた。ハイブリダイズし たオリゴヌクレオチド（１００口ｇ）４μｌを約１００１ｇのプラスミドベクタ ーにライゲーションし、大腸菌ＨＢＩＯＩにトランスホーメーシコンした。

マルチクローニング部位の酵素（Ｎｏｔｌは除（）で線状化しうるプラスミドを ｐＡＤ−ＣＭＶｌと命名した。多（のクローンをテストしてみたが、Ｎｏｔｌで 切断しうるプラスミドを有しているものは同定できなかった。シーケンシングは 、常にＮｏｔｌ認識配列の内にい（つかの欠失のあることを示した。オリゴヌク レオチド・ペアＥ　Ｂ　Ｉ−１８２０（５’　−ＡＧＣＴＣＴＡＧＡＧＡＡＴｒ Ｃｆｌ；ＣＧＧＣＣＧＣＴＣＧＡＧＧＴＡＣＣＧＧＡＴＣＣＡＴＣＧＡＴＧＴＣ ＧＡＣＣＴＧＣＡＧＡＡＧＣＴｒＧ−３’　）オヨびＥ　Ｂ　Ｉ−１８２１（５ ’　−ＣＴＡＧＣＡＡＧＣＴＴＣＴＧＣＡfＧ ＴＣＧＡＣＡＴＣＧＡＴＧＧＡＴＣＣＧＧＴＡＣＣＴＣＧＡＧＣＧＧＣＣＧＣＧ ＡＡＴｒＣＴＣＴＡＧ−３’　）を用いた同様の方法で、マルチクローニング部 位内に逆の配列で制限部位を含む発現プラスミドｐＡＤ−ＣＭＶ２を調製した。

このように、Ｎｏｔｌを含む全ての制限酵素で線状化しうるプラスミドｐＡＤ− ＣＭＶ２を得た。

６４１４ｂｐのプラスミドｐＡＤ−ＣＭＶＩ　（第１０図）のヌクレオチド配列 を第１１図に全て示す。

プラスミドのセクション（塩基の番号で示す）は、以下の配列に対応している。

塩基 １−２１　ＥＢＩ−１７３３、ＣＭＶエンハンサーープロモーター（ＣＤＭ８由 来）の開始 ６３２−６４９　Ｔ７プロモーター ６５８−７１３　マルチクローニング部位（ＥＢＩ−１８２３、ＥＢＩ−１８２ ９由来のＨｉｎｄＩ［［−Ｘｂａ　Ｉ）７１４−１４１２　ＳＶ４０のイントロ ンおよびポリアゾニレ−ジョン部位（ＣＤＭ８由来） １４１３−２３１０　ハム７、ターＤＨＦＲ遺伝子（ｐＳＶ２ｇｌ）ｔＤＨＦＲ ２０由来）の５゛非コード領域およびプロモーター２３１１−２３９６　ハムス ターＤＨＦＲ：エクソン１２５１６ＡからＴへの変異がＤＨＦＲイントロンｌ中 のＰｓｔＩ部位を破壊する ２７０１−３１７８　ＤＨＦＲエクソン２−６（コード領域）２７０？　Ａから Ｇへの変異がＥｃｏＲ１部位を破壊する３２７１−３２７３　ＤＨＦＲ３°ＨＦ −ド領域にお（づるＢｇｌＴＩおよびＢａｍＨＩ間の欠失 ３８３１　ＤＨＦＲ遺伝子（＋）ＳＶ２ｇｐｔＤＨＦＲ２０由来）の末端 ３８３２−４１６９　５Ｖ４０ｏｒｉ　（ｐｓＶ２ｇｐｔＤＨＦＲ２０由来）４ １７０−４６４８　Ｍ１３ｏｒｉ　（ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ　ＳＫ＋由来）４ ７８０−５６４０　β−ラクタマーゼ（コード領域）６３９５−６４１４　ＥＢ Ｉ−１７２９、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔベクター配列の末端 プうスミドｐＡＤ−ＣＭＶＩおよびｐＡＤ−ＣＭＶ２の調製に関しては第１Ｏ図 に示した。

実施例５ グリコジル化ヒト・インターフェロン−α２を生産する組み換え“チャイニーズ ・ハムスター・卵巣（ＣＨＯ）”細胞系列の開発ａ）ＣＨＯ細胞のトランスフェ クションおよび安定なトランスフェクト細胞系列の選択 親細胞系列ＣＨＯ−ＤＸＢ　ｌ　１およびＣＨＯ−ＤＧ４４　（Ｐｒｏｃ、Ｎａ 　ｔ　ｌ。

Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ　７７．４２１６−４２２０　（１９８０）；Ｓｏｍ 。

Ｃｅ１１．Ｍｏ１ｅｃ、Ｇｅｎｅｔ、１２，５５５−６６６　（１９８６））を １０９６ウシ胎児血清、ヒポキサンチン（１００μＭ）、チミジン（１６ｇＭ） 、ペニシリンＧナトリウム（１００ユニツト／ｍｌ）およびストレプトマイシン （５０ユニット／ｍｌ）を補ったロスウェル・パーク・メモリアル・インスチチ ュート（ＲＰＭＩ）培地１６４０中で培養した。トランスフェクションの２日前 、細胞を２５ｅｅのボトルに入れた。トランスフェクションの際に、細胞を実質 的に集密化させた。

トランスフェクション実験は、以下のように行った。２０μ■のプラスミドｐＡ Ｄ１９Ｂ−ＩＦＮ溶液（ｌ　μｇ／ｍｌ）を１２５μｌの２Ｍ　ＣａＣ１，およ び８５５μｌの滅菌脱イオン水で希釈した。この溶液を１ｍｌの２ｘＨ８Ｂ　（ ｌｘＨ８Ｂは、１リツトル当たり以下の物質を含む：　８．　ｌ　８ｇ　ＮａＣ １，５，９４ｇ　ヘペス、０．２ｇ　ＮａｔＨＰＯａ　；ｐＨ７，１）に滴下し た。ＣＨＯ細胞の培養培地を取り出し、そのサスペンション０．２５ｎ＋ｌを各 ボトルに添加した。その培養物を３７℃で４時間培養した。このサスペンション を取り出し、トリプシン／ＥＤＴＡ溶液を用いて細胞を表面から剥がして選択培 地（選択培地は、ｌＯ％透析ウシ胎児血清、ペニシリンＧナトリウム　１００ユ ニツト／ｍｌ、ストレプトマイシン　５０ユニット／ｍｌおよびアンホテリシン Ｂ　２．５μｇ／ｍｌを補い、リボヌクレオチドおよびデオキシリボヌクレオチ ドを含まないα修正を施した最小基礎培地を含む；ボトル当たり４０ｍ１）に懸 濁した。さらに、このサスペンションを２枚の細胞培養マイクロプレート（プレ ート当たり９６ウエル、ウェル当たり０．　２ｍ１）のウェルに移し、３７℃で ２週間培養した。また、アンホテリシンＢ以外の特定の選択培地も他の全ての実 験に使用した。

実際に、細胞増殖に関して細胞培養物を検定した。細胞増殖を示すウェルからの 培養培地をＩＦＮ−α２に対する２種のモノクローナル抗体を用いる酵素イムノ アッセイを使用してＩＦＮ−α２含量に関するテストを行った（Ｂｉｏｃｈｅｍ 、Ｊ、２７６．５１１−５１８．１９９１）、このテストは、新しい培養上清を 用いて一週間後にも繰り返した。ポジティブ培養物由来の細胞をトリプシン／Ｅ ＤＴＡ溶液を用いて表面から剥がし、２４ウエルを有する培養皿に移した。良好 な細胞増殖を示す培養物をＩＦＮ生産に関して繰り返しテストした。一般に、上 滑中のＩＦＮ−ａ２２度は、２．０００から〉１０，０００ユニツト／ｍｌの範 囲にあった（ＩＦＮ−α２タンパク質１ｎｇは、２３０ユニツトに相当する）。

ｂ）メソトレキセート選択によるＩＦＮ−α２の増幅多くのテストで高いＩＦＮ 濃度を示した、２つの親細胞系列、ＣＨＯ−ＤＸＢｌｌおよびＣＨＯ−ＤＧ４４ 由来のトランスフェクト細胞を増幅用に選択した。

さらに、３−５個のその他のクローンも合わせて行った。これらの培養物を２５ ＣＣのボトルの選択培地（アンホテリシンＢは除（）中に維持し、これに２０ｎ Ｍまたは５０ｎＭ濃度となるようにメサトレキセートを添加した。週に１度、こ の培養物に新鮮な培地を与えた。約２から３週間後、い（らかの生存クローンが 観察された。細胞が培養面積の約５０％となったところで、再び上清のＩＦＮ− α２含量を検定した。それから細胞を剥がし、希釈して新しいボトルに移した。

ついで、メソトレキセート濃度を約２から５倍、例えば、２０ｎＭから５０およ び１１００ｎ、または５０ｎＭから１００および２０Ｏｎ！ｉｆへと増加した。

増加したメソトレキセートの存在下でのこのような数回の選択サイクル、すなわ ちＩＦＮ生産に従う耐性培養物の選択の後、最終的に５，０００ｎＭまでのメソ トレキセート濃度に耐性であって、かつ比較的多量のＩＦＮ−α２を分泌する細 胞系列を得ることが出来た。

以下に示す表Ｉは、その例として細胞系列ＣＨＯ−ＤＸＢｌ　１−ＩＦＮ−α２ ｃｍ３　／　２　Ｄ　４を用いて生産性の増加を示している。

また、以下に示す表■は、細胞系列ＣＨＯ−ＤＧ４４−ＩＦＮ−α２Ｃ−プール “Ｓ”の結果を示している。

表Ｉ メソトレキセート濃度　培養上滑中のＩＦＮ−α２Ｃ（ｎＭ）　（ユニット／ｍ １） ０　６．０００　−１４．０００ ２０　１２．０００　−８９，０００ ５０　２９．０００　−１２５，０００１００　９６．０００　−１２０，００ ０２００　１１０．０００　−１９０，０００５００　１４０．０００　−３０ ０，０００１０００　３５０．０００　−９００，０００２０００　２００．０ ００　−３５０，０００表■ メソトレキセート濃度　培養上溝中のＩＦＮ−α２Ｃ（ｒＬ！１ｌ）（ユニット ／ｍ１） ２０　２９．０００　−８３．０００ ５０　５８．０００　−１１２．０００１００　６９．０００　−９８．０００ ２００　７１．０００　−２２０．０００５００　１９０．０００　−２２０， ０００１０００　１７０．０００　−５７０．０００２０００　２００．０００ 　−３５０．０００５０００　１９０．０００　−３２０，０００組み換えＣＨ Ｏ細胞の培養上滑から、従来法（例えば、Ｎａｔｕｒｅ　２８５゜４４６−４５ ０．１９８０；Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、２６５．９２９０−９２９５、１９９ ０；Ｂｉｏｃｈｅｍ、　Ｊ、　２７６、５１１−５１８．１９９１）を用いたモ ノクローナル抗体（例えば、抗体ＥＢＩ−ＩまたはＥＢＩ−１０）によるアフィ ニティークロマトグラフィーでＩＦＮ−α２を精製できた。特に、本発明のタン パク質は、ＥＰＡ　０　２０３　３８２に示されている方法で精製しうる。

実施例６ チャイニーズ・ハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞由来の組み換えグリコジル化ヒト ＩＦＮ−α２Ｃの分析 ａ）逆相ＨＰＬＣ（ＲＰ−ＨＰＬＣ） アフィニティークロマトグラフィーで精製したＣＨＯ細胞由来の組み換えグリコ ジル化ＩＦＮ−α２ｃをＲＰ−ＨＰＬＣによりグリコジル化していない大腸菌由 来の組み換えＩＦＮ−α２ｃと比較した。分析法の詳細は、アドルフ等、Ｊ。

Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、２６５．９２９０−９２９５　（１９９０）に示されてい る。

グリコジル化ＣＨＯ−ＩＦＮ−α２ｃ（第２１図の上部分）は、２つのメインピ −ク（ピークｌおよび２）および２つの小さいＩＦＮピーク（ピーク３および４ ）を含んでいる。一方、非グリコジル化大腸菌ＩＦＮ−α２ｃ（第２１図の下部 分）は、１つのメインピーク（正しいジスルフィド結合）および“スクランブル 型”ジスルフィド結合形に由来するより小さいサブピークを含んでいる。保持時 間の比較で、ＣＨＯ−ＩＦＮ−α２ｃの２つのメインピークは、大腸菌ＩＦＮ− α２Ｃのメインピークよりも幾分速く溶出することを示している。この疎水性の 減少の理由は、ＣＨＯ−ＩＦＮ−α２ｃ中のオリゴサツカライドの存在である。

ＣＨＯ−ＩＦＮ−α２ｃ中の２つの小さいＩＦＮピークは、大腸菌ＩＦＮ−α２ ｃのメインピークと同じ保持時間を有しており、おそらく、これはＣＨＯ−ＩＦ Ｎ−α２ｃの非グリコジル化部分がより小さいことに由来すると考えられる。

ｂ）Ｎ末端シーケンシング ＣＨＯ−ＩＦＮ−α２Ｃの２つのメインピークをＲＰ−ＨＰＬＣで単離し、シー ケンシングした。シーケンシング条件は、アドルフ等、Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ 、２６５．９２９０−９２９５　（１９９０）に示されている。最初の１５個の アミノ酸は、ｃＤＮＡ配列にしたがって同定しつる。Ｎ末端の”均一性は示され なかった。

ｃ）Ｃ末端分析 大腸菌ＩＦＮ−α２ｃのメインピークおよびＣＨＯ−ＩＦＮ−α２ｃの２つのメ インピークをＲＰ−ＨＰＬＣで単離し、トリプシンで切断した。もう一度、トリ プシン分解ペプチドをＲＰ−ＨＰＬＣで分離した。実験条件は、アドルフ等、Ｂ ｉｏｃｈｅｍ、Ｊ、２７６．５１１−５１８　（＋９９１）に示されている。第 ２２図は、得られたペプチド地図の比較を示している。ＣＨＯ−ＩＦＮ−α２ｃ のピークｌおよびピーク２のペプチド地図の間には、たった１つの差しか見られ ない（上および甲部分）。具体的には、ピークｌ由来のトリプシン分解ペプチド は、ピーク２には存在しない（ここではペプチド１５に相当）。その代わりに、 ピーク２の地図には新しいペプチド（１９番）が見られるが、このピークはピー クｌにおいても、また大腸菌ＩＦＮ−α２ｃ（第２２図の下部分）においても全 く見られない。

ペプチド１２（大腸菌−ＩＦＮ−α２Ｃ由来）、１８　（ＣＨＯ−Ｉ　ＦＮ−ａ 　２Ｃのピーク１由来）、１５およびｌ　９　（ＣＨＯ−ＩＦＮ−α２Ｃのピー ク２由来）をプラズマ脱離マススペルトル測定（ＰＤ−ＭＳ）で分析した。実験 の詳細は、アドルフ等、Ｂｉｏｃｈｍ、Ｊ、２７６．５１１−５１８　（１９９ １）に示されている。上述のサンプルの内の最初の３つには、ＩＦＮ−α２Ｃ配 列のアミノ酸１５０から１６２に相当する分子量が示された。一方、ＣＨＯ−Ｉ ＦＮ−α２Ｃのピーク２由来のペプチド１９は、アミノ酸Ｉ５０から１６１に相 当するより小さな分子量を与えた。また、ペプチド１９の一部をシーケンシング すると、このペプチドがアミノ酸１５０で始まり、ＬＥＵ−１６１で終わってい ることが明らかに示された。これらの結果から、ＣＨＯ−ＩＦＮ−α２ｃのピー クｌは、完全なＩＦＮ分子を含んでいるが、ピーク２においては、４個のＣ末端 アミノ酸（１６２−１６５）が欠失していると結論できる。アミノ酸１６３−１ ６５は、トリプシン切断後のペプチド地図に検出できなかったが、これは生成し たジペプチド（１６３−１６４）および遊離アミノ酸（１６５）がＲＰカラムの デッド・ボリューム中に溶出したためである。ＣＨＯ−ＩＦＮ−α２ｃのピーク ２に見られるペプチド１５の一部（アミノ酸１５０−１６２を含む非短縮型トリ プシン分解ペプチド）は、ピーク１とピーク２がＲＰ−ＨＰＬＣにより完全には 分離できないことから、混入するピーク１画分に寄因させる事が出来る。

さらに実験を重ねていくと、培養容器の表面から細胞を剥がす際に、通常のトリ プシン／ＥＤＴＡ溶液の代わりに無トリプシン溶液（例えば、リン酸緩衝液（ｐ Ｈ７，４）中、ＥＤＴＡ二ナトリウム塩、２００ｍｇ／ｌおよびＤ（＋）グルコ ース・モノハイドレート、２００■／１）を用いるとＣＨＯ細胞由来のＯ−グリ コジル化ＩＦＮ−α２のＣ末端の短縮を防ぐことが出来ることが分かった。先に 述べた方法を使用して、このように培養した細胞培養物から精製したＩＦＮ−α ２は、逆相ＨＰＬＣ（第２１ａ図と同様に）において完全なタンパク質に対応す るピークｌのみを示し、短縮型のタンパク質に対応するピーク２は示さなかった 。

さらに、トリプシン分解地図（第２２図と同様に）により、トリプシンを使用し ないで調製したこのタンパク質のペプチドパターンは、ピークｌから発生するペ プチドのパターンと同一であることを示すことが出来た（第２２ａ図）。

ｄ）ＳＤＳゲル電気泳動 ＣＨＯ−ＩＦＮ−α２Ｃのピーク！および２をＲＰ−ＨＰＬＣで単離した。これ らを各々、および大腸菌ＩＦＮ−α２ｃと比較しながら、還元条件下（ジチオス レイトールとの煮沸後）および非還元条件下のＳＤＳゲル電気泳動で分析した。

実験の詳細は、アドルフ等、Ｊ、Ｂｉｏ、Ｃｈｅｍ、、２６５．９２９０−９２ ９５　（１９９０）に示されている。この結果を第２３図に示す（非還元条件下 のトレース２−４、還元条件下のトレース５−７：各トレースでＩＦＮ４μｇを 使用した上部、各トレースでＩＦＮＩμｇを使用した下部）。特に、下部のトレ ース５−７から、ＣＨＯ−ＩＦＮ−α２Ｃのピークｌおよび２の両ピークが非グ リコジル化大腸菌ＩＦＮ−α２ｃよりも大きい分子量を有していることは明白で ある。ＲＰ−ＨＰＬＣにおけるピーク１および２の不完全な分離から、ピークｌ および２は相互に混入している。同じ理由で、ピーク２は、ピーク３に由来する 少量の非グリコジル化ＣＨＯ−ＩＦＮ−α２Ｃで汚染されている（第２１図）。

この汚染を考慮すると、ＣＨＯ−ＩＦＮ−α２ｃのピークｌおよび２のメインバ ンドは、均一であると考えられる。ピークｌと２は、Ｃ末端が異なるので（上述 ）、ＳＤＳゲル電気泳動の結果から、ＣＨＯ−ＩＦＮ−α２ｃのピークｌおよび ２のオリゴサツカライド含量は同一であると結論しうる（後のｆ）の章参照）。

ｅ）ＣＨＯ−Ｉ　Ｆ　Ｎ−ａ　２　ｃの脱グリコジル化ＣＨＯ−ＩＦＮ−ａ２ｃ のピークｌおよび２をＲＰ−ＨＰＬＣで単離し、スピードバク・コンセントレー タ−で乾燥した。これらのサンプルおよび大腸菌ＩＦＮ−ａ２ｃを１０μｍの０ ．ＬＭ　ＮａＯＨ中、室温で２０時間インキュベートした。このβ−説離で脱グ リコリル化したサンプルをＳＤＳゲル電気泳動で未処理のサンプルと比較するこ とにより分析した。第２４図の結果は、ＣＨＯ−ＩＦＮ−α２ｃのピーク１およ び２の分子量が、ＮａＯＨによる処理で有意に減少し、かつ、ＮａＯＨで処理し た大腸菌のＩＦＮ−α２Ｃの分子量と同じであることを示している。ＮａＯＨで 処理した全てのサンプルのバンドが拡散して見えるのは、使用した反応条件下に おけるペプチド鎖の変化に寄因させることが出来る。

ｒ）ペプチドマツピングによる糖ペプチドの同定大腸菌ＩＦＮ−ａ２ｃ　（第２ ２図、下部）およびＣＨＯ−ＩＦＮ−α２Ｃのピークｌ　（完全なＣ末端）（第 ２２図、上部）のトリプシン分解後のペプチド地図の比較は、２つのペプチドか 異なる保持時間を有していることを示している。それぞれ、アミノ酸８４−１１ ２および７１−１１２を含む大腸菌ＩＦＮ−α２ｃのペプチド１８および２１は 、ＣＨＯ−ＩＦＮ−α２ｃのピークｌのペプチド地図には出現していない。その 代わりに、２８０ｎｍおよび２１４ｎｍにおける吸収比率が大腸菌のＩＦＮ−α ２ｃのペプチド１８および２１と同じである２つの新しいペプチド（２６番およ び３１番）が存在する。この事から、ペプチド２６および３１は、各々アミノ酸 配列８４−１１２および７１−１１２のグリコジル化型であると結論しうる。従 って、これらは大腸菌ＩＦＮ−α２ｃの類似ペプチドよりも有意に速＜ＲＰカラ ムから溶出する。２つの長さのトリプシン分解ペプチド（アミノ酸８４−１１２ および７ｌ−１１２）に関して、それぞれにメインピークがあることから（ペプ チド２６または３１）、オリゴサツカライド含量も概ね均一であると結論しうる 。

ＣＨＯ−ＩＦＮ−α２ｃのピークｌおよびピーク２のペプチド地図の比較は、問 題の糖ペプチド（ピークｌの２６および３１、およびピーク２の２４および３０ ）が同一のものであることを示している。従って、ピーク２のＣ末端の４個の失 われたアミノ酸がピークｌと２の間の唯一の差であると考えることが出来る。

アミノ酸配列８４−１１２および７１−１１２の関する３つのＩＦＮサンプルの 全ての主要ペプチドをＲＰ−ＨＰＬＣで単離し、グルタミン酸のＣ側をスタフィ ロコッカス　オーレウス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ　ａｕｒｅｕｓ）Ｖ８ ブロテアーセで切断した。正確な条件は、アドルフ等、Ｂｉｏｃｈｅｍ、Ｊ。

２７６．５１１−５１８　（１９９１）に示されている。生成するペプチド地図 を比較し、全ての異なるピークを単離して、Ｎ末端シーケンシングおよび／また はマススペルトルで分析した。

ＣＨＯ−ＩＦＮ−α２ｃのピーク１および２で生成するが、大腸菌ＩＦＮ−α２ ｃには生成しない５ｔａｐｈ、Ａペプチドの１つは、ＩＦＮ−α２Ｃ配列のアミ ノ酸９７−１１２を含んでいた。このペプチド中のＴＨＲ−１０６をＮ末端シ− ケンシングで同定することは出来なかった。この事から、ＴＨＲ−１０６は、こ のペプチドのグリコジル化型に存在すると結論しうる。ここで使用したエドマン ・シーケンシングでは、グリコジル化アミノ酸は誘導体を作り、非グリコジル化 アミノ酸の様に切断されるが、これらの親水性の増加からブチルクロライドによ って反応容器から抽出する事が出来ない。従って、この分解ステップでは、いか なる種類のアミノ酸も同定できないが、その配列は以後分解される事はない。

このオリゴサツカライドがＴＨＲ−１０６に結合しているという別の証拠は、Ｇ ＬＵ−１０７／ＴＨＲ−１０８の結合が５ｔａｐｈ、Ａ、プロテアーゼにより部 分的にではあるが切断を受けるという結果から提供される。大腸菌ＩＦＮ−α２ Ｃ由米の同様のペプチドでは、このペプチド結合は殆ど完全に分解される。

ＣＨＯ−ＩＦＮ−α２Ｃにおいてのみ生成する他の５ｔａｐｈ、Ａ、ペプチドを プラズマ脱離マススペルトルで分析した。この分子量は、１分子のＮ−アセチル ガラクトサミンおよびガラクトースおよび２分子のＮ−アセチルニューラミノ酸 からなるオリゴサツカライドを含むアミノ酸９７−１１２に対応している。

これらの結果は、ＣＨＯ−ＩＦＮ−α２Ｃのグリコジル化部位およびオリゴサツ カライド含量の両方か概ねウィルス刺激化白血球由来の天然のＩＦＮ−α２に存 在する割合と同じであることを示している。

ウィルス刺激化細胞からのＯ−グリコジル化インターフェロンの単離方法 インターフェロン・バイオアッセイ・ エンセファ０ミオカルジチス・ウィルス（ＥＭＣＶ）の細胞変性効果（ＣＰＥ） を測定する検定法を使用して、マイクロプレート中でＩＦＮ調製物の抗ウィルス 活性を測定した。テストには、Ａ３４９ヒト肺ガン細胞を使用した。この検定法 の詳細は報告されている（例えば、アドルフ、Ｇ、　Ｒ，、Ｊ、　Ｇｅｎ、　Ｖ ｉ　ｒ。

１．６８．１６６９−１６７６　（＋９８７））。各検定における全ての測定は ２回行った。各検定には、大腸菌中で生産した組み換えヒトＩＦＮ−α２Ｃの実 験室標準調製物を含めた。この調製物の活性は、ヒトＩＦＮ−α２の国際参照調 製物Ｇｘａ　０１−９０１−５３５と比較することにより簡単に測定しうる。観 測された全てのＩＦＮ活性は、この参照調製物に規定されている活性に関して補 正した。

インターフェロンＥＬＩＳＡ： ＩＦＮ−αおよび標準物質としてのＩＦＮ−α２ｃ実験室参照調製物（上述）に 対する２つの中和マウスＩｇＧＭＡｂを使用してＥＬＩ　ＳＡを行った。それら の抗体の調製法および特性は報告されている（アドルフ等、Ｊ、Ｃｅ１ｌ　Ｐｈ ｙｓｉｏｌ、５ｕｐｐ１．２．６１−６８　（１９８２）；アドルフ　Ｇ、Ｒ， 。

Ｊ、Ｇｅｎ、Ｖｉｒｏｌ、６８．１６６９−１６７６））、抗体ＥＢＩ−１を使 用して検定プレートをコートした。ホース・ラディッシュ・パーオキシダーゼと 共有結合した抗体ＥＢＩ−１０をサンプルに添加して検定した。酵素の基質とし ては、０−フユニレンジアミンおよび過はう酸ナトリウムを使用した。反応は硫 酸を添加して停止し、生成物の吸収を測定した（４９２ｎｍ、参照　６９０ｎｍ ）。

天然のヒトＩＦＮ−α２の精製： 使用説明書（ファルマシア）に従い、ＩｇのＣＮＢｒ活性化セファロース４Ｂに １２■のモノクローナル抗体、例えば、ＭＡｂＥＢＩ−１０（標準的方法に従い 、マウス腹水から硫安沈殿およびプロティンＧアフィニティークロマトグラフィ ーで精製した）を結合することによりアフィニティーカラムを調製した。このカ ラムの最終的ベッドボリュウムは、約３ｍｌであった。ＩＦＮ−ω成分を除去し くアドルフ等、Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、２６５．９２９０−９２９５（１９９ ０））、かつ、２■／ｍｌの全タンパク質濃度で約２−３ｘｌＯ’　ＩＵ／ｍｌ の活性を含む部分的に精製したヒト白血球インターフェロン（キャンチル等、Ｍ ｅｔｈｏｄｓＥｎｚｙｍｏｌ、７８．２９−３８　（１９８１）；キャンチル等 、１ｂｉｄ。

４９９−５０５）をｌ　ｍｌ／ｍ１ｎの流速でカラムに流した（２００および３ ５０ｍ１）。

ＦＰＬＣシステム（ファルマシア）を使用し、流速Ｌｍｌ／ｍｉｎの流速でＯ， １Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７，５、バッファＡ）を用いてカラムを洗浄した後、バ ッファＡおよびバッファＢ（０，１Ｍクエン酸ナトリウム、ｐＨ２，１）の直線 濃度勾配で溶出を行った。得られたフラクションは、ＥＬＩＳＡでＩＦＮ活性を 検定した。

２つの混合物中の相当フラクションを回収し、ＩＭ　ＮａＯＨで中和した後、再 びバッファＡで平衡化した同カラムにかけた。同様の溶出プログラムを使用した く流速０　、　２５　ｍｌ／ｍ１ｎ）。再び相当フラクションを回収し、中和後 、小分けして冷凍した。

ＳＤＳゲル電気泳動、ＨＰＬＣおよびアミノ酸シーケンシング：ＳＤＳポリアク リルアミドゲル電気泳動および逆相ＨＰＬＣを使用して精製したＩＦＮ−α２を 分析した。全ての方法の詳細は報告されている（アドルフ等、Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃ ｈｅｍ、２６５．９２９０−９２９５　（１９９０））、Ｎ末端配列は、自動シ ークエネーター（アプライド・バイオシステムズ、モデル４７７Ａ）で測定した 。アミノ酸誘導物は、ＲＰ−ＨＰＬＣでオンラインで分析した（アドルフ等、Ｊ 、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、２６５．９２９０−９２９５））。

分解ペプチドの“マツピング″： アドルフ等、Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、２６５．９２９０−９２９５）の方法に 従い、アフィニティー精製したＩＦＮ−α２を再度逆相ＨＰＬＣで精製し、変性 抜脱塩した。ピークフラクションを回収し、５ｐｅｅｄＶａｃコンセントレータ −で乾燥した。０．１ｍｌの１％炭酸水素アンモニウム溶液にタンパク質２９μ ｇ（ピーク１）および６６μｇ（ピーク２）を溶解し、それぞれ３または６μｌ の０．０１％トリフルオロ酢酸中、各々０．５μｇおよびｌμｇのトリプシン（ ベーリンガー・マンハイム）を添加して、その反応混合物を３７℃でインキュベ ートした。６時間後、再び等量のトリプシンを添加し、さらに１８時間インキュ ベートした。

分析前に反応混合物にｌＯμｌの０．５Ｍジチオスレイトールおよび１００μｌ の６麻素を添加し、室温で２時間かけて還元した。以下の溶媒：溶媒Ａ：０．１ ％トリフルオロ酢酸水溶液：溶媒Ｂ：０．１％トリフルオロ酢酸／アセトニトリ ル溶液を用い、Ｄｅｌｔａ　Ｐａｋ　Ｃ１８カラムを使用した逆相ＨＰＬＣを３ ０℃で行った。以下の勾配プログラムを使用した（流速１ｍｌ／ｍ１ｎ）　：　 ０−５５ｍ１ｎ：０−５５％Ｂ（直線勾配）；　５５−７０ｍ１ｎ：　５０％Ｂ ０ペプチドは、２１４および２８０圓の吸収で測定した。そのパターンを大腸菌 由来の組み換えＩＦＮ−α２ｃのパターンと比較した。組み換え物と異なる溶出 特性を示す天然のＩＦＮ−α２のペプチドを回収し、Ｎ末端シーケンシングする か、または、さらにそれらをスタフィロコッカス　オーレウス（Ｓｔａｐｈｙｌ ｏｃｏｃｃｕｓ　ａｕｒｅｕｓ）Ｖ８プロテアーゼ（エンドペプチダーゼ　Ｇｌ ｕ−Ｃ、ベーリンガー・マンハイム）で分解した。Ｏ，１ｍｌの２５−リン酸緩 衝液（ｐＨ７，８）にペプチド０．８８μｇ（ピークｌ／Ｉ）　、２．６ｎｇ　 （ピーク２／Ｉａ）および１．５μｇ（ピーク２／Ｉｂ）を溶解した。水に溶解 したプロテアーゼを添加しく　１７．５ｎｇ、５２．５ｎｇおよび２９μｇ）、 この反応混合物を３７℃でインキュベートした。

６時間後、再度等量のプロテアーゼを添加し、１８時間インキュベートした。こ のサンプルを逆相ＨＰＬＣで分析した（上記参照）。相当するフラクションを回 収し、Ｎ末端シーケンシングした。

ＩＦＮ−α２の脱グリコジル化： 精製、変性および脱塩したＩＦＮ−α２をビブリオ・コレラ・ニューラミニダー ゼ（ベーリンガー・マンハイム）　（５０ｍＵ／ｍｌ、２０μｌの５０−酢酸ナ トリウム（ｐｉ（５，ｓ）、４　ｍｃ　ａ　ＣＩ　を中３７℃、１８時間）およ び／またはエンド−α−Ｎ−アセチル−ガラクトサミニダーゼ（０−グリカナー ゼと同じ）（ベーリンガー・マンハイム）　（１００ｍＭ／ｍｌ、同バッファ中 ３７℃、１８時間）で処理した。０．ＩＭ　ＮａＯＨ中、室温、２０時間のイン キュベーションで化学的脱離が達成された。

プラズマ脱離マススペルトロメトリー・“ＢＩＯ−１ＯＮ　２０　タイム・オブ ・フライト”マススペクトロメーター（ＢＩＯ−ＩＯＮ　ノルディックＡＢ、ア ブサラ、スウェーデン）でトリプシン分解ペプチドをマススペクトルを測定した 。サンプルをトリフルオロ酢酸水溶液（０，１％）に溶解し、ニトロセルロース コートしたターゲット（ＢＩＯ−ＩＯＮ）に乗せた。スペルトル積算時間は、収 量に応じて０．　５から１２時間の範囲とした。スペルトルは、加速電圧１７ｋ Ｖで測定した。

実施例７ 天然のヒトＩＦＮ’−α２の精製 センダイ・ウィルスで誘導したヒト抹消ミルパ球から得られ、キャンチル等（Ｍ ｅｔｈｏｄｓ　Ｅｎｚｙｍｏｌ　７８．２９−３８および７８，４９９−５１２ （１９８１））の方法で部分的に精製したヒトリンパ球インターフェロンを出発 物質として使用し、ＩＦＮ−α２を単離、精製した。例えば、ＯＭＧ−４、ＯＭ Ｇ−５、またはＯＭＧ−７等の抗ＩＦＮ−（ｄモノクローナル抗体を用（Ａた選 択的アフィニティークロマトグラフィーにより、ＴＦＮ−ωを除去した（アドル ］等、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ　１７５．４１０−４１７　（１９９０）；ＥＰＡ　２ ６２５７１）。特異的抗ウィルス活性は、１−２ＸｌＯ’　ＩＵ／■であった。

従って、２Ｘ１０’ｌＵ／■の比活性を有するＩＦＮ−αは、全タンパク質含量 の僅か１％である。混入する異種タンパク質、および同時に他種のＩＦＮ−αの ＩＦＮ−α２活性を除去するために、高選択性抗−ＩＦＮ−α２モノクローナル 抗体を使用した。これらの抗体は、標準化された中和バイオアッセイにおいてＩ ＦＮ−α２に高い特異性を有する（アドルフ　Ｇ、　Ｒ，、Ｊ、　Ｇｅｎ、　Ｖ ｉ　ｒｏ　ｌ。

６８．１６６９−１６７５　（１９８７））。

イムノアフィニティー・カラムは、この種のモノクローナル抗体、例えば、Ｊ。

Ｇｅｎ、Ｖｉｒｏｌ、６８．Ｉ　６６９−１６７６　（１９８７）またはＤＥ　 ３３０６０６０．６の方法で調製したＥＢＩ−１０のＣＮＢｒ活性化セファロー ス４Ｂへのカップリングにより調製した。この抗体は、標準操作を用いた硫安沈 殿およびプロティンＧアフィニティークロマトグラフィーによりマウス腹水力１ ら精製した。例えば、１２■のモノクローナル抗体ＦＢＩ−１ｏを説明書（フル マシア）の推薦する条件でＩｇのＣＮＢｒ活性化セファロース４Ｂにかツブリン グするのに使用した。カラムの最終ベッド・ポリウムは、約３ｍｌであった。

白血球インターフェロン調製物をこのカラムにかけた。約２０％の抗ウィルス活 性が結合した。このカラムをＯ，ＬＭ　リン酸ナトリウム（ｐＨ７’、５）およ び０．　１Ｍ　クエン酸ナトリウム（ｐＨ２，１）の直線ツク・ソファ勾配で溶 出した。

溶出物を２つのタンパク質ピークに分離できた（第１２図）・フラクションＡお よびフラクションＢ、ＦＢＩ−１０およびＦＢＩ−１を用いた“ツー・サイドＥ ＬＩＳＡ”でそれら２つのフラクションのＩＦＮ−α含量を分析した。両抗体は 、ＩＦＮ−α２に対して高い特異性を示した（フドルフ等、Ｊ、Ｃｅ１ｌ　Ｐｈ ｙｓｉｏｌ、５ｕｐｐ１．２．６１−６８　（１９８２））、組み換えＩＦＮ− α２ｃを標準物質として使用した。サンプルと同様に、低ｐＨ側で溶出したフラ クション（第１２図、ピーク“Ａ”）は組み換えＩＦＮ−α２ｃの測定曲線と平 行する測定曲線を示した。第１ピーク（“Ｂ”）のフラクションは、異なる曲線 を示した。従って、これらをＥＬＩＳＡで定量する事は出来なかったが、生物学 的検定でチェックした（表■）。

ＥＬＩＳＡの結果と同様に、ピークＡを溶出するのに低ｐＨが必要であることは 、ＩＦＮ−α２がピークＡの主成分であることを示している。全ての免疫反応性 ＩＦＮ−αが抗体と結合したことを確認するために、この物質をもう一度カラム に通し、上述のように二度目の溶出を行った。溶出した物質は、最初の溶出の際 のＩＦＮ活性のせいぜい１０％であった。

ＡおよびＢの両フラクションを別々に回収し、中和後、再び同じアフィニティー カラムのクロマトグラフィーで精製した。双方、９５％以上のＩＦＮ活性が結合 した。溶出は最初と同様の勾配位置であった。出発物質、カラムの運転条件およ び両クロマトグラフィーの回収フラクションを、これらのタンパク質含量に関し てはコマージ・ブルー染色検定法で、またＩＦＮ活性含量に関しては抗ウイルス バイオアッセイで検討した。その結果を表■に示す。

天然ＩＦＮ−α２の精製 容積　タンパク質　抗ウィルス活性　収率第１サイクル　５５０　１．７　２． ２　１２１６　７９スルーフロー 第１サイクル　１８　０．０８　９．６　１７２　１１溶出物Ａ 第１サイクル　１７　０．０５　４．３　７３　４．８溶出物Ｂ 第２サイクル　８　０．１　１２　９６　６．２溶出物Ａ 第２サイクル　４　０．１　１３　５４　３．５溶出物Ｂ １５回のバイオアッセイの平均 ’ＩＦＮ−ωＩ除去後の部分精製したヒト白血球ＩＦＮ実施例８ アフィニティー精製したタンパク質に関するＩＦＮ−α２の同定先ず、アフィニ ティー精製したＩＦＮ−αを逆相クロマトグラフィーで分析および精製した。ピ ークＡは、質量比約１：２の完全に分離しないピークｌおよび２の２つのピーク を示した。ピーク“１”は、より親水性のタンパク質画分である。２つのピーク フラクションを回収し、再びクロマトグラフィー分離後、Ｎ末端アミノ酸分析を 行った。両フラクションから以下の配列が得られた（括弧付きのＣｙｓ基は同定 されなかったが、保存的ＩＦＮ配列に基づき誘導したものである）。

（’　ＣＹＳ）−ＡＳＰ−ＬＥＵ−ＰＲＯ−’　ＧＬＮ−ＴＨＲ−ＨＩＳ−ＳＥ Ｒ−ＬＥＵ−”ＧＬＹ−８ＥＲ−ＡＲＧ−ＡＲＧ−ＴＨＲ−”ＬＥＵ−ＭＥＴ− ＬＥＵ−ＬＥＵ−ＡＬＡ−”ＧＬＮ−ＭＥＴ−ＡＲＧ−”ＡＲＧ−ＩＬＥ−”５ ＥＲ−ＬＥＵ−ＰＨＥ−８ＥＲ−［ＣＹＳ）−３０ＬＥＵ−報告されている配列 と比較して、両フラクションのタンパク質をＩＦＮ−α２と同定した。

両ピークフラクション“ｌ”および“２”における部位２３のアミノ酸は、明ら かにアルギニンと同定された。従って、部位２３にリジンを有するＬｅ　ＩＦＡ と命名された変異体（ジョーデル等、Ｎａｔｕｒｅ、２９０．２Ｏ−２６（１９ ８１））は、使用した白血球調製物中に検出可能な量が存在しなかった。

部位３４は、ヒスチジンと同定された。従って、単離したＩＦＮ−α２は変異体 ＩＦＮ−α２ｂであった。

２１４ｒｕｎの吸収によるタンパク質含量に基づ（（アドルフ等、ＶｉｒｏｌＯ ｇｙ１７５，４１０−４１７　（１９９０））、ＩＦＮ−α２に関する国際参照 調製物、Ｇｘａｏｌ−９０１−５３５を基準とした天然のＩＦＮ−α２の抗ウイ ルス比活性は、１．５ｘｌＯ”　ＩＵ／ｍｇ（５回の独立するバイオアッセイの 平均）と測定された。

逆相ＨＰＬＣに関する天然ＩＦＮ−α２と組み換え大腸菌ＩＦＮ−α２ｃの保持 時間の比較から、組み換えタンパク質は有意に遅く溶出することが明らかになっ た（第１４図）。従って、天然タンパク質の親水性の増加および不均一性は、翻 訳後の修飾と関連する。

溶出ピーク“Ｂ”の逆相ＨＰＬＣは、５個の完全に分離しないピークを含む複雑 なパターンを生じた。配列分析は、これら全てのピークがＩＦＮ−α種であり、 そのいずれもがＩＦＮ−α２では無いことを示した。

さらにＨＰＬＣで精製したＩＦＮ−α２をジチオスレイトール還元後ＳＤＳ−Ｐ ＡＧＥで分析した（第２０図）。選択した条件下、大腸菌の組み換えＩＦＮ〜α ２ｃは、見かけの分子量１７，０ＯＤ（アミノ酸配列から見積もった分子量＝１ ９．２８７Ｄ）を示した。ＨＰＬＣピークフラクション“１″は、比較的ブロー ド単一バンドを与えたが（見かけの分子量：２０，０ＯＯＤ）、ピークフラクシ ョン“２”は、２つの主成分（２０，０００および１９，０ＯＯＤ）および１つ の副成分（２１，０ＯＯＤ）に分離した。大腸菌由来の組み換えタンパク質と比 較した分子量の差、サイズの不均一性および親水性の増加は、天然のＩＦＮ−α ２がグリコジル化していることを示している。ＩＦＮ−α２構造中にＮ−グリコ ジル化の認識部位が無いことから、Ｏ−グリコジル化であると考えられる。

実施例９ 天然ＩＦＮ−α２とエンド−およびエクソグリコシダーゼとの反応以下の実験は 、ＲＰ−ＨＰＬＣによる分離後の２つのピークを用いて行った（第１４ｂ図のピ ークｌおよび２）。両サンプルをニューラミニダーゼとインキュベートし、つい でＯ−グリカナーゼとインキュベートした。各酵素反応後、その一部を５ＤＳ− ＰＡＧＥで分析した。

第１６図から分かるように、ピークｌはニューラミニダーゼともＯ−グリカナー ゼとも反応しなかった。見かけの分子量は、２０，０ＯＯＤで一定のままであっ た。一方、ピーク２の３つのバンドは、ニューラミニダーゼともＯ−グリカナー ゼとも反応した。２つの重いバンド（Ｍｒ２１，０００および２０，０００）の 見かけの分子量は、ニューラミニダーゼとの反応で１９，０００に減少した。

しかし、見かけの分子量２０，０００のバンドの一部の移動度には遅れがあった 。

これに続く該タンパク質のＯ−グリカナーゼとのインキュベーションでは、さら に１９，０００から１７．５００（＝大腸菌ＩＦＮ−α２Ｃの見かけの分子量） への見かけの分子量の減少があった。Ｍｒ１９，０００の成分は、すべて分解し た。先の述べたように、少量の見かけの分子量２０，０００のバンドは、ここで も検出された。ＲＰ−ＨＰＬＣによる第１４ｂ図の２つのピークＩおよび２の分 離が不完全であるため、Ｍｒ２０，０００のバンドの未切断画分がピークｌによ るピーク２の汚染を引き起こしているのであろう。

別の実験で、ニューラミニダーゼによる処理無しにピーク２をＯ−グリカナーゼ とインキュベートした（０−グリカナーゼは、他の化合物による置換を受けてい ないタンパク質からジッカライドＧａ　ｉ（β１−３）Ｇａ　１ＮＡｃを切断す る）。

この反応物を５ＤＳ−ＰＡＧＥでもう一度分離した（第１７図）。ピーク２の最 も軽い成分のみが分子量の減少（Ｍｒ１９，０００からＭｒ１７．５００への減 少）を起こしていることは明らかである。２つのより重い成分（Ｍｒ２１，００ ０および２０，０００）の見かけの分子量には変化が無かった。

実施例１０ 天然ＩＦＮ−ａ２の０．ＩＭ　ＮａＯＨとの反応０−グリコシレージョンは、マ イルドなアルカリ条件下でも分解しうるから、０．１Ｍ　ＮａＯＨとのインキュ ベーションによるＯ−グリカナーゼ耐性成分（第１４ｂ図のピークｌ）の脱グリ コジル化を試みた。反応は上記のように行った。

同時に、コントロールとして大腸菌ＩＦＮ−α２ｃおよびピーク２も同条件下で インキュベートした。反応物は５ＤＳ−ＰＡＧＥで分析した。第１８図に見られ るように、天然ＩＦＮ−α２の全ての成分の分子量は、大腸菌ＩＦＮ−α２の見 かけの分子量にまで減少した。明確なタンパク質バンドが無いことは、先の条件 下でのタンパク質の分解に寄因させることが出来る。また、アルカリ処理の結果 、より高分子領域のバンド（Ｍｒ＞３０．　０００）も出現している。

実施例１’１ ペプチド地図によるグリコペプチドの同定天然ＩＦＮ−α２（第１４ｂ図）およ び大腸菌ＩＦＮ−ａ２ｃの２つのピークをトリプシンで切断し、還元後、ＲＰ− ＨＰＬＣで分離した。第１９図は、そのクロマトグラムの一部を示している。大 腸菌ＩＦＮ−α２Ｃのペプチド地図由来の２つのピークは、天然ＩＦＮ−α２由 来の相当するピークと比較して顕著な疎水性を示している。ピークＩおよび■（ 大腸菌ＩＦＮ−α２Ｃのペプチド地図における）は、対応する第１４ｂ図のピー クｌのピーク１／Ｉおよび１／ＩＩおよび第１４ｂ図のピーク２のピーク２／Ｉ ａ、２／ｎｂ、２／ＩＩ　ａおよび２／Ｉ［ｂよりも有意に遅く溶出する。

先に述べた天然ＩＦＮ−α２のピークおよび大腸菌の２つのピークのＮ末端シー ケンシングは、ピークＩ、１／Ｉ、２／Ｉａ、２／Ｉｂ（第１９図）に関しては アミノ酸（ＡＳ）８４−１１２のペプチドの配列およびピーク■、１／ＩＩ、２ ／ｎａ、２／ＩＩｂに関してはＡＳ７１−１１２の配列を示した（ＩＦＮ−ａ２ ｃのアミノ酸配列は、第１５図に示した）。従って、保持時間の差は、天然のＩ ＦＮ−α２由来のペプチドのグリコジル化に寄因させうる。

実施例１２ 天然ＩＦＮ−α２のグリコペプチドのプラズマ脱離マススペクトロメトリーさら に、ピーク１／ｎ、２／Ｉａ、２／ＩＩ　ａおよび２／Ｉ［ｂをＰＤ−ＭＳで分 析した。測定結果を表■に示す。アミノ酸配列から計算される分子量の差および 実際に得られた各ペプチドの分子量は、異なるグリカン構造から説明しうる。■ ＦＮ−α２のＯ−グリカナーゼ耐性型から得られるペプチド１／ｎの分子量は、 ２つのＮ−アセチルへキソサミン単位および２つのヘキソース単位からなるテト ラサツカライドで置換したペプチド（ＡＳ７１−１１２）の分子量に対応してい る。すでに述べてきたこの種のＯ−グリカンの構造と同様に、これは以下の構造 ：Ｇａ　１１−３　（Ｇａ　ｌ　ｌ−４ＧＩｃＮＡｃ　ｌ−６）Ｇａ　ｌＮＡｃ −を有するオリゴサツカライドである。

ペプチド２／Ｉａは、３，９７５ａｍｕの分子量を有し、この事はトリサツカラ イドＮｅｕＡｃ−Ｇａ　１−Ｇａ　ｌＮＡｃによるペプチドの置換で説明しつる 。

同様のグリカン構造は、ペプチド２／ＩＩ　ａの分子量（５，４４８ａｍｕ）か らも誘導しつる。ペプチド２／ｎｂに関しては、５，１３２ａｍｕという値が測 定され、これはジサッカライドＧａ　１−Ｇａ　ｌＮＡｃによるグリコジル化に 対応する。

原則として、分析した全てのピークは、約２３ａｍｕ大きい分子量を有していた 。

この事は、ペプチドへのＮａ′″イオンの蓄積によって説明しつる。これらの不 純物は測定前に目的物を十分洗浄することで回避できるが、この場合には、グリ コペプチドのロスを最小限に止めるよう考慮した。表■にリストしたグリカン構 造は、グリコシレージョン（上述）およびマススペクトロメーターによる測定の 結果から誘導しつる。ペプチド地図中のグリコペプチド領域に見られる小さなピ ークは、他のグリコジル化変異体に由来する物である。

（アミノ酸番号）　測定値　計算値　差　構造　分子量３（ＡＳ配列） １／ＩＩ　７１−１１２　５．４８５　４．７３６　７４９　−ＧａｌＮＡｃ− Ｇａｌ−７５２ＧｌｃＮＡｃ−Ｇａ１ ２／Ｉａ　８４−１１２　３．９７５　３．３０４　６７１　−ＧａｌＮＡｃ− Ｇａｌ−６７８ｅｕＡｃ ２／ＩＩａ　７１−１１２　５．４４８　４．７３６　７１２　−ＧａｌＮＡｃ −Ｇａｌ−６７８ｅｕＡｃ ２／Ｉ［ｂ　７１−１１２　５．１３２　４．７３６　３９６　−ＧａｌＮＡｃ −Ｇａｌ　３８７表■：対応するグリカン構造を含む天然ＩＦＮ−α２のグリコ ペプチドの分子量（１）第１９図に対応するピーク番号；　”　ａｍｕ　、質量 の原子単位；”Ｎａ＋イオンを含む理論質量。

実施例１３ 気相シーケンシングによるＯ−グリコジル化アミノ酸の同定トリプシンによる分 解で得られるグリコペプチドの全配列をそのまま測定するには長すぎるので、こ れらのペプチドを再びスタフィロコッカス　オーレウス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏ ｃｃｕｓ　ａｕｒｅｕｓ）のプロテアー七ｖ８で切断し、ＲＰ−ＨＰＬＣで分離 した。大腸菌ＩＦＮ−α２Ｃ由来の対応するペプチドについても同様の操作を行 った。ペプチド地図の比較から、保持時間の異なる全てのペプチドを単離し、シ ーケンシングした。天然ＩＦＮ−α２由来の全てのグリコペプチドは、アミノ酸 ９７−１１２を含んでいた。大腸菌ＩＦＮ−α２Ｃペプチドではｌ　Ｏ＠　’ｒ 　）（Ｒが検出されたが、天然ＩＦＮ−α２から得られたペプチドからは検出さ れなかった。従って、ｌ　Ｇ　８　Ｔ　ＨＲがグリコジル化部位であると同定し た。

ＦＩＧ、１ ＦＩＧ、　３ ５日＋−２１：１３ 一一一←　ＣＭＶ Ｃ１，ＩＶ　イントロン　ポリリンカ−ＦＩＧ１４ ＦＩＧ、５ Ｆ　ＥＧ、　６　Ａ ＦＩＧ、６Ｂ ＦＩＧ、７Ａ ＦＩＧ、７Ｂ ＦＩＧ、７Ｃ ＦＩＧ、７Ｄ ＦＩＧ、８ ＦＩＧ、９ ＦＩＧ、１０ ＦＩＧ、１１Ａ ＦＩＧ、１１Ｂ ＦＩＧ、１１Ｃ ＦＩＧ　１１Ｄ ＦＩＧ、１１Ｅ ＦＩＧ、１２ 溶出体積　（ｍｌ） 巳ＩＧ、１３ ２１ｏｇ（希釈率） ＦＩＧ、１６ ＦＩＧ　１７ 一雪−２０ ＦＩＧ、１８ 保持時間（ｍｉｎ） ＩＧｊ９ ＦＩＧ、２０ ＦＩＧ、２１ ＦＩＧ、　２２ ＦＩＧ、２３ ＦＩＧ、　２４ 国際調査報告 １＾−ＩＩｅ１１１１＾吋に−１１−Ｈ＝　ＦＣＴ／ＥＰ　９１１０１２６６国 際調査報告 フロントページの続き （５１）　Ｉｎｔ、　Ｃ１，５識別記号　庁内整理番号Ｃｌ２Ｐ　２１１０２　 Ｆ　８２１４−４Ｂ／／　Ｃ１２Ｐ　２１１０８　８２１４−４８（Ｃ１２Ｐ　 ２１１０２ Ｃ１２Ｒ１：９１） （８１）指定国　ＥＰ（ＡＴ、ＢＥ、ＣＨ，ＤＥ。

ＤＫ、ＥＳ、ＦＲ，ＧＢ、ＧＲ，ＩＴ、ＬＵ、ＮＬ、ＳＥ）、ＡＵ、ＣＡ、Ｃ５ ，ＦＩ、ＨＵ、ＪＰ、ＫＲ，ＮＯ，ＰＬ、ＳＵ、ＵＳ ＦＩ （７２）発明者　アオルン　ホルシュト　ヨハンオーストリア　ア−２４８４ヴ アイゲルスドルフ　アイゼンシュテッテルシュトラーセ（７２）発明者　カルズ ナー　インゲ オーストリア　ア−１０３０ウィーン　ゴイザウガッセ　５ｌ−２０ （７２）発明者　マウレル　フオギュ　イングリッドオーストリア　ア−１２３ ８ウィーン　リンダウエルガッセ　３５

Claims (15)

【特許請求の範囲】
1. １．Ｏ−グリコシル化しており、かつ、ＩＦＮ−α２の生物学的、および／また は免疫学的性質を有することを特徴とするインターフェロン・アルファであって 、望ましくはＯ−グリコシル化ヒトＩＦＮ−α２ａ、ＩＦＮ−α２ｂまたはＩＦ Ｎ−α２ｃであるインターフェロン・アルファ。
2. ２．スレオニン−１０６（ＴＨＲ−１０６）がＯ−グリコシル化していることを 特徴とする請求項１記載のインターフェロン・アルファ。
3. ３．オリゴサッカライドが、望ましくは天然のジサッカライドＧａｌ−ＧａｌＮ Ａｃ、そのモノまたはジ・シアリル化変異体、または天然のテトラサッカライド Ｇａｌ−（Ｇａｌ−ＧｌｃＮＡｃ−）ＧａｌＮＡｃであることを特徴とする請求 項１または２記載のインターフェロン・アルファ。
4. ４．請求項１記載のインターフェロン・アルファの製造法であって、以下のステ ップ； ａ）白血球、望ましくはヒトの白血球をウイルスで誘導する、ｂ）ｐＨ値が８． ０を越えない、一連のマイルドなタンパク質沈殿／タンパク質溶解ステップを用 いて（“キャンテル”法）、誘導したインターフェロン・アルファを精製する、 ｃ）ａ）、または、ａ）およびｂ）の操作に従って得られるインターフェロン混 合物を抗ＩＦＮ−α２モノクローナル抗体を含むイムノアフィニティー・カラム に結合させる、 ｄ）結合したタンパク質を適当な手段で溶離する、ｅ）溶離したタンパク質を回 収し、場合によっては、さらにイムノアフィニティー・カラムで数回精製する、 を含むことを特徴とする方法。
5. ５．前記抗ＩＦＮ−α２モノクローナル抗体としてＥＢＩ−１０、またはその類 似物を使用することを特徴とする請求項４記載の方法。
6. ６．前記ステップｅ）につづいて、さらにクロマトグラフィー精製を行うことを 特徴とする請求項４記載のインターフェロン・アルファの製造法。
7. ７．請求項１記載のインターフェロン・アルファの製造法であって、以下のステ ツプ； ａ）多細胞生物の細胞にトランスフェクションするのに適した発現プラスミドに 、ＩＦＮ−αをコードするＤＮＡを導入する、ｂ）得られた発現ベクターを多細 胞生物の細胞、望ましくは脊椎動物細胞にトランスフェクトする、 ｃ）トランスフェクトした生物を適当な培地で培養する、ｄ）細胞上清を回収す る、 ｅ）従来法を用いて、Ｏ−グリコシル化ＩＦＮ−αを単離、精製する、を含むこ とを特徴とする方法。
8. ８．前記ステップａ）で使用する発現プラスミドが、ｐＡＤ−ＣＭＶ１３、１５ または１９、望ましくはｐＡＤ−ＣＭＶ１９であり、かつ前記ステップａ）で挿 入するＤＮＡが、基本的にＩＦＮ−α２の生物学的、および／または免疫学的性 質を有するタンパク質、望ましくはヒトＩＦＮ−α２ａ、ＩＦＮ−α２ｂまたは ＩＦＮ−α２ｃ、とりわけヒトＩＦＮ−α２ｃをコードするものであることを特 徴とする請求項７記載の方法。
9. ９．前記発現プラスミドがｐＡＤ１９Ｂ−ＩＦＮであることを特徴とする請求項 ７または８のいずれか１項記載の方法。
10. １０．前記多細胞生物の細胞としてＣＨＯ細胞を使用することを特徴とする請求 項７、８、９のいずれか１項記載の方法。
11. １１．ｐＡＤ−ＣＭＶ１３、ｐＡＤ−ＣＭＶ１５またはｐＡＤ−ＣＭＶ１９であ ることを特徴とする多細胞生物のトランスフェクションに使用する発現プラスミ ド。
12. １２．請求項４乃至１０のいずれか１項記載の方法で調製しうるＯ−グリコシル 化インターフェロン・アルファ。
13. １３．医薬組成物として使用するための請求項１乃至３、または１２のいずれか １項記載のインターフェロン・アルファ。
14. １４．請求項１乃至３、または１２のいずれか１項記載のインターフェロン・ア ルファを含む、ウイルス性疾患または腫瘍性疾患の治療剤。
15. １５．Ｏ−グリコシル化タンパク質ＩＦＮ−α２ａ、ＩＦＮ−α２ｂまたはＩＦ Ｎ−α２ｃの内の少なくとも２つの混合物を含むことを特徴とする請求項１４記 載の治療剤。