JPH06502988A - ポータブルリボザイムカセット、それを含有するｄｎａ配列、これらｄｎａ配列によりコードされるリボザイム、およびこれらリボザイムを含有する組成物 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ポータブルリボザイムカセット、それを含有するＤＮＡ配列、これらＤＮＡ配列 丘主グ三二上亘ちゑ孟匹二ゑムエ旦盈ｇ且扛亘ユエブヱ△量豊直工Ａ里惑惣本発 明は、所定の制限酵素開裂部位に挿入することができ、それゆえリボザイムの簡 易化された構築に利用することのできる、一般的適用性を有するポータブルリボ ザイムカセット（「挿入可能なりボザイム力セットｊとも称する）に関する。

本発明はまた、該ポータブルリボザイムカセットを含有するＤＮＡ配列、そのよ うなりＮＡ配列を含有する組換えベクター、および本発明の組換えベクターで形 質転換した宿主生物にも関する。さらに、本発明は、該ＤＮＡ配列によりコード されるリボザイムに関する。本発明はまた、本発明のりボザイムまたはＤＮＡ配 列を含有する組成物に関する。他の態様は、下記記載から明らかになるであろう 。

ＲＮＡ鎖のみからなる酵素はｒＲＮＡＲＮＡ酵素は「リポザイムｊと呼ばれてい る。

そのような触媒ＲＮＡは、種々の生物系で観察されている。

最初に発見されたりポザイムはテトラヒメナ・テルモフィラ（Ｔｅｔｒａｈｙｍ ｅｎａ　ｔｈｅｒｏ＋ｏｐｈｉｌａ）の核ｒＲＮＡであり、これは４１３ヌクレ オチドの介在配列（ＩＶＳ）を含有し、タンパク賀の不在下で自己開裂を行うこ とができる。このＩＶＳは種々のエステル交換反応を触媒し、その結果、前駆体 ＲＮＡがらＩＶＳが切り出され２つのエクソンがライゲートされる。このＩＶＳ 　ＲＮＡ酵素は文献に詳細に記載されている（たとえば、クルーガ−（Ｋｒｕｇ ｅｒ）ら、Ｃｅ１１３Ｈ１９８２）；　１４７〜１５７、チェック（Ｃｅｃｈ） 、Ｃｅ１１３４　（１９８３）、７１３〜７１３＋ザウグ（Ｚ　ａｕｇ）ら、５ ｃｉｅｎｃｅ２２４（１９８４）、５７４〜５７８：チェック、Ｃｅ１１４４（ １９８６）、２０７〜２１０；チェックおよびバス（Ｂ　ａｓｓ）、Ａｎｎｕ、 　Ｒｅｖ、　Ｂ　ｉ。

ｃｈｅｗ、　５５（１９８６）、５！’３９〜６２９；ザウグら、Ｎａｔｕｒｅ ３２４（１９８６）、４２９〜４３３：ザウグおよびチェック、５ｃｉｅｎｃｅ 、　２３１　（１９８６）、４７０−４７５；チェック、５ｃｉｅｎｃｅ２３６ （１９８７）、１５３２〜１５３７；レイサム（Ｌ　ａｔｈａｍ）ら、Ｍｅｔｈ ｏｄ、Ｅｎｚｙｍｏｌ、　１８１（１９９０）、５５８〜５６９）。

チェックおよび彼の同僚はまた、ＩＶＳリポザイムを修飾してこれを配列特異的 な仕方で大きなＲＮＡ分子を開裂するのに用いることを記載している。この修飾 ＩＶＳは、ＣＵＣＵのような小さな配列モチーフおよびＣＣＣＵのような関連配 列を認識し、ＤＮＡ制限酵素に匹敵する配列特異的な仕方で開裂する。

チェックらのりポザイムの正確な記載、とりわけ配列特異的なエンドリボヌクレ アーゼとしての使用はまたＷＯ３８１０４３００にも示されている。

本発明のりポザイムは、部位特異的自己溶解開裂を行ってそれぞれ末端が５゛− ヒドロキシ基および２゛、３“−環状ホスホジエステルの２つの開裂生成物を生 じる天然のＲＮＡの他のクラスに由来する。これら自己開裂ＲＮＡの大部分は植 物ウィルスのサテライトＲＮＡに由来する。また、他の植物病原体であるアボカ ドサンブロッチウイロイド（ａｖｏｃａｄｏ　５ｕｎｂｌｏｔｃｈ　ｖｉｒｏｉ ｄＸＡ　Ｓ　Ｂ　Ｖ）および１６ｖｔノＲＮＡ転写物中にもこのタイプの自己開 裂ＲＮＡが一つ存在する（ブルーニング（Ｂｒｕｅｎｉｎｇ）、Ｍｅｔｈｏｄ、 　ＥｎｚｙｍｏＬ　１８０（Ｉ　９８９）、５４６〜５５８に概説されている） 。自己触媒開裂反応は、アボカドサンブロッチウイロイド（Ａ　Ｓ　Ｂ　Ｖ）（ ハッチンス（Ｈｕｔｅｈｉｎｓ）ら、Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、　 １４（１９８６）、３６２７〜３６４０）についても、タバコ’Ｈ１状斑点ウィ ルス（ｔｏｂａｃｃｏ　ｒｉｎｇ　５ｐｏｔ　ｖｉｒｕｓＸ　ｓ　Ｔ　。

ｂＲＶＸプロディー　（Ｐ　ｒｏｄｙ）ら、５ｃｉｅｎｃｅ２３１（１９８６） 、１５７７−１５８０、ブザヤン（Ｂ　ｕｚａｙａｎ）ら、Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔ ｌ、＾ｃａｄ、　Ｓｃｉ、　８３、（１９８６）、８８５９−８８６２）および アルファルファ−過性条斑ウィルス（ｌｕｃｅｒｎｅ　ｔｒａｎｓｉｅｎｔ　５ ｔｒｅａｋ　ｖｉｒｕｓＸｓ　ＬＴＳＶ）（フォースター（Ｆ　ｏｒｓｔｅｒ） およびサイモンス（Ｓ　ｙｍｏｎｓ）、Ｃｅ１ｌ　４９（１９８７）、２１１− ２２０）のサテライトＲＮＡ、およびｎｅｗｔからの繰返しＤＮＡ配列のＲＮＡ 転写物（エプスタイン（Ｅｐｓｔｅｉｎ）およびゴール（Ｇａ１１）　Ｃｅ１ｌ 　４８（１９８７）、５３５−５４３）についても自己触媒開裂反応がインビト ロで示されている。

これら自己開裂ＲＮＡはすべて、開裂部位を決定するいわゆる「ハンマーヘッド （ｈａｍｍｅｒｈｅａｄ）Ｊ構造（フォースターおよびサイモンス、Ｃｅ１１５ ０、（１９８７）、９〜１６）を呈する。２つの合成ＲＮＡオリゴマー（−緒に なってハンマーヘッド構造を形成することができる）を用い、開裂がトランスに 起こること、すなわち一方の分子が他方の開裂を触媒することが示された（ウー レンベック（Ｕｈｌｅｎｂｅｃｋ）、　Ｎａｔｕｒｅ　３２８（１９８７）、５ ９６〜６００）。

開裂がトランスに起こる場合、開裂され得るＲＮＡは基質（標的）ＲＮＡと考え られ、開裂を触媒するＲＮＡはＲＮＡ酵素または「リポザイム」と呼ばれる。

所定の基質ＲＮＡのあらゆるＧＵＣ配列モチーフに対してその３′末端で開裂が 起こるように適当なりポザイムを設計することが今や可能である（ハーゼロフ（ Ｈａｓｅｌｏｆｆ）およびゲルラッハ（Ｇｅｒｌａｃｈ）、Ｎａｔｕｒｅ　３３ ４（１９８８）、５８５〜５９１）。同様に、ＧＵＡ、ＧＵＵＳＣＵＡ、ＣＵＣ ，ＡＵＧおよびＵＵＣは、ハンマーヘッドタイプのりボザイムＲＮＡに適した標 的配列である（コイズミ（Ｋｏｉｚｕｍｉ）ら、ＦＥＢＳ　Ｌｅｔｔ、２２８（ １９８８）、２２８〜２３０およびＦＥＢＳＬｅｔｔ、２３９（１９８８）、２ ８５〜２８８およびＥＰ−Ａ２３２１２０１）。

モチーフＧＵＧは、ある場合には開裂されたが（ジェルトン（Ｓ　ｂｅｌｄｏｎ ）およびサイモンス、Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、１７（１９８９） ５６７９〜５６８５）、他の場合には開裂されなかった（コイズミら、ＦＥＢＳ 　Ｌｅｔｔ、２２８（１９８８）およびハーゼロフおよびゲルラッハ、Ｎａｔｕ ｒｅ　３３４（１９８８）５８５〜５９１）。ラフナー（Ｒｕｆｆｎｅｒ）ら（ Ｂ　１ｏｃｈｅｓｉｓｔｒｙ　２９、（１９９０）１０６９５〜１０７０２）に よる配列要求についての研究によれば、あらゆる３ヌクレオチド配列ＮＵＨは標 的配列となり得る（ＮはＡ、Ｃ，、ＧまたはＵ、ＨはＡＳＣまたはＧ）。それゆ え、モチーフＡＵＡＳＡＵＵＳＣＵＵ、ＵＵＡ、ＵＵＵも標的配列を表す。

ＥＰ−Ａ２　３２１　２０１には、「ハンマーヘッド」タイプのりポザイムおよ びそれを用いたＲＮＡエンドヌクレアーゼの製造が記載されており、得られたＲ ＮＡエンドヌクレアーゼは、ＷＯ３８１０４３００に記載されているＩＶＳリボ ザイムとは対照的に、ある標的ＲＮＡに対して高度に特異的である。所定の基質 ＲＮＡ（標的ＲＮＡ）をある部位で開裂するために、２つの機能的領域、すなわ ち実際の触媒ドメインおよび標的ＲＮＡに相補的な領域からなるように特異的リ ボザイムＲＮＡを設計して、配列特異的な仕方およびリボザイムの触媒ドメイン が標的ＲＮＡの開裂モチーフの反対側に位置するような仕方でリポザイムがその 基質に結合することができるようにすることができる。

ＥＰ−Ａ２　３２１　２０１にはりボザイムの製造方法が記載されている。この 目的のため、特定の開裂モチーフおよび標的ＲＮＡ内でそれに隣接する配列のつ ながりに従ってＤＮＡオリゴヌクレオチドを合成する。このＤＮＡオリゴヌクレ オチドを適当なプロモーターの下流にクローニングした後、この合成りＮＡを用 いて標的特異的なりボザイムＲＮＡをインビトロおよびインビボ合成することが できる。転写により触媒リボザイムドメインを含宵するＲＮＡ分子が生成し、こ の触媒リボザイムドメインの両側には標的ＲＮＡに相補的な配列、さらに通常は 、標的ＲＮＡに相補的ではないベクター由来配列が存在する。配列特異的なハン マーへラドコンフォメーションが形成された後、基質ＲＮＡのモチーフ、たとえ ばＧＵＣの３′末端で開裂が起こる。触媒反応に関与しない基質ＲＮＡとリボザ イムＲＮＡとの間の塩基対相補的領域がリポザイムとその標的との間の配列特異 的結合を可能にするので、その長さはりボザイム反応の特異性および有効性に影 響を与える。

承認された従来技術ですでに知られているハンマーヘッドタイプのりボザイムは 、使用のたびに新たに合成しなければならないという欠点を有する。そのような 合成は労力がかかり、時間もかかるうえ、技術的な困難さをもきたすものである 。なぜなら、ＤＮＡ配列をコードする合成リボザイムは、標的ＲＮＡの正確な開 裂を保証するのに充分な長さを有していなければならないからである。それゆえ 、現在までのところりボザイム技術の適用性には限界があった。

従って、本発明の根底にある技術的課題は、所望の標的ＲＮＡを開裂するりボザ イムをコードする充分な長さのＤＮＡ配列の容易かつ正確な構築を可能とする手 段を提供することである。

上記技術的課題の解決は、該標的ＲＮＡをコードするＤＮＡ配列の選択された制 限酵素開裂部位に挿入することのできるＤＮＡからなるリボザイムカセットを提 供することにより達成される。さらに、請求の範囲中で特徴付けられる他の態様 を提供することによっても達成される。

それゆえ、本発明は、下記特徴を示すポータブルリポザイム力セットに関する。

（ａ）標的ＲＮＡとは塩基対を形成しないリボザイム部分をコードするＤＮＡ配 列（ａ）；および （ｂ）ＤＮＡ配列（ａ）の両側に存在する配列であって、標的ＲＮＡをコードす るＤＮＡ配列の制限酵素開裂部位の突出端（ｐｒｏｔｒｕｄｉｎｇ　ｅｎｄｓ） に由来し、標的ＲＮＡと塩基対を形成するりボザイム部分の一部分をコードする 配列（ｂ）、その際、標的ＲＮＡをコードする標的ＤＮＡ中にリポザイム力セッ トが挿入された後、該ＤＮＡ配列（ａ）および（ｂ）は、標的ＲＮＡ（アンチセ ンス鎖）に相補的な該標的ＤＮＡ鎖と一緒になって、該標的ＲＮＡに対してエン ドリボヌクレアーゼ活性を有するリボザイムをコードする。

「標的ＲＮＡと塩基対を形成しないリボザイム部分をコードするＤＮＡ配列」と は、リボザイムのループをコードするＤＮＡ配列であり、これはまたリポザイム の「活性ドメイン」または「触媒ドメイン」とも呼ばれる。そのようなりＮＡ配 列（ａ）の例としては、図１１図４１図７および図１３に示すソポザイムがそれ らの標的ＲＮＡ（基質ＲＮＡ）と対を形成した際に形成されるループが挙げられ る。配列（ａ）の例はまた、図２および図３に示しである。特定のＤＮＡ鎖に言 及する場合は、ＲＮＡを「コードするＪＤＮＡｔｌは対応ＲＮＡと同じ極性を有 することが理解される。図２に示すように、ｃＤＮＡのセンス鎖が標的ＲＮＡを コードするのに対して、ポータプルＤＮＡカセット挿入後は、アンチセンス鎖が 配列（ａ）と−緒になって標的ＲＮＡに対して向けられたりボザイムＲＮＡをコ ードする。

ｒＤＮＡ配列（ａ）の両側に存在するＤＮＡ配列であって、標的ＲＮＡをコード するＤＮＡ配列の制限酵素開裂部位の突出端に由来し、標的ＲＮＡと塩基対を形 成するりボザイム部分の一部分をコードする配列」とは、配列（ａ）に隣接する ヌクレオチドをいう。それゆえ、配列（ｂ）は連続的な配列を表すのではなく、 それぞれ、その５′末端で配列（ａ）の側部に存在する部分およびその３゛末端 で配列（ａ）の側部に存在する他の部分とからなる。配列（ｂ）はまた、それぞ れ、配列（ａ）の５゛末端の側部に存在する部分のみ、あるいは３′末端の側部 に存在する部分のみからなっていてもよい。そのようなりＮＡ配列（ｂ）の例は 図１および図２に示しである。

本発明の幾つかの態様においては、ポータブルリボザイムカセットは容易に合成 することができる。なぜなら、下記一般式から明らかなように、これらカセット は少数のヌクレオチドを含有するだけだからである。他の態様においては、本発 明のポータブルリボザイムカセットの製造にはクローニング工程が含まれる。

なぜなら、これらポータブルリポザイムカセットはマーカー配列などの他の一層 長い配列を含有するからである。

本発明のポータブルリボザイムカセソトは、標的特異的なりボザイムＲＮＡの製 造を簡単にする。この目的のため、標的ＲＮＡをコードするＤＮＡ、たとえばｃ ＤＮＡ中に該カセットを挿入する。この挿入の結果、標的ＲＮＡをコードするｃ ＤＮＡはそれぞれリボザイム構築物に変えられ、転写によって所望の触媒性アン チセンスリポザイムＲＮＡを得ることができる。以下に説明するように、本発明 のポータブルリボザイムカセットを挿入するために２０以上の好ましい制限酵素 開裂部位を用いることができる。本発明のりポザイムカセットの特別の利点は、 標的の配列に従ってリボザイムＲＮＡを設計する必要がないことである。事実、 標的のヌクレオチド配列を知る必要さえない。本発明の特定のポータブルリボザ イムカセット、たとえば５ａ１１−特異的カセットは、あらゆる標的中のあらゆ る５ａ１１部位中に挿入するために普遍的に用いることができる。その結果得ら れるＲＮＡはリポザイムとアンチセンスＲＮＡの両方の特性を持ち合わせている ため「触媒性アンチセンスＲＮＡＪまたは「アンチセンスーリボザイム」または 「アンチセンス（ａｎｔｉｚｙｍｅｓ）　Ｊとも呼ばれる。それゆえ、本発明の ポータブルリポザイムカセットの驚くべき利点は、それが普遍的に用いることが できるということである。

好ましい態様において、本発明は、該ＤＮＡ配列（ａ）および（ｂ）が下記式で 示され、上記式中、該ＤＮＡ配列（ａ）が配列：５“Ｍ２ＭＩＫ　Ｌ　および　 ＮＩ　Ｎ２　Ｎ３　Ｎ４３゜３’　Ｍ’２Ｍ’ＩＫ’Ｌ’　、Ｎ’ＩＮ’２Ｎ’ ３Ｎ’４５’で示されるポータブルリボザイムカセットに関する（式中、ヌクレ オチドにおよびＬは、それぞれ、標的ＲＮＡの標的モチーフの第一番目および第 二番目のヌクレオチド（５’−３’）を表し、ヌクレオチドＭ、およびＮ１は、 それぞれ、５′部位および３″部位において標的ＲＮＡの標的モチーフの両側に 位置する第一番目のヌクレオチドである。

ヌクレオチドＭ２およびＮ２は、それぞれ、５°部位および３゛部位において標 的ＲＮＡの標的モチーフの両側に位置する第二番目のヌクレオチドであり、ヌク レオチドＮ３およびＮ４は標的ＲＮＡの標的モチーフの３゛部位の第三および第 四位にヌクレオチドＭ２、Ｍｌ、Ｋ、Ｌ、、Ｎ、、Ｎ２、Ｎ８、およびＮ４は、 独立にＡ、Ｇ。

ＣまたはＴを表すかまたはカセット中に存在しない、ただし、Ｎ２の存在にはＭ 、の存在を必要とし、Ｍ、の存在にはＫの存在を必要とし、 Ｋの存在にはＬの存在を必要とし、 Ｎ、の存在にはＮ３の存在を必要とし、Ｎ３の存在にはＮ２の存在を必要とし、 Ｎ、の存在にはＮ１の存在を必要とし、該ヌクレオチドＭ２、Ｎ４、Ｋ、Ｌ、Ｎ ｌ、Ｎ２、Ｎ８、およびＮ４の合計数はＯ〜４、好ましくは１〜４である： Ｗ、ＸまたはＹはＡ、ＧＳＣまたはＴである。

Ｘは少なくとも６（その際、各Ｘは独立にＡＳＧ、ＣまたはＴであり、Ｘは、リ ボザイムがその標的配列と対を形成したときに形成される二次構造において、ヌ クレオチドＣ１およびＧ２（配列（Ｘ゛）の両側に存在する）により形成された 塩基対に隣接して少なくとも１つの別の塩基対を相補的ヌクレオチドＸ′が形成 するようにＸが選択される）； ｙはＯまたは１である； ヌクレオチドＣＩがＣである場合はヌクレオチドＧ！はＧであり、ヌクレオチド Ｃ１がＴである場合はヌクレオチドＧ１はＡであり、ヌクレオチドＣ１がＣまた はＴである場合は、ヌクレオチドＣ２およびＧ２は、それぞれ、ＣおよびＧかま たはＴおよびＡであり： 「゛」の記号のついたヌクレオチドは相補的ヌクレオチドであり；ヌクレオチド Ｍ２、Ｍｌ、ＫＳＬ、Ｎｌ、Ｎ２、Ｎ８、およびＮ４は、標的ＲＮＡをコードす るＤＮＡ内の制限酵素開裂部位を対応制限酵素で開裂した後に得られる突出端か らのヌクレオチドに対応し、該制限酵素開裂部位は該突出端内にさらにヌクレオ チドＺ（Ａ、Ｇ、ＣまたはＴである）を含有する）。

上記一般式についての定義はＤＮＡレベルでのものである。当業者により理解さ れるように、ＲＮＡ配列について言及する場合はＴはＵである。

標的ＲＮＡと本発明のりボザイムとの相互反応は、以下のように図式される。

３’　Ｎ’Ｎ’Ｎ’Ｎ’Ｎ’Ｎ’Ｎ’Ｎ’　Ｍ’２Ｍ’ＩＫ’Ｌ’　Ｎ’ＩＮ２ ’Ｎ’３Ｎ’４Ｎ’Ｎ’Ｎ’Ｎ’Ｎ’Ｎ’Ｎ’Ｎ’　５’（式中、ヌクレオチド ＮおよびＮｏは標的ＲＮＡをコードするＤＮＡに由来し、ヌクレオチドＫＬＺは 標的ＲＮＡの開裂モチーフを表い＊は水素結合を表し； 配列３　”　ＡＡ　Ｇ　Ｃ’（Ｘ’　）　ｔ、＋　Ｇ”Ｙ’　（−１Ａ　ＧＷ’ 　Ａ　ＧＴ　Ｃ５’は配列（ａ）（標的ＲＮＡと塩基対を形成しないリボザイム の部分をコードするＤＮＡ配列）を表し：（Ｘ）は少なくとも６（その際、これ らＸ゛残基、配列（ａ）内のりボザイムの０１＊０２対に隣接するさらに少なく とも１つの塩基対、好ましく（嘘少な（とも３つの塩基対とともにループ構造を 形成する）：（ｙ）は０または１である） そのような相互反応の特定の例を図１に示す。

この本発明の好ましい態様においては、リボザイムカセットは５ａｌＩ部位中に 挿入され、その際にはＧＳＬはＵ、ＺはＣＳｒ’ＬはＧ５Ｎ２はＡＳＮ３ｔｉｃ 、すなわち、ヌクレオチドに、　Ｌ、、Ｚ、　Ｎｌ、Ｎ２およびＮ、は標的ＲＮ ＡをコードするＤＮＡ中に含まれる５ａｌｌ開裂部位を表し、ヌクレオチドＬ、 Ｚ、Ｎ＋およびＮ２は５ａｉｌ消化によって形成された突出端内に位置する。同 様（こ、ヌクレオチドＬ′、Ｎ’＋およびＮ’２は、ＲＮＡレベルで標的ＲＮＡ と塩基対を形成する本発明のりボザイムカセットのヌクレオチドを表す。ここで も、ＲＮＡレベルではＴがＵであることを理解すべきである。ヌクレオチドＬ゛ 、Ｎ’＋およびＮ″２２力１る部分はまた、一般に本発明の配列（ｂ）とされて しλる部分である。図１１こ示すループ（本発明においては一般に配列（ａ）と して言及される）および両（ＩＩＩ　ｉこ存在するヌクレオチドＮ’（ヌクレオ チドＭ′２、Ｍ′１、Ｋ′、およびＮ“３、Ｎ′４を含む、これらヌクレオチド はこの特定の配列においてはヌクレオチドＮ′と同じ機能を果たす）と−緒にな って、該ＤＮＡ配列は本発明のりボザイム（「アンチザイム」）を形成する。

標的ＲＮＡまたはその対応するＤＮＡ配列の極性のため、本発明のりボザイムは 請求の範囲、図面および本発明の説明において３’−５’の方向で示されること を理解すべきである。それゆえ、所望のエンドリボヌクレアーゼ活性を有する発 現産物として所望のりボザイムを得るため、本発明のりボザイムまたはりボザイ ムカセットをコードするＤＮＡ配列は５’−３’の方向、すなわち該図面および 説明で与えられるのとは反対の方向で表されなければならないことは当業者には 明らかであろう。

本発明のポータブルリポザイムカセットが優れていることは図２および図３から 明らかである。ポータブルリボザイムカセットは、標的ＲＮＡ（基質）ＲＮＡを コードするＤＮＡ配列の所定の開裂部位、この好ましい態様の場合は５ａ１１部 位中に挿入される。得られたＤＮＡ配列によりコードされるリポザイム（「アン チザイム」）の正確な配列特異性は、なんら困難な時間のかかる工程や他の操作 を要することなく自動的に得られる。これは、挿入されたりポザイムカセントの 両側に存在するＤＮＡ配列が、標的ＲＮＡをコードするＤＮＡ配列と完全に相同 であるためである。

それゆえ、本発明に従えば、リボサイムのエンドリボヌクレアーゼ活性の特異性 および有効性に影響を与える（なぜなら、これら塩基対領域は、得られるリボザ イムと標的ＲＮＡとの正確で有効な結合に関係するからである）塩基対領域の長 さは、制限酵素開裂部位中に本発明のポータブルリボザイムカセットが導入され るＤＮＡ配列の長さによってのみ制限される。それゆえ、本発明によれば、所望 なら塩基対領域が基質ＲＮＡと同じ長さまで有するリポザイムの構築が可能とな る。

上記一般式中のヌクレオチドＭ２、Ｍ、ＫＳＬ、Ｎ、、Ｎ２、Ｎ３およびＮ４の 意味に依存して、この一般式は、本発明の組み込まれていない（ｎｏｎ−ｉｎｔ ｅｇｒａｔｅｄ）リボザイムカセット（「ポータブルリボザイムカセット」）、 または標的ＲＮＡをコードするＤＮＡ配列の制限酵素開裂部位に由来する全両側 配列とともに組み込まれたりボザイムカセットのいずれかを表す。

ヌクレオチドＭ２、Ｍｌ、Ｋ、Ｌ、Ｎｌ、Ｎ７、Ｎ３およびＮ４が、対応制限酵 素で該制限酵素開裂部位を開裂した後に得られる突出端からのヌクレオチドとし て定義される場合は、上記一般式はポータブルリボザイムカセットを表す。この ポータブルリボザイムカセットが上記ヌクレオチドＭ２、Ｍ、、Ｋ、ＬＳＮ、、 Ｎ２、Ｎ３およびＮ、のいずれかを欠く場合は、機能性のりポザイムを得るため には、これらヌクレオチドは標的ＲＮＡをコードするＤＮＡ配列の５°末端によ って提供されなければならない。

本発明のポータブルリボザイムカセットの好ましい態様において、ヌクレオチド ＬはＴである。

本発明の特に好ましい態様においては、ヌクレオチドＭ＋、ＫＳＬ、Ｎｌ、ＮＺ 、Ｎ、およびＮ４は下記のいずれかの意味を有する。

ＭＩＫ　Ｌ　ＮｌＮ２Ｎ５Ｎ４ １３　−　Ｇ　Ｔ　Ａ　Ｃ−− １４−−−ＣＡ　Ｇ　Ｇ 本発明の他の好ましい態様においては、ＹまたはＷは、それ力（隣接するヌクレ オチドとともに制限酵素開裂部位を形成するように選択される。

ポータブルリボザイムカセット内にそのような制限酵素開裂部位を形成すること により、本発明のポータブルリボザイムカセットが組み込まれた標的ＤＮＡ配列 をスクリーニングする手段が得られる。さらに、そのような促ｊ限酵素開裂部位 により、本発明のポータブルリボザイムカセ・ノドが標的ＤＮＡ配Ｗｌｌ中番二 組み込まれている方向を決定する手段が得られる。さらに、そのような制限酵素 開裂部位により、標的ＲＮＡをコードするＤＮＡ中に２以上のカセットが挿入さ れてしする場合に余剰のカセットを切り出す手段が得られる。

本発明の他の好ましい態様において、Ｘは、単独かまた（言隣接するヌクレオチ ドとともに制限酵素開裂部位を形成するように上記一般式；こおＬ％で選択され る。

この制限酵素開裂部位はまた、本発明のボータブルリボザイムカセントのスフ１ ノーニングおよびその方向の決定のｊ−めの手段を提供する。さら（こ、このＩ Ｉ限酵素開裂部位は、本発明のポータブルリボザイムカセ・ノド中（こマーカー ゲタ１１まｊこ（ま他の所望の配列を挿入するための手段を提供する。それゆえ 、本発明の特に好ましい態様においては、ポータブルリボザイムカセット：まま たマーカー配り１］（ヌクレオチドＸの位置にある制限酵素開裂部位に組み込ま れる）をも含有する。

驚くべきことに、本発明のポータブルリボザイムカセットを組み込んｔど所望の ＤＮＡ配列によってコードされるリボザイムの酵素活性（ま、マーカー配’Ｗ１ １を挿入した後も保持されることがわかった。

本発明のポータブルリポザイムカセットの該制限酵素開裂部位に含まれるマーカ ー配列により、本発明の該ポータブルリボザイムカセットを含有するりボザイム 構築物の迅速な選択力何能になる。それゆえ、本発明の特に好ましいマーカー配 列は、抗生物質耐性遺伝子やβ−ガラクトシダーゼ遺伝子のような遺伝子などの 選択可能なマーカー遺伝子を表し、発色反応を生成することにより所望の組換え ＤＮＡ配列を同定することが可能となる。

本発明のポータブルリボザイムカセット中にマーカー配列を保持することが望ま しくない場合には、単にＸの位置にある制限酵素開裂部位を認識する制限酵素で 構築後の組換えＤＮＡ配列を開裂し、開裂生成物（すなわち最初に含まれるマー カー配列の両側に存在するＤＮＡ配列）を再ライゲートするだけでマーカー配列 を除去することができる。

さらに好ましい態様において、本発明のポータブルリボザイムカセットは、該カ セットの両側が制限酵素開裂部位となるように組換えベクター中にクローニング される。好ましい態様において、これら開裂部位は、該ポータブルリポザイムカ セットの配列の外側に位置する実際の認識配列から一定の距離を置いて開裂する クラスＩＩＳ制限酵素に由来する。この本発明のポータブルリポザイムカセット の挿入により、同カセットの切り出し、従って他の標的ＤＮＡ配列中への容易な 移動が可能となる。

さらに、正確に切り出されるようにそれ自身制限酵素認識配列を含有しベクター 上にクローニングされる本発明のりボザイムカセットは他のＤＮＡを含有してい てもよく、たとえばマーカー遺伝子を挿入することができる。これにより、マー カー遺伝子を含有するりポザイムカセットを生成させることができる。

他の態様において、本発明は、リボザイム（アンチザイム）をコードするＤＮＡ 配列に関し、該Ｄ　Ｎ　Ａ配列は、宿主細胞中で発現させた場合または複製連鎖 反応において鋳型として用いた場合にエンドヌクレアーゼ活性を示すリボザイム の生成が可能となるような方向で本発明のポータブルリボザイムカセットを含有 しており、該リボザイムカセットの両側にさらに配列（コードされたりボザイム の標的特異的なエンドリボヌクレアーゼ活性を得るに充分な長さを有する）を含 有している。

これら本発明のＤＮＡ配列は、下記系において高度に選択的なりポザイム（アン チセンスリボザイム、アンチザイム）の製造のために用いることができる。これ らＤＮＡ配列は、標的ＲＮＡと比較してアンチセンスであるＲＮＡをコードする ＤＮＡ配列の制限酵素開裂部位中に本発明のポータブルリポザイム力セットを挿 入することによって容易に得ることができる。それゆえ、すでに記載したように 、本発明のりポザイムはまたアンチセンスリボザイムまたは「アンチザイム」と も呼ばれる。

所望のＤＮＡ配列中にポータブルリボザイムカセットを挿入後、ポータブルリボ ザイムカセットの両側に存在する配列は、標的ＲＮＡとの関係でアンチセンスＲ ＮＡをコードする。これら両側に存在する配列は、該アンチセンスＲＮＡの一部 または全長のアンチセンスＲＮＡのいずれかである。所望でない限り、たとえば 所定の細胞中でエンドリボヌクレアーゼとして働く標的特異的リポザイムを発現 させるため、リポザイムＲＮＡと標的ＲＮＡとが高度に選択的な結合をするのに 充分な長さのアンチセンスＲＮＡの一部を用いることができる。

本発明の好ましい態様において、組換えベクター中に含まれる本発明の該ＤＮＡ 配列は、適当なプロモーターの制御下にある。これら本発明の組換えベクターは 、本発明のりボザイムを所望の宿主細胞中で発現させるのに適した発現ベクター である。そのような原核プロモーターの例としては、バクテリオファージラムダ ＰＬおよびＰＲプロモーター、バクテリオファージＳＰ６、Ｔ３およびＴ７プロ モーター（本発明のりポザイムをインビトロで合成するのに好ましい）、ｌ　ａ 　ｃＺ％ｔａｃ、ｔｒｃおよびｔｒｐプロモーターが挙げられる。動物系での真 核プロモーターの例としては、マウス乳癌ウィルス長末端繰返しくｍｏｕｓｅ　 ｍａａ＋ｍａｒｙ　ｔｕｍｏｒ　ｖｉｒｕｓ　ｌｏｎｇ　ｔｅｒｔｎｉｎａｌｒ ｅｐｅａｔＸＭＭＴＶ　Ｌ　ＴＲ）中に存在するグルココルチコイド誘発性プロ モーター、ＳＶ４０初期および後期プロモーター、および植物系に対してはツバ リンシンターゼ（ｎｏｐａｌｉｎｅ　５ｙｎｔｈａｓｅ）プロモーター、カリフ ラワーモザイクウィルス（ＣａＭＶ）３５Ｓプロモーター、およびジェミニウィ ルス（ｇｅｍｉｎｉ　ｖｉｒｕｓ）に由来するプロモーターが挙げられる。

本発明の好ましい態様において、アンチセンスＲＮＡをコードし、挿入後にポー タブルリボザイムカセットの両側に存在する付加配列は、その５°および／また は３′末端に、自己相補的でありＲＮＡに転写後に高度に安定なステム−ループ 構造を形成する配列ドメインを含んでおり、これによりエキソヌクレアーゼに対 する保護が得られる。

本発明の特に好ましい態様において、上記ＲＮＡに転写後に安定なステム−ルー プ構造を形成する配列は、平滑末端ライゲーションにより挿入することが可能で 下記配列を有する二本鎖ＤＮＡカセットに由来する。

別の態様において、本発明は、本発明のポータブルリポザイム力セットまたは本 発明の上記ＤＮＡ配列を含有する組換えベクターに関する。

本発明はまた、これら組換え発現ベクターを含有する細菌（たとえば、大腸菌ま たはバシラス・サブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　５ｕｂｔｉｌｉｓ））、低級真 核生物（酵母または真菌）などの宿生生物にも関する。

他の態様において、本発明は、本発明のりボザイムの製造方法に関し、該方法は 本発明の宿主を適当な条件下で培養し、培養液がら本発明のりボザイムを単離す ることを特徴とする。

本発明はまた、本発明のＤＮＡ配列によりコードされるリボザイムに関する。

さらに、本発明は、本発明のポータブルリポザイム力セットまたは上記本発明の ＤＮＡ配列を含有するウィルス、細菌、植物および動物ゲノムに関する。さらに 、本発明は、そのようなゲノムを含有する対応ウィルス、細菌、真菌、植物また は動物に関する。たとえば、そのようなウィルスは、本発明のりボザイムをコー ドするＤＮＡ配列を所望の宿主中に導入するためのベクターとして用いることが できる。レトロウィルスおよびワクシニアウィルスが好ましいベクターウィルス である。

上記に説明したように、本発明のりポザイムをコードするＤＮＡ配列の転写によ り、所望の標的ＲＮＡ（基質ＲＮＡ）を不活化するように働くリポザイムが生じ る。それゆえ、本発明のりポザイムをコードするＤＮＡ配列またはりボザイム自 体のいずれも、広範囲の治療的および生物学的適用性を有する。たとえば、これ らは、ウィルスのライフサイクル中に生成された標的ＲＮＡを不活化することに より、ある種の望ましくない遺伝子を抑制したりヒト、動物および植物のウィル ス感染を治療したりするのに用いることができる。それゆえ、本発明のりポザイ ムは、レトロウィルスの感染、たとえばヒト免疫不全ウィルス（ＨＩＶ）および ポジティブ−センス（ｐｏｓｉｔｉｖｅ　−５ｅｎｓｅ）　ＲＮ　Ａウィルスの 感染、たとえばトガウィルス、コロナウィルス、ピコルナウィルス、カリビウイ ルス（ｃａｌｉｖｉｖｉｒｕｓｅｓ）の感染、およびネガティブ−センス（ｎｅ ｇａｔｉｖｅ−ｓｅｎｓｅ）ＲＮＡウィルス、たとえばバラミクンウイルス（た とえば、センダイウィルス）、ラブドウィルス、インフルエンザウィルス、ブン ヤウィルス（ｂｕｎｙａｖｉｒｕｓｅｓ）またはアレナウィルスの感染の治療に 用いることができる。

ＤＮＡウィルスのｍＲＮＡもまた本発明のりボザイムの攻撃目標とすることがで き、ポックスウィルス、イリドウィルス、ヘルペスウィルス（たとえば、単純ヘ ルペスウィルス（Ｈ３Ｖ））、アデノウィルス、パボーバウイルス（たとえば、 Ｂ型肝炎ウィルス（ＨＢＶ））および／またはレオウィルスによるウィルス感染 の治療に用いることができる。本発明のりボザイムおよび対応するコードＤＮＡ 配列はまた、細菌などの原核細胞、または原生動物や酵母などの真核細胞におい て、植物および動物（プラスモジウム・ファリバルム（ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ　 ｆａｌｉｐａｒｕｍ）などの寄生性動物など）、およびヒトにおいて標的ＲＮＡ の不活化のために用いることができる。ヒトの治療においては、本発明のりボザ イムまたは対応するコードＤＮＡ配列を、必要とする患者に投与することができ る。

それゆえ、本発明はまた、本発明のりボザイムまたは対応するコードＤＮＡ配列 を含有する組成物にも関する。本発明はさらに、植物、動物またはヒト患者にお いて標的ＲＮＡを除去する方法に関し、該方法は、薬理学的、獣医学的または農 学的に許容し得る担体および／または賦形剤を任意に用い、該植物、動物または ヒト患者を本発明のりボザイムをコードするＤＮＡ配列または本発明のりボザイ ムで処理することを特徴とする。そのような組成物を用いることにより、本発明 のりポザイムまたは対応するコードＤＮＡ配列を非経口または他の投与手段によ り送り込むことができる。

本発明の組成物の好ましい態様において、本発明のりポザイムをコードし本発明 のポータブルリボザイムカセットを含有するＤＮＡ配列をビヒクル（たとえば、 担体ウィルス）中に含有させることによって該ＤＮＡ配列は特定の標的組織また は細胞中に移され、そのゲノム中に組み込まれるか、またはその中で一過的に発 現される。この場合に用いられる担体ウィルスは、たとえば、組換えレトロウィ ルスまたは組換えワクシニアウィルスである。

植物の場合には、本発明の組成物はＴ１−プラスミドベースのベクターまたはベ クター系または対応して形質転換されたアグロバクテリウム属を含有していてよ く、これらは、ポータブルリボザイムカセットを含有する本発明のＤＮＡ配列が 、治療しようとする植物の所望の標的組織または標的細胞中に移動するのを指令 することができる。別の態様においては、本発明の組成物は、植物細胞または組 織中に直接遺伝子移動させる技術、たとえばエレクトロポレーションや粒子促進 （ｐａｒｔｉｃｌｅ　ａｃｃｅｌｅｒａｔｉｏｎ）などに適した発現ベクターを 含有していてもよい。

この場合も、そのような植物標的組織または標的細胞中でのりボザイムの発現は 、一過性であっても永久的であってもいずれでもよい。

それゆえ、本発明はまた、感染因子が疾患を引き起こす可能性を除くための組成 物にも関する。

本発明はまた、リボザイムをコードするＤＮＡ配列（このＤＮＡ配列は、上記ポ ータブルリボザイムカセットを含有する）の製造方法にも関し、該方法は、（Ａ ）リボザイムにより不活化されるべき所望の標的ＲＮＡをコードするＤＮＡ配列 中に、下記ヌクレオチド配列・ Ｍ２ＭＩＫＬＺＮｌｈｈＮ３Ｎ４ （式中、Ｍ２、Ｍ、、に、Ｌ、Ｎ、、Ｎ２、Ｎ３およびＮ４は前記と同じ：Ｚは Ａ、Ｇ％ＣまたはＴ。

Ｚは標的ＲＮＡの５゛末端リボザイム開裂生成物の３′末端ヌクレオチドに対応 する： ヌクレオチド配列ＫＬＺは、リボザイムによって開裂される標的ＲＮＡのヌクレ オチド配列に対応する； Ｚは該制限酵素開裂部位を対応制限酵素で開裂した後に得られる突出端の一部で ある）の制限酵素開裂部位を選択し； （Ｂ）（Ａ）で得られたＤＮＡ配列の該制限酵素開裂部位を対応制限酵素で開裂 し。

（ＣＸＢ）の開裂生成物の突出端を除去して平滑末端とし：（Ｄ）下記工程： （ＤＡ、）前記請求の範囲で定義したＤＮＡ配列（ａ）の５゛末端に、（Ｂ）で 得た突出端中に存在するＺの５°部位に位置するヌクレオチドを付加し：（ＤＢ ）該ＤＮＡ配列（ａ）の３′末端に、該突出端中に存在するＺの３′部位に位置 するヌクレオチドを付加する からなる方法を行うことによりリボザイムカセットを製造し二ついで（Ｅ）工程 （Ｄ）で得たりボザイムカセソトを工程（Ｃ）で得たＤＮＡ配列中に挿入する 工程からなることを特徴とする。

この方法の好ましい態様において、工程（Ｄ）で得られた構造を示すリボザイム カセット（工程（Ｅ）において、二Ｈ（Ｃ）で得られたＤＮＡ配列中に挿入され る）は、該ポータブルリポザイムカセットの両側に存在する制限酵素開裂部位の 開裂によりクローニングベクターから切り出される。

さらに、本発明は、本発明のポータブルリポザイムカセットの製造方法に関し、 該方法は、 （Ａ）リボザイムにより不活化されるべき所望の標的ＲＮＡをコーばするＤＮＡ 配列中に、下記ヌクレオチド配列： ＭｔＭ　１ＫＬＺＮｒＮ２ＮｓＮ４ （式中、Ｍ２、Ｍｌ、Ｋ、Ｌ、Ｎ、、Ｎ！、Ｎ３およびＮ４は前記と同じ：Ｚは Ａ、Ｇ、ＣまたはＴ； Ｚは標的ＲＮＡの５′末端リボザイム開裂生成物の３′末端ヌクレオチドに対応 する； ヌクレオチド配列ＫＬＺは、リポザイムによって開裂される標的ＲＮＡのヌクレ オチド配列に対応する： Ｚは該制限酵素開裂部位を対応制限酵素で開裂した後に得られる突出端の一部で ある）の制限酵素開裂部位を選択し； （Ｂ）対応制限酵素を用いた開裂により生成される該制限酵素開裂部位の突出端 を決定し：ついで （Ｃ）下記工程： （ＣＡ）前記請求の範囲で定義したＤＮＡ配列（ａ）の５゛末端に、（Ｂ）で決 定された突出端中に存在するＺの５゛部位に位置するヌクレオチドを付加し：（ ＣＢ）該ＤＮＡ配列（ａ）の３′末端に、該突出端中に存在するＺの３′部位に 位！するヌクレオチドを付加する からなる方法を行うことによりリボザイムカセットを製造する工程からなること を特徴とする。

本発明の好ましい態様において、アンチセンスーリポザイム（特定の標的ＲＮＡ （基質ＲＮＡ）に向けられる）をコードするＤＮＡ構築物を生成させる技術は５ つの工程からなる：すなわち、（ｉ）ＤＮＡカセットの調製、（１１）標的ＲＮ Ａ（基質ＲＮＡ）をコードするｃＤＮＡのＦｌ製、（ｉｉｉ）該ＤＮＡカセット の該ｃＤＮＡへの実際の挿入、（ｉｖ）得られた組換えクローンの分析、および （Ｖ）得られたＲＮＡの触媒活性のリボザイムアッセイでの確認。個々の手順は 下記のようにして行う。

幾つかの通常の実験手順の一層詳しい記載は、サンプルツク（Ｓ　ａｍｂｒｏｏ ｋ）らの［モレキュラー・クローニング（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ ）、コールド・スプリング１ハーバ−５第二版、１９８９」に掲載されている。

（ｉ）ＤＮＡカセットの調製 実施例２および図８に示すように、各所望のＤＮＡカセットのため、プラスミド ベクター（プラスミドｐＴ３Ｔ７１ａｃ（ベーリンガー・マン／Ｘイム、ＦＲＧ ）が好ましい）中にオリゴデオキシヌクレオチドをクローニングする。得られた 組換えプラスミド（たとえば、プラスミドｐＡｚｓａｌｌ）は、ＥａｒＩなどの クラスＩＩＳ制限酵素の２つの認識部位の間に所望のＤＮＡカセ・ノドに対応す るＤＮＡ配列を含有しており、その突出端を埋めた後に所望のＤＮＡカセ・ｙト が得られるように、定められた末端を有するＤＮＡ断片を特異的に放出すること ができる。

配列分析によってオリゴデオキシヌクレオチドが正しくクローニングされている ことを確認した後、リボザイムＤＮＡカセットを有するプラスミドをＸｈｏＩで 開裂する。両側がＸｈｏＩ部位でありテトラサイクリン耐性遺伝子（ｔｅｔ遺伝 子）を含有するＤＮＡ断片を挿入する。このＤＮＡ断片は、プラスミドｐＢＲ３ ２２の修飾形（プラスミドｐＢＲ３２２のＥｃｏＲＩおよびＡｖａＩ部位を該制 限酵素で開裂し引き続いてフレノウポリメラーゼで埋めた後、該部位にそれぞれ Ｘｈｏｌリンカ−を連続的に導入することにより生成する（それゆえ、ＥｃｏＲ ■部位は保存される））から得られる。ついで、ＥｃｏＲＩおよびＨｉｎｄＩＩ Ｉで消化することにより（ｔｅｔ遺伝子内で１度、プラスミドｐＴ３Ｔ７１　ａ ｃ中で１度開裂する）、ｔｅｔ遺伝子がＸｈｏＩ部位に挿入された方向を決定す る。

この分析を完了した後、組換えプラスミド（たとえば、ｐＡｚｓａｌｌ−ｔｅｔ ）をＥａｒｌで開裂することにより実際のＤＮＡカセットを生成する。このプラ スミド約５〜１０μｇを約２０〜３０単位のアイソシゾマーＫｓｐ６３２１（べ −リンガ−・マンハイムから）で１００１１１の容量にて消化する。３７℃で２ 〜３時間後、ｄＮＴＰｓを最終１度５００μＭで加え、大腸菌ポリメラーゼＩの 大きい断片（フレノウ酵素、Ｎ、Ｅバイオラブズ）５単位を加え、この反応混合 物を１６℃にて５分間インキュベートする。ＥＤＴＡを最終濃度１５ｍＭで添加 した後、このＤＮＡをアガロースゲル上に幾つかのレーンにて負荷する。これら ＤＮＡ断片を電気泳動により分離した後、ゲルをエチジウムブロマイド（１μｇ ／ｍｌ）で染色し、約１４５０塩基対の断片（所望のＤＮＡカセットに対応する ）を切り圧す。

このＤＮＡを電気的に溶出しくｅｌｅｅｔｒｏｅｌｕｔｅｄ）、フェノール処理 し、イソプロパツール沈澱により回収する。ついで、このＤＮＡカセットを小容 量（１０〜２０μｌ）のＴＥ緩衝液（ｌＱｍＭトリス／ＨＣＩ、１ｍＭ　ＥＤＴ Ａ　ｐＨ８，０）中に溶解する。小アリコート（１μｍ）を再びアガロースゲル 上に負荷して、回収したＤＮＡカセットの濃度を評価する。

このＤＮＡカセットの残留溶液を一２０℃にて貯蔵し、幾つかの組込み実験のた めに用いることができる。

（ｉｉ）ｃＤＮＡの調製 バクテリオファージによりコードされるＲＮＡポリメラーゼ（Ｔ３、Ｔ７または ＳＦ３　ＲＮＡポリメラーゼなど）プロモーターとは異なる方向に挿入されたＤ ＮＡのインビトロ転写が可能なりローニングベクター中に、標的ＲＮＡをコード するｃＤＮＡ（またはその断片）をクローニングする。これら「ジエミニ」タイ プのベクターの多くは市販されている。好ましい例は、ベーリンガー、マンハイ ム、ＦＲＧからの転写ベクターＩ）Ｔ３Ｔ７１ａｃ（または、一つの制限部位が 破壊されている、その修飾形）である。このプラスミドは、Ｔ７およびＴ３　Ｒ ＮＡポリメラーゼのプロモーターの間にポリリンカー領域を含んでいる。このこ とにより、基質ＲＮＡまたはその相補体ＲＮＡに対応するＲＮＡ（図２を比較） のインビトロ合成が可能になる。それゆえ、リボザイムアッセイの基質として働 き得る標識ＲＮＡを合成することができる（下記参照）。

対応ＤＮＡリポザイムカセットを導入することができるようになる制限部位を選 択した後、上記組換えプラスミド（１μｇ）を該制限酵素で開裂する。フェノー ル処理し、ついでイソプロパツール沈澱によりプラスミドを回収した後、このプ ラスミドを１８μｍの８１緩衝液（２２５ｍＭＮａＣ１，３０ｍＭ酢酸カリウム ｐＨ４，５，２００１１Ｍ　ＺｎＳＯ４および５％グリセリン）中に溶解し、水 中で少なくとも１０分間インキ、ベートして０℃まで冷却する。これと平行して 、ヌクレアーゼＳｌ（ベーリンガー・マンハイム）を８１緩衝液中に１単位／１ μｌの濃度に希釈し、氷上で少な（とも１０分間インキュベートする。ついで、 この２μ］（ヌクレアーゼＳ１２単位に対応する）を上記開裂プラスミドに加え る。氷上で２０分後、５μｌの８１停止緩衝液（３００ｍＭ）リス／ＨＣＬ　５ ０ｍＭＥＤＴＡ、ｐＨ８，０）を反応混合物に加え、ついでこれを６５℃にて１ ０分間インキ、べ−１−してヌクレアーゼを不活化する。ついで試料をフェノー ル処理し、再びイソプロパツールで沈澱させる。これを小容量のＴＥ緩衝液（１ ０μｌ）中に溶解し、１μｌをアガロースゲル上に負荷して濃度を評価する。

（ｉｉｉ）ｃＤＮＡ中へのＤＮＡカセットの挿入：約２００〜３００ｎｇのｃＤ ＮＡ含有プラスミド（制限酵素で開裂：その中にＤＮＡリボザイムカセットを導 入する：得られた突出端はヌクレアーゼＳ１で処理することによりトリミングし である）を約１１００ｎのＤＮＡリボザイムカセットと混合し、小容量（５〜１ ０μｌ）の平滑末端ライゲーション緩衝液（５０ｍＭトリス／ＨＣＩ　ｐＨ７， ５，１０ｍＭ　Ｍｇ（Ｊ’ｚ、５％ＰＥＧ３０００．１ｍＭＤＴＴおよび１００ μＭ　ＡＴＰ、３単位のＴ４ＤＮＡリガーゼ（ミノチック（ＭｉｎＯｔｅｃｈ） 、ヘラクリオン、ギリシャ）を添加）中、１２℃にて少なくとも１２時間ライゲ ーンヨコンる。ついで、このライゲーション混合物を大腸菌（好ましくは株Ｊ　 Ｍ８３）中に形質転換し、テトラサイクリン（１３μｇ／ｍｌ）およびアンピノ リン（１００μｇ／ｍ］）を含有するアガープレート上にブレーティングした。

（１ν）組換えクローンの分析 上記組換えクローン（ミニブレブ（ｍｉｎｉｐｒｅｐ））からプラスミドを単離 した後、上記ＤＮＡカセットに由来する５ｔｕ１部位の存在を試験するため、「 制限分析」を行う。Ｘｈｏｌ消化により、ｔｅｔ遺伝子を切り出すことができる ことが確認される。挿入の方向性は、ｔｅｔ遺伝遺伝市内びｃＤＮＡ挿入物中ま たはベクター内で開裂する制限酵素、たとえばＢａｍＨＩ、ＥｃｏＲＩまたはＨ ｉｎｄＩ　Ｉ　Ｉを用いることにより決定する。ｔｅｔ遺伝子の挿入の方向性に 依存して、センスまたはアンチセンスのいずれに向けられたりボザイムが構築さ れたかを結論付けることができる。

（Ｖ）リボザイムアッセイ・ リボザイムＲＮＡの正確な生成は、機能性試験により確認する。この目的のため 、目的のｃＤＮＡ断片をクローニングした転写ベクターを用い、インビトロ転写 により標識基質ＲＮＡを調製する。これらリポザイム構築物を制限酵素（ｔｅｔ 遺伝遺伝市内はｃＤＮＡ挿入物内のいずれでも開裂しない）で開裂して、ラン− オフ（ｒｕｎ−ｏｆｆ）転写のための鋳型が得られるようにする。標準反応条件 下（酵素の供給者（Ｎ、　Ｅ、バイオラブズまたはベーリンガー・マンハイム） に従う）、２０μ】中、３７℃で１時間、対応プロモーターからインビトロ転写 （非標識）することによりリボザイムＲＮＡを調製する。反応の最後の２分間に ４単位のＤＮａｓｅ１１ＲＮａｓｅフリー（ベーリンガー・マンハイム）を加え る。ついで、混合物をフェノール処理し、エタノールで沈澱する。ついで、この リポザイムＲＮＡを２０μｍの５０ｍＭトリス／ＨＣＩ　ｐＨ８，０，２０ｍＭ 　Ｍｇ（Ｊｚ中、標識基質ＲＮＡとともに６０℃で３０分間インキュベートする 。最終濃度１２Ｍの酢酸ナトリウム（ｐＨ５）および１μｇのｔＲＮＡｆｆ担体 」として使用）を添加した後、試料をエタノールで沈澱し、変性５％ポリアクリ ルアミドゲル上で分離しくツァグリス（Ｔｓａｇｒｉｓ）ら、ＥＭＢＯＪ、、６ （１９８７）、２１７３〜２１８３に記載）、オートラジオグラフィーにより視 覚化した。期待されるサイズの開裂生成物の検出により、試験したＲＮＡのりボ ザイムとしての性質が確認された。

最後に、ｔｅｔ遺伝子を切り出すため、対応ＤＮＡ構築物をＸｈｏＩで開裂し、 ライゲートする。

迅速な分析のため、転写後（リポザイムＲＮＡをフェノール処理および沈澱させ ることなく）直接、リボザイムＲＮＡを取り扱うこともできる。その場合は、１ ００ｍＭ）リス／ＭＣＩ　ｐＨ８，０および４０ｍＭ　ＭｇｃＩ２中の標識基質 ＲＮＡ（２０μｌ）を非標識リポザイムＲＮＡに加え、この反応混合物を６０℃ で３０分間インキュベートする。ついで、２０μｍの０．６Ｍ酢酸ナトリウム、 １５０μｇ／μ］　ｔＲＮＡを加え、ついで１５０μｍのエタノールを加える。

遠心分離により試料を回収し、標識はしであるが未処理の基質ＲＮＡのアリコー トとともに変性ポリアクリルアミドゲル上で分離する。オートラジオグラフィー により視覚化した後、基質の開裂生成物を同定することができる。リボザイムＲ ＮＡのフェノール処理を行わないため、基質ＲＮＡは若干の非特異的な分解を受 けるがもじれない。しかしながら、開裂生成物は同定することができる。それゆ え、一定の構築物のりポザイム活性を確かめることができる。

上記本発明の方法に用いることのできる制限酵素開裂部位の例にュー・イングラ ンド・バイオラブズのカタログから採用）を下記表１に示す。

！上　制限酵素特異的ポータブルリボザイムカセットの挿入のための制限酵素開 削１素ｂ　８に的モチーフ０　ケースＮｏ、’　）リミング後　ＤＮＡ力ゞ７１ ｆＢａｍ１４工　−ｃ’ｃ７ｃｍ　１００　−Ｇ　Ｃ−ＧＡＴ　（ａ）　−−− −ＢｃｌＩ　−Ｔ’Ｇ−＝Ａ−１００−Ｔ　Ａ−ＧＡＴ（ａ）−−−−ＢｇｌＩ ｒ　−Ａ’（ＪｇＱＴ−１００−Ａ　Ｔ−ＧＡＴ（ａ）　−−−−ＢｓｔＹＸ　 −ＲＧに＝’Ｙ−１００−Ｒ’Ｙ−ＧＡｒ（ａ）−−−−Ｃ１ａｒ　−ＱＣ；Ａ Ｔ−１００−ＡＴ　ＡＴ−−−−（ａ）　に　−−−ＡｖｒＸＩ−Ｃ’ロムＧＣ ；−１００−ＣＧ−−ＣＴ（ａ）（：−−−ＮｈｅＩ　−Ｇ’シロ−Ｃ−１００ −Ｇ　Ｃ−−０丁（ａ）　Ｇ　−−−５ｐｅＩ　−Ａ’５ＪにＴ−１００−Ａ　 Ｔ−−０丁（ａ）　Ｇ　−−−ＸｂａＸｇ−Ｔ’１Ｊ４ＧＡ−１００−Ｔ　Ａ− −ＣＴ（ａ）Ｇ−−−ＸｈｏＩ−２二〇Ａに−１００−ＣＧ−−−τ（ａ）　に 　Ａ　−−Ａｖａニーｉ、ＱＪｊＧＲＧ−５０−ＣＧ−−−Ｔ（ａ）にＲ−−Ｂ ｓｕ３６Ｉ　−ＣＬｕＡＧＧ−５０−ＣＣＧＧ−−−Ｔ（ａ）Ａ−−−ＤｄｅＩ 　−二＝ＡＣ；−５０−ＣＧ−−−Ｔ（ａ）＾−−−ＥｓｐＩ　−ＣＬｕＡＧＧ −５０−にＣ（：Ｃ−−−Ｔ（ａ）Ａ−−−表■の続き 制限酵素ｂ　標的モチーフ０　ケースＮｏ、ｄ　）リミングＨＤＮＡ力ゞットｆ Ｋ　ＬＺ　（％）　の配列　Ｍ、Ｋ　Ｌ　（ａ）　Ｎ１Ｎ２Ｎ５Ｎ４ＡｃＣＩｈ −２ニムＴＡＣ−５０−ＣＴ　ＡＣ−−−−（ａ）　Ｔ　−−−＾ｖａエニーＧ ’二≦Ｃ−５０−Ｇ　Ｃ−−ＧＴ（ａ）　−−−−Ｐｐｍｕｌ　−ＲＧ’社瓜Ｃ Ｙ−５０−Ｒに　ＣＹ−−０丁（ａ）　−−−−Ｒｓｒ工Ｘ　−ＣＧ’二ＣＣ− ５０−ＣＧ　Ｃに−−０丁（ａ）　−−−−ΣｅｏＯ１０９エ　−ＲＧ’二ＣＹ −２５−ＲＧ　ＣＹ−−Ｇ　Ｔ　（ａ）　−−−−ＢｓセΣエエ　−Ｃ；’輿ヨ ＡＣＣ−１００−Ｇ　Ｃ−−ＣＴ　（ａ）　Ａ　Ｃ−−ＭａｅＩ工Ｉ　−１−Ａ Ｃ−１００−−−ＧＴ（ａ）ＡＣ−−ＡｐａＬＸ　−＝ＣＡＣ−１００−Ｇ　Ｃ −τ（ａ）　ＣＡ　−−ＢｓｐＭＸＸ　−（ｊＪ二：ｊＣＣＣＡ−１００−（Ｎ ）Ｔ　八−−−−（ａ）　ＣＧ　に　−ＴａｑＩ　（Ｎ）Ｔ’０ＣＡ−１００− （Ｎ）丁　Ａ−−−−（ａ）Ｃ；　−−−Ｘｂａ工ｇ−Ｃロ二ＴＡＧＡ−１００ −（Ｎ）Ｔ　Ａ−−−−（ａ）ＴＡＣ；−ＥｃｏｒｌＩ　（≦よ二〇ｗＧに−２ ５−（Ｎ丁）　−−−−（ａ）ＣＷＧＧ表Ｉの続き 制限酵素ｂ　標的モチーフ０　ケースＮｏ、　トリ８ング後　ＤＮＡカセットｆ ｄ　、 ＢｓｔＢＸ　−エニエＱＣ，ＡＡ−１００−Ｔ　Ａ−−−τ　（ａ）　ＣＡ　− −ＮｄｅニーＣトｎＴＣ−１００−ＣＡ’ＴＧ−−−Ｔ（ａ）−−−−＾Ｓｅ工 に−ＡにＡＡＴ−１００−ＡＴ　ＡＴ−−−−（ａ）　Ａ　−−−ＥｅｏＲＩ　 −に″％Ｃ−１００−Ｇ　Ｃ−ＡＡτ（ａ）−−−−ＡｆｌＩｌｌ−＝ＡＡＣ； −１００−Ｃに−−−Ｔ（ａ）ＡＡ　−脚注 ａ　上記表の解釈のための詳細な例示は下記に示す。

ｂ・リボザイムカセットの挿入のために用いることのできる制限酵素をリストア ツブする；ＴａｑＩを例外として、５またはそれ以上のヌクレオチドの認識配列 を有する制限酵素のみをリストアツブ。

Ｃ標的ＲＮＡをコードするＤＮＡの一部である制限酵素の認識配列を示す。

開裂部位は「“」で示す。

ヌクレオチドＮはＡ、Ｃ，、ＧまたはＴであり、ＷはＡまたはＴであり、ＹはＣ またはＴであり、ＲはＡまたはＧである。

制限部位内で３つのヌクレオチドＫＬＺ（前記と同じ）からなる標的モチーフに は下線を引いである。

リストアツブした制限酵素はすべて、その中にヌクレオチドＺを含有する突出端 を生成する ｄ　パーセンテージは標的モチーフを生成する制限部位の割合を示す；たとえば 、配列ＧＧＴＣＣは、認識配列ＧＧＷＣＣを有するすべての可能なＡｖａ１１部 位の約５０％のみを表す。ＡｖａｌＩ部位の５０％のみが標的モチーフとして期 待できる。

ｅ：？ｔｊｌ化および突出端除去後の制限認識配列の残留ヌクレオチドｆ・上記 リホサイムを生成するための、標的ＲＮＡをコードするＤＮＡ中に挿入するのに 用いるＤＮＡ力セントの配列。ＤＮＡカセットは上記配列（ａ）からなり、該配 列（ａ）の５゛末端および３′末端にはそれぞれ上記Ｍ、に、ＬおよびＮ、、Ｎ ２、Ｎ３およびＮ４の幾つかのヌクレオチドが付加している。

ｇ：Ｘｂａｌは２つの標的モチーフニー（Ｎ）Ｔ’ＣＴＡＧＡ−および−Ｔ’Ｃ 工ΔＧＡ−を含む。

ｈ　２つの可能なＡｃｃ１部位ＧＴ’ＣＧＡＣおよびＧＴ’ＡＴＡＣ（それぞれ 、ＧＴＡモチーフおよびＧＴＣモチーフを含有する）が存在する。

１　現在のところ、ＣＴＡおよびＣＴＣモチーフについてのみ開裂が観察されて いる。

ｋ＋ＡｓｅＩは２つの標的モチーフ：ＡＴ’ＴＡＡＴおよびＡＴ’ＴΔＡＴを含 有する。

本発明を一層よく理解するため、以下に表Ｉの適用および解釈の仕方の一例を示 す。

たとえば、５ａｉｌ認識部位中にＧＴＣ標的モチーフを含有するりポザイムを所 望する場合には、ＤＮＡカセットは表１に従って以下のようにして通訳する。

５ａｌＩ部位は である。消化後は −Ｇ（ニー（表Ｉでは−Ｇ　Ｃ−） 挿入すべき触媒ドメインを有する本発明のポータブルリボザイムヵセソトは、た とえば、下記コア配列（ＤＮＡ配列（ａ））、および各制限認識配列に特異的な りＮＡ配列（ｂ）（この場合、５′末端のＬはＴ１３゛末端のＮ、はＧ、Ｎ２は Ａである）である「買換ヌクレオチド」からなる。

３’ＡＡＡ　ＣＡ　Ｔ　ＡＧＴＡＴ　ＣＴ５’コア配列 （ＤＮＡ配列　（ａ）） ５°　３゜ （表ＩではＴ（ａ）ＧＡ） 特定の標的ＲＮＡに特異的な本発明のりポザイムを生成させるためには、下記２ つの要件のみが満たされる必要がある。

（ｉ）好ましくはプラスミドまたはファージベクター中にクローニングした（配 列に関する情報は必要ないり、標的ＲＮＡ（基質ＲＮＡ）をコードする少なくと も一部のＤＮＡ構築物を入手する必要がある。

（ｉｉ）このＤＮＡ構築物は、上記一般式で定義したような制限酵素開裂部位、 たとえば、表Ｉに示す制限酵素開裂部位を含有している必要がある。

これら配列モチーフはすべて、リボザイム活性に必要な開裂モチーフの一つを含 んでいる。

制限酵素開裂部位および可能な標的モチーフに関する本発明物らの知識に基づい て好ましいと思われるポータブルリポザイムカセットの配列を、表Ｈにまとめて 示す。

表■　リポザイムをコードするＤＮＡを生成するために種々の制限部位中に挿入 τａｑ工 ３　τ（ａ）　Ａ　Ｂｓｕ３６エＬ　Ｎ、　２５ｐＩ ４　６丁　（ａ）　ＡｖａＩ工　ＫＬ　２ｐｍｕＩ ５　ＣＡ　Ｔ　（ａ）　’Ｂａｍ）ＩＩ　Ｍｔ　）：　Ｌ　３ｇｌ　ｌｌ ＢｓセｙＩ ６　ＣＴ　（ａ）　ＣＡｖｒＩＩ　Ｋ　Ｌ　Ｎ１３ｐｅＸ ＸｂａＸ’ ｐｎ１ 表Ｈの続き Ｂ　Ｔ（ａ）ＧＡ　Ａｖａ工ｅ　ＬＭＩＮ２　３９　Ｔ　（ａ）　ＣＧ　Ａｖａ ＩｅＬ　ＮＩ　Ｎ２　３１０　（ａ）　Ａ　Ｔ　ＣＢｓｐ＋４Ｉ　ＮｌＮ２　Ｎ ３　３１１　（ａ）　ＣＣＧ　ＢｓｐＭＩＩ　Ｎｚ　Ｎ２　Ｎ３　３１２　（ａ ）　Ｔ　Ａ　Ｇ　ＸｂａｌｆＮＩＮ２Ｎ３３１３　Ｇ　Ｔ　（ａ）＾ＣＢｓｔΣ ＩＩ　ＫＬＮＩＮ２（１１４（ａ）　ＣＡ　Ｇ　（：　ＥｅｏＲＩＩｅＮＩＮ２ Ｎ３Ｎ４４１５　（ａ）　ＣＴ　Ｃ；　ＣＥｃｏＲＩＩｅＮ、　Ｎ、、　Ｎ５Ｎ ４４１６　Ｔ（ａ）ＣＡ　ＡｐａＬＩ　Ｌ　ＮｌＮ２３ｓｅＩｇ １８　（ａ）＾　ＡｓｅＩｇ　Ｎ、　１１９　丁（ａ）　ＡＡ　ＡｆｌＩＩｈＬ 　Ｎ、　Ｎ２３２０　Ｔ丁（ａ）＾　Ａｆｌ工１ｈ　スＬ　Ｎ、　３脚注 ａ：ＤＮＡカセットは、上記配列（ａ）と、上記その付加配列とからなる。

ｂ：このＤＮＡカセットとともに用いることのできる制限酵素。

Ｃ・上記一般式の定義に示す、ＤＮＡカセットの配列（ａ）に付加するヌクレオ チド。

ｄ：配列（ａ）に付加するヌクレオチドの合計数を示す。

ｅ、これらの制限酵素は、特定の開裂部位の認識配列に依存して２つの異なるＤ ＮＡカセットとともに用いることができる。

ｆ：ＸｂａＩは２つの標的モチーフ：　−（Ｎ）Ｔ’ＣＴＡＧＡ−および−Ｔ’ ＣＴＡＧＡを有するので、各ＸｂａＩ部位は、２つのＤＮＡカセットのそれぞれ とともに用いることができる。

ｇ＋ＡｓｅＩは２つの標的部位　ΔＴ’ＴＡＡＴおよびＡＴ’ＴＡＡＴを有する 。

ｈ：ＡｆｌｌＩは２つの標的部位　Ｃ’ＴＴＡＡＧおよびＣ°エエΔＡＧを有す る。

図面の説明。

図１゜ ５ａｉ１認識配列（ＧＵＣＧＡＣ）を含有する基質ＲＮＡ（標的ＲＮＡ）とその 対応リポザイムＲＮＡとの間のハンマーへッドコンホメーンコンリボザイム分子 の突き出ている部分は触媒ドメインであり、開裂反応に関与していると思われる 残基は囲んである。開裂部位は矢印で示す。

この特定の場合では、配列ＧＵＣが基質ＲＮＡの標的モチーフである。それゆえ 、これらヌクレオチドはヌクレオチドＫＬＺを表し、このうちヌクレオチドＺは リボザイムＲＮＡと直接塩基対を形成しない基質ＲＮＡの唯一のヌクレオチドで あり、標的ＲＮＡの５′末端リボザイム開裂生成物の３°末端ヌクレオチドに対 応する残基である。配列： ５’　ＣＩＸ；ＡＵにＡにＬＩＣＣにＵにＡにＣＡＣにＡＡ　３゜は配列（ａ） 、すなわち、標的ＲＮＡと塩基対を形成しないリボザイム部分を表す。

基質ＲＮＡをコードするＤＮＡを５ａｌｌで開裂後、標的ＲＮＡのヌクレオチド ＵＣＧＡは突出端内に位置する。基質ＲＮＡのヌクレオチドＵおよびＧＡ並びに リポザイムＲＮＡのＡおよびＣＵは５ａｉｌ部位の突出端部分であり、基質ＲＮ Ａとリボザイムとの間で塩基対を形成する領域の部分でもある。それゆえ、これ らヌクレオチドは、配列（ｂ）（すなわち、標的ＲＮＡをコードするＤＮＡ配列 の制限酵素開裂部位の突出端に由来し、標的ＲＮＡと塩基対を形成するりポザイ ム部分の一部をコードする、配列（ａ）の両側に位置するＤＮＡ配列）を表す。

図２： 標的ＲＮＡおよびリボザイムＲＮＡを生成する転写を可能にするｃ　ＤＮＡ上部 は５ａｉｌ部位を有する標的ＲＮＡのｃＤＮＡを示し、下部は対応するりボザイ ムＤＮＡ構築物を示す。矢印で示す方向に転写されると、図１に示すハンマーヘ ッド構造を形成することのできる標的ＲＮＡおよびリボザイムＲＮＡ（リボザイ ムドメインを有するアンチセンスＲＮＡと考えられる）が合成されるであろう。

上記ｃＤＮＡのセンス鎖は標的ＲＮＡをコードし、対応リポザイム構築物のアン チセンス鎖はリボザイムＲＮＡをコードする。これら２つのＤＮＡの配列は囲ん である２つの部分のみが異なっており、このうち下の囲みは配列（ａ）を表す。

標的ＲＮＡ中の囲みＣ／Ｇ対およびアンチセンスリボザイム構築物中の囲み配列 （ａ）に隣接する塩基対Ｔ／ＡおよびＧＡ／ＣＴは、５ａｉｌ開裂部位の突出端 に由来する配列（ｂ）を表す。

この図は本発明の原理を要約しており、標的ＲＮＡをコードするＤＮＡ内の囲み Ｃ／Ｇ対を下部に示す囲みで置き換えることにより得られるＤＮＡ構築物は、こ れを鋳型として利用してアンチセンス（アンチザイム）ＲＮＡを合成した場合に 標的ＲＮＡに特異的なりホザイムＲＮＡを生じる。

図３ ＳａｌＩ認識配列を有するＲＮＡに対して向けられたりボザイム構築物を生成す るための方法 最上部は５ａｉｌ部位を有する二本鎖ｃＤＮＡを示し、そのうちセンス鎖は上部 に示す。４つの内部ヌクレオチドＴＣＧＡは、５ａｌＩ１１８ｉ化およびその後 の突出端のトリミングにより除去される。合成５ａｉｌ特異的二本鎖ＤＮＡカセ ットの挿入により、挿入の方向に依存してセンス指向またはアンチセンス指向リ ボザイム構築物が得られる。合成りＮＡカセット中の斜線で示した部分は、図２ の囲み配列の下部鎖に対応し、リポザイム配列中の配列（ａ）を表す。この場合 、図４に示すように、配列（ａ）は５ｔｕＩ部位（ＡＧＧ’ＣＣＴ）を含有する ように修飾されている。付加されているヌクレオチド（それぞれ、５’Ｔおよび ３’ＧＡ、並びに５’ＴＣおよび３′Ｃ）は配列（ｂ）からなり、上記一般式の ヌクレオチドＬ１Ｎ１およびＮ２に対応する。これらヌクレオチドは、５ａｌＩ 消化およびその後のトリミングにより除去された４つのヌクレオチドのうち３つ を置換するのに用られる。　５ａｉｌ部位中の第三の位置にあるヌクレオチドＣ はヌクレオチドＺに対応し、カセットを挿入することにより置換されない。

図４： ５ｔｕＩ認識配列を有し５ａｉｌ認識配列を含有するＲＮＡに対して向けられた りボザイムＲＮＡにより形成されるハンマーヘッド構造基質ＲＮＡは、図１と同 様に５ａｉｌ認識配列を有する。触媒ドメインは、３つのヌクレオチドの交換に より修飾されている。新たに導入された残基Ｇ、Ｕ、Ｃ（５゛→３′）は大きな 文字で示し、当初のヌクレオチドは括弧で示す。このヌクレオチドの交換により 新たな５ｔｕＩ認識配列ＡＧＧＣＣＵが生成され、その反対側にはさらにＨａｅ ＩＩＩ配列ＧＧＣＣが生成される。

図５ プラスミドｐＰＶｌおよびｐＰＶ２並びにそれらから得られるアンチザイム構築 物の地図 上部の２つの地図は、プラスミドｐＰＶｌおよびｐＰＶ２を示しており、それぞ れ３６３１部位に５ａｉｌ部位（詳細に示す）を有するヌクレオチド３４０９〜 ３８３１の範囲のプラムポックスウィルス（ＰＰＶ）のｃＤＮＡのＥｃｏＲＩ断 片を含有する。このＥｃｏＲＩ断片は、これら２つのプラスミド中で異なる方向 に挿入されている。右の説明は、ＰＰＶ　ＲＮＡ（それぞれ、これらプラスミド がらＴ３およびＴ７ＲＮＡポリメラーゼを用いて合成することができる）の極性 を示す。

中央の２つの地図はプラスミドｐＰＶ１から得られるアンチザイム構築物てあり 、下部の２つの地図はプラスミドｐＰＶ２から得られるアンチザイム構築物であ る。これら４つのアンチザイム構築物中のＤＮＡカセットの斜線を付した部分は 、リポザイム配列の配列（ａ）を示す。右の説明は、Ｔ３またはＴ７ＲＮＡポリ メラーゼがセンスまたはアンチセンス指向リボザイム構築物を合成することがで きるかどうかを示す。

図６ アンチザイムＲＮＡによるＰＰＶ標的ＲＮＡの開裂についてのゲル電気泳動分析 のオートラジオグラフ プラスミドｐＰＶ２およびｐＰＶ１２を用い、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼを用いた 転写により、それぞれ基質（Ｓ）およびアンチザイムＲＮＡ（Ａｚ）として働く 放射能標識ＰＰＶ（−）ＲＮＡを合成した。これらＲＮＡを単独または混合物に て、０℃かまたは６０℃のいずれかにて３０分間、５ＱｍＭトリス／ＨＣＩ、２ ０ｍＭ　ＭｇＣｌ２、ｐＨ８，０中でインキュベートした。エタノール沈澱によ り回収した後、これらＲＮＡを８Ｍ尿素を含有するポリアクリルアミドゲル（５ ％ポリアクリルアミド、０１２５％ビスアクリルアミド）上で分析した。

レーン１は０℃でインキュベートしたｐＰＶ１２からのアンチザイムＲＮＡ（Ａ Ｚ）、レーン２はＯｏＣでインキュベートしたプラスミドｐＰＶ２からのＰ　Ｐ 　Ｖ基質ＲＮＡ（Ｓ）、レーン３および４はレーン１および２に対応するがイン キュベー／コン温度を６０°Ｃである。レーン５は、レーン３およびレーン４の 両方のＲＮＡを含有し、−緒にインキュベートした。レーン６はレーン５と同様 であるが、リポザイムＲＮＡは放射能で標識されていない（Ａｚに括弧を付けて 示す）。レーン７は、前取て５ａｉｌで開裂したプラスミドｐＰＶ１２からＴ７ ＲＮＡポリメラーゼにより合成した切り出しくｔｒｕｎｃａｔｅｄ）マーカー転 写物（Ｔ）を含有しており、これは期待される５′末端開裂生成物に対応する。

レーン５およびレーン６かられがるように、ＰＰＶ標的ＲＮＡはアンチザイムＲ ＮＡにより２つの一層小さなＲＮＡに開裂される。これら２つの開裂された生成 物のうち一層小さい方は、レーン７のマーカー転写物とともに移動し、ＰＰＶ標 的転写物の５′側半分を示す。

３０分の反応時間の後、基質ＲＮＡの半分以上が開裂された。

図７ ＸｈｏＩおよび５ｔｕｌ認識配列を含有し５ａｉｌ認識配列に特異的なりボザイ ムＲＮＡのハンマーヘッド構造 図４に示す構造と比較して、さらに塩基の修飾（ＵがＣに）がなされており、そ の結果、ＸｈｏＩ部位（ＣＵＣＧＡＧ）が生成し、これは触媒ドメインのヘアピ ンループを形成している。

図８： テトラサイクリン耐性遺伝子（ｔｅｔ遺伝子）選択を有する普遍的５ａｌＩ−リ ボザイムーカセットの構築法 最上部の配列はプラスミドｐＡｚｓａｌｌの一部分を示す。制限エンドヌクレア ーゼＥａｒｌで消化し、ついで突出端を埋めた後、図３に記載のようなりボザイ ム構築物を生成するのに用いることのできる２５ｂｐ　ＤＮＡカセットが生成さ れる。

プラスミドｐＡｚｓａｌｌのＸｈｏ１部位にテトラサイクリン耐性遺伝子（ｔｅ ｔ遺伝子）を挿入することにより、プラスミドｐＡｚｓａｌｌ−ｔｅｔが得られ る（下部）。ＥａｒＩ消化ついでフレノウ反応の結果、下部に示すカセットが得 られ、このものもまた同様にトリミングした５ａｉｌ部位中に挿入するのに用い ることができる。テトラサイクリンを用い、ポータブルリボザイム力セットの挿 入について選択することができる。

図９ 異なるタイプのアンチセンスリボザイムＲＮＡの模式地図アンチセンスリボザイ ムの特色は、それが標的ＲＮＡに相補的な（アンチセンス）配列の長い領域を含 有するということである。１または２の触媒ドメインを有するアンチザイムを上 の２つの地図に示す。最下部の地図は、外来ＲＮＡ、たとえばテトラサイクリン 耐性遺伝子のｍＲＮＡを導入したアンチザイムＲＮＡを示す。テトラサイクリン 耐性遺伝子の場合には、挿入された配列は実際の触媒ドメインに比べて５０倍以 上も大きいことを強調しておく必要がある。

図１０ニ プラスミドｐＰＶ１２−ｔｅｔの地図 プラスミドｐＡｚｓａｌｌ−ｔｅｔ（図８）から得た５ａｌＩ特異的ＤＮＡカセ ツトをｐＰＶｌ（図５）の開裂およびトリミングした５ａｌＩ部位に挿入するこ とにより、プラスミドｐＰＶ１からプラスミドｐＰＶ１２−ｔｅｔを生成した。

箱で囲んだ部分は、挿入したカセットの関連配列を詳細に示す。得られた構築物 ｐＰＶ１２−ｔｅｔは、プラスミドｐＰＶ１２（図５および図６）と関係する。

（＝）指向アンチセンスリボザイムは、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼで転写すること により得ることができる。ＸｈｏＩでｔｅｔ遺伝子を切り出し、ついで再びライ ゲートした後、プラスミドｐＰＶ１２ａが得られた。

図１１： ２つのタイプのアンチザイムＲＮＡによるＰＰＶ標的ＲＮＡの開裂についてのゲ ル電気泳動分析のオートラジオグラフ 図６の説明で記載したのと同様にして分析を行った。Ｔ７転写により３つのタイ プのＲＮＡを合成した。すなわち、プラスミドｐＰＶ２からはＰＰＶ（−）ＲＮ Ｎ高基質Ｓ）を、プラスミドｐＰＶ１２からはアンチザイムＲＮＡ（Ａｚ）を、 プラスミドｐＰＶ１２−ｔｅｔからはＸｈｏｌ認識配列中にテトラサイクリン耐 性遺伝子を挿入したアンチザイムＲＮＡ（Ａｚ−ｔ）を合成した。レーン１〜３ は、０℃でインキユベートシタプラ７．ミＦｐＰＶ１２、ｐＰＶ２およびｐＰＶ ｌ２−４ｅｔのＲＮＡを含有する。レーン４〜６は、６０℃でインキュベートし た同じＲＮＡを含有する。レーン７は、レーン４およびレーン５のＲＮＡの混合 物を含有する。レーン８にはレーン４およびレーン６のＲＮＡを混合する。レー ン９はし一層８と同じであるが、アンチザイムＲＮＡは標識されていない。

プラスミドｐＰＶ１２−ｔｅｔからのＲＮＡは、プラスミドｐＰＶ１２からのア ンチザイムＲＮＡと同じ仕方でＰＰＶ（−）標的ＲＮＡを開裂することができる ことが示されている。

図１２： ｔｅｔ遺伝子がＡｆ１ｍ部位に挿入された５ａｌＩ特異的ＤＮＡリボザイムカセ ツトの生成 Ａ。

プラスミドｐＡｚＳａ　Ｉ　０図８）をＸｈｏＩで線状にし、ヌクレアーゼＳ１ で消化することにより突出端を除去した。

Ｂ。

プラスミドｐＢＲ３２２において、開裂しフレノウポリメラーゼで埋めておいた ＥｃｏＲＩ部位およびＡｖａ１部位にそれぞれＡｆ１ｍリンカ−（ｐＣＣＴＴＡ ＡＧＧ）を順に導入し、プラスミドｐＢＲ−ａｆ２を生成した。このＡｆｌＩＩ リンカ−の導入により、ＥｃｏＲ１部位は保存されることを言及しておく必要が ある。ついで、このプラスミドｐＢＲ−ａｆ２をＡｆｌｍで開裂することにより ｔｅｔ遺伝子を含有するＤＮＡ断片を放出させた。突出Ａｆ　ＩＩＩ端をフレノ ウポリメラーゼで埋め、得られたＤＮＡ断片をアガロースゲルから回収した。

Ｃ１ ついで、Ｂで得たＤＮＡ断片をＡに従って調製したプラスミド中にライゲートし た。得られた構築物ｐＡｚｓａ１３−ｔｅｔは、プラスミドｐＡｚＳａｌｌ−ｔ ｅｔ（図８）に対応しくｔｅｔ遺伝子の方向を別として）、同様に、ｐＡｚＳａ ｌｌ−ｔｅｔと同様にしてｔｅｔ遺伝子を含む５ａｌＩ特異的ＤＮＡリポザイム カセツトをプラスミドｐＡｚＳａ　１３−ｔ　ｅ　ｔから得ることができる。こ のＤＮＡカセットをｃＤＮＡの５ａ１１部位に挿入した後、Ａｆｌｍで消化する ことによりｔｅｔ遺伝子を除去することができる。

図１３＝ Ａｆｌｍおよび５ｔｕＩ認識配認識歯有する５ａｌＩ認識配認識時異的なリボザ イムＲＮＡのハンマーヘッド構造 Ａｆ１ｍ部位を含有するりボザイム配列は、プラスミドｐＡｚｓａ１３−ｔｅｔ （図１２）などからのＤＮＡカセットから得られる。図４に示す配列と比較して さらにＧがＡに変異しており、これにより触媒ドメイン内にＡｆｌＩ［部位が生 成プラスミドｐＰＶ−ＢＳＩおよびそれから得られるリボザイム構築物ｐｐｖ− ＢＳＩＩ−ｔｅＨ））地図 上部の地図は、ベクターｐＴ３Ｔ７］ａｃ（ベーリンガー・マン／％＜ム）（開 裂およびその後の充填、ついで再びライゲートすることによりＥｃｏＲＩ部位を 欠失させである）中に挿入した、ヌクレオチド３６３１に５ａｉ１部位を有しヌ クレオチド３４６１−４０５８に対応するプラムポックスウィルス（ＰＰＶ）の Ｂｓｔｙｒ−８ｐｈＩ断片を含有するプラスミドｐＰＶ−ＢＳＩを示す。プラス ミドｐＡｚＳａ　Ｉ　３−ｔ　ｅ　ｔ（図１２）からのＳａｌ！特異的ＤＮＡカ セットを挿入することにより、構築物ｐＰＶ−ＢＳＩＩ−ｔｅｔが得られ、これ はＰｖｕＩＩ開裂およびＴ３ＲＮＡポリメラーゼ転写後に（＋）指向アンチセン スリボザイムＲＮＡを放出する。

図】５ ＡｆｌＩＩ部位に挿入したｔｅｔ遺伝子を含有するアンチセンスリボザイムＲＮ ＡによるＰＰＶ標的ＲＮＡの開裂についてのゲル電気泳動分析のオートラジオグ ラフ Ｈｉｎｄｍで線状にしＴ７’ＲＮＡポリメラーゼで転写したプラスミドｐｐｖ− ＢＳＩから標識標的ＲＮＡを得た。ＰｖｕＩＩで開裂したプラスミドｐＰＶ−Ｂ Ｓ１１−ｔｅｔからＴ３ＲＮＡポリメラーゼで転写することにより得られた非標 識ＲＮＡ転写物を、図６に記載したのと同様にして標識標的ＲＮＡとともにイン キュベートシ、変性ポリアクリルアミドゲル上で分析した。レーン１、インキュ ベートしないｐＰＶ−ＢＳＩの標識ＲＮＡ　、レーン２．５０ｍＭトリス／Ｈｅ １ｐＨ８，０，２０ｍＭ　Ｍｇ（Ｊｔ中、ｐＰＶ−ＢＳＩＩ−ｔｅｔの非標識Ｒ ＮＡ転写物とともに６０℃にて３０分間インキュベートしたｐＰＶ−ＢＳＩの標 識ＲＮＡ：レーン３．５０ｍＭトリス／ＨＣＩ　ｐＨ８，０，２ＱｍＭ　ＭｇＣ １ｘ中、６０℃にて３０分間インキュベートしたｐＰＶ−ＢＳＩの標識ＲＮＡ、 ゲルによって示されるように、ＡｆｌＩ［部位中の配列修飾は触媒活性に影響を 及ぼさなかった。

つぎに下記実施例により本発明を説明する。

本明細書に採用した方法についての一層の情報は、サンプルツクらの「モレキュ ラー・クローニング」（コールド・スプリング・ハーバ−１第２版、１９８９） に記載されている。

制限酵素５ａｌＩはパリンドローム配列−−ＧＴＣＧＡＣ−一を認識する。それ はまた、その認識配列内に、ハンマーヘッドＲＮＡの「開裂」モチーフ（開裂可 能なモチーフまたは標的モチーフ）：ＧＵＣ（＝ＧＴＣ，それぞれ）を含有する 。

そのような５ａｌＩ認識配認識時有するＲＮＡに対して向けられたりボザイムＲ ＮＡは、図１に示すようにハンマーへラドコンホメーションを形成する。目的は 、そのような５ａｌＩ指向リポザイムＲＮＡの転写を可能にするＤＮＡ構築物を 生成することにある。図２は、一般的な形で、そのようなｃＤＮＡ構築物の配列 を標的のｃＤＮＡと比較して示す。転写の方向は異なり、標的の５ａｌｌ認識配 列内の囲んだＣ／Ｇ対はりポザイムＲＮＡの触媒ドメインにより置換される。図 ３は、標的のｃＤＮＡを所望のりボザイム構築物に変換する方法を記載する。

この一般的方法を実際の実験で試験するため、自動ＤＮＡ合成機（アプライド・ バイオシステムズ）を用いて２つのＤＮＡオリゴヌクレオチドを合成した。それ ぞれ２５のヌクレオチドからなるこれらオリゴヌクレオチドは、下記配列を有し ていた。

Ｒｚ−５ａｉｌ　５’ττＴＣＧＧＣＣＴＣＡＡＧＧＣＣＴＣＡテＣＡＧＧＡ３ ゜Ｒｚ−５ａ１２　５°ＴＣＣＴにＡＴＧＡＧＧＣＣＴＴＧＡＧＧＣＣＧＡＡＡ ３’ゲル電気泳動ついで等速電気泳動で電気溶出することにより上記２つの合成 りＮＡオリゴヌクレオチドを精製した後、これらＤＮＡの５゛末端をポリヌクレ オチドキナーゼを用いてリン酸化した。この酵素反応の後、これら２つの標識Ｄ ＮＡオリゴヌクレオチドを等モル量で混合し、沸騰水浴中で１分間インキュベー トし、ゆっ（つと室温に冷却した。この変性および復元工程により、所望の二本 鎖ＤＮＡカセットが生成する。

Ｒｚ−５ａｉｌ　−−−５ｔｕＸ　−−−５’　ＴＴＴＣＧＧＣＣＴＣＡＡＧＧ ＣＣＴＣＡＴＣＡＧにＡ３’３°＾＾＾ＧＣＣＣＣＡＧＴＴＣＣＧＧＡにτＡＧ ＴにＣＴ５’これら２つのアニールしたオリボデ牙キジヌクレオチドは、図３で 概説した方法に従って図４に示すリポザイムＲＮＡを生成するのに必要なりＮＡ カセットを表しており、それはりポザイム配列内の５ｔｕｌ認識部位ＡＧＧＣＣ Ｔの存在により特徴付けられる。

上記２つの合成りＮＡオリゴヌクレオチドＲｚ−ＳａｉｌおよびＲｚ−３ａ１２ からなるＤＮＡカセットを用い、ボテイウイルス（ｐｏｔｙｖｉｒｕｓ）群の植 物ウィルスであるプラムポックスウィルス（ＰＰＶ）の（−）ＲＮＡに対するア ンチザイムＲＮＡを生成した。この目的のため、（ＰＰＶ）のｃＤＮＡの４２３ 塩基（該ウィルスＲＮＡゲノムのヌクレオチド３４０９−３８３１の範囲、テチ ェニ−（Ｔｅｃｈｅｎｅｙ）らのＮｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、１７（ １９８９）１０１１５に記載の配列（こよる）を含有するＥｃｏＲＩ断片を、プ ラスミドｐＴ３Ｔ７−３ａ　］（Ｓａ１１で開裂し、ヤエナリヌクレアーゼを用 いて突出端をトリミングし、つＬｌで得られｊこプラスミドＤＮＡを再びライゲ ートすることにより５ａ１１部位を前辺て除去しｌこプラスミドｐＴ３Ｔ７１　 ａｃ（ベーリンガー・マンノ１イム）の修飾形）中にクローニングした。このベ クター中に上記ＥｃｏＲＩ断片を両方の可能な方向で挿入して、図５（上部）に 示すように２つのプラスミドｐＰＶ１およびｐＰＶ２を得た。このＰＰＶ　ｃＤ ＮＡ挿入物は、ヌクレオチド３６３１部位、すなわちＥｃｏＲＩ部位から２２３ ヌクレオチドおよび２００ヌクレオチド離れて５ａｌｌ部位を含有する。これら ２つのプラスミドのそれぞれの５ａｌｌ部位を消化し、供給者（Ｎ。

Ｅ、バイオラブズ）により記載されたプロトコールを用いてヤエナリヌクレアー ゼで処理してトリミングすることにより、図３に概略を示したように突出端を除 去した。ついで、上記５ａｌｌ特異的合成リポザイムＤＮＡカセット（Ｓ　ｔ　 ｕ　１部位を含有）を平滑末端ライゲーションにより挿入した。

このＤＮＡカセットが挿入された変換体をスクリーニングするには制限酵素５ｔ ｕＩを用いた。５ｔｕＩ消化により線状化することのできたプラスミドをＥｃｏ ＲＩで消化し、得られたＤＮＡ断片を５％ポリアクリルアミドゲル上で分離した 。プラスミドｐＰＶ２の４２３塩基断片と比較することにより、５ａｌＩ特異的 ＤＮＡカセツトの１つ、２つまたは３つのコピーが上記トリミング５ａ１１部位 中に挿入された組換えプラスミドを同定することができた。

２つ以上の挿入カセットを含有するプラスミドを５ｊｕｌで消化し、再びライゲ ートした。基質ｃＤＮＡおよびベクターのいずれにも５ｊｕｌ部位は存在しない ので、この手順により過剰に存在するカセットが除去される。しかしながら、得 られたプラスミドのうち約５０％しか正しくモノマーＤＮＡカセットを含有して いることが期待できず、他の５０％はりボザイムＲＮＡの生成には役立たない頭 部同士（ｈｅａｄ−ｔｏ−ｈｅａｄ）または尾部同士（ｔａｉｌ−ｔｏ−ｔａｉ ｌ）で連結したＤＮＡカセットの部分が存在する。

これら２つのプラスミドｐＰＶｌおよびｐＰＶ２内での５ａｌｌ特異的ＤＮＡカ セツトの挿入の方向についてスクリーニングするため、機能的リボザイムアツセ イを行った。この目的のため、プラスミドｐＰＶ１およびｐＰＶ２をＨｉｎｄ■ で線状化することによりＴ３プロモーターに隣接するポリリンカーの部分を開裂 した（図５、上部参照）。Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼで転写することにより、これ ら２つの鋳型から放射性標識ＰＰＶ（＋）および（−）ＲＮＡを合成した。

モノマー性の５ａｉ１特異的ＤＮＡカセツトが挿入された組換えプラスミド、お よび５ｔｕＩ消化および再ライゲーション（過剰のカセットを除去するため）（ 二より得られたプラスミドを、それぞれＨｉｎｄＩＩ［またはＰｖｕＩＩで消化 した。ＨｉｎｄＩＩ［切断ＤＮＡはＴ７ＲＮＡポリメラーゼで転写し、ＰｖｕＩ Ｉ切断ＤＮＡＩ；！Ｔ３ＲＮＡポリメラーゼの鋳型として働いた。得られたＲＮ Ａ転写物を１ノポザイム活性について試験した。

図３かられかるように、５ａｉ１特異的リボザイムカセットの挿入方向１ま、セ ンス指向およびアンチセンス指向構築物のいずれが得られるかを決定する。それ ゆえ、プラスミドｐＰＶｌ中に５ａｌｌ特異的リボザイムカセツトを挿入するこ とにより得られるプラスミドを下記方法によりスクリーニングした。

Ｔ３ＲＮＡポリメラーゼを用いて合成したＲＮＡ転写物（可能なセンス指向アン チザイムを表す（図３と比較））を、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼで転写すること１ こよりプラスミドｐＰＶ１から得られたＰＰＶ（＋）ＲＮＡとともに２０ｍＭ　 ＭｇＣｌ２．５０ｍＭトリスｐＨｓ、ｏ中、６０℃にて３０分間インキュベート し、つ（Ａでエタノール沈澱を行い、生成物を変性５％ポリアクリルアミドゲル （０，１２５％ビスアクリルアミド、８Ｍ尿素含有）上で分離した。同様にして 、同じ組換えプラスミドからＴ７ＲＮＡポリメラーゼを用いて合成したＲＮＡ転 写物（可能なアンチセンス指向アンチザイムを表す（図３と比較））を、Ｔ７Ｒ ＮＡポ１ツメラーゼを用いて転写することによりプラスミドｐＰＶ２から得られ たＰＰＶ（−）ＲＮＡとともにインキュベートした。

このＲＮＡ転写物の触媒活性のための機能的ア・ソセイを用いること（こより、 ｐＰＶＩ由来プラスミドの中から組換えクローンｐＰＶ１１およびｐＰＶ１２（ 図５、中央）が同定された。

同様にして、Ｔ３ＲＮＡポリメラーゼにより合成した転写物をプラスミドｐＰ■ ２のＴ７ＲＮＡ転写物（ＰＰＶ（−）ＲＮＡである）とともにインキュベートし 、Ｔ７ＲＮＡ転写物をプラスミドｐＰＶ１のＴ７ＲＮＡ転写物とともにそれぞれ 試験することにより、ｐＰＶ２由来プラスミドであるｐＰＶ２１およびｐＰＶ２ ２（図５、下部）を同定することができた。

リポザイム反応の一例を図６に示す。

アンチザイム構築物を生成する技術をさらに改良するため、リボザイムカセソト 中のヌクレオチドをさらに変化させてＸｈｏｌ認識配列（ハンマーヘッド構造の ヘアピンループの全く中央に位置する）を生成させた（図７）。

修飾配列をさらに有する合成５ａｌＩ特異的ＤＮＡカセツトを用いる代わりに、 図８の上部に示すように、実際のＤＮＡカセットの配列の他に２つの両側に位置 するＥａｒｌ認識部位を含有するＤＮＡオリゴヌクレオチドＡｚ−３ａｌｌを合 成した。加えて、このＤＮＡオリゴヌクレオチドは、プラスミドｐＴ３Ｔ７１　 ａｃ（５゛突出端を生成する酵素（ＢａｍＨＩ）および３°突出端を生成する他 の酵素（Ｋｐｎｌ）て開裂しである）中にクローニングすることのできるヌクレ オチドを５゛末端および３°末端に含有していた。

このＤＮＡオリゴヌクレオチドＡｚ−３ａｌｌの配列は下記の通りであった（こ のオリゴヌクレオチド中に含まれる制限酵素認識配列を示す）。

上記ベクターのこれら突出ＢａｍＨＩおよびＫｐｎｌ端に上記オリゴヌクレオチ ドをアニールし、フレノウポリメラーゼおよびｄＮＴＰの存在下でライゲーショ ンを行って、該ライゲーション反応の間にＡｚ−３ａｌｌに相補的なり　Ｎ　Ａ 　ｆＪ［が酵素的に合成されるようにした。このようにしてプラスミドｐＡｚＳ ａ　ｌ　１が生成された（図８、上部）。

ＥａｒＩは、その認識配列の外部に開裂部位を有するクラスＩＩＳ制限酵素であ り、ＤＮＡ配列を下記のようにして開裂する。

５’　ＣＴＣＴｒＣＮＮＮＮ−３’　−＞　５’　Ｃ丁ＣτＴＣＭ　跡−３”３ ’　にＡＧＡＡＧＮＮ？ＩＮ−５’　−＞　３°ＧＡＧＡＡに囲聞　−５゜つい で、ＥａｒＩで消化、フレノウ酵素で突出端を埋めることにより、プラスミドｐ Ａｚｓａｌｌから所望の５ａｌＩ特異的リボザイムカセツトを得ることができる 。

この５ａｌＩ特異的ＤＮＡカセツトを得る手順は、それ自体、実施例１で用しま た合成りＮＡカセットと比べて有意の利点を有するものではない。しかしながら 、このＤＮＡカセットはプラスミドｐＡｚｓａｌｌ上にクローニングされたので 、マーカー遺伝子を導入するためにリポザイム配列内のＸｈｏ１部位を利用する ことができた。

この目的のため、ＸｈｏＩリンカ−をプラスミドｐＢＲ３２２のＥｃｏＲＩ部位 およびＡｖａ１部位（それぞれ、開裂し、突出端を埋めた後）にも導入して、Ｘ ｈｏＩ開裂によりテトラサイクリン耐性遺伝子（ｔｅｔ遺伝子）を切り出すこと 力（できるようにした。

得られたｐＢＲ３２２のテトラサイクリン耐性遺伝子を含有するＸｈｏＩ断片（ そのプロモーターを含む）をプラスミドｐＡｚ−ＳａｌｌのＸｈｏＩ部位中に導 入してプラスミドｐＡｚ−８，ａ　ｌ　ｌ−ｔ　ｅ　ｔを生成した（プラスミド ｐＡｚ−３ａｌｌ−ｔｅｔの模式地図を図９、下部に示す）。

アンチザイムＲＮＡを生成するため、プラスミドｐＡｚ−３ａ　ｌ　ｌ−ｔ　ｅ 　ｔをＥａｒｌで消化し、突出端をフレノウポリメラーゼで埋め、得られたＤＮ Ａ断片をアガロースゲル上で分離し、所望の５ａｌＩ特異的リボザイムカセット であるＤＮＡ断片を等速電気泳動による電気溶出によって精製した。この断片（ 嘘サイズが約１４５０ｂｐであり、プラスミドｐＰＶＩ（実施例１に記載のよう ζｍ、５ａＩＩで開裂し、突出端を除去するためにヤエナリヌクレアーゼで処理 しである）中にライゲートするのに用いた。

転換体を選択するのにアンビンリンおよびテトラサイクリンを用いた。

５ａｌＩ特異的リボザイムカセツトに特徴的な５ｔｕ１部位の存在およびテトラ サイクリン耐性遺伝子を含有するＸｈｏＩ断片の存在について組換えプラスミド を分析した。テトラサイクリン耐性遺伝子内およびプラスミドｐＰＶ１由来配列 内でも開裂する制限酵素（たとえば、ＨｉｎｄＩＩＩやＢａｍＨＩ）で上記組換 えプラスミドを消化することにより、５ａｌＩ特異的ＤＮＡカセツトが挿入され た方向を導き出すことができた。このようにして、プラスミドｐＰＶ１１−ｔｅ ｔおよびｐＰＶ１２−ｔｅｔが同定された。これらはプラスミドｐＰＶ１１およ びｐＰＶ１２（図５、中央）と関連するが、リポザイム配列内にさらにテトラサ イクリン耐性遺伝子を含有している。

これらプラスミドからＸｈｏＩ消化によりテトラサイクリン耐性遺伝子を切り出 す前に、プラスミドｐＰＶ１２−ｔｅ　ｔ（図１０）が図９の下部に示すＲＮＡ のように機能的アンチザイムＲＮＡをすでに放出することができるかどうかを試 験した。それゆえ、このプラスミドをＸｂａＩで開裂し、Ｔ７ＲＮＡポリメラー ゼで転写し、得られたＲＮＡを、Ｔ７転写によりプラスミドｐＰＶ２から得られ る標的ＲＮＡとともにインキュベートした。驚くべきことに、テトラサイクリン 耐性遺伝子がリポザイムカセット中に挿入されていてもリボザイムの酵素活性に は影響はなかった（図１１）。

実験の示すところによると、標的ＲＮＡと塩基対を形成しないリボザイムの触媒 ドメイン（配列（ａ）ＸプラスミドｐＰＶ１２の場合には２２ヌクレオチドから なる）は、それぞれ９ヌクレオチドおよび１３ヌクレオチドの２つのサブドメイ ンに分割することができ、触媒活性を失うことなくｐＰＶ１２−ｔｅｔ中で１４ ００塩基以上も離れている。

プラスミドｐＰＶ１２−ｔｅｔをＸｈｏＩで開裂し再びライゲーションした後、 テトラサイクリン耐性遺伝子を除去し、プラスミドｐＰＶ１２ａを得た。このプ ラスミドはプラスミドｐＰＶ１２と非常によく似ている。唯一の違いは、それが 図７に従ってＸｈｏＩ部位を含有しているのに対してプラスミドｐＰＶ１２は図 ４に従ってリボザイム配列を含有していることである。

ポータブルリボザイムカでメト中にテトラサイクリン耐性遺伝子を付加すること は、２つの主要な利点を有する。

（１）テトラサイクリン耐性により選択することができるので、アンチザイムク ローンを同定するためのスクリーニングの作業を大幅に減少させる。

（１１）簡単な制限分析によるテトラサイクリン耐性遺伝子の方向に従って、セ ンス指向およびアンチセンス指向アンチザイム構築物を区別することができる。

アンチザイム構築物が得られたらＸｈｏＴ消化によりテトラサイクリン耐性遺伝 子を除去することができるが、アンチザイムＲＮＡはまたテトラサイクリン耐性 遺伝子の存在下でも機能する。

実施例３ 種々の制限部位に挿入するのに適したｔｅｔ遺伝子を有するまたは有しないＤＮ Ａリボザイムカセットを調製することのできる、プラスミドｐＡｚＢａｍｌ、ｐ ＡｚＢａｍｌ−ｔｅｔＳｐＡｚｃｌａｌ、ｐＡｚｃＩａｌ−ｔｅｔ、ｐＡｚＥｃ ｏｌ、ｐＡｚＥｃｏｌ−ｔｅｔＳｐＡｚＫｐｎｌ、ｐＡｚＫｐｎｌ−ｔｅｔＸｐ ＡｚＸｂａｌ、ｐＡｚｂａｌ−ｔｅｔ、ｐＡｚＸｂａ２およびｐＡｚＸｂａ２− ｔｅｔの構築、およびさらにリボザイムを生成させるためのこれらカセットの適 里 ｃＤＮＡ中に組み込むことによりアンチセンスリボザイムを生成するのに利用す ることのできる利用可能ＤＮＡカセントのスペクトルを広げるため、実施例２に 示したＡｚＳａ　ｌ　１と同様、ｐＡｚｓａｌｌおよびｐＡｚＳａ　ｌ　１−ｔ 　ｅ　ｔにｉス応する構築物を生成するために幾つかのＤＮＡオリゴデオキシヌ クレオチドをクローニングした。下記リストは、クラスＩＩｓ制限酵素消化つい で突出端の充填により放出することができるように２つのＥａｒ１部位の間に位 置するＤＮＡカセットを含有するプラスミドの関連配列を示す。各構築物は、ｔ ｅｔ遺伝子を有するかまたは有しないＤＮＡカセットが得られるように、Ｘｈｏ Ｉ部位（下に標記する）中にｔｅｔ遺伝子が挿入されているかまたは挿入されて いない形で存在する。「コアリボザイム」の配列は配列（ａ）に対応する。

ｐＡｚｓａｌｌ、Ｉ）ＡｚＳａｌｌ−ｔｅｔ５’　、−５ａｌＩ特異的ヌクレオ チド→　３・ＫｐｎＩ　’　コ−ｒ　＋）　ホ４　イム、　、　Ｂａ＋ｎ）Ｉ工 ５’　ＣＧＴＡＣＣＴＣＴＴＣＣ；　Ｔ　ＴＴＣＣＧＣＣＴＣＧＡＧにＣＣＴＣ ＡＴＣＡＧ　ＧＡ　ＴＧＡＡＧＡＧＧＡτＣＣ３′３’　ＣＣＡＴＣＣＡＣＡＡ ＧＣＡ　ＡＡＧＣＣに［；ＡＧＣＴＣＣＧＧＡＧＴＡにＴＣＣＴ　ＡＣＴｒＣＴ Ｃ（：ＴＡＧＧ　５“ＥａｒＩ　ＸｈｏＸ　Ｅａｒ工 ｐＡｚＢａｍｌ、ｐＡｚＢａｍｌ−ｔ　ｅ　ｔ５”　−ＢａｄＩ特興的ヌクレオ チド Ｋｐｎ工！！！　：ｙア’Ｊホｆイｌ−”−工３’　ＣＣＡＴＧＧＡＧＡＡＧＣ ＣＴＡ　ＡＡＧＣＣＧＣＡＣ；ＣＴＣＣＧＧＡＧＴＡＧＴＣＡＣＴＴＣＴＣＣτ ＡＧＧ５’Ｃ１ａＩ特異的ヌクレオチド→３・ ＫｐｎＩ　コアリボザイム　Ｂａ圃工 ５°ＣＣＴＡＣＣＴＣＴｒＣＧ　ＴＴＣＣＣＣＣＴＣにＡにＧＣＣＴＣＡＴＣＡ Ｇ　ＣＴＣＡＡＧＡにＧＡＴＣ（：　３゜３’　ＣＣＡＴにＧＡにＡＡＧＣＡＡ にＣＣ［：にＡＧＣＴＣＣ（：ＣＡＧＴＡ（：ＴＣＣＡＣＴＴＣ？ＣＣＴＡにＧ 　５’ｐＡｚＥｃｏｌ、ｐＡｚＥｃｏｌ−ｔｅｔ５゛　←ＥｃｏＲＩ特興的ヌク レオチドｐＡｚＫｐｎｌ、ｐＡｚＫｐｎｌ−ｔｅｔｐＡｚＸｂａｌ、ｐＡｚＸｂ ａｌ−ｔｅｔＸｂａＩ：ＮＴＣタイプ ＸｂａＩ特興的ヌクレオチド→３゜ ｐへｚＸｂａ２、ｐＡｚＸｂａ２−ｔｅｔＸｂａＩＣＴＡタイプ ５’　−ＸｂａＩ特興的ヌクレオチド→　３゜Ｋｐｎ工　”　）７！／ホｆイＡ 　’　ＢａｍＨＩ３’　ＧＣＴＡＣＣＴＣ’ｌＴＣに　ＣＴ　ＴＴＣにＧＣＣＴ ＣＧＡ［；ＧＣＣＴＣＡＴＣＡＧ　に　ＴＧｋＡにＡＧＧＡＴＣＣ３’これら構 築物を用いることにより、シュードモナス・シリンゲ（Ｐ　ｓｅｕｄｏｍｏｎａ ｓｓｙｒｉｎｇａｅ）のアイスニュークリエーション（ｉｃｅ　ｎｕｃｌｅａｔ ｉｏｎ）遺伝子（ｉｎａＺ）およびｈｒｐＳ遺伝子（ＳａｌＩ部位）、ドロソフ ィラ・メラノガスター（Ｄ　ｒｏｓｏｐｈｉｌａ　ａ＋ｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ ）の白色遺伝子（ｗｈｉｔｅ　ｇｅｎｅＸＳ　ａ　ｌ　１部位）、酵母の転写レ ギュレーターＧＣＮ４（ＢｓｔＥＩＩ部位、この場合、ｔｅｔ遺伝子を含有しな い合成カセットを用いた）のｍＲＮＡに対して向けられたりボザイムを生成させ ることができた。また、ＤＮＡカセットを２つの異なるＢｓｔＢＩ部位中に挿入 、およびＸｂａ１部位（センダイウィルスのし遺伝子）および５ａ１１部位（Ｐ 遺伝子）に対する両方の可能なカセットを挿入することにより、センダイウィル スの（＋）および（−）ＲＮＡに対してリポザイムも生成させた。

すべての場合において、対応ＤＮＡカセットを組み込んだ後に触媒性アンチセン スリボザイムを得ることができた。

実施例４ 触媒ドメインの配列内のＡｆ１ｍ部位中にｔｅｔ遺伝子が挿入されたＤＮＡリボ ザイムカセットを切り出すことのできる、プラスミドｐＡｚＢａｍ３−ｔｅｔ。

ｐＡｚｃ１ａ３−ｔｅｔＳｐＡｚｓａ１３−ｔｅｔ、ＡｚＫｐｎ３−ｔｅｔ。

ｐＡｚＸｂａ３−ｔｅｔＳｐＡｚＸｂａ４−ｔｅｔの構築ｃＤＮＡ自体にＸｈｏ １部位が含まれている場合には、選択マーカー遺伝子を有する選択可能なりＮＡ カセットを組み込む技術に困難さが生起する可能性がある。そこで、プラスミド ｐＡｚｓａｌｌ−ｔｅｔから得られるものなどのＤＮＡカセットは所望のあらゆ る部位に組み込むことができる。しかしながら、触媒ドメイン内のＸｈｏＩ部位 にクローニングされた（図７を比較）ｔｅｔ遺伝子の切り出しには、部分的に消 化したＤＮＡを調製する必要がある。同様の困難さは、リボザイムドメインがＸ ｈｏＩ部位を含むＤＮＡカセットをすでに含有するｃｌ：Ｂ”Ａ構築物中に第二 のカセットを導入すべき場合に生じる。この不都合を克服すイため、ＡｆｌＩＩ 部位内にｔｅｔ遺伝子を含有する第二の一連の組換えブラスミ１を調製した。こ の目的のため、プラスミドｐＡｚｓａｌｌ（図８、上部を比較）ろＸｈｏＩで消 化し、得られた突出端をヌクレアーゼＳ１でトリミングして除去した（図１２Ａ ）。これと平行して、対応突出端を場めた後に、プラスミドｐＢＲニー２２のＥ ｃｏＲＩおよびＡｖａＩ部位中にそれぞれ合成ＡｆｌＩ［リンカ−（ＣＣＴＴＡ ＡＧＧ）を連続的に導入した。この修飾プラスミドｐＢＲ−ａｆ２（図１２Ｂ） から、ｔｅｔ遺伝子を含有するＡｆｌＩｒ断片を放出し、突出端をフレノウポリ メラーゼで埋めた。アガロースゲル上で精製し、ついで電気溶出した後、得（れ たＤＮＡ断片をＸｈｏＩ開裂およびトリミングしたプラスミドｐＡｚｓａｌＩ中 に挿入した（図１２０）。それゆえ、Ａｆ　Ｉｎ部位ＣＣＴＴＡＡＧは保存され た。

この操作の結果、触媒ドメイン内のＸｈｏ１部位はＡｆｌＩＩ部位で置換される 。

それゆえ、第二のタイプのＤＮＡカセットを得ることができ、これは、ＸｈｏＩ 部位を含有しているか、またはＸｈｏ１部位を有するリボザイムカセットがすで に挿入されているｃＤＮＡ中に導入することができる。ｔｅｔ遺伝子を含有する Ａｆｌｌ［断片を切り出した後、図１３に示すリボザイムが得られる。

それぞれＡｆｌｎ部位中にｔｅｔ遺伝子が挿入された下記プラスミドが得られた 。

ｐＡｚｓａ１３−ｔｅｔ ５１　←５ａｌＩ特異的ヌクレオチド→　３゜ＫｐｎＩ！　コ７リボザイム　！ ！　ＢａｍＨＩ３°←ｈ■ＨＩ特異的ヌクレオチド Ｋｐｎ工！　！　！　：＋７　リホｆイＡ　ＢａｍＨ工Ｅａｒ工　Ａｆｌエエ　 Ｅａｒ工 ｐＡｚｃ］　ａ３−ｔ　ｅ　ｔ Ｃ１ａＩ特異的ヌクレオチド→３１ Ｋｐｎエ　コアリボザイム　Ｂ　ａ＋ｎｆｌ　Ｉ５’　にＧＴＡＣＣＴＣＴＴＣ ＣＴＴＣＣＣＣＣＴＴＡＡＣ：ＣＣＣＴＣＡＴＣＡＣＧ　ＴＧＡＡｃＡＧＣＡＴ ＣＣ３゜３°ＣＣＡＴＣにＡＣ；ＡＡＧ；ＣＡＡＣＣＣＣＣＡＡＴＴＣＣににＡ ＣＴＡＧＴＣＣＡＣＴＴＣＴＣＣＴＡにＣ５’Ｅａｒ工　ＡｆＨ工Ｅａｒｌ ｐＡｚＫｐｎ３−ｔ　ｅ　ｔ ５　’　ｔｈ−ＫｐｎＩ特異的ヌクレオチド→　３′Ｋｐｎ工！　！　コア　１ Ｊ　、Ｋ　ｑ　イム’　Ｂａｍ１４ＩｐＡｚＸｂａ３−ｔ　ｅ　ｔ ＸｂａＩ：ＮＴＣタイプ Ｘｂａｒ特異的ヌクレオチド→３・ にｐｎエ　コアリボザイム　ＢａｍＨ工ｐＡｚＸｂａ４−ｔ　ｅ　ｔ Ｘｂａ　Ｉ　：　ＣＴＡタイプ ５・　←ＸｂａＩ特興的ヌクレオチド→　３゛Ｘｐｎｌ　！！　：Ｉ７’）Ｍサ イム’　”ｌ″Ｊ（工９．ｏ９０．　目　。−−−−−−−−−−−−−−−− −−−−−■−−−−−−５’　（：ＣＴＡＣＣＴＣＴＴＣ（：　ＣＴ　ＴＴＣ ＣＣＣＣＴＴＡＡＧにＣＣＴＣＡＴＣＡＧ　Ｃ；　τにＡＡＣＡＧＧＡＴＣ（： 　３゜３°ＣＣＡＴＧＧＡＧＡＡ（：ＣにＡ　ＡＡにＣＣににＡＡＴＴ（：Ｃに ＧＡＧＴＡＧτＣＣＡＣＴＴＣＴＣＣＴＡＧＧ　５゜ＥａｒＩ　ＡｆｌエエＥａ ｒ工 触媒ドメイン中にＡｆｌＩＩ認識配列を含有するりボザイムプラスミドｐＡｚｓ ａ１３−ｔｅｔから、ＫＳＩ）６３２Ｉ（Ｅａｒｌのアイソシゾマー）で消化し 、得られる突出端を埋めることにより５ａｌＩ特異的ＤＮＡカセツトを調製した 。この５ａｌＩ特異的ＤＮＡカセツトをアガロースゲル上で精製し、電気溶出し た。これと平行して、プラムポックスウィルス（ＰＰＶ）のＣＤＮＡの断片を含 有するプラスミドｐＰＶ−ＢＳＩ（図１４Ｘ１　ｔｔ　ｇ）を５ａｉｌで開裂し た。このプラスミドを２０μｍの８１緩衝液（２２５ｍＭ　ＮａＣ１，３０ｍＭ 酢酸カリウムｐＨ４，５，２００μＭ　ＺｎＳＯ４および５％グリセリン）中に 溶解し、氷上、２単位のヌクレアーゼＳｌ（ベーリンガー・マンハイム）で２０ 分間処理した。ついで５μｌの８１停止緩衝液（３００ｍＭ）リス／ＨＣＩ、５ ０ｍＭ　ＥＤＴＡ、ｐＨ８，０）を加え、試料を６５℃で１０分間インキュベー トし、ついでフェノール処理およびイソプロパツール沈澱を行った。実施例１お よび２に記載のりポザイムの構築と比べて、上記方法はトリミング反応の反応条 件に関して好ましい態様を表す。このようにして処理したプラスミドｐＰＶ−Ｂ Ｓｌ（３００ｎｇ）を５μｍの容量の平滑末端ライゲーション緩衝液（５０ｍＭ Ｉ−リス／ＭＣＩ　ｐＨ７，５，１０ｍＭ　ＭｇＣｂ、５％ＰＥＧ３０００，１ ｍＭ　ＤＴＴおよび１００μＭ　ＡＴＰ、３単位のＴ４ＤＮＡリガーゼ（ミノチ ック、ヘラクリオン、ギリシャ）を含有）中、１２℃で１６時間、上記プラスミ ドｐＡｚＳａ１３−ｔｅｔから調製した５ａｌＩ特異的ＤＮＡカセツト（約１０ １００ｎとライゲートした。大腸菌株ＪＭ８３中で形質転換し、アンピシリンお よびテトラサイクリンで選択した後、得られたクローンを制限マツピングにより 分析した。かくして、それぞれ（＋）または（−）指向リポザイムを放出するプ ラスミドｐＰＶ−ＢＳｌｌ−ｔｅｔ（図１４）およびｐＰＶ−ＢＳ１２−ｔｅｔ が同定された。図１５はオートラジオグラフを示し、ｐＰＶ−ＢＳＩＩ−ｔｅｔ から得られた転写物の触媒活性が確認された。

リボザイムＲＮＡの安定化 インヒポ発瑛後にリボザイムを保護するため、下記２つの合成オリゴヌクし／オ チトを合成した。

ステムｌ：　５＋　ｃｃｃｃｃｃｃｃｒｃｃｃｃｃｃＡｃｃｃｃＡｃｃｃｃｃｃ ｒｃｃｃｃｃｃｃ丁　３゛および ステム２　：　５’　ＡＣＧＧＣＣＧＣＡＣＧにＧＣＣ丁ＣＣＣＣＴＧＧＣＣＣ Ｃ；ＡＣＣＧｆｌ；ＣＣＧにれらオリゴヌクレオチドは、Ｔ４ポリヌクレオチド キナーゼでリン酸化し、ついてアニーリングした後に下記二本鎖ＤＮＡカセット を形成することができる。

５°　ｐＧＣＧにＣＣＧＣＴＣＧＧＧＣＣＡＣＧＣにＡＧＣＣＣＣＧＴＧＣＧＧ ＣＣＣ丁　３′３’　ＣＧＣＣＧＣ；ＣにＡＣＣＣＣＧＣＴＣＣＣＣＴＣＣにＧ ＧＣＡＣＧＣＣにＧＣＡｐ　５’これらＤＮＡカセットは、ＡｖａＴ、Ｅａｇｌ の制限部位を含有しており、Ａｖａ工　ＡｖｓＩ ５°ｐｃｃＣＣＣＣＧＣＴＣＧＣにＣＣＡＣにＣにＡにＧＣＣＣにＴＧＣＧＣＣ ＣＧτ　］゛３°　ＣにＣＣＧにＣＣＡにＣＣＣＣ；ＧＴＧＣＧＣＴＣＣににＧ ＣＡＣＧＣＣＧＧＣＡｐ　５゜制限エンドヌクレアーゼＮｏｔ　Ｌ　Ｓｆ　ｉ　 Ｉ（８塩基の配列を認識する）の制限部位を含有している。

５“ｐＧｃｃｃｃｃにＣＴＣＣ：ＣにＣＣＡＣＣＣＣＡ（’；ＣＣＣＣｌ：ＴＧ ＣＣ（：ＣＣにＴ　３’３’　ＣにＣＣＩＩ；ＧＣ［；ＡにＣＣＣＧＣＴＧＣＣ ＣＴＣＣ（１；ＣＣＣＡＣＣＣＣＣにＣＡｐ　５’５ｆｉＩ　５ｆｉｌ このＤＮＡカセットは、平滑末端ライゲージ３ンにより、アンチセンスリボザイ ムをニートするＤＮＡ構築物中の２つの部位、すなわち挿入されたＤＮＡリボザ イｌ、カセットの」二流および下流に挿入することができる。これら制限部位１ ごより、カセットの挿入の検出および挿入の方向の試験が可能となり、過剰のカ セットを切り出すこともできる。５′末端および３゛末端のそれぞれの挿入の方 向が同じであるのが好ましい。

このＤＮＡカセットの配列は、上記ステム１およびステム２からなるＤＮＡカセ ットを含有するＤＮＡを転写の鋳型として用いた場合に、得られるＲＮＡが下記 に示すようなステムループ構造をとることを確実にするように選択した。

上記ＤＮＡカセットの配列の選択はまた、ＲＮａｓｅｍタイプの二本鎖特異的エ ンドリボヌクレアーゼによる分解を回避するため、得られるＲＮＡステムが完全 には二本鎖ではないようにして行った。アンチセンスリボザイムＲＮＡの５゜末 端および３°末端のステムループ構造は、エクソヌクレアーゼに対して保護する 。インビボで非常に安定な同様の構造は、細菌のＩＳエレメントにも認められる （サイモンズ（Ｓ　ｉｍｏｎｓ）およびクレンクナ−（Ｋ　１ｅｃｋｎｅｒ）、 Ａｎｎｕ、　Ｒｅｖ　Ｇｅｎｅｔ２２（１９８８）、５６７〜７００参詔）。

ＲＮＡ転写物はまた、「折り返しくｆｏｌｄｉｎｇ　ｂａｃｋ）Ｊ構造（ピンポ ンパドル）を形成することにより、クローニングしたステムカセットからの５′ 末端および３°末端領域が関与する別の構造をとることもできる。それゆえ、完 全には二本鎖のＲＮＡセグメントを形成することなくアンチセンスリボザイムの ５′末端と３°末端とが塩基対を形成する［偽環状（ｐｓｅｕｄｏ　−ｃｉｒｃ ｕｌａｒ）Ｊ構造を形成することができる。

この構造もまた、エクソヌクレアーゼの攻撃に対して保護する。

３’　ＧＣＧＣＣにＧＣＧ　ＧＣＣＣＣＣ；　ＧＣにＣＣＣ（：（：にＣＣＧＣ ＣににＣＡ−−−−−−リボザイＡ−−−−−−−−プラスミドｐＰＶ−ＢＳＩ およびｐＰＶｌは、１９９１年７月２６日にＤＳＭ６６２４および０５Ｍ６６２ ５の受託番号にてブダペスト条約の条件下、トイチェ・ザムルング・フォノ・ミ クロオーガニスメン・ラント・ツエルクルトゥーレン・ゲゼルシャフト・ミド・ ゲシュレンクター・ハフラング（Ｄｅｕｔｓｃｈｅ　ＳａｍＩｌｌｕｎｇ　ｖｏ ｎ　Ｍｉｋｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｎ　ｕｎｄ　Ｚｅｌｌｋｕｌｔｕｒｅｎ　Ｇ ｍｂＨ）、ブラウンシュバイク、ドイツに大腸菌ＪＭ８３中にて寄託した。

国際調査報告 ＋Ｒ＋１ｆＩＩＩ＋ｗ＊ｌＡＰｍｌｃｓ＋縛噛Ｎ＠ｏｒイ／１ｏＱｌ／ｎ１Ａｎ ’１ＰａｎｎＰＣＴ／１ｓＮ２＋Ｏｌ−一一―−−■喝ｒ区−１１１’ｌ＠＠ｌ ｌり１１．ｌ’ｋ１２６Ｍ国際調査報告 フロントページの続き （５１）　Ｉｎｔ、　Ｃ１，”　識別記号　庁内整理番号Ｃ１２Ｎ　１／２１　 ７２３６−４８ １５／１１　ＺＮＡ ／／（Ｃ１２Ｎ　１／２１ Ｃ１２Ｒ１：１９） （８１）指定国　ＥＰ（ＡＴ、ＢＥ、ＣＨ，ＤＥ。

ＤＫ、　ＥＳ、　ＦＲ，ＧＢ、　ＧＲ，ＩＴ、　ＬＵ、　ＮＬ、　ＳＥ）、０Ａ （ＢＦ、ＢＪ、ＣＦ、ＣＧ、ＣＩ、ＣＭ、ＧＡ、　ＧＮ、　ＭＬ、　ＭＲ，ＳＮ 、　ＴＤ、　ＴＧ）、　ＡＵ、　ＢＢ、　ＢＧ、　ＢＲ，ＣＡ、　Ｃ３，ＦＩ、 　ＨＵ、ＪＰ、　ＫＰ。

ＬＫ、　ＭＣ，ＭＧ、　ＭＮ、　ＭＷ、　Ｎｏ、　ＰＬ、　ＲＯ，ＳＤ、　ＳＵ 、　ＵＳ ＦＩ （７２）発明者　タブラー、マーティンギリシャ共和国、７１１　１０、クレタ 、ヘラクリオンーフォーテッツァ、ハウス　２５５番（ディー、カラリス）

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．下記特徴を示すポータブルリボザイムカセット；（ａ）標的ＲＮＡとは塩基 対を形成しないリボザイム部分をコードするＤＮＡ配列（ａ）；および （ｂ）ＤＮＡ配列（ａ）の両側に存在する配列であって、標的ＲＮＡをコードす るＤＮＡ配列の制限酵素開裂部位の突出端に由来し、標的ＲＮＡと塩基対を形成 するリボザイム部分の一部分をコードする配列（ｂ）、その際、標的ＲＮＡをコ ードする標的ＤＮＡ中にリボザイムカセットが挿入された後、該ＤＮＡ配列（ａ ）および（ｂ）は、標的ＲＮＡ（アンチセンス鎖）に相補的な該標的ＤＮＡ鎖と 一緒になって、該標的ＲＮＡに対してエンドリボヌクレアーゼ活性を有するリボ ザイムをコードする。 ２．該ＤＮＡ配列（ａ）および（ｂ）が下記式：【配列があります】 で示され、上記式中、該ＤＮＡ配列（ａ）が配列：【配列があります】 で示され、該ＤＮＡ配列（ｂ）が配列：【配列があります】 で示される（式中、ヌクレオチドＫおよびＬは、それぞれ、標的ＲＮＡの標的モ チーフの第一番目および第二番目のヌクレオチド（５′−３′）を表し、ヌクレ オチドＭ１およびＮ１は、それぞれ、５′部位および３′部位において標的ＲＮ Ａの標的モチーフの両側に位置する第一番目のヌクレオチドである；ヌクレオチ ドＭ２およびＮ２は、それぞれ、５′部位および３′部位において標的ＲＮＡの 標的モチーフの両側に位置する第二番目のヌクレオチドであり、ヌクレオチドＮ ３およびＮ４は標的ＲＮＡの標的モチーフの３′部位の第三および第四位に位置 する； ヌクレオチドＭ２、Ｍ１、Ｋ、Ｌ、Ｎ１、Ｎ２、Ｎ３、およびＮ４は、独立にＡ 、Ｇ、ＣまたはＴを表すかまたはカセット中に存在しない、ただし、Ｍ２の存在 にはＭ１の存在を必要とし、Ｍ１の存在にはＫの存在を必要とし、 Ｋの存在にはＬの存在を必要とし、 Ｎ４の存在にはＮ３の存在を必要とし、Ｎ３の存在にはＮ２の存在を必要とし、 Ｎ２の存在にはＮ１の存在を必要とし、該ヌクレオチドＭ２、Ｍ１、Ｋ、Ｌ、Ｎ １、Ｎ２、Ｎ３、およびＮ４の合計数は０〜４、好ましくは１〜４である； Ｗ、ＸまたはＹはＡ、Ｇ、ＣまたはＴである；ｘは少なくとも６（その際、各Ｘ は独立にＡ、Ｇ、ＣまたはＴであり、Ｘは、リボザイムがその標的配列と対を形 成したときに形成される二次構造において、ヌクレオチドＣ１およびＧ２（配列 （Ｘ′）の両側に存在する）により形成された塩基対に隣接して少なくとも１つ の別の塩基対を相補的ヌクレオチドＸ′が形成するようにＸが選択される）； ｙは０または１である； ヌクレオチドＣ１がＣである場合はヌクレオチドＧ１はＧであり、ヌクレオチド Ｃ１がＴである場合はヌクレオチドＧ１はＡであり、ヌクレオチドＣ１がＣまた はＴである場合は、ヌクレオチドＣ２およびＧ２は、それぞれ、ＣおよびＧかま たはＴおよびＡであり； 「′」の記号のついたヌクレオチドは相補的ヌクレオチドであり；ヌクレオチド Ｍ２、Ｍ１、Ｋ、Ｌ、Ｎ１、Ｎ２、Ｎ３、およびＮ４は、標的ＲＮＡをコードす るＤＮＡ内の制限酵素開裂部位を対応制限酵素で開裂した後に得られる突出端か らのヌクレオチドに対応し、該制限酵素開裂部位は該突出端内にさらにヌクレオ チドＺ（Ａ、Ｇ、ＣまたはＴである）を含有する）請求項１に記載のポータブル リボザイムカセット。 ３．ＬがＴである請求項１または２に記載のポータブルリボザイムカセット。 ４．Ｍ１、Ｋ、Ｌ、Ｎ１、Ｎ２、Ｎ３およびＮ４が下記意味：【配列があります 】 を有する請求項１〜３のいずれか一つに記載のポータブルリボザイムカセット。 ５．隣接するヌクレオチドと一緒になって制限酵素開裂部位を形成するようにＹ またはＷが選択される請求項１〜４のいずれか一つに記載のポータブルリボザイ ムカセット。 ６．単独または隣接するヌクレオチドと一緒になって制限開裂部位を形成するよ うにＸが選択される請求項１〜５のいずれか一つに記載のポータブルリボザイム カセット。 ７．該制限酵素開裂部位中にマーカー配列が含まれる請求項６に記載のポータブ ルリボザイムカセット。 ８．該マーカー配列が選択可能なマーカー遺伝子である請求項７に記載のポータ ブルリボザイムカセット。 ９．宿主細胞中で発現させた場合または複製連鎖反応において鋳型として用いた 場合にエンドリボヌクレアーゼ活性を示すリボザイムの生成が可能となるような 方向で請求項１〜８のいずれか一つに記載のポータブルリボザイムカセットを含 有し、該リボザイムカセットの両側に存在し、コードされたリボザイムの標的特 異的なエンドリボヌクレアーゼ活性を得るに充分な長さを有する付加配列を含有 する、リボザイム（アンチザイム）をコードするＤＮＡ配列。 １０．該リボザイムカセットの両側に存在し、該コードされたリボザイムの標的 特異的なエンドリボヌクレアーゼ活性を得るに充分な長さを有する該付加配列自 体が、ＲＮＡに転写後に安定なステムループ構造をとる少なくとも一つのＤＮＡ ドメインを含有する請求項９に記載のＤＮＡ配列。 １１．ステムループ構造を形成する該付加ＤＮＡドメインが、配列：【配列があ ります】 を有する合成二本鎖ＤＮＡカセットから得られるものである請求項１０に記載の ＤＮＡ配列。 １２．請求項１〜８のいずれか一つに記載のポータブルリボザイムカセットまた は請求項９〜１１のいずれか一つに記載のＤＮＡ配列を含有する組換えベクター 。１３．該ポータブルリボザイムカセットが、組換えベクターから正確に切り出 すことができるようにその両側が制限部位となっている請求項１２に記載の組換 えベクター。 １４．該ＤＮＡ配列が適当なプロモーターの制御下にある請求項１２または１３ に記載の組換えベクター。 １５．請求項１２〜１４のいずれか一つに記載の組換えベクターを含有する宿主 生物。 １６．請求項１５に記載の宿主を適当な条件下で培養し、ついで該リボザイムを 培養液から単離することを特徴とする、リボザイムの製造方法。 １７．請求項９〜１１のいずれか一つに記載のＤＮＡ配列によりコードされるリ ボザイム。 １８．請求項１〜８のいずれか一つに記載のポータブルリボザイムカセットまた は請求項９〜１１のいずれか一つに記載のＤＮＡ配列を含有するウイルス、細菌 、植物または動物ゲノム。 １９．請求項１８に記載のゲノムを含有するウイルス、細菌、真菌、植物または 動物。 ２０．任意に薬理学的、獣医学的または農学的に許容し得る担体および／または 賦形剤とともに、請求項１７に記載のリボザイムまたは請求項９〜１１のいずれ か一つに記載のＤＮＡ配列を含有する組成物。 ２１．遺伝子の望ましくない活性を抑制するため、または感染因子が疾患を引き 起こす可能性を除去するための請求項２０に記載の組成物。 ２２．該ＤＮＡ配列が担体ベクター中、好ましくはレトロウイルス中またはワク シニアウイルス中に含まれる請求項２０または２１に記載の組成物。 ２３．リボザイムをコードするＤＮＡ配列の製造方法であって、該ＤＮＡ配列は 請求項１〜８のいずれか一つに記載のポータブルリボザイムカセットを含有し、 （Ａ）リボザイムにより不活化されるべき所望の標的ＲＮＡをコードするＤＮＡ 配列中に、下記ヌクレオチド配列： Ｍ２Ｍ１ＫＬＺＮ１Ｎ２Ｎ３Ｎ４ （式中、Ｍ２、Ｍ１、Ｋ、Ｌ、Ｎ１、Ｎ２、Ｎ３およびＮ４は請求項１〜２２の 記載と同じ； ＺはＡ、Ｇ、ＣまたはＴ； Ｚは標的ＲＮＡの５′末端リボザイム開裂生成物の３′末端ヌクレオチドに対応 する； ヌクレオチド配列ＫＬＺは、リボザイムによって開裂される標的ＲＮＡのヌクレ オチド配列に対応する； Ｚは該制限酵素開裂部位を対応制限酵素で開製した後に得られる突出端の一部で ある）の制限酸素開裂部位を選択し； （Ｂ）（Ａ）で得られたＤＮＡ配列の該制限酵素開裂部位を対応制限酵素で開製 し；（Ｃ）（Ｂ）の開裂生成物の突出端を除去して平滑末端とし；（Ｄ）下記工 程： （ＤＡ）請求項１〜２２の記載と同様に定義したＤＮＡ配列（ａ）の５′末端に 、（Ｂ）で得た突出端中に存在するＺの５′部位に位置するヌクレオチドを付加 し；（ＤＢ）該ＤＮＡ配列（ａ）の３′末端に、該突出端中に存在するＺの３′ 部位に位置するヌクレオチドを付加する からなる方法を行うことによりリボザイムカセットを製造し；ついで（Ｅ）工程 （Ｄ）で得たリボザイムカセットを工程（Ｃ）で得たＤＮＡ配列中に挿入する 工程からなることを特徴とする方法。 ２４．工程（Ｄ）で得られた構造を示し、工程（Ｅ）において工程（Ｃ）で得ら れたＤＮＡ配列中に挿入されるポータブルリボザイムカセットが、該ポータブル リボザイムカセットの両側に存在する制限酵素開裂部位の開裂によりクローニン グベクターから切り出される請求項２３に記載の方法。 ２５．請求項１〜８のいずれか一つに記載のポータブルリボザイムカセットの製 造方法であって、 （Ａ）リボザイムにより不活化されるべき所望の標的ＲＮＡをコードするＤＮＡ 配列中に、下記ヌクレオチド配列： Ｍ２Ｍ１ＫＬＺＮ１Ｎ２Ｎ３Ｎ４ （気中、Ｍ２、Ｍ１、Ｋ、Ｌ、Ｎ１、Ｎ２、Ｎ３およびＮ４は請求項１〜２４の 記載と同じ； ＺはＡ、Ｇ、ＣまたはＴ； Ｚは標的ＲＮＡの５′末端リボザイム開裂生成物の３′末端ヌクレオチドに対応 する； ヌクレオチド配列ＫＬＺは、リボザイムによって開裂される標的ＲＮＡのヌクレ オチド配列に対応する； Ｚは該制限酵素開裂部位を対応制限酵素で開製した後に得られる突出端の一部で ある）の制限酵素開裂部位を選択し； （Ｂ）対応制限酵素を用いた開裂により生成される該制限酵素開裂部位の突出端 を決定し；ついで （Ｃ）下記工程： （ＣＡ）請求項１〜２４の記載と同様に定義したＤＮＡ配列（ａ）の５′末端に 、（Ｂ）で決定された突出端中に存在するＺの５′部位に位置するヌクレオチド を付加し； （ＣＢ）該ＤＮＡ配列（ａ）の３′末端に、該突出端中に存在するＺの３′部位 に位置するヌクレオチドを付加する からなる方法を行うことによりリボザイムカセットを製造する工程からなること を特徴とする方法。